人肾母细胞瘤细胞

个法国研究团队评估了替莫唑胺为基础化放疗添加伊立替康和贝伐珠单抗可否改善不可切除胶质母细胞瘤患者的预后。ESMO 2012期间，B. Chauffert博士报告了该研究结果：患者无进展生存（PFS）有改善趋势。 　　这项Ⅱ随机研究共纳入了120例18～70岁的新发不可切除胶质母细胞瘤患者。患者卡诺夫斯基体能状态评分＞50分，递归分割分析（recursive partitioning analysis ，RPA）5级。患者被随机分组，每组60例，接受4个周新辅助贝伐珠单抗和伊立替康治疗，继以替莫唑胺和贝伐珠单抗同步放疗，或者接受6个月的替莫唑胺同步放疗。 　　临床因素组间平衡性良好，疾病进展后可交叉治疗。治疗16个月时的评估显示，治疗组较对照组PFS期延长，6、12个月时的PFS率分别为65%、31%和41%、18%。但是，两组的总生存（OS）相似，6、12个月的OS率分别为75%、48%和72%和50%。 　　治疗相关严重不良事件发生情况如下：治疗组中，致命性脑出血3例，胆管或消化道穿孔/感染3例（1例致命），非致命性血栓栓塞发作4例；对照组中，非致命性胆管或消化道穿孔/出血2例，非致命性肺部感染1例，非致命性血栓栓塞2例，血栓和/或中性粒细胞减少症4例。 　　研究者作出结论：替莫唑胺为基础化放疗添加伊立替康和贝伐珠单抗新辅助和辅助治疗有改善PFS的趋势，但不改善6和12个月OS。

通过交叉科学研究，提出并发展生物医学前沿新技术，是提高重大疾病治疗效果的重要手段。胶质瘤是发病率和死亡率最高的中枢神经系统肿瘤，其中胶质母细胞瘤（GBM）是最恶性的肿瘤，也被称为“癌中之王”。临床上治疗GBM以外科手术为主，同时辅助放化疗，但是效果非常有限；以手术和替莫唑胺联合治疗为例，5年生存率小于5%。因此，亟需开发新型高效的GBM治疗策略。 GMB治疗棘手的原因主要有三方面。首先， 血脑屏障（BBB） 的存在阻止了药物进入中枢神经系统，需要发展更有效的药物递送策略；其次，单一化疗药物的使用易导致耐药性的产生，需要联合新的肿瘤杀伤手段；另外，GBM具有复杂的肿瘤微环境，对其快速生长和向周围组织的浸润起到重要作用，在治疗的过程中不容忽视。 近日，中科院过程工程所生化工程国家重点实验室 魏炜 研究员、 马光辉 院士、深圳市第二人民医院 李维平 教授，作为共同通讯作者 在 Signal Transduction and Targeted Therapy 期刊发表了题为： Exploration and functionalization of M1-macrophage extracellular vesicles for effective accumulation in glioblastoma and strong synergistic therapeutic effects 的研究论文。 该研究基于工程化细胞外囊泡发展了“ 免疫调控-化学动力-乏氧激活 ”多级联动的治疗新策略，为胶质母细胞瘤的治疗带来了新思路。针对胶质母细胞瘤治疗难题，过程工程所生化工程国家重点实验室基于具有定向趋化能力的巨噬细胞的细胞外囊泡 （EVs） 和工程化的设计，提出了“免疫调控-化学动力-乏氧激活”多级联动的治疗新策略，并联合深圳市第二人民医院交叉合作，进行了个体化创新药物制剂的研发。 研究团队首先基于胶质瘤患者的临床样本和小鼠模型进行了免疫组化的研究，发现胶质瘤恶性程度越高，肿瘤组织中浸润的M2型巨噬细胞/M1型巨噬细胞的比例也相应更高，并且这些巨噬细胞大多来源于外周血。在此基础上，研究团队提出了以M1巨噬细胞EVs作为载体，一方面可以利用M1巨噬细胞的趋化特性在GBM部位大量蓄积，另一方面可以通过调控巨噬细胞表型实现GBM微环境的免疫调控。图1 胶质瘤样本中巨噬细胞的表型及其来源分析：a. 胶质瘤患者临床样本中巨噬细胞表型分析示意图；b. 不同级别胶质瘤中M1、M2和Ki67（细胞增殖指标）的分析；c. 基于TCGA数据库分析不同级别胶质瘤中M2/M1比例；d. 基于TCGA数据库分析胶质瘤患者瘤内M2/M1比例与生存曲线的关系；e. GBM组织中小胶质细胞和M1巨噬细胞的共定位分析；f. 免疫荧光染色分析GBM组织中小胶质细胞和M2巨噬细胞的共定位；g. 小鼠胶质瘤样本中巨噬细胞表型分析示意图；h. 在不同胶质瘤细胞系（U87MG、G422和GL261）中M1、M2和Ki67的分析；i. 免疫荧光染色分析不同鼠胶质瘤组织中小胶质细胞和M1或M2巨噬细胞的共定位情况；图中标尺均为50 μm 研究团队进一步在M1EVs的细胞膜和内腔差异化装载了化学激发分子对 （CPPO和Ce6） 以及乏氧药物 （AQ4N） ，以此将肿瘤微环境调控、化学激发动力学及肿瘤乏氧治疗合理有序地集成于M1EVs递送系统中。上述仿生剂型 （CCA-M1EVs） 静脉注射后，M1EVs可以携带上述组分穿过BBB进入GBM病灶，进而实现多级联动治疗：M1EVs调控免疫微环境产生大量过氧化氢，从而激发CPPO和Ce6生成自由基 （ROS） ，同时该反应消耗氧气激活细胞毒性药物AQ4N。借助上述作用的协同，在小鼠原位胶质瘤模型和患者来源的 （PDX） 模型上显著抑制了疾病的进程，大幅延长了生存期。图2 基于M1EVs的仿生剂型构建方案、抗肿瘤机制及PDX疗效：a. 仿生剂型的构建示意图；b. 仿生剂型在GBM模型中的累积及免疫调节、化学激发动力学和乏氧触发化疗的协同作用示意图；c. 基于光声成像分析仿生剂型在PDX小鼠GBM病灶中的累积；d. 各组PDX小鼠的抑瘤效果（20天核磁成像）；e. 各组PDX小鼠的生存期分析；f. 各组PDX小鼠的TUNEL分析（标尺50 μm） 十余年来，过程工程所生化室魏炜研究员和马光辉院士创制了一系列仿生递送新剂型，利用其体内的天然路径和属性，在动物模型上成功用于肿瘤、传染病、炎症性疾病的防治，并且部分剂型已通过医院伦理批准进入个体化临床前和临床研究。 深圳市第二人民医院 王晓君 博士和丁辉博士为该论文的共同第一作者，中科院过程工程所生化工程国家重点实验室魏炜研究员、马光辉院士和深圳市第二人民医院李维平教授为共同通讯作者。论文链接 ： https://www.nature.com/articles/s41392-022-00894-3

“ 内吞作用是EGFR功能的一个重要调节因子，在胶质瘤细胞中经常发生失调，并与治疗耐药性有关。然而，在GBM细胞中从未检测过TKIs对EGFR内吞作用的影响。超分辨率dSTORM成像显示，在吉非替尼处理的细胞内膜室中，β1整合素和EGFR非常接近，表明它们潜在的相互作用。有趣的是，整合素的消耗延迟了吉非替尼介导的EGFR内吞作用。EGFR和β1整合素的共内吞作用可能会改变胶质瘤细胞对吉非替尼的反应。利用球状体胶质瘤细胞扩散的体外模型，我们发现α5整合素缺失的细胞比表达α5的细胞对TKIs更敏感。这项工作首次为EGFR TKIs可以触发大量EGFR和α5β1整合素共内吞作用提供了证据，这可能在治疗过程中调节胶质瘤细胞的侵袭性。”01—研究结果1、吉非替尼可引起EGFR的内吞作用胶质母细胞瘤(GBM)是融合星形细胞和少突胶质细胞肿瘤的一个亚群，是最常和比较具有侵袭性的脑肿瘤。GBM的特征是肿瘤间和肿瘤内的异质性和高度侵袭性的表型。表皮生长因子受体(EGFR、HER1、ErbB1)的过表达或突变是GBM中反复发生的分子改变，与不良预后相关。EGFR是一种跨膜受体酪氨酸激酶，属于ERBB家族，负责胶质瘤细胞的增殖、存活、侵袭性和干性调节。尽管EGFR在GBM中是一个有吸引力的治疗靶点，但使用EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的靶向治疗未能改善患者的护理。EGFR的过表达驱动胶质母细胞瘤(GBM)细胞的侵袭，但这些肿瘤仍然对EGFR靶向治疗，如酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)产生耐药性。在本研究中，作者发现吉非替尼和其他酪氨酸激酶抑制剂诱导EGFR在早期核内体中积累，从而导致内吞作用增加。此外，TKIs触发另一种膜受体的早期核内蛋白受体重新定位，即纤维连接蛋白受体-β1整合素，这是GBM中一个很有前途的治疗靶点，调节癌细胞的生理EGFR内吞和再循环。EGFR阻断调节失调参与了GBM的进展和侵袭性。然而，TKIs在EGFR迁移中的意义和作用尚不清楚。为了解决这个问题，作者用吉非替尼处理U87GBM细胞，并通过共聚焦显微镜检测了EGFR的定位，考虑到胶质母细胞瘤的异质性，作者分析了吉非替尼在其他3个具有不同水平EGFR表达的细胞系中对EGFR分布的影响。发现吉非替尼增加了T98G和LN443细胞中EEA1/EGFR的共定位，以及LN443、T98和LNZ308细胞中EGF的内吞作用。这些实验表明，吉非替尼在体外导致GBM细胞大量EGFR内吞。图1. 吉非替尼诱导U87细胞的EGFR内吞作用。用DMSO（对照细胞）或吉非替尼(20µM)处理4小时后，免疫检测肌动蛋白（绿）、EGFR（红）和内吞体标记物EEA1（青）。2、整合素和EGFR通过吉非替尼治疗而被共同招募到早期核内体中作者之前的实验清楚地表明，吉非替尼显著增加了EGFR的内吞率。整合素α5β1促进EGFR循环，全基因组基因筛选发现α5β1整合素是EGFR内吞作用的强启动子。因此，作者假设α5β1整合素，作为GBM中潜在的治疗靶点，可能会影响吉非替尼介导的EGFR内吞作用。作者接下来研究了EGFR和整合素是否被运输到相同的核内体。在未处理的细胞中，α5β1整合素和EGFR在质膜上或作为点状细胞内染色，令人惊讶的是，在短期吉非替尼治疗后，α5β1整合素明显被重新分配到大的EGFR阳性核内体中。吉非替尼治疗增加了核周区域整合素/EGFR的共定位，表明这两种受体在同一核内体中募集。图2. 吉非替尼引起EGFR和α5β1整合素的共内吞作用。用载体（对照）或吉非替尼处理的U87细胞的共聚焦图像。EGFR和β1的免疫检测接下来，作者对瞬时表达α5-GFP或Rab5-YFP的U87细胞进行了免疫标记和共聚焦分析。在吉非替尼治疗后，整合素β1和EGFR均定位于rab5阳性的早期核内体同样，EGFR和α5-GFP均在eea1阳性的早期核内体中被发现图3. 表达Rab5-YFP或α5-eGFP的U87细胞经吉非替尼处理后的共聚焦图像。在核周区域的插入物的高倍放大图像。箭头突出了标记有EGFR、整合素和早期核内体标记的囊泡接下来，作者使用2色dSTORM超分辨率显微镜来整合早期核内体中整合素和EGFR之间的潜在相互作用。在吉非替尼处理的细胞中，显示EGFR和整合素β1标记在核内体样结构中存在强覆盖，但不是在细胞外周处，这表明这两种受体更可能在核内体中相互作用，而不是在质膜上相互作用。此外，作者也在另外三个GBM细胞系中观察到内吞体整合素/EGFR共标记。图4. 吉非替尼处理的细胞的双色dSTORM图像显示细胞外周和核内体上的EGFR/β1整合素复合体02—研究总结 综上所述，这些数据表明EGFRTKIs增加了GBM细胞早期内吞体中EGFR的内吞作用和α5β1整合素的共积累。EGFR/α5β1整合素内吞作用和膜破坏。由于这些受体在癌细胞的侵袭和传播中发挥着关键作用，未来的挑战将评估TKIs对整合素生物学功能的影响，以及整合素/EGFR如何改变TKIs处理的细胞的内吞作用可能有助于GBM细胞逃避。并且，最近的一份报告强调了靶向治疗的靶标细胞毒性被低估的重要性。这项工作强调了需要更好地了解药物机制，以确定适当的生物标志物来预测药物的疗效。因此，描述吉非替尼等药物对内体转运的影响并揭示参与这些机制的分子将是很重要的。这可能为新的治疗方案提供理论基础，并改进脑肿瘤的精确医学方法。在本研究中，研究者主要借助STORM技术在更深一层次了解整合素之间的位置关系。这项2014年诺贝尔化学奖的发现已在国内实现产业化。宁波力显智能科技有限公司(INVIEW)现已发布超高分辨率显微系统iSTORM，采用3D随机光学重构技术、高精度细胞实时锁定技术、多通道同时成像技术等，以纳米级观测精度、高稳定性、广泛环境适用、快速成像、简易操作等优异特性，获得了超过50家科研小组和100多位科研人员的高度认可。参考文献：1. Blandin, Anne-Florence, et al. "Gefitinib induces EGFR and α5β1 integrin co-endocytosis in glioblastoma cells." Cellular and Molecular Life Sciences 78.6 (2021): 2949-2962.

p 　　卵母细胞体外成熟是辅助生殖领域已开展近30年的一项重要技术，在预防卵巢过度刺激综合征，保存女性生育力，拓展辅助生殖技术应用领域等展现出巨大的应用价值。 /p p /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/200e2031-e412-4cd0-a657-9cb63171a9a6.jpg" title=" NewsDataAction.png" / /p p 　　在啮齿类及家畜等动物中，卵母细胞经过体外成熟后，依然可以保持较高的发育潜能，但是人类辅助生殖临床中发现，体外成熟卵母细胞发育潜能较差，形成胚胎的流产率相对较高，且尚无公认的有效改善措施。此前有多项研究揭示小鼠卵母细胞成熟过程中的关键分子，然而对人类卵母细胞成熟过程中的分子表达特征尚不明确。 /p p 　　2月27日，北京大学第三医院乔杰院士团队的李蓉教授、于洋副研究员与广州医科大学附属第三医院范勇教授，昆明理工大学谭韬副教授团队合作，在Antioxidants & amp Redox Signaling杂志在线发表题为“Single-cell transcriptomics of human oocytes: environment-driven metabolic competition and compensatory mechanisms during oocyte maturation”的研究成果，揭示了体外培养影响人卵母细胞成熟及发育潜能的关键分子及其作用机制。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/2df4c471-0a8d-4c97-a46b-adbe430a85dd.jpg" title=" NewsDataAction-2.png" / /p p /p p 　　在该研究中，研究者在伦理委员会指导下，通过来自于3名女性捐赠的6枚卵母细胞（每名女性捐赠1枚成熟与1枚不成熟卵母细胞），利用单细胞转录组测序技术，从整体水平上，对体外成熟卵母细胞中的RNA表达特征进行了阐述，并利用小鼠模型、干细胞模型、人类样本等，从基因、亚细胞结构、细胞发育等不同层面，系统揭示了代谢通路关键分子ACAT/HADHA-DPYD在维持卵母细胞发育潜能方面扮演重要的角色。 /p p 　　首先，研究者利用高通量测序与生物信息学分析手段，明确代谢通路的改变是体外成熟卵母细胞与体内成熟卵母细胞的最典型差异。进而，通过多种筛选手段，包括与不同质量的体内成熟卵母细胞比较、物种间比较等，明确三种与辅酶A相关的酶编码基因（ACAT1、HADHA、DPYD）是潜在影响体外成熟卵母细胞发育潜能的靶标分子（下图）。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/4ca2142c-ebee-4bd7-a0cd-9cd6e94c59c1.jpg" title=" NewsDataAction-3.png" / /p p /p p style=" text-align: center " 筛选与人体外成熟卵母细胞发育潜能相关的靶标分子 /p p 　　其中，ACAT1和HADHA协同调控三羧酸循环的底物乙酰辅酶A与琥珀酸的生成，间接影响三羧酸循环的效率，导致线粒体功能不足。同时发现，三羧酸循环酶类的激活剂钙离子在体外成熟卵母细胞中浓度降低，再次提供证据表明体外成熟卵母细胞线粒体功能及能量代谢异常。 /p p 　　然而，为维持发育的进行，卵母细胞在钙离子摄入障碍的情况下，内源钙离子释放，实现钙离子浓度代偿。同时，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶（NNT）编码基因上千倍上调表达，促进体内NADH与NADP+的生成。一方面NADH可以提供额外的能量供卵母细胞成熟发育，缓解线粒体功能失调导致的NADH生成减弱，维持其细胞质的生物学功能；另外一方面，NADP+的生成上调DPYD表达，对体外成熟卵母细胞中出现的异常DNA双链断裂进行修复，维持其细胞核的生物学功能。 /p p 　　综上所述，研究者首次利用严格的对照，排除不同人群遗传的潜在影响，从组学筛选到靶标分子的生物学功能鉴定的系列实验中，明确人体外成熟卵母细胞从受损到功能代偿的分子机制。研究在提示辅助生殖技术每一步操作都潜在对生殖细胞产生影响的同时，也为辅助生殖技术的持续优化提供了理论基础。 /p p 　　据悉，北京大学第三医院2011级博士生赵红翠为本文的第一作者，2017级博士生李天杰，赵越副研究员，昆明理工大学谭韬副教授为本文共同第一作者，北京大学第三医院李蓉教授为该论文的通讯作者，于洋副研究员，广州医科大学附属第三医院的范勇教授为共同通讯作者。 /p

在哺乳动物和果蝇中，雌性多细胞雌性生殖细胞包囊（Female germline cyst）中只有一个细胞会成为卵母细胞，但是这颗卵母细胞是如何打破对称性从中脱颖而出的还不得而知。为了揭开这一问题的答案，英国剑桥大学D. St. Johnston研究组与D. Nashchekin（第一作者）合作在Science发文题为Symmetry breaking in the female germline cyst，发现微管负极稳定蛋白Patronin/CAMSAP通过标记果蝇中的卵母细胞，促使生殖细胞打破对称性从而特化形成卵母细胞的具体分子机制。在许多生物中并非所有的雌性生殖细胞都会变成卵母细胞，一部分细胞会变成辅助细胞为卵母细胞提供物料和营养支持【1】。举例来说，小鼠卵巢中一个生殖细胞包囊中包含约30个细胞，其中只有一小部分细胞会变成卵母细胞，大多数的细胞会作为营养细胞（Nurse cells）经历细胞凋亡，将胞质的内容物通过环管（Ring canals）输送卵母细胞（图1）【2, 3】。在果蝇中，生殖细胞包囊形成于生殖腺，包囊具有三个区域。生殖干细胞产生成囊细胞（Cystoblast），成囊细胞在不完全的胞质分裂的情况下分裂四次，产生一个包含16个生殖细胞组成的包囊，这些生殖细胞通过环管相连接（图2）。卵母细胞的选择依赖于非中心体组织中心（noncentrosomal microtubule organizing center，ncMTOC）在未来的卵母细胞中组织一个具有极性微管网络指导动力蛋白（Dynein）依赖的细胞命运决定因子的运输。但是这颗卵母细胞是如何脱颖而出获得命中注定的卵母细胞命运呢？为了揭开这一问题的答案，作者们将目光集中在了Patronin以及其脊椎动物同源蛋白CAMSAPs上。该蛋白是微管负极结合蛋白，是 ncMTOCs非常关键的组分【4，5】。作者们在patronin突变体中检测了卵母细胞标记物的分布，发现突变体中卵母细胞标记物的累积显著地降低。限定表达在区域3中卵母细胞中的联会复合体蛋白C(3)G也在patronin突变体中也显著降低。这些结果说明Patronin对于卵母细胞的决定非常关键。为了对Patronin在生殖腺包囊中的定位进行检测，作者们对内源荧光标记的Patronin-Kate品系进行成像，发现Patronin在2a区域时开始在单独的一个细胞中表达，早于既定卵母细胞标记物的表达，该信号会持续累积在此单个细胞中到区域2b-3，发育到该时期时会在细胞中形成点状信号，最终此细胞发育成为卵母细胞。但是作者们发现patronin的mRNA并不会定位在包囊之中，因此这种不对称的分布依赖于Patronin蛋白而非mRNA的定位或者新蛋白的合成。另外作者们发现动力蛋白在patronin突变体中的定位在推定的卵母细胞中，该结果说明Patronin的缺失会破坏前体卵母细胞中MTOC的形成，从而导致极化的微管网络形成的缺失。通过检测微管正极末端追踪蛋白EB1-GFP对包囊中的MTOC进行可视化观察，作者们发现EB1-GFP信号与Patronin的信号在相同的细胞中共定位。同样，EB1-GFP的不对称定位在patronin突变体的包囊中会消失，此时EB1-GFP的分布模式会相对比较均质。随后，作者们想知道中心体是否对Patronin MTOC的形成是否有一定的贡献，为此对中心体蛋白Asterless与Patronin的共定位进行了探究。作者们发现Patronin与Asterless只有小部分共定位，大部分的Patronin信号都在中心体聚集体的之外，该结果说明Patronin形成的MTOCs是非中心体依赖的。目前，Patronin成为了未来卵母细胞最早的标记物。那么提出了一个新的问题即Patronin是如何富集在卵母细胞中从而打破包囊中细胞的对称性的。其中一个可能的机制是对称性打破依赖于融合体（Fusome）的不对称继承【6】。融合体在区域1的有丝分裂过程中就出现了不对称分布，因此母细胞会比子代细胞继承更多的组分，四环管时期两个细胞中的一个会具有比其他细胞更多融合体。为了验证这一想法，作者们使用融合体标记物Hts检测该观点。Patronin与融合体共定位于早期2a区域，但在包囊向区域3发展时信号会集中在一个细胞之中。因此，该结果说明Patronin的最初定位由融合体决定于早期2a区域，随后被某些机制进一步将此不对称性进行扩大。进一步地，作者们想要探究其中可能的扩大机制。Spectraplakin蛋白Shot引起了作者们的注意，因为该蛋白定位融合体上并且与卵母细胞的特化相关【7】。作者们发现在shot突变体中，Patronin不能在一个细胞中累积并且也不能形成点状信号，而且也不能与融合体相互作用。因此，Shot对于招募Patronin到融合体上是非常关键的，从而能够将融合体不对称信号带给Patronin从而交给细胞命运决定过程进行解码。由此，作者们得到了一个卵母细胞命运决定的工作模型，该模型被称为“四步走”模型（图3），第一步，在包囊形成过程中融合体的不对称性促使一个细胞中继承更多的融合体内容物；第二步，在区域2a，Patronin通过Shot蛋白被招募到融合体上，形成一个微微极化的微管网络结构；第三步，包囊中其他细胞通过动力蛋白将Patronin蛋白结合的微管蛋白运输到预卵母细胞之中；第四步，形成一个正反馈循环通路，动力蛋白运输更多的Patronin以及微管蛋白到卵母细胞中，进一步扩大微管的极性，从而促进动力蛋白运输更多的卵母细胞命运决定因子进入该细胞之中。通过该不对称性建立并逐渐扩展的方式，卵母细胞从包囊中“脱颖而出”。Patronin是CAMSAP家族中保守的成员，这说明该机制可能具有一定的保守性，虽然在哺乳动物中未发现融合体的存在，但是微管依赖的细胞器通过细胞环管运输已被证明在小鼠卵母细胞分化中发挥重要作用。这一发现对于卵母细胞命运建立提供了新的思考。原文链接：http://doi.org/10.1126/science.abj3125

1947年，Mandel和Metais首次报道了外周血中存在游离DNA（Cell-free DNA, cfDNA）。正常生理状态下，血液中的cfDNA主要来源于白细胞的坏死和凋亡；在某些疾病和特殊状态下，如组织损伤、癌症和炎症反应等，细胞内的DNA片段也会被释放到各种体液中（血浆、脑脊液、尿液等）成为cfDNA。在癌症早期，当患者还未表现出明显的临床症状时，细胞内DNA状态就已经发生变化，这些DNA被释放到体液中，使得体液cfDNA中包含了与癌症相关的重要信息。通过对这些信息进行提取和处理，可对癌症进行非侵入式诊断，实现癌症的早期诊疗，因此，cfDNA检测是目前市场上最常见的液体活检形式。髓母细胞瘤（Medulloblastoma，MB）是一种恶性的儿童胚胎中枢神经系统肿瘤，具有沿软脑膜转移的倾向。根据基因组特征可分为4个亚群：WNT、SHH、 Group 3和Group 4。手术切除结合放化疗是目前治疗MB的首选治疗方案（可治疗约70%的病人），术后的标本则作为诊断和肿瘤特征分析的证据。MB能够随着时间的推移而发展，约1/3患有MB的儿童最终都是死于该疾病，存活下来的患者也需要长期忍受由于治疗而产生的毒性。目前，除了磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）和脑脊液（Cerebrospinal fluid, CSF）细胞学检测，还没有可靠的分子生物标志物来反应MB的进展情况。因此，通过纵向样本开发强大的、微创的、临床可操作的生物标志物是非常必要的。研究显示，在 CNS 恶性肿瘤患者中，CSF来源的cfDNA比从血浆中分离出来的cfDNA具有更大的效用【1-2】。MB基因组几乎没有热点驱动突变，而是以普遍的染色体拷贝数变异（Copy number variations, CNVs）为特征，因此限制了cfDNA 突变分析在MB中的通用性【2-3】。近日，来自美国St. Jude儿童研究医院的Paul A. Northcott团队在Cancer Cell杂志在线发表了题为Serial assessment of measurable residual disease in medulloblastoma liquid biopsies的文章。研究人员利用MB中染色体不稳定性的特点，通过低深度全基因组测序（Low-coverage whole-genome sequencing, Lc-WGS）对来自123名MB患者的476例CSF来源的cfDNA样本进行分析，鉴定了可作为可测量残留病变（Measurable Residual Disease, MRD）标志物的CNVs，阐释了cfDNA检测的疾病预测价值和诊断价值。本研究共收集了来自123名MB患者的共476例CSF样本，提取cfDNA进行低深度全基因组测序（lcWGS），并进行后续分析（图1）。首先，作者评估了cfDNA来源的CNVs作为MRD标志物的效用。数据显示，在67例样本（67/105）中检测到了MRD；相反，7例非肿瘤CSF样本中都没有检测到cfDNA来源的CNVs，即MRD阴性。MRD阳性CSF样本与相应的原发性肿瘤之间的CNVs检测谱高度一致。MRD检测与疾病的转移状态、分子亚群和肿瘤位置显著相关，与年龄、性别、切除范围、细胞学检查结果以及切除和脑脊液取样之间的时间无关。值得注意的是，无论相应的脑脊液细胞学结果如何，MRD在高危疾病患者中的阳性率相似：91例脑脊液细胞学阴性的样本中有56例样本的MRD呈阳性。图1. 样品收集及检测流程图随后，作者探究了连续MRD检测与疾病复发之间的关系。在30/77（39%）例放疗后、21/75（28%）例化疗中及20/68（34%）例治疗结束的患者中检测到MRD。出现疾病复发的患者在治疗期间的MRD持续率明显高于没有复发的患者。在MRI显示病情完全缓解的32例病人中，有16例病人在复发前3个月时就检测到了MRD，此时影像学或细胞学异常还不能检测到。在所有持续接受放化疗或细胞学有差异的12例病人的CSF样本（n=27）中均检测到了MRD。24/25例患者在病情发展的3个月内采集的脑脊液标本中MRD呈阳性；在病情没有进展的患者中，193/209（92%）例CSF样本都是MRD阴性。那么，连续检测MRD在临床上有何价值？作者发现，那些放化疗后、治疗期间或已经结束治疗的病人中，MRD阳性病人的无进展生存期（progression-free survival, PFS）比MRD阴性的病人差很多。与治疗结束时MRI和脑脊液细胞学检查的标准评价进行比较，同时进行的MRD检测对于病人分类更有效，其对残留病变的灵敏度也更高（64% vs. 24%）。在治疗结束的病人中，12/20（60%）MRD-阳性的病人的MRI/细胞学检查正常，但后期其中的10位病人的病情都有所进展；其余两例病人MRI正常其MRD也呈阳性。在高风险患者中，治疗结束时的MRD与PFS有显著关系。作为一个随时间变化的变量，随访期间MRD检测与PFS显著相关。接下来，作者对疾病复发中的肿瘤相关分子图谱进行了分析。为了同时在早期和疾病进展期检测渐进性疾病（Progressive disease, PD）和MRD阳性患者的CSF，作者比较了从患者匹配的CSF样本中提取的CNVs谱，发现了染色体非整倍性，提示12/15（80%）例患者存在克隆选择或进化。cfDNA 分析可以更早地检测出那些在疾病复发时占主导地位的肿瘤克隆。在研究过程中，作者也注意到了原位肿瘤与cfDNA中检测到的CNVs不一致的情况。例如，患者sj024被诊断为Group4髓母细胞瘤，随后又出现转移性骨骼复发。然而与相应的原位肿瘤CNV检测结果相比，患者的cfDNA来源的CNVs谱更符合复发肿瘤特性，提示患者的CSF样本中包含了具有侵略性的亚克隆，可以驱动疾病的进展。最后，作者进一步评估了基于 lcWGS 的 cfDNA 分析在其他儿童脑肿瘤中的适用性。通过对17名非髓母细胞瘤患者进行分析，发现所有患者在其相应的原发肿瘤中都存在染色体和/或局灶性CNVs。基于lcWGS分析CSF来源cfDNA显示，13例（76%）样本呈MRD阳性，包括3例转移样本。此外，作者还观察了与临床过程相呼应的cfDNA样本的分子反应，其与MB中的发现类似。综上所述，该研究利用从MB和其他CNS肿瘤患者收集的脑脊液样本的大型纵向队列，首次有效地、系统地论证了CSF来源的cfDNA谱在儿童CNS癌症中检测MRD的临床效用（图2）。虽然液体活检的种类和方式非常丰富，但作者认为使用lcWGS检测CSF来源的cfDNA中的肿瘤相关CNVs非常适合于MB：（1）MB切除后患者脑脊液或血浆中cfDNA的含量明显低于其他脑肿瘤患者【4-5】，这种低于毫微克的产物，若采用其他检测方法（如表观遗传组和突变分析）是极具挑战的，但对lcWGS已经足够；（2）染色体CNVs在儿童MB中几乎无处不在，捕获CNVs无需使用定制探针来靶向不同的突变驱动基因，适用于缺乏已知驱动基因突变的MB样本。该研究支持将前瞻性cfDNA评估纳入MB临床试验，以进行进一步的研究和技术改进，最终实现根据MRD反应进行个性化治疗。图2. cfDNA检测流程及临床效用原文链接:https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.09.012

人NK/T细胞淋巴瘤细胞的处理方法与培养步骤！ NK/T细胞淋巴瘤（NK/T cell lymphoma）是起源于成熟NK/T细胞的淋巴系统恶性肿瘤。NK细胞和T细胞具有共同的祖细胞，两者在功能和某些抗原的表达上具有相似之处，NK/T细胞淋巴瘤因起源于这两种细胞而得名。 细胞说明信息平台编号：Bio-129794规格：1×10⁶ Cells/T25培养瓶细胞信息：SNK-6细胞名称：人NK/T细胞淋巴瘤细胞细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。组织来源：淋巴细胞培养条件：1640培养基（GIBCO,货号11875093） +10%澳洲来源进口胎牛血清（GIBCO,货号10091148）+1%双抗形态：悬浮；淋巴母细胞样规格：1×10^6 cells/瓶用途：细胞系注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准） 细胞收到后的处理方法细胞在培养瓶中培养至良好状态后灌满完全培养液并封好瓶口是细胞运输的最好办法。收到细胞回到自己的实验室后，先打开外包装，用 75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超净台内，严格无菌操作，培养箱静置 2-4 小时。镜下观察：未超过 80%汇合度时，可将瓶装的完全培养液收集至离心管中，加入 6ml 完全培养基，放入 37℃、5%CO2 孵箱培养；超过 80%汇合度时，根据情况传代或者冻存，具体操作见细胞培养步骤。（注意发货的是密封培养瓶的话，放入培养箱培养记得培养瓶盖子拧松） 细胞培养步骤1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入 5mL 培养基混合均匀。在 1000RPM 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，补加 4-6mL 完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入 6cm 皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。3）细胞冻存：1、细胞生长至覆盖培养瓶的 80%面积时，弃 25cm2 培养瓶中的培养液，用 PBS 清洗细胞一次；2、添加 0.25%胰蛋白酶消化液约 1ml 至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至 15ml 离心管中，1000rpm 离心 5min；3、用适量的冻存液重悬细胞，并放置于冻存管中；4、先将细胞冻存管放置于-20℃ 1.5h，然后将其移入-80℃。 对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。2、加 1-2ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加 5ml 以上含 10%血清的完全培养基终止消化。3、轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在 1000RPM 条件下离心 8-10 分钟，弃去上清液，补加1-2mL 培养液后吹匀。4、按 5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按 1：2 的比例分到新的含 5-6 ml 培养液的新皿中或者瓶中。PS：若客户收到 2ml 小管细胞，收到细胞后，用 75%酒精喷洒整个管子消毒后放到超净台或安全柜内，严格无菌操作；将小管细胞转移至 T25 培养瓶或 6cm 培养皿，加入 5ml 左右完全培养基混匀，放入培养箱过夜培养后查看细胞密度：若密度未超过 80%，换液继续培养，视情况传代或者冻存。若密度超过 80%，可直接进行传代（方法同上）。 北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

近日，重庆陆军军医大学西南医院病理科&西南癌症中心研究所卞修武院士和王岩教授研究团队在胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）的治疗策略方面取得了新的进展，相关研究成果已发表在Nature子刊“Signal Transduction and Targeted Therapy”（IF= 18.005，JCR1）。△ 图1Nature子刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》（IF:18.187,JCR 1区）胶质瘤是最常见的脑肿瘤，2016年世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将其分为四级(I-IV)。数字越大，恶性程度越高，预后越差，其中，GBM属于IV级。GBM恶性程度高、侵袭性强，患者的平均生存期约为15个月，5年生存率不到5%，因此，探究GBM的发生、发展机制，寻找复发相关的分子标志物，针对相关靶点进行转化研究，具有重要的意义。在临床上，大多数GBM患者(约90%)被诊断为野生型IDH1/2，定义为原发或新发的GBM；大约10%的GBM患者携带IDH1/2突变，定义为继发性GBM。根据癌症基因组图谱计划(The Cancer Genome Atlas，TCGA)中脑胶质瘤基因转录组，可以将GBM分为4种亚型：前神经元型、神经元型、经典型、间质型。经典型以EGFR基因扩增/突变为特征，前神经元型主要表现为PDGFRA（Platelet-derived growth factor receptor α）突变或IDH1/2 突变，间质型主要存在神经纤维蛋白1(Neurofibromatosis type 1，NF1 )突变。血小板衍生生长因子受体α（PDGFRA） 和受体β（PDGFRB） 属于受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase，RTK）家族，并作为血小板衍生生长因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）的受体发挥作用。哺乳动物中的四种 PDGF 基因（PDGFA、PDGFB、PDGFC 和 PDGFD）分别编码四种肽（PDGFA、PDGFB、PDGFC 和 PDGFD），它们形成五种功能同源或异源二聚体：PDGF-AA、PDGF- AB、PDGF-BB、PDGF-CC 和 PDGF-DD。研究发现PDGFA 和 PDGFRA 在胶质瘤发生和进展中起关键作用。实验也表明，PDGFA 和 PDGFRA 的过表达成功地诱导了小鼠模型中GBM的发育，这些结果表明PDGFRA 在GBM中的关键作用，并将 PDGFA/PDGFRA 轴确定为 GBM 的潜在治疗靶点。虽然已经开发出几种针对 PDGFRA 的抗肿瘤药物，体外和体内的数据也支持靶向PDGFRA对GBM细胞的有效抑制作用，然而，单一PDGFRA抑制剂的临床试验均未显示出抗肿瘤作用。基于上述背景，研究人员对GBM 中 PDGFA 和 PDGFRA 的调控机制进行了详细研究。首先开展的实验数据表明，PDGFRA 的活性或表达缺陷并没有有效地阻断PDGFA活性，所以推测PDGFRA 可能不是 PDGFA 功能所必需的。为了分析参与 PDGFA 功能的蛋白质，研究人员进行了免疫共沉淀 (Co-IP) 和质谱 (MS)实验，并首次描绘了 PDGFA 相关蛋白网络。令人惊讶的是，实验结果表明，即使没有激活 PDGFRA 和 AKT，EPHA2 也可以被 PDGFA 暂时激活。此外，MS、Co-IP、体外结合热力学（In vitro binding thermodynamics）和邻近连接实验（Proximity ligation assay）都一致地证明了EPHA2与PDGFA的相互作用，EPHA2的高表达导致 TCGA-GBM 数据库和临床 GBM 样本中 PDGF 信号靶标的上调。由于 PDGFA 诱导的 EPHA2 活化，通过抑制剂阻断 PDGFRA 不能有效抑制 GBM细胞的增殖，但同时抑制 EPHA2 和 PDGFRA后，在体外和体内的实验结果都显示出对GBM 细胞的协同抑制作用。因此，靶向PDGFRA 和 EHA2的双重抑制剂有望作为未来GBM的治疗新策略。△ 图2 PDGFRA和EPHA2联合抑制对GBM细胞的协同抑制作用。a、MTT实验测量过表达EPHA2（左）或敲低EPHA2（右）的LN18细胞的IC50。b、抗体阵列分析载体、EPHA2抑制剂(ALW)和PDGFRA抑制剂(IMA)处理的LN18细胞，显著变化的蛋白质用框架标记并单独列出。c、MTT实验评价联合药物在四种GBM细胞株的作用。d、载体、IMA、ALW 或 IMA + ALW 处理过的 U251 细胞原位生长的代表性图像（使用博鹭腾AniView100多模式动物活体成像系统拍摄）。e、生物发光信号强度绘制的肿瘤大小统计图。f、载体、IMA、ALW或IMA+ALW治疗的小鼠原位GBM肿瘤组织切片上Ki67的代表性免疫组织化学图像。论文链接https://www.nature.com/articles/s41392-021-00855-2广州博鹭腾博鹭腾作为一家集生命科学仪器设备的研发、生产、服务于一体的国家高新技术企业，目前已开发并上市了多款具有自主知识产权的产品，形成了活体成像、分子影像、蛋白凝胶预制及印迹处理系统、发光检测四个系列，用户包括清华大学、中山大学、西北农林科技大学等上百家高校及科研单位。

神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）是婴儿最常见的肿瘤。该病是由身体多个部位的未成熟神经细胞发展而来的一种癌症，通常起源于腹部或胸部的交感神经，最常起源于肾上腺。　　目前，CAR-T细胞疗法在血液系统肿瘤领域的治疗效果出色，然而，实体瘤分子更加复杂且缺乏良好抗原靶点使得CAR-T细胞疗法在实体瘤领域的挑战巨大。因此，开发能够同时识别至少两种抗原的下一代CARs具有重要意义。　　近日，北卡罗来纳大学教堂山分校的研究团队开发了一种新的治疗方法——基于双重靶向、分裂共刺激信号和共享CD3ζ链的免疫疗法。该疗法构建了同时针对NB疾病模型中的两种临床相关抗原GD2和B7-H3，可以实现快速和持续的抗肿瘤作用。值得一提的是，当肿瘤细胞中的抗原表达是异质性时，双CAR-T细胞可在体内应激时提供持续的高抗肿瘤活性以防止肿瘤因异种抗原表达而逃逸。相关研究结果于9月23日以“Dual-targeting CAR-T cells with optimal co-stimulation and metabolic fitness enhance antitumor activity and prevent escape in solid tumors”为题发表在《Nature Cancer》杂志上。 　　注：此研究成果摘自《Nature Cancer》，文章内容不代表本网站观点和立场。　　论文链接：https://www.nature.com/articles/s43018-021-00244-2

复制压力是DNA复制过程中的障碍, 可以减慢或者停止复制叉的行进过程。这些压力主要来自以下四个方面：DNA复制机制自身缺陷, DNA序列中自身难以复制区域包括端粒和中心粒区域的重复序列, 变异细胞 (肿瘤) 中基因组复制的高度需求, 和外部压力包括高温或药物处理。DNA复制缺陷的细胞如何获得突变, 从而逃逸在DNA复制压力下的细胞凋亡, 是一个生物学界长期未解的问题。2021年12月2日, 美国希望城国家医学中心 (City of Hope) 沈炳辉 (Binghui Shen) 实验室在Science杂志发表题为 Error-prone, stress-induced 3' flap-based Okazaki fragment maturation supports cell survival 的文章。该研究报道了敲除结构特异性内切酶FEN1/RAD27基因的酵母细胞在限制性温度下激活一条新的易错的冈崎片段成熟通路 (Okazaki fragment maturation)。限制性温度压力激活Dun1, 促进未加工的5' flap转变为3' flap, 进而被Pol δ等3' 核酸酶去除。然而, 3' flap在某些区域并不被降解, 而是形成二级结构, 促进3' 端延伸, 产生在两个重复序列之间与模板序列反相的小片段。这样一种新的重复序列突变称为非典型的重复序列突变(alternative duplication mutation)。一旦DNA复制酶Pol δ基因内出现这种重复序列, 细胞会失去形成5' flap的能力, 而是以高突变率为代价, 抑制rad27Δ细胞在限制性温度下的死亡。这一研究揭示了一种全新的应激诱导的、易错的冈崎片段成熟途径, 解释了突变细胞株产生突变, 抵消复制缺陷, 促进细胞进化和生存的过程。在DNA复制过程中, 后随链的复制是不连续的, 由冈崎片段连接而成。在冈崎片段成熟过程中, RNA片段和由Pol α合成的DNA片段会形成5' flap, 进而由FEN1或DNA2和FEN1合作切除。FEN1的缺失会积累未加工的5' flap, 阻止冈崎片段的连接, 导致复制叉的坍塌和DNA双链断裂。缺失FEN1同源蛋白Rad27的酵母细胞在许可温度 (30℃) 下生长缓慢, 在限制性温度 (37℃) 下致死。这种表型称为条件致死。长时间培养后, 有极少部分细胞在37℃条件下幸存。这类细胞株称之为回复突变体 (Revertant)。通过单克隆的全基因组测序, 发现在回复突变体中21个基因发生了突变, 但其中只有Pol δ的催化亚基Pol3的突变率为100%。后续的Sanger测序发现, 31个独立的回复突变体中都含有Pol3的突变。敲入 (knock-in) Pol3的突变至rad27Δ细胞中, 细胞生长速率、突变率、突变图谱都和野生型相似。有趣的是, 全基因组测序在回复突变体细胞中发现了非典型的重复序列突变图谱, 这些序列可以形成三种类型的发卡结构 (图1)。在此模型中, 5' flap首先转变为3' flap, 3' flap退火形成互补序列, 3' flap延伸继而连接成非典型的重复序列突变。图1. 三种类型的非典型重复序列突变的形成原理基于对非典型重复序列突变形成机制的了解, 作者相信3' flap在体内的存在。运用作者新研发的检测基因组3' flap的方法 (图2) 发现, rad27Δ细胞基因组只有在37℃条件下形成大量的3' flap。而rad27Δ细胞在30℃条件下或野生型细胞在任何温度下都只有极少量的3' flap。图2. 基因组DNA中3' flap检测方法和结果A. 绿色点表示在双链DNA中的3' 端被封闭。红色星号表示单链DNA中3' 端被放射性标记。B. 3' flap只出现在高温培养条件下的rad27细胞中。这样一种从分子水平上像火山爆发型的基因组重组事件, 必须把rad27Δ突变细胞的细胞周期停止在S期的后期。高通量基因表达组学研究发现在37℃条件下rad27Δ细胞的中的Mec1, Rad53和Dun1转录水平明显升高。敲除DUN1基因导致rad27Δ细胞在37℃条件下3' flap的形成、突变率和回复突变子的形成频率大幅下降。基于以上结果, 作者提出了细胞在遗传缺失和高度DNA复制压力下冈崎片段成熟的易错加工的新型模型 (图3)。当细胞缺失结构特异性内切酶FEN1/RAD27时, 残留的5' flap可以转化为更具活性的3' flap。一旦单链的3' flap形成二级结构, Pol δ便以此为引物, 补齐空缺序列, 并把重复序列连接起来, 形成非典型的重复序列突变子。细胞用突变作为代价, 求得了生存。这些发现为新型的抗癌药物开发提供了重要的理论基础和崭新的方向。图3. 冈崎片段成熟的易错加工新型模型City of Hope 博士后孙海涛为该文章第一作者, 沈炳辉教授和郑力教授为该论文的共同通讯作者。加州理工大学的Judith L. Campbell教授, 加州大学圣塔芭芭拉分校的Eric Zheng, 沈郑团队的Amanpreet Singh, 周亚竟, 路兆宁, 周棉博士为本文的共同作者。希望城国家医学中心的顾朝辉和吴锡伟团队提供了高通量测序数据分析, 为本文共同作者。中国农业大学的楼慧强教授及实验室的刘路, 邹友龙, 李晓丽和张晶晶博士, 加州理工大学的Martin E. Budd博士为本研究提供了酵母遗传学的实验技术指导。加州大学圣地亚哥分校的Richard Kolodner教授, 华盛顿大学医学院的Peter M.J. Burgers教授, 德克萨斯大学的Satya Prakash和Louis Prakash教授, 加州大学的Wolf-Dietrich Heyer教授和爱荷华大学的Marc S. Wold教授为本研究提供了重要的实验材料。南京师范大学郭志刚教授团队, 浙江大学医学院夏大静教授团队, 澳门大学沈汉明教授团队在本课题前期探索性阶段给予了大力支持。上述工作为沈郑团队在过去二十五年来, 在冈崎片段成熟和DNA损伤应答机制研究工作的积累。欢迎生物信息学, 分子细胞生物学和生物化学等相关专业的有志青年加入团队, 开展进一步的合作研究。原文链接：http://doi.og/10.1126/science.abj1013

肿瘤异质性对癌症预后和治疗反应有显著影响。传统的基因组和转录组分析被广泛用于研究不同的癌症类型，在预测预后和对不同治疗的反应以及为癌症治疗提供靶点方面具有潜在作用。不同癌症类型的单细胞分析表明，肿瘤免疫微环境的详细信息在多种癌症类型之间共享。目前，自从发现检查点抑制剂以来，免疫治疗彻底改变了癌症治疗并引起了越来越多的关注。肿瘤免疫微环境由非细胞成分(血管、细胞外基质、信号分子等)和细胞成分(T细胞、髓细胞、成纤维细胞等)组成。尽管传统的基因组和转录组学分析，也强调免疫相关途径和计算方法，并已应用于预测免疫细胞成分，但技术限制阻碍了时间的精确表征。传统的批量基因组和转录组分析获得的信号均来自不同细胞，掩盖了特定细胞类型和状态的识别。原位杂交和免疫组织化学已被用于探索单个细胞的基因组、转录组和蛋白质组学特征，但其产量相对较低。流式细胞术能够分析数千或数百万个单细胞蛋白质组学图谱；然而，这些方法需要事先选择感兴趣的抗体。随着细胞分离和测序技术的突破，单细胞转录组测序已经能够在单次运行中在单细胞水平上对许多细胞进行无偏好的全基因组分析。单细胞转录组测序已被用于分析单个细胞的转录组学，用于解析细胞间的异质性。肿瘤免疫微环境在诊断、治疗和预测不同类型癌症的预后方面显示出了潜力。与传统方法相比，scRNA-seq可用于识别新的细胞类型和相应的细胞状态，加深了我们对肿瘤免疫微环境的理解。1.介绍了scRNA-seq的原理，并比较了不同的测序方法。2.根据肿瘤免疫微环境中新的细胞类型、持续的过渡状态以及肿瘤免疫微环境成分之间的相互通讯网络找到了癌症的预后预测和治疗的潜在靶点。3.总结出在肿瘤免疫微环境中应用scRNA-seq后发现的由癌症相关成纤维细胞、T细胞、肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞组成的新型细胞簇。4.提出了肿瘤相关巨噬细胞和耗尽的T细胞的发生机制，以及中断这一过程的可能靶点。5.对肿瘤免疫微环境中细胞相互作用的干预治疗进行了总结。几十年来，肿瘤免疫微环境中的细胞成分定量分析已被应用于临床实践，预测患者生存率和治疗反应，并有望在癌症的精确治疗中发挥重要作用。总结目前的研究结果，我们认为单细胞技术的进步和单细胞分析的广泛应用可以导致发现癌症治疗的新观点，并应用于临床。最后，作者提出了肿瘤免疫微环境研究领域的一些未来方向，并认为通过scRNA-seq对这些方向进行辅助。相关会议预告：8.30召开，点击报名scRNA-seq在刻画肿瘤免疫微环境中的应用scRNA-seq技术进展scRNA-seq程序主要包括单细胞的分离和提取、cDNA合成、核酸扩增、测序和数据分析。与传统的批量测序相比，scRNA-seq单个细胞中的RNA量相对较少。因此，需要更有效的扩增方法。研究人员已经成功建立了稳定的单细胞文库构建过程，以产生足够的cDNA用于测序。单细胞分离和捕获是scRNA-seq在不同方法中的基本程序。目前单细胞分离和捕获的常用方法。这些程序分为四大类：激光捕获微切割、油滴包裹技术、流式细胞荧光分选技术和微流控微孔技术。scRNA-seq技术的未来发展可能会降低成本并增加细胞产量，使scRNA-seq成为研究单个细胞转录组的标准工具。肿瘤免疫微环境的细胞成分肿瘤免疫微环境的细胞成分包括淋巴细胞(T和NK细胞)、髓细胞(巨噬细胞和树突状细胞)、成纤维细胞和其他免疫细胞。成纤维细胞传统上被归类为基质细胞，因为它们在构建细胞外基质中发挥着重要作用。在这里，作者将肿瘤免疫微环境的癌相关成纤维细胞包括在内，因为它们分泌丰富的促炎和抗炎因子来重塑免疫微环境。细胞毒性CD8+T细胞识别肿瘤细胞上的特异性抗原并随后消除它们，是免疫微环境最常见和最有效的免疫细胞。CD8+T细胞的细胞毒性功能依赖于CD4+T Th1细胞。其他CD4+T细胞，包括Th2细胞和Th17细胞，也促进肿瘤微环境中的免疫反应。调节性T细胞抑制肿瘤免疫微环境并加剧肿瘤进展。自然杀伤T细胞和自然杀伤细胞也参与其中。它们的受体识别肿瘤细胞，从而激活其他免疫细胞。作为先天免疫的重要组成部分，骨髓细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞，在肿瘤免疫微环境中发挥着重要作用。巨噬细胞通常分为促炎M1和抗炎M2表型。肿瘤相关巨噬细胞主要由M2巨噬细胞组成，通过产生生长因子和细胞因子促进肿瘤生长、肿瘤存活和血管生成。DC对于T细胞的抗原呈递至关重要，连接先天免疫和适应性免疫。癌症相关成纤维细胞在肿瘤免疫微环境中维持增殖和分泌调节因子，可分为炎症性CAF和肌纤维母细胞CAF。炎症性CAF具有较高的细胞因子和趋化因子分泌，而肌纤维母细胞CAF高度表达收缩蛋白，成纤维细胞对免疫微环境起相互抑制作用。研究表明，成纤维细胞募集M2巨噬细胞和调节性T细胞，抑制肿瘤微环境中的免疫反应。肿瘤相关成纤维细胞也被发现在某些情况下会支持抗肿瘤免疫。除了分泌抗体，B细胞还通过产生与T细胞相互作用的细胞因子参与细胞免疫。研究表明，B细胞抑制细胞毒性T细胞并诱导CD4+T细胞分化为调节性T细胞。B细胞也是最近引入的三级淋巴结构的重要组成部分，富含B细胞的三级淋巴结构与各种肿瘤的生存和免疫治疗反应有关。先前的研究强调了细胞成分在时间中的重要作用。然而，免疫细胞的鉴定常基于有限的细胞标记，并借助免疫组织化学。个体免疫细胞的转录组图谱是探索不同免疫细胞及其相应功能所必需的。为了理解细胞进化过程及其决定因素，有必要应用scRNA-seq观察每个细胞的转录动态。利用scRNA-seq探索免疫微环境的新发现聚类和注释对于解释scRNA-seq数据探索至关重要。根据细胞相似性对数据进行划分，挑战在于在不提供先验知识的情况下估计固有的簇数或密度。可能的解决方案是采用分层聚类方法来揭示细胞的分层结构，这也与细胞本体相一致。给定聚类方法产生的数据划分结果，需要细胞类型注释来提供生物学意义。注释的主要挑战是确定每个聚类中存在多少细胞类型，以及是否存在当前未发现的细胞类型。在实践中，研究人员通常首先识别每个聚类的标记基因，然后根据专业知识和文献对其进行注释。scRNA-seq使研究人员能够以更高的分辨率将免疫细胞分类为具有不同功能的亚群，描述了免疫细胞的常规亚型。利用scRNA-seq发现的淋巴细胞(T和NK细胞)、髓细胞(巨噬细胞和树突状细胞)和成纤维细胞的组成(图2)。人和小鼠样本的scRNA-seq表明，成纤维细胞可分为抗原呈递CAFs、癌症相关成纤维细胞或肌成纤维细胞。抗原提呈CAFs独特地表达主要组织相容性复合体(MHC)II类基因，包括激活CD4+T细胞的CD74。在结直肠癌中也观察到类似的抗原提呈CAFs亚群。乳腺癌症基因工程小鼠模型中成纤维细胞的scRNA-seq进一步鉴定了血管CAF、基质CAF、发育CAF和循环CAF。血管CAF、基质CAF和发育CAF似乎起源于固有成纤维细胞和恶性细胞发生上皮-间充质转化时的血管周围位置。循环CAF是血管CAF群体中增殖的部分。在其他小鼠模型中也发现了血管CAF和基质CAF，它们在患者乳腺肿瘤样本中是保守的，并且发现它们会增加乳腺癌症细胞的转移。提高CAF的分辨率为开发精确靶向CAF的药物提供了生物标志物。另一项关于乳腺癌症的scRNA-seq研究将调节性T细胞分为五类：共表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4的调节性T细胞、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体，以及相互或仅表达相同基因的GITR和其他调节性T细胞，它们具有不同的功能。不同预后的患者具有不同比例的调节性T细胞簇，为个性化治疗提供了靶点。免疫微环境对T细胞和髓细胞进行了更详细的泛癌研究，发现存在颗粒酶K+T细胞、干扰素刺激基因+T细胞、杀伤细胞免疫球蛋白样受体在记忆性T细胞和NK细胞上表达、转录因子7+CD8+T细胞，ficolin 1+常规DC2、分泌性磷酸蛋白1+TAM，以及肿瘤微环境中的叶酸受体β+TAMs。基于scRNA-seq数据，免疫微环境还发现了新的免疫细胞亚群。葡萄膜黑色素瘤的scRNA-seq鉴定了以前未识别的细胞类型，包括主要表达检查点标记LAG3而不是程序性死亡-1或CTLA-4的CD8+T细胞。同时，在肝细胞癌中发现浸润耗尽的CD8+T细胞和具有高表达layilin的记忆T细胞的克隆富集，这些研究为癌症免疫治疗提供了新的靶点。因为CD8+T细胞是参与消除恶性细胞的主要成分。大肠癌CXC基序趋化因子的scRNA-seq鉴定配体BHLHE40+Th1样细胞与干扰素-γ调节转录因子BHLHE40。在不稳定肿瘤中，这些细胞对免疫检查点阻断有良好的反应，可能会提高免疫疗法的疗效。树突状细胞对于呈递抗原以激活肿瘤免疫微环境中的T细胞是必不可少的。胃癌的scRNA-seq揭示了一个新的树突状细胞簇，表达吲哚胺2,3-双加氧酶1和趋化因子C–C基序趋化因子配体(CCL)22、CCL17、CCL19和白细胞介素-32，它们参与T细胞的募集。胰腺导管腺癌的scRNA-seq还鉴定了除了常规细胞标记物之外还高表达吲哚胺2,3-双加氧酶1的树突状细胞簇。吲哚胺2,3-双加氧酶1对于催化色氨酸消耗和犬尿氨酸产生、抑制T细胞增殖和细胞毒性至关重要，这揭示了树突状细胞和T细胞之间的密切相互作用。此外，通过scRNA-seq鉴定了溶酶体相关膜蛋白3+树突状细胞，并且似乎是经典树突状细胞族的成熟形式。溶酶体相关膜蛋白3+DC可以迁移到淋巴结，并高度表达与T细胞相互作用的配体。这些表达特异性标记物的新型树突状细胞簇的发现为癌症免疫治疗提供了一个新的视角。使用scRNA-seq在肺腺癌中发现了肿瘤相关巨噬细胞的新特征基因，包括髓系细胞触发受体2、CD81、具有胶原结构的巨噬细胞受体和载脂蛋白E。此外，乳腺癌症的scRNA-seq表明，除了M2型基因如CD163、跨膜4域A6A和转化生长因子β1外，血管生成因子纤溶酶原激活剂、尿激酶受体和IL-8也在肿瘤相关巨噬细胞中表达。肿瘤相关巨噬细胞中这些新的基因特征图谱与患者生存相关，并为癌症治疗提供了新的潜在靶点。肿瘤样本scRNA-seq显示，一个肿瘤相关巨噬细胞亚群呈现出SPP1、巨噬细胞清除剂受体MARCO和MHC II类基因的高表达。MARCO和SPP1是巨噬细胞激活中的抗炎和免疫抑制信号，而MHC II类基因与促炎功能有关。其他scRNA-seq研究表明，肿瘤相关巨噬细胞经常同时具有促炎和抗炎特征。这一现象表明，肿瘤微环境中的巨噬细胞活化与传统的M1/M2极化不一致。图2：利用scRNA-seq揭示免疫微环境中的新的免疫亚群单细胞数据揭示免疫细胞进化大多数免疫细胞都处于细胞发育过程中。大量的免疫细胞处于发育轨迹的瞬态状态，而不是分化良好的细胞的离散状态。借助scRNA-seq和深入分析，研究人员可以探索分化细胞的特征、特定细胞类型的转变及其可能的机制。最常用的计算方法是拟时序分析。轨迹描述了细胞的发育过程，其特征是基因表达的级联变化。分支点代表细胞分化的显著差异。各种机器学习计算方法已被用于构建轨迹，包括Monocle3、DTFLOW、DPT、SCORPIUS和TSCAN，这些方法已在单独的综述中进行了评估和比较。由于肿瘤相关巨噬细胞和T细胞代表了免疫微环境中最丰富的免疫细胞类型，这里主要关注这两种细胞类型。scRNA-seq显示，TAMs经常共表达M1基因，包括TNF-α和M2基因，如IL-10，并且肿瘤相关巨噬细胞的分化和状态与其抗肿瘤作用直接相关。拟时序轨迹分析证实，肿瘤相关巨噬细胞在M1和M2表型之间连续转换。转录因子IRF2、IRF7、IRF9、STAT2和IRF8似乎在决定TAMs分化中很重要，并可作为表观遗传学靶点诱导肿瘤相关巨噬细胞的M1极化，从而产生促炎和抗肿瘤的微环境。使用环境刺激和抗原T细胞受体(TCR)刺激测定T细胞表型。不同状态的细胞之间TCR库的重叠，即TCR共享，也可用于研究T细胞的进化。结合scRNA-seq和TCR追踪在结直肠癌中发现20个具有不同功能的T细胞亚群。在黑色素瘤肿瘤的耗竭T细胞中发现了28个基因的耗竭特征，包括TIGIT、TNFRSF9/4-1BB和CD27，并且在大多数肿瘤的高耗竭细胞中也被发现上调。另一项关于T细胞的研究进一步鉴定了CD8+T细胞中的其他耗竭标记物，如LAYN、普列可底物蛋白同源物样结构域家族A成员1和突触体相关蛋白47。拟时序轨迹分析表明，T细胞在时间上处于连续激活和终末分化(衰竭)状态(图3)。已经进行了额外的研究来研究耗尽的T细胞的进化和逆转T细胞耗尽的潜在靶点。scRNA-seq与TCR分析相结合表明，功能失调的衰竭T细胞和细胞毒性T细胞可能在时间上与发育有关。因此，研究集中在CD8+T细胞从效应细胞到衰竭T细胞的过渡过程。scRNA-seq鉴定出两个CD8+T细胞簇为非小细胞肺癌中预先耗尽的T细胞。在肺腺癌中，预先耗尽与耗尽的T细胞比率与更好的预后相关。因此，在耗尽前中断预先耗尽的T细胞可能对癌症免疫治疗至关重要。由于免疫细胞和恶性细胞之间的密切相互作用，恶性细胞的进化在免疫细胞进化中也起着至关重要的作用。拟时序轨迹分析表明，转移性肺腺癌的轨迹分支不同于向纤毛细胞和肺泡型细胞的正常分化。受恶性细胞进化的影响，正常的骨髓细胞群体被单核细胞衍生的巨噬细胞和新型树突状细胞取代。T细胞也被发现会衰竭，从而构建免疫抑制的肿瘤微环境。同样，另一项研究表明甲状腺癌症细胞来源于乳头状甲状腺癌症细胞亚簇，其中构建了不同的肿瘤免疫微环境，导致预后显著恶化。图3：肿瘤相关T细胞和巨噬细胞的进化过程免疫微环境中不同细胞间的通讯网络免疫微环境上的细胞通讯与肿瘤进展有关。配体-受体相互作用是一种重要的细胞通讯类型，对于构建免疫微环境和识别潜在的治疗靶点至关重要。scRNA-seq是在细胞基础上进行的，这使得研究未发现的细胞相互作用变得可行。已经开发了许多基于scRNA-seq数据研究配体-受体相互作用的分析工具，包括iTALK、CellTalker和CellPhoneDB。这些工具利用了已知配体-受体对相互作用的数据库。其中，CellTalker利用差异表达的基因，而CellPhoneDB包括配体和受体的亚基结构。其他工具，如NicheNet，也考虑了受体细胞下游通路的变化。在肿瘤进展过程中，恶性细胞导致免疫细胞的募集和功能障碍，从而相互影响肿瘤的发生和恶性细胞的进化，形成恶性循环(图4)。发现TAMs通过表皮生长因子受体-双调节蛋白配体受体对与恶性细胞相互作用。在基底样乳腺癌细胞系中AREG的调节导致抗炎TAMs的招募。同时，基于scRNA-seq，发现了一种EGFR相关的反馈回路可促进胰腺腺鳞癌的进展。来源于TAMs的抑瘤素M也与其在恶性细胞上的受体相互作用，以激活信号转导子和转录激活子3。研究人员通过整合素受体与胶原蛋白、纤维连接蛋白、血小板反应蛋白1配体和富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4-R-反应蛋白3的相互作用，发现CAF与胃癌细胞之间的通信，这些配体调节干细胞。此外，胰腺导管腺癌的scRNA-seq揭示了TIGIT与T细胞和NK细胞中的甲型肝炎病毒细胞受体2之间的相互作用，以及它们在恶性细胞中的相应配体PVR和LGALS9，导致免疫细胞功能障碍和胰腺癌症进展。因此，基于单细胞数据探索免疫细胞和恶性细胞之间的细胞相互作用提供了可能治疗靶点，以打破肿瘤进展的恶性循环。除了恶性细胞外，scRNA-seq和随后的分析还预测了免疫细胞之间在时间上的相互作用，这表现出相反的功能(图3)。例如，研究发现TAM降低了CXCL12-C-X-C基序趋化因子受体3和CXCL12-CXCR4的相互作用，增强了鼻咽癌细胞毒性T细胞和Tregs之间的CD86-CTLA-4相互作用，导致肿瘤免疫微环境加重癌症进展。此外，CAFs通过分泌CXCL12募集Tregs，并通过periostin与M2巨噬细胞相关。图4：免疫微环境中的细胞通讯网络基于scRNA-seq的肿瘤免疫微环境的临床应用和潜在靶点几十年来，临床实践中一直采用时间的量化来预测患者的生存率和对治疗的反应。利用免疫组化分析的免疫评分，量化肿瘤中的原位免疫细胞浸润。与传统的免疫评分相比，scRNA-seq在免疫微环境上提供了前所未有的渗透免疫细胞分辨率。已经鉴定出与预后相关的新的免疫细胞簇。例如，在早期复发的肝细胞癌中发现了一种独特的低细胞毒性先天性样CD8+T细胞表型。这些T细胞过表达KLRB1，同时下调共刺激和耗竭相关分子，包括肿瘤坏死因子受体超家族、成员9、CD28、诱导型T细胞共刺激因子、TIGIT、CTLA-4和HAVCR2。这种T细胞簇的浸润与癌症的不良预后相关。此外，基于scRNA-seq的细胞相互作用也被计算在预测模型中。基于细胞间通讯相关基因构建了机器学习模型，以预测肺腺癌的复发。将八个细胞间通讯相关基因和患者的临床信息相结合，获得了0.841的受试者-操作者特征曲线下面积。除了预后预测外，肿瘤免疫微环境中独特的细胞相互作用也与免疫疗法的反应有关。scRNA-seq分析发现，抗PD-1治疗的应答者和非应答者之间存在不同的细胞-细胞通信网络，有可能预测患者对抗PD-1疗法的反应。因此，在scRNA-seq的帮助下，可以更准确地预测患者的预后和对免疫疗法的反应。利用scRNA-seq在精准医学中具有启发性，例如帮助靶向治疗克服耐药性。例如，医生在使用替比法尼治疗的非CR肌肉浸润性膀胱癌症患者治疗前后应用患者衍生异种移植物的scRNA-seq。在治疗后的PDX中发现PD-L1的上调，并降低了免疫细胞的抗肿瘤作用。因此，选择了用PD-L1抑制剂进行额外治疗。随后，患者获得了良好的反应。此外，在单药耐药性肿瘤中，通过scRNA-seq鉴定了新的免疫亚型。用抗集落刺激因子1受体阻断TAMs不能减少胆管癌的肿瘤进展。scRNAs-eq鉴定了表达APOE的粒细胞髓系衍生抑制细胞的补偿富集，其介导T细胞抑制。TAMs和粒细胞性骨髓源性抑制细胞的双重抑制与抗CSF1R和抗淋巴细胞抗原6复合物、基因座G治疗联合增强了小鼠的免疫检查点阻断效果小鼠模型，这在临床实践中很有前景。除了治疗耐药肿瘤外，scRNA-seq在免疫微环境上的应用也突出了需要进一步研究的潜在新靶点。T细胞是免疫微环境中去除恶性细胞最重要的免疫细胞。然而，在不同的肿瘤中，耗尽的CD8+T细胞会导致不利的预后。除了众所周知的免疫抑制检查点外，scRNA-seq还鉴定了高表达内皮前体蛋白、酪氨酸酶相关蛋白1和内皮素受体B型的耗尽CD8+T细胞，这些细胞可以作为新的潜在靶点。髓细胞是免疫微环境招募免疫细胞所必需的。通过scRNA-seq鉴定TREM2/APOE/补体组分1，q亚组分阳性巨噬细胞浸润为透明细胞肾癌复发的预后生物标志物。另一项研究证实，小鼠中靶向TREM2的抗体与缺乏MRC1+和CX3CR1+巨噬细胞以及表达免疫刺激分子的髓系簇的扩增有关，这促进了T细胞反应并导致更好的预后。细胞相互作用也可以用作治疗靶点。肝内胆管癌的scRNA-seq揭示了血管CAFs与肝内胆管细胞之间的串扰。血管CAFs分泌的IL-6诱导Cajal间质细胞细胞的表观遗传学改变，从而增强恶性肿瘤。因此，IL-6信号在Cajal间质细胞的中断变得非常有趣。表1总结了scRNA-seq显示的癌症治疗的潜在靶点。表1：scRNA-seq显示的癌症治疗的潜在靶点总结scRNA-seq可以绘制全面的肿瘤免疫微环境细胞图谱，为各种肿瘤的临床应用提供了新的视角。此外，免疫微环境的细胞成分和通讯为癌症治疗提供了潜在靶点，并有助于精确医学的发展。技术的进步和单细胞分析的广泛应用可以发现癌症治疗的新观点，助力临床研究。作为突破性的新技术，单细胞分析技术有望逐渐取代传统的整体样本二代测序。单细胞分析技术在临床和药物开发方面的应用前景更为广阔，可以代替或补充分子、细胞和组织病理检测的现有技术，也可以用于新兴的细胞治疗。

肿瘤药敏性检测方法学是抗癌药物评价和筛选的前提，也是临床化疗方案设计的基础。中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞研究中心开发了基于拉曼组的肿瘤单细胞药敏检测新方法D2O-CANST-R，具有快速、低成本、单细胞器精度、识别耐药细胞、体现抗癌机制、可对接单细胞分选和测序等特色，为癌细胞-药物互作研究、抗癌药物筛选等提供了新手段。　　化疗在恶性肿瘤的治疗手段中占重要地位，如使用得当，单纯或辅助化疗即可根治部分肿瘤；对于一些晚期肿瘤，化疗也可用于姑息性治疗。然而，各种肿瘤类型间或不同患者个体间，其药物应激反应均存在显著差异，且化疗过程中耐药细胞的产生会削弱抗癌药物疗效。因此，快速、低成本、可识别耐药细胞、揭示药物应激机制的肿瘤药敏检测方法，对抗癌药物研发和临床精准用药十分重要。　　目前，主流的肿瘤药敏检测方法，如比色法、生物发光法、荧光分析法等，通常依赖于终点检测，即区分细胞死活，难以定量、特异性地测量药物对癌细胞的“代谢抑制”程度。同时，基于细胞群体反应的检测手段，难以检测癌细胞群体中极个别的耐药细胞；这些“害群之马”在正常环境下没有生长优势，却耐受高浓度药物，因此可能造成肿瘤死灰复燃，导致临床化疗失败。　　针对这一问题，单细胞研究中心科研人员Maryam Hekmatara等以人乳腺癌细胞株（MCF-7）和雷帕霉素的互作为例，开发了重水饲喂单细胞拉曼光谱肿瘤药敏快检技术（D2O-probed CANcer Susceptibility Test Ramanometry；D2O-CANST-R）。结合肿瘤细胞拉曼组采集和多元曲线分辨-交替最小二乘法分析算法（MCR-ALS），研究发现，在1-3天的药物处理后，D2O-CANST-R能特异性地基于“代谢抑制”检测肿瘤药敏性，并能在细胞核、细胞胞质、脂质体等单个细胞器的分辨精度，追踪和区分其中蛋白质与脂质的合成速率和代谢变化，从而揭示药物作用机制。脂质和蛋白质代谢的高度活跃，是肿瘤细胞快速增殖的重要原因，因此，上述能力对于抗癌药物的机制研究和筛选具有重要价值。重水饲喂单细胞拉曼光谱肿瘤药敏快检技术D2O-CANST-R　　基于前期单细胞研究中心提出的“拉曼组”（ramanome）和“药物应激拉曼条形码”（Raman Barcode of Cellular response to stresses；RBCS）等概念，科研人员还揭示了真核生物（人乳腺癌细胞和酵母细胞）之间、细胞器之间、药物浓度之间、药物处理时长之间、生物大分子代谢途径之间等，在单细胞精度代谢应激机制上的异同。因此，D2O-CANST-R还具有高时空分辨率、信息量丰富、揭示代谢层面机制等特点。此外，在高剂量雷帕霉素（500或5000×IC50）处理后，仍存在保持较高代谢活性的癌细胞，即耐药细胞。D2O-CANST-R识别肿瘤耐药细胞和测定耐药异质性的能力，对于药物机制研究、抗癌药物评价和筛选等具有重要意义，并具备辅助精准化疗方案设计的潜在能力。　　单细胞研究中心前期针对临床抗感染用药，提出了“重水饲喂单细胞拉曼药敏快检”原理，引入了“最小代谢活性抑制浓度”（MIC-MA）这一衡量药敏性的新概念，发明了“单细胞光镊微液滴拉曼分选”（RAGE）和“单细胞微液滴流式拉曼分选”（RADS）等核心器件，研制出“临床单细胞拉曼药敏快检仪”（CAST-R）和单细胞拉曼分选-测序耦合系统（RACS-Seq）等；针对临床样品，证明了单个细菌细胞精度同时测定抗生素药敏表型和高覆盖度基因组的可行性（Xu T, et al, Small, 2020）。该研究是上述单细胞技术体系针对人体细胞与药物互作的拓展，不仅将服务于肿瘤药物研发、肿瘤精准用药等，而且为肿瘤单细胞分选和多组学研究提供了新的技术路线。　　相关研究成果发表在《分析化学》（Analytical Chemistry）上。研究工作由青岛能源所研究员徐健主持完成，得到国家重大科学仪器研制项目（国家自然科学基金委员会）和中科院前沿局人才项目等的资助。　　论文链接相关介绍：徐健 中国科学院青岛生物能源与过程所研究员、单细胞中心主任 山东省能源生物遗传资源重点实验室主任。2003年华盛顿大学计算机科学硕士和生物化学博士，2003-2004年华盛顿大学基因组科学和系统生物学中心博士后。2004-08年于华盛顿大学基因组研究院任基因组拼装和分析团队负责人。2008年入选中科院“百人计划”并全职加入中科院青岛生物能源与过程所。研究方向为单细胞分析仪器和大数据，及其在微生物组、合成生物学和生物安全等领域的应用。论文发表于Science, Cell Host Microbe, Sci Adv., Nature Commu.等130余篇，被引用10000余次(H-index 43)。获青年拔尖、创新领军人才、国家杰青基金、中国青年科技奖等支持。中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞中心简介：中国科学院青岛生物能源与过程研究所是由中国科学院、山东省人民政府、青岛市人民政府于2006年7月启动筹建，2009年11月30日通过共建三方验收并纳入中国科学院“知识创新工程”管理序列的国立科研机构。单细胞中心的核心使命是以基因组工程、工具酶开发、先进成像、微流控器件、大数据等为主要方法学支撑，围绕细胞工厂构建、微生物组快检及机制等领域的关键科学和技术瓶颈，开发单细胞分析、分选、测序与培养技术，研制与产业化单细胞分析仪器系列，从国产装备的角度支撑单细胞大数据网络和微生物组天网等原创大数据系统，服务于工业生物技术、大健康、海洋资源挖掘、环境保护与修复、生物安全等应用领域。

在活细胞中以原子分辨率确定蛋白的三维结构，对结构生物学家来说是一大挑战。本期Nature报告的两项进展，应能拓宽这一领域中一项很有希望的方法——细胞内NMR光谱的应用范围。以前，光谱方法较低的灵敏度及样本的短寿命，使得人们难以获得足够的结构信息来用这种方法确定蛋白结构。为NMR实验收集数据一般需要一到两天时间，这对活细胞来说太长了。Sakakibara等人通过在2至3个小时内收集到足够数据而克服了这一局限。他们报告了完全根据在活大肠杆菌中获得的信息确定的第一个三维蛋白结构。 　　该原理证明研究中所用模型蛋白，是来自嗜热菌的假设的重金属结合蛋白TTHA1718。此前，活细胞的细胞内NMR光谱仅限于细菌和非洲爪蟾卵母细胞，对活真核细胞的广泛应用受到向这些细胞中输送同位素标记蛋白效率相对较低的限制。现在，Inomata等人发现，通过细胞穿透肽由吡啶酸调控的作用，有可能将合适标记的蛋白输送到人细胞的细胞液中，所用细胞穿透肽通过共价键与目标蛋白相结合。当输入的蛋白被内生酶活性或自体还原裂解作用释放时，研究人员便能够获得活的人细胞内蛋白质的高分辨率二维异核NMR光谱。这一方法有可能成为以细胞内蛋白为作用目标的药物的设计及筛选工作的一个强大工具。

最近几年，关于单细胞测序的报道日益增多。事实上，单细胞测序是一个新兴的领域。据了解，单细胞测序萌芽于2010年，13年左右才真正发展起来。2014年，单细胞测序的应用被列为《自然—方法学》(Nature Methods)年度最重要的方法学进展。2015基因组学前沿研讨会将单细胞组学单独列为一个单元，可见单细胞测序在当前基因组学前沿研究中的热度。　　本次研讨会上，报告主题涉及单细胞组学领域的报告人，包括美国哈佛大学终身教授谢晓亮博士,美国德克萨斯大学达拉斯分校张奇伟博士，厦门大学杨朝勇博士，中国科学院重庆绿色智能技术研究院王德强博士，北京大学汤富酬博士，美国贝勒免疫研究所林巍博士，华中科技大学宁康博士，南方科技大学贺建奎博士，华中农业大学李响同学等。　　事实上，即使是来源相同的单个细胞，由于随机生物过程和环境扰动的原因，彼此在许多方面也存在差异，即细胞的异质性。常见的基因组测序技术避免不了这一现象带来的影响，基于这一原因，研究人员开启了单细胞测序技术的探索之路。此次研讨会的单细胞组学单元中也有多个报告涉及了单细胞/单分子测序技术的最新进展。　　其中，谢晓亮教授，于2012年在Science发表的论文中推出了一项新技术，多重退火和成环循环扩增技术(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles, MALBAC)。这项技术能从一个细胞的基因组中，分离出DNA。据了解，这种技术能降低PCR扩增偏倚，使得单细胞中93%的基因组能够被测序。从而使得检测单细胞中较小的DNA序列变异变得更容易，也能够发现个别细胞之间的遗传差异。这样的差异可以帮助解释癌症恶化的机制，生殖细胞形成机制，甚至是个别神经元的差异机制。目前，这项技术已经应用到体外受精以及肿瘤的个性化治疗中。谢晓亮　　来自厦门大学的杨朝勇教授，运用液滴微流控技术进行高通量的单细胞检测，包括分离，处理和分析DNA、RNA和蛋白质，这种技术是在微流控芯片上发展起来的一种操纵微小体积液体的全新技术。在传统的液滴微流控技术基础上,将“油包水”改成“油包琼脂糖”,同时杨教授提出了一种琼脂糖液滴微流控技术。这项技术已经成功应用到蛋白结晶、酶分析、化学合成、单分子/单细胞研究等分子与细胞生物学及分析化学研究领域中。杨朝勇　　据了解，上世纪90年代已有关于利用纳米孔进行核酸序列识别的报道，该方法存在DNA易位速率过快的问题。中国科学院重庆绿色智能技术研究院王德强博士，正在研发新一代单分子测序技术，在直径小于双螺旋的固态纳米孔中，通过拉伸双链DNA，减慢单个分子的双链DNA的易位速度。王德强　　目前，单细胞的RNA或DNA测序方法不允许同时分析转录组和基因组序列。来自深圳南方科技大学的贺建奎博士介绍到，他们利用基于新一代测序技术的策略解决了这一问题。以小鼠卵母细胞为例，这种将单个卵母细胞DNA和RNA测序合并的方法可以达到基因组的高覆盖率和低偏好性转录组的可重复性。这项技术将有助于实现生物学和医学的核目标，即将生理或病理条件下单个细胞的基因型和表型完美地联系起来。贺建奎　　从此次研讨会上单细胞组学的热烈讨论中，我们可以感受到，现在是单细胞测序的蓬勃发展阶段，相信在不久的将来，科学工作者们能解释更多的诸如遗传性疾病的成因、癌症恶化机制等问题，为精准医学和个性化医疗等临床应用提供更坚实的理论基础。 编辑：史秀明

全日程更新|8月30日开播！31位嘉宾云聚第六届细胞分析网络会议iCCA2023（点击查看）仪器信息网将于2023年08月30日-09月01日举办第六届细胞分析网络会议（iConference on Cell Analysis，iCCA 2023）。大会首日8月30日，特设【类器官与器官芯片】专题会场，12位嘉宾在线分享类器官的构建及流式、细胞成像等表征分析技术的应用！在线免费向听众开放报名，欢迎报名参会！报名链接: https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/icca2023 （点击报名）分会场设置日期上午下午08月30日类器官与器官芯片08月31日单细胞分析技术（上）：微流控/质谱单细胞分析技术（下）：测序/代谢组学09月01日细胞治疗产品的CMC质量控制分析细胞成像分析技术iCCA 2023 交流群 8月30日|类器官与器官芯片主题日程 精彩报告 速览《细胞(类器官)力学芯片研究进展》熊春阳 北京大学工学院 教授【摘要】越来越多的研究表明，物理力学微环境是机体生长发育、结构重建以及功能维持的重要因素，也与疾病的发生发展密切相关。微流控技术既可以在体外精确构建细胞(类器官)的物理力学微环境，也可以实现对细胞(类器官)表型的高通量、精确检测，为类器官和器官芯片研究与应用提供了强有力的工具。本次报告将介绍近期我们在细胞(类器官)力学芯片方面的一些研究进展。安捷伦细胞分析技术在类器官领域的应用林鹤鸣 安捷伦科技（中国）有限公司 产品应用专家【摘要】类器官作为更接近体内真是水平的研究模型，近年来受到越来越多研究者的青睐。类器官的拍照成像，是质控类器官，了解类器官生长情况的最直接手段。 安捷伦提供了长时间，高通量自动化的成像分析方法，同时配合微孔板检测，流式细胞术以及细胞能量代谢等手段，让科研工作者更为深入全面的分析类器官模型背后的科学问题。干细胞与类器官王凯 北京大学 研究员【摘要】干细胞衍生的类器官能够复现人体组织的三维结构和特征，能够用于研究人胚胎发育的过程，构建疾病模型和作为替代性的细胞治疗疗法。Hamilton自动化解决方案在细胞高通量筛选的应用潘晓 哈美顿（上海）实验器材有限公司 应用工程师【摘要】目前有多种细胞培养类型和基于细胞的系统用于基于细胞的试验；从传统的二维(2D)单层细胞到基于支架的3D培养（例如类器官），以及最近的器官芯片Organs-On-A-Chip (OOAC)。在基于细胞的高通量筛选试验中，在培养细胞的同时需要评估大量化合物/条件。这些试验的效率及标准化通常是通过自动化得以实现。自动液体处理系统可以通过控制关键因素确保整个过程的标准化，例如吸液和分液的速度、吸头在孔内的位置、移液步骤中板的倾斜、试剂在板上的温度和工作区域的无菌性。此外，自动化液体处理工作站可以通过96和384移液头显著提高通量，并整合第三方设备进行细胞成像。 在本次网络会议中，主要讨论如何使用Hamilton自动化液体处理工作站满足基于细胞的高通量筛选要求。Application of organoid technology in prostate stem cell and cancer research蔡志伟（Chua Chee Wai） 上海交通大学医学院附属仁济医院 研究员【摘要】In the recent years, we have witnessed the emergence of androgen receptor (AR)-independent prostate cancer (AIPC) with the clinical use of second-generation androgen deprivation therapy. Upon the progression to AIPC, the remaining treatment options are mainly palliative but not curable. Therefore, understanding the cellular origins and dynamics involved in AIPC evolution is crucial for identifying timely treatment strategies for these patients. In this presentation, I will first share with you the invention of prostate organoid technology, which facilitates novel discoveries in prostate stem cell and cancer research. Subsequently, I will talk about how we integrate organoid technology and single-cell transcriptomic analysisto identify novel AR-independent prostate luminal progenitor and cancer subsets. Our findings have highlighted the capability of organoid technology in preserving progenitor potential and tumor heterogeneity. Consequently, continual investigations using organoid technology should yield novel insights into the emergence of AIPCs and identify novel therapeutic targets for AIPC patients.复杂皮肤类器官构建及其应用冷泠 中国医学科学院北京协和医院 正高级/教授【摘要】冷泠研究团队基于空间基质组学技术及其研究成果，创建了一种具有表皮及毛囊附属器、真皮及神经系统的完整细胞极性的皮肤类器官。利用该类器官进行病毒的体外感染，首次为新冠肺炎和脱发后遗症之间的关联提供了证据；进行罕见病治疗研究，实现了该疾病表皮附属器和血管的新生，推动类器官在罕见病治疗和药物筛选中的应用。实时活细胞成像分析在3D器官细胞模型中的应用陆叶舟 赛多利斯（上海）贸易有限公司 生物分析产品应用科学家【摘要】 1. 实时活细胞成像与分析技术介绍 2. 实时活细胞分析促进3D细胞模型培养及应用 应用案例解析：神经肌肉类器官、食管类器官、胰腺导管癌类器官、肾脏类器官、胶质母细胞瘤球体、直肠癌类器官等基于微流控的细胞无标记分选和打印研究陈华英 哈尔滨工业大学（深圳） 副教授【摘要】 微流控芯片在单细胞操控、培养和分析领域具有独特优势，已被广泛用于单细胞分析。本文主要介绍课题组在利用微流控芯片进行单细胞打印、克隆扩增、弹性模量测量和形貌分选方面的最新研究进展。课题组开发的一款集成两个气动微阀门的芯片，可以通过气压控制阀门的闭合程度，进而在单细胞尺度实现细胞大小的动态筛选。前后两个阀门分别控制细胞的尺寸上限和下限，符合尺寸要求的细胞可以在压力泵的驱动下被快速打印到384孔板内，实现每孔一个细胞。打印后的单细胞活性为97.2%。与对照组相比，打印过程未对细胞活性造成影响。此外，课题组还开发了一款集成颗粒分离和压力传感器以进行单细胞弹性模量精密测量的微流控芯片。该芯片可将细胞悬浮液中的杂志分离到侧通道，并使单个细胞在微流道中受挤压变形，同时由压力传感器记录导致细胞变形的压力。通过研究细胞变形量和对应的压力，并结合幂律流变模型，可以计算出细胞的弹性模量和粘度数据。利用该芯片获得了K562和人脐静脉细胞的弹性模量分别是64.2 ± 33.3 Pa 和383.4 ± 226.7 Pa。基于上述技术课题组开发了利用图像实时处理进行细胞大小、形貌和弹性分选的微流控系统，实现了混合细胞群体的无标记高通量分选打印。上述工作为微流控芯片在高通量单细胞分析领域的创新应用提供了实验基础。流式细胞术在类器官研究中的应用于化龙 贝克曼库尔特 高级应用专家【摘要】1流式用于类器官构建 2流式用于类器官质控 3流式用于类器官免疫监测 4流式用于类器官药物筛选TOPMOS类器官高通量药物筛选系统杨根 北京大学 副教授【摘要】本团队开发的肿瘤类器官精准药物芯片筛选（Tumor Organoid Precision Medicine On-chip Screening Platform, TOPMOS）平台可在短时间内高通量培养出大小可控、均一性高的肿瘤类器官，实现高仿生化模拟体内微环境和高精度模拟体内药代动力学，能与现有常规检测设备匹配，实现多药物多浓度的快速药敏测试。类器官多维度多模态显微成像应用游换阳 徕卡显微系统（上海）贸易有限公司 应用专员【摘要】针对类器官成像复杂性，Leica提供全流程需要的设备，从类器官获取，日常培养观察，高清宽场和共聚焦成像再到最后的人工智能大数据分析，徕卡提供全流程成像分析解决方案，助力类器官科研。类器官与器官芯片在细胞分析中的应用与发展陈早早 江苏艾玮得生物科技有限公司/东南大学 副总经理/副研究员【摘要】人体器官芯片并非电子产品，而是一种‘体外的活的人体器官’，简单的说，即科研人员利用人体自身的干细胞，在U盘大小的芯片上制作出微缩的人体器官，以模拟人体相应器官的功能，制造出要用显微镜才能观察到的体外迷你的‘心脏’、‘肝脏’、‘肾脏’等等。人体器官项目正逐渐从研发端走到应用端的“最后一公里”。不仅在药物发现、细胞分析、环境评估、精准医疗、航天医学方面都有器官芯片的应用。温馨提示:1) 报名后，直播前一天助教会统一审核，审核通过后，会发送参会链接给报名手机号。填写不完整或填写内容敷衍将不予审核。2) 通过审核后，会议当天您将收到短信提醒。点击短信链接，输入报名手机号，即可参会。

近日，有报道称，20世纪70年代男性平均每毫升精液有9900万个精子，到了2011年，这一数量降至4700万个，降幅高达53%。美国西奈山伊坎医学院环境医学和公共卫生学教授Shanna Swan因此预测，照这一趋势持续下去，到2045年时，男性或将“绝精”。这一说法是否耸人听闻我们还无法下结论，但男性不育症已成为一个全球性的健康问题。全世界至少15%的夫妇受到不孕不育的困扰，其中一半是男性。男性不育的原因包括遗传缺陷、环境毒剂、损伤或治疗后遗症，如碱化化疗。目前还没有治疗不育症的方法。近日，发表在《Fertility and Sterility Science》上的一项研究中，来自美国佐治亚大学领导的研究团队首次利用非人灵长类动物的胚胎干细胞在体外分化出功能性精子细胞。该研究是生殖和发育生物学领域的重大突破，有望在男性无法生成活精子的情况下治疗不育症。在此前的研究中，该研究团队、华东师范大学团队等已经证明利用小鼠干细胞分化出高级生精细胞的能力，但啮齿类动物精子的生成过程与人类截然不同。在这项工作开始之前，研究人员还不清楚这项技术能否应用于人类。由于恒河猴与人类具有相似的生殖机制，而且它们的精子发生在动力学上也与人类更类似，这使其成为探索基于干细胞技术的男性不育疗法的理想和必要模型。在这项新研究中，研究人员通过恒河猴实验首次表明功能性单倍体精子可以完全在体外从非人灵长类多能干细胞分化出来。这一结果代表了在体外生成雄性生殖细胞的重要一步。然而，研究人员表示仍存在一些问题。他们注意到精原干细胞介导的生殖细胞分化不会使TET3基因（通常在成熟精子中表达）表达提升到在恒河猴精子中观察到的水平。也就是说，生成的精子样细胞，就像灵长类动物体内的圆形精子一样，是不成熟的。因此，不能自行激活成熟的卵母细胞。为了克服受精这一障碍，研究人员发现，加入激活因子和纯化的TET3蛋白可以提高生成健康胚胎的效率。总之，这项研究证明了非人灵长类多能干细胞可以分化成生精细胞系，包括可以使非人灵长类卵母细胞受精并发育到囊胚阶段的精子样细胞，该研究还强调了一些减数分裂机制参与了在体外生成单倍体圆形精子细胞样细胞。研究人员表示，可以通过深入了解男性不育症患者精子发生停止的原因，来帮助弥合生殖和发育生物学领域的问题。该研究负责人、佐治亚大学公共卫生学院首席研究员Charles Easley教授说：“这项研究是表明干细胞技术具有可转化性的重要一步。我们正在使用一种与我们更近的物种进行研究，并且在创造健康胚胎方面我们已取得了成功。”今年秋天，研究人员计划进行下一个关键步骤，将这些胚胎植入代孕恒河猴体内，以检查这些体外生成的精子细胞是否能产生健康胚胎。如果这一步成功，研究团队将使用源自恒河猴皮肤细胞的精子样细胞复制这一过程。论文链接：https://www.fertstertscience.org/action/showPdf?pii=S2666-335X%2821%2900066-5

近日 Cell旗下Cell metabolism杂志上发表宾夕法尼亚大学的Chi V. Dang研究团队发现癌基因Myc会扰乱细胞的生物钟和代谢的相关论文。这项研究表明，MYC能结合到关键基因的启动子区域，改变细胞的代谢和昼夜节律。这种蛋白具有双重功能，不仅在代谢通路中起作用，还能抑制BMAL1的抑癌效果。这项研究有助于更好的理解癌细胞如何有效维持快速复制。文章第一作者Brian Altman博士说“MYC癌细胞的节律性振荡发生改变，是因为蛋白REV-ERBα的表达水平被上调，这类癌症应该很适合采取时间疗法(chronotherapy)”。“我们的工作将癌细胞代谢与癌症时间疗法关联起来。”癌症时间疗法的理论基础是，在正确的时间进行治疗，可以有效杀死癌细胞，同时减少对正常细胞的副作用。已知CLOCK-BMAL1二聚体是生物钟的重要调控子，而MYC在基因组中的结合位点与CLOCK-BMAL1相同。因此研究人员推测，癌细胞中的MYC异常表达可能会影响到生物钟。研究中发现，MYC异常表达会提高REV-ERBα的表达，进而影响BMAL1和生物钟。降低REV-ERBα的表达水平，可以部分恢复这些癌细胞中的节律性振荡。此外，在神经母细胞瘤患者中，高水平REV-ERBα和低水平BMAL1都与预后差有关。在神经母细胞瘤中重新表达BMAL1，能够抑制这些癌细胞的复制能力。研究显示，MYC对葡萄糖代谢的振荡和谷氨酰胺的消耗也有很大的影响。葡萄糖和谷氨酰胺都是细胞中的基础代谢分子。研究人员建立了骨肉瘤细胞系，并且在其中分析了MYC和代谢的互作。细胞系的葡萄糖通路原本存在正常的节律性振荡，但MYC增多之后这种振荡就消失了，细胞的葡萄糖摄取速度大大增加。Hsieh说。癌细胞独特的代谢谱为人们提供了癌症治疗的重要线索：当正常细胞休息而癌细胞还在没日没夜地工作时，癌症治疗可以起到事半功倍的效果，对正常细胞的毒性也大大降低。

95-D 人高转移肺癌 95-D细胞 THC-8307 人高分化结肠腺癌细胞系 THC-8307细胞 HuH7-HCV 人感染HCV肝癌细胞,HuH7-HCV细胞 JRDC071 人肝转移癌 HCCLMS细胞, THLE-3 人肝永生化细胞,THLE-3细胞 LX-2 人肝星形细胞正常 LX-2细胞 LX-2 人肝星形细胞,LX-2细胞 HL-7702 人肝细胞正常 HL-7702细胞 QSG-7701 人肝细胞,QSG-7701细胞 FL62891 人肝细胞,FL62891细胞 HIBEpiC 人肝内胆管上皮细胞,HIBEpiC细胞 CASC111 人肝母细胞瘤细胞,HuH-6细胞, ED-25 人肝静脉内皮细胞,ED-25细胞 CASC204 人肝胆管癌细胞,RBE细胞, PLC/PRF/5 人肝癌亚历山大细胞,PLC/PRF/5细胞 HCCC-9810 人肝癌亚力山大细胞,HCCC-9810细胞 MHCC-97H 人肝癌细胞系（高转移）MHCC-97H细胞 LM-6 人肝癌细胞系 LM-6细胞 Human bel7402 人肝癌细胞系 Human bel7402细胞 Hep-3B 人肝癌细胞系 Hep-3B细胞 MHCC-97L 人肝癌细胞（低转移）MHCC-97L细胞 SNU-739 人肝癌细胞,SNU-739细胞 SNU-475 人肝癌细胞,SNU-475细胞 SNU-449 人肝癌细胞,SNU-449细胞 SNU-398 人肝癌细胞,SNU-398细胞 SMMC-7721 人肝癌细胞,SMMC-7721细胞 SK-HEP-1 人肝癌细胞,SK-HEP-1细胞 QGY-7703 人肝癌细胞,QGY-7703细胞 QGy-7701 人肝癌细胞,QGy-7701细胞 Li-7 人肝癌细胞,Li-7细胞 Human SMMC-7721 人肝癌细胞,Human SMMC-7721细胞 Human SK-HEP-1 人肝癌细胞,Human SK-HEP-1细胞 HUH-7 人肝癌细胞,HUH-7细胞 HHCC 人肝癌细胞,HHCC细胞 HepG-2 人肝癌细胞,HepG-2细胞 HepG2.2.1.5 人肝癌细胞,HepG2.2.1.5细胞 Hep3b 人肝癌细胞,Hep3b细胞 Hep3B2.1-7 人肝癌细胞,Hep3B2.1-7细胞 Hep G2 人肝癌细胞,Hep G2细胞 JRDC054 人肝癌细胞,hep 3B细胞, Hep 3B2.1-7 人肝癌细胞,Hep 3B2.1-7细胞 HCC-9724 人肝癌细胞,HCC-9724细胞 H7402 人肝癌细胞,H7402细胞 FL62891 人肝癌细胞,FL62891细胞 Bel-7405 人肝癌细胞,Bel-7405细胞 BEL-7402 人肝癌细胞,BEL-7402细胞

细胞治疗一般包含干细胞治疗和免疫细胞治疗。间充质干细胞和造血干细胞是目前临床研究和治疗应用最广泛的干细胞类型，诱导多能干细胞（iPSC）则因其不存在传统干细胞存在的伦理问题，而成为干细胞领域最具前景的干细胞类型之一。CAR-T疗法是当前免疫细胞治疗领域最炙手可热的领域，此外，TCR-T、TIL、NK等免疫细胞疗法也是当前免疫细胞疗法的主要类型。载体介导的基因疗法是目前基因治疗的主要形式，主要包括病毒载体和非病毒载体，广义的基因治疗还包括核酸药物、溶瘤病毒疗法等。本文将重点盘点国内以CAR-T为代表的免疫细胞疗法、以间充质干细胞为代表的干细胞疗法以及基因疗法等临床和注册情况。01 干细胞2004年至今，CDE共承办了62项干细胞药物申请，包括2项进口药品申请和60项国产药品申请，目前已有35项临床申请获得了临床批件或临床默示许可，另有8项申请终止了审批程序或不被批准。从药物注册分类来看，62项干细胞药物申请中共有42项1类新药申请，从2018年至今呈现逐年增长情况，2021年较上一年同比增速超120%，2022年前四个月已有10项1类干细胞药物申请，全年有望以超过50%的增速再创新高。 图1：我国历年1类干细胞药物申请数量 数据来源：CDE从干细胞类型来看，间充质干细胞（包括间充质祖细胞、间充质前体细胞等）共有47项，主要来源包括脐带、胎盘、宫血、脂肪、骨髓、牙髓等；胚胎干细胞、造血干细胞、前体细胞、肌母细胞等其他类型干细胞申请仅15项，包括泽辉生物的人胚干细胞产品CAStem、仙荷医学的支气管基底层细胞产品REGEND001，以及两款基因编辑的干细胞产品——康景生物的CG001和辑因医疗的CRISPR/Cas9 基因修饰BCL11A红系增强子的自体CD34+造血干祖细胞注射液。 从临床试验来看，目前在中国临床试验注册中心登记开展的干细胞相关临床试验多达600余项，而在CDE药物临床试验登记与信息公示平台上登记开展的以药物上市为目的的临床则有20项，其中进度最快的仅推进至临床II期，离推进至上市仍有很长一段距离。表1：以上市为目的登记开展的干细胞药物临床试验数据来源：药物临床试验登记与信息公示平台由研究者发起的干细胞临床研究方面，截至目前我国医学研究登记备案信息系统和卫健委公布的干细胞临床研究备案项目已超100项，批准设立的干细胞临床研究备案机构已达133家（含部队医院）。其中，上海交大附属仁济医院、中山大学附属第三医院分别以6项和5项干细胞临床研究备案项目位居前二，仁济医院备案项目涉及神经系统疾病、骨科疾病和风湿免疫性疾病，中山大学附三医院开展3项针对脊髓损伤的干细胞临床研究，南京大学附属鼓楼医院、郑大一附院、中南大学湘雅医院均以4项干细胞临床研究备案项目并列第三。02 免疫细胞截至2022年5月，全国已有累计131项免疫细胞疗法申请获得CDE受理，其中CAR-T疗法84项、TCR-T疗法8项、TIL疗法4项、CAR-NK疗法2项，其他类型免疫细胞疗法共33项。其中，共有75项免疫细胞治疗产品申请获得临床批件/临床默示许可，包括CAR-T疗法独（56项）、TCR-T疗法（3项）、CAR-NK疗法（1项）、其他免疫细胞治疗（15个）。 图2：我国免疫细胞疗法申请与获批临床情况 数据来源：CDECAR-T领域，我国已上市的瑞基奥仑赛提交的新适应症（成人复发或难治性滤泡淋巴瘤）上市申请被纳入优先审评序列，其以明聚生物申报的用于成人复发难治性套细胞淋巴瘤的JWCAR029也别纳入突破性治疗药物程序。在此之前，已先一步上市的另一款CAR-T产品阿基仑赛的新适应症（复发或难治性惰性非霍奇金淋巴瘤）上市申请也率先被纳入突破性治疗药物程序。从靶点来看，除北恒生物的UCAR-T产品之外，CD19仍是当前扎堆最为严重的赛道，靶向CD19的CAR-T产品共有56个药物申请，其次为BCMA靶点的11个，CD20、CD30、CD70、TGF-β、GPC3、Claudin 18.2、B7-H3等其他单靶点CAR-T疗法。此外，另有4项双靶点CAR-T疗法申请获得CDE受理，分别为赛比曼的CD19/CD20和驯鹿医疗的CD19/CD22双靶点CAR-T疗法。 图3：我国CAR-T疗法靶点分布情况 数据来源：CDE 从临床试验情况来看，目前在CDE药物临床试验登记与信息公示平台上登记开展的CAR-T疗法临床试验共48项。其中，诺华的进口产品CTL019在国内开展的临床试验进度最快，已进入临床Ⅲ期，其他国产1类CAR-T疗法均未进展至Ⅲ期。表2:国内临床阶段CAR-T疗法进展数据来源：药物临床试验登记与信息公示平台其他免疫细胞疗法方面，香雪旗下TAEST16001、TAEST1901和星汉德生物的SCG101三款TCR-T疗法已获得临床默示许可，君赛生物、智瓴生物和沙砾生物各有一款TIL疗法获得CDE受理，国健呈诺的靶向间皮素嵌合抗原受体NK细胞注射液是目前唯一一款进入临床阶段的CAR-NK疗法。03 基因治疗截至2022年5月，国内共有27项基因疗法申请获得CDE受理，其中已有9项申请获得临床批件/临床默示许可，包括诺华的进口腺相关病毒（AAV）基因疗法OAV101注射液。同时，共有6项基因疗法临床试验在CDE药物临床试验登记与信息公示平台登记开展。从载体类型上看，AAV基因疗法（包括重组腺相关病毒）占据主导，共有17项。表3:国内IND阶段的基因治疗产品（除CAR-T）数据来源：火石创造数据库另外，国内目前还有64个溶瘤病毒疗法获得CDE受理，其中已有30项获得临床批件/临床默示许可，主要以疱疹病毒和腺病毒为主要病毒类型，临床进展最快的为达博生物的重组人内皮抑素腺病毒注射液，已进入临床Ⅲ期。

流式细胞技术与相关的荧光激活细胞分选技术(fluorescence-activated cell sorter，FACS)对生物学研究产生了深远的影响，但是它们还是存在一些局限性，近年来，科学家们研发出了一些新的策略，但他们并没有修改传统的流式细胞仪，而是在新型微流控装置上进行精简。这些微型芯片实验室能帮助研究人员在更为多样的物理和分子特征基础上进行筛选和分型，而且也不需要抗体。以下是几位学者提出的新型流失细胞技术与研究策略。 　　研究人员：中科院青岛生物能源与过程研究所单细胞研究中心主任徐健研究员 　　当前项目: 微生物生物燃料发展 　　存在问题: 生物燃料研发需要标识出那些能进行特殊碳化学反应的细胞，但是这些细胞无法正常培养和研究，因此研究人员也不清楚是否有一些能识别和分拣细胞的分子标记。 　　解决方案： 　　徐健研究组以单细胞拉曼分选(RACS)为基础，研发出了一种基于阵列介电单细胞捕获/释放的快速拉曼识别技术。 　　单细胞拉曼分选(RACS)是一种极具潜力的活体细胞功能分选技术。与目前通用的荧光激活细胞分选(FACS)相比，RACS具有直接基于细胞功能分选、无需标记、不需预知生物标识物的关键优势，因此在海洋资源挖掘、生物能源种质筛选、肿瘤监测与分选、环境微生物监控、农业生态研究等诸多领域具有广阔应用前景。但由于细胞固有拉曼信号弱所导致的细胞分选通量低这一问题限制了其应用与推广。开发高速流动细胞拉曼信号的快速采集和识别已经成为发展高通量拉曼流式细胞分选的关键技术挑战之一。 　　为此，这一研究组开发了一种基于阵列介电单细胞捕获/释放的快速拉曼识别技术。通过对高速流动单细胞的介电操控，实现了单细胞流在电极上的捕获/释放，并在细胞捕获期间(毫秒-秒)完成拉曼信号的采集识别。 　　通过耦合该团队同期建立的基于电磁阀吸吮的微流控细胞分离技术(Zhang Q, et al., Lab on a Chip 2014, Cover page, 2014 HOT Articles)，实现了产色素工程酵母和普通酵母细胞的拉曼流式分选。前述工作首次建立起基于介电单细胞捕获/释放的单细胞拉曼流式分选原理和装置，为下一步发展高通量拉曼流式细胞分选仪器奠定了原理和关键技术基础。 　　单细胞中心前期建立的单细胞弹射分选方法(Wang Y, et al, Anal Chem, 2013)适用于贴壁生长的细胞、微生物生物膜等固相细胞的分选。而该研究开发的单细胞流式分选方法针对于流动相细胞的分选。这两种方法学的建立和相互结合，为研制广谱性适用于自然界各种细胞存在状态的单细胞拉曼分选装备提供了可行性。 　　如何入手： 　　徐健研究员表示，在国内已经配置了两台微流控RAC系统，同时还有另外两台正在组装中。第三台RAC系统在牛津大学，研究人员可以申请使用这些仪器，他表示，&ldquo 欢迎提出任何问题，我们的一些资助资金也鼓励项目合作。&rdquo

近日，清华大学欧阳证教授课题组在analytical chemistry上发表了single-cell mass spectrometry analysis of metabolites facilitated by cell electro-migration and electroporation，且以acs editors' choice形式亮点报道。 文章介绍了基于细胞电迁移-电穿孔的单细胞质谱分析方法，该方法无需细胞高精度操控平台，仅通过对单细胞施加一定序列的电压，即可实现对单个酵母等具有细胞壁的细胞内代谢物的可控释放与质谱分析。 acs美国化学会报道： acs 编辑良择 | 基于细胞电迁移-电穿孔的单细胞质谱分析方法通讯作者：欧阳证，清华大学作者：zishuai li (李自帅)，zhengmao wang (王正茂)，junmin pan (潘俊敏)，xiaoxiao ma (马潇潇)，wenpeng zhang (张文鹏)，zheng ouyang (欧阳证) 单细胞分析对研究细胞在转录组学、蛋白组学以及代谢组学等方面的异质性有着重要的意义。目前，科学家们开发了大量的单细胞分析方法和技术，例如荧光分析法、微流控芯片、流式细胞仪、单细胞测序等。质谱分析，因其低样品消耗量、高灵敏度、高定量准确性等优势，已经被广泛应用于单细胞蛋白组学、脂质组学和代谢组学分析中。然而，目前大部分的单细胞质谱分析方法，都需要依托于高精度操作平台，这给单细胞分析技术的应用带来了一定的挑战。 清华大学欧阳证教授课题组报道了一种基于细胞电迁移-电穿孔的单细胞质谱分析方法。该方法无需细胞高精度操控平台，仅通过对单细胞施加一定序列的电压，即可实现对单个酵母等具有细胞壁的细胞内代谢物的可控释放与质谱分析。如图1所示，在硼玻璃纳喷管中加入适当体积(约0.5 μl)的细胞悬浮液(约104细胞/ml)，该溶液内平均只含有单个细胞。由于细胞表面通常带负电，通过非接触式电极对溶液施加直流负电压，使细胞迁移到纳喷管尖端，并在针尖处封闭一段超小体积(约1.5 pl)的液体。之后施加高压脉冲电压，在细胞膜表面形成电穿孔，细胞内代谢物即释放到前端的超小体积液体中，从而避免了细胞内代谢物的过度稀释。最后，采用非接触式电极加压，由纳升电喷雾离子化将该部分溶液离子化并进行质谱分析。图1. 基于细胞电迁移-电穿孔的单细胞质谱分析方法 该研究中，首先用酵母细胞进行了方法验证。如图2所示，从离子流热图中可以看出，施加脉冲电压后，在质荷比m/z 50到800的范围内出现了大量的代谢物离子信号。图2b-c中比较了施加脉冲电压前后的单细胞分析质谱图。通过精确质量对比、串级质谱分析等方法，该课题组在单个酵母细胞内检测到了71种代谢物。图3a-f展示了几种典型代谢物的串级质谱谱图。 图2. (a)质谱离子流热图。在5 s时刻施加了高压脉冲电压。(b)负离子模式。(c)正离子模式。 图3. 负离子模式下单酵母菌代谢产物典型的串级质谱谱图 (a) glu, (b) gsh, (c) amp, (d) adp, (e)atp, (f) udp-hex. 除了酵母细胞，该方法还可用于其他种类的具有细胞壁结构的单细胞菌类的高灵敏度质谱分析。图4展示了莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtti)、杜氏盐藻(dunaliella salina)、斜生栅藻(scenedesmus obliquus)、绿眼虫(euglena viridis)的单细胞分析质谱图。图4. 不同种类细胞的单细胞质谱谱图。从内向外依次为：莱茵衣藻，杜氏盐藻，斜生栅藻，绿眼虫。 此外，该课题组还研究了不同培养环境下，单个细胞内代谢物相对含量的变化情况。将两组莱茵衣藻细胞，分别在有/无光照条件下培养24小时，之后采用本方法进行单细胞内代谢物的质谱分析。单细胞质谱分析表明，在黑暗条件下，衣藻细胞内的卡尔文循环内的碳固定被终止，细胞内有氧呼吸强度下降，糖酵解代谢增强。此时，细胞的光合作用停止，细胞通过糖酵解分解糖类以提供基本的代谢需求，同时降低有氧呼吸强度以维持生存。图5. 黑暗条件下的莱茵衣藻单细胞内部分代谢物强度比值变化。 本研究的相关结果已发表在analytical chemistry，并以acs editors' choice形式亮点报道。该论文得到了国家自然科学基金项目的支持。 文章链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.analchem.0c02147

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p 　　拔根汗毛，吹口气，就能变出一大堆小猴子。如今，“齐天大圣”孙悟空的这项绝活，真的成为了现实。 /p p 　　最近，在中国科学院神经科学研究所非人灵长类研究平台出生的两个猕猴宝宝“萌”化了所有人，它们时而一起嬉笑打闹，时而依偎着自己心爱的“Hello Kitty”毛绒玩具，时而瞪着大大的眼睛，好奇地望着这个世界。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/noimg/7696dbb3-c7ab-4fc7-bc3d-a18b33961f3c.jpg" title=" 中华.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " “中中”和“华华” /span /p p 　　这两个小猴子的“父母”，是中科院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越中心研究团队。经过五年不懈努力，他们在国际上首次实现了非人灵长类动物的体细胞克隆。1月25日在线出版的《细胞》杂志以封面文章形式发表了这项成果。 /p p 　　这两只名叫“中中”和“华华”的小家伙，也在一夜之间，成为世界上最珍贵的一对小猕猴。 /p p 　 strong 　克隆猴为何这么难? /strong /p p 　　自从1997年“多莉羊”体细胞克隆成功后，人类就打开了一扇新的窗户。 /p p 　　20年间，许多哺乳类动物的体细胞克隆相继获得成功，不仅诞生出马、牛、羊、猪和骆驼等大型家畜，还诞生了小鼠、大鼠、兔、猫等多种实验动物。 /p p 　　然而，与人类最为相近的非人灵长类动物的体细胞克隆，却一直没有得到解决，成为世界性难题。美国、中国、德国、日本、新加坡和韩国等多家科研机构在此方面进行不断探索和尝试，但始终未能成功。 /p p 　　“一个主要的限制因素，是供体细胞核在受体卵母细胞中的不完全重编程，导致胚胎发育率低。”文章通讯作者、中科院神经科学研究所非人灵长类研究平台主任孙强说，“另外，非人灵长类动物胚胎的操作技术不完善，这些都影响了实验的成功。” /p p 　　胚胎操作的一个必要步骤是给卵母细胞去核。但与其他动物不同的是，猴子的卵母细胞不透明，因此去核操作非常困难。 /p p 　　科研人员想出了使用偏振光的方式来给细胞“打光”，但为了尽可能减少对细胞的影响，操作必须在极短时间内完成。 /p p 　　为此，文章第一作者、中科院神经科学研究所非人灵长类研究平台博士后刘真花了大量的时间，去训练这项技术，最终实现了在10秒内精准完成体细胞核移植的显微操作。 /p p 　　同时，科研人员不断尝试各种实验方法，通过表观遗传修饰促进体细胞核重编程，显著提高了体细胞克隆胚胎的囊胚质量和代孕猴的怀孕率。 /p p 　　2017年11月27日，世界上首个体细胞克隆猴“中中”在中科院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心非人灵长类平台诞生 12月5日，“中中”的妹妹“华华”也顺利诞生。 /p p 　　 strong 真正有用的动物模型 /strong /p p 　　体细胞克隆猴是在中科院战略性先导科技专项“脑功能联结图谱与类脑智能研究”的支持下，完全由中科院团队独立完成的国际重大突破。 /p p 　　“这个成果真正实现了生命科学领域的弯道超车，意义重大。”中科院院长白春礼评价称，该成果标志着中国率先开启了以体细胞克隆猴作为实验动物模型的新时代，实现了我国在非人灵长类研究领域由国际“并跑”到“领跑”的转变。 /p p 　　体细胞克隆猴的成功，为动物模型家族再添“新成员”。 /p p 　　当前，药物研发通用的动物模型是小鼠。但小鼠与人类相差甚远，药物研发人员在小鼠模型上花费了巨大资源，但筛选到的候选药物用在病人身上，却大都无效，或有不可接受的副作用，这使得诸如阿尔茨海默病、自闭症等脑疾病，以及免疫缺陷、肿瘤、代谢性疾病等不能得到有效治疗。 /p p 　　这让非人灵长类动物模型成为生命科学研究和人类疾病研究的急需。 /p p 　　因此，除了基础研究上的重大意义外，利用体细胞克隆技术制作脑疾病模型猴，为人类社会面临的重大脑疾病的机理研究、干预、诊治带来了前所未有的光明前景。 /p p 　　“这项成果使猕猴有望成为真正有用的动物模型。”中科院院士、美国科学院院士、中科院神经科学研究所所长、脑智卓越中心主任蒲慕明说。 /p p 　　白春礼也相信，体细胞克隆猴的成功，以及未来基于体细胞克隆猴的疾病模型的创建，将有效缩短药物研发周期，提高药物研发成功率，使我国率先发展出基于非人灵长类疾病动物模型的全新医药研发产业链，有力推动我国新药创制与研发，助力“健康中国2030”目标实现。 /p p 　　 strong 伦理问题?不存在的! /strong /p p 　　两只小猴子目前正在实验室里健康活泼地生活着，但人们的疑问也随之而来：克隆猴出来了，克隆人还会远吗? /p p 　　对于这个公众高度关切的问题，蒲慕明明确表示，中科院做这项工作的目的，不是为了克隆人，而是为了提高人类健康、研究脑科学基本问题服务的。 /p p 　　相反，这项工作还可能使一些伦理争议得到化解。 /p p 　　目前，中国每年出口数万只猕猴，主要用于药物筛选。在蒲慕明看来，这么大批量的动物实验，在伦理方面是有问题的。“我们做这项工作，就是要解决这一伦理问题。” /p p 　　有了体细胞克隆猴技术，人们就能使用体细胞在体外有效地做基因编辑，准确地筛选基因型相同的体细胞，产生基因型完全相同的大批胚胎，用母猴载体怀孕出生一批基因编辑和遗传背景相同的猴群。 /p p 　　也就是说，中科院神经科学研究所的这项技术，让人们在一年内就能制备大批遗传背景相同的模型猴，大大减少了个体差异对实验的干扰。这样，只要使用很少数量的克隆猴，就能够完成很有效的筛选。 /p p 　　“任何科学发现都是双刃剑，既有可能带来巨大的进步，也有可能造成一系列危机，核能、基因编辑都是典型的例子。”在蒲慕明看来，生命科学的伦理问题不仅仅是科学家需要注意的，更需要政府部门以及整个社会大众共同参与，通过立规、立法等方式，来约束人们的行为，做出正确的决策。 /p p 　　“对新技术，我们要重视，但不要害怕。”他最后补充说。 /p

“学科交叉点往往就是科学新的生长点、新的科学前沿，这里最有可能产生重大的科学突破，使科学发生革命性的变化。同时，交叉科学是综合性、跨学科的产物，因而有利于解决人类面临的重大复杂科学问题、社会问题和全球性问题。”--中国科学院院刊 细胞外囊泡（EVs）作为递送载体，已被广泛应用于生化工程学、生物医学工程学、纳米材料学、分子影像学等交叉学科中。通过交叉学科的火花碰撞，利用前沿新技术，提高疾病治疗效果，造福广大病患。本文与您分享EV递送纳米抗氧化剂等应用案例，拓展您的课题研究思路。巨噬细胞EV参与“免疫调控-化学动力-乏氧激活 ”多级联动 2022年3月，深圳市第二人民医院李维平团队联合中国科学院大学化学工程学院魏炜团队共同发表题为“Exploration and functionalization of M1-macrophage extracellular vesicles for effective accumulation in glioblastoma and strong synergistic therapeutic effects”于《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊（IF：18.19）。 被称为“终结者”的胶质母细胞瘤（GBM）是颅内神经系统最常见的恶性肿瘤。临床治疗GBM以外科手术为主，辅助放化疗，但效果收效甚微。难以穿透的血脑屏障 （BBB） 阻止药物进入中枢神经系统，使得治疗难度雪上加霜。因此，亟需更为有效的药物递送策略。 研究人员利用M1型巨噬细胞来源细胞外囊泡（M1EVs），使其膜被两种疏水剂功能化：化学激发源CPPO（C）和光敏剂Ce6（C），并装载亲水缺氧激活原药AQ4N（A），构成的CCA-M1EVs可穿过BBB，并可趋化富集在GBM部位，通过调控巨噬细胞表型实现GBM微环境免疫调控，增加过氧化氢（H2O2）水平。H2O2和CPPO之间可进行反应，产生的化学能量进一步激活Ce6，产生大量活性氧，实现化学激发的光动力疗法（CDT）。由于该反应消耗氧气，肿瘤缺氧的加剧也导致无毒的 AQ4N 转化为有毒的 AQ4 用于化疗。因此，CCA-M1EVs在GBM中实现了免疫调控-化学动力-乏氧激活的多级联动协同作用，发挥了强大的治疗效果。 研究人员利用全自动Digital Western检测M1巨噬细胞和M1EV中CD9、CD81、ALIX、TSG101、iNOS、F4/80和GAPDH的蛋白水平（如上图b所示）。EV递送纳米抗氧化剂 2021年来自中科院过程所魏炜团队，联合上海交大医学院附属同仁医院等多家单位，共同发表题为“In situ growth of nano-antioxidants on cellular vesicles for efficient reactive oxygen species elimination in acute inflammatory diseases”于《Nano Today》期刊（IF：20.72）。 临床上常见的急性炎症疾病，有急性肠炎和急性肝损伤等等。病情严重的患者，会出现脏器功能紊乱甚至器官衰竭。急性炎症过程中，会产生大量的活性氧自由基（ROS）。ROS会引起细胞膜脂质过氧化，导致细胞膜通透性改变和进一步DNA损伤，进而引起器官功能障碍。ROS大量产生是体内炎症发生发展过程中的一个重要环节，因此需要高效手段，将药物富集在炎症部位，然后消灭ROS。 纳米抗氧化剂，例如氧化铈、氧化钼和氧化锰，可借助其催化活性清除ROS，以此减少ROS引发的组织损伤，并控制疾病进展。然而，这些纳米抗氧化剂在炎症组织中的蓄积量较低。研究人员利用红细胞囊泡递送纳米抗氧化剂，效果显著。该项研究的另一亮点是研究人员将具有组织修复功能的干细胞外泌体融合（ReMeV），并在此基础上原位生长氧化铈（shi）纳米晶体（Ce-ReMeV），用于重症急性肠炎和急性肝损伤的治疗，在有效清除ROS同时，还能修复受损组织和器官，在小鼠模型上取得了满意的效果。 研究人员利用全自动Digital Western检测外泌体 Marker（CD9）、外泌体和红细胞Marker（TSG101、HSP70）以及MSC生长因子（HGF）（如上图c所示）。每个样品仅需3μL。全自动Digital Western，为何备受大家的喜爱？ 传统Western Blot（WB）属于劳动密集型技术，时间长、步骤冗长、人为操作引入过多误差，最终导致数据质量低......最重要的是实在太影响心情！图片取材于网络 全自动Digital Western技术平台的横空出世，一扫传统Western带给广大科研工作者的阴霾，每一天都是做WB的良辰吉日，让您从此享受WB！节省出大量宝贵时间去专注于阅读、思考、交流、仰望天空、参与社团、思考人性、（校园恋爱）等更有价值的事务。全自动Digital Western检测全流程（上样后，剩下的一切都交给她，一顿晚饭的功夫拿到结果） 全自动数字式Western，带给您的仅仅是3 μL超微量的上样量？3小时出结果？全程自动化标准化？更重要的是真正数字化的高质量数据和全膜结果，让您的数据不被质疑！撤稿？不存在的！扫码索取全自动Digital Western产品资料解放双手，从此爱上WB，告别实验Emo！

2021年6月10日，北京大学医学部精准医疗多组学研究中心黄超兰团队，与中国科学院生物物理研究所薛愿超团队、广东省第二人民医院孙青原团队，合作在Nature Cell Biology上发表了题为“Global profiling of RNA-binding protein targetsites by LACE-seq”的论文，该研究开发了可在微量细胞中鉴定RNA结合蛋白(RNA-binding protein, RBP)作用靶点的新技术LACE-seq(Linear amplificationof cDNA ends and sequencing)。通过线性扩增逆转录酶在RBP结合位点处的终止信号，首次实现了在单碱基分辨率和单细胞层面精准鉴定RBP的结合位点，为研究 RBP在胚胎发育和生殖疾病中的功能机制打开了大门。　　在本研究中，黄超兰团队使用原创新颖的微量样品蛋白质组学技术对Ago2-/-卵母细胞和空白对照细胞进行蛋白质组学分析，共鉴定到2715个蛋白，其中与Ago2结合的蛋白数量为1155个。与对照组相比，在Ago2-/-卵母细胞中出现特异性上调和下调的蛋白数量分别为170和80个。根据endo-siRNA密度将蛋白分为两组后的分析结果显示，Ago2-/-卵母细胞中endo-siRNA密度与蛋白质水平变化呈正相关趋势。此外，黄超兰团队还根据LTR序列逆转录建立了新的数据库进行de novo分析，结果表明在Ago2-/-卵母细胞中可检测到的LTR衍生且上调的嵌合蛋白比例为17.6%。蛋白组学分析结果证实了嵌合蛋白的存在，并进一步说明Ago2-endo-siRNA介导的翻译调控广泛存在于小鼠卵母细胞中。　　此前，黄超兰团队与浙江大学方群团队合作在单细胞蛋白组学分析研究领域取得突破性进展，成果于2018年发表在AnalyticalChemistry上[1]。目前基于质谱的“单细胞”和“极微量样品”蛋白质组学技术已上升到皮升级gOAD chip (3.0), 连续在2019和2020年的国际权威会议上被认可为单一体细胞中鉴定最高蛋白量的最灵敏方法。多组学中心在黄超兰教授的带领下，将继续深耕前沿技术方法开发，为推动基础生物学和临床领域的创新研究提供最有质量保证的蛋白质组和质谱技术手段。　　北京大学医学部精准医疗多组学研究中心主任黄超兰教授，中国科学院生物物理研究所薛愿超研究员，广东省第二人民医院孙青原教授为本文的共同通讯作者 中科院生物物理所博士研究生苏瑞宝、生物物理所副研究员曹唱唱、动物所博士研究生樊立华为本文的共同一作。

最近，英国苏格兰圣安德鲁大学一个研究小组开发出一种新奇的方法，把一种微小的共振器放入人体活细胞内，一经照射就会发出荧光。研究人员指出，这一技术在细胞传感、医疗成像等领域有着广泛应用。相关论文发表在最近出版的《纳米快报》上。　　据物理学家组织网7月24日(北京时间)报道，研究小组多年来一直在探索以单细胞为基础的激光，希望在活组织内造出会发荧光的细胞，以便在这些细胞工作时跟踪它们，深入揭示身体内部机制，比如癌症是如何开始的。　　以往他们所用的光学共振器都比细胞要大，而新研究所用的共振器非常小，能放在细胞内。科学家曾把水母细胞中的绿色荧光蛋白引入到人类细胞中，然后用共振腔增强发光。新研究是对这一研究的扩展。　　研究人员诱导细胞“吞下”一种“回音廊式”的共振器，在细胞内部形成一个微小的泡泡——当用一束激光照射时，光会在泡泡内部反射而增强，共振器内的荧光染料就会发光。发出的光波长不同，其颜色取决于泡泡的大小和折射率，就像一个微小的植入式激光器。　　通过这种技术处理可以修改大量细胞。由于细胞发光可以持续一个较长的周期(几天或几周)，可以在较长时间里识别和跟踪活组织内的细胞，有望为研究人员提供一种很有潜力的手段，执行细胞内传感，自适应成像，还可能真正看到肿瘤细胞的生长过程。　　研究人员指出，目前这一技术还只用在实验室培养的活细胞中，但他们希望进一步研究能带来用于动物实验的细胞跟踪系统，并最终用于人类。

日前，中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞研究中心在基于微流控的单细胞拉曼流式分选技术研究中取得新进展，相关成果于2月5日在线发表在Analytical Chemistry (Zhang PR, et al, Anal Chem, 2015)。 　　单细胞拉曼分选(RACS)是一种极具潜力的活体细胞功能分选技术。与目前通用的荧光激活细胞分选(FACS)相比，RACS具有直接基于细胞功能分选、无需标记、不需预知生物标识物的关键优势，因此在海洋资源挖掘、生物能源种质筛选、肿瘤监测与分选、环境微生物监控、农业生态研究等诸多领域具有广阔应用前景。但由于细胞固有拉曼信号弱所导致的细胞分选通量低这一问题限制了其应用与推广。开发高速流动细胞拉曼信号的快速采集和识别已经成为发展高通量拉曼流式细胞分选的关键技术挑战之一。 　　由研究员徐健和马波领导的研究团队针对上述瓶颈开发了一种基于阵列介电单细胞捕获/释放的快速拉曼识别技术。通过对高速流动单细胞的介电操控，实现了单细胞流在电极上的捕获/释放，并在细胞捕获期间(毫秒-秒)完成拉曼信号的采集识别(下图A)。通过耦合该团队同期建立的基于电磁阀吸吮的微流控细胞分离技术(Zhang Q, et al., Lab on a Chip 2014, Cover page, 2014 HOT Articles 下图B)，实现了产色素工程酵母和普通酵母细胞的拉曼流式分选。前述工作首次建立起基于介电单细胞捕获/释放的单细胞拉曼流式分选原理和装置，为下一步发展高通量拉曼流式细胞分选仪器奠定了原理和关键技术基础。 　　单细胞中心前期建立的单细胞弹射分选方法(Wang Y, et al, Anal Chem, 2013)适用于贴壁生长的细胞、微生物生物膜等固相细胞的分选。而该研究开发的单细胞流式分选方法针对于流动相细胞的分选。这两种方法学的建立和相互结合，为研制广谱性适用于自然界各种细胞存在状态的单细胞拉曼分选装备提供了可行性。 　　该研究得到了科技部创新方法专项、国家自然科学基金面上项目、微进化重大研究计划及中科院重点部署方向项目等的支持。 　　原文链接： 　　1. Raman-activated Cell Sorting based on dielectrophoretic single-cell trap and release, Anal. Chem., 2015, doi: 10.1021/ac503974e. 　　2. On-demand control of microfluidic flow via capillary-tuned solenoid microvalve suction. Lab Chip, 2014 Dec 21 14(24):4599-603. doi: 10.1039/c4lc00833. 　　3. Raman activated cell ejection for isolation of single cells, Anal. Chem., 2013. doi: 10.1021/ac403107p. 　　 　　(A)基于阵列介电单细胞捕获/释放单细胞拉曼分选示意图 (B)基于电磁阀吸吮的微流控细胞分离技术(Cover Article)。

html, body { -webkit-user-select: text } * { padding: 0 margin: 0 } .web-box { width: 100% text-align: center } .wenshang { margin: 0 auto width: 80% text-align: center padding: 20px 10px 0 10px } .wenshang h2 { display: block color: #900 text-align: center padding-bottom: 10px border-bottom: 1px dashed #ccc font-size: 16px } .site a { text-decoration: none } .content-box { text-align: left margin: 0 auto width: 80% margin-top: 25px text-indent: 2em font-size: 14px line-height: 25px } .biaoge { margin: 0 auto /* width: 643px */ width: 100% margin-top: 25px } .table_content { border-top: 1px solid #e0e0e0 border-left: 1px solid #e0e0e0 font-family: Arial /* width: 643px */ width: 100% margin-top: 10px margin-left: 15px } .table_content tr td { line-height: 29px } .table_content .bg { background-color: #f6f6f6 } .table_content tr td { border-right: 1px solid #e0e0e0 border-bottom: 1px solid #e0e0e0 } .table-left { text-align: left padding-left: 20px } 基本信息 关键内容： 流式细胞仪,单细胞分析仪 开标时间： 2021-08-06 09:30 采购金额： 350.00万元 采购单位： 上海市第六人民医院 采购联系人： 姜瑞瑶 采购联系方式： 立即查看 招标代理机构： 上海东松医疗科技股份有限公司 代理联系人： 陈雅敏 代理联系方式： 立即查看 详细信息 智能化流式细胞分选仪国际招标公告(1) 上海市-黄浦区 状态：公告 更新时间：2021-07-17 招标文件: 附件1 上海东松医疗科技股份有限公司受招标人委托对下列产品及服务进行国际公开竞争性招标，于2021-07-16在中国国际招标网公告。本次招标采用传统招标方式，现邀请合格投标人参加投标。1、招标条件项目概况:智能化流式细胞分选仪壹套（项目预算：人民币350万元，可以采购进口产品）资金到位或资金来源落实情况:已落实项目已具备招标条件的说明:已具备2、招标内容招标项目编号:0811-214DSITC1544招标项目名称:智能化流式细胞分选仪项目实施地点:中国上海市招标产品列表(主要设备):3、投标人资格要求投标人应具备的资格或业绩:（1）投标人具有合法经营资质的独立法人、其他组织；（2）投标人未被“信用中国”网站（www.creditchina.gov.cn）、中国政府采购网（www.ccgp.gov.cn）列入失信被执行人、重大税收违法案件当事人名单、政府采购严重违法失信行为记录名单；（3）投标人参加政府采购活动前三年内，在经营活动中没有重大违法记录； （4）投标人是专业生产本次所需设备的制造商，或由制造商指定一个代理商作为本次投标的唯一授权代理；（5）投标人提供的投标机型应是原产地的全新产品；（6）投标人提供的投标机型应在中国国内有装机用户。是否接受联合体投标:不接受未领购招标文件是否可以参加投标:不可以4、招标文件的获取招标文件领购开始时间:2021-07-16招标文件领购结束时间:2021-07-23是否在线售卖标书:否获取招标文件方式:现场领购招标文件领购地点：关注微信公众号“东松投标”，完成信息注册，即可购买招标文件。招标文件售价:￥700/$1005、投标文件的递交投标截止时间（开标时间）:2021-08-06 09:30投标文件送达地点:中国上海市宁波路1号申华金融大厦10楼会议室开标地点:中国上海市宁波路1号申华金融大厦10楼会议室6、投标人在投标前应在____（）或机电产品招标投标电子交易平台（）完成注册及信息核验。评标结果将在____和中国国际招标网公示。7、联系方式招标人:上海市第六人民医院地址:中国上海市宜山路600号联系人:姜瑞瑶联系方式:021-64369998招标代理机构:上海东松医疗科技股份有限公司地址:中国上海市宁波路1号申华金融大厦11楼联系人:陈雅敏、朱佳莹联系方式:021-63230480转8603、86248、汇款方式:招标代理机构开户银行(人民币):浦发银行黄浦支行招标代理机构开户银行(美元):账号(人民币):0763634292323474账号(美元): 附件1： × 扫码打开掌上仪信通App 查看联系方式 $('.clickModel').click(function () { $('.modelDiv').show() }) $('.closeModel').click(function () { $('.modelDiv').hide() }) 基本信息 关键内容：流式细胞仪,单细胞分析仪 开标时间：2021-08-06 09:30 预算金额：350.00万元 采购单位：上海市第六人民医院 采购联系人：点击查看 采购联系方式：点击查看 招标代理机构：上海东松医疗科技股份有限公司 代理联系人：点击查看 代理联系方式：点击查看 详细信息 智能化流式细胞分选仪国际招标公告(1) 上海市-黄浦区 状态：公告 更新时间： 2021-07-17 招标文件: 附件1 上海东松医疗科技股份有限公司受招标人委托对下列产品及服务进行国际公开竞争性招标，于2021-07-16在中国国际招标网公告。本次招标采用传统招标方式，现邀请合格投标人参加投标。1、招标条件项目概况:智能化流式细胞分选仪壹套（项目预算：人民币350万元，可以采购进口产品）资金到位或资金来源落实情况:已落实项目已具备招标条件的说明:已具备2、招标内容招标项目编号:0811-214DSITC1544招标项目名称:智能化流式细胞分选仪项目实施地点:中国上海市招标产品列表(主要设备):3、投标人资格要求投标人应具备的资格或业绩:（1）投标人具有合法经营资质的独立法人、其他组织；（2）投标人未被“信用中国”网站（www.creditchina.gov.cn）、中国政府采购网（www.ccgp.gov.cn）列入失信被执行人、重大税收违法案件当事人名单、政府采购严重违法失信行为记录名单；（3）投标人参加政府采购活动前三年内，在经营活动中没有重大违法记录； （4）投标人是专业生产本次所需设备的制造商，或由制造商指定一个代理商作为本次投标的唯一授权代理；（5）投标人提供的投标机型应是原产地的全新产品；（6）投标人提供的投标机型应在中国国内有装机用户。是否接受联合体投标:不接受未领购招标文件是否可以参加投标:不可以4、招标文件的获取招标文件领购开始时间:2021-07-16招标文件领购结束时间:2021-07-23是否在线售卖标书:否获取招标文件方式:现场领购招标文件领购地点：关注微信公众号“东松投标”，完成信息注册，即可购买招标文件。招标文件售价:￥700/$1005、投标文件的递交投标截止时间（开标时间）:2021-08-06 09:30投标文件送达地点:中国上海市宁波路1号申华金融大厦10楼会议室开标地点:中国上海市宁波路1号申华金融大厦10楼会议室6、投标人在投标前应在____（）或机电产品招标投标电子交易平台（）完成注册及信息核验。评标结果将在____和中国国际招标网公示。7、联系方式招标人:上海市第六人民医院地址:中国上海市宜山路600号联系人:姜瑞瑶联系方式:021-64369998招标代理机构:上海东松医疗科技股份有限公司地址:中国上海市宁波路1号申华金融大厦11楼联系人:陈雅敏、朱佳莹联系方式:021-63230480转8603、86248、汇款方式:招标代理机构开户银行(人民币):浦发银行黄浦支行招标代理机构开户银行(美元):账号(人民币):0763634292323474账号(美元): 附件1：

摘要：线粒体和复杂的内膜系统是真核细胞的重要特征。到目前为止，对活细胞内的细胞器进行操纵仍然十分困难。多功能单细胞显微操作FluidFM技术能够从活细胞中提取、注射细胞器，将定量的线粒体移植到细胞中，同时保持它们的活力。近期，Julia A. Vorholt课题组使用多功能单细胞显微操作FluidFM技术，将线粒体移植至培养的细胞中，并实时跟踪线粒体注射后的情况，监测它们在新宿主细胞中的命运。通过跟踪，作者发现与受体细胞线粒体网络融合发生在移植后20分钟，持续16小时以上。活细胞之间移植线粒体不仅为细胞器生理学的研究开辟了新的前景，也为机械生物学、合成生物学和疾病治疗开辟了新的前景。该篇文章以” Mitochondria transplantation between living cells.”为题，发表在BioRxiv.上。 结果：1. 从活细胞中提取线粒体为了检测FluidFM探针对单细胞细胞器采样的能力。作者使用了两种探针，分别是锥型探针(A=1.2 um2)和圆柱型探针(A=1.6 um2)(图1B)。实验结果表明，使用这两种探针都可以对线粒体及单个线粒体进行提取或大量抽提。作者对内质网（ER）和线粒体提取后的细胞活力进行了检测，发现细胞仍保持较高的细胞活力 (95%)。为了进一步确保FluidFM提取方案在探针插入时不会破坏细胞质膜，作者使用荧光探针(mito-R-GECO1)监测细胞培养基中可能发生的Ca2+内流。实验显示，在操作过程中和操作后都没有Ca2+流入，表明细胞器提取过程中细胞质膜的完整性。本研究还发现暴露在FluidFM负压下的线粒体小体会经历形状的转变，类似于“串上珍珠”的形态。 其特征是离散的线粒体基质球体状，并且通过细长的膜结构相互连接，在进一步负压拉力的作用下，这些球状结构终被拉断，并在悬臂中呈现为球状线粒体(图2E)。进一步探究显示，施加FluidFM负压后，力诱导的形状转变沿线粒体小管在毫秒到秒的范围内传播了数十微米。形状转变沿这一方向均匀传播，而外层线粒体膜(OMM)保持了初的完整性。当牵引力保持数秒后，OMM在先前形成的“珍珠”之间的一个或多个收缩点分离，从而产生立的球形线粒体，而管状结构的其余部分放松并恢复。结合线粒体牵引实验和线粒体定位的钙流实验，结果证明线粒体的串上珍珠表型的形状转变以及随后细胞质内的线粒体裂变是不依赖钙的。 图1：(A) 示意图：使用FluidFM技术进行细胞器提取。通过调整悬臂探针中的负压(-Δp)进行提取。(B) 通过调节孔径大小和流体作用力的适用范围，选择性地提取不同的细胞器成分。1行：用悬梁臂探针提取单细胞细胞器的示意图。2行：不同孔径的悬臂扫描电镜图。3行：FluidFM悬臂探针孔径与对应的流体力范围。(C) 示意图：使用FluidFM技术进行细胞器注射。通过调整悬臂探针中的正压(+Δp)进行将探针中的细胞器注射到受体细胞内。 图2：(A) FluidFM悬臂探针的扫描电子显微镜图像。具体尺寸参数是：L = 200 μm, W = 35 μm, H = 1 μm。Scale bar= 5 μm。(B) 提取线粒体后的FluidFM悬臂的荧光显微镜图像。由于折射率不同，可以看到提取物和悬臂探针填充物之间的边界。Scale bar = 10 μm。(C) 是图(B)的示意图，提取物的体积是1170 fL。(D- F) 活细胞器提取的延时图像和提取后金字塔悬臂图像。黄框表示细胞内的悬臂的位置。(D) 对表达su9-BFP(线粒体)和Sec61-GFP (ER) 的U2OS细胞进行提取。箭头表示ER区域。使用孔径为0.5µm2的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。(E) 从表达su9-BFP的U2OS细胞中提取单个线粒体。使用1µm2孔径的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。(F) 从表达su9-BFP的U2OS细胞中提取数个线粒体。使用1µm2孔径的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。 2. 线粒体移植至新细胞研究人员的下一个目标是将线粒体移植到新的宿主细胞中，并保持细胞活性。FluidFM技术为线粒体转移提供了两种可能性方案：方案一、用FluidFM技术直接提取线粒体而后注入到新的宿主细胞中；方案二、将从细胞中分离纯化的线粒体回充入FluidFM探针，然后注射(图3A-D)。作者比较了两种方法，为了实现可视化的线粒体的转移，作者在供体和受体细胞中分别对线粒体进行了差异化标记 (图3E-F 供体细胞线粒体su9-mCherry和受体细胞线粒体su9-BFP)。当使用FluidFM直接将线粒体从一个细胞移植到另一个细胞时，成功率高达95%，而且保持了细胞活力(图3G, 41个移植细胞中有39个)。在注射纯化线粒体后，作者观察到46%的样本(19/41)发生了线粒体转移且保持了细胞活力(图3G)。移植的定量结果显示，这些实验中移植的线粒体数量从3到15个线粒体每个细胞不等(图3H)。两种替代方案的不同成功率可以由线粒体分离获取的条件差异来解释。在评估线粒体提取方案时，作者观察到部分提取的线粒体外膜发生破裂。线粒体的不可逆损伤导致细胞内降解，细胞色素C释放可能导致细胞凋亡。虽然线粒体的细胞间移植降低了通量，但它的优点是细胞外时间短(如上所述，细胞间移植即方案一的效率高，并可以直接观察单个移植线粒体的命运。为了展示这一点，作者将标记好的线粒体(su9-mCherry)从HeLa细胞移植到差异标记的U2OS细胞(su9-BFP)中，这种细胞通常用于研究动态线粒体行为。高灵敏度相机可以用于追踪受体细胞内的单个线粒体(图3L)。作者观察到荧光线粒体基质标签在移植后23分钟的发生初始融合而后扩展到线粒体网络。综上所述，作者建立了两种将线粒体转移到单个培养细胞的方法。 一种方法是活细胞间移植。该方案显示移植后细胞活力高，允许观察移植后线粒体的动态行为，是一种高效方案。二种方法是大量纯化线粒体并将其注射到受体细胞中。 注射速度相当快，但不可避免地损害线粒体和细胞功能。图3：(A) 方案一示意图（活细胞间线粒体移植）：通过FluidFM吸入法提取线粒体。 随后，将带有提取物的悬臂探针移至受体细胞插入并注入提取物。(B) 方案一预填充C8F18的FluidFM悬臂梁的图像，被移植线粒体通过su9-mCherry标记，提取量~0.8 pL。Scale bar = 10 μm。(C) 方案二示意图（纯化线粒体注入细胞）：使用标准线粒体纯化方案纯化的线粒体进行线粒体移植的方案。 将纯化的线粒体重悬在HEPES-2缓冲液中，直接填充到FluidFM探针中并对细胞进行注射。(D) 方案二由su9-mCherry标记的FluidFM悬臂充满线粒体的图像。Scale bar = 10 μm。(E) 通过方案一（活细胞间线粒体移植）进行线粒体移植后的宿主细胞图像。宿主细胞的线粒体通过su9-BFP标记，移植细胞线粒体通过su9-mCherry标记。Scale bar = 10 μm。(F) 通过方案二（纯化线粒体注入细胞）进行线粒体移植后的受体细胞图像。宿主细胞的线粒体通过su9-BFP标记，移植细胞线粒体通过su9-mCherry标记。Scale bar = 10 μm。(G) 通过光学成像对两种方案注射的细胞进行评估。每种方法评估了40个细胞。(H) 两种方案的线粒体的计数评估。每种方法评估了22个细胞。(I) 方案一移植线粒体后，对移植线粒体(su9-mCherry)和宿主线粒体网络(su9-BFP)使用不同的荧光标记进行成像，融合。Scale bar = 5μm。(J) 方案二注入纯化线粒体后移的融合状态，标记方案同(I)。Scale bar = 5 μm。(K) 移植线粒体发生降解，分裂成多个更小的荧光囊泡(su9-mCherry)，荧光与标记的宿主细胞线粒体网络(su9-BFP)没有重叠。Scale bar=5 μm。 (L) 单个移植线粒体的延时图像序列(su9-mCherry)。细胞器供体为HeLa细胞，受体细胞为U2OS细胞，带有荧光标记线粒体网络(su9-BFP)。Scale bar = 10 μm。 讨论单细胞的操纵一直是细胞生物学领域的热点和难点，尤其是在不损害细胞活力的情况下从细胞中提取细胞器或将外源物质直接导入到细胞中。截止到目前，尽管单细胞技术有了较大的发展，但要实现将细胞器从一个细胞移植到另一个细胞，除了更大的卵母细胞外，几乎是不可能实现的。线粒体是细胞中的能量转换的核心，与细胞代谢和信号通路以及细胞命运紧密联系在一起。线粒体含有自身的遗传成分(mtDNA)，通常是严格垂直遗传给子细胞的。目前将线粒体地转移到细胞的手段有限，对于线粒体移植后的剂量-反应关系分析更是十分困难，这样我们就很难从机制上了解健康或疾病细胞的线粒体移植后的生物学效应。本文使用的FluidFM技术采用微型探针，可以在微环境中以高时空分辨率操纵单细胞或者对单个细胞进行采样，并与组学方法相结合，使细胞器的研究成为可能。FluidFM技术将原子力显微镜的高精度力学调节手段与光学检测下的纳米尺度微流控系统相结合，提供与单细胞操作相关的力学和定量的体积控制。这些特性在现有微型探针中是的，在本研究中，作者将FluidFM单细胞技术用于活细胞真核内和细胞间的细胞器微操作。成功实现了活细胞之间的线粒体移植。该研究将启发人们将FluidFM技术应用于更多领域，例如，干细胞治疗中低代谢活性细胞的再生，作为线粒体替代治疗方法的一种备选方案等。此外，FluidFM技术为解决细胞生物学、生物力学和细胞工程等问题提供了新的视角。 多功能单细胞显微操作系统- FluidFM OMNIUM参考文献[1].C. Gäbelein, Q. Feng, E. Sarajlic, T. Zambelli, O. Guillaume-Gentil, B. Kornmann & J. Vorholt. Mitochondria transplantation between living cells. (2021). BioRxiv.

遗传性平滑肌瘤和肾细胞癌（HLRCC associated RCC）是常染色体显性遗传肾癌，由延胡索酸酶基因FH的胚系或体系突变、缺失以及甲基化失活导致。与其他常见的肾细胞肿瘤相比，HLRCC associated RCC具有Ⅱ型乳头状肾癌特点，也会偶发集合管癌和透明细胞癌等。该型肿瘤常表现为单侧或单病灶，呈囊性，或囊性实性混合生长，且侵袭性远强于其他肾细胞癌，在肾原发病灶较小且局限时（1.5厘米），也可能出现淋巴结转移或远处转移，转移部位常见于肺，预后极差。由于FH-缺陷患者队列研究的不足，迄今缺乏有效药物和标准治疗方案。临床诊断主要通过基因测序或组织病理学或医学影像分析进行术前诊断，但疾病的复杂性和多样性使得早期诊断较为困难，因此对于该疾病的诊断新方法亟待探索。2023年4月13日，上海交通大学医学院附属儿童医学中心郑亮团队和仁济医院张进，徐云则团队合作，在Journal of Clinical Investigation（影响因子IF=19.477）在线发表题为Circulating succinate-modifying metabolites accurately classify and reflect the status of fumarate hydratase-deficient renal cell carcinoma的研究论文。 研究团队在多年研究基础上，组建了全国范围的多中心延胡索酸酶基因突变携带者队列，阐明了基因延胡索酸酶失活突变在肿瘤与携带者中的代谢异常机制。揭示血液小分子suc-cys和suc-ado可以准确诊断延胡索酸酶的胚系或体系突变，其AUCROC=0.97，为临床上遗传性平滑肌瘤和肾细胞癌的诊断提供了新的视角。 △HLRCC-associated患者I/II期和III/IV期的Kaplan-Meier总生存期分析（点击查看大图）研究队列由来自 16 个中心的 252 名参与者组成：其中FH 缺陷 (FH-MT) RCC 患者77例，临床分型为I、II、III 和 IV 期；77例FH-MT患者中70例携带种系突变，7例为散发性突变，涉及错义、无义、移码和大规模缺失。在所有 FH-MT 患者中，47 名有家族史。FH-野生型 (FH-WT) RCC (n=88) 患者是新招募的，包括各种亚型的患者。以及新招募的无肿瘤 (NC) 个体的正常对照和 9 岁和性别匹配。我们首先对 77 名 FH-MT RCC 患者进行了 Kaplan-Meier 生存分析，显示 I/II 期患者的平均生存期明显长于 III/IV 期患者（P = 0.007），表明早期诊断具有明显的生存获益。△HLRCC-associate病人血浆的组学分析（点击查看大图） 本研究共使用了 n = 268 份血浆样本。来自 10 名 FH-MT RCC 患者、10 名 FH-WT RCC 患者和 10 名 NC 个体的样本 (n = 30) 被选为发现集。单独的验证集 (n = 238) 包含 67 个 FH-MT 样本、78 个 FH-WT 样本和 77 个 NC 样本。主成分分析结果表明，肿瘤中 FH 遗传状态和疾病阶段的血浆代谢物的潜在聚类，来自 ROCAUC 分析的前 20 种代谢物使 FH-MT 样品与其他两组的样品清晰分离。涉及氨基酸代谢、脂类代谢、TCA循环及核苷酸代谢途径。其中 suc-cys、suc-ado、琥珀半胱氨酸-甘氨酸 (suc-cys-gly) 和肌酸核苷水平具有很强的相关性，并且似乎是肿瘤负荷的最佳预测因子，被确定为监测 FH 变异患者和肿瘤负担潜在生物标志物。△FH突变型和野生型PDX小鼠模型血浆生物标志物的关联（点击查看大图） 进一步采用移植患者来源的肿瘤异种移植物 (PDX)，以监测真正的人类肿瘤对血浆代谢物的影响，FH 突变型小鼠肿瘤的生长速度与野生型相当。在FH 缺陷型 PDX 的小鼠血浆中，检测到suc-ado、suc-cys 和 suc-cys-gly，并随时间推移，随着肿瘤生长成比例地增加。这些结果表明，suc-cys和suc-ado具有出色的反映肿瘤状态的敏感性。更重要的是，皮下肿瘤手术切除后一天血浆代谢物降至基础水平。△HLRCC-associated患者的临床诊断效能（点击查看大图） 为了验证发现集和小鼠临床前模型的结果，我们采用独立验证集进行了验证，其中包含来自 67例 FH突变型患者、FH野生型患者和 67个健康受试者的 238 个血浆样本。通过同位素标记的内标对 suc-ado 和 suc-cys 的血浆浓度进行了定量分析。结果表明，两种代谢物在 FH突变型病人血浆中均显着升高。 Suc-cys和suc-ado 可以显著区分健康受试者与FH突变型患者，ROCAUC = 0.983，suc-ado 的 ROCAUC = 0.930。以及突变型及野生型FH RCC（suc-cys: ROCAUC = 0.980 suc-ado: ROCAUC = 0.923）。提示所选择的Suc-cys和suc-ado，可作为常规筛选 FH 突变携带者，以及 RCC 患者分型的生物标志物。△HLRCC-associated诊断与代谢机制示意图（点击查看大图） 进一步的机制研究显示，在小鼠模型中，肿瘤微环境中肾脏组织的蛋白级联和协同作用导致肿瘤来源的多肽转化为小分子suc-cys和suc-ado。 本文总结 目前对于高转移性肾癌，除了在早期阶段的肿瘤切除外，尚无有效的治疗方法。作者筛选的suc-cys和suc-ado，可靠地反映了基因突变状态和肿瘤负荷，在早期诊断，转移复发和预后的效果都较好，填补了肾癌肿瘤代谢标志物的空白。研究团队的成果对于寻找适合快速诊断、筛查和监测的无创血浆生物标志物的探索，为出生基因缺陷型健康筛查和复发难治型肾癌的精准治疗带来新希望。 作者信息上海交通大学医学院附属儿童医学中心研究员郑亮为第一作者和通讯作者，上海仁济医院泌尿科张进教授为共同通讯作者，伍小宇为共同作者。文章中非靶向代谢组学，脂质组学，以及标志物定量使用Thermo Q Exactive Plus完成。