人神经上皮瘤细胞

[align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]上皮细胞[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]间充质转化[/color][/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]上皮细胞[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]间充质转化，是指上皮细胞转化为具有间质表型细胞的生物学过程，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在肿瘤的侵袭和转移等方面[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]具有[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]重要作用[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][31][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]经历[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程的细胞具有类似干细胞的特性，耐药性也随之增强[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][32][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。研究发现，在乳腺癌的小鼠模型中，降低[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]snail[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的表达，肺转移的发生显著减少[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][33][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。胰腺癌、肺腺癌细胞在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程后表现出更强的迁移和侵袭能力[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][34, 35][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]从[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]转录调控的角度看，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]与非小细胞肺癌相比，人小细胞肺癌细胞系中[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]相关转录因子的表达量较高[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][36][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Krohn[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]等人研究发现，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]E[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-cadherin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达下调，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Vimentin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达上调的贴壁的小细胞肺癌亚系[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]NCIH69V[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]具有更高的侵袭性[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][37][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。在小细胞肺癌中，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]与[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]抑制剂、顺铂、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bcl-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]抑制剂等药物的耐药具有显著关联性。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]E[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-cadherin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达量较高的小细胞肺癌对[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bcl-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]抑制剂具有更好的应答率[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][38][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Contactin 1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通过诱导[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程调节小细胞肺癌聚乙二醇精氨酸酶的耐药性[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][39][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。越来越多的研究证明，小细胞肺癌[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程受到多种通路的调节，促进小细胞肺癌细胞的增殖、侵袭和转移，并促进化疗的耐药性[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][40-44][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]指的是上皮细胞变成具备间质细胞形态和特性的细胞的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的发生过程中[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]细胞丧失上皮表型[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]同时获得间质表型。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]E-cadherin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]水平下降可以导致细胞的粘附力降低[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]使细胞获得易于侵袭和转移的特性[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，这[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]已经被认为是[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]最显著的特征。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在乳腺癌及宫颈癌中发现，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]促进肿瘤[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][29][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。通过[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Western blot[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]技术检测[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]低表达后[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]相关蛋白的表达情况。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]如果[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]与对照相比，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]H69[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-sh[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]组[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]N-cadherin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Vimentin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达量下降，而[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]E-cadherin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达量上升，表明[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]低表达的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]H69[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]细胞的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程受到了抑制，减少了肿瘤转移的概率。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Wnt[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]信号通路能通过抑制[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]GSK3β[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]（糖原合成酶激酶[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3β[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]glycogen synthase kinase -3β[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）介导的磷酸化作用以及抑制胞质中的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]β-catenin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]降解等作用来诱发[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]转换[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][75][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]研究显示，抑制[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Wnt[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]信号通路逆转非小细胞肺癌[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][76][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，而肿瘤干细胞[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]LGR5[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通过活化[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Wnt[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通路促进神经胶质瘤[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][77][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。参与[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程的信号通路还有：[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]TGF-β[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Notch[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]SMAD[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PI3K-AKT-MTOR[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]信号通路[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]等，其中涉及[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]调节的信号通路。在人小细胞肺癌细胞系中，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]可能通过[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Wnt[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通路调节[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程，也可能通过其他通路协同作用，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]具体机制仍需进一步关注与研究。[/color][/size][/font]

各国争相发展的重点项目　　iPS技术，即诱导性多能干细胞技术，是一种将成体成熟、分化的体细胞重编程获得类似胚胎干细胞的新兴技术。2007年11月美国和日本科学家分别独立宣布可将人类皮肤细胞转化为iPS细胞。这一发现被《自然》和《科学》杂志分别评为2007年第一和第二大科学进展。之后，iPS细胞研究迅猛发展，不同的国家和实验室纷纷报道了多种方法建立的iPS细胞系。就连世界第一只体细胞克隆动物多利羊的培育者伊恩·威尔莫特也宣布放弃人类胚胎干细胞克隆研究，转而进行 iPS 细胞研究，因为他认为这种细胞比胚胎干细胞更具潜在优势。　　我国连续多年将干细胞研究列入“863”、“973”、国家自然基金重点项目。国务院2006年发布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年）》中，干细胞作为五项生物技术之一成为未来15年我国前沿技术的重点研究领域。　　致瘤风险浮出水面　　Yamanaka研究组在《自然·生物技术》上发表的文章显示，用iPS细胞诱导的神经干细胞，即使不含c-Myc（曾被认为是导致肿瘤的主要原因），在植入NOD/SCID免疫缺陷小鼠后仍有很强的致瘤性，甚至高于胚胎干细胞。　　　他们共研究了36个iPS细胞克隆，在诱导方式上，有些诱导剂配方中含有c-Myc基因，有些没有，因此具有较好的代表性。同时他们选择了3株胚胎干细胞作为对照。在45周的观察中，移植胚胎干细胞来源神经干细胞的34只小鼠有4只长出肿瘤。在100只移植胚胎成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中34只发现肿瘤，概率和胚胎干细胞相当。在55只移植成人成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中46只发现肿瘤，概率远高于胚胎干细胞。在36只移植肝细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中10只发现肿瘤，概率高于胚胎干细胞。8只移植胃上皮细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中未发现肿瘤。病理学检查证实肿瘤均为畸胎瘤，部分为恶性畸胎瘤。　　研究还发现，以前认为致瘤性很强的c-Myc在去掉后并没有减少iPS神经干细胞的致瘤性，相反以前认为没有致瘤性的Nanog基因却可以明显增强iPS神经干细胞的致瘤性。　　这次试验的另一个意外结果是并未发现在生成的肿瘤细胞中有c-Myc或其他基因的激活。以前的观点认为，转入的癌基因是iPS致瘤性的基础，只要在iPS细胞诱导成功后通过各种方法去除已完成使命的癌基因即可使iPS细胞免于致瘤性。这次试验的结果无疑给这些想法留下了阴影，而且使iPS致瘤的机制更加扑朔迷离。

胆固醇稳态对机体正常的细胞和系统功能至关重要，胆固醇平衡失调是心血管疾病、神经退行性疾病和癌症等其他疾病的基础[1]。胆固醇代谢包括内源性胆固醇合成、吸收和排泄等环节。研究表明，胆固醇在体内不能被降解，有效排泄是维持其稳态的重要环节[2]。体内积累的胆固醇最终通过肠道以粪便消除胆固醇和胆汁酸的形式达到平衡，目前已知的胆固醇排泄途径包括了胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport，RCT）途径和经肠胆固醇排泄（transintestinal cholesterol excretion，TICE）途径；前者是肝脏将胆固醇转化为胆汁酸后经肠排出，后者是由血直接经肠道分泌和排出血浆脂蛋白来源的胆固醇，二者交汇于肠道，因此，肠道在胆固醇稳态中发挥了重要作用[3-4]。调血脂治疗是防治体内高胆固醇含量诱导的相关疾病的有效方法，目前临床常用调血脂药物他汀类的作用是通过降低低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）以限制内源性胆固醇合成，从而防治心血管等疾病的发生发展，但其相关发病率和死亡率仅降低了30%[5]。这意味着需要更多策略来解决这个严重的公共卫生事件。 雷公藤红素（celastrol，CeT）是一种从传统中药雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.中提取分离出的活性成分，具有抗炎、抗癌和抗动脉粥样硬化等多种药理活性[6]，且具有良好的成药性，被《Cell》杂志列为最可能转化为现代药物的5种有潜力传统药物之一[7]。Zhang等[8]前期研究发现，体外有效成分为CeT的南蛇藤能够通过在促进RCT减少脂质蓄积方面具有积极作用，其机制主要是通过激活清除剂受体B类成员1（scavenger receptor class B member 1，SRB1）、ABC转运体和细胞色素P450家族7亚家族A成员1（cytochrome P450 family 7 subfamily A member 1，CYP7A1）途径促进胆固醇代谢。然而，有关CeT调控胆固醇代谢的作用机制探索尚不完善。此外，迄今为止，并无有关CeT通过调控肠道TICE途径介导胆固醇代谢的相关研究。因此，本研究采用网络药理学和系统生物学理论，通过构建“CeT-靶点-肠道胆固醇代谢”多层次网络，初步预测CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢的作用机制[9-10]，并结合实验深入探讨和验证CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢的作用及机制，旨在为维持体内胆固醇稳态提供新的方向和理论依据。 1 材料 1.1 细胞 大鼠小肠隐窝上皮IEC-6细胞（批号ZQ0783）由中国科学院上海细胞库提供。 1.2 药品与试剂 CeT（批号C0869）购自美国Sigma公司；肝X受体α（liver X receptor α，LXRα）抑制剂GSK2033（批号HY-108688）、Bodipy荧光染色（批号HY-W090090）购自美国MCE公司；0.25%胰蛋白酶（批号PB180229）购自美国Hyclone公司；DMEM高糖完全培养基（批号ZQ-121）、DMEM基础培养基（批号09122）购自上海中乔新舟生物科技有限公司；磷酸酶抑制剂（批号CW2383S）、蛋白酶抑制剂（批号CW2200S）、BCA试剂盒（批号CW0014S）、SDS-PAGE试剂盒（批号CW0022S）、Loading buffer（批号CW0028S）液购自康为世纪生物科技股份有限公司；CCK-8试剂盒（批号C0037）、RIPA裂解液（批号P0013B）、ECL化学发光试剂盒（批号P0018S）购自碧云天生物技术股份有限公司；油红O染色试剂盒（批号G1262-4）购自北京索莱宝科技有限公司；PVDF膜（批号ISEQ00010）购自美国Millipore公司；兔抗三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G5（adenosine triphosphate-binding cassette transporters G5，ABCG5）抗体（批号27722-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号10494-1-AP）、山羊抗兔二抗（批号SA00001-2）购自美国Proteintech公司；兔抗ATP结合盒转运蛋白G8（ATP-binding cassette transporters G8，ABCG8）抗体（批号A01482-2）购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗NPC1样细胞内胆固醇转运蛋白1（NPC1 like intracellular cholesterol transporter 1，NPC1L1）抗体（批号PA5-116672）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；兔抗LXRα抗体（批号ab41902）、DAPI染液（批号ab228549）购自英国Abcam公司。 1.3 仪器 ix 73型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；FC型酶标仪、Forma 3系列CO2培养箱、EVOS fl auto全自动荧光倒置荧光学显微镜（美国Thermo Fisher Scientific公司）；ChemiDoc XRS+化学发光成像系统、Mini-PROTEAN Tetra蛋白电泳系统（美国Bio-Rad公司）。 2 方法 2.1 网络药理学研究 将PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到的CeT 3D结构导入PharmMapper（http://www. lilab-ecust.cn/pharmmapper/）进行药物靶点预测。通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）得到肠道和胆固醇代谢靶点。并与CeT靶点取交集得到共有靶点；通过STRING（https://STRING-db.org）进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建，并导入Cytoscape 3.9.1软件构建网络模型并分析；通过DAVID（https://david. ncifcrf.gov/）进行基因本体（gene ontology，GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；利用PDB（https://www.rcsb.org/）筛选并下载分辨率小于0.25 nm的靶点的结晶复合式，结合上述得到的CeT 3D结构，采用Autodock进行分子对接，运用PyMol可视化处理。 2.2 实验验证 2.2.1 IEC-6细胞培养 IEC-6细胞用DMEM高糖完全培养基于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中常规培养。 2.2.2 CCK-8法检测细胞存活率 将对数生长期的IEC-6细胞接种于96孔板中，5×103个/孔。每孔加入100 μL含不同浓度（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 μmol/L）CeT的培养基，另设置加入无药物培养基的对照组，每组设置5个复孔，培养箱中培养24、48 h。每孔加入10 μL CCK-8试剂，于培养箱中孵育1～2 h后，采用酶标仪在450 nm处检测吸光度（A）值，计算细胞存活率。 细胞存活率＝A给药/A对照 2.2.3 油红O染色评估CeT对肠上皮细胞胆固醇的影响 设置对照组、模型组和CeT（0.05、0.10、0.20 μmol/L）组，除对照组外，其余各组加入DMEM基本培养基配制的胆固醇胶束（cholesterol micelles, C-M，10 mmol/L）构建肠上皮细胞高胆固醇模型[11]，给药组加入不同浓度的CeT溶液，对照组加入不含药物的培养基。干预24 h后，加入ORO Fixative固定液固定细胞；加入1 mL 60%异丙醇浸洗；加入油红O染液（ORO Stain A∶ORO Stain B＝3∶2），洗涤至孔内无红色剩余；加入Mayer苏木素染色液，洗涤；加入油红O染液缓冲液；加入蒸馏水覆盖细胞并拍照，使用Image-Pro Plus软件以脂滴与整个图像的面积比进行定量。 2.2.4 Bodipy荧光标记法 按“2.2.3”项下方法进行分组和给药，干预24 h后，PBS洗涤，室温下多聚甲醛固定30 min；每孔加入2 μmol/L Bodipy染色液，于37 ℃细胞培养箱中孵育15 min；弃去染色液，PBS洗涤；DAPI复染核5 min，PBS洗涤；观察并拍照。使用Image-Pro Plus软件以荧光强度进行统计。 2.2.5 Western blotting检测TICE相关蛋白表达 按“2.2.3”项下方法进行分组和给药，干预24 h后，收集细胞；PBS洗涤后使用蛋白裂解液提取总蛋白质，BCA定量法测定蛋白质浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶封闭3 h，用TBST洗涤后加入一抗，4 ℃孵育过夜；洗涤后加入二抗，室温孵育2 h；洗涤后进行显影，使用Image-Pro Plus软件分析条带灰度值。 2.2.6 免疫荧光检测LXRα/ABCG8和LXRα/ NPC1L1通路相关蛋白的影响 设置对照组、模型组、CeT（0.1 μmol/L）组、GSK2033（10 μmol/L）组和CeT＋GSK2033组，除对照组外，其余各组加入DMEM基本培养基配制的胆固醇胶束（10 mmol/L）构建肠上皮细胞高胆固醇模型，各给药组加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基。干预24 h后，PBS洗涤3次；4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次后加入Trition X-100，室温下通透10 min；PBS洗涤3次后，加入免疫染色封闭液封闭60 min，吸去多余的牛血清白蛋白；分别滴加100 μL LXRα（1∶200）、ABCG8（1∶200）、NPC1L1（1∶200）一抗，4 ℃孵育过夜；回收一抗，PBS浸洗3次，滴加100 μL二抗（1∶300），室温避光孵育60 min；PBS洗涤3次，滴加DAPI复染核15 min，PBS洗涤3次；滴加抗淬灭剂10 μL，扣片，正面朝下盖在载玻片上，荧光显微镜下观察并拍照。使用Image-Pro Plus软件分析荧光强度。 2.2.7 统计学分析 采用GraphPad Prism 9.0和SPSS 26.0软件进行统计分析，数据以表示。两组间数据分布的正态性和方差齐性分别以Kolmogo? rov-Smirnov和Levene检验确定。组间均数比较采用t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，组间有差异进一步采用SNK-q检验进行两两比较。 3 结果 3.1 网络药理学研究 3.1.1 CeT-肠道胆固醇代谢靶点 通过TCMSP等数据库得到94个CeT相关靶点。通过NCBI Gene等数据库得到15 415个肠道相关靶点、14 177个胆固醇代谢相关靶点。并构建韦恩图预测CeT-肠道胆固醇代谢共有靶点，见图1。 图片 3.1.2 CeT-靶点-肠道胆固醇代谢网络构建 将PPI导入Cytoscape 3.8.1软件进行可视化，发现1个关键的子网络，见图2。 图片 3.1.3 CeT-肠道胆固醇代谢的GO功能富集分析 对CeT调控肠道胆固醇代谢的作用及机制进行GO富集分析，分别得到855个生物进程、17个细胞组成、53个分子功能，根据P＜0.05，选出排名前10的条目，见图3。 图片 3.1.4 CeT-肠道胆固醇代谢的KEGG通路富集分析 CeT调控肠道胆固醇代谢的通路涉及34条，根据P＜0.05，选出排名前10的通路，见图4。其中，主要涉及脂肪的消化和吸收、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）等信号通路。其中，肠道脂质代谢的关键通路（fat digestion and absorption）的靶点（ABCG5、ABCG8、NPC1L1）主要涉及CeT-靶点-肠道胆固醇代谢网络的关键网络之一（图5）。并且该网络主要涉及胆固醇排泄的关键途径——TICE途径。 图片 图片 3.2 分子对接分析 CeT与NR1H3（LXRα）结合能为?28.131 4 kJ/mol，可视化显示，匹配度良好，化合物与靶点结合的最优构象以氢键的方式呈现，结合活性良好，见图6。 图片 3.3 体外实验研究 3.3.1 CeT浓度筛选 不同浓度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L）的CeT分别干预IEC-6细胞24、48 h后，如图7所示，干预24 h时随着CeT浓度的增加细胞存活率降低，CeT的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）为0.2 μmol/L。本研究在探索CeT安全浓度调控IEC-6细胞胆固醇代谢活性的同时，为了更进一步研究CeT在IC50时是否较安全浓度的效果更好，因此，选择0.05、0.10、0.20 μmol/L的CeT处理细胞24 h进行后续研究。 图片 3.3.2 CeT对IEC-6细胞内脂质的影响 如图8所示，油红O染色与Bodipy荧光标记结果均显示，与对照组比较，胆固醇胶束干预显著增加脂滴染色和荧光强度（P＜0.001），表明造模成功；与模型组比较，各剂量CeT均显著抑制IEC-6细胞中脂质积累（P＜0.05、0.01、0.001）。 图片 3.3.3 CeT对TICE途径关键蛋白的影响 NPC1L1是胆固醇吸收的重要蛋白，ABCG5/G8与胆固醇流出密切相关。如图9所示，与对照组比较，模型组NPC1L1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），ABCG5和ABCG8蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，CeT（0.2 μmol/L）组NPC1L1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），CeT（0.1、0.2 μmol/L）组ABCG5和ABCG8蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。因此，CeT可能通过抑制NPC1L1，促进ABCG5、ABCG8的表达，调控TICE途径介导的胆固醇摄取和流出。 图片 3.3.4 LXRα是CeT调控TICE途径的关键蛋白 如图10所示，与对照组比较，模型组LXRα、ABCG8表达显著降低（P＜0.01），NPC1L1表达显著增加（P＜0.001）；与模型组比较，CeT组LXRα、ABCG8表达显著增加（P＜0.001），NPC1L1表达显著降低（P＜0.01），LXRα抑制剂GSK2033组ABCG8表达显著降低（P＜0.01），NPC1L1表达显著增加（P＜0.05）；与CeT组比较，CeT＋GSK2033组LXRα、ABCG8表达显著降低（P＜0.01），NPC1L1表达显著增加（P＜0.01）。因此，CeT可能通过促进LXRα的表达，调控TICE途径中的关键蛋白NPC1L1、ABCG8介导的胆固醇摄取和流出。 图片 4 讨论 胆固醇广泛存在于机体中，具有广泛的生理作用，是组织细胞中不可缺少的重要物质，它不仅参与细胞膜的形成，也是合成胆汁酸、维生素D及甾体激素的重要原料，但当其过量时便会导致高胆固醇血症，研究表明，心血管疾病、胆石症和肿瘤与高胆固醇血症密切相关[12-13]。胆固醇在体内不能被降解，机体有效排泄胆固醇是维持胆固醇稳态的重要环节[2]。因此，促进体内胆固醇排泄以维持体内胆固醇的动态平衡可能是治疗胆固醇失衡相关疾病的新策略。 基于此，本研究通过网络药理学方法，探讨CeT通过调控肠上皮细胞胆固醇代谢的潜在靶点及相关机制。PPI网络发现，CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢涉及1个核心子网络。其中，ABCG5/8与NPC1L1为胆固醇摄取与流出相关的核心靶点。本研究通过体外构建和模拟肠上皮细胞高胆固醇环境，探索CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢的机制，油红O和Bodipy结果均显示，CeT能够呈浓度相关性地降低胆固醇胶束干预的肠上皮细胞内的脂质积蓄。进一步通过结合KEGG通路分析发现，该子网络中的核心靶点与肠道脂质代谢的关键通路（fat digestion and absorption）相匹配，通过深度分析该通路发现，其主要涉及肠上皮细胞摄取与流出胆固醇中的TICE途径。已有研究表明，胆固醇从体内排出的唯一途径是通过粪便直接排出或转化为胆汁酸后排出，粪便排泄可通过2种独立途径进行，第1种途径是胆汁分泌，该途径已被广泛描述和研究。第2种途径是通过TICE途径[14]。在2009年Van团队初步研究估计，TICE对野生型小鼠体内排出的粪便中性固醇总量的贡献约为30%[15]。接下来，该团队在2010年通过实验得出在小鼠中TICE途径占粪便中性甾醇排泄的70%[16]。在人体生理情况下，TICE途径排泄的胆固醇占粪便胆固醇排泄总量的35%[2,17]。TICE指由血直接经肠道分泌和排出血浆脂蛋白来源的胆固醇。包括肝源性含载脂蛋白B的脂蛋白被基底膜侧低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）和其他可能受体吸收、内化，最终通过ABCG5/G8以及其他可能的转运体从顶端膜流出排泄到肠腔[18]。另有研究发现，利用Ezetimibe抑制NPC1L1介导的胆固醇摄取可显著增强TICE途径[2]。而本研究表明，CeT干预处于高胆固醇环境中的肠上皮细胞后，NPC1L1被抑制，而ABCG5、ABCG8被激活。提示，CeT主要通过抑制NPC1L1减少肠上皮细胞胆固醇摄取和促进ABCG5、ABCG8增加胆固醇流出。 LXRα由于其抗动脉粥样硬化、去除胆固醇和抗炎活性，在胆固醇稳态的转录调控中发挥极其关键作用[19]。研究发现，LXRα可调控NPC1L1在肠上皮细胞中的表达，降低肠道胆固醇的吸收[20]。此外，ABCG5和ABCG8是LXRα的直接靶基因，常形成异二聚体ABCG5/G8发挥作用，负责将细胞内胆固醇泵入肠腔并最终通过粪便排出体外[21]。PPI子网络表明，NPC1L1、ABCG5以及ABCG8主要由LXRα交联。因此，在上述研究的基础上，通过分子对接模拟了CeT与LXRα的对接模式，结合活性良好。采用LXRα抑制剂GSK2033处理，结果显示，NPC1L1和ABCG5/G8主要受LXRα调控。提示，CeT可能通过LXRα/ABCG5/ABCG8和LXRα/ NPC1L1途径分别介导IEC-6细胞胆固醇摄取和流出，进而促进TICE途径介导的胆固醇排泄。 本研究通过网络药理学和相关实验发现，CeT可能通过抑制肠上皮细胞胆固醇摄取和促进胆固醇流出维持机体胆固醇稳态，这一效应与核心靶点LXRα密切相关，本研究拓展了CeT调控体内胆固醇代谢的机制，为维持体内胆固醇稳态和胆固醇失衡相关疾病的新药研发提供了新思路。

[font=宋体][size=15px]淫羊藿苷[/size][/font][size=15px][font=宋体]（[/font][font=&]Icariin[/font][font=宋体]，[/font][font=&]ICA[/font][font=宋体]）[/font][font=宋体]是传统中药淫羊藿的主要活性成分，在体内会被代谢为淫羊藿素（[/font][font=&]Icaritin[/font][font=宋体]，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]）发挥作用。[/font][font=&]2022[/font][font=宋体]年，以[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]为主要成分的[/font][font=&]Icaritin[/font][font=宋体]胶囊获得[/font][font=&]NMPA[/font][font=宋体]批准用于晚期无法手术的肝细胞癌的一线治疗。[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]不仅通过诱导细胞凋亡和自噬直接作用杀死肿瘤，而且调节肿瘤免疫微环境，促进抗肿瘤免疫应答。然而，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]调节[/font][font=&]TME[i][/i][/font][font=宋体]的具体机制，特别是在尿路上皮癌中，尚不完全清楚。[/font][font=&][/font][/size] [size=15px][font=宋体]淫羊藿素（[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]）通过减少肿瘤微环境中[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]（中性粒细胞胞外诱捕网）的形成和中性粒细胞浸润来预防尿路上皮癌转移。[/font][b][font=宋体]机制上，在中性粒细胞中，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]结合并抑制[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化。此外，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制[/font][font=&]ROS[/font][font=宋体]的产生，抑制[/font][font=&]MAPK[/font][font=宋体]信号通路，抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]诱导的肿瘤转移。同时，在肿瘤细胞中，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制肿瘤[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]诱导的组蛋白瓜氨酸化，从而降低[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]转录，[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]表达的下调通过[/font][font=&] JAK2/STAT3/IL-6 [/font][font=宋体]轴形成调节反馈回路并限制中性粒细胞募集。[/font][/b][font=&][/font][/size] [size=15px][b][font=&]1[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]在体外抑制尿路上皮癌细胞的恶性生物学行为[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]为阐明[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]对肿瘤的调控机制，[/font][b][font=宋体]作者通过体外实验（[/font][font=&]CCK8[/font][font=宋体]、集落形成、流式细胞术、划痕和[/font][font=&]Transwel[/font][font=宋体]等）评估了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]对恶性生物学特性的抑制作用[/font][/b][font=宋体]。结果显示[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]显著抑制多种尿路上皮癌细胞系的细胞活力，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，诱导细胞周期停滞。这些体外研究结果证明了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]作为抗肿瘤药物的潜力[/font][/size] [align=center][img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img][/align][align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]2[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制体内中性粒细胞浸润来抑制肿瘤转移[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]进一步作者研究了[/font][b][font=&]ICT[/font][font=宋体]对尿路上皮癌的体内抗肿瘤功效[/font][/b][font=宋体]。通过皮下肿瘤模型发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制肿瘤增长，增强细胞毒性[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞和[/font][font=&]M1[/font][font=宋体]型巨噬细胞的浸润，促进抗肿瘤免疫效应分子的分泌，显著抑制中性粒细胞浸润。尾静脉肺转移试验显示，[/font][b][font=&]ICT[/font][font=宋体]在体内显著抑制肿瘤转移，而在中性粒细胞耗竭后，这种对转移的抑制作用减弱。[/font][/b][font=宋体]此外，在[/font][font=&]CD4[/font][font=宋体]或[/font][font=&]CD8 T[/font][font=宋体]细胞单独耗竭后，对肿瘤转移的抑制仍然存在。结果表明[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]调节肿瘤免疫微环境中的中性粒细胞，从而通过抑制中性粒细胞浸润来增强抗肿瘤免疫。[/font][font=&][/font][/size] [align=center][img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img][/align] [size=15px][b][font=&]3[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]逆转[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]介导的肿瘤上皮[/font][font=&]-[/font][font=宋体]间充质转化（[/font][font=&]EMT[/font][font=宋体]）和干性以抑制转移[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]中性粒细胞胞外陷阱（[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]）作为中性粒细胞中[/font][font=&]NETosis[/font][font=宋体]的产物，在介导肿瘤免疫微环境中的免疫抑制中起着关键作用。[/font][b][font=宋体]作者发现[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]标志物组蛋白[/font][font=&]3[/font][font=宋体]瓜氨酸化（[/font][font=&]H3CIT[/font][font=宋体]）和髓过氧化物酶（[/font][font=&]MPO[i][/i][/font][font=宋体]）的表达显著降低，进一步通过体外共培养系统发现[/font][font=&]PMA[/font][font=宋体]诱导的[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成增强了肿瘤的侵袭和转移，而[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]有效逆转了这一作用。[/font][/b][font=宋体]此外，[/font][font=&]DNase I[/font][font=宋体]（一种[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]降解剂）与[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]表现出协同作用。体内实验进一步证实了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]对[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成的抑制作用。接着作者检查了共培养后肿瘤的[/font][font=&]EMT[/font][font=宋体]表型，发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]不仅能抑制中性粒细胞浸润，还能有效抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成，从而抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]介导的肿瘤[/font][font=&]EMT[/font][font=宋体]和干性。[/font][font=&][/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]4[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT [/font][font=宋体]通过靶向[/font][font=&] PADI2 [/font][font=宋体]和抑制自杀性[/font][font=&] NETosis [/font][font=宋体]来抑制[/font][font=&] NET [/font][font=宋体]的形成[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][b][font=宋体]为了研究[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成的机制，作者分离[/font][font=&]CD45CD11b[/font][font=宋体]中性粒细胞，用[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]处理，并进行[/font][font=&]RNA-seq[/font][font=宋体]分析。功能富集分析表明，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]调节了与[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成和趋化因子信号传导相关的通路，差异基因表达分析显示[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达显著降低[/font][/b][font=宋体]，[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]是一种与组蛋白瓜氨酸化和[/font][font=&] NET[/font][font=宋体]形成相关的基因。分子对接实验表明，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]可以在六个潜在位点与[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]结合。相关性分析表明[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达与中性粒细胞浸润有关。[/font][font=&]GSVA[/font][font=宋体]分析揭示[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达与[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]相关基因表达之间的相关性，从而得出了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]介导的[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成调控可能与[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]相关的假设，并通过一系列实验证实[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]通过抑制自杀性[/font][font=&]NETosis[/font][font=宋体]和[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化来抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]的形成。[/font][font=&][/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]5[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化和[/font][font=&]IL-6/JAK2/STAT3[/font][font=宋体]信号传导的正反馈回路来抑制中性粒细胞浸润[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]先前的研究表明，[/font][b][font=&]ICT[/font][font=宋体]不仅可以抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]的形成，还可以抑制中性粒细胞浸润。作者进一步剖析[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制中性粒细胞浸润的机制，发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]处理后与中性粒细胞募集相关的几种细胞因子下调，功能富集分析表明这种抑制可能与[/font][font=&]JAK/STAT[/font][font=宋体]信号通路有关。[/font][/b][font=宋体]体外中性粒细胞[/font][font=&]-[/font][font=宋体]肿瘤共培养系统发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]处理后招募到下腔室的中性粒细胞数量减少，[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]和[/font][font=&]IL-8[/font][font=宋体]的转录在不同肿瘤细胞系中受到抑制。鉴于[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化可以增强[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]的转录，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]与[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]抑制剂[/font][font=&]AFM32a[/font][font=宋体]的组合用于进一步的机制探索，发现[/font][font=&]ICT [/font][font=宋体]同样抑制肿瘤内[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]的表达，并且抑制[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达导致肿瘤细胞内组蛋白瓜氨酸化减少，导致[/font][font=&] IL-6 [/font][font=宋体]转录的下游减少并阻碍中性粒细胞募集。[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]水平降低可进一步抑制[/font][font=&]JAK2/STAT3[/font][font=宋体]信号通路，从而破坏[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]的正转录反馈回路。[/font][font=&][/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]6[/font][font=宋体]、[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的[/font][font=&]NETs[i][/i][/font][font=宋体]对尿路上皮癌具有预后价值[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][b][font=宋体]为了验证[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]是尿路上皮癌的预后生物标志物，作者收集了尿路上皮癌患者的组织和血液样本进行相关性分析。[/font][/b][font=宋体]结果显示[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]标志物[/font][font=&]CD66b[/font][font=宋体]和[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]标志物[/font][font=&]H3CIT[/font][font=宋体]的联合分析显示，两种标志物高表达的患者预后最差，且中性粒细胞浸润与化疗耐药性相关。肌层浸润性膀胱癌[/font][font=宋体]患者的[/font][font=&]MPO-DNA[/font][font=宋体]水平高于非肌层浸润性膀胱癌患者[/font][font=宋体]，且手术后血浆[/font][font=&] MPO-DNA [/font][font=宋体]升高的患者往往会复发。这些结果强调了中性粒细胞[/font][font=&]NE[/font][font=宋体]相关成分在预测尿路上皮癌复发和进展方面的潜力。[/font][font=&][/font][/size] [align=center][img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img][/align] [size=15px][b][font=&]7[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]与抗[/font][font=&]PD-1[/font][font=宋体]免疫疗法协同作用，以抵消[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]诱导的[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞耗竭[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]既往研究证实，[/font][b][font=宋体]中性粒细胞和[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]可以抑制肿瘤微环境中[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞的抗肿瘤功能，诱导[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞耗竭，导致免疫逃逸。[/font][/b][font=宋体]因此，作者分析了肿瘤中中性粒细胞、[/font][font=&]NETs[/font][font=宋体]和[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞耗竭之间的关系。相关性分析显示，肿瘤中中性粒细胞浸润和[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]与[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞浸润增加有关。然而，

iPSC神经细胞培养试剂【胜创生物】成功取得GlobalStem中国区总代理：人ES细胞mRNA高效转染试剂，GlobalStem公司2006年在美国成立，其团队核心技术骨干为原Lifetech部门，负责研发生产细胞转染试剂Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000及细胞培养试剂等。　　GlobalStem专注于iPSC（诱导性多功能干细胞神经分化）神经细胞转染、干细胞转染试剂，iPSC神经细胞培养、干细胞培养、原代细胞培养试剂。　　【胜创生物】http://www.shengchuangbio.com/-人ES细胞mRNA高效转染试剂　　DNA-In-Neuro：在神经细胞中的转染效率约高于Lipofectamine 2000的 3倍。　　DNA-In-Neuro：*转染效率高*低毒性*数据重复性高*操作简单。　　日前，【胜创生物】公司已成功取得GlobalStem的中国总代理权，电话咨询400-6400-850　　胜创生物以“品质第一，客户第一“为公司价值观，以引进”新产品、新技术“为己任，更多资讯关注胜创生物微信【sc-bios】获取详情！

人神经干细胞染色体是否有异常的检测的检测方法微生物检测，还是诺禾测序方法，那种比较好呢？

研究人员报告说，以能检测到皮肤中的外来入侵物而最为出名的一组免疫细胞也能通过代谢环境中的化学物质而促进肿瘤的生长。包括皮肤及那些覆盖许多身体表面的上皮组织形成了一种抵御微生物及可以引起癌症的化学毒素的关键性的屏障。（在人类中，90%的癌症起源于上皮组织。）这些组织常常充满了树突状细胞，其中包括一个叫做朗格汉斯细胞的亚组细胞，这些细胞可识别抗原并将它们“穿戴”在其表面以警示T细胞进行防御反应。这些抗原可以是微生物，或它们也可来自肿瘤。然而，令人感到惊讶的是，缺乏朗格汉斯细胞的小鼠则可不受化学性致癌作用的侵害，而Badri Modi及其同事希望能找出其原因。他们如今用一种鳞状细胞癌的小鼠模型揭示了朗格汉斯细胞可驱使健康的皮肤细胞转变成为癌性细胞。朗格汉斯细胞在对致癌物7,12二甲基苯丙蒽（DMBA）进行回应时会增加其对某种叫做CYP1B1酶的表达，这种酶会将DMBA代谢成为一种可诱导细胞内突变的化合物。文章的作者指出，DMBA是一种聚芳烃，或PAH，而这些烃类化合物一般在工业污染中非常普遍。他们说，含有PAH的颗粒物质可能是人类皮肤癌中的一种未得到正确评价的环境因素。 —————————————————————————————————————————— 令人震惊的比例（人类90%），不过PAHs尤其是苯并芘（BAP）是强致癌物倒是听说过！

胎盘亚全能干细胞定义： 　　亚全能干细胞自胚胎形成的第5到7天开始出现，能分化形成200 多种人体组织器官细胞，但不能形成一个完整的人体。胎盘亚全能干细胞是来源于新生儿胎盘组织的一族亚全能干细胞，其在发育阶段与胚胎干细胞接近，具备分化形成三个胚层的组织细胞的能力，但不会形成畸胎瘤。 　　胎盘亚全能干细胞的主要特性与功能： 　　胎盘亚全能干细胞是取自胎盘组织的一类亚全能干细胞，胎盘亚全能干细胞具有以下特性： 　　1. 具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为间充质干细胞，上皮干细胞、神经干细胞、肝干细胞，肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。可以用来修复受损或病变的组织器官，治疗心、脑血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病、骨组织病、角膜损伤、烧伤烫伤、肌病等多种疾病。 　　2.具有免疫调节作用，通过负性免疫调节功能，抑制机体亢进的免疫反应，使机体免疫功能恢复平衡，从而可以用来治疗造血干细胞移植之后的免疫排斥反应以及克隆氏病、红斑狼疮，硬皮病等自身免疫系统疾病。 　　3.胎盘亚全能干细胞定向培养的间充质干细胞是人体微环境的重要组成部分，移植间充质干细胞可以改变造血微环境，重建免疫系统，促进造血功能恢复，与造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等的治疗效果。 　　4.具有来源方便，细胞数量充足，易于分离、培养、扩增和纯化，传代扩增30多代后仍具有干细胞特性。 　　胎盘亚全能干细胞的用途： 　　胎盘作为理想的亚全能干细胞来源，在抗衰老及疾病治疗领域显示了其独特的功能，治疗疾病种类如下： 　　心脑血管系统疾病 　　糖尿病 　　肝肾损伤 　　脑及脊髓神经损伤 　　自身免疫性疾病 　　移植物抗宿主病 　　与造血干细胞共移植治疗血液病 　　缺血性血管病 　　肺及其它组织器官纤维化 　　抗衰老，恢复健康体态 　　胎盘亚全能干细胞的储存流程： 　　在新生儿娩出、胎盘剥离子宫排出后，由接生的医生尽快按照干细胞库胎盘标准采集规程进行胎盘的采集，然后放置在干细胞库特定的装置工具中，在限定时限内运送到干细胞库，由专业的技术人员进行亚全能干细胞的分离、提取、培养、检测等技术流程，直到根据最终检测结果来确认所获得的干细胞是否具有长期保存的价值。 　　保存和期限 　　目前国际上通用的干细胞保存技术是将获得的干细胞储存在-196℃深低温状态，医学研究与临床实践证明保存一百多年的细胞仍然具有活性。干细胞保存已有几十年的历史，胎盘干细胞库在与客户签订的合同期限内对干细胞库中所保管的胎盘亚全能干细胞活性负责。 　　安全性 　　胎盘的采集简便易行，不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。过去胎盘通常作为废物丢弃，而从胎盘中提取亚全能干细胞进行保存，是宝贵的生命资源再生。 　　而干细胞行业数据显示，胎盘亚全能干细胞基因稳定、不易突变，动物实验证明无致瘤性，使用安全可靠，对适应症范围疾病治疗效果好，优于传统医疗手段。 　　胎盘亚全能干细胞的优势 　　1.取材方便，原料来源充足，是生命资源的再生。 　　2.分化能力强可以定向诱导分化为间充质干细胞、血管干细胞、上皮干细胞、神经干细胞和肝干细胞等多种干细胞。 　　3.数量充足，使用方便，增殖能力强，培养后数目可达10亿，可以供多人多次使用。 　　4.在人群中使用不需要配型，不会产生免疫排斥反应，同时，血缘关系越亲近，生物利用度会越高，使用的效果越好。 　　5.治疗疾病范围广，抗衰老，恢复健康体态，心脑血管系统疾病，糖尿病，肝肾损伤，脑及脊髓神经损伤，自身免疫性疾病，移植物抗宿主病等多种疾病。

10多年来，干细胞疗法一直被认为能够给那些遭受遗传和退行性疾病折磨的人带来希望。而就在几天前，随着两个研究团队在于日本横滨召开的国际干细胞研究学会（ISSCR）年会上宣告了他们在人类临床研究中取得的成果——一项聚焦于罕见的遗传神经病，另一项则着眼于老年人的视力丧失，这一希望又朝着现实迈出了一步。　　美国加利福尼亚州纽瓦克市干细胞公司报告了用人体神经干细胞治疗梅氏病（PMD）所取得的鼓舞人心的研究成果。PMD是一种渐进式的致命疾病，该病通过基因突变抑制了髓鞘的正常生长，后者是大脑中包裹神经纤维的一种保护物质。缺乏髓鞘，神经信号便会流失；病人，通常是婴儿，便会经历运动协调能力退化以及其他神经病症状。据干细胞公司负责研究的副总裁Ann Tsukamoto介绍，该公司之所以选择PMD来测试其神经干细胞技术，缘于目前尚没有这种疾病的治疗方法，且通过基因检测和磁共振成像能够确诊这种疾病。她说：“这便为最有效的早期介入创造了一个机会。”　　该公司建立了一个从成熟神经组织中分离出的高度纯化的神经干细胞库。研究人员将这些神经干细胞注入啮齿动物体内后，它们并没有形成肿瘤，事实上，这些细胞在小鼠的大脑中游走，并分化成不同类型的神经细胞，其中就包括分泌能够保护神经纤维的髓鞘的细胞。Tsukamoto介绍说，当神经干细胞被注入小鼠后，它们表现出了“强大的移植和迁移能力，并形成新的髓鞘”。　　该公司如今正赞助对4名PMD婴幼儿患者进行该技术的初期安全试验。加利福尼亚大学旧金山分校的研究人员，向每位患者大脑中的4个区域中的每一个区域移植了7500万个神经干细胞，并随之进行了免疫抑制治疗，这样受体才不会排斥外来的细胞。Tsukamoto报告说，在试验过程中并没有出现安全隐患。此外，在18个月后进行的磁共振成像显示，在轴突周围形成了新的髓鞘，并且对患者进行的临床观察表明，他们的运动机能保持稳定或出现了小幅提升。干细胞公司如今正计划进行更大规模的试验。Tsukamoto表示，一旦这种疗法被证明是有效的，它将带来多发性硬化、大脑性麻痹和阿尔茨海默氏症的神经干细胞新疗法。　　在这次会议上，神户市日本理化研究所（RIKEN）发育生物学中心的干细胞研究人员Masayo Takahashi，报告了她的研究小组在针对与年龄相关的黄斑变性（AMD）的临床前研究所取得的进展。在AMD中，视网膜色素上皮（RPE）细胞的生长出现了问题，并且位于视网膜下部的血管出现了渗漏。这些情况导致眼睛中心部位的视力下降。Takahashi的研究小组研制出一种方法，即用外科手术摘除有问题的血管，同时用源自病人自身细胞的新RPE细胞替代受损的RPE细胞。利用被称为细胞再编程的一项技术，研究人员采集了病人的皮肤细胞，并将其转化为所谓的诱导多能干（iPS）细胞，这种细胞能够分化成人体中的所有细胞。研究人员随后将iPS细胞转化为RPE细胞。由于iPS方法使用的是病人自身的细胞，因此避免了对免疫抑制药物的需求。　　由Takahashi小组生成的RPE细胞表现出了真正人体RPE细胞的特征结构和基因表达模式。她报告说，将它们注入小鼠并没有引发肿瘤，并且这些细胞在移植到猴子体内后存活了6个多月。Takahashi希望在得到必要的批准后，能够在1年内开展人体试验。　　英国剑桥研究学院癌症中心的干细胞研究人员Fiona Watt指出，在ISSCR上发表的这些研究结果将帮助该领域“积攒力量”。而美国哈佛医学院的干细胞科学家George Daley则更为乐观。他说，记住这次年会上报告的这些进展；并表示对明年在波士顿召开的2013年ISSCR年会充满期待。

http://www.biomart.cn//upload/userfiles/image/2012/02/1328771705.jpg英国剑桥大学科学家首次从人皮肤样品中构建出大脑皮层细胞(cerebral cortex cell)---这些细胞组成大脑灰质。2012年2月5日，这项研究结果在线发表在《自然-神经科学》期刊上。大脑皮层疾病包括从诸如癫痫和自闭症之类的发育疾病到诸如阿尔茨海默(Alzheimer)疾病之类的神经退化疾病。这些研究发现将使得科学家们能够研究人大脑皮层如何发育和它如何“连接接通”以及这种接通如何出错(一种导致学习障碍的常见原因)。它也将允许科学家在实验室中重建诸如阿尔茨海默疾病之类的大脑疾病。这将给予他们之前不可能获得的启示，允许它们实时观察疾病发展同时也可测试阻止疾病发展的新药物。剑桥大学生物化学部门Rick Livesey 博士是这篇研究论文的主要研究员。他说，“这种方法让我们有能力研究人大脑发育和疾病，而这在5年前是难以想象的。”对他们的研究而言，科学家从病人中获取皮肤活组织，然后将来自皮肤样品中的细胞重编程为干细胞。这些干细胞如同人胚胎干细胞一样就能够被用来产生大脑皮层细胞。Livesey博士补充道，“我们正使用这种体系来重建阿尔茨海默疾病。阿尔茨海默疾病是世界上一种最为常见形式的痴呆症。当前在英国痴呆症影响着800000个人。这种疾病主要影响一种神经细胞类型，而这种神经细胞我们已能够在实验室中制造出来，因此我们在实验室中有一种非常好的工具创建出该疾病的一种完整的人类模型。”英国阿尔茨海默疾病研究中心是英国一家主要的痴呆症研究慈善组织。该中心研究主任Simon Ridley说，“我们为资助了这项研究而感到非常高兴。这项研究向前迈出了积极性的一步。在实验室中将干细胞变成完全功能性的神经细胞网络很有希望能够解密诸如阿尔茨海默疾病之类的复杂大脑疾病。痴呆症是我们时代面临的最大医学挑战，我们迫切需要更多地了解和如何阻止该疾病。我们希望这些发现能有让我们更接近这种目标。”

体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。 我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一.鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。1． 材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置 灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧 排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料 培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。2． 结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。二．新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRG细胞，进行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。

近日哈佛医学院和哈佛牙科学院的研究人员在培养皿中模拟一种罕见的遗传性疾病时，发现了一种新方法可以扭转成熟细胞的生物钟，使细胞返回成体干细胞状态。由此生成的新“干细胞“可在培养基及动物模型中分化为各种细胞类型。新发现发表在《自然-医学》（Nature Medicine）的网络版上。“新发现对于推动个体化用药尤其是组织工程学的发展具有重要的意义，”哈佛医学院细胞生物学系教授及哈佛牙科学院院长Bjorn Olsen说。进行性骨化性纤维发育不良（FOP）是一种罕见的遗传性疾病，目前全球的患者不到1000人。临床表现为急性炎症引起软组织转变为软骨和骨骼。在漫长的几十年病程中，患者身体的各个部分逐渐发生僵化，目前临床对此病征尚无有效的治疗策略。哈佛医学院及波士顿贝斯以色列女执事医疗中心的医学系讲师Damian Medici对来自这些患者的病变软骨细胞和骨细胞进行检测时，发现不同于正常的骨骼组织，病变细胞中包含有上皮细胞（一种排列在血管内壁的细胞）特异的生物标记物，这使得Damian Medici开始怀疑在FOP患者软组织中生成的软骨和骨是否有可能起源于内皮细胞。Medici和他的同事们将引起FOP的突变基因导入到正常上皮细胞中，意外地发现上皮细胞转化成了与间充质干细胞或成体干细胞非常相近的细胞类型，这些细胞可以分化为骨骼、软骨、肌肉、脂肪，甚至是神经细胞。研究人员在接下来的试验中证实当不使用突变基因时，用特异的蛋白TGF-β2或BMP4（功能与突变基因效应非常相似）孵育上皮细胞均可有效地诱导细胞重编程。进而Medici证实这些重编程细胞在培养皿和动物模型中均可诱导分化为一些相关的组织类型。“我们发现这些新细胞与骨髓间充质干细胞并不完全相同，两者之间存在一些非常重要的差异，”Medici说：“然而新细胞却拥有与骨髓间充质干细胞相同的潜能性和可塑性。”Olsen 说：“通过这个系统我们简单地重复和模拟了在自然界发生的过程。从这个意义上来说，它相比于当前其他的细胞重编程技术更少一些人为的影响。”“新发现必将推动组织工程学和个体化医疗领域的发展。可以想见或许在某天患者就可以通过获取自身的上皮细胞，将其培养为所需的组织类型进行移植，这样同时还避免了宿主免疫排斥等问题，”Medici和Olsen echo说。

俄亥俄州哥伦布市一项新的研究表明，成熟脑细胞表面的三种特定蛋白量的增加可促使细胞产生新的生长延伸。该研究探讨了小鼠脑神经细胞上的三个相关的受体蛋白：GPR3，GPR6和GPR12。当研究人员增加这三种蛋白的量后，细胞生长延伸比蛋白水平正常时的神经细胞的生长大三倍，延伸速度比对照细胞快4-8倍。俄亥俄州立大学医学中心的项目主持人Yoshinaga Saeki说，“我们的研究结果显示，这三种蛋白可能是用于治疗中风、脑和脊髓损伤及神经退行性疾病的重要靶点。”该研究刊登在4月6日的《生物化学杂志》（Journal of Biological Chemistry）上。 这些蛋白量的增加与神经细胞cAMP内的一种重要的信号分子的水平的增加有关。这个分子在调控神经细胞生长、分化和生存，以及传输神经冲动的轴突再生中起着关键作用。随着哺乳动物神经细胞的成熟，其细胞内的cAMP水平下降，这可以部分解释为什么成熟神经细胞受损的轴突不能再生。神经外科副教授、俄亥俄州州立dardinger神经肿瘤及神经科学实验室主管Saeki声称，“我们的发现为cAMP在轴突生长中起着重要作用这一观点提供了更多证据，并显示出这些受体蛋白可能在调节神经细胞cAMP的产生中起主要作用。” 该研究的第一作者Shigeru Tanaka是Saeki所在实验室的一名博士后研究员。在本项研究中，他与同事从小鼠与大鼠脑组织神经母细胞瘤中取得神经细胞，使之在培养基中生长以了解更多关于这三种蛋白及其调控cAMP生长中的作用。他们向这些细胞中注入三种基因以增加这三种蛋白的含量水平，然后用一种被称为核糖核酸干扰的实验室技术关闭这三种蛋白的产生。上述三个蛋白分子中GPR3在神经细胞中最为丰富，而GPR12刺激神经细胞延伸的作用最强。研究表明，阻断GPR3的产生会大大减慢神经细胞的生长速度，研究者们通过修复GPR3或GPR12的产生扭转了这种效应。三种蛋白质的含量水平高也与较高水平的cAMP有关，同时GPR6和GPR12能增加两倍到三倍的水平。 Saeki说，“总的来说，我们的研究结果显示，这三种蛋白能加快神经细胞的生长即使在抑制分子的存在下也是如此，我们迫切希望能找出可以在临床前中风或脊髓损伤动物模型身上重现此结果的方法。”来源：生物谷

http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/201208/2012080216013081.jpg癌症研究人员可以测定肿瘤细胞基因组的序列，扫描其异常的基因活性，剖析其突变的蛋白质和研究它们在实验室培养皿中的生长，但研究者一直无法跟踪细胞形成肿瘤的过程。现在三个独立研究小组在小鼠体内做到了这一点。他们的研究结果支持这样的观点：一小部分细胞驱动肿瘤的生长，而想要治愈癌症可能需要将这些所谓肿瘤干细胞清除。目前还无法确认，这些从脑瘤，肠癌和皮肤癌研究的结论是否适用于其他类型肿瘤，但是得克萨斯大学西南医学中心的路易斯·帕拉达认为，如果它们适用于其他肿瘤，"将深刻地改变目前的化疗疗效评价和临床疗法的制定标准"。 不仅是看某种疗法是否缩小肿瘤，研究人员将更关注是否杀死了正确的细胞。帕拉达和他的同事们想检测是否特异性标识健康成人神经干细胞的一个遗传标记，也可标识神经母细胞瘤中的癌症干细胞。他们发现，所有神经母细胞瘤样本中至少有几个标记细胞 - 大概是干细胞。未标记细胞可被标准化疗杀死，但肿瘤可迅速恢复。进一步的实验表明，未标记细胞起源于标记的细胞祖先。当研究者把化疗与抑制标记细胞的遗传手段相结合进行治疗时，帕拉达说，肿瘤显著缩小到"残留遗迹"的水平。在另一项研究中，荷兰乌得勒支Hubrecht研究所的干细胞生物学家们把注意力瞄着了肠道。利用药物驱动的荧光素标志物表达系统，他们在小鼠体内证实，多种不同类型的肿瘤细胞，其实是来源于同一干细胞的。而且，这些干细胞是肿瘤发展的驱动力。对皮肤癌的研究，Blanpain和他的小组标记单个肿瘤细胞，而不是特异地标记干细胞。他们发现，细胞表现出两种不同的分工模式：它们要么在慢慢耗尽前分裂出少数细胞，或者产生许多细胞。这再次证实，一类独特的细胞亚群是肿瘤生长的驱动力。研究者说，下一步的研究计划将是，搞清楚这些实验所跟踪的细胞如何与通过多年移植实验所确定的，假定的癌症干细胞相联系的。研究人员已经紧锣密鼓地在寻找杀死这些细胞的方法;现在他们有更多的工具来测试这样的策略是否会奏效。

中国科技网讯 据物理学家组织网近日报道，美国麻省理工学院和佐治亚理工学院研究人员开发出利用机器人操纵来自动发现和记录活体大脑中神经元信息的方法，即用一种全细胞膜片钳制动一个微小的空心玻璃针，在神经细胞的膜上开孔，以记录其内部电活性。该研究成果刊登在5月6日《自然·方法》期刊上。 这种深入大脑中神经元内部运作的方式可提供大量有用的信息，如电活性模式、细胞内部状况、甚至基因在某一时刻被闭合的剖面。然而，能够实现这个入口非常困难，目前世界上只有极少数实验室在进行尝试，这种自动发现和记录活体大脑中神经元信息的最新方法有望改变该领域研究现状。研究人员证明，在一个细胞检测的计算机程序的引导下，与人工相比，该自动装置识别和记录活老鼠大脑中的神经元信息具有更好的精度和速度。 采用新型自动化装置消除了对活体细胞的活动进行数月定向和长期搜索的需要。采用这种技术，科学家可将大脑中数千个细胞划分成不同类型，还可绘制其彼此之间的连接，并从正常细胞中找出病变细胞。 研究人员称，该方法在研究大脑疾病方面将会尤其有用，如精神分裂症、帕金森氏症、自闭症和癫痫。科学家们一直难以描述这些疾病中一个细胞与其具有电活回路和性能的分子集成。描绘出疾病如何改变活体大脑内特定细胞分子，将会更好地发现药物的靶标。 如果通过人工对这种精密仪器进行操作，需花上4个月的训练时间，最终还可能不是很精准，于是研究人员将这项任务交与机器人来操作，其机械手臂由计算机程序做指导。研究人员说，在神经科学中使用机器人来研究有生命的动物还仅仅是个开始，而像这样的机器人可能被用于在大脑中有目标点地注入药物，或提供基因治疗载体，希望新方法也能激励神经学家追求各类机器人自动化，例如在光遗传学方面，利用光有针对性地干扰神经回路和确定神经元在大脑功能中发挥的因果作用。(记者 华凌) 《科技日报》（2012-05-11 二版）

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）最常见且严重的微血管病变之一，常伴有肾小球硬化和肾小管间质纤维化，最终可发展为终末期肾脏病（ESRD），严重危及生命。西医治疗DN主要以降糖、降压、调脂、抗感染为主，但这些手段仍难以阻止炎症反应与肾纤维化的发生，且存在一定的局限性及不良反应，因此，探寻行之有效的DN防治策略，提高治疗水平迫在眉睫［1-3］。中医药根据辨证分型对DN进行治疗已有上千年的历史，对其记载可追溯至《黄帝内经》之“消瘅”及“消渴病”继发的“虚劳、水肿、尿浊、关格、肾劳”等，可通过调节代谢、自噬、抗氧化、抗炎、抗纤维化等机制，对DN进行多靶点调控治疗。在改善DN客观指标、保护肾功能及远期疗效方面，中医药都显示出了独特的优势［4-5］。 黄芪六一汤始载于《太平惠民和剂局方》，由黄芪60 g、甘草10 g组成，具有大补肺气、滋益肾水、调和脾胃的功效［6］。课题组前期发现［7-11］，由黄芪六一汤提取、分离出来的黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖、甘草酸所组成的黄芪六一汤组分（简称“HQD”）具有防治DN、显著改善肾功能的作用。并鉴定出HQD中6个主要原型入血成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、甘草酸）。然而，HQD作为中药复杂化学成分的混合体，其在体内发挥抗DN药效的分子作用机制尚不完全明确，制约了其深层次开发利用。 网络药理学能高效整合中药、成分和靶点之间关系，构建中药-成分-靶点网络，诠释药物与疾病之间的复杂关系，为中药及其复方作用机制研究提供了行之有效的新方法［12-13］。故本实验首先采用网络药理学技术对HQD抗DN的机制进行探索，发现HQD发挥药理作用可能与细胞自噬缺陷有关。据报道［14-15］，自噬缺陷可导致肾小管上皮细胞的损伤，而激活自噬能够减轻这一损伤从而保护肾功能。根据药效学及网络药理学实验结果，推测HQD发挥抗糖尿病肾病的作用机制可能和肾小管上皮细胞自噬水平失调有关，为验证推测结果，本研究从细胞自噬角度出发，采用DN大鼠模型对筛选出的核心通路进行验证，以期为黄芪六一汤及中药复方的分子作用机制研究及深层次开发提供创新思路与借鉴。 1　材料 1.1　仪器 EnVision酶标仪（PerkinElmer）；H1-16KR台式高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；Rayto全自动生化分析仪（Chemray 800）；Tissuelyser-24L多样品组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；三诺血糖仪（长沙三诺生物传感技术有限公司）；Multiskan FC酶标仪（Thermo Scientific）；免染蛋白印迹系统（ChemiDooTM）、蛋白快速转印仪（Trans-Blot Turbo）、胶凝成像系统（GBOXChemiXL1.4）均购自美国Bio-rad公司；电泳仪（PowerPacBasic）、核酸蛋白紫外检测仪（Biomate 3S）、垂直电泳槽，均购自美国Thermo公司；纯水超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；透射电子显微镜（日本电子JEOL）生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；台式高速微量离心机（大龙兴创实验仪器北京股份）；超薄切片机（LEICA）；组织脱水机（LEICA）。 1.2　试药 黄芪（批号220604、211104、220901，四川盛世锦荣药业有限公司）、甘草（批号201024、200306、220805，四川盛世锦荣药业有限公司），黄芪、甘草经贵州中医药大学谢军丽讲师鉴定分别为豆科植物膜荚黄芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.干燥根和根茎。细胞凋亡检测试剂盒（货号E-CK-A322，Elabscience），DAPI（货号C1002，上海碧云天生物技术有限公司），抗荧光淬灭封片剂（货号0100-01，southernbiotech），苏木素（货号H9627，Sigma）；二甲苯（货号10023418）、包埋石蜡（货号69019361）、伊红Y（水溶性，货号71014544）、中性树胶（货号10004160）均购于中国医药集团有限公司；肌酐（Scr，货号C074-d）、尿素氮（BUN，货号C010-a）、总胆固醇（TC，货号C048-a）、三酰甘油（TG，货号C019-a）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C，货号C047-a）检测试剂盒均购于长春汇力生物科技有限公司；尿蛋白测试试剂盒（货号C035-2，南京建成生物工程研究所），RIPA裂解液、PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒、1xTBST 缓冲液、5x蛋白上样缓冲液、β-actin 兔多克隆抗体（货号AC230205001）均购于武汉塞维尔生物科技有限公司；mTOR（货号66888-1-lg）、Beclin 1（货号66665-1-lg）、p-mTOR（货号66882-1-lg）、HRP标记的羊抗鼠 IgG（货号SA00001-2）、HRP标记的羊抗兔 IgG（货号20000373）鼠单克隆抗体均购于武汉Proteintech有限公司；LC3α/β（货号R10241506）、PI3K（货号N09263380）、Akt（货号M04201652）兔多克隆抗体购于沈阳万类生物科技有限公司，链脲佐菌素（STZ，索莱宝生物有限公司，批号2230520002）。 根据本课题组前期确定的HQD制备工艺［10］，按照原处方黄芪与甘草6∶1比例，取符合药典标准的黄芪饮片12 kg和甘草饮片2 kg，制备得质量分数为72.04%的黄芪总皂苷干浸膏76.02 g（含黄芪甲苷2.69%）；质量分数为70.03 %的黄芪总黄酮干浸膏31.64 g（含毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.72%、毛蕊异黄酮1.52%、芒柄花苷0.94%、芒柄花素0.31%）；质量分数为67.12%的黄芪总多糖干浸膏185.04 g，质量分数为80.05%的甘草酸精制品22.01 g。将上述制备所得黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖干浸膏与甘草酸精制品全部混合均匀，即得本实验所需HQD样品。 1.3　实验动物 SPF级雄性SD大鼠35只，体质量（300.00±10.82）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（湘）2022-0011，饲养于通风良好，室温18～25 ℃，相对湿度50%～70%，按常规定期消毒的动物房。按每笼4只分装，由专人饲养管理，自由饮水及饲料，实验操作和处理严格遵循国际准则。 2　方法 2.1　HQD抗DN的药效实验 2.1.1 　DN模型大鼠的制备 大鼠适应性喂养1周后，选取8只作为对照组，对照组大鼠喂食普通饲料。其余大鼠高糖高脂饲料喂养2周，尾iv STZ（溶于pH 4.5，0.01 molL-1无菌柠檬酸钠缓冲液）33 mgkg-1，注射4周后测定空腹血糖（FBG）及24 h尿蛋白（24 h U-Alb）含量，以FBG≥11.1 mmolL-1［16-17］，肾组织出现病变为造模成功。其中，24只大鼠造模成功，3只血糖低于11.1 mmolL-1，无死亡大鼠。 2.1.2　分组及给药 将造模成功大鼠随机分为模型组，HQD高、低剂量给药组，每组8只。以黄芪六一汤临床生药用量（黄芪60 g、甘草10 g）的4倍、1倍剂量，换算本实验的HQD高剂量（0.66 gkg-1）与低剂量（0.17 gkg-1）。按照给药剂量，每日固定时间ig 1次，对照组与模型组ig等量的0.9%氯化钠溶液，连续给药8周。 2.1.3　各组大鼠相关生化指标检测 实验期间观察各组大鼠活动情况、精神状态、毛色、进食、饮水量及排泄量状况等。末次给药后，代谢笼收集24 h尿液并记录尿量（禁食不禁水），1 400 rmin-1离心5 min，收集上清。尾静脉采血测FBG，于腹主动脉取血，4 ℃下3 000 rmin-1离心15 min，收集上清。取血后断颈处死各组大鼠，取肾脏，除去被膜，部分肾组织用于病理学、细胞凋亡等检测，其余组织于-20 ℃保存备用。采用全自动生化分析仪，检测血清Scr、BUN、TG、TC、LDL-C水平。按照尿蛋白定量测试盒说明书操作测定尿总蛋白。 2.1.4　肾脏组织病理学观察 取上述部分肾脏置于4%多聚甲醛中固定，蒸馏水冲洗，将组织包裹在石蜡块中，组织脱水，浸蜡、包埋、切片、烤片、切片脱蜡，HE染色、Masson染色，封片，光镜下观察肾脏组织病理学改变。 2.1.5　TUNEL检测细胞凋亡情况 取肾组织石蜡切片进行脱蜡、水化，以蛋白酶K工作液在25℃下消化组织15 min，PBS漂洗，按照说明书对切片进行TUNEL染色，荧光显微镜下观察采集图像，计算细胞凋亡率。 2.1.6　数据统计分析 所有数据以±s表示，统计分析采用SPSS 27单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 2.2　网络药理学研究 2.2.1　活性成分靶点预测 以HQD中6个主要原型入血成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、甘草酸）为研究对象。采用PubChem数据库 （https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载活性成分的SDF格式，将其导入SwissTargetPrediction 数据库（http：//swisstargetprediction.ch/）进行活性成分的靶点预测。剔除重复靶点，获取与6个活性成分相关的靶点。通过UniProt数据库 （https：//www.uniprot.org/）将得到的活性成分靶点蛋白名称进行标准化。 2.2.2　DN的靶点预测 通过GeneCard（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（https：//www. disgenet.org/）和OMIM（https：//omim.org/）数据库以“Diabetic nephropathy”为关键词进行检索，剔除重复得到疾病靶点，并用Venny工具将6个活性成分的作用靶点与DN靶点进行交集比对，得到其共同作用的靶点作为6个活性成分治疗DN的潜在靶点。 2.2.3　蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 为了进一步明确HQD治疗DN预测靶点之间的直接或间接调控关系，将潜在靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/）中构建PPI网络，限定物种为“Homo sapiens”，为了具有高置信度，设置minimum required interaction score≥0.9，并隐藏游离蛋白，以TSV格式保存结果，将其导入可视化的Cytoscape 3.6.0软件进行拓扑分析，筛选得到核心靶点。 2.2.4　基因本体（GO）注释及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将交集靶点导入Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html），进行GO功能富集分析；将交集靶点导入KOBAS 3.0数据库（http：//kobas.cbi. pku.edu. cn/ kobas3/genelist/），进行KEGG通路富集分析。下载分析结果，将其分别按P值和“Count”（每条通路中含有的潜在基因靶点的数量）值的大小进行排序。 2.3　实验验证网络药理学预测结果 2.3.1　透射电镜观察肾小管上皮细胞中自噬体及自噬溶酶体的形成 取“2.1.3项”下对照组、模型组、HQD高剂量给药组大鼠部分肾组织约1 cm3，经3%戊二醛预固定24 h左右，1%四氧化锇再固定2 h；依次加入30%、50%、70%、80%、95%、100%的丙酮溶液进行逐级脱水，每次20 min；脱水后，采用丙酮和Epon812包埋剂对其进行渗透和包埋；采用超薄切片机制备60～90 nm的超薄切片；并以醋酸铀避光染色10～15 min，再用柠檬酸铅避二氧化碳染色1～10 min，超纯水清洗3次，滤纸吸干、室温干燥过夜后，采用JEM-1400FLASH透射电镜对各组肾组织中的肾小管上皮细胞外形及其中的自噬体及自噬溶酶体进行观察。 2.3.2 Western blotting检测肾脏组织中自噬相关蛋白及磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信号通路关键蛋白的表达 随机从对照组、模型组、HQD高剂量给药组选取3只大鼠的肾组织，加入含蛋白酶和磷酸化酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上匀浆，裂解1 h后，12 000 rmin-1离心10 min，收集上清液；BCA法测定总蛋白浓度。每孔以20 μg蛋白上样，100 V电泳，100 V湿转；5%的脱脂牛奶封闭2 h，加入Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，显色曝光。扫描胶片，分析胶片灰度值。考察HQD对肾组织中Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、PI3K、Akt、mTOR及p-mTOR蛋白表达的影响。 3　结果 3.1　HQD抗DN的药效实验 3.1.1　各组大鼠相关生化指标检测 结果见图1。对照组大鼠精神状态良好，饮食、饮水与大小便正常，皮毛有光泽，体质量逐渐增加。模型组大鼠呈明显的多饮、多尿、多食、体质量下降等糖尿病“三多一少”症状，后期出现不同程度的体毛暗淡、稀疏、精神萎靡，反应迟钝症状。与对照组比较，模型组大鼠FBG、Scr、BUN、TG、TC、LDL-C、24 h U-Alb显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，HQD高剂量组均能显著降低上述药效指标（P＜0.05、0.01）；低剂量组FBG、Scr、BUN、TG、24 h U-Alb显著降低（P＜0.05、0.01）。 3.1.2　肾脏组织病理学观察 HE染色结果显示，细胞核呈蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。对照组肾小球结构清晰，肾小球系膜区未见明显改变。模型组大鼠肾小球系膜基质增宽、增多，基底膜弥漫增厚，肾小囊腔狭窄，肾小球体积增大。HQD给药组大鼠肾小球系膜轻度增生，肾组织损伤情况较模型组明显减轻，见图2。 Masson染色结果显示，胶原纤维、黏液、软骨呈蓝色，肌肉、胞浆、纤维素、红细胞呈红色，胞核呈蓝黑色。主要用于区分肌纤维和胶原纤维。与模型组相比，HQD给药组大鼠的肾纤维化程度较轻，见图3。 3.1.3　TUNEL检测细胞凋亡情况 荧光显微镜下组织切片上凋亡的细胞呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。每个样品选取3个高倍视野（400倍），每个高倍视野计数各视野总细胞数，同时计数各视野的凋亡阳性细胞。结果见图4。与对照组比较，模型组细胞凋亡率明显上升（P＜0.01）；而HQD高、低剂量组细胞凋亡率显著下降（P＜0.05）。 3.2　网络药理学研究 3.2.1　潜在靶点 通过检索SwissTargetPrediction得到各个活性成分所对应的靶点基因共600个，去掉重复的244个，剩余356个靶点。通过GeneCard、DisGeNET和OMIM 数据库共获得1 480个与DN相关的靶点，通过制作韦恩图分析，得到114个药物-疾病共同靶点作为活性成分治疗DN的潜在靶点，见图5。 3.2.2　潜在靶点的PPI网络分析 为了获得有关潜在靶点交互作用的信息，将114个潜在靶点上传到STRING平台，进行PPI网络分析，结果见图6。并将结果的TSV文件导入Cytoscape 3.6.0 进行可视化和拓扑分析，PPI网络包括102个节点和451条边，选择“度”（degree）、“介数中心性”（betweenness centrality）和“接近中心性”（closeness centrality）高于中位数的靶点作为关键目标，首次筛选值为degree＞6，betweenness centrality＞0.003 836 8，closeness centrality＞0.413 800 8，筛选后，获得了一个包含41个节点和258条边的新网络；随后筛选值为degree＞10，betweenness centrality＞0.007 837 44，closeness centrality＞0.571 428 57，获得包含19个节点和107条边的中心网络；为了在PPI网络中找到最关键的目标，最后一次筛选值为degree＞11，betweenness cenTrality＞0.014 000 41，closeness centrality＞0.72，筛选获得STAT3、EGFR、VEGFA、JUN、TNF、AKT1、CASP3、mTOR及IL2作为PPI网络中的核心靶点，见图7。其中，mTOR是调节自噬的关键激酶，抑制mTOR可促进自噬。 3.2.3　GO分析和KEGG分析 将114个交集靶点导入Metascape平台进行GO富集分析，共获得 1 581条结果，包含1 388条生物过程（BP）结果，122条分子功能（MF）结果，71条细胞组成（CC）结果，分别选取显著丰富的前15个结果进行可视化处理，见图8。BP主要对激素的反应、MAPK级联调节、细胞对氮化合物的反应、细胞对有机氮化合物的反应和蛋白质磷酸化的正调控等；CC主要涉及膜筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）、细胞外基质（extracellular matrix）、膜面（side of membrane）和囊泡腔（vesicle lumen）等；MF主要涉及激酶结合（kinase binding）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）、激酶活性（kinase activity）、内肽酶活性（endopeptidase activity）和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）等。表明HQD治疗DN的机制涉及多种生物学过程，体现多重治疗作用。 使用KOBAS3.0共检索到235条富集通路，选取P＜0.001的结果，获得147条显著富集通路，并按“Count” 值由高到低排列，选取前20条通路作为核心通路进行展示，见图9。显示6个成分治疗DN的靶点主要涉及癌症通路、癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等信号通路，其中PI3K-Akt信号通路、MAPK通路均与自噬调控相关。与上述“3.2.2 ”项下PPI网络分析得出的“HQD核心作用靶点”进行联合分析后，选择对自噬经典通路PI3K/Akt/mTOR进行验证。 3.3　实验验证 3.3.1　透射电镜观察肾小管上皮细胞中自噬体及自噬溶酶体的形成 结果见图10。检测自噬的金标准是电镜下可观察到结构完整的自噬体及自噬溶媒体。采用透射电镜观察对照组、模型组、HQD高剂量组大鼠肾小管上皮细胞中自噬体及自噬溶酶体的数量。结果显示，对照组肾小管上皮细胞形态结构较正常；细胞核呈椭圆形或类圆形，核仁明显；线粒体呈圆形、椭圆形或长梭形，嵴排列较紧密，胞浆中可见大量溶酶体、自噬溶酶体和空泡。模型组肾小管上皮细胞形态结构出现明显异常。细胞核呈类圆形或椭圆形，核仁明显；线粒体发生肿胀，仅可见少量残留嵴结构，基质颗粒大量丢失；胞浆中自噬溶酶体数量较对照组明显降低。HQD高剂量组肾小管上皮细胞形态结构轻度异常。细胞核呈类椭圆形或类圆形，核仁明显；部分线粒体轻度肿胀，嵴溶解断裂，基质颗粒减少；胞浆中自噬溶酶体及自噬小体数量较模型组有所增加，溶酶体与自噬小体融合较好。 3.3.2　Western blotting检测肾脏组织中自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ及PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白的表达 结果见图11。与对照组比，模型组PI3K、Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平显著升高；Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比，HQD高剂量给药组PI3K、Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平显著降低；Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。 4　讨论 自噬是真核细胞的一种自我保护机制，也是细胞内蛋白质降解的主要途径之一。自噬活性正常时，细胞能够及时降解自噬小体内包裹的受损细胞器、侵入的病原体及衰老的蛋白质等，以维持细胞稳态、能量生成及细胞器的更新［19-20］。研究表明［21-23］，DN发生时，肾脏存在显著的自噬失调。自噬缺陷可导致肾小管上皮细胞的损伤，激活自噬能够减轻这一损伤从而保护肾功能。恢复自噬活性可能成为保护肾脏免受高糖损伤的一种新的治疗选择，有望成为防治DN的新靶点。 课题组前期已鉴定出HQD中6个主要原型入血成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、甘草酸）。文献报道［24-28］，黄芪甲苷可通过激活AMPK/eNOS信号通路，改善大鼠糖尿病肾损伤；毛蕊异黄酮葡萄糖苷具有保护血管内皮细胞的作用，能延缓DN患者的血管病变；毛蕊异黄酮能通过调节NF-κB/p65/NLRP3/TXNIP炎症小体信号通路延缓DN的发展；芒柄花素可通过调节Sirt1/PGC-1α通路减轻DN大鼠的肾小管及线粒体损伤；芒柄花苷能通过降低氧化应激和炎症标志物减轻链脲佐菌素诱导的DN大鼠模型的肾损伤；甘草酸能通过调节SNARK/AMPK信号通路保护高糖诱导的肾小球足细胞损伤。然而， HQD在体内发挥抗DN药效作用的分子机制尚不完全明确，限制了其深层次研究。网络药理学能基于中药多靶点效应，从生物信息学上整体分析在HQD治疗DN上所涉及的靶点及信号通路。故本实验以HQD中6个主要原型入血成分为研究对象，采用网络药理学方法对HQD作用靶点及信号通路进行预测，并将114个潜在靶点进行了PPI分析，发现HQD可能主要作用于STAT3、EGFR、VEGFA、JUN、TNF、AKT1、CASP3、mTOR及IL2等核心靶点。其中，mTOR是调控自噬的重要因子。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白酶，是磷脂酰肌醇3激酶的相关激酶（PIKK），mTOR复合体是调节细胞自噬的关键分子之一，可作为多条信号通路的中间环节参与细胞自噬调节过程，并影响自噬标志性蛋白LC3的表达。mTOR可与其他调控蛋白相互作用至少形成两个不同的复合物，分别是mTOR复合物1（mTORC1）和复合物2（mTORC2）。虽然这两个复合物含有相同的催化亚基——TOR，但均可磷酸化不同的下游靶点，从而显示出不同的细胞功能。抑制mTOR可促进自噬，响胰岛素抵抗和炎性反应［29-30］。因此，调控mTOR不同的上游信号通路可能是治疗DN的一个新思路。 KEGG通路功能富集分析显示，HQD可能通过作用于癌症通路、癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、MAPK等信号通路发挥药理作用。其中PI3K/Akt/mTOR通路为自噬调控的经典通路，通路活化后可激活mTORC1抑制细胞自噬过程［31］。据报道［32］，Beclin-1、LC3蛋白参与自噬小体的形成与自噬溶酶体降解过程，是经典的自噬标志物。自噬小体的减少会导致Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平降低，而激活Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ表达可诱导细胞发生自噬。故本项目选择对经典自噬调控通路PI3K/Akt/mTOR进行验证，并进一步考察HQD对自噬标志蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的调节作用。Western blotting结果表明，HQD可以上调肾组织自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达，抑制PI3K/Akt通路活化，抑制mTOR的激活；透射电镜观察显示，HQD可以增加肾小管上皮细胞自噬体及自噬溶酶体数量。研究结

牛奶体细胞数的英文为somatic cell count,SCC。牛奶体细胞数是指每毫升牛奶中的细胞总数，多数是白细胞，通常由巨噬细胞、淋巴细胞、多形核嗜中性白细胞和少量乳腺组织上皮细胞等组成，约占牛体细胞数的95%，其余是乳腺组织死去脱落的上皮细胞。体细胞数反映了牛奶质量及奶牛的健康状况,在正常情况下,牛奶中体细胞数一般在20万～30万个/mL。

牛奶体细胞数的英文为somatic cell count,SCC。牛奶体细胞数是指每毫升牛奶中的细胞总数，多数是白细胞，通常由巨噬细胞、淋巴细胞、多形核嗜中性白细胞和少量乳腺组织上皮细胞等组成，约占牛体细胞数的95%，其余是乳腺组织死去脱落的上皮细胞。体细胞数反映了牛奶质量及奶牛的健康状况,在正常情况下,牛奶中体细胞数一般在20万～30万个/mL。

组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。　　　　实体组织材料的细胞分离方法　　　　对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。　　　　(一)机械分散法　　　　所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的实验室试剂软组织。　　　　(二)消化分离法　　　　组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。　　　　1、酶消化分离法　　　　酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：　　　　(1)胰蛋白酶分散技术　　　　胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用人血清 AB的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。　　　　①细胞类型胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效，但若与胶原酶合用,就能增加其对组织的分离作用。　　　　②酶的活力市售的胰蛋白酶,其活力都经过测定而有效，但配制时必须新鲜，需保存在低温冰箱中，消化时的pH和温度都要适宜，否则会影响活力，细胞的分散直接与酶的活力有关，最终使用活力为1:200或1:250，56℃pH8.0时活力最强。　　　　该酶为粉剂，保藏时要防潮，室内温度不宜过高，保存时间不能太长，若粉剂结团块,说明该部分受潮或失效。　　　　③酶的浓度胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。　　　　④温度一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为37℃，通常在37℃进行消化比室温作用快。　　　　⑤pHpH8~pH9是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时PH只能选用7.6～8.0之间，否则对细胞有损伤。　　　　⑥无机盐离子若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。　　　　⑦消化时间如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为20分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于4℃过夜也可。　　　　分离方法如下：　　　　①过夜冷消化将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。　　　　②多次提取消化法多次提取消化法有以下三种：　　　　热消化多次提取将剪碎的细胞块加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。　　　　冷消化多次提取方法同上，只是消化温度为4℃。　　　　先热消化后冷消化将组织块先用胰蛋白酶于37℃下消化20分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。　　　　(2)胶原酶(Collagenase)消化法　　　　胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。细胞培养此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。　　　　经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。　　　　鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间(小时)有差异，以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶(对细胞表面糖基有作用)，采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。　　　　除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年来，还有一种从灰霉菌中提取的Pronase新酶分散细胞更佳。　　　　2、非酶消化法(EDTA消化法)　　　　EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用(1:1或2:1)，不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。　　　　消化分离法的操作步骤：　　　　(1)剪切把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。　　　　(2)加液漂洗将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2-3次(采用倾斜，自然沉降法)。　　　　(3)消化加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次)，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。　　　　(4)弃去消化液采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。　　　　(5)漂洗将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。　　　　(6)机械分散采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。

【序号】：3【作者】：关冀弛1刘丹1陈艳阁【题名】：神经细胞三维培养技术研究进展【期刊】：精准医学杂志. 【年、卷、期、起止页码】：2022,37(06)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=jDUTNXVfqCojw0DdevfNg1SgRg5oPxJ46PI1zWMvw2TKeVOWOygv7uu8lOMdg6qOxGJYMFhSZBfxYraqcDIYskQavCAVeSBSvQRWf2u3HijFbJZB1d-K1-6Y8klBYdGdcscw3JhIMPBZx97RFKrDjA==&uniplatform=NZKPT&language=CHS

【序号】：2【作者】： 黄红云1陈琳2毛更生【题名】：神经修复学临床细胞治疗进展【期刊】：中华细胞与干细胞杂志(电子版). 【年、卷、期、起止页码】：2022,12(01)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iJTKGjg9uTdeTsOI_ra5_XUVbJPrYRFKimwQkAGBhkzoOEdf41TgOGcDsCjJJ2q_1&uniplatform=NZKPT

中国首款针对黑色素瘤、脑癌、神经胶质瘤等恶性肿瘤的硼药完成中试，最快30分钟杀死癌细胞，预计2023年用于临床.

【序号】：4【作者】：宋丽丽【题名】：细胞外基质化组织工程神经移植物修复大鼠臂丛神经缺损的研究【期刊】：吉林大学【年、卷、期、起止页码】：2022【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=hqt_j-uEELGBdZ64e_NeKorNyHTEXc4WYj-JgSxFHTEpCLC63y8VE8Mu3IzigvqsHSk6VdDKHqm2DTJ_TXRYEqQmRqDJKz4V5h2yvTxnQgxouHPXRH9w56VOku-572pIgg-Gv-EJdinh9kmJyVIkbA==&uniplatform=NZKPT&language=CHS

国际学术期刊Cell Research于4月24日在线发表了中科院上海生命科学研究院生化与细胞所刘默芳组关于Onconase抑制恶性间皮瘤细胞microRNA（miRNA）表达的最新研究成果。该工作与上海南方模式生物研究中心王庆诚教授合作完成。 Onconase是从北方豹蛙卵或胚胎中提取的一种核糖核酸酶，是RNase A超家族中最小的成员，目前已被欧盟、澳大利亚和美国FDA批准作为罕见病药物（Orphan drug）用于恶性间皮瘤临床治疗使用。因接触石棉是其主要诱因，恶性间皮瘤也俗称为石棉癌，该恶性肿瘤预后极差，至今尚无有效的治疗措施。Onconase特异性地诱导癌细胞凋亡，而对正常细胞的毒性较低，对非小细胞肺癌、乳腺癌等的临床试验目前也正在进行中。然而，作为一种很有前景的抗肿瘤药物，Onconase的细胞毒性机理尚不完全清楚。 miRNA在肿瘤发生发展中有重要作用。刘默芳研究组研究生乔萌和祖立东等发现，Onconase对恶性间皮瘤细胞的miRNA表达具有普遍下调作用，而对细胞中一些oncomiR（如miR-155和miR-21）的下游靶基因，如socs1、pten、pdcd4等肿瘤抑制基因有明显上调作用。有趣的是，该工作发现Onconase降解miRNA前体，而对miRNA成熟链无明显作用；与之一致的是，Onconase抑制Dicer对miRNA前体的加工、降低Dicer生产成熟miRNA。进一步的研究发现，Onconase对miRNA前体的切割位点偏好于U-G和U-U。 该工作揭示了Onconase抗癌活性的一种新机制，完善了Onconase的抗癌作用机理，为与Onconase有关的更加合理、有效、安全的用药提供了科学依据。 该项研究工作得到了科技部、国家自然科学基金委、中国科学院及上海市科委的资助。

虽然经过几个世纪的研究，人类的生长于发育过程中仍遗留有很多的未解之谜。人类胚胎发育的研究始于20世纪，一般以观察胚胎的组织图像的方式来研究如器官发生的机制等，传统的方式如切片一直使用至今。现今，对于胚胎3D图像的数字化构建也已经开始，使用核磁共振、X光摄影等方法均可获得胚胎的3D图像，但分辨率仍无法达到细胞水平。本研究使用了妊娠期6-14周的胚胎和胎儿共36个，结合免疫染色、3DISCO组织透明技术和光片照明技术，获得了人类胚胎细胞级分辨率的3D图像，清晰地显示了胚胎的外周神经、肌肉、血管、心、肺和泌尿系统。通过这种方法，我们可以建立人类生长发育的图库，研究人类胚胎发育的分子机制。[b]3D图像示例：1) 周围神经系统3D成像（使用中间纤维外周蛋白（Prph）的抗体标记Prph）： [/b][align=center][img=,450,317]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/2.jpg[/img] [/align][align=center]（A）7周龄胚胎的表面造影图像（左）；对Prph进行标记所得图像。[/align][align=center]（B）8周龄胚胎的表面造影图像（灰色）和标记Prph所得图像（绿色）的叠加图像。[/align][align=center]（C）8周龄胚胎的面部神经分布。表面造影图像和标记Prph所得图像的叠加（中）（右）。 [/align][align=center]感觉神经轴突和运动神经轴突在手脚的分布：分别使用胆碱乙酰转移酶（ChAT）和瞬态粘附糖蛋白-1（Tag-1）的抗体来标记。[/align][align=center]（D）在外周神经，染色产生重叠现象，但在末端Tag-1（绿色）更为明显。（D-F）ChAT染色与Prph和Tag-1均无重叠。 [/align][align=center][img=,550,177]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/3.jpg[/img] [/align][align=center]（D）9.5周龄的拇指，标记Prph和Tag-1。染色发生重叠，但在末端区域Tag-1更显著。[/align][align=center]（E）9.5周龄的左手，ChAT与Prph表达区域不同。[/align][align=center]（F）9周龄的右脚，ChAT与Tag-1表达区域不同。 [/align][align=center] [img=,550,177]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/4.jpg[/img][/align][align=center]（G）7周龄的头部，标记Prph显示颅神经。（右）对颅神经分布使用Imaris软件进行3D虚拟解剖、区分并着色。 [/align][b]2) 手足的神经分布的3D成像：对Prph和Tag-1进行免疫染色以建立胚胎和胎儿手部的感觉神经及其分支的3D图像，并可观察感觉神经随时间推移的发育情况。 [/b] [align=center] [img=,450,362]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/5-1.jpg[/img][/align][align=center]（A）8周龄标记Prph的右手，感觉神经分为尺骨神经、正中神经和桡神经。[/align][align=center]（B）右手从7周龄到11周龄的神经分布随时间的变化。肌皮神经（指针处）很快便延长深入手部。 [/align][align=center] 之后分别对ChAT和Tag-1标记，建立了运动和感觉神经的分布的图像，以确定两种神经在何处以何种方式分离。 [/align][align=center][img=,550,286]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/5-2.jpg[/img] [/align][align=center]（C）（D）9周龄的右脚和8周龄的左手的感觉神经和运动神经的3D图像。 [/align][b]3) 对肌肉生长进行3D成像分析：[/b]转录因子Pax7是有颌下门动物的肌肉干细胞标记物，是肌肉生成的关键启动因子。在肌肉的生长中，表达Pax7的细胞均匀分布于生长中的肌肉，表达肌细胞生成素（Myog）的细胞成簇分布于运动神经末端。生长中的肌肉表达了双皮质素（Dcx），可能影响神经肌肉接点的发育。 [align=center][img=,550,259]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/7-1.jpg[/img] [/align][align=center]（A）9.5周龄标记Pax7的右脚和右手。[/align][align=center]（B）10.5周龄标记Pax7与ChAT的右脚。[/align][align=center]（C）9周龄标记Myog、ChAT和Tag-1的右脚。[/align][align=center]表达Myog的细胞成簇分布于运动神经分支末端。[/align][align=center]（D）9.5周龄的左脚标记Dcx与ChAT。[/align][align=center]Dcx在肌肉（*号）和感觉神经中检测到，但在运动神经轴突中未检测到。 [/align][align=center] [img=,450,334]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/7-2.jpg[/img][/align][align=center]（E）8周龄标记MHC与Tag-1的胚胎。[/align][align=center]（中上）动眼肌肉的图像。[/align][align=center]点状线标示出了肌肉的分界线，此处照明被色素上皮所减弱。[/align][align=center]（中下）肌肉与感觉神经。（右）左臂的肌肉与感觉神经。[/align][align=center]（F）9.5周龄标记MHC与ChAT的左手，显示了肌肉与运动神经。[/align][align=center]使用不同颜色对肌肉进行了区分，同时能够观察到正在发育的骨骼。 [/align][b]4) 人类胚胎脉管系统的3D成像分析：[/b]质膜膜泡关联蛋白（Plvap）是一种由网状微血管内皮细胞表达的跨膜糖蛋白。对整个胚胎标记Plvap并成像，可以观察到致密的血管网络。对平滑肌表达的α肌动蛋白（SMA）进行免疫染色可以观察到生长中的动脉的3D结构。 [align=center][img=,450,414]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/9.jpg[/img] [/align][align=center]（A）（B）8周龄标记Plvap的胚胎。[/align][align=center]Plvap在整个胚胎中形成了致密的网络。[/align][align=center]（A中、右）右臂与右手。（B左）左腿的Z轴投射图像。[/align][align=center]（*号）血管网络穿过了除了骨骼的所有组织。[/align][align=center]（B右）面部图像。（箭头）角膜处没有血管。[/align][align=center]（C）11周龄胎儿，标记胶原IV的肋骨表面。[/align][align=center]（D左）11.5周龄胎儿的右腿和右膝，标记MyoSM的动脉。[/align][align=center]（D右）11.5周龄胎儿的右脚，标记SMA的动脉。[/align][align=center] 对胃肠道的淋巴细胞表达的Podoplanin进行标记以研究淋巴管形成，表达Podoplanin的细胞覆盖了肠胃，[/align][align=center]而含Podoplanin的微管数量较少，说明人类淋巴系统成熟可能晚于血管系统。[img=,550,181]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/10.jpg[/img][/align][align=center]（E）14周龄标记Podoplanin的消化道。表达Podoplanin的细胞位于肠胃上方。 [/align][align=center]（右）表达Podoplanin的细胞尚未发育形成淋巴管。[/align][b]5) 肺的生长发育的3D分析：[/b]标记鼠的性别决定基因Sox9转录因子和Dcx，观察到Sox9在人的末端支气管芽处表达，Dcx在每个气道的近端上皮部分表达。用Plvap标记肺部的血管，发现肺间质内微血管和大血管形成了连续的网络。肺部气道的分支方式是高度保守的，包括域分支、水平分支和垂直分支，使用Sox9/Dcx标记小支气管，可以观察到3种分支方式，并发现了不对称分支现象。 [align=center][img=,550,329]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/11.jpg[/img] [/align][align=center]（A）9.5周龄标记Sox9、Dcx和Plvap的胎儿的肺部。Sox9在上皮小管的末端表达，Dcx在近端表达。Plvap在整个肺的血管中表达。[/align][align=center]（B）肺上皮小管Z轴光学切面。[/align][align=center]（C）末端的微血管网络。[/align][align=center]（D）气道分支的3D图像。肺叶（蓝绿），支气管（红）。[/align][align=center]（E）支气管的3D图像。（右）三种分支方式。[/align][align=center] 标记SMA和平滑肌肌凝蛋白（MyoSM），两者均于围绕支气管和气道上皮小管的平滑肌处表达。标记Sox9显示出末端没有平滑肌。[/align][align=center]对平滑肌进行染色同时可以显示动脉和微动脉。可以使用SMA和酪氨酸羟化酶（TH）标记心脏来观察血管和神经分布。 [/align][align=center][img=,550,289]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/12.jpg[/img] [/align][align=center]（F）9.5周龄的标记MyoSM的肌凝蛋白平滑肌的染色。（箭头）支气管及分支。[/align][align=center]（G）11.5周龄的左肺标记SMA显示出气道平滑肌的分支方式。（箭头）动脉周围肌肉和（指针）近端气道周围肌肉。[/align][align=center]（H）10周龄的肺的分支图像。末端芽部用Sox9标记。表达SMA的平滑肌分布于不表达Sox9的近端区域。[/align][align=center]（I-K）心脏的光片显微图像。 [/align][b]6) 泌尿生殖系统发育的3D分析：[/b]人类生殖道分为两种结构：由中肾分化而来的中肾管（WD）和由中肾管诱导分化而来的副中肾管（MD）。性别决定伴随着生殖道的重构。Pax2转录因子可用于标记中肾和WD。8周龄的雄性胚胎中，MD尖端与WD紧密接触但并未完全生长。肾处于腹侧位置邻接生殖嵴。9.5周龄时MD继续沿WD延伸但并未连接。10周龄时两条MD连接，从两侧WD的中间延伸至泌尿生殖窦，同时开始降解，融合的剩余MD分化为前列腺囊。14周龄时，WD的中肾肾小管退化，附睾与输精管出现。Sox9是睾丸分化的必需因子，在睾丸索中表达，对Sox9使用免疫染色可以观察到睾丸索。[align=center][img=,350,415]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/13.jpg[/img][/align][align=center]（A）8周龄标记Pax2的胚胎。[/align][align=center]（B）（箭头）MD/WD连接。[/align][align=center]（C）（D）9.5周龄的泌尿生殖系统。（箭头）MD尾端沿WD延长但仍未融合。[/align][align=center]（E）10周龄的泌尿生殖系统。MD在底端融合（指针）并开始降解（箭头）。[/align][align=center]（F）降解的继续。[/align][align=center]（G）14周龄的泌尿生殖系统。输精管进一步发育（指针）。[/align][align=center]（H）10周龄标记Pax2和Sox9的睾丸。[/align][align=center]（I）10周龄标记Pax2的睾丸。[/align][align=center]（J）14周龄的睾丸。[/align][align=center][img=,350,452]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/14.jpg[/img][/align][align=center]（A）10.5周龄标记Pax2的泌尿生殖系统。WD连续，MD已融合。（B）11.5周龄标记Pax2的生殖系统。（箭头）WD开始降解。（C）13周龄，标记Pax2的生殖系统。（箭头）子宫大小增加，WD显著降解。（右）MD顶端发育中的输卵管纤毛。（D）8周龄标记Pax2和Plvap的睾丸。（指针）微血管覆盖了睾丸和WD。而MD却没有血管形成。（E）10周龄的雄性胎儿中，MD没有微血管形成。（F）（G）10.5和13周龄标记Pax2和Plvap的卵巢。WD和MD均有致密的血管覆盖。 [/align][align=center][/align][b]总结：[/b]将免疫标记与3D成像技术结合，能够完好地保存器官的3D结构并使分辨率达到细胞水平，简单、快速、稳定、可重复，以上这些优势适合其应用于胚胎学，可用于研究遗传疾病或畸胎。此方法的限制条件主要在材料的获得，同时使用得抗体最大数量，抗体与实验方法的兼容性和大容量数据的存储。然而其应用的广泛程度依然不可限量。以后甚至可用于建立人类生长发育的3D图库。

美国食品药品监督管理局（FDA）近日批准了Gazyva（obinutuzumab）与苯丁酸氮芥联用治疗初治型慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者。CLL是一种缓慢加重的渐进性血液与骨髓系统疾病。根据美国国家癌症研究所估计，今年将有15680名美国人被确诊患有该疾病，4580人因CLL死亡。Gazyva有助于免疫系统的某些细胞攻击癌细胞，并且需要与另一种CLL治疗药物——苯丁酸氮芥合用。在对重症CLL患者的治疗过程中，Gazyva在安全性和有效性方面表现出显著改善，此外，FDA还授予此药优先审查和孤儿药地位。FDA药物评价研究中心血液/肿瘤部门主管，Richard Pazdur博士说：“FDA对Gazyva的批准意味着对CLL患者疗法的重要补充，同时也反映了突破性疗法认定的优势，此项认定使我们与企业共同合作，加快重要新药物的开发、评估和上市。”此次批准是基于一项涉及356名受试者的随机、开放性、多中心临床研究，评估了Gazyva-苯丁酸氮芥联用组和苯丁酸氮芥单用组的药效。结果表明，联用组患者的无进展生存期得到显著提高（23个月vs11.1个月）。联用组患者的最常见不良反应包括输液反应、白细胞减少（中性粒细胞减少症）、血小板水平降低（血小板减少症）、红细胞数目降低（贫血）、肌肉和骨骼疼痛、发热等。Gazyva的说明书中含有黑框警告，提示Gazyva与乙肝病毒的再活化及一种罕见病有关，该罕见病（进行性多灶性白质脑病）能损伤大脑白质中覆盖和保护神经的物质，这是此类药物（包括其它单克隆抗体）共有的已知风险。Gazyva由罗氏子公司基因泰克上市销售。转自：http://www.hfoom.com/industry/20131106/376.html

如果要在液体环境下扫描细胞表面形貌，应该用哪种模式呢？对探针的参数又有哪些要求？我用的是NT-MDT的AFM和配套探针CSG10/NSG10，锥形针尖，刚度分别为0.2N/M和12N/M，细胞是贴壁的狗肾上皮细胞，但效果都不太好。接触模式下，探针把细胞推来推去，轻敲模式也差不多，感觉是不是探针没用对。如果给细胞加载的话，是不是球形探针比较好。

中科院广州生物医药与健康研究院裴端卿博士和潘光锦博士领导的研究组通过对人的不同组织来源的三个细胞状态（体细胞，体细胞衍生的iPS细胞和iPS细胞分化获得的神经前体细胞）的免疫原性的研究，发现细胞的免疫原性在重编程及分化后仍然具有一定的遗传记忆。这项研究成果7月26日在线发表在学术期刊Plos One上。研究人员主要比对了较为成熟的体细胞（成人皮肤来源的成纤维细胞）和较为幼稚的体细胞（胎儿脐带组织来源的间充质细胞）相应的三个细胞状态的免疫学特性。研究结果表明：由免疫原性较高的体细胞（皮肤成纤维细胞）最终获得的神经前体细胞人具有较高的免疫原性。与之相对的是，由免疫原性较低的体细胞（脐带间充质细胞）最终获得的神经前体细胞，在HLA-I表达、激活淋巴细胞等方面，均会保持较低的免疫原性。这种低免疫原性的神经前体细胞为iPS技术开拓了新的应用领域——异体移植，并且可以通过免疫原性较低的体细胞获得iPS细胞库建立异体移植的治疗模式。 http://www.cas.cn/ky/kyjz/201307/W020130731665880470908.jpg广州生物院发现细胞的免疫原性在重编程中可被遗传记忆