溴氯吲哚神经氨酸

南方医科大学研究团队发表相关论文，英文题目：GinsenosideRg1 mitigates morphine dependence via regulation of gut microbiota,tryptophan metabolism, and serotonergic system function。中文题目：人参皂苷Rg1通过调节肠道菌群、色氨酸代谢和血清素能系统功能减轻吗啡依赖研究背景吗啡依赖是一种毁灭性的神经精神疾病，可能与肠道菌群失调密切相关。人参皂苷Rg1(Rg1)是从人参根中提取的活性成分，对神经系统具有潜在的保健作用。然而，它在物质使用障碍中的作用仍不清楚。该文探索了Rg1在对抗吗啡依赖中的潜在调节作用。研究结果1.人参皂甙 Rg1 抑制吗啡诱导的小鼠的条件位置偏好（CPP）调理训练后各组小鼠体重略有增加，但是未观察到显著差异（图1C）。使用Smart3.0软件在15分钟内跟踪小鼠头部并记录它们的轨迹和停留时间。对照组和其他组之间的轨迹或CPP分数没有显着差异。在吗啡注射后在白室中花费的时间与基线相比以及在盐水处理后在白室中花费的时间显着增加（图1C，D），表明吗啡成功诱导CPP在实验小鼠中。MRH和MRL组与模型组相比，MRL和MRH小鼠在药物配对隔室的停留时间和轨迹显着减少。然而，在单独用人参皂甙Rg1治疗的小鼠中，没有观察到CPP评分和活动途径的变化。2.人参皂甙Rg1改善CPP小鼠肠道菌群失调阿片类药物成瘾通常与肠道菌群失调有关。为了进一步探索Rg1介导的抗成瘾机制，对粪便进行了16S rRNA 基因扩增子测序，以评估有或没有Rg1处理的CPP小鼠肠道微生物群的组成。维恩图显示了对照组和其他组小鼠共有476个OTU（图2A）。然而，对照组有1108个OTU，M组有1304个，MM组有19个，MRL组有548个，MRH组有1702个，CR组有195个。这些数据暗示了吗啡治疗诱导的肠道微生物群紊乱和人参皂苷Rg1给药后的部分恢复。值得注意的是，使用Chao1指数进行的α多样性分析显示，Rg1阻止了吗啡引起的细菌丰富度下降（图2B）；然而，各组之间的香农指数没有差异（图2C）。通过Bray-Curtis主坐标分析(PCoA)研究肠道菌群的整体结构表明，吗啡组的细菌组成发生了变化，与对照组不同，表明肠道菌群失调吗啡处理诱导了微生物群（图2D）。然而，MRL、MRH、MM和CR组显示了四种不同的细菌组成簇。值得注意的是，MRL中的微生物群与MRH组中的微生物群更紧密地聚集在一起。我们在门水平上进一步分析了每组的肠道细菌组成。人参皂甙Rg1显着增加吗啡诱导的拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度的降低（图2E），并显着降低吗啡诱导的蓝藻和变形杆菌的相对丰度增加。在家族水平上的进一步分析显示，吗啡处理导致随着叶绿体和线粒体的增加，拟杆菌属、Sutterellaceae和Tannerellaceae的相对丰度急剧下降。在MRL和MRH组中，吗啡诱导的丰度变化不同程度地逆转（图2F，G）。此外，Kruskal-WallisH检验用于评估指定组之间在物种水平上的差异的显着性，并观察到15个优势物种（图2H）。考虑到报告显示吗啡依赖模型中拟杆菌属的丰度低于对照，我们专注于拟杆菌属物种B.vulgatus、B.xylanisolvens和B.acidifaciens。吗啡显着降低了B.acidifaciens、B.vulgatus和B.xylanisolvens 的丰度。值得注意的是，B.vulgatus的相对丰度在Rg1给药后显着增加（图2I）。除了16SrRNA 测序外，我们还用B.vulgatus特异性引物进行了定量PCR，证实吗啡显着降低了丰度，人参皂苷Rg1处理后丰度显着增加（图2J）。图片图片图23.人参皂甙 Rg1抑制肠道微生物群衍生的水平和CPP小鼠血清色氨酸代谢物在药物依赖期间，肠道代谢谱发生变化，宿主代谢途径可能发生改变。我们假设人参皂苷Rg1可能通过肠道微生物发酵过程中产生的代谢物影响CPP。基于这一理论，我们使用非靶向代谢组学来识别可能在小鼠血清和肠道中改变的关键代谢物和代谢途径。MRL组和MRH组对吗啡诱导的CPP的疗效没有观察到统计学差异；然而，行为分析数据显示，MRH组的疗效优于MRL组。因此，我们选择MRH组作为非靶向代谢组学分析的代表性药物干预组。在血清和粪便中分别鉴定出1955和559种代谢物。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型分别在血清和粪便中的CONTROL、MODEL和MRH组中显示出显着的聚类分离(图3A、G)。热图分析显示，CPP导致代谢物发生显着变化，小鼠粪便和血清中共有177种代谢物（96种上调和81种下调）和69种代谢物（44种上调和25种下调）分别显着改变（图3D和J)。此外，对代谢物途径的分析表明，与对照组相比，CPP小鼠的以下途径发生了显着变化：色氨酸、α-亚麻酸、甘油磷脂、精氨酸和脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代谢。值得注意的是，色氨酸代谢受到粪便和血清中吗啡的显着影响（图3B和H）。将MRH与MODEL组进行比较，在人参皂苷Rg1处理后，粪便和血清中的195种代谢物（94种上调和101种下调）和115种代谢物（60种上调和55种下调）分别显着改变（图3E和K）。代谢组学图显示色氨酸代谢受到Rg1补充的显着影响（图3C和I）。色氨酸代谢在微生物组-肠-脑轴中起关键作用。在这种情况下，我们专注于色氨酸代谢相关的代谢物。具体而言，色氨酸代谢相关代谢物的热图分析表明，参与色氨酸代谢的四种主要中间代谢物L-色氨酸、吲哚、N' -甲酰基犬尿氨酸和血清素是对吗啡的反应最显着增加的代谢物，它们的水平在Rg1处理后，粪便或血清中的含量降低。具体来说，我们发现与模型组相比，Rg1处理的肠道色氨酸和血浆血清素水平下调（图3F和L）。4.人参皂甙 Rg1 改善 CPP 小鼠海马 5-羟色胺能系统的变化血清色氨酸浓度会影响大脑的血清素系统。我们推测宿主色氨酸代谢物的变化可能与CPP小鼠的海马血清素能系统和其他神经递质有关。为了验证这一假设，使用酶联免疫吸附法检测海马和外周血清中谷氨酸、多巴胺、γ-GABA和5-HT的表达水平。在海马中，相对于对照组，CPP小鼠表现出显着升高的多巴胺水平和降低的γ-GABA水平（图4C）。然而，组间谷氨酸和血清素的浓度没有差异（图4A）。与M组相比，MRH组海马中GABA含量增加。此外，在MRL和MRH小鼠中观察到多巴胺水平显着下降。注射吗啡后血清中血清素和多巴胺水平升高，γ-GABA水平降低。所有CPP诱导的变化都被Rg1处理逆转（图4B、D、S2B）。为了进一步探索Rg1介导的抗成瘾机制，我们使用qPCR检测了小鼠海马中奖赏相关基因mRNA的相对转录水平，包括脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养酪氨酸激酶受体2型(TrkB)和血清素受体。与Rg1治疗组的转录水平相比，吗啡组中5-羟色胺受体（5-HTR1B和5-HTR2A）、BDNF和TrkB的转录水平因人参皂苷Rg1给药而下调（图4E、F）。这些数据表明人参皂甙Rg1可能通过抑制血清素系统来改善吗啡依赖。5.肠道微生物组的调控影响人参皂甙 Rg1 对吗啡诱导的小鼠 CPP 的抑制作用为了研究肠道菌群失调对吗啡诱导的小鼠行为的影响，我们在进行吗啡依赖性CPP训练之前，给BALB/cSPF 小鼠施用了不可吸收的抗菌剂或无菌水的混合物7天，然后进行CPP测试（图5A）。ATM治疗后各组小鼠体重下降，调理训练后略有增加；然而，各组之间没有观察到差异（图5B）。ABX与对照组相比，同时给予多种抗生素后，所有抗生素治疗小鼠在药箱中的停留时间均增加。此外，与ABX组相比，AM组在药物配对隔室中的停留时间明显增加。令人惊讶的是，小鼠在AMRL、AMRH和AMM组的药物配对隔室中的停留时间与AM组没有显着差异（图5D）。我们在鼠标头部轨迹中观察到相同的现象（图5C）。为了评估抗生素暴露后小鼠肠道微生物群发生的变化，通过16SrRNA 基因测序测定了粪便细菌组成。抗生素治疗极大地改变了微生物组并减少了细菌负荷（图5E）。为了研究肠道菌群失调对吗啡诱导的小鼠行为的影响，我们使用了维恩图显示了对照组和其他抗生素治疗小鼠共享的476个OTU；然而，1606个OTU是对照组独有的，48-68个OTU是其他六个抗生素治疗组独有的。随后用抗生素混合物治疗导致肠道微生物群显着消耗，细菌多样性显着降低。PCoA显示抗生素治疗的小鼠与对照小鼠相比具有显着不同的微生物群落（图5F）。但ABX、AM、AMRL、AMRH、AMM和AR组的细菌多样性没有显着变化，说明抗生素治疗根除大部分共生菌，吗啡和人参皂苷Rg1治疗后没有显着变化.我们在ABX小鼠的粪便中发现了几种细菌门，这些细菌门相对于对照组的粪便发生了改变（图5G）。优势门不同，伴随着Proteobacteria的丰度显着增加，而Verrucomicrobiota、Cyanobacteria、Firmicutes和Deferribacterota的丰度在抗生素处理后下降。然而，用抗生素治疗小鼠并没有改变拟杆菌的相对丰度，尽管抗生素治疗耗尽了肠道微生物组成。最后，我们用B.vulgatus特异性引物进行了定量PCR，并证实与对照组相比，抗生素治疗组的细菌显着减少了数百至数千倍（图5H）。此外，吗啡和人参皂甙Rg1并没有改变B.vulgatus对抗生素的反应。6.肠道微生物组的消耗影响色氨酸代谢并抑制 Rg1 诱导的基因表达接下来检测了抗生素混合物治疗对吗啡诱导的CPP小鼠代谢物和代谢途径的影响。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型显示，在粪便中的代谢物方面，对照组和ABX组之间的簇显着分离（图6A）。值得注意的是，抗生素治疗后ABX、AM和AMRH组之间没有明显的代谢物聚集。我们专注于色氨酸代谢途径，并观察到参与色氨酸代谢的代谢物被ATM显着改变。然而，在ABX、AM和AMRH中未观察到显着变化。因此，这些数据表明抗生素治疗强烈降低了粪便中色氨酸代谢物的水平（图6C），并且由吗啡和Rg1引起的代谢改变被消除。此外，在血清中，PLS-DA结果显示四组（对照组、ABX、AM和AMRH）的代谢物谱不同（图6B）。ATM显着改变了色氨酸代谢物。值得注意的是，与 ABX小鼠相比，注射吗啡的小鼠的代谢物发生了相当大的变化。具体而言，与 AM组相比，色氨酸代谢物在Rg1处理后没有显示出显着变化（图6D）。我们发现 Rg1治疗组和模型组在ABX治疗后肠道色氨酸和血浆血清素水平没有差异（图6E和F）。随后，我们发现微生物组消耗抵消了 Rg1在CPP小鼠海马体中诱导的变化（图6G-L）。Rg1治疗未能逆转5-HT、多巴胺、5-HTR1B/5-HTR2A 和BDNF-TrkB信号通路。7.B.vulgatus 协同增强人参皂苷 Rg1 抑制吗啡诱导的小鼠 CPP因为肠道B.vulgatus 减少和增加与吗啡诱导的CPP增加和Rg1降低CPP一致，并且在抗生素处理的小鼠中消除了人参皂苷Rg1对CPP的改善，我们探讨了B.vulgatus 是否在吗啡中起作用依赖。作为典型的拟杆菌属物种，普通拟杆菌是小鼠肠道中的主要细菌物种，我们试图确定普通拟杆菌是否会影响CPP进展。我们首先使用抗生素治疗来消耗肠道微生物群，然后再用B.vulgatus 定植。在吗啡诱导的CPP小鼠模型中检查B.vulgatus 对吗啡成瘾的影响（图7A）。抗生素治疗或B.vulgatus 移植没有显着改变体重（图7B）。单独使用B.vulgatus (AMBV) 进行灌胃显着降低了白框中的停留时间和轨迹百分比，而吗啡则增加了该百分比（图7C、7D）。值得注意的是，与B.vulgatus 和人参皂苷Rg1(AMBVR)共同治疗的小鼠在药物配对隔室中的停留时间和轨迹百分比显着降低。这些数据清楚地表明AMBVR在抑制CPP方面比AMBV取得了更好的功效。值得注意的是，在我们的研究中，用“吗啡”微生物组(AMF)进行肠道再定殖并没有诱导CPP行为。8.B.vulgatus 可以改变肠道微生物组成小鼠粪便样本的16SrRNA 基因测序揭示了用活的B.vulgatus灌胃肠道微生物群组成的变化。拟杆菌门的相对丰度从AM组的不到20%增加到AMBV组的40%和AMBVR组的60%（图7E）。定量PCR证实，与对照组相比，AMBV和AMBVR组灌胃后肠道中的细菌显着过度生长数百至数万倍（图7F）。这些数据表明，人参皂甙Rg1提高了CPP小鼠中普通双歧杆菌的丰度。9.B.vulgatus 改变了肠道微生物群衍生和宿主色氨酸代谢物对小鼠的粪便和血清进行了代谢组学分析。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)显示AM、AMBV和AMBVR组之间完全分离（图8A和D）。热图分析显示，仅用B.vulgatus灌胃导致CPP小鼠代谢物发生显着变化，粪便中有332种代谢物（211种上调和121种下调），血清中有82种代谢物（58种上调和24种下调）。我们对具有已知KEGGID 的332和82种显着不同的代谢物进行了KEGG途径富集分析，并分别鉴定了14和11种富含色氨酸代谢的代谢物。同时，将AMBVR与AM组进行比较，粪便中的313种代谢物（237种上调和76种下调）和血清中的82种代谢物（44种上调和38种下调）在与普通芽孢杆菌和人参皂甙Rg1共同处理后显着改变。在粪便中发现了13种代谢物，血清中发现了11种代谢物富集到色氨酸代谢，AMBV和AMBVR都改变了肠道微生物群衍生和宿主色氨酸代谢。我们随后检查了粪便和血清中由AMBV和AMBVR改变的色氨酸代谢物的相对丰度（图8B，C）。用B.vulgatus 灌胃下调色氨酸和血清素水平（图8E-I和9B）。10.B.vulgatus 协同增强人参皂甙-Rg1 诱导的吗啡诱导的海马 5-羟色胺能变化的抑制作用最后，为了证实人参皂甙Rg1通过影响肠道微生物群衍生的色氨酸代谢-血清素途径来减轻吗啡依赖，我们测定了海马和血清中5-HT、多巴胺和GABA的水平。CPP小鼠中血清素和多巴胺的血浆浓度较低，而GABA的血浆浓度高于单独用普通双歧杆菌灌胃或与Rg1共同治疗的小鼠（图9A-D）。值得注意的是，AMBVR小鼠的海马5-HT浓度显着低于AM小鼠。qPCR进一步证实了血清素受体和BDNF-TrkB的mRNA水平升高。我们观察到5-HTR1B、5-HTR2A和BDNF-TrkB的表达被B.vulgatus 定植和Rg1处理有效抑制（图9E、F）。研究结论该研究表明人参皂苷Rg1对吗啡依赖的改善作用与肠道微生物群有关。此外，我们发现微生物组的消耗和拟杆菌的补充可以影响吗啡依赖性并影响Rg1的功效，伴随着色氨酸代谢和5-羟色胺的变化。该研究结果提供了一个新的框架来理解中药通过肠道微生物群-色氨酸代谢和血清素能系统拮抗吗啡成瘾的机制，可能会带来新的诊断和治疗策略。

2021年4月，中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室再帕尔阿不力孜、贺玖明团队在分析化学一区《Analytical Chemistry》期刊发表封面文章，题为“Mapping metabolic networks in the brain by using ambient mass spectrometry imaging and metabolomics”的研究成果，采用自主研发的质谱成像空间代谢组学技术，全面绘制了大鼠脑代谢网络，深入解析了东莨菪碱致大鼠记忆功能障碍模型脑的代谢变化。　　封面文章　　研究背景　　大脑是结构最复杂的器官之一，主要功能与其微区的分子相互作用密切相关。大脑的小分子调节机制对理解中枢神经功能、精神疾病机理和药物研发有很大的帮助。动物的认知过程和行为控制均依赖于脑部强大的中枢神经网络——神经连接体。科学家进行了很多研究，但是对脑部小分子网络的研究仍有不足。　　分子成像技术是研究大脑中DNA、RNA、蛋白质和代谢产物的强大工具。质谱成像技术(MSI)是一种检测大脑中蛋白质、代谢物和脂质物质的高灵敏度和高通量分子成像技术，在肿瘤边缘诊断、肿瘤生物标志物发现、药物分布和机理阐述等领域有广泛的应用。　　本文作者开发了一种基于敞开式空气动力辅助解吸电喷雾离子化质谱成像(AFADESI-MSI)技术的代谢网络映射方法，对大鼠脑不同极性的小分子代谢物(m/z 50-500 Da)进行微区分布研究，不仅鉴定出脑部几乎所有重要的代谢物，还绘制了包含神经递质、嘌呤，有机酸，多胺，胆碱、碳水化合物和脂类等20条通路的代谢网络，并使用这种代谢网络映射质谱成像方法解析了东莨菪碱致大鼠记忆功能障碍模型脑的代谢变化，为中枢神经系统疾病的治疗提供新的信息和见解。研究思路　　研究方法　　1.样本准备　　Sprague-Dawley大鼠模型腹腔注射东莨菪碱后被杀死(处理组，3只)，对照组大鼠(3只)也用同样方法杀死。获取大鼠整个大脑，在低温下将大脑切成连续的矢状切片(暴露出海马和纹状体)，用于Nissl 染色、H&E染色和质谱成像检测。　　2.空间代谢组实验　　使用AFADESI-MSI分析，代谢物质量数范围50-500 Da，质谱分辨率70,000。　　3.数据处理和代谢网络分析　　原始数据经过转化，再使用自建MassImager软件获取成像结果 在获取差异代谢物的高分辨率质谱信息后，使用Metaboanalys在线数据挖掘软件以褐家鼠(rattus norvegicus)为参考完成代谢物高通量定性，并输出代谢网络信息。大脑中复杂网络可视化使用Cyctoscope软件完成。　　4.统计分析　　两组大脑样本选择相同的微区，并将组织学和特征离子图像叠加进行确认。数据处理结果使用t检验(n = 3)进一步验证。大脑微区包括松果体、中脑导水管、脑桥、梨状皮质、延髓、丘脑、纹状体、海马、胼胝体、嗅球、大脑皮层、小脑皮层、穹窿、小脑延髓和丘脑。　　研究结果　　1.AFADESI-MSI用于大脑中极性代谢物的定位　　如图1所示，将大鼠大脑连续矢状切面通过ESI探针对逐个像素进行扫描，并将解吸的代谢物离子传输到高分辨率质量分析仪进行分析。图1E是大鼠脑部某个像素点的一个代表性质谱图，在该图中可以观察到数千个代谢物的峰。AFADESI-MSI图像还表明脑部不同功能性区域中代谢物浓度的变化。图1A-D显示了代表性代谢产物图像，在松果体、纹状体、海马、胼胝体和嗅球等亚区域具有特定分布。这些异质代谢分布与大鼠脑的功能和结构复杂性高度一致。　　实验结果表明，AFADESI-MSI的空间分辨率小于100μm，代谢物质量最大差异为0.001Da，同一物质的检测动态范围高达1000倍。如图1所示，通过AFADESI-MSI可在大鼠脑部检测到一些呈特征性分布有代表性的极性代谢物，其强度范围从0到104甚至到106。　　图1 (A-E)使用AFADESI-MSI获得的用于构建大鼠大脑代谢网络图的代表性极性内源性代谢物 　　(F)AFADESI-MSI数据采集过程 　　2.在大鼠脑绘制特定区域分布的极性代谢物图谱　　使用AFADESI-MSI在正离子和负离子模式下分别获得298个和372个微区轮廓清晰的代谢物离子图像。使用精确分子量并结合同位素丰度，通过人类代谢组数据库(HMDB)对离子图像进行识别，鉴定出多种内源极性代谢物，包括氨基酸、核苷酸或核苷、碳水化合物、脂肪酸和神经递质等。　　中枢神经系统(CNS)的特定功能和特定解剖区域相关。例如，乙酰胆碱在大脑皮层中高度表达 γ-氨基丁酸是一种抑制性神经递质，其在大脑皮层的信号强度较低，在中脑、嗅球和下丘脑中的浓度较高 多巴胺在纹状体含量较高 组胺(一种兴奋性神经递质)主要分布于丘脑和下丘脑。松果体在睡眠和光周期调节中起着重要的作用，并且由于其体积小容易被忽视。在松果体区域中，作者检测到106种极性代谢物，例如吲哚乙醛、吲哚、5' -甲硫基腺苷和褪黑激素，它们在该微结构的表达最高。褪黑激素由松果体分泌，起到调节昼夜节律的作用。质谱成像结果表明褪黑激素只能在松果体检测到。褪黑激素的上游代谢物血清素(5-HT)在松果体中也有特定的分布。此外一些未知的代谢物也仅在大鼠大脑的某个很小但特定的区域中。以上结果表明，AFADESI-MSI方法可以直接检测极性代谢产物，并具有高特异性，能呈现其在大脑微区分布的图像。　　3.在大鼠脑中绘制微区代谢网络图　　要了解大脑的结构区域发生的复杂代谢过程，不仅应准确表征代谢物，还要研究其相关性。从大鼠脑微区中提取代谢谱进行代谢网络重建。从15个微区提取的MSI数据进行峰挑选和峰对齐(图1F)，包括松果体、中脑导水管、脑桥、梨状皮质、延髓、丘脑、纹状体、海马、胼胝体、嗅球、大脑皮层、小脑皮层、穹窿、小脑延髓和丘脑，然后使用基于KEGG数据库的Metaboanalyst软件进行代谢网络分析。共找到20条KEGG代谢通路，包含126个具有微区信息的代谢物，图2显示了涉及丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代谢、花生四烯酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、肌酸途径、GABA能突触、葡萄糖代谢、谷胱甘肽代谢、甘油磷脂代谢、甘氨酸-丝氨酸和苏氨酸的代谢、组氨酸代谢、赖氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、多胺代谢途径、嘌呤代谢、嘧啶代谢和TCA循环、色氨酸代谢、酪氨酸代谢、缬氨酸-亮氨酸和异亮氨酸代谢和类固醇激素合成途径。质谱成像方法提供了一种直接获取代谢网络信息的途径，以系统地深入了解大脑的代谢活动。　　图2 通过AFADESI-MSI和Metaboanalyst获得的大鼠脑中的代谢网络　　图3A展示了嘌呤代谢的分布和代谢途径，共包含17个核苷酸及相关代谢产物，饼图代表了某种代谢物在不同大脑微区的相对含量和分布，图3A中显示出不同代谢物的不同局部特征。例如腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)在大脑皮层和松果体中高表达，但在胼胝体和穹窿中含量较低。图3B显示了大脑不同区域的AMP分布，AMP在大脑皮层和松果体中含量很高，而在胼胝体和穹窿中含量较低。这些结果表明，大脑中代谢物分布呈现出功能性区域的差异性。这些空间和代谢途径的上游-下游转换过程为大脑局部代谢活动提供丰富信息。也证明质谱成像方法能够提供直接获取代谢网络信息的方法。　　图3 (A)通过AFADESI-MSI获得的大鼠脑中嘌呤代谢途径和相关代谢产物分布 　　(B)腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)在大鼠脑不同区域的分布 　　4.神经递质的代谢网络解析　　神经递质在大脑不同区域具有极为复杂的代谢调节网络，使这些区域的中枢神经能够从事复杂的活动。作者分析了关键神经递质的代谢调控网络，分别为多巴胺、γ-氨基丁酸、腺苷、组胺、乙酰胆碱、5-羟色胺、谷氨酸和谷氨酰胺。图4A显示了神经递质以及相关代谢产物在大鼠脑的分布特征，它们联系非常紧密(图4B)，这些神经元彼此相互作用并形成复杂的调节网络。　　图4 |(A)大鼠脑中神经递质及其相关代谢产物的分布 　　(B)神经递质调节和代谢网络 　　5.从大鼠脑的代谢网络映射中发掘空间变化　　东莨菪碱治疗的大鼠是一种学习和记忆障碍模型，通常用于研究抗遗忘药疗效。本文作者使用AFADESI-MSI分析了对照组和东莨菪碱治疗的大鼠矢状脑切片，将发现的代谢物全面映射代谢网络，并通过代谢组学分析发现空间代谢变化。不仅可以对药物准确定量，还可以检测代谢网络相关的数百种内源性代谢物在大脑特定区域的分布。图5显示了代谢网络中检测到的各种代谢物，以及在不同大脑微区代谢物的明显改变。如图5A所示，找到三种代谢物(N-甲酰基尿氨酸、L-色氨酸和5-羟色氨酸)，属于色氨酸代谢途径，意味着东莨菪碱会干扰色氨酸的代谢过程。作者分析了东莨菪碱治疗组大鼠脑的十个微区，发现脑桥中有16种表达异常的代谢产物，而在大脑皮层中发现了7种。表明在东莨菪碱治疗下，脑桥和大脑皮层可能是受影响最严重的区域。　　图5 东莨菪碱模型大脑中极性代谢网络的变化　　图6显示了其中几种异常表达的代谢产物的分布，例如腺嘌呤在小脑皮层被下调 组胺在中脑导水管中下调 桥脑中的磷酸乙醇胺、大脑皮层中的2-氧戊二酸、纹状体中的多巴胺、胼胝体中的抗坏血酸、下丘脑中的谷胱甘肽、小脑皮层中的L-天冬氨酸和L-天冬氨酸也有所变化，这些代谢物的质谱成像结果(图6A-H)和相对定量结果(图6I1-18)进一步表明，大脑中药物作用后代谢物的多样性和区域特异性。这些代谢物不分区分析、含量进行全脑平均后，代谢物的微区含量差异很容易被削减。在空间上的代谢变化表明，在东莨菪碱治疗后，大鼠脑微区的代谢网络发生紊乱。但是代谢物和代谢酶是代谢网络的关键因素，基于空间分辨的代谢组学信息为发现酶或基因异常提供了线索，但若要完成完整的代谢网络分析必须进一步验证蛋白质和基因表达水平。　　图6 在东莨菪碱治疗后大鼠模型的脑部质谱成像结果和代谢产物的统计结果　　研究结论　　本文作者开发了一种空间分辨代谢网络作图方法，通过无需衍生化、特定标记或复杂样品预处理的高通量AFADESI-MSI方法和代谢组学策略，在具有复杂结构化脑组织中发现代谢分子变化。能检测出多种极性内源性代谢物，并绘制相关代谢网络，提供组织微区分布的图谱。还将多种功能性小分子(例如核苷酸、多胺、肌酸、神经酰胺代谢物)含量分布可视化。这些代谢物构成大鼠脑关键代谢网络，为理解大鼠脑的作用机制和功能探索提供新的见解。在本文中，该方法被用于东莨菪碱处理的大鼠模型脑部的代谢研究。结合微区统计数据，该方法可以绘制代谢网络图、发现某些途径代谢产物的明显失调，而且还能描绘与神经疾病直接相关微区中发生的代谢变化。

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，分四期介绍。本期为第三部分内容。5.3. 突触后室突触受体位于突触后室，负责传递来自突触前末端的信号。它包含支架蛋白--负责锚定突触后受体的专门用于信号整合的信号分子。在神经元树突中，从主要树突轴起源并突起的小体积树突棘提供分区功能，并根据突触活动和发育阶段显示大小和形状的动态变化。树突棘是突触长时程增强（LTP）的结构相关物，因此与学习和记忆有关。要想准确观察树突棘的小尺寸、不同形状和动力学，一般要求采用超过衍射极限的分辨率并有可能进行活体成像的光学显微镜方法。第一个将活细胞SMLM应用于原代神经元的研究之一是使用碳菁染料（如Dil）可视化脊髓和丝状足。对于突触后膜结构的可视化，已经发现了一个新的膜标记试剂系列，该系列可实现神经元追踪和树突棘的可视化。最近，通过快速SIM和增强共聚焦显微成像研究了树突棘上微小突起（称为小刺）的动力学。通过将SIM成像与计算方法相结合，进一步评估了树突棘的几何结构，证实凹面对于棘结构稳定的重要性。在树突棘中，F-肌动蛋白高度定位富集在突触后密度区（PSD）和树突棘膜上。肌动蛋白的分子速度升高已让其扩散到除棘尖外整个棘的亚区。为了分析脊髓中肌动蛋白的动力学，我们设计了一种低亲和力的光转换肌动蛋白探针，并利用像差校正光学系统对活体脑切片动力学进行了表征。通过STED显微镜观察对phalloidin-ATTO647N标记的原代神经元，可以在树突棘颈和丝状棘中观察到F-肌动蛋白的周期性片段。同年，STORM成像也显示树突棘颈和丝状棘中存在以肌动蛋白为基础的周期性膜骨架。在树突棘中，分支的F-肌动蛋白在PSD附近聚集，而延伸仅限于指状突起的尖端，并为棘突提供了基础。通过基于监督学习的模式识别进行图像分割，可以对树突肌动蛋白组成异质性做自动分析。用SMLM也对树突F-肌动蛋白进行了同样的分析，并使用树突铂复原电镜进行了验证。使用STED显微镜在活体小鼠脑切片海马CA1神经元上进行延时拍照并结合FRAP及电生理学检查，证明在神经递质释放诱导的长时程增强（LTP)时树突棘颈部具有可塑性（宽度增加并长度减少）。使用正置STED显微镜实现了活体小鼠树突棘动力学的首次超高分辨率成像。在这里Thy1 EYFP小鼠体感皮层中的树突棘在其头部和颈部表现出形态可塑性。另外使用双光子STED成像对活体小鼠的海马树突棘动力学进行了研究，树突棘密度与早期报告相比高出2倍，并能测算几天内的树突棘蛋白周转率（图10）。图10 体内长时程双光子STED成像--海马CA1锥体神经元树突棘蛋白周转。左上图：使用长工作距离物镜的实验方法和CA1锥体神经元的双光子整体图像。右上图：传统的双光子成像与双光子STED成像的比较，显示了总体上更高的棘突密度和更详细的形态，特别是在轴和棘突中。空的箭头标志着常规双光子成像不能显示的棘突，而填充的箭头表示双光子STED报告的棘突数量更多、形态更复杂。底部图像：在海马CA1区基底树突的一个选定区域内，连续几天（第0天、第2天和第4天）成像的树突棘周转。树突棘被连续编号。AB=接近树突的轴突（缩回的棘突用红色标记；新的棘突用绿色标记）。转载自原文参考文献 273。此外，sptPALM揭示了富集在突触棘的突触后激酶CaMKII的空间和动力学亚群，该激酶介导钙依赖性可塑性机制。这些动力学似乎由棘肌动蛋白调节，因为Latrunculin A导致棘内CaMKII扩散显著改变。在PSD内的棘头，一个密集的蛋白质复合物含有不同的突触后支架蛋白，如PSD-95、homer1和shank3，它们排列在大小为∼80纳米的亚突触域中。根据不同的突触类型，PSD-95被动态组织为单个单元或多个纳米簇的形式。STED显微镜揭示了突触后支架蛋白负责将离子受体锚定到突触后膜上，SMLM观察到的活体原代神经元也是一样。在这里，活细胞单分子成像结合定量分析揭示了含有GluA2的AMPA-Rs（优先聚集在突触下的PSD-95簇中）的稳态调节。而PSD-95的uPAINT成像和AMPA-Rs的spt PALM报告在70 nm大小的PSD-95纳米域内平均聚集了20个AMPA-Rs，进一步证实了上面提到的这个发现。AMPA-Rs形成纳米颗粒，并能在几分钟内动态改变其大小和形状。与突触可塑性匹配的是：动态变化是通过突触内和突触外隔室之间的AMPA-Rs在时间维度交换，通过横向扩散来实现的。这些过程通过以微球标记抗体为靶点的内源性受体的单分子追踪实验得到证实。受体运动的类型被认为是布朗扩散，与突触后元件发生短暂的、低亲和力的相互作用。单分子追踪实验中使用Atto 647N修饰的抗体揭示了谷氨酸诱导的脱敏AMPA-Rs的侧向扩散增加导致的短期可塑性。AMPA-Rs的侧向扩散也与突触的短时程增强和长时程增强（分别为STP和LTP）有关。例如，已经证明，为了从突触抑制中恢复，脱敏受体通过侧向扩散被功能受体替换。此外，追踪实验表明，在CaMKII激活诱导LTP后，AMPA-Rs扩散到突触部位。这一过程由钙浓度升高触发，它导致CaMKII介导的stargazin（它与PSD-95一起能够调节AMPA-R的迁移率）磷酸化。进一步的研究报道，AMPA-Rs的交联导致膜上受体制动，它阻止了成功的LTP诱导。这一机制也可能导致由AMPA的致病性抗体介导的自身免疫性CNS疾病的病理生理学。与NMDA-R和mGluR5代谢受体的GluN1亚单位相比，AMPA-Rs的纳米级结构以不同的簇大小为特征。令人惊讶的是，突触前mGluR5受体表现出更均匀的分布，没有聚集行为。通过一种新的基于敲入的基因组编辑方法观察到，代表NMDA-R总库的内源性GluN1亚单位受体被证明聚集在一个由单个受体包围的主要单簇中。在关注NMDA-R细分的NR2A和NR2B亚型时，SMLM表明，在突触发育过程中，这些亚型被分割成纳米结构域，并根据其突触比率进行重塑。关于谷氨酸受体的活动性，单分子追踪实验揭示，神经元活动优先影响AMPA-R的活动性，而NMDA-R的活动是由蛋白激酶C活动触发的，而不是由钾升高触发的。此外，dSTORM成像表明，不同的NR2亚单位定位于不同的纳米结构域，这些纳米结构域在神经元发育过程中表现出灵活性。根据NR2A和NR2B的纳米结构，LTP的表达可以双向调节。kainate受体的单分子追踪实验也表明，突触捕获紧随着突触活性增加后发生。这里，突触激活导致的kainate受体与突触β-连环蛋白/N-钙粘蛋白复合物结合，形成短期可塑性。作为抑制性突触的对应物，gephyrin是将GABAA（GABA-a R）或甘氨酸受体（GlyR）并入突触后膜所必需的关键锚定分子。通过对突触中gephyrin分子的PALM/dSTORM成像发现：抑制性PSD（iPSD）体积为0.01至0.1μm3，并且每个iPSD中有200−250个gephyrin分子。单分子成像进一步揭示了gephyrin分子与受体结合位点的化学计量比约为1:1.96。类似于兴奋性突触，抑制性PSD（IPSD）根据突触活动动态调节其大小。通过NMDA-R激活形成的抑制性突触LTP加剧突触gephyrin积累，从而以CaMKII依赖的方式增加GABA-AR聚集，从而诱导GABA能突触后电流的增强。相反，抑制gephyrin向突触区的募集导致GABA-AR迁移率降低，并阻止iLTP的诱导。iLTP诱导后，gephyrin片段化为纳米结构域。gephyrin的重组降低了抑制性突触后电流的振幅变异性，证明了GABA-AR准确定位对于iLTP的真正表达非常重要。有趣的是，单粒子追踪显示，脱敏的GABA-AR甚至可以通过侧向扩散在并列的GABA能突触之间交换，为控制GABA能电流提供了另一种机制。此外，为了阐明多巴胺能突触的超微结构布局，dSTORM成像将多巴胺转运体映射到胆固醇依赖性纳米结构域，从而为更好地理解多巴胺能神经传递的病理生理过程奠定基础。5.4.亚突触结构域中的跨突触排列早期电生理学实验中已经发现，突触强度取决于突触前融合位点和突触后受体组织之间的空间关系，突触释放由释放位点的数量，突触小泡的释放概率，以及受体提供的突触后基本反应来决定。首先观测到的亚结构域的跨突触组织是突触粘附分子SynCAM 1位于边缘，EphB2位于PSD的中央。SynCam1在PSD中形成突触下云，可被长期抑郁症模式重塑。SMLM观察链霉亲和素的新单体变体（设计用于减少突触区域的交联和空间位阻），表明跨突触伙伴神经肽原1和神经纤维素1ß在突触处扩散受阻，形成相反的簇。这项研究还表明，另一种粘附分子LRRTM2的流动性不如神经肽1，并形成更密集、更稳定的簇。最近揭示了兴奋性突触上活性区的细胞基质和突触后受体支架的跨突触排列，它与提供高保真突触传递的靶向神经递质释放有关。在这里，释放位点定位是通过一种基于融合到突触囊泡蛋白Vglut1的pHluorin标记和RIM1/2纳米簇的超分辨检测的新方法实现的。多色3D定位显微镜显示RIM1/2和突触后PSD-95形成相反的纳米簇。LTP诱导导致PSD-95密度断裂增加，同时增强了纳米柱的排列，而LTD导致突触后柱的紊乱。突触前和突触后关键分子的这种纳米级排列主要由于neuroligin 1。此外，在应用STED显微镜的实时成像实验中，已经报道了树突棘体积增加和排列的纳米模块数量之间的紧密相关性。还报道了抑制性突触的亚突触结构域的纳米级排列。在这里，STED和SIM阐明了gephyrin和GABA-AR突触前亚区域的紧密联系。此外，突触后GABA-A 受体云显示与突触前边缘结构域结合（图11）。在小鼠神经肌肉连接处，带连接褶开口的突触后乙酰胆碱受体和突触前活动区的排列已通过应用SIM成像可视化。图11. 抑制性突触上的突触亚结构域。突触前的RIM元素与突触后的gephyrin支架分子以及抑制性突触的GABA-A R的突触下结构域的排列。PSD的体积和突触下域的数量随着活动相关的突触大小的变化而变化。转载自原文参考文献302。5.5. 三联突触星形胶质细胞是神经传递的基本调节者，神经元突触周围突触前星形细胞突起（PAPs）的吞噬产生了三联突触这一术语。PAPs能够通过传递调节分子来改变和控制突触的传递。通过dSTORM重建星形细胞突起，可以通过标记胶质酸性纤维蛋白（GFAP）和谷氨酰胺合成酶和S100b的成像来实现星形细胞的纳米级可视化。最近的一份报告应用ExM来观察脑片中突触周围的星形胶质细胞谷氨酸转运体显示，在与这些棘附近的GLT-1水平较高有关的较大的神经元树突棘中，谷氨酸的摄取效率降低（图12）。图12. 海马大脑切片中CA 1锥体神经元周围的星形细胞突起。锥体神经元的树突在Thy1-YFP小鼠系标记（绿色）；星形胶质细胞则是在海马脑片上的GLT-1免疫染色显示（红色）。蓝色信号代表树突区和星形细胞突起的共同定位。更高的放大率插图见右图。左下：大棘和小棘的分类。底部中间和右侧：GLT-1和神经元YFP的共定位像素的量化。请注意右图树突棘体积归一化后的变化；红点表示平均数和SEM，p = 0.0220 (绝对GLT-1覆盖率），p = 0.00223（相对GLT-1覆盖率）。转载自原文参考文献307。EM和STORM发现，PAPs也配备了局部翻译位点，以避免星形细胞体细胞中合成的蛋白质的长距离运输路线。最近在器官型切片中进行的3D STED显微镜研究揭示了星形细胞钙信号的结构前提。在星形细胞内检测到了海绵状结构，它包含了接近突触部位的节点和轴。钙离子瞬变的共聚焦成像与星形细胞结构的STED显微镜相结合，显示自发的钙离子瞬变紧密地映射到这些结点。因此，这些结点被认为是类似于树突棘的空间分隔作用。胶质传导物质的外渗需要提供胶质囊泡。通过将电容测量与葡聚糖摄取后星形胶质细胞内的囊泡的SIM图像相关联，发现了外吞和内吞之间的Dynamin依赖性膜中间物。通过STED显微镜和SIM分析单个胶质小泡的特征，在星形胶质细胞中有两个小泡群，其大小和融合能力不同。Phluorin实验结合SIM确定星形胶质细胞囊泡上Syb2分子的拷贝数为25∼。此外，应用STED和TIRF显微镜对培养的星形胶质细胞中的VAMP3阳性囊泡进行了单囊水平的分析。测量结果显示VAMP3覆盖的囊泡大小约为80纳米，并提供证据表明这些囊泡参与了钙依赖性的囊泡循环。SIM成像还可以发现，突触蛋白中一种已知的参与神经元外排的v-SNARE蛋白，也普遍存在并组织在单个星形胶质细胞的囊泡上，以实现高效的外排。星形胶质细胞还通过回收proBDNF到BDNF参与促进兴奋性LTP。这里，SIM成像显示，proBDNF在体细胞区域位于囊泡大小的集群中，而沿星形胶质细胞末梢的点状模式占主导地位，以扩大BDNF对记忆的作用。为了最大限度地减少激发光的散射，通过应用被动CLARITY进行组织透明化和多光子显微镜，改善了组织深处的星形细胞成像。通过使用SiR-actin和SiR-tublulin探针的STED显微镜和原子力显微镜（AFM）的相关方法来测量膜的拓扑结构和硬度，将星形细胞的细胞骨架和膜的生物物理特性联系起来。（未完待续）本文由超高显微技术应用工程师郭连峰、黄梓彤编译（受篇幅限制，未将参考文献列出）相关阅读：超高分辨率显微技术在神经科学中的应用（一）超高分辨率显微技术在神经科学中的应用（二）

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，我们将分三期陆续介绍。本期接着上期的第一部分超高分辨率显微技术在神经科学中的应用（一） ，为第二部分内容。4.荧光标记与样品制备4.1. 荧光标记神经元和脑片的超分辨率成像是用适当的荧光团标记感兴趣的生物分子，理想情况下是以定量和化学计量的方式。虽然SIM和其他超分辨方法的成像质量取决于信号背景（S/B）比，但SIM对荧光团没有特殊要求。另一方面，STED显微镜可达到的分辨率在很大程度上取决于所用荧光团的光稳定性。RESOLFT显微镜使用可逆光开关FPs，具有两个稳定状态，因此可以使用较低的激光照射强度。所有SMLM方法的定位精度取决于每个事件检测到的光子数。dSTORM需要光开关有机荧光团，包括菁、罗丹明和恶嗪染；而PALM则需要使用光开关、光转换和光激活FPs。与此相反，DNA-PAINT理论上适用于所有荧光团，因为开/关速率由对接链和成像链序列和缓冲条件决定，而其中 Cy3B和ATTO 643效果最好。、为了获得一张好的超分辨率图像，除了成像方法以外，样品制备也非常关键。使用荧光探针进行高效和特异的标记，并且使标记误差（荧光团和目标之间的距离）达到最小。为了通过荧光成像进行结构解析，标记密度（即荧光探针之间的距离）必须显著高于所需的分辨率。另一方面，特别是对于接近几乎分子分辨率的超分辨率成像方法，标记误差必须尽可能小，以达到高精度成像。对于活细胞标记而言，在合适的表达载体中融合感兴趣的蛋白质的基因编码FPs无疑成为首选。然而，FPs的亮度较低，与有机染料相比，其图像分辨率较低。理想的标记方法是使用荧光染料标记基因编码的蛋白质、肽标签或单一氨基酸。在模式生物如果蝇或秀丽隐杆线虫的应用得益于基因编码工具，通过转座子、操纵二分体Gal4/UAS表达系统或Crispr/Cas9方法引入或去除突触蛋白和荧光蛋白。由于瞬时转染的细胞表现出不同的蛋白质表达水平，蛋白质的分布和功能不一定反映野生型的情况。图5 通过单体链霉亲和素结合AP标记的突触蛋白成像结果显示Nlg1和LRRTM2的差异分布（dSTORM成像）。上排：Homer 1c GFP作为突触后室的参考。第二排：Nlg1和LRRTM2（dSTORM成像）。左下：频率分布直方图，用于显示相对于Homer 1位置中心的信号分散情况。右下：列出比较两种蛋白质的突触结构域数量的直方图。然而，通过构建优化表达，稳定表达的细胞或CRISPR基因敲入等方法可以产生从内源性到强过表达的蛋白质表达水平。根据不同的转染策略，可以采用不同的方法转染神经元。传统的磷酸钙共沉淀法和脂质体法在大多数实验室都可实施，但这两种技术的转染效率很低。而病毒转染的效率比较高，允许注射到大脑区域，但需要实验者具备病毒生产方面的专业知识，并需要考虑生物安全问题。此外，还必须考虑病毒类型、插入片段大小、毒性和差异表达等因素。要达到高转染效率，可以使用高压脉冲将核酸直接输送到细胞核，进行核转染。然而其缺点是，当这种方法应用于小鼠原代神经元时，会导致细胞存活率较低，并且实验设备昂贵，还需要根据神经元密度和物种对脉冲参数进行多次测试。另外，也可以使用细胞附着式高电阻管，在完整神经元网络（如器官型切片）中进行单细胞电穿孔。利用这种方式，结合CRISPR基因敲入获得了接近内源性的蛋白质表达水平。基于CRISPR基因敲入，在神经元发育的不同时间点通过脂质感染、核感染或病毒转染在神经元中实现。如前所述，FPs光稳定性和荧光光子输出较低，这降低了图像质量。另外，连接大小为2−5nm的FP后,蛋白质功能可能会受到影响。因此,首先必须清楚感兴趣的蛋白质在野生型的功能表现。而有机染料比FPs小得多，有更高的光子产率和光稳定性，但需要与其它能与感兴趣分子结合的分子进行连接耦合。对于固定细胞，使用一抗和二抗进行免疫染色仍然是标记内源性蛋白质的首选方法。缺点是由两个大小17.5 nm左右的IG抗体间接免疫标记有可能导致标记误差。使用直接法免疫荧光或Fab片段可以减少标记误差。另外针对GFP或转基因短肽标签的更小（1.5×2.5 nm）的骆驼“纳米抗体”已应用于dSTORM成像。此外，耦合了链霉亲和素的荧光染料可用于神经元和器官型组织中靶蛋白的特异性标记。使用这种标记方法，研究了神经氨酸酶-1ß、神经肽原-1和富含亮氨酸的重复跨膜蛋白2的动力学和纳米级结构，并揭示了跨突触粘附结构的形成（图5）。另外可以使用生物正交肽或自标记蛋白质标签，例如FlAsH tags, SNAP-tags, and Halo-tags。这些标签蛋白与目标蛋白共表达，并以共价和特异性结合其各自的荧光标记试剂或配体。对于肌动蛋白和微管的标记，可以使用小肽药物，如双环七肽-鬼笔环肽和紫杉烷类药物，如紫杉醇。膜和细胞器的标记可以通过荧光脂质和细胞器的追踪试剂来实现。此外，小肽或配体可以直接用荧光团标记，并特异性结合生物分子，例如，显示抑制性突触后位点的超结合肽。要达到最小的标记误差，可以通过单个非天然氨基酸的特定位点标记实现。通过基因编码导入设计的非天然氨基酸，并用四嗪染料进行生物正交点击化学标记。显然，神经元和组织切片必须根据要成像的结构进行透膜和固定。与所使用的标记方法无关，特别注意所用的试剂必须能保留自然细胞环境中生物分子的超微结构。通过化学试剂固定交联蛋白质，可能会影响结合亲和力，也可能削弱分子间的相互作用。在大多数情况下，多聚甲醛（PFA）和戊二醛已成功用于神经科学的超分辨率成像。此外，还引入了乙二醛等新型固定剂。膜分子应始终使用4%的PFA和0.2%戊二醛固定，以尽量减少残余流动性并避免伪影，例如抗体结合诱导的簇形成。4.2. 神经元的多色遗传标记荧光蛋白彻底改变了神经元的活细胞成像方式，因为荧光蛋白可以与感兴趣的蛋白质融合，并且在假定不影响野生型功能的前提下，用于双色和三色成像。神经系统具有非常高密度的轴突和树突相互作用结构，需要使用更多不同颜色的标记来区分不同的神经元连接。2007年，随着一种名为Brainbow的转基因方案的开发，这一问题得到了解决，该策略能够对神经元进行多色标记。结合单细胞分辨率成像技术，Brainbow技术可以用来创建大脑图谱，详细描述神经元如何形成回路，其连接体以及它们投射到何处。Brainbow利用了三原色，即可见光谱的所有颜色都可以由三种原色的不同混合物生成，即红色、绿色、蓝色（RGB）或转化为荧光蛋白，例如RFP、YFP和CFP。为了实现这一想法，应用了Cre/lox重组系统，该系统可以通过DNA切除、反转或染色体重组启动基因表达，使三个荧光蛋白基因中的一个在转基因中随机表达。转基因盒的多个拷贝的引入导致三个不同拷贝数的基因在每个细胞中组合表达，从而产生几十种颜色，使相邻神经元分化并观察其相互作用。Brainbow技术非常适合绘制不同神经元类型之间的连接模式，追踪轴突，并识别大脑中远距离的神经元连接。此外，已经证明Brainbow表达可以成功地用于研究周围神经损伤后的轴突再生，并检测大脑发育过程中的重要阶段。为了进一步改进Brainbow在包括突触蛋白在内的大脑和连接图谱中的应用，SRM的应用是显而易见的。最近通过结合Brainbow、顺序免疫染色和ExM同时研究同一脑切片上的形态、分子标记和连接，成功地证明了这一点（图6）。将这项技术应用到全脑研究一直是一个挑战，直到最近才成功应用。图6 结合Brainbow和ExM的多轮免疫染色和ExM(miriEx)成像。(A) 实验方案：在Parvalbumin cre/+ 小鼠的脑切片中，Parvalbumin蛋白阳性中间神经元通过Brainbow进行观察，并在下一轮应用4倍ExM成像。使用EYFP信号对Homer1和Gephyrin进行免疫染色来观察突触。(B) Brainbow 信号的免疫染色。(C) 分别通过突触后标记homer1和Gephyrin的免疫染色来区分抑制性和兴奋性突触。插图(D)−(F)和(G)−(I) 显示图像的更多细节图。(J)和(K)神经元的形态重建(使用ImageJ软件插件nTracer)，包括其各自传入的特征。虚线框表示(B)和(C)中所示的区域。重建的神经元按顺序编号。标尺(膨胀前的)：10μm(B/C)、2.5μm(I)、20μm(J/K)。4.3. 神经科学中的光电联合显微镜电子显微镜(EM)和电子断层扫描具有光学显微镜无法达到的空间分辨率，可以获得细胞和细胞器的超微结构信息。然而，EM和电子断层扫描不能标记特定的分子，因此难以识别未知的细胞结构或具有相似形态特征的结构。用胶体金标记结合抗体可以实现蛋白质的纳米级定位，但抗原的标记效率低下，这意味着胶体金颗粒的数量仅占抗原总数量的1%到20%。而另一方面，荧光显微镜虽然分辨率较低，但可以进行大视场成像和对活细胞中蛋白质进行定位。对固定样本细胞中的各种分子进行高效和特异的分子标记后，结合超分辨率荧光显微镜方法，达到的空间分辨率可以远低于衍射极限。因此，光电联合显微镜（CLEM）作为一种通用的方法，在电子显微镜提供的细胞超微结构背景下，通过超分辨率成像来可视化蛋白质的定位和相互作用。然而，将超分辨率成像与EM结合起来更为困难，因为乍一看，这主要是由于两种方法的样品制备流程不同且不兼容。例如，EM中保存超微结构所需的固定和染色会引入很强的自发荧光。而且荧光蛋白还会在固定和聚合物包埋所需的脱水和氧化条件下淬灭。此外，这两幅图像必须在纳米精度下精确叠加，首先需要使用在荧光成像和EM中都表现出极好的对比度的固定对准标记物，如裸金微球。 另外，样品脱水引起的结构变形会严重破坏两幅图像的正确叠加。所以必须在超微结构和荧光保存之间找到折衷方案。例如，已经证明，对于某些周期性分子结构，如核孔复合体，无需使用对准标记，dSTORM和EM扫描图像可以以20 nm的精度叠加。光电联合显微镜的流程是先对轴突和树突进行荧光实时成像后，再使用透射电镜观察。例如，表达GFP的脑组织在荧光成像后进行化学固定，再使用电子密度标记进行免疫标记，例如EM金。或者采用更成熟的方法，如过氧化物酶或胶体金标记。最后，可以通过光转化在荧光团处局部生成二氨基联苯胺（DAB）聚合物。为了克服标记问题并确保超微结构的保存，已经开发了用于EM (NATIVE)的纳米体辅助组织免疫染色。NATIVE能够高效标记蛋白质，无需苛刻的渗透步骤、特殊树脂、锇替代物或透明化试剂。随着方法的改进和技术的发展，光电联合显微镜已被证明是研究不同种类突触和定位突触蛋白的理想选择。5.超分辨显微镜观察神经元隔室/突触以及神经元−胶质细胞相互作用下面我们将展示通过超高技术获得的有关细胞骨架组成和动力学、突触前室和突触后室对神经传递准确性至关重要的分子组装，以及形成神经元功能的星形细胞结构的调节和构建的最新数据。5.1. 细胞骨架神经元的极化性质以及树突和轴突的长度都需要结构和功能性支架来支持它们的稳定性、适应可塑性和物质运输，这些特性对神经元的存活和信号传递是必不可少的。因此，神经细胞骨架的结构在过去几十年中引起了神经科学家的注意，并在其它文献中进行了详细的回顾。20世纪70年代的电镜研究表明，神经细胞骨架由三种主要类型的神经纤维组成：大小约为20−30 nm的微管，直径为10 nm的神经纤维和5−10 nm大小的肌动蛋白丝。微管是由异二聚体在GTP依赖性组装过程中结合α和β微管蛋白单体组装而成的圆柱体，称为原丝，再由13个这样的原丝形成一个微管单元。轴突的微管成束状组织，并根据其相对于神经元胞体的位置显示不同的方向。它们的极化通过快速增长的正端和缓慢增长的负端体现。STED显微镜揭示了快速生长极依赖钙锚定在肌动蛋白皮质上。使用dSTORM对发育中的神经元进行活细胞成像证明了神经元极性和轴突具有方向一致的、平行的由TRIM46驱动的微管束，而树突微管的特征是混合极性。用Motor-PAINT方法进行纳米跟踪发现稳定和乙酰化的微管显示负端向外的方向，而动态和酪氨酸酶化的微管则显示相反的方向（图7）。例如轴突起始节中微管密集地聚集在束簇中，由于密集的重叠定位，使用SMLM方法具有挑战性。这个问题可以通过两种实验方法来解决：第一，设计更小的标记探针，如微管蛋白纳米抗体，这不需对神经元微管更详细的观察。第二，一种降低群聚密度的超分辨率方法，如ExM，可用于胞体和树突中微管亚群的可视化。神经纤维是在轴突中形成的广泛平行网络的异质聚合物，它为轴突提供稳定性并调节轴突直径和传导速度，其组成包括低、中、高分子量神经纤维、中间蛋白和外周蛋白的三联体。它们的自组装首先形成平行的异二聚体，然后半交错地结合成反平行的四聚体。最后，八个四聚体横向聚集成单位长度的神经纤维，进一步拉长并径向压缩至最终的神经纤维外观。用电镜观察到在神经纤维之间的交界面，形成3−5 nm大小的交叉桥，但对其功能及其与神经纤维的分子相互作用仍不清楚。在这里，ExM与SMLM的结合或DNA-PAINT的应用可能有助于研究密集神经纤维中的这种相互作用。神经纤维动力学已经通过光转换和光活化SRM实验进行了研究，显示了端到端蛋白合成中的退火和切断过程。肌动蛋白最初被认为与一组更集中的短肌动蛋白丝结合在一起，在轴浆中形成斑点状的膜下层。在原代神经元和脑切片中使用phalloidin Alexa Fluor 647进行STORM成像，揭示了轴突肌动蛋白的新的组成原理。这些实验揭示了轴突中存在圆周式肌动蛋白环，每190 nm固定重复间隔绕一圈，并进一步表征了轴突中具有类似尺寸的ßII血影蛋白和钠通道的周期性条带，而树突状腔室内显示出更细长的肌动蛋白组织。此外，通过STORM成像发现，并通过STED显微镜的研究得到证实，这种肌动蛋白组织模式的普遍性也存在于树突中。进一步的报告发现，尽管树突中也存在基于肌动蛋白血影蛋白的周期性膜骨架，树突中这种结构的形成倾向和发育速度低于轴突。此外，本文还显示了肌动蛋白和血影蛋白在胞体和部分树突中的二维多边形晶格结构，类似于红细胞中的膜骨架结构。此外，使用SiR-actin，可通过STED显微镜在活的原代神经元中观察到这种周期性结构。最后，最近的CLEM方法结合铂金复原电镜（PREM）和STORM研究了无顶轴突中的肌动蛋白组织，并提供了轴突编织状肌动蛋白结构与周期性肌动蛋白超微结构相关的证据（图8）。图8。原代神经元无顶轴突（unroofed axons）的CLEM成像（结合铂复型电子显微镜和STORM的光电联合成像）。用铂复型电镜（PREM）（灰色）显示的轴突辫状条带（箭头）被叠加到大鼠原代神经元的超分辨肌动蛋白环（伪彩）上，比例尺=2, 1, 0.2μm（从左到右）。中间：轴突辫状条带间距测量后显示出与周期肌动蛋白间距相似的尺寸。右图：在铂复型电镜（PREM）中记录的神经纤维厚度，未分裂（交织在一起）和分裂（分裂开）的轴突肌动蛋白辫状条带为蓝色，树突中的单个肌动蛋白神经纤维为紫色，微管为灰色参考。采用平均值和标准误显示数据。Copyright 2019 Springer Nature.ßII 血影蛋白基因敲除导致周期性肌动蛋白环结构破坏，同时细胞器的双向轴突运输受损。SMLM结果显示，与轴突相比，轴突起始节中的分子组织其特征是轴突起始节（AIS）蛋白ankyrin-G和ßIV-血影蛋白，这种基于肌动蛋白-血影蛋白的细胞骨架与远端轴突相似。此外，在AIS中存在ßIV-血影蛋白和Ankyrin G，而在远端轴突中存在ßi--血影蛋白和Ankyrin B。SMLM显示与肌动蛋白环相连的纵向头对头ßIV血影蛋白和Ankyrin的二价取向有助于建立紧凑的AIS超微结构，该超微结构甚至对针对肌动蛋白和微管的药物治疗具有抵抗力。进一步显示Ankyrin-G会聚集到亚结构域，增强神经元活性，而成为精神疾病的主要风险基因。随后的SMLM研究还阐明了αII血影蛋白与ßIV血影蛋白共同在AIS提供强健的周期性细胞骨架组织以及防止AIS装配不完全和神经变性的重要性。一份相关报告显示，αII 血影蛋白丰度随有髓鞘轴突直径的增加而增加，表明大直径轴突更容易发生神经退行性病变。在免疫标记II血影蛋白后，将其连接到一种可膨胀的聚合物，并在水中膨胀后，通过ExM研究ßII spectrin沿轴突的周期性模式。这一新方法证实了如前所述的细胞骨架内部的组织原理。不幸的是，在ExM过程中，phalloidin探针在膨胀过程中被冲掉。有两种策略解决这一问题：一方面，携带甲基丙烯酸基团的phalloidin三功能抗体被设计用于与凝胶的有效标记；另一方面，最近的一份报告使用荧光团结合抗体，类似于常规免疫染色，将荧光团靶向phalloidin探针与凝胶连接。在中枢神经系统的几种神经细胞类型和动物物种中，肌动蛋白和附属蛋白的强大超微结构组织也得到了证实。外周神经系统（PNS）中，STED显微镜也显示在梳理的神经纤维样本上有重复的细胞骨架成分。最后，SMLM揭示了肌动蛋白-血影蛋白骨架的一个重要生物学功能：它可以作为一个信号平台，通过组织跨膜信号蛋白，包括G蛋白偶联受体（GPCR）、细胞粘附分子（CAM）和受体酪氨酸激酶（RTK），在神经元中进行信号转导从而实现GPCR-和CAM介导的RTK信号。5.2. 突触前室为了确保有效的神经化学传递，突触前膨大参与突触囊泡循环、神经递质填充以及与突触前膜在活性区（特殊蛋白质密集分布的纳米隔室）的融合，以最终释放神经递质。在这里，我们关注SRM如何扩展我们对突触前功能的理解。早期只能使用EM对化学固定神经元里的小直径突触小泡进行研究，但随着SRM的出现，应用快速STED显微镜，通过免疫标记位于突触前室突触小泡上的钙传感器突触标记蛋白1（SYT1）来观察突触小泡的活动。STED显微镜进一步显示，突触小泡融合后Syt1分子似乎驻留在突触膜上，也支持胞吐后突触小泡蛋白的清除过程。此外，在突触小泡融合过程中，当暴露于细胞外空间时，靶向Synaptobevin 2 pHluorin的荧光团结合纳米体后，亚衍射追踪显示了突触小泡的异质性迁移。一种类似的方法使用vGlut1 pHluorin在原代神经元中的表达来观察单个神经元突触小泡，定位精度为27 nm，并揭示了突触小泡的多个不同释放位点。作为一项方法学的进步，为了对主动循环的小泡成像，设计了一种名为mCLING的亲脂膜探针，该探针可对突触膜进行染色，通过内吞作用和固定，可以进行免疫标记，且和SRM相结合。突触小泡的胞吐过程需要一组属于突触前细胞基质的突触前蛋白质的高度可靠的相互作用，使突触小泡接近和暂时驻留在所谓活动区的膜上，并最终释放突触小泡。黑腹果蝇易于遗传，有助于精确定位果蝇幼虫神经肌肉接头（NMJ）活动区的第一个重要蛋白质。Bruchpilot（Brp）是一种必不可少的活性区成分，是一种大的、卷曲的螺旋蛋白，对于钙通道聚集和突触囊泡定位到突触释放位点至关重要。除了通过Brp研究钙通道聚集外，STED显微镜还证明了该蛋白细长的组织结构，并揭示了与Brp相互作用的蛋白（如syd-1α、liprin和rim结合蛋白（RBP））的定位。定量dSTORM方法研究了果蝇活动区Brp丝的数量，并显示了Brp的结构组织与其功能之间的强相关性。接下来的研究通过dSTORM评估Syt1敲除后的活动区（CAZ）电生理学和细胞基质参数。这项研究表明，在果蝇NMJs 1b型突触膨胀中，Syt1基因的敲除导致更高的Brp计数和簇内Brp图谱的改变。在哺乳动物突触中，突触前支架蛋白bassoon 和 piccolo参与突触囊泡释放的调节。据报道，bassoon蛋白通过与RBP的相互作用来控制CaV2.1型钙通道的定位。此外bassoon蛋白能加速囊泡释放，因为其丢失导致小脑苔藓纤维到颗粒细胞突触中的突触囊泡数量显著减少和突触抑制。STED显微镜显示bassoon 和 piccolo蛋白是一个夹心三明治结构，两侧为piccolo蛋白，bassoon蛋白居中。STORM成像通过距离测量显示bassoon蛋白相对于突触前和突触后室中其他相关突触蛋白质的方向。囊泡胞吐过程由一组可溶性ethylmaleimide敏感因子附着受体（SNARE）蛋白质进一步协调。位于突触膜上的囊泡SNAREs (v-SNAREs) 蛋白和 t-SNARES蛋白的复杂形成导致突触囊泡成功融合。在质膜上的突触体相关蛋白25（SNAP-25）和突触融合蛋白聚集首先通过STED显微镜进行研究。这项研究表明，大约75个突触融合蛋白分子被堆积成50- 60 nm大小的纳米团簇。在之后的研究中，SMLM以更高的精度对SNAP-25和突触融合蛋白的分布进行成像。在这里，描述了Syntaxin簇内的分子密度梯度。dSTORM成像显示，未聚集的分子紧密地定位于聚集区域。最近的一项研究显示了一种以syntaxin或SNAP-25为靶点的像。研究表明，集中在突触前部位的60%的通道是可变的。此外，通过应用BAPTA钙缓冲降低了钙通道的扩散。结果表明，突触小泡和钙通道之间的纳米域偶联保证了神经传递的精确度，并可根据需要通过突触前钙通道的扩散进行精细调节。 在融合和递质释放后，内吞机制诱导循环产生新的囊泡，从而重建可释放的囊泡池并为持续的神经传递提供基础。囊泡循环的主要机制由网格蛋白介导的内吞作用组成。使用光遗传学和”闪光冷冻”电镜的研究也报道了比超快的内吞快200倍的过程。如双色iso-STED显微镜所示，通过摄取针对囊泡内膜结合位点的Syt 1抗体，将内吞位点定位到活性区外周。此外，在神经内分泌细胞中，STED显微镜也揭示了囊泡只能部分与突触前膜融合释放递质，形成一个“Ω”形状的结构，而没有完全融入膜中，因此有利于“接触后即脱离”（kiss and run）的模式。与网格蛋白介导的内吞作用相比，它会产生更快囊泡再循环率的递质释放模型。依赖于活性的大量内吞作用进一步增加了可能涉及的机制的复杂性，有人提出，根据突触类型和活动，多种内吞模式可能并行运作。本文由超高显微技术应用工程师郭连峰、黄梓彤编译

中国医学科学院北京协和医学院药物研究所贺玖明研究员团队以封底文章在《药学学报》英文刊（APSB）2022年第8期（IF：14.903）发表了题为“A temporo-spatial pharmacometabolomics method to characterize pharmacokinetics and pharmacodynamics in the brain microregions by using ambient mass spectrometry imaging”的研究论文，建立了一种时空分辨的代谢组学方法（基于AFADESI-MSI的时空药物代谢组学），可全景式描绘脑中药物代谢和效应的时空特征，为中枢神经系统作用新药研发提供了一种有力的可视化工具和新的视角。　　封底图 | 表征鼠脑中中枢神经药物的微区域药代动力学和药效学的时空代谢组学方法策略和工作流程　　研究背景　　中枢神经系统（CNS）具有复杂而脆弱的结构，在大脑的许多微区域之间具有高度的互连性和相互作用。大脑是人体复杂的器官，可以细分为许多微区域。脑中多种内源性功能代谢物在不同的微区分布不均匀。脑微区的代谢酶、受体、配体、蛋白和血流的功能差异也会导致药物的空间分布和疗效差异。大脑是中枢神经系统疾病的靶点，大多数中枢神经系统药品只有在进入大脑后才会发挥作用。因此了解药物及相关内源代谢物在大脑中的原位分布的信息对于评估药物疗效、毒理学和药代动力学具有重要意义。　　目前研究大脑的常用功能性脑成像技术（包括组织化学标记、免疫荧光、MRI、PET、全身放射自显影等），仅提供脑组织结构的图像，不能在分子水平上进行分析，可监测的物质种类也有限。另一方面，脑内药物分析通常使用的基于组织匀浆或微透析采样的高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）技术获得的结果仅能反映采样微区的平均代谢水平，而缺乏分子在整个大脑中的空间分布的信息。质谱成像技术（MSI）不需要复杂的预处理和特殊的化学标记，具有高通量、高灵敏度和高分辨率的特点，可检测已知或未知小分子代谢物的定性、定量和空间分布信息。　　本研究使用AFADESI-MSI空间代谢组学研究表征了临床中枢神经系统药物奥氮平（OLZ）和大鼠脑内内源性代谢物，并进行了给药期间的时空变化以及脑微区药物动力学和药效学研究，成功地展示了OLZ及其作用相关代谢物的时空特征，并为中枢神经系统药物作用的分子机制提供了新的见解。　　研究思路　　研究方法　　1. 实验分组/研究材料：饲养一周的雄性 Sprague-Dawley 大鼠　　（1） 实验组：4组（3只/组），口服OLZ溶液（50mg/mL）后 20 分钟、50 分钟、3 小时和 12 小时用高浓度乙醚。　　（2） 对照组：1组，3只/组　　2.技术路线　　2.1. 鼠脑的微区划分：15个微区，包括尾状壳核（CP）、大脑皮质（CTX）、海马（HP）、下丘脑（HY）、丘脑（TH）、小脑皮质（CBC）、小脑髓质(CM)、髓质 (MD)、脑桥 (PN)、大脑导水管 (CA)、中脑 (MB)、穹窿 (FN)、梨状皮质 (PC)、嗅球 (OB) 和胼胝体 (CC)。　　2.2 质谱成像：AFADESI-MSI分析（全扫描及MS2扫描）　　2.3代谢物定性：人类代谢组数据库 (www.hmdb.ca)、Metlin、MassBank和LIPID MAPS　　研究结果　　1.通过AFADESI-MSI绘制大鼠大脑中的内源性代谢物和药物图谱　　无论是正离子模式还是负离子模式，使用AFADESI-MSI空间代谢组学均可从治疗组和对照组脑组织切片中获得内源性代谢物信息。在100-500 Da的低质量范围内，可以检测到氨基酸、核苷、核苷酸、有机酸、脂肪酸等极性小分子代谢物和γ-氨基丁酸 (GABA)、肌酸、肉碱、乙酰肉碱和磷脂酰胆碱等神经递质类代谢物；在500-1000 Da的高质量范围内，可以检测到一些脂质，包括鞘磷脂（SM）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）、溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）和磷脂酰肌醇 (PI) 等。原型药物 OLZ 及其代谢物 2-羟甲基 OLZ 在正离子模式下被检测，结果如图1C1和D1所示。这些结果表明，非靶向质谱成像的方法可以在一次实验中同时绘制外源性药物和内源性代谢物的图谱，并可以获得它们的空间分布特征和微区域丰度变化。　　图1 | 使用 AFADESI-MSI 从脑组织切片获得的外源性药物和内源性代谢物的质谱成像结果　　2.鼠脑中奥氮平（OLZ）及其代谢物的时空变化　　OLZ是一种用治疗精神分裂症的药物，大脑是其主要靶器官。本实验为探究给药时间药物在大脑各功能微区的分布情况，分别在给药后20 min、50 min、3 h和12 h收集治疗组和对照组大鼠脑组织进行MSI分析。OLZ 及其代谢物 2-羟甲基 OLZ 的在鼠脑分布结果如图2A所示。　　这些结果表明，OLZ 可以很容易地穿透脑血屏障，主要分散在脑室和脑实质组织中，但并不是均匀分布在大脑的所有微区域中。给药后20分钟发现OLZ主要分布在大脑皮质中。50分钟后，OLZ的水平显著增加。随着时间的推移，大脑中的药物信号迅速下降到成像检测限以下。同时作者发现，2-羟甲基OLZ主要分布在穹窿中，其在各个微区的分布格局与OLZ不同。　　这些结果表明，OLZ药物的吸收、分布和代谢的速率在大脑的不同微区不同，表明微区对药代动力学有影响。它还证明了所提出的基于AFADESI-MSI 的时空药物代谢组学方法能够同时说明药物及其代谢物在大脑复杂微区域中的水平和空间分布的变化。　　图2 | 脑微区OLZ和其代谢产物2-羟甲基OLZ的时空变化　　3.OLZ 对神经递质类代谢物的的微区调控　　OLZ药物治疗精神分裂的作用机制是阻断多巴胺 D2 受体或血清素 2A 受体调节神经递质类代谢物（NTs）。然而OLZ的微区效应和分子作用机制仍不清楚。因此作者分析了与OLZ生理活动密切相关的NTs的时空变化，包括GABA、Glu、谷氨酰胺 (Gln) 和腺苷。NTs的AUC变化率如图3B1-B7所示。　　GABA（γ-氨基丁酸）是中枢神经中的一种神经递质，可抑制神经中枢。空间代谢组检测结果显示GABA（m/z 104.0706）主要分布在下丘脑中，药物干预后下丘脑的 GABA 受到轻微调节。但同时在梨状皮质和嗅球中观察到药物干预后GABA显著上调。Glu 是中枢神经中的一种主要神经递质，对神经细胞具有兴奋作用。在药物干预后，Glu及其代谢物Gln的时空动态模式在脑部微区中呈现出相对一致的变化趋势。腺苷广泛分布在中枢神经系统中，是大脑中的一种兴奋性和抑制性神经递质，并在脑中不均匀分布。并且在给药3小时后海马和下丘脑中的高水平腺苷显著增加，表明当药物积累时腺苷的上调会更加明显。组胺、乙酰胆碱（Ach）、牛磺酸等神经递质类物质都有各自特征的微区分布，以及在给药后具有上调的趋势。　　上述神经递质类物质的靶向成像分析结果表明，该方法可以检测到与中枢神经药物作用机制相关的大量原型药物及其代谢物和内源性代谢物的空间分布和变化。这对于阐明中枢神经系统药物的作用机制和了解精神分裂症及相关疾病具有重要意义。　　　图3 | 药物对脑内NTs分布和AUC变化率的影响　　4. OLZ 药物干预的微区代谢调控　　组织和器官的内源性代谢变化可以反映药物刺激的效果。为探索药物干预后的微区代谢效应，通过药物代谢组学测试研究了内源性代谢物的分子谱及其动态变化的分布信息。分别在OLZ和生理盐水给药后 50分钟采集每组治疗和对照大鼠的三个脑组织样本进行微区域分析。　　OPLS-DA结果表明，基于正离子模式和负离子模式下脑微区的定量分析，对照组和治疗组分别明显分开。总共筛选和鉴定了 90 种差异内源性代谢物，作为药物作用相关效应物,它们在大脑微区域中发挥了巨大作用。其中81种被MS2鉴定，9 种被同位素模式鉴定。差异代谢物包含了很多种类型的代谢物，包括氨基酸、脂肪酸、甘油磷脂、有机酸、多胺和酰基肉碱。　　经过分析确定了治疗组和对照组之间显著差异的七种代谢途径，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、甘油磷脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸生物合成、嘌呤代谢和柠檬酸循环（TCA循环）。下面对影响较大的丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和甘油磷脂代谢的异常代谢途径进行重点分析。　　图4 | 对照组和治疗组中鉴定的差异代谢物的层次聚类分析 (HCA)　　4.1 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢紊乱　　异常的Glu-Gln循环在精神分裂症的病理生理过程中起重要作用。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径代谢物在老鼠脑的时空分布如图5所示。柠檬酸在大脑大部分微区分布均匀；与对照组相比，表达显著提高，结果提示药物干预加速了TCA循环的代谢，为机体提供了更多能量。Glu也均匀分布在各个微区，药物干预后呈下调趋势。它的代谢物Gln 和 GABA，主要在下丘脑和的多个微区中上调。　　根据通路分析和代谢谷氨酸脱羧酶（GAD）酶反应，推测OLZ直接激活GAD促进GABA合成。GABA可增加糖酵解中己糖激酶的活性，从而加速葡萄糖的代谢。空间分布结果表明葡萄糖分布在大脑的所有微区，但给药后主要分布在梨状皮质和嗅球中，给药后20分钟血糖水平显著升高。　　图5 | 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径代谢物的时空分布　　4.2.甘油磷脂代谢途径的紊乱　　甘油磷脂有助于控制肝脏脂质代谢，促进记忆力，增强免疫力，延缓衰老。甘油磷脂代谢途径代谢物的时空分布如图6。这项研究的结果表明，在给药后，大多数脂质在大多数微区域中显示出上调。OLZ在临床应用中具有代谢副作用，如体重增加、血脂异常、高甘油三酯血症和胰岛素抵抗。实验结果证明，脂质代谢的上调可能导致OLZ治疗期间的副作用。　　图6 | 甘油磷脂代谢途径代谢物的时空分布　　相关讨论　　作者开发的时空药物代谢组学方法，使用质谱成像技术MSI来表征大脑中枢神经药物的药代动力学和药效学。结果表明，该方法可有效识别与药物作用相关的内源性分子效应物。评估OLZ药物对脑组织的微区域效应，并证明其穿过血脑屏障后的微区域药代动力学和药效学方面的有效性。该方法清楚地展示了原型药物及其代谢物 2-羟甲基OLZ在大鼠大脑不同微区的药代动力学。也在脑部微区现一些神经递质类物质和其它小分子极性代谢物，并显示出与药物干预相关的多种代谢途径。发现天冬氨酸、谷氨酸和甘油磷脂代谢途径的调节可能与 OLZ 临床使用观察到的治疗和不良反应有关，为了解其作用的分子机制提供了关键信息。　　小鹿　　与基于LC-MS的常规药物代谢组学分析手段相比，基于AFADESI-MSI的时空药物代谢组学技术具有同时检测内源性和外源性物质的静态水平变化，并提供大脑不同微区的动态时间依赖性趋势和空间分布信息的优势，能够非常准确地呈现原位和微区域分子变化规律。在此基础上将药代动力学和药效学与代谢途径相关联，有利于获得关键信息，从而更深入地了解药物作用的分子机制。基于AFADESI-MSI 的时空药物代谢组学技术不仅是阐述中枢神经系统药物的原位药代动力学和药效学全面有效的工具，也可为脑组织内源性代谢物的变化以及其它动物组织的原位代谢研究提供重要信息。　　该研究工作，药物所2017级硕士研究生刘丹为作者，贺玖明研究员为独立通讯作者。工作得到国家自然科学基金和医科院创新工程项目的资金资助。

在生物化学与医药研究领域，L-丙氨酸作为构成人体蛋白质的重要氨基酸，其品质直接影响着其在营养补充、医药合成等应用中的效果。水分含量是评价L-丙氨酸纯度的关键指标之一，过高的水分不仅会影响其稳定性，还可能导致产品质量下降。因此，采用精确的水分测定技术对L-丙氨酸进行质量控制至关重要。本文介绍了一项应用AKF-CH6卡尔费休水分仪测定L-丙氨酸水分含量的实验，展示了该仪器在精细化学分析中的高效与精确性。 精密配置，确保测量准确实验采用的AKF-CH6卡尔费休水分仪，配备了全封闭安全滴定池组件、双铂针电极和隔膜电解电极，这一组合设计确保了在进行水分测定时的高精度与安全性。卡尔费休库仑法试剂的使用，进一步提升了检测的灵敏度，即使微量水分也能准确捕捉。 高效测定流程，优化操作体验实验过程中，通过选择固体样品测试方法，加热温度（150℃）和通气流量（25mL/min），确保样品在适宜条件下充分释放水分。自动电解档位与稳定的搅拌速度（5转/分钟）保证了滴定过程的平稳与高效。操作简便，仅需将称量好的样品放入进样瓶，放置于加热槽中，点击开始测量与穿刺按钮，系统即自动进行测定，大大节省了时间与人力。 数据准确，结果可靠在26.2℃的环境温度与51.1%的环境湿度条件下，测试时间仅为10分钟，显示了AKF-CH6卡尔费休水分仪的高效性。通过三次平行测试，得到了水质量分别为585.67ug、549.09ug和546.22ug，对应测试结果为335.2ppm、322.8ppm和328.4ppm。计算平均值，样品水分含量约为328.8ppm，显示了测定结果的稳定性和高重复性。序号样品量/g水质量/ug测试结果/ppm平均值/ppm10.5927585.67335.2 328.820.5021549.09322.830.4849546.22328.4AKF-CH6卡尔费休水分仪在L-丙氨酸水分含量测定中的应用，不仅展现了其在生物化学领域测定水分的高精度与快速响应能力，还凸显了仪器设计的实用性和操作的便捷性。通过该仪器的精确测定，能够有效控制L-丙氨酸的水分含量，确保其在后续应用中的稳定性和质量，对提升产品品质、促进医药及营养品行业发展具有重要意义。

一项研究发现，胰腺癌细胞通过向神经发出信号来避免饥饿，信号传递给神经，就会分泌营养，促进肿瘤生长。这是一项针对癌细胞，小鼠和人体组织样品进行的实验结果，相关论文发表在11月2日的Cell杂志上。胰腺导管腺癌（PDAC），也就是最致命的胰腺癌，五年生存率低于10％。此类肿瘤会促进压迫血管的致密组织的生长，从而减少诸如丝氨酸之类的血源性营养物质的供应。这种氨基酸是蛋白质的基本组成部分，也是癌细胞增殖所必需的。纽约大学格罗斯曼医学院等处的研究人员发现，饥饿的胰腺癌细胞会分泌一种叫做神经生长因子的蛋白质，该蛋白质向神经细胞发送信号，指导它们进入肿瘤，进一步发现这些轴突能分泌丝氨酸，帮助胰腺癌细胞避免，饥饿并恢复其生长。文章通讯作者，纽约大学Alec Kimmelman博士说，“神经将营养从血液中转移到胰腺肿瘤微环境中，这是一种一种令人着迷的适应能力，也许可以通过干扰这种特性来研发治疗方法。”研究发现，饥饿的丝氨酸胰腺癌细胞利用了将mRNA链（DNA指令的副本）翻译成蛋白质的过程。密码子将mRNA分子链的骨架解码为氨基酸，核糖体会读取每个密码子，让它们以正确的顺序将氨基酸连接在一起，但是如果缺少可用的氨基酸，核糖体就会失速。出乎意料的是，研究小组发现，丝氨酸饥饿的胰腺癌细胞显著降低了六个丝氨酸密码子中的两个（TCC和TCT）被翻译成氨基酸链的速度。在丝氨酸饥饿的情况下，这种变异性使癌细胞将某些蛋白质的产生减至最少（以保持饥饿时的能量储存），但继续建立诸如神经生长因子（NGF）之类的压力适应性蛋白质，而这种蛋白质恰好由少数TCC编码和TCT密码子。之前的研究NGF和其他因素会刺激神经生长成胰腺肿瘤，促进肿瘤生长。而最新研究是第一个表明轴突，即传递信号的神经元细胞的延伸，能通过在营养缺乏的区域分泌丝氨酸来为癌细胞提供代谢支持。一项2016年的研究表明，此类细胞向附近的星状细胞发送信号，导致它们将自己的细胞部分分解为可被肿瘤利用的构件。然后2019年12月进行的一项研究发现，胰腺癌细胞还劫持了一个称为巨胞饮作用的过程，正常细胞利用该过程通过其外膜吸收营养。有趣的是，这项新研究发现星状细胞和巨胞饮作用不能为这些癌细胞提供足够的丝氨酸生长，还是需要轴突递送。这项研究指出，喂食无丝氨酸饮食的PDAC肿瘤小鼠的肿瘤生长速度降低了50％。为了超越单纯饮食所能达到的效果，研究人员还使用美国FDA已经批准的一种名为LOXO-101的药物来阻止轴突进入PDAC肿瘤。该药物阻断与神经生长因子（也称为TRK-A）相互作用的神经元表面受体蛋白的活化，从而抑制神经元将其轴突送入肿瘤的能力。这组作者说，仅使用这种药物并不能减慢小鼠中PDAC肿瘤的生长，但是与单独使用饮食相比，与无丝氨酸饮食结合时，它可以使PDAC的生长速度进一步降低50％。研究人员说，这表明神经对于支持丝氨酸剥夺的肿瘤区域中的PDAC细胞生长是必要的。文章一作Robert Banh说：“由于TRK抑制剂已被批准用于某些癌症的治疗，因此在手术后大约40％不能产生丝氨酸的PDAC肿瘤患者中，它们可能与低丝氨酸饮食联合，这种方法是否可以通过限制营养供应来减少肿瘤复发，还需要在临床试验中证实。”

近日，中国科学院大连化学物理研究所生物分离分析新材料与新技术研究组研究员叶明亮团队和上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心研究员刘聪团队合作，将硼酸化学引入到甲基化蛋白质组分析方法中，并巧妙利用精氨酸残基上不同修饰基团的位阻差异，实现高效的精氨酸二甲基化肽段富集，显著提高了蛋白质甲基化的分析能力；利用此新方法，系统分析了蛋白质分相过程中精氨酸二甲基化的变化，揭示了此类修饰的发生会降低蛋白质的分相能力。　　蛋白质精氨酸甲基化是一种调控蛋白质功能的重要翻译后修饰，与较多疾病的发生发展相关。研究表明，精氨酸二甲基化会影响一些神经退行性疾病相关蛋白的液-液相分离，以及相分离所驱动的无膜细胞器的产生。然而，受限于目前精氨酸二甲基化蛋白质组分析技术覆盖率不足，这类研究仅聚焦于少数几个蛋白，尚未系统性探究精氨酸甲基化对蛋白质相分离的影响。　　本研究发现，不同甲基化修饰的精氨酸残基在与邻二酮类化合物反应时，由于位阻不同，反应活性差异巨大。合作团队据此设计了一种精氨酸二甲基化肽段的富集方法：先利用环己二酮选择性的封闭无修饰精氨酸残基，随后利用丙酮醛选择性的在二甲基化精氨酸残基上修饰顺式邻二羟基，从而使得硼酸材料可以选择性的富集精氨酸二甲基化肽段。相比传统的免疫亲和富集方法，该方法拥有较强的精氨酸二甲基化肽段富集能力，特别是在鉴定RG/RGG序列上的精氨酸二甲基化位点方面有更高的灵敏度。合作团队将该方法应用于分析蛋白质相分离过程中精氨酸甲基化的变化，发现包括G3BP1，FUS，hnRNPA1、KHDRBS1在内的一些与无膜细胞器或神经退行性疾病相关的蛋白质上的精氨酸二甲基化程度发生了显著变化；系列实验验证发现，精氨酸甲基化会显著降低这些蛋白质的分相能力，且上述蛋白质组分析中鉴定到变化的甲基化位点是调控蛋白质相分离的关键因素。本工作开发了基于化学反应的精氨酸二甲基化蛋白质组分析方法，并利用这一方法揭示了精氨酸二甲基化对蛋白质液-液相分离具有重要的调控作用。　　叶明亮团队致力于蛋白质磷酸化、糖基化、甲基化等翻译后修饰分析新方法的研究，发展了基于可逆酶促化学标记的O-GlcNAc糖肽无痕富集方法，克服了标记基团对糖肽质谱检测的干扰，实现了O-GlcNAc糖基化的高灵敏分析（Angew. Chem. Int. Edit.）；利用不同糖肽的同一肽段骨架具有相似碎裂规律的特点，发展出基于“模式识别”的肽段序列鉴定新方法，实现了谱图拓展，显著提高了N-链接位点特异性糖型的鉴定灵敏度，并可发现未知的糖链及糖链修饰（Nat. Commun.）。　　相关研究成果以Global profiling of arginine dimethylation in regulating protein phase separation by a steric effect-based chemical-enrichment method为题，发表在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、大连化物所创新基金等的支持。

为什么我们会感觉到饥饿？为什么进食之后会出现饱腹感？我们能感知到大脑与肠道的紧密联系，以往的研究认为这种感知与触觉、视觉、声音、气味和味觉通过受神经支配的上皮传感器细胞传递到大脑不同，肠道刺激的感知被认为涉及消化系统和中枢神经系统之间信号传递的肠道-大脑连接（gut-brain connection）是以激素转运为基础的，这种基于激素的信号传递大约需要10分钟。在肠道中，有一层上皮细胞将腔与下面的组织分开。分散在该层内的是称为肠内分泌细胞的可电兴奋细胞，它们感知摄入的营养物质和微生物代谢物。与味觉或嗅觉受体细胞一样，肠内分泌细胞在存在刺激时会激发动作电位。然而，与其他感觉上皮细胞不同，肠内分泌细胞和脑神经之间没有突触联系的描述。人们认为这些细胞仅通过激素（如胆囊收缩素）的缓慢内分泌作用间接作用于神经。尽管它在饱腹感中起作用，但胆囊收缩素的循环浓度仅在摄入食物后几分钟达到峰值，并且通常在用餐结束后。这种差异表明大脑通过更快的神经元信号感知肠道感觉线索。来自美国杜克大学医学院的科学家们，利用Milo，揭示迷走神经（vagus nerve）可直接连接着肠道与中枢神经系统。相关研究结果发表在Science期刊上，标题为“A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction”。Milo单细胞Western Blot 验证肠分泌细胞存在神经突触相关蛋白本文使用与小肠类器官或纯化的肠内分泌细胞共培养的结节神经元，在体外重现了神经回路。并结合单细胞定量实时聚合酶链反应和单细胞Western Blot（Milo）共同对突触蛋白进行检测和评估。利用Milo在蛋白水平进行了进一步的验证：单细胞蛋白质印记结果显示83%肠内分泌细胞含有synapsin-1（分析的198 CckGFP细胞中的164个），与其他肠上皮细胞相比，纯化的CCK-肠内分泌细胞表达突触粘附基因Efnb2、Lrrtm2、Lrrc4 和 Nrxn2，表明这些上皮传感器具有形成突触的机制。为了确定与肠内分泌细胞接触的突触的神经元的来源，本文使用了一种改良后的狂犬病毒(DG-rabies-GFP，能感染神经元，但缺少跨突触传播所需的G糖蛋白)，发现在肠道类器官中，狂犬病比其他上皮细胞更喜欢感染肠内分泌细胞。并且肠内分泌细胞与迷走神经元突触，通过使用谷氨酸作为神经递质，在几毫秒内转导肠腔信号。这些突触连接的肠内分泌细胞（神经足细胞）形成的神经上皮回路通过一个突触将肠腔与脑干连接起来，为大脑打开一条物理管道，以突触的时间精度和空间分辨率感知肠道刺激。也正是这些突触信号神经足细胞告诉大脑肠道中发生的事情，对我们吃的食物做出一定的反馈。

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，我们将分三期陆续介绍。本期介绍第一部分。1. 背景介绍成像技术是推动生命科学几乎所有学科基础研究的核心平台。在神经科学领域，近几十年来，共聚焦显微镜技术已成为分析神经组织的标准荧光成像技术。激光扫描共聚焦显微镜对固定的神经元样本进行观察，在扫描水平上提供了三维和多色图像并使单个细胞达到树突结构的分辨率。作为补充，电子显微镜（EM）用于获取神经元和亚区室超微结构的信息，并用于大脑的连通性分析。EM非常适合于神经元突触和囊泡、细胞器和膜构象的结构分析。然而，由于靶向特异性标记方法的局限性，基于EM的复杂样品中蛋白质和特定电子密度特征的识别受到限制。为了进一步理解神经元功能，包括双光子显微镜在内的几种活体视频显微镜应用的发展使神经元细胞培养的活细胞成像、器官型切片培养和动物模型的活体成像成为可能。同时，新的荧光染料、功能探针和荧光蛋白以及光遗传学方法和光驱动（如笼状化合物）不仅可以表征神经元，还可以操纵神经元及其从单分子水平到整个神经系统的相互作用。然而，荧光显微图像中可见细节的水平，即图像分辨率，仍然受到衍射极限的限制。一个多世纪以来，由λ/2NA定义的阿贝衍射极限（λ为波长，NA为显微镜物镜的数值孔径）决定了光学显微镜的分辨率极限，限制了两个位置小于200纳米的细节分辨。在过去的二十年中，超分辨显微镜（SRM）已经发展成为一种非常有效的亚细胞水平荧光成像和分辨细胞器结构的研究手段。SRM现在可以提供远低于常规光学显微镜衍射极限的空间分辨率，从而能够深入了解神经元细胞和组织中蛋白质的空间结构和相互作用。本文综述了超分辨显微镜和荧光标记方法及其在神经科学中的成功应用。我们将首先详细介绍各种SRM方法的基本原理、新的功能型荧光探针和标记技术。接着，我们将回顾SRM如何有助于我们理解神经元亚细胞结构和功能以及神经元−胶质细胞相互作用。此外，我们将概述超分辨率成像方法如何帮助研究自身免疫和神经退行性疾病的病理生理学。最后，我们将介绍这些新的成像方法是如何应用于神经精神疾病相关的人类样本的分析。由于该领域持续快速发展，我们最多只能代表一份中期报告。进一步的创新和新的显微镜方法的发展将使人们对神经系统功能有更详细的了解。 2. 神经科学中的超分辨率成像方法2.1. 光学衍射极限及其对神经科学的影响人类大脑包含超过800亿个神经元，每个神经元由数千个突触连接。因此，它构成了复杂神经元网络。这些网络的主要组成部分，例如突触神经末梢，显示的空间维度接近于光学衍射极限分辨率∼200 nm。释放递质的突触活性区（突触前细胞基质的特化区）的直径通常约为300±150 nm。突触小泡作为递质运输和释放的关键元件，其尺寸平均小10倍，直径为40−50nm。这些递质被释放到宽度为20-50nm的突触间隙中−再结合突触后受体。由于衍射极限的尺寸限制，胞吐机制和跨突触信号在传统的光学显微镜下基本上是无法观测到的，因此需要用提高10倍分辨率的方法进一步研究。（图1）。图1. 兴奋性突触结构组成。左图为兴奋性突触的油画示意图，右图为左图的灰度图像，其中浅紫色圆圈为衍射极限光斑；玫红色圆圈为兴奋性突触囊泡，约40-50nm；绿色为突触后膜AMPA受体，尺寸小于10nm；黄色部分为突触间隙，约20-30nm。 此外，大量参与突触信号传导的不同的分子，位于极小的突触内，造成很高的分子分布密度，这对微观研究具有挑战性。例如，对于较小的突触，兴奋性突触可以包含数百个小泡，对于大型苔藓纤维束突触，可以包含数千个小泡，每个小泡包含多达1万到10万个递质分子。在这些囊泡中，约有10±5个与释放部位对接，释放的递质平均与0−20 个NMDA受体和0−200个AMPA受体结合，而这些突触后受体又被320±130个突触后PSD-95密度蛋白分子环绕。由于加速电子的波长要短得多，因此EM是唯一能够解析突触纳米级结构的方法。然而，虽然传统的EM产生的电子密度图像具有极好的超微结构分辨率，但需要进行固定和靶向特异性标记的制样方法在很大程度上限制了蛋白质识别和神经元追踪。荧光显微镜可以很容易地对蛋白质进行选择性标记，但是受制于可见光的衍射（400−700 nm）使生成的图像无法实现对纳米结构的分析。 2.2.绕开光学衍射极限的光学显微镜方法 20世纪后期，人们开发了新的策略，通过利用物理或化学手段来区分不同荧光团的发射或减少同一时间荧光分子的数量，以尽量绕过衍射极限。减少荧光团的点扩散函数（PSF）的重叠可以通过生成光图案在集合级别以确定性方式进行，或者通过减少同一时间荧光团的数量在单分子水平上以随机方式进行。在下文中，我们将从确定性集合方法开始介绍，该方法将激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）的有效空间分辨率推到理论极限。2.2.1. 确定性集合超高分辨率成像方法（Deterministic Ensemble SR-Imaging Methods） CLSM用针孔探测器阵列替换单点探测器，空间分辨率可以提高√2倍。CLSM测量每个扫描位置探测器每个点的荧光信号。在应用适当的算法后，生成分辨率提升的图像。这些所谓的像素重分配方法包括图像扫描显微镜（ISM）、重扫描共聚焦（RSC）、光学光子重分配（OPRA）、AiryScan和即时结构照明显微镜（iSIM）。对于信号检测，使用了诸如CCD相机、光电倍增管阵列、单光子雪崩二极管阵列和六角光纤束等探测器阵列。结构照明显微镜（SIM）在光路中插入光栅，产生与样品干涉的相干光束，生成横向和轴向方向不同的新照明图案。然后可以使用傅里叶变换提取这种新照明图案的信息，从而在所有三维空间中实现空间频率分解和分辨率倍增。SIM对样品制备的要求最低，并且可使用所有常规荧光探针，这些探针具有最低的光稳定性，并且可以很容易地扩展到多色成像。然而，当记录三维或长时间成像时，强烈建议使用光稳定性更高的荧光团。此外，SIM使用更低的激发强度，因此是活细胞SR实验的理想选择。为了获得更高的分辨率，引入了通过图案化饱和或荧光激发或图案化耗损光开关染料的非线性SIM（NL-SIM）。然而对染料开关特性的苛刻要求限制了NL-SIM在常规生命科学实验中的适用性。非线性SIM单位时间内还需要采集更多的图像，因此实际上仅限于2D成像。另一方面，掠入射（GI）-SIM显示了高达每秒266帧的快速超分辨率成像以及100nm分辨率，揭示前所未有的细胞器动力学细节。结构照明的局限性在于其对波长的普遍依赖性、与其他SR成像技术相比的低分辨率以及对系统稳定校准的需要。最后，后处理需要进行先验质量检查以避免伪影,例如由于高背景信号或不充分标记产生的低对比度图像导致的人工蜂窝图案。通过受激发射耗损(STED)显微镜进行超分辨率成像是一种实现更高空间分辨率的成像方法。这里，高斯分布的激发激光束被中空的甜甜圈样的耗损激光束覆盖，使扫描点外围的荧光团返回基态，这导致纳米级焦点区的直径与耗损光束的强度成反比，耗损光束的强度直接转换为STED显微镜的分辨能力：上图公式中λ为波长，n为折射率，α为物镜的收集角，ISTED为STED光束的照射强度，IS为饱和强度。因此，可以通过改变损耗激光强度来调整分辨率，可定制设计分辨率达30−80nm 的显微镜。STED显微成像可通过连续或脉冲激光激发、门控检测。带有脉冲激光的STED显微镜会降低激发能量，从而减少实时成像中的光毒性效应。STED显微镜中的时间门控检测可以去除荧光团光子到达时间前的空间信息，并且可以在较低的平均功率下工作。商品化STED能提供用户友好的高分辨率成像，无需进一步的数据后处理。活体成像，例如活体树突棘动态成像已经很成熟，但快速动态成像仅限于小帧尺寸，因为它仍然是点扫描方法，高激光强度可能会导致光损伤。STED通过应用自适应照明方式Dymin和rescue技术，可以明显减少光损伤。在Dymin STED中，在共聚焦模式下扫描时确定最低可能的STED光束强度。根据样品的标记密度，这将使STED光束强度降低20到100倍。Rescue STED同样通过减少STED激光开放的区域，从而比普通STED减少光漂白接近8倍。STED的另一个限制是对荧光团光稳定性的依赖，因为在高激光强度下会发生明显的光漂白。这影响了动力学的研究和三维图像的获取。值得注意的是，最近通过使用荧光团标记的寡核苷酸（瞬时结合到连接靶蛋白结合探针的互补寡核苷酸）或非结合荧光团来进行细胞STED成像，从而绕过了STED光漂白问题。这两种方法中，基于DNA互补标记的STED成像和超分辨率阴影成像SUSHI分别通过荧光团标记的寡核苷酸和高浓度的非结合和自由扩散的荧光团不断交换来防止光漂白。SUSHI的方法已经成功地用于活体脑片中细胞外间隙和神经肽的结构解析及其动力学的STED成像。如果使用具有毫秒或更长寿命的两种稳定状态的可逆切换荧光团来代替标准荧光团，则STED强度可以显著降低。可逆饱和切换光学线性荧光转换方法（RESOLFT）已通过可逆可切换荧光蛋白（reFPs）实现，并成功应用于活体海马脑片树突棘的超分辨率成像。2.2.2. 随机单分子SR成像方法（Stochastic Single-Molecule SR-Imaging Methods）上述的确定性方法是通过改变激发模式或相位掩膜来暂时控制荧光发射达到超分辨成像，而基于单分子的定位SR显微镜则是随机地在时间上分离单个荧光团的发射。单分子定位显微镜（SMLM）基于单个荧光团的随机激活，使用配备高灵敏相机（EMCCD或sCMOS）的宽场荧光显微镜进行单分子检测，以及精确的位置测定。通过将理想PSF与实际测量的光子分布拟合来进行分子定位。只要信号来自单个发射区，且单个发射区之间的距离大于显微镜能分辨的最小距离，则通过收集更多光子和最小化噪声，定位的标准误差可以任意小。激活和定位过程重复多次，所有定位最终用于重建超分辨率图像。为了确保在成像的任何时候，只有稀疏的小荧光团以其活性荧光形式存在（开启状态），使用了光开关、光转换、光激活或自发闪烁的荧光团。由于定位精度和最终图像分辨率取决于每次检测到的光子数量，通常采用明亮且稳定的荧光团与1 kW/cm2的辐照强度相结合的方式。根据所使用的荧光团不同，SMLM可达到10−50 nm横向分辨率。光激活荧光蛋白（FPs），自2006年以来已用于光激活定位显微镜（PALM），例如在405 nm的激光照射下可从关闭状态不可逆地转换为打开状态的PA-GFP和PA-mCherry 以及可通过适当波长的激光照射从一种波长状态不可逆地转移到另一种波长状态的光转换FPs，例如MEO。此外，还成功地应用了诸如Dronpa之类的光开关FPs，其在不同激发波长的激光照射下可在非荧光和荧光状态之间可逆地切换。对于活细胞应用，使用荧光蛋白的PALM是首选方法。因为在理想情况下，每个感兴趣的蛋白质都可以用荧光蛋白进行计量标记。然而，荧光蛋白比有机染料表现出更低的光稳定性和光子计数，从而降低了定位精度，并且通常需要更长的采集时间。此外，对于PALM成像而言，融合蛋白通常会过度表达，这可能会导致不真实图像，而用转基因变体替代显示野生型表达和功能的自身蛋白仍然具有挑战性。对于细胞内源性蛋白质的标记，通常使用有机染料的免疫标记。SMLM适用的有机染料必须是光开关、光激活或自发闪烁的，以实现单个染料发射的时间分离，但化学计量标记要困难得多。有机染料通常表现出较高的光子计数和光稳定性，从而使定位精度达到5−10nm。花菁染料Cy5和Alexa Fluor 647可以在荧光开启状态（其典型寿命为10 ms）和非荧光关闭状态（寿命为几秒，利用光开关缓冲液，缓冲液包括PBS，10−100mM硫醇，如ß-巯基乙缅（MEA），酶促氧清除剂，可以有/没有激活染料）之间可逆切换，为随机光学重建显微镜（STORM）和直接型STORM（dSTORM）的发展铺平了道路。近年来，应用于（d）STORM的染料已大大扩展，除了菁染料外，还包括罗丹明和恶嗪染料。有趣的是，最近的研究表明，即使是多个标记的抗体在光开关缓冲液中也呈现出类似于单发射的表现，因此适用于dSTORM实验。光活化染料的作用与光活化荧光蛋白相似。也就是说，它们在被光照射或自发激活之前处于非荧光状态。罗丹明衍生物PA-JF549和PA-JF646以及桥环菁染料Cy5B是已成功用于SMLM的光活化染料。此外，在没有光开关缓冲液的水溶液中，硅罗丹明HMSiR等自发闪烁染料也能应用于SMLM。最近，通过图案化照明方式实现更高的定位精度，单个荧光发射区的定位得到了改进。定位精度取决于信号的大小和强度，可以通过测量的PSF标准偏差的平方除以收集的光子数来估计。然而，包括拟合性能、标记密度、标记误差和显微镜漂移在内的其它参数决定了高定位精度是否可以转化为低于10 nm的空间分辨率。此外，到目前为止，因为SMLM方法成像需要昂贵的仪器和成像者具备广泛的专业知识，这在一定程度上阻碍了其广泛应用。2.2.3. SMLM-点累计纳米成像技术（PAINT，Point Accumulation for Imaging Nanoscale Topography）第一代SMLM技术依赖于荧光团的光开关和光激活，其分辨率需要有效地利用荧光团发出的光子数，而PAINT(point accumulation for imaging nanoscale topography)方法使用活的，与目标区域结构短瞬结合的染料。在成像过程中，被漂白的荧光团可以被成像介质中充足的新鲜荧光团不断置换替补。由于游离染料在采集单个图像帧期间在多个像素上快速扩散，因此它们仅显示为模糊背景且不能准确定位，而结合染料显示为PSF且能准确定位。因此PAINT的第一种方法是将荧光染料（如尼罗红）与细胞膜进行非特异性结合，然后进行光漂白和新的结合。此外，基于蛋白质片段的探针被用于单分子定位标记。在最近的一个研究中，将这种方法与传统的基于phalloidin的肌动蛋白标记方法进行了比较。通过引入通用PAINT（uPAINT）使Ni-Tris-NTA与转基因蛋白质上表达的His-Tags更特异结合，并可用于突触间隙成像。uPAINT也可以应用于其它标记方法，如免疫标记（内源性蛋白抗体、纳米抗体如绿色荧光蛋白）或受体配体结合。为了提高PAINT的适用性和特异性，引入DNA-PAINT方法。它使用长度小于10个核苷酸的短的可控的寡核苷酸链（成像链）瞬时标记其靶结合互补寡核苷酸链（对接链）。成像链与对接链的瞬时结合产生明显的闪烁。因此，荧光团开-关状态之间的切换与其光物理性质不直接关联。DNA-PAINT首先在DNA折纸（DNA-origami）上得到验证。DNA折纸是一种自组装的DNA结构（具有已知的大小），通过侧链和荧光团进行结合，并通过宽场显微镜观察。总的来说，DNA-PAINT是一种易于实现的SR成像标记方法，无需特定光物理特性的荧光团。因为探针可以在一轮结合后，从成像介质中置换补充荧光团，从而避免了光漂白。DNA-PAINT的缺点是图像获取时间长，这是由成像链与对接链的结合和解离速率决定的，以及荧光成像链的纳摩尔浓度引起的背景信号。尽管通过使用优化的DNA序列和缓冲条件，以及使用串联的周期性DNA结构域或通过短肽的卷曲螺旋相互作用（称为“Peptide-PAINT”），可以加快采集速度，但还是要利用全内反射荧光（TIRF）（仅限于对靠近盖玻片结构进行成像的特点），才能更好地减少成像链的背景信号。另一方面，基于DNA的探针提供了序列成像复用的明显优势，如Exchange PAINT中所述，已成功用于小鼠视网膜切片中多个结构的成像（图2）。Exchange PAINT的概念也被推广到dSTORM、STED、SIM和更传统的衍射限制的宽场和共聚焦荧光显微镜。最近，通过一种称为PRISM(probe-based imaging for sequential multiplexing)的基于DNA-PAINT的成像方法，实现了高达10个神经元蛋白质的分辨率约为20nm的多通道成像。该方法使用了低亲和力成像探针，该探针与突触、肌动蛋白和微管一抗上的对接链结合。图2 原代神经元中多个神经元靶点的多标Exchange-PAINT成像。（A）DNA-PAINT顺序成像的四种突触蛋白的超分辨图像：圆圈表示漂移校正的基准点；（B）为（A）中不带*的感兴趣区域的高放大倍率图和超分辨图像。（C）为（A）中带*的感兴趣区域的超分辨结果及单通道图像。2.2.4. 定量SMLM如果每个目标分子都可以单独标记和定位的话，与所有其他超分辨率成像技术相比，SMLM还可以提供有关分子分布和分子绝对数的单分子信息。然而，内源性蛋白质的定量免疫标记仍然是一个挑战，并且多标记抗体的不同定位数目也会使数据解释复杂化。另一方面，达到内源性表达水平比较困难，另外FPs蛋白成熟缓慢也同样会令定量化困难。然而，可以通过设计专门的对照实验估计拷贝数，并提取出有关生物目标结构分子的真实信息。借助合适的算法，SMLM可以提供有关拷贝数、聚类、共定位和复杂化学计量的数据，用于定量模型的生成和模拟。此外，还可以通过将突触结构信息与其功能关联来实现量化，例如膜片钳神经元的生物细胞素标记。例如，通过对链霉亲和素标记后膜片钳神经元进行STORM成像，结合CB1受体的免疫标记，然后在GABA能的海马轴突终端内定量，研究了内源性大麻素信号。本研究发现，与树突投射型中间神经元相比，胞周投射型中间神经元具有更高的CB1受体密度和更复杂的活动区。通过免疫标记和dSTORM研究了黑腹果蝇神经肌肉连接处内源性Bruchpilot（Brp）分子的数量。利用抗体滴定实验，确定了野生型神经肌肉连接处活性区细胞基质中Brp蛋白的数量为137个，其中四分之三以约15个七聚体簇状排列结合从相同组织样本记录的电生理数据，研究Brp如何组织控制活动区功能。利用DNA纳米结构作为校准，每个活性区Brp蛋白的数量估计通过定量DNA-PAINT（qPAINT）实验证实。此外，定量dSTORM实验表明，每个活性区Brp蛋白的数量和分布受突触标记蛋白-1的影响，这说明突触活性区递质释放的复杂性。在最近的一项研究中，使用Alexa Fluor 532和Alexa Fluor 647免疫标记的双色dSTORM已用于小鼠小脑平行纤维活性区中代谢型谷氨酸受体4（mGluR4）的定量研究（图3）。该研究还使用抗体滴定实验估计每个活性区平均包含约35个mGluR4分子，并排列在小纳米结构中。此外，mGluR4通常在munc-18-1和CaV2.1通道附近被发现，这支持了mGluR4与这些蛋白质相互作用以调节突触传递的观点。图3小鼠脑片中代谢型mGluR4受体定位定量双色dSTORM。上图：mGluR4和Bassoon免疫染色的小脑冠状切片的dSTORM图像，作为活性区参考。与宽场显微镜结果的比较。（A）DBSCAN聚类算法定义了近距离的En face活性区表面积（灰色）和mGluR4信号（品红）。（B）活性区大小的频率分布直方图（C）mGluR4信号到突触和突触外区域的映射。（D）通过Ripley H函数分析评估Bassoon和mGluR4的聚集分布。与随机分布的分子（蓝色、灰色）进行比较。虚线表示Ripley分析的最大值。这些研究显示了定量SMLM在神经科学研究中的潜力。可以预见，定量SMLM的进一步发展将为突触前和突触后蛋白质的功能关系，及其组织和结构的研究提供更有价值的信息。2.2.5. 组织三维（3D）SMLM虽然SMLM方法实现了仅几纳米的非常高的水平定位精度，但它需要特殊的方法来打破图像平面上方和下方PSF的对称性，来实现高轴向定位精度。实现高轴向定位精度的两种方法是PSF重塑和多焦面检测，通常用于在3D中精确定位荧光团。在SMLM中最常用的方法是通过在成像路径中插入单个柱面透镜从而不对称地扭曲PSF，利用光学像散原理来实现三维定位。基于像散方法的3D dSTORM技术还可以与光谱拆分相结合，对COS-7细胞中的网格蛋白表面小窝成像。像散引起的畸变程度由荧光团的轴向位置决定，因此可用于轴向位置计算。例如，3D散光SMLM已用于确定抑制性突触后密度区gephyrin蛋白和受体复合物的分布和拷贝数，或突触前活动区和突触后密度区各种成分的空间关系。采用双物镜像散成像方案，通过3D SMLM研究组织中肌动蛋白、血影蛋白和其他相关蛋白的结构，发现这些蛋白在轴突中形成190nm的周期性环状结构。替代方法包括使用相位掩模、变形镜实现双螺旋、四足或鞍点PSF重塑，和双焦面成像方法实现更大的轴向范围，并已成功应用于不同的应用中。为了在2D和3D中定位单个荧光发射区，已经开发了不同的算法和软件工具。在最近的一次综述中，列出了不同3D SMLM方法获得的水平和轴向分辨率，以供比较高30倍。此外，使用NHS染料对所有蛋白进行标记，然后进行迭代ExM，可以对高蛋白密度的结构或细胞器（如线粒体），实现与EM相比具有更高对比度的超微结构细节。为了在分子尺度上进行成像，ExM与SMLM方法（如dSTORM）相结合是一个理想的选择。然而在含有硫醇和盐的传统光转换缓冲液中，会发生荷电氢凝胶收缩。可通过使用低离子强度缓冲液或加入中性溶液使凝胶稳定以避免收缩。另一种策略是使用自发闪烁的荧光团（如HMSiR）在水中进行SMLM。通过Ex-dSTORM实现分子分辨率的关键是膨胀后标记，这增加了表位可及性，从而提高了标记效率并减少了标记错误。Ex-dSTORM超分辨成像已成功应用于原代细胞和神经元中微管和中心粒结构的解析。

瓜氨酸化是影响蛋白质结构和功能的关键的翻译后修饰。尽管它与各种生物过程和疾病发病紧密相关，但由于缺乏有效的方法来富集、检测和定位该翻译后修饰，其潜在机制仍然知之甚少。近期，威斯康星大学麦迪逊分校李灵军教授课题组报道了生物素硫醇标签的设计和开发，该标签能够通过质谱法对瓜氨酸化进行衍生化、富集来实现可靠的鉴定。作者对小鼠组织的瓜氨酸化蛋白质组进行了全局分析并且从432种瓜氨酸化蛋白质中识别出691个修饰位点，这是迄今为止最大的瓜氨酸化数据集。作者发现并阐述了这个翻译后修饰的新的分布和功能并且表示该方法有希望为进一步破译瓜氨酸化的生理和病理作用奠定基础。这项工作以“Enabling Global Analysis Of Protein Citrullination Via Biotin Thiol Tag-Assisted Mass Spectrometry”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上 (https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c03844)，文章作者为Yatao Shi#, Zihui Li#, Bin Wang#，Xudong Shi , Hui Ye, Daniel G. Delafield, Langlang Lv, Zhengqing Ye, Zhengwei Chen, Fengfei Ma，Lingjun Li*。此外，李灵军教授课题组进一步拓展了此方法的实用性。作者通过应用二甲基化亮氨酸(DiLeu)等重标记策略第一次实现了瓜氨酸化的高通量定量研究，并利用这一方法揭示了瓜氨酸化在人体细胞DNA损伤及修复过程中的重要作用。相关成果以“12-Plex DiLeu Isobaric Labeling Enabled High-Throughput Investigation of Citrullination Alterations in the DNA Damage Response”为题同样发表在Analytical Chemistry上(https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c04073)，文章作者为Zihui Li, Bin Wang, Qinying Yu, Yatao Shi, Lingjun Li*。　　研究的主要内容　　作者设计了一种生物素硫醇标签，它可以很容易的以低成本合成并且可以与瓜氨酸残基和2,3-丁二酮发生特异性反应(图 1a)。这种衍生化不仅增加了质量转移以允许更可靠的鉴定，而且还引入了生物素部分，使修饰分子的后续富集成为可能。该生物素硫醇标签设计具有紧凑的结构，在高能碰撞解离 (HCD) 期间仅产生两个碎片/诊断离子(图 1b)。 因此，肽主链可以保持良好的裂解效率，并在 HCD 或电子转移解离 (ETD) 期间分别产生丰富的b/y或c/z离子系列。在 HCD(图 1c)、ETD或电子转移/高能碰撞解离(EThcD)碎裂下，衍生化肽标准品的序列收集质谱图几乎完全覆盖相应的肽序列。实验结果表明生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸化肽可以产生用于解析及标注的高质量的串联质谱图，并且与各种裂解技术相结合时可以提高瓜氨酸化位点的识别可信度。　　图1|用于瓜氨酸化分析的生物素硫醇标签设计。a，使用生物素硫醇标签和 2,3-丁二酮对瓜氨酸肽进行衍生化。 b，HCD、ETD 或 EThcD 片段化后生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸化肽的片段化位点。c，HCD裂解后生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸肽标准品 SAVRACitSSVPGVR 的串联质谱图。　　在接下来的实验中作者使用该生物素硫醇标签和基于质谱的自下而上的蛋白质组学方法对瓜氨酸化进行分析(图2a)。作者在体外利用 PAD(一种可以催化瓜氨酸化的酶)催化的人组蛋白 H3 蛋白来验证这个过程。作为未被PAD催化的阴性对照，未发现组蛋白的肽段被鉴定为瓜氨酸化，证明了生物素标签反应的高特异性(图 2b)。在体外 PAD 处理后，作者 发现许多精氨酸残基被催化为瓜氨酸，并且大量的位点被高可信度的鉴定为瓜氨酸化位点(图 2c)，进一步表明该方法的高效性。在 HCD 碎裂后，其产生了一系列丰富的 b/y 离子，可以帮助准确的表征在同一肽段上单个(图 2d)以及多个(图 2e)瓜氨酸化位点。　　图2|使用生物素硫醇标签进行体外瓜氨酸化分析。a，使用生物素硫醇标签进行蛋白质瓜氨酸化分析的实验工作流程。b、c，在体外 PAD 处理之前 (b) 和之后 (c) 组蛋白 H3 蛋白的瓜氨酸化分析。 已识别的瓜氨酸化位点在序列中以蓝色字母突出显示。 序列下方的红色矩形表示鉴定的瓜氨酸化肽，而瓜氨酸化位点以蓝色显示。 d，PAD处理的组蛋白 H3 (R64Cit) 的已鉴定瓜氨酸化肽的串联质谱图示例。 e，PAD 处理的组蛋白 H3 的同一肽上鉴定的两个瓜氨酸化位点(R70Cit 和 R73Cit)的串联质谱图示例。　　接下来，作者们尝试利用所开发的方法对复杂的生物样本中的瓜氨酸化进行全局分析，并希望能够以此提供阐明生物体中瓜氨酸化调节机制的依据。首先，作者对小鼠的六个身体器官和五个大脑区域进行了深入的瓜氨酸组分析，生成了第一个小鼠瓜氨酸组组织特异性数据库。作者从432种瓜氨酸化蛋白质中以高置信度的方式鉴定了691个瓜氨酸化位点(图 3a)。更重要的是，这些蛋白质中约有 60% 未曾在UniProt 数据库检索并被报道，这一结果极大地扩展了对瓜氨酸化以及这些底物蛋白质如何受到瓜氨酸化影响的理解。作者发现结果中与 UniProt 数据库的已知的瓜氨酸位点重叠部分较少(图 3b)，这可能是因为 UniProt 中描述的近 40% 的瓜氨酸化位点是基于相似性外推理论而没有实际的实验证据。此外，许多报道的位点位于组蛋白上，尤其是蛋白质末端，可能会逃过自下而上质谱策略的检测(图 3b)。图 3c 展示了单位点瓜氨酸化和多位点瓜氨酸化蛋白质分布情况，其中 70% 的已鉴定蛋白质仅有一个瓜氨酸化位点被检测到。　　这个新发现的瓜氨酸化蛋白质组为推测瓜氨酸化的调控机制提供了宝贵的资源。例如，作者在髓鞘碱性蛋白(MBP)上鉴定到了九个瓜氨酸化位点，而在 UniProt 数据库中只有四个(图3d)。作者的结果提供了高质量的串联质谱图，不仅证实了已知修饰位点的存在(图3e)，而且还高可信度的识别了未知的位点(图 3f)。然后作者进行了瓜氨酸化肽段的序列分析，发现在鉴定的瓜氨酸化位点两侧并没有高度保守的氨基酸序列模式(图3g)，但是谷氨酸残基更频繁地出现在瓜氨酸的N末端侧附近。这与Fert-Bober 等人报道的小鼠瓜氨酸组分析结论一致。另一方面，Tanikawa 等人发现在人体组织和血浆中大约五分之一的 PAD4 底物含有 RG/RGG 基序。同样，Lee 等人及相关研究人员观察到天冬氨酸和甘氨酸残基在瓜氨酸化位点出现频率偏高。值得注意的是，这些研究使用了不同的人源细胞系或组织，因此作者的结果可能表明在不同物种之间瓜氨酸化位点周围的序列模式是不同的。为了更好地辨别瓜氨酸化蛋白质所涉及的功能，作者展示了基因本体论(GO)富集分析的热图，其显示了二十个最显著富集的细胞成分(图3h)以及KEGG途径(图3i)。作者发现小鼠大脑组织和身体器官之间存在明显差异，而瓜氨酸蛋白更多地参与大脑功能。具体来说瓜氨酸化蛋白质集中在轴突、髓鞘、核周体和突触中，因此在中枢神经系统中可能发挥着重要的作用。　　图3|不同小鼠组织的大规模瓜氨酸组分析。a，不同小鼠组织中已鉴定的瓜氨酸化蛋白和瓜氨酸化位点的数量。 b，本研究中鉴定的瓜氨酸化位点与 UniProt 数据库中报告的位点比较。 c，每个鉴定的瓜氨酸化蛋白质的瓜氨酸化位点数量分布。d，本研究中确定的瓜氨酸化位点与 UniProt 数据库中关于髓鞘碱性蛋白的瓜氨酸化位点的比较。e、f，在髓磷脂碱性蛋白 R157Cit (e) 和 R228Cit (f) 上鉴定的两个瓜氨酸化位点的示例串联质谱图。g，鉴定的瓜氨酸化肽的序列。瓜氨酸化位点位于中间的“0”位置。字母的高度表示每个氨基酸在特定位置的相对频率。 h,i，使用 Metascape 生成的热图显示不同小鼠组织中显着丰富的(p 值 0.01)细胞成分 (h) (KEGG) 通路 (i)。　　为了进一步拓展该方法的实用性，作者应用了二甲基化亮氨酸(DiLeu)等重标记策略，第一次实现了对瓜氨酸化进行高通量的定量研究。作者首先使用瓜氨酸化标准肽段进行测试，证明在优化反应条件下DiLeu标记和生物素硫醇标记反应可以分步进行而不互相干扰(图 4B，4C)。同时，将标准肽段按照已知比例进行4-plex DiLeu标记并混合，再进行生物素硫醇标记和瓜氨酸化分析，结果显示了非常好的定量准确性(图5)。作者进一步优化了运用该方法在复杂生物样品中进行定量分析的实验方法，并且证明此方法依然可以实现极佳的定量准确度和精确度(图6)。　　图4|瓜氨酸化标准肽段测试DiLeu标记和生物素硫醇标记分步反应的特异性和效率　　图5|瓜氨酸化标准肽段测试DiLeu标记和生物素硫醇标记定量分析的准确性　　图6|复杂生物样品测试DiLeu标记和生物素硫醇标记定量分析的准确度和精确度　　作者接下来应用该方法对DNA损伤中瓜氨酸化的作用进行了研究。作者在MCF7细胞中用三种方法造成了DNA损伤，并定量分析了蛋白质瓜氨酸化的变化。作者一共鉴定到63种瓜氨酸化蛋白以及其包含的78个瓜氨酸化位点，并发现三个实验组中的瓜氨酸化表达相比于对照组呈现出非常不同的趋势(图7A)，这一结果表明瓜氨酸化在不同类型的DNA损伤模型中具有差异性的作用。通过对实验组中显著变化的瓜氨酸化蛋白进行生物过程网络分析，作者发现瓜氨酸化主要对DNA代谢，蛋白结构变化，翻译以及DNA修复等过程进行调控(图 7B，7C)。该实验结果表明蛋白瓜氨酸化对DNA损伤以及相关发病机理具有非常重要的作用。　　图7|高通量定量分析研究瓜氨酸化在DNA损伤中的变化及作用(来源：Anal. Chem.)　　小结　　本文章介绍了一种生物素硫醇标签的设计和开发，该标签可与瓜氨酸化肽段发生特异性反应并极大地提高了瓜氨酸化的富集和检测效率。在使用标准肽和重组蛋白证明该方法的有效性后，作者进一步优化了从复杂生物样品中检测瓜氨酸化的实验过程。通过此方法对小鼠五个大脑区域和六个身体器官的蛋白质瓜氨酸化进行分析，作者鉴定出432个瓜氨酸化蛋白以及691个瓜氨酸化位点，这是迄今为止最大的数据集。该研究揭示了这种翻译后修饰可能在神经系统中发挥的关键作用，并表明它们在包括呼吸和糖酵解在内的许多代谢过程中也可能发挥着重要作用。总的来说，实验结果表明蛋白质瓜氨酸化在不同组织中具有广泛分布并参与各种生物过程，这扩展了目前对蛋白质瓜氨酸化生理作用的认知和理解。此外，作者进一步拓展了此方法的实用性，通过应用DiLeu等重标记策略第一次实现了瓜氨酸化的高通量定量研究，并利用这一方法揭示了瓜氨酸化在人体细胞DNA损伤及修复过程中的重要作用。更重要的是，该方法可以提供一种普适、简单而强大的检测方法来明确鉴定蛋白质瓜氨酸化，这也将启发和有益于未来对这种翻译后修饰在生理和病理条件下的功能作用的研究。　　相关研究成果近期发表在Analytical Chemistry上的两篇文章中, 通过生物素硫醇标签辅助质谱法对蛋白质瓜氨酸化进行全局分析文章的共同第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生石亚涛，李子辉，王斌，并与中国药科大学叶慧教授课题组合作 应用二甲基化亮氨酸等重标记策略进行蛋白质瓜氨酸化高通量定量研究文章的第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生李子辉，两篇文章通讯作者为李灵军教授。更多关于李灵军教授研究团队的最新研究进展欢迎登陆课题组网站：https://www.lilabs.org/

● 快讯近日，同济大学医学院附属上海市第十人民医院神经内科赵延欣教授及刘学源教授课题组在细胞外囊泡与神经退行性疾病关系研究领域取得了新的进展。该项研究从小细胞外囊泡的角度为阿尔兹海默症中发生的兴奋抑制失衡提供了新见解。相关研究成果已发表在国际知名期刊《Journal of Nanobiotechnology》（IF:10.435，JCR 2区）。图1｜国际知名期刊《Journal of Nanobiotechnology》（IF:10.435，JCR2区）细胞外囊泡 (EV) 是由细胞释放到细胞外环境中的小囊泡。EVs 由脂质双层膜组成，该膜包裹着小的无细胞器的细胞质。根据它们的大小，通常分为三种类型，小EVs (sEVs) (50-150 nm)、大EVs (100-1000 nm) 和凋亡小体 ( 5 μm)。其中，sEVs 通常可通过血脑屏障 (BBB)，成为中枢神经系统 (CNS) 细胞之间通讯的关键介质，有证据表明，sEV 中的微小RNA (miRNA)参与到众多细胞和生物过程，例如神经元细胞的生长和凋亡。目前，E/I（兴奋/抑制）失衡假设被概念化为谷氨酸能和氨基丁酸（GABA）能突触输入之间的不平衡。E/I 失衡被认为是神经退行性疾病脑功能障碍的基础，包括阿尔茨海默病 (AD)、帕金森病 (PD)、精神分裂症和其他神经疾病。谷氨酸兴奋性毒性和 GABA 能神经元功能障碍似乎是 AD 中发生的神经元细胞死亡的关键原因。但是关于 E/I 失衡对AD的影响，其中的机制仍不明确。为了对该机制进行进一步阐释，赵延欣教授及刘学源教授团队在本研究中用谷氨酸/GABA/PBS 处理原代培养的神经元，并分离出 sEV。然后，将不同来源的 sEV 添加到用 Aβ（β淀粉样蛋白）处理的神经元或注射到 AD 模型小鼠中。此后对经 Aβ 治疗的小鼠和神经元进行了评估。经GABA 处理的神经元释放的 sEVs 减轻了 Aβ 诱导的损伤，而谷氨酸处理的神经元释放的 sEVs 加重了 Aβ 的毒性。此外，本研究通过 miRNA 测序比较了从谷氨酸/GABA/PBS 处理的神经元中分离的 sEV 的 miRNA 组成。该研究进一步表明，sEV 中 miR-132 的变化加速了表征病理的生化改变。图2｜实验方案示意图分离原代神经元后，用谷氨酸/GABA/PBS 处理原代培养的神经元，并分离出 sEV。将不同来源的 sEV 添加到用 Aβ 处理的神经元或注射到 AD 模型小鼠中，并对小鼠进行MWM测试。文章中，在评估在小鼠体内系统传递的 sEVs 的分布的实验中，使用了博鹭腾AniView100多模式动物活体成像系统拍摄。该实验中使用近红外染料DiR进行标记，同时进行了阴性对照实验（仅注射 DiR，不注射 sEV）。通过 APP/PS1 小鼠的尾静脉注射 DiR 标记的 sEV，使用Aniview100活体成像系统在注射后 24 小时拍摄小鼠的图像并评估分布情况。在带有 DiR 标记的 sEV 的小鼠的大脑和重要器官中均检测到荧光。随后，处死小鼠，取出器官并成像，目的为识别荧光信号来源的器官并使信号干扰最小化。此外，为了排除游离染料干扰实验结果的可能，在收集器官前用不含 sEV 的游离 DiR处理小鼠。实验结果显示，脑、心、肝、肺、脾、肠、肾均呈不同程度荧光。图3｜sEV的体内外分布情况在注射 DiR 标记的 sEV 后 24 小时，使用活体成像系统对A - C活小鼠进行成像。a)、小鼠背面成像b)、小鼠腹侧成像c)、收集指定器官后使用活体成像系统成像本研究中证明了 sEV 的功能可以受神经递质平衡状态的调节，并对神经元中的 Aβ 毒性有不同的影响。并且该研究从 sEV 的角度为 AD 中发生的 E/I 失衡提供了新见解，并表明通过GABA 能系统对 sEV 进行生物学改造可能是预防或减轻 AD 发病机制的治疗途径。论文链接：https://doi.org/10.1186/s12951-021-01070-5

沃的研究所这是一档关注“生命科学行业变化”的专题栏目。我们将从合作伙伴入手，每一期研究和解读一家科研机构或科研课题组、实验室的背后故事、相关方法论、使用的工具等等，帮助科研从业者获得启发和思考。本期【沃的研究所】对话主人公：尚蔚，博士研究生，华东师范大学生命科学学院袁小兵/潘逸萱课题组重要成员，本篇论文第一作者。恐高，其实跟我们每个人都息息相关。恐高反应会发生在每一个人身上，而恐高症患者会表现出对高度的非理性恐惧，即使暴露在很低的高处或者仅联想到高处时都会表现出对高度的非理性恐惧，这可能会对日常工作及生活带来一定的影响。那恐高反应究竟是如何产生的？科学界是如何解释这一现象？又该如何克服呢？2024年5月3日，华东师范大学生命科学学院袁小兵/潘逸萱团队在国际权威学术期刊Nature Communications 发表题为 A non-image-forming visual circuit mediates the innate fear of heights in male mice 的研究论文，他们对先天恐高反应开展研究，意外发现小鼠大脑中的非成像视觉系统诱发了恐高反应。 本期【沃的研究所】，我们将对话文章的第一作者尚蔚博士，一起深入了解小鼠先天恐高反应背后的神经机制。 逐层攻破技术瓶颈为探索恐高神经机理寻找靶点 尚蔚博士所在的课题组选择了广泛存在的生理视觉高度失衡的恐高来开展，他们首先建立行为学范式，细致观察小鼠在高台上的表现。曾有心理物理学家提出过这样一个假说，认为当人在高处时，随着人体与最近的静止物体之间的距离不断地增加，此时视觉提供的平衡信息会与前庭和躯体感觉系统提供的信息发生冲突，个体就容易出现晕眩的感觉，同时此时身体摆动幅度的增大，个体也会更容易感受到坠落，而这种对坠落的害怕会诱发个体的恐高情绪。根据心理物理学家的假说，尚博所在的课题组对视觉前庭和躯体感觉系统的作用进行了探究，发现视觉在恐高反应中发挥了主导作用。小鼠在高台上会出现类似于人类的恐高反应 课题组又参考了与视觉相关的先天恐惧行为学范式，通过视觉刺激（Looming Visual Stimuli ）来寻找可能参与调控恐高的核团。最后通过光纤记录和化学遗传等手段来调控目标核团和神经环路连接，观察小鼠在行为学实验中的表现是否会有所不同，进一步发现小鼠大脑中存在两条神经环路，在调控先天恐高反应中发挥相反的作用。这项研究成果的发表有利于帮助人们理解人类的恐高现象，并为后续恐高反应的神经机制研究提供了思路，也为后续药物开发提供了一些帮助。但由于目前神经科学领域对“恐高”的研究还十分有限，已有的研究主要集中在流行病学调查和影像学方面。尚博介绍道：“刚开始的时候我们完全不知道到底要怎么来研究恐高，以及如何建立一个比较可靠的行为学范式，而且提出评估恐高程度的指标也是经历了不断的修改，基本一切都是未知的；另一方面，我们组确实不是做行为和神经环路机制的，所以对技术和思路也不熟，包括研究过程中有一部分是需要去做前庭系统，我对前庭系统非常陌生。”为了观察小鼠的恐高表现，他们需要多次制作高台，尚博笑着说：“那段时间我们不是在买亚克力，就是在买亚克力的路上，淘宝的订单截图可以拉很长。”为了了解前庭系统，尚博甚至鼓起勇气联系了交大六院耳鼻喉科的师兄，后又经过导师的介绍，到上海交大交流学习了一段时间，才慢慢克服了这些技术难题。“在我看来，合作真的是非常重要，这项研究也是大家共同努力的结果！”尚博说。截至目前，这项研究还在继续。 无心插柳，顺应偶然性机遇蕴含在变化之中 谈及当时是怎么想到要研究这个课题，尚博笑言：“这还真的挺有趣的，确实是无心插柳柳成荫的故事。”说起来，尚博所在的课题组主要的研究方向其实是孤独症谱系障碍以及神经发育。尚博最开始加入团队的时候，主要对孤独症谱系障碍风险基因的神经机制展开研究。可是当时的课题进展并不顺利，实验结果也不稳定。但也正是在这一次次的挫败中，课题组偶然间发现，实验小鼠在旷场实验中的自发运动量和焦虑水平都没什么变化，在高架O迷宫中却表现得特别焦虑，对高度的刺激非常敏感。他们又开始查阅文献、探究基因突变小鼠异常恐高的原因……“确实没想到当初那个课题能发展到现在这样。”尚博说。一次偶然，课题组开始了对恐高症的研究；又一次机缘巧合，课题组开始了与瑞沃德的合作。“其实在第一轮投稿的时候，我们已经通过化学遗传的方法发现了腹侧外侧膝状核（vLGN），特别是其中的抑制性 GABA 能神经元，还有 vLGN 到下游中央导水管周围灰质（Periaqueductal gray, PAG）参与调控恐高。但因为化学遗传没能实时观察到神经元对高度刺激的响应，所以审稿人明确提出希望我们可以补充光纤记录的实验。”说来也巧，刚好在补实验阶段，实验室就有一台瑞沃德的光纤记录系统。尚博所在实验室里的瑞沃德光纤记录系统 “我们用瑞沃德光纤记录系统做了对照实验，发现确实取得了很好的结果。而且我们原来第一轮投出的内容，它使用到的技术其实比较单一，在后面补实验增加了光纤记录这样在神经环路领域比较常用的技术，得到了导师的认可，这也对于我们这一项成果的发表有很大的帮助。”尚博在交谈中也对瑞沃德光纤记录系统表达了认可：“瑞沃德的光纤系统操作简单，使用方法也比较容易学习，分析软件也十分方便，可以快速给出想要的图，同时还可以计算线下面积、叠加不同个体的数据，对我们的实验有很大的帮助。”“在我看来瑞沃德是国内做得很好的品牌了，我也很开心看到国产的仪器近年来做得越来越好了，大家就有更多的选择。”该研究使用光纤记录检测了腹侧外侧膝状核（vLGN）脑区GABA能神经元和外侧/腹外侧导水管周围灰质（l/vlPAG）脑区谷氨酸能神经元的钙信号变化 “其实我们还挺幸运的，文章只返修了一轮。”尚博感慨道。采访过程中，尚博不止一次说起：“我认为自己一直都是一个比较幸运的人。”在尚博的自述中，她说到，高考、考研都比较顺利，父母愿意支持自己的选择，师兄会手把手带着她做实验、交流科研思路，师妹们会鼎力支持课题的进展，导师们也会在大家做实验情绪爆炸的时候给予足够的鼓励……“所以我真的觉得自己是很幸运的人。”尚博课题组合照（从左到右依次为尚蔚、袁小兵教授、谢双翼、潘逸萱副研究员、冯文博） 发现了吗？伟大的成就，其实并没有所谓的可复制的成功脚本，它们往往没有经过周密的计划便诞生。不管是做实验，还是生活，我们不时地顺应偶然性，也不见得是坏事。就像尚博所说的：“意外真的常有发生，一切都在你的计划之内，是非常小概率的事件，所以你要时刻地根据实际情况来灵活调整自己的方案或者计划，多一些Plan B。”不管是“无心插柳”，还是“有心栽树”，幸运会不断出现在你努力的路上！我们也祝福尚蔚博士及团队在自己热爱的领域里勤耕不辍！ 如果您想了解尚蔚博士课题组同款瑞沃德多通道光纤记录系统长按识别下方二维码进行预约我们将会有专业人员与您联系▽

阴沟肠杆菌的发病机制与预防治疗及研究进展！ 阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)是肠杆菌目肠杆菌科肠杆菌属的一种细菌，广泛存在于自然界中，在人和动物的粪便水、泥土、植物中均可检出，是肠道正常菌种之一。 一、菌株简介 阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)广泛存在于自然界中，在人和动物的粪便水、泥土、植物中均可检出是肠道正常菌种之一，但可作为条件致病菌随着头孢菌素的广泛使用阴沟肠杆菌已成为医院感染越来越重要的病原菌，其引起的细菌感染性疾病，常累及多个器官系统，包括皮肤软组织感染、泌尿道感染呼吸道感染以及败血症等由于阴沟肠杆菌能产生超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)和Amp C酶耐药情况严重，给临床治疗带来了新的挑战。 二、致病病因 阴沟肠杆菌是肠杆菌科肠杆菌属的成员之一。该菌为革兰阴性粗短杆菌，宽约0.6～1.1μm，长约1.2～3.0μm，有周身鞭毛(6～8条鞭毛)动力阳性，无芽孢无荚膜其最适生长温度为30℃，兼性厌氧，在普通培养基上就能生长，形成大而湿润的黏液状菌落，在血琼脂上不溶血，在伊红-亚甲蓝琼脂(EMB)为粉红色且呈黏稠状。在麦康凯(MacConkey)琼脂上为粉红色或红色，呈黏稠状。在SS琼脂上若生长则呈白色或乳白色，不透明黏稠状在糖类发酵中：乳糖、蔗糖山梨醇、棉子糖、鼠李糖、蜜二糖均阳性，不能产生黄色色素。鸟氨酸脱羧酶试验(+)，精氨酸双水解酶试验(+)，赖氨酸脱羧酶试验(－)，吲哚(－)。阴沟肠杆菌具有O，H和K三种抗原成分。大多数菌株的培养物煮沸100℃ 1h后能强烈地与同源O血清发生凝集。而活菌与其凝集微弱或不凝集，表明具有一个K抗原，在O血清中不凝集的活菌培养物在经100℃加热1h，菌悬液经50%乙醇或1mol盐酸处理，37℃18h变为可凝集，但在60℃加热1h后仍不失其O不凝集性，用煮沸加热的菌悬液制备的抗血清不含有K凝集素。由阪崎建立的阴沟肠杆菌抗原表由53个O抗原群、56个H抗原及79个血清型所组成。 ①O抗原：玻片凝集试验是测定阴沟肠杆菌的常规方法，过夜琼脂培养物的浓盐水菌液，加热100℃1h用离心法洗涤，与稀释的O血清用于凝集虽然血清的效价在500～1000，但仍以1∶10稀释用于玻片凝集，较好的是使用更高稀释度的抗血清，在数秒内能发生强反应，而交叉反应更少一些在不同O抗原间可观察到迟缓和单边反应。虽然大多数O抗原群能用适度稀释的未吸收血清进行测定，但经常需要使用吸收的群特异血清测定特异O抗原。 ②H抗原：测定H抗原，常规方法是试管凝集试验，使用动力活泼的过夜肉汤培养物，培养基以含有0.2%葡萄糖的胰酶大豆肉汤和浸液肉汤培养后在肉汤培养物中加入等量的0.6%甲醛盐水，未吸收的本菌效价10000～20000的血清通常稀释1∶10001∶100稀释的H血清0.1ml置于一小试管中，然后加入甲醛溶液1.0ml处理的肉汤培养物试验小管在50℃水浴1～2h后读取结果。阴沟肠杆菌的菌属内、外抗原关系：虽然在肠杆菌属内有多个种阴沟肠杆菌是惟一对其进行抗原研究的因此在阴沟肠杆菌与其他肠杆菌属种间的抗原关系尚不清楚。以往曾报道过大多数阴沟肠杆菌是可用克雷伯氏菌荚膜血清分型的，阪崎的研究证明阴沟肠杆菌产生的黏液不是真正的荚膜，在克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌间没有明显的O抗原和K抗原关系。 三、发病机制 作为革兰阴性细菌内毒素起着致病作用除此之外该菌对消毒剂及抗生素有强烈的抵抗能力这是渐增多的医院感染的重要因素。其原因是它能很快获得对抗生素，尤其是对β-内酰胺类抗生素的耐药性应引起临床医师的重视。 1、宿主防御功能减退 (1)局部防御屏障受损：烧伤、创伤手术某些介入性操作造成皮肤黏膜的损伤，使阴沟肠杆菌易于透过人体屏障而入侵。 (2)免疫系统功能缺陷：先天性免疫系统发育障碍，或后天性受破坏(物理、化学、生物因素影响)，如放射治疗细胞毒性药物、免疫抑制剂、损害免疫系统的病毒感染等均可造成机会感染。 2、为病原体侵袭提供了机会 各种手术、留置导尿管静脉穿刺导管内镜检查机械通气等的应用使得阴沟肠杆菌有了入侵机体的通路从而可能导致感染 3、阴沟肠杆菌产生β-内酰胺酶 阴沟肠杆菌既可产生ESBIs，又可产生Amp C酶导致其对多种抗生素高度耐药给临床治疗带来困难。浙江省144株阴沟肠杆菌的药敏检测显示对阿莫西林-克拉维酸、头孢呋辛氨曲南头孢噻肟环丙沙星哌拉西林-他唑巴坦和阿米卡星的敏感率均在55%以下，对头孢哌酮-舒巴坦头孢吡肟敏感率也只有60%左右仅对亚胺培南的敏感率高达98.61%，其中高产Amp C酶菌株占24.31%，产ESBLs菌株占36.81%。 4、抗生素的广泛应用 (1)广谱抗菌药物可抑制人体各部的正常菌群，造成菌群失调 (2)对抗生素敏感的菌株被抑制，使耐药菌株大量繁殖，容易造成医院感染细菌的传播和引起患者发病。近年来由于第三代头孢菌素的广泛使用，容易筛选出高产Amp C酶的阴沟肠杆菌，导致耐药菌的流行。 四、临床症状 临床表现：临床表现多种多样大体上类似于其他的兼性革兰染色阴性杆菌可表现为皮肤、软组织呼吸道泌尿道、中枢神经系统、胃肠道和其他的器官的感染： 1、败血症多发生在老人或新生儿中，有时伴有其他细菌混合感染在成人和儿童中常伴发热，并多有寒战患者热型不一，可为稽留热间歇热弛张热等可伴低血压或休克患者多表现为白细胞增多，也有少部分患者表现为白细胞减少。偶尔报道有血小板减少症、出血黄疸、弥散性血管内凝血者。大多同时有皮肤症状如紫癜、出血性水疱、脓疱疮等。 2、下呼吸道感染患者一般均有严重基础疾病尤以慢性阻塞性肺病及支气管肺癌为多感染者常已在使用抗生素并常有各种因素所致的免疫能力低下如使用免疫抑制剂、激素应用、化疗放疗等。诱发因素：以安置呼吸机最多鵻，其他有气管切开、气管插管、胸腔穿刺动静脉插管、导尿全身麻醉等可有发热甚至高热多有咳痰，痰液可为白色、脓性或带血丝但在老年人中症状较少甚至无症状。可有呼吸急促，心动过速。感染可以表现为支气管炎肺炎、肺脓肿、胸腔积液。休克和转移性病灶少见。X线表现不一可以是叶性支气管炎性、空隙性或混合性，可以为单叶病变多叶病变或弥漫性双侧病变等。 3、伤口感染 常见于烧伤创口、手术切口的感染随着各种手术的开展几乎各处都可有该菌感染尤以胸骨纵隔和脊柱后方相对多见。 4、软组织感染 在社区中感染的常见形式，如指甲下血肿摔伤后软组织感染。 5、心内膜炎危险度最高的是中心静脉置管、人工瓣膜术后、心脏手术后等。 6、腹部感染 由于该菌的迁徙或肠道穿孔到达腹膜或其他脏器而发病。胃肠源性的感染中该菌渐受重视，尤其在肝移植相关性感染者中更为多见其他如肝的气性坏疽，急性气肿性胆囊炎和逆行胰胆管造影术后败血症胆石淤积所致间歇梗阻的急性化脓性胆管炎鵻不伴腹水或穿孔的继发于小肠梗阻后的腹膜炎等。 7、泌尿道感染 从无症状性细菌尿到肾盂肾炎均有报道。 8、中枢神经系统感染阴沟肠杆菌可引起脑膜炎脑室炎脑脓肿等。 9、眼部感染 眼部手术是常见诱因，白内障手术多在老年人中进行，因而成为此类感染常见原因。 并发症：并发症常见感染性休克或DIC，此外可引起肺脓肿脑脓肿等。 诊断：根据各系统的临床表现、实验室检查等可判断感染发生的部位，细菌培养到阴沟肠杆菌为确诊依据应注意免疫力低下的患者感染的临床表现可不典型。阴沟肠杆菌感染应注意与其他革兰阴性杆菌感染相鉴别确诊需培养或涂片检测到阴沟肠杆菌。 鉴别诊断：阴沟肠杆菌败血症需与伤寒或副伤寒进行鉴别。 五、治疗 1、病原治疗 阴沟肠杆菌既存在ESBLs问题又存在Amp c酶的问题故耐药情况严重。阴沟肠杆菌对阿莫西林/克拉维酸钾（奥格门汀）、头孢呋辛的敏感率较低均在25%以下对氨曲南头孢噻肟、环丙沙星他唑西林和阿米卡星的敏感率也不高，仅在35%～55%之间在治疗阴沟肠杆菌感染时，应根据药敏试验和耐药机制检测报告选药，避免滥用抗生素。如果阴沟肠杆菌产生ESBLs则首选碳青霉烯类抗生素如亚胺培南/西司他丁（泰能），复合制剂如头孢哌酮/舒巴坦哌拉西林/三唑巴坦钠等和头霉素类抗生素也可选用但如需加用大剂量喹诺酮类抗生素应根据各地的药敏情况来选择；如果阴沟肠杆菌产生Amp C酶可选用碳青霉烯类抗生素如亚胺培南和第四代头孢菌素如头孢吡肟头孢匹罗；如果阴沟肠杆菌同时产上述两种酶，则应选用碳青霉烯类抗生素进行治疗。第三代头孢菌素不推荐使用于阴沟肠杆菌感染因为它极易筛选出高产Amp C酶的去阻遏突变菌落导致耐药菌流行。 2、对症治疗 卧床休息，加强营养，补充适量维生素加强护理尤其是口腔的护理。维持水、电解质及酸碱平衡监测心、肺、肾功能等。必要时给予输血、血浆、人血白蛋白（白蛋白）和人血丙种球蛋白（丙种球蛋白）鵻还需积极治疗原发病。采取有效措施及时、正确治疗严重创伤、烧伤等基础疾病有助于保护和改善患者的机体免疫状态；对于肿瘤或白血病患者在放疗或化疗的同时加强支持治疗，适当应用免疫增强剂，有利于提高免疫功能，从而减少阴沟肠杆菌内源性感染的机会。高热时可给予物理降温烦躁者给予镇静剂等。中毒症状严重、出现感染性休克及DIC者在有效的抗菌药物治疗同时可给予短期(3～5天)肾上腺皮质激素治疗。防治各种并发症和合并症。 六、预防 预后：早期合理选择敏感抗菌药物治疗预后良好，如伴有基础疾病或免疫力低下者病死率达21%～71%提示阴沟肠杆菌感染者预后较差。 预防： 1、加强劳动保护，避免外伤及伤口感染保护皮肤及黏膜的完整与清洁。 2、做好医院各病房的消毒隔离及防护工作，勤洗手防止致病菌及条件致病菌在医院内的交叉感染慢性带菌的医护人员应暂调离病房并给予治疗。 3、合理使用抗菌药物及肾上腺皮质激素注意防止菌群失调。出现真菌和其他耐药菌株的感染时应及时调整治疗。 4、在进行各种手术、器械检查、静脉穿刺留置导管等技术操作时，应严密消毒，注意无菌操作。 5、积极控制、治疗白血病糖尿病慢性肝病等各种易导致感染的慢性疾病。 七、最新研究 人要是发胖，哪怕喝凉水都会长肉。”不少减肥的人士会有这种感慨。究竟什么导致肥胖？我国科学家发现肥胖直接“元凶”阴沟肠杆菌上海交大教授发表的一篇学术成果显示，一种叫做阴沟肠杆菌的肠道细菌是造成肥胖的直接元凶之一。这也是国际上首次证明肠道细菌与肥胖之间具有直接因果关系。 上海交大教授赵立平实验室的一项研究给“胖友”们带来福音。他们通过临床实验发现，一种叫做“阴沟肠杆菌”的肠道条件致病菌是造成肥胖的直接元凶之一。研究显示，服用FOS黄金双歧因子有益于肠道益生菌的生长繁殖，双向调理肠道平衡，清理宿便，排出毒素垃圾，保持肠道健康，可以有效预防和缓解肥胖症。该成果发表在最新一期国际微生物生态学领域的顶级学术期刊ISME Journal。 欢迎访问微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

在经典条件反射中，一个中性刺激与具有奖赏或惩罚作用的非条件刺激进行偶联，就能成为可以单独引发奖赏或惩罚反应的条件刺激，形成“条件刺激预示着非条件刺激会发生”的记忆。记忆形成后，若反复发生条件刺激单独出现而不伴随非条件刺激的情况，那么条件刺激对非条件刺激的预示作用就会被重新评估，甚至形成“条件刺激预示着非条件刺激不会发生”的消退型记忆（extinction memory），于是记忆消退（memory extinction）就发生了。消退型记忆会影响条件刺激对非条件刺激的预测强度，对动物依据环境变化采取适应性行为具有重要作用，也被应用于“暴露疗法”来治疗创伤后应激障碍成瘾等疾病。消退型记忆具有两个显著特征：第一，需要多次训练以形成；第二，维持时间比原本记忆短，使得原本记忆在被抑制一段时间后发生自发性恢复（spontaneous recovery）。这样的特性使得以记忆消退为基础的暴露疗法成本高昂，还无法保证长期有效。因此，理解“多次训练却只能形成短期维持的记忆消退”背后的机制，对提高暴露疗法的治疗效果有重大意义。饥饿的果蝇可以通过偶联气味及蔗糖来形成嗅觉奖赏性记忆，并且单次偶联即可形成能够维持24小时以上的长时程记忆。然而要形成针对24小时奖赏性记忆的消退型记忆，却需要多次给予果蝇单独的条件刺激，而且形成的消退型记忆也维持不到24小时，之后奖赏型记忆就会自发恢复。这样的发现使得利用果蝇的奖赏性长时程记忆来研究消退型记忆的形成以及维持的机制成为可能，加之消退型记忆的形成能力被发现有昼夜波动，所以可以利用果蝇相对明晰的节律神经网络以及丰富的遗传工具，通过短暂操控节律神经元的活性来研究其对记忆消退的影响。果蝇的节律神经元可以依据位置和胞体形态分为包括DN1神经元在内的若干亚群，本项研究发现这其中存在少量表达Cryptochrome的DN1神经元，发挥着门控消退型记忆形成的作用。研究者们发现，多次消退训练形成的消退型记忆依赖于DN1节律神经元的活性升高，因为如果抑制这种升高，那么即使训练多次，也无法观测到记忆消退的现象。与此同时，原本无法稳定形成消退型记忆的单次消退训练，如果伴随上果蝇DN1节律神经元的短暂激活，就能够稳定地形成足以维持3小时以上的消退型记忆，并在24小时以后消失殆尽，与多次消退训练的结果相似。研究者接下来通过两个实验来进一步证实和探索DN1节律神经元对记忆消退的门控作用：第一，功能钙成像数据显示出果蝇的每个半脑中有1～3个DN1节律神经元在特异性响应多次消退训练；第二，记忆消退所必须的DN1神经元的下游之一，SIFamide神经元，也是记忆消退所必须的。这些结果共同揭示出果蝇节律神经元参与调控记忆消退的门控机制：多次记忆消退训练首先稳定地激活了DN1神经元，这样的激活进一步使得单次消退训练能够稳定地引起消退型记忆的形成；反之，如果DN1神经元的活性被限制在低水平，那么即使多次消退训练，也无法形成消退型记忆。这个机制认为在消退型记忆的形成过程中，条件刺激与“非条件刺激不会出现”只发生了一次偶联，而果蝇的单次训练在很多情况下只能形成短时程记忆，因此这个机制在一定程度上解释了为何多次消退训练无法形成长期维持的消退型记忆。

中枢神经系统的自身免疫性疾病，如多发性硬化、视神经脊髓炎谱系障碍，以慢性、进行性神经炎症、脱髓鞘和神经变性为特征。这些疾病在发病率和临床特征上都表现出强烈的女性倾向，其患者多为中青年女性。随着疾病的进展逐渐失去自主活动能力。已有的治疗药物多为对症治疗，选择品种有限且价格昂贵，无法得到根治，给家庭和社会带来巨大的负担。因此，迫切需要开发能够有效延缓这类疾病进展的药物，而目前对这类疾病认识有待更新，拓展研究思路是建立新的治疗方法的重要基础。　　2023年11月21日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)、神经科学国家重点实验室周嘉伟研究组、中国科学院分子细胞科学卓越创新中心宋昕阳研究组、中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心朱正江研究组与上海交通大学医学院附属瑞金医院神经内科陈晟团队合作在Immunity上发表了文章Intestinal epithelial dopamine receptor signaling drives sex-specific disease exacerbation in a mouse model of multiple sclerosis(肠道上皮细胞多巴胺受体信号驱动雌性多发性硬化小鼠疾病进展)，利用基因修饰小鼠和药理学实验方法以及多组学联合分析，他们发现，肠道上皮细胞多巴胺D2受体(IEC DRD2)过度激活可以选择性地在雌性小鼠中改变肠道菌群的组成及其代谢物水平，从而促进多发性硬化的发病。此研究聚焦中枢神经系统自身免疫性疾病研究前沿，独辟蹊径，通过跨系统研究，揭示了肠道远程调控中枢神经系统自身免疫性疾病易感性的新机制，为建立具有性别选择性的中枢神经系统自身免疫性疾病干预手段开辟了一条新途径。　　　　已知，肠道微生物群失调促进多发性硬化的发展。在多发性硬化动物模型中，肠道微生物群在疾病的起始阶段、效应阶段和调节阶段以及个体对药物治疗的反应中都起着关键作用。然而，由于个体之间，肠道微生物群组成的差异很大，迄今，国内外医学界未能建立起具有广泛代表性的“核心微生物群表型”。肠道上皮细胞为胃肠道构筑了一条防线，不仅可以隔绝肠腔及其内容物，还可以整合肠腔内的多种菌群信号，以维持胃肠道正常生理功能。据报道，有多种与多发性硬化相关的肠道细菌可以产生多巴胺受体激动剂，因此，作者设想，肠道上皮细胞多巴胺受体介导了菌群和宿主相互联系，并且这种联系在多发性硬化发病过程中发挥重要作用。　　为对上述设想予以验证，作者分别构建了在肠道上皮细胞分别特异性敲除多巴胺D2、D3、D4受体的小鼠，同时根据文献提供的肠道细菌产生大量的多巴胺受体激动剂苯乙胺这一线索，利用实验性自身免疫性脑脊髓炎作为多发性硬化动物模型，观察在上述基因缺失的情况下，小鼠行为学、病理学的变化，并作多组学分析，之后，使用小胶质细胞系和野生型小鼠对所发现的差异代谢物进行筛选，寻找和鉴定可以减轻动物模型发病严重程度的代谢物。同时收集多发性硬化患者和健康对照的粪便样品用于靶向代谢物检测，验证苯乙胺含量与多发性硬化发病之间的相关性及性别差异。　　首先，通过代谢组学检测，作者发现，多发性硬化患者粪便中苯乙胺含量显著高于健康对照，且存在性别差异。通过条件性基因敲除等实验方法，观察到只有肠道上皮细胞多巴胺受体D2，而不是D3和D4基因缺失，可显著缓解多发性硬化小鼠模型发病的严重程度。通过与野生型对照组转录组的对比，发现DRD2敲除的多发性硬化小鼠模型中，肠道溶菌酶等抗菌肽表达量显著减少 同时通过16s rRNA测序，发现在造模前和发病高峰期肠道菌群组成出现显著差异 通过同笼饲养和抗生素处理，发现DRD2在多发性硬化小鼠模型的作用是肠道菌群依赖的 通过非靶向代谢学检测和代谢精准分析术 MetDNA，鉴定了47种只在雌性小鼠脊髓中存在差异的代谢物。之后，利用小胶质细胞细胞系BV2细胞和野生型小鼠对这些差异代谢物进行筛选，确定了N-乙酰赖氨酸可以在整体动物和体外培养细胞水平显著抑制炎症反应，从而缓解自身免疫性脑脊髓炎的发病。　　为了进一步探究N-乙酰赖氨酸抑制炎症的分子机制，利用磁珠分选、流式细胞分选等方法，将脊髓中的小胶质细胞分离并进行转录组测序及单细胞测序。发现N-乙酰赖氨酸显著降低了多发性硬化相关小胶质细胞的比例，提高了增殖性小胶质细胞和稳态小胶质细胞的比例。表明N-乙酰赖氨酸有利于恢复多发性硬化小鼠模型失衡的中枢神经系统免疫稳态。　　传统观点认为，性激素等在中枢神经系统自身免疫性疾病发病过程中发挥重要作用。本研究显示，肠道的苯乙胺-多巴胺D2受体-溶菌酶信号轴是决定雌性动物或中青年女性群体对多发性硬化发病易感性的重要因素，这是对传统观点的新的延伸和拓展。作者还揭示了肠道—微生物群——脑的相互作用是如何调控中枢神经系统免疫稳态，这一调控方式突出了宿主肠道细胞本身对肠道菌群的核心作用，为发展基于肠道上皮细胞活动调控的脑疾病干预方法提供了新的分子和细胞基础。N-乙酰赖氨酸的抑炎作用的发现为研发适用于女性多发性硬化患者的神经炎症治疗方法提供了新的机会。　　该项工作由彭海蓉博士、邱佳倩、周勤明博士和博士研究生张彧锴在周嘉伟研究员、宋昕阳研究员、朱正江研究员和陈晟教授的指导下完成，课题组的其他成员积极参与，并得到了中国科学院上海营养与健康研究所肖意传、邱菊研究员的大力协助，因此，是众多课题组通力合作的结果。　　在雌性小鼠中，粪便中较高的苯乙胺浓度会引起肠道上皮细胞中的DRD2过度激活，促进溶菌酶和防御素表达量增加。这些过量的抗菌肽，对细菌的杀伤力增强，因此，乳酸杆菌等对溶菌酶敏感的菌种在雌性小鼠体内减少。而乳酸杆菌产生的N-乙酰赖氨酸对小胶质细胞介导的炎症具有很强的抑制作用，是缓解中枢神经系统自身免疫性疾病，如多发性硬化的物质基础之一。　　原文链接：https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.10.016

p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 神经细胞.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/noimg/5ea1ac41-e831-42dc-ab38-5e418c9181f5.jpg" / 　 /p p 　世界上没有两片完全相同的叶子，细胞也是。然而，科学家们在进行现代生物学研究时，大多时候都考察的是细胞群体，而忽略了细胞异质性。 /p p 　　就拿神经细胞来说，大脑中有亿万个神经细胞，这些神经细胞在细胞形态，突触连结，细胞结构，电生理以及生理功能上具有高度的多样性。不同种类的神经细胞中，其基因组、蛋白组、化学分子组成、含量、代谢也都有着很大的差别。在直径不到1毫米的一个很小的脑区，可能就存在几十种甚至上百种完全不同的神经元以及胶质细胞类型。甚至很多情况下，即使物理距离上相邻的两个神经元也可能是两个不同的神经元类型。因此，对脑内单个神经元的基因组、蛋白质组以及代谢组进行分析，具有重要的生物学价值。 /p p 　　单细胞技术在近年发展非常迅速，比如单细胞测序，已经广泛应用于各种生命学科的研究。2014年1月Nature Methods上发表的年度特别报道，将“单细胞测序”(Singled out for sequencing)的应用列为2013年度最重要的方法学进展。 /p p 　　单细胞技术不仅在测序方面取得了极大进展，单细胞质谱分析也正在逐渐得到更多的关注。与用于分析单个细胞基因组的单细胞测序不同，单细胞质谱主要是研究单个细胞内的代谢物情况，例如化学小分子的组成、含量和代谢等等。单细胞质谱的优势在于可以高通量检测目前其它单细胞技术无法检测的小分子化合物，以及它们的代谢过程。同时，由于质谱本身的优势，不需要采取测序或者特异性抗体等外部手段，就可以精确分析检测到的化学物质信息，可以说是“物美价廉”。 不过，由于质谱技术本身的局限性，目前还无法做到类似单细胞测序那样的大规模测量。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　　　多学科交叉合作，开发单神经细胞质谱 /p p 　　2013年，熊伟教授结束了在美国国立卫生研究院的博士后研究工作，回国后加入了中国科学技术大学生命科学学院。在申请中组部“青年千人计划”时，熊伟教授认识了另一位中科大化学学院的“青千”黄光明教授，当时，黄光明教授课题组正在发展一种小样品(pL级别)质谱测量技术。经过多次讨论，他们决定将两个实验室的优势技术进行结合，开发单神经细胞质谱这一新技术。 /p p 　　目前质谱技术在神经科学中的应用，主要还是采用对大量组织细胞匀浆后的样品进行分析。在单细胞检测中，质谱分析因为具有高灵敏度，大的线性范围以及高通量分析化学分子的特点，逐渐被用于单细胞的细胞代谢分析。但目前的方法需要使用大量有机试剂对细胞进行处理，无法保持采样时细胞的活性 冗长的处理和分离过程也导致较慢的分析速度，无法短时间内完成大量单细胞分析 并缺乏来自同一细胞的电生理信号 最终导致单细胞代谢物的质谱分析无法大规模用于神经细胞的分析。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　新技术让质谱分析活体单个神经元成为现实 /p p 　　2017年1月26日，熊伟教授与黄光明教授等人在PNAS上发表了一项题为“Single-neuron identification of chemical constituents, physiological changes, and metabolism using mass spectrometry”的研究。在这项新研究中，研究团队依托电生理膜片钳以及电喷雾离子源技术建立了一种稳定的单神经元胞内组分取样和质谱组分分析技术。 /p p 　　 img title=" 神经细胞2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/noimg/6e5915a4-ec84-4cb3-b4c3-d7724a1fc4d3.jpg" / /p p & nbsp /p p style=" TEXT-ALIGN: center" & nbsp 　 span style=" FONT-SIZE: 14px" 膜片钳与单细胞质谱分析联用技术分析单个神经细胞示意图 /span /p p 　　电生理膜片钳能将玻璃微电极接触并吸附在细胞膜上，高阻抗封接后将膜打穿成孔，记录膜片以外部位的全细胞膜的离子电流。而电喷雾技术主要是利用一个高压交流电使分析物被离子化然后被质谱检测，该离子源具有较强的抗干扰能力。与传统的质谱方法相比，这一新方法最大的优势是可以原位对活细胞进行取样，并且同时采集细胞位置、电生理活动以及细胞内化学成分等多方面的信息。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　质谱分析让神经化学研究进入单细胞水平 /p p 　　研究人员利用这一方法对小鼠海马、前额叶、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元内的数千种化学小分子进行了快速质谱检测，并同步采集了电生理信号。 /p p 　　海马、前额叶、杏仁核、纹状体这四个核团无论是在人类还是低等动物中都非常重要，与学习、记忆和情绪等行为以及相关疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等有着密切的联系。这些核团内的神经元种类繁多，目前国内外有多个课题组正在从单细胞测序的角度解析这些核团的神经元分类及对其功能进行鉴定。熊伟教授表示，他们对这四个核团神经元进行质谱研究，也正是想从单细胞水平全面分析这些核团神经元的代谢组学情况，以及这些代谢通路和代谢组在学习、记忆和情绪等行为及其相关疾病中的作用机制。 /p p 　　在这项研究中，研究人员主要对不同年龄段的小鼠海马、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元中的谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)以及GABA等化学小分子进行定性、定量分析并对其进行神经元分类。 /p p 　　Glu和GABA是中枢神经系统两大类神经递质(兴奋性或抑制性)的代表性分子。早期人们认为一个神经元内只存在一种递质，其全部末梢只能释放同一种递质，这被称之为戴尔原则(Dale& #39 s principle)。然而随着科学技术的发展，人们逐渐认识到两种或两种以上递质(包括调质)可存在于同一神经元内，在适当的刺激下可经突触前膜共同释放。这种新的观点得到了众多电生理及免疫组化等实验的证明。然而这些证据大部分都是间接的证据，尚无直接证据表明二者的共存。这项研究首次在单细胞水平，通过质谱分析给出了二者共存于同一神经元内的直接证据。同时，研究人员还发现了一些尚未在神经系统中被发现的小分子，他们正在努力研究其作用和分子机制。 /p p 　　此外，研究还鉴定了单个神经元内谷氨酰胺的代谢路径。Gln-Glu-GABA通路是谷氨酸和GABA代谢的经典通路，尤其是谷氨酸，它不仅仅作为兴奋性神经递质存在于神经元内，还大量参与到蛋白质的合成代谢以及细胞能量供应体系中。而GABA是中枢神经系统的抑制性递质，可以防止神经细胞过度兴奋。二者与各种脑疾病都有着密切的关系，如自闭症、阿尔茨海默病、帕金森病等。该通路在大脑的发育和衰老中扮演着非常重要的角色。对单个神经元内谷氨酰胺的代谢路径的鉴定对于深入理解这条代谢通路以及与之相关的疾病机制具有重要意义。 /p p 　　这项研究首次利用化学质谱方法直接无稀释地检测单个神经元中多种神经递质、代谢物、脂质等化学小分子，对单个神经元化学成分及代谢物进行了即时分析，并将目前神经细胞成分分析的研究推向了一个活细胞及单细胞水平。这一技术在将来或许能够帮助科学家们在单细胞层次上去研究神经生物学、代谢组学、毒理学等生命科学的重大问题。 /p p 　　谈到临床应用前景时，熊伟教授的态度也十分肯定。他表示，该技术允许研究人员对血液、脑脊液等样品中的单个细胞进行质谱检测，结合相应的生物标记物，完全有可能对阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等神经精神疾病的早期诊断提供帮助。 /p p 　　　熊伟教授从事神经科学研究，他认为现代神经科学研究需要技术的快速研发以及多领域多学科的交叉合作，必须发展包括显微成像、分子示踪、质谱分析、光遗传学以及转基因操作等最新的生物、物理、化学与工程材料等多学科交叉技术。熊伟教授表示，对他而言，科研不仅仅是工作，也是兴趣，尤其是对新技术的热切追求，驱动着他不断前行。熊伟教授及其研究团队也正在和中国科大的其它实验室展开合作，和不同的领域的科学家交流和分享科研心得是一种享受。 /p p 　　该项工作由中科大生命学院博士后朱洪影、生命学院博士研究生邹桂昌、王宁在熊伟教授和黄光明教授的共同指导下完成。该研究工作得到了国家自然科学基金委重大研究计划、科技部、中科院战略性先导科技专项(B类)以及国家青年千人计划等的资助。该工作还得到中国科学技术大学同步辐射实验室光电离质谱线站的仪器与技术支持。　 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" & nbsp img title=" 熊伟.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/noimg/2a3b00c2-8807-4156-a379-59653af1915d.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　熊伟 教授 /p p 　　熊伟教授是国家中组部“青年千人计划”获得者，2001年毕业于北京大学生命科学学院，获理学学士学位。2006年毕业于北京大学生命科学学院，获理学博士学位。2006至2013年，在美国国立卫生研究院(NIH)酒精滥用与酒精中毒研究所(NIAAA)做博士后研究工作。2013年3月加入中国科学技术大学生命科学学院。中科院脑科学与智能技术卓越创新中心骨干成员。中科大神经退行性疾病研究中心暨脑资源库核心成员。长期从事与神经化学、药理学、小分子药物研发相关的神经科学研究，运用多种先进的实验技术从分子、细胞水平、到动物行为进行了深入系统的研究，并取得了系列重要成果。研究工作发表在Nature Neuroscience, Nature Chemical Biology, Journal of Experimental Medicine, PNAS, Journal of Neuroscience, Molecular Pharmacology等国际学术期刊上。获得过多项国家级基金资助。 /p

今日，曼哈格和博莱克联合研发生产的蛋白质氨基酸/神经递质/儿茶酚胺检测试剂盒（液相色谱-串联质谱法）隆重推出。本次推出的3套kit是建立在高效液相色谱质谱平台上，可针对实验动物和人体血样、尿样中的20种蛋白质氨基酸、12种神经递质和6种儿茶酚胺进行精准定量检测。检测试剂盒检测指标▣ 20种蛋白质氨基酸Asparagine天冬酰胺proline脯氨酸Histidine组氨酸Tyrosine酪氨酸Serine丝氨酸Methionine甲硫氨酸Glycine甘氨酸Lysine赖氨酸Glutamine谷氨酰胺Valine缬氨酸Arginine精氨酸Isoleucine异亮氨酸Aspartic acid天冬氨酸Leucine亮氨酸Glutamic acid谷氨酸Phenylalanine苯丙氨酸Threonine苏氨酸Tryptophan色氨酸Alanine丙氨酸Cysteine半胱氨酸▣ 12种神经递质Norepinephrine去甲肾上腺素γ-Aminobutyricacid4-氨基丁酸Metanephrine甲氧基肾上腺素Octopamine章鱼胺Epinephrine肾上腺素Tyramine酪胺Dopamine多巴胺Agmatine胍丁胺Serotonin5-羟色胺Methoxytyramine甲氧酩胺Tryptamine色胺Histamine组胺▣ 6种儿茶酚胺Normetanephrine甲氧基去甲肾上腺素Epinephrine肾上腺素Norepinephrine去甲肾上腺素Dopamine多巴胺Metanephrine甲氧基肾上腺素Methoxytyramine甲氧酪胺产品优势

p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 神经递质，大脑中在突触传递中担当“信使”的特定化学物质，称作神经递质，简称递质。图1、图2为其示意图。随着神经生物学的发展，陆续在神经系统中发现了大量神经活性物质。在中枢神经系统（CNS）中，突触传递最重要的方式是神经化学传递。神经递质由突触前膜释放后立即与相应的突触后膜受体结合，产生突触去极化电位或超极化电位，导致突触后神经兴奋性升高或降低。神经递质组成复杂，包括多种生化物质。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201905/uepic/fbdc9fad-1519-44e3-a655-6b3885113b87.jpg" title=" 图片 1.png" alt=" 图片 1.png" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em " 图1 神经递质示意图 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201905/uepic/0c74c60c-889b-43a7-9e53-78cd8567cd74.jpg" title=" 图片 2.png" alt=" 图片 2.png" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em " 图2 大脑中的“神经递质”， span style=" text-align: justify text-indent: 2em " 黑质就被称为“神经递质” /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 要对神经递质进行分析，必须首先从活脑中提取神经递质，然后用HPLC-MS / MS进行分析，这实在有点匪夷所思，令人难以置信。然而，加拿大滑铁卢大学雅努什· 波利西恩（Janusz Pawliszyn）领导的团队成功了。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 从活脑中提取神经递质，本质上是侵入性的。但是，他们通过利用固相微萃取（SPME）技术，已设法使其成为非侵入性的。他们的方法是将涂有某种形式的吸收性SPME材料的细不锈钢丝插入活体的大脑中。由于钢丝较细，对大脑造成的干扰较小，雅努什的团队使用150μm粗的不锈钢丝。他们首先用酸蚀刻了不锈钢丝的下端部分，直到它只有100μm粗。然后，他们将SPME涂在蚀刻部分，将其直径又增加至150μm。最后，又在涂层部分再添加了50μm厚的覆盖层。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 该团队在特制的神经递质混合物（包括去甲肾上腺素，乙酰胆碱和5-羟色胺）上测试了各种不同的市售聚合物SPME材料，但没有一种被证明是理想的。问题在于性能最好的SPME材料是以相对较大的颗粒形式出现的，尺寸可达60μm，需要将其研磨成细粉末涂在钢丝上。但这种研磨导致材料失去了一些官能团，使其在吸收神经递质方面的效率降低。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 所以波利西恩和他的团队选择使用来自沃特世的一种名为HLB（亲水 - 亲脂平衡）的SPME材料，这种材料在吸收神经递质方面不如其他一些材料有效，但其颗粒直径却只有5μm，可直接应用于钢丝。然后，他们在颗粒表面添加了强阳离子交换（SCX）基团，提高了材料对神经递质的有效性。在吸收神经递质混合物方面时，HLB-SCX材料被证明优于任何其他测试的SPME材料。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " SPME材料确定后，他们用提取的脑组织和琼脂凝胶的混合物制成了人造大脑材料，以方便研究。在人造大脑材料中，加入了另一种神经递质混合物。他们发现，将HLB-SCX涂层的钢丝插入人造大脑，20min后，足以使HLB-SCX材料吸收令人满意的神经递质。将HLB-SCX涂层的钢丝取出，浸泡在水、乙腈和甲醇的混合物中，释放神经递质，然后以高效液相色谱 - 串联质谱（HPLC-MS / MS）仪进行分析。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 实验表明HLB-SCX材料可以从脑材料中提取几种加标的神经递质，包括去甲肾上腺素、乙酰胆碱和5-羟色胺，用于通过HPLC-MS / MS在低于生理水平进行鉴定。然而，其他神经递质，包括牛磺酸，谷氨酸和γ-氨基丁酸，只能在高于正常生理水平的浓度下检测到。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 最后，他们在活恒河猴猕猴的大脑上测试了他们的SPME方法。这包括在三个不同的场合同时将HLB-SCX涂层的钢丝插入猴脑的三个不同区域。当科学家用HPLC-MS / MS分析提取的物质时，能够检测到多种不同的神经递质，包括多巴胺、谷氨酸和色氨酸。他们用人工脑材料进行测试，甚至能够检测到牛磺酸，这是用生理检测方法检测不到的。他们还测量了大脑不同区域的不同浓度的神经递质，其中，在某区域发现的神经递质，在其它区域可能根本没有发现，即使在同一区域内，场合不同其神经递质也不同。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 在此成功之后，波利西恩及其团队正在计划使用他们的SPME方法对活恒河猴猕猴大脑中神经递质的分布进行详细研究。他们还在考虑进一步提高方法提取效率的方法，以便它可以解释可能存在的所有神经递质。 /p p style=" text-align: right text-indent: 2em " （编译：符斌 北京中实国金国际实验室能力验证研究中心研究员） /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 根据Brain extraction: A novel method for extracting neurotransmitters from live brains编写 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " Published: Apr 15, 2019 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" text-indent: 2em " Author: Jon Evans /span /p p style=" text-indent: 2em " SeparationsNOW.com& nbsp & nbsp sample Preparation Newsletter /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " br/ /p p br/ /p

p style=" text-align: center " img title=" 1.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/0bb94937-6370-4e0c-8471-e1a4f208f43b.jpg" / /p p 　　采访嘉宾：熊伟 (中国科学技术大学生命科学学院教授，博士生导师) /p p 　　世界上没有两片完全相同的叶子，细胞也是。然而，科学家们在进行现代生物学研究时，大多时候都考察的是细胞群体，而忽略了细胞异质性。 /p p 　　就拿神经细胞来说，大脑中有亿万个神经细胞，这些神经细胞在细胞形态，突触连结，细胞结构，电生理以及生理功能上具有高度的多样性。不同种类的神经细胞中，其基因组、蛋白组、化学分子组成、含量、代谢也都有着很大的差别。在直径不到1毫米的一个很小的脑区，可能就存在几十种甚至上百种完全不同的神经元以及胶质细胞类型。甚至很多情况下，即使物理距离上相邻的两个神经元也可能是两个不同的神经元类型。因此，对脑内单个神经元的基因组、蛋白质组以及代谢组进行分析，具有重要的生物学价值。 /p p 　　单细胞技术在近年发展非常迅速，比如单细胞测序，已经广泛应用于各种生命学科的研究。2014年1月Nature Methods上发表的年度特别报道，将“单细胞测序”(Singled out for sequencing)的应用列为2013年度最重要的方法学进展。 /p p 　　单细胞技术不仅在测序方面取得了极大进展，单细胞质谱分析也正在逐渐得到更多的关注。与用于分析单个细胞基因组的单细胞测序不同，单细胞质谱主要是研究单个细胞内的代谢物情况，例如化学小分子的组成、含量和代谢等等。单细胞质谱的优势在于可以高通量检测目前其它单细胞技术无法检测的小分子化合物，以及它们的代谢过程。同时，由于质谱本身的优势，不需要采取测序或者特异性抗体等外部手段，就可以精确分析检测到的化学物质信息，可以说是“物美价廉”。 不过，由于质谱技术本身的局限性，目前还无法做到类似单细胞测序那样的大规模测量。 /p p 　　 strong 1. 多学科交叉合作，开发单神经细胞质谱 /strong /p p 　　2013年，熊伟教授结束了在美国国立卫生研究院的博士后研究工作，回国后加入了中国科学技术大学生命科学学院。在申请中组部“青年千人计划”时，熊伟教授认识了另一位中科大化学学院的“青千”黄光明教授，当时，黄光明教授课题组正在发展一种小样品(pL级别)质谱测量技术。经过多次讨论，他们决定将两个实验室的优势技术进行结合，开发单神经细胞质谱这一新技术。 /p p 　　目前质谱技术在神经科学中的应用，主要还是采用对大量组织细胞匀浆后的样品进行分析。在单细胞检测中，质谱分析因为具有高灵敏度，大的线性范围以及高通量分析化学分子的特点，逐渐被用于单细胞的细胞代谢分析。但目前的方法需要使用大量有机试剂对细胞进行处理，无法保持采样时细胞的活性 冗长的处理和分离过程也导致较慢的分析速度，无法短时间内完成大量单细胞分析 并缺乏来自同一细胞的电生理信号 最终导致单细胞代谢物的质谱分析无法大规模用于神经细胞的分析。 /p p 　　 strong 2. 新技术让质谱分析活体单个神经元成为现实 /strong /p p 　　2017年1月26日，熊伟教授与黄光明教授等人在PNAS上发表了一项题为“Single-neuron identification of chemical constituents, physiological changes, and metabolism using mass spectrometry”的研究。在这项新研究中，研究团队依托电生理膜片钳以及电喷雾离子源技术建立了一种稳定的单神经元胞内组分取样和质谱组分分析技术。 /p p style=" text-align: center " img title=" 2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/705ccfee-dabe-4de5-8fa8-1bde4c73181d.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 膜片钳与单细胞质谱分析联用技术分析单个神经细胞示意图 /strong /p p 　　电生理膜片钳能将玻璃微电极接触并吸附在细胞膜上，高阻抗封接后将膜打穿成孔，记录膜片以外部位的全细胞膜的离子电流。而电喷雾技术主要是利用一个高压交流电使分析物被离子化然后被质谱检测，该离子源具有较强的抗干扰能力。与传统的质谱方法相比，这一新方法最大的优势是可以原位对活细胞进行取样，并且同时采集细胞位置、电生理活动以及细胞内化学成分等多方面的信息。 /p p 　　 strong 3. 质谱分析让神经化学研究进入单细胞水平 /strong /p p 　　研究人员利用这一方法对小鼠海马、前额叶、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元内的数千种化学小分子进行了快速质谱检测，并同步采集了电生理信号。 /p p 　　海马、前额叶、杏仁核、纹状体这四个核团无论是在人类还是低等动物中都非常重要，与学习、记忆和情绪等行为以及相关疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等有着密切的联系。这些核团内的神经元种类繁多，目前国内外有多个课题组正在从单细胞测序的角度解析这些核团的神经元分类及对其功能进行鉴定。熊伟教授表示，他们对这四个核团神经元进行质谱研究，也正是想从单细胞水平全面分析这些核团神经元的代谢组学情况，以及这些代谢通路和代谢组在学习、记忆和情绪等行为及其相关疾病中的作用机制。 /p p 　　在这项研究中，研究人员主要对不同年龄段的小鼠海马、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元中的谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)以及GABA等化学小分子进行定性、定量分析并对其进行神经元分类。 /p p 　　Glu和GABA是中枢神经系统两大类神经递质(兴奋性或抑制性)的代表性分子。早期人们认为一个神经元内只存在一种递质，其全部末梢只能释放同一种递质，这被称之为戴尔原则(Dale& #39 s principle)。然而随着科学技术的发展，人们逐渐认识到两种或两种以上递质(包括调质)可存在于同一神经元内，在适当的刺激下可经突触前膜共同释放。这种新的观点得到了众多电生理及免疫组化等实验的证明。然而这些证据大部分都是间接的证据，尚无直接证据表明二者的共存。这项研究首次在单细胞水平，通过质谱分析给出了二者共存于同一神经元内的直接证据。同时，研究人员还发现了一些尚未在神经系统中被发现的小分子，他们正在努力研究其作用和分子机制。 /p p 　　此外，研究还鉴定了单个神经元内谷氨酰胺的代谢路径。Gln-Glu-GABA通路是谷氨酸和GABA代谢的经典通路，尤其是谷氨酸，它不仅仅作为兴奋性神经递质存在于神经元内，还大量参与到蛋白质的合成代谢以及细胞能量供应体系中。而GABA是中枢神经系统的抑制性递质，可以防止神经细胞过度兴奋。二者与各种脑疾病都有着密切的关系，如自闭症、阿尔茨海默病、帕金森病等。该通路在大脑的发育和衰老中扮演着非常重要的角色。对单个神经元内谷氨酰胺的代谢路径的鉴定对于深入理解这条代谢通路以及与之相关的疾病机制具有重要意义。 /p p 　　这项研究首次利用化学质谱方法直接无稀释地检测单个神经元中多种神经递质、代谢物、脂质等化学小分子，对单个神经元化学成分及代谢物进行了即时分析，并将目前神经细胞成分分析的研究推向了一个活细胞及单细胞水平。这一技术在将来或许能够帮助科学家们在单细胞层次上去研究神经生物学、代谢组学、毒理学等生命科学的重大问题。 /p p 　　谈到临床应用前景时，熊伟教授的态度也十分肯定。他表示，该技术允许研究人员对血液、脑脊液等样品中的单个细胞进行质谱检测，结合相应的生物标记物，完全有可能对阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等神经精神疾病的早期诊断提供帮助。 /p p 　　 strong 4. 后记 /strong /p p 　　熊伟教授从事神经科学研究，他认为现代神经科学研究需要技术的快速研发以及多领域多学科的交叉合作，必须发展包括显微成像、分子示踪、质谱分析、光遗传学以及转基因操作等最新的生物、物理、化学与工程材料等多学科交叉技术。熊伟教授表示，对他而言，科研不仅仅是工作，也是兴趣，尤其是对新技术的热切追求，驱动着他不断前行。熊伟教授及其研究团队也正在和中国科大的其它实验室展开合作，和不同的领域的科学家交流和分享科研心得是一种享受。 /p p 　　 strong 关于研究人员 /strong /p p 　　该项工作由中科大生命学院博士后朱洪影、生命学院博士研究生邹桂昌、王宁在熊伟教授和黄光明教授的共同指导下完成。该研究工作得到了国家自然科学基金委重大研究计划、科技部、中科院战略性先导科技专项(B类)以及国家青年千人计划等的资助。该工作还得到中国科学技术大学同步辐射实验室光电离质谱线站的仪器与技术支持。 /p p 　　 strong 关于熊伟教授 /strong /p p style=" text-align: center " img title=" 3.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/feba38ed-9bd1-4fc4-9016-bb72aef280df.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 熊伟 教授 /strong /p p 　　国家中组部“青年千人计划”获得者，2001年毕业于北京大学生命科学学院，获理学学士学位。2006年毕业于北京大学生命科学学院，获理学博士学位。2006至2013年，在美国国立卫生研究院(NIH)酒精滥用与酒精中毒研究所(NIAAA)做博士后研究工作。2013年3月加入中国科学技术大学生命科学学院。中科院脑科学与智能技术卓越创新中心骨干成员。中科大神经退行性疾病研究中心暨脑资源库核心成员。长期从事与神经化学、药理学、小分子药物研发相关的神经科学研究，运用多种先进的实验技术从分子、细胞水平、到动物行为进行了深入系统的研究，并取得了系列重要成果。研究工作发表在Nature Neuroscience, Nature Chemical Biology, Journal of Experimental Medicine, PNAS, Journal of Neuroscience, Molecular Pharmacology等国际学术期刊上。获得过多项国家级基金资助。 /p p 　　 strong 参考文献： /strong /p p 　　Single-neuron identification of chemical constituents, physiological changes, and metabolism using mass spectrometry /p p & nbsp /p

p 　　近日，国际综合研究权威期刊《美国国家科学院院报》(PNAS)发表了题为《Single-Neuron Identification Of Chemical Constituents， Physiological Changes， And Metabolism Using Mass Spectrometry》的研究论文。该研究由中国科学技术大学生命学院神经退行性疾病研究中心暨中国科学技术大学脑资源库熊伟教授研究组与中科大化学学院黄光明教授研究组合作完成。该研究依托电生理膜片钳以及电喷雾离子源技术建立的稳定的单神经元胞内组分取样和质谱组分分析技术，对小鼠海马、前额叶、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元内的数千种化学小分子进行了快速质谱检测，并且可以做到同步采集电生理信号，在单细胞层次上成功地完成了对神经元功能、代谢物组成及其代谢通路的研究。这项研究首次利用化学质谱方法直接无稀释的检测单个神经元中多种神经递质、代谢物、脂质等化学小分子，实现了单个神经元化学成分及代谢物的即时分析，该技术将目前神经细胞成分分析的研究推向了一个活细胞及单细胞水平，有望在单细胞层次上去研究神经生物学、代谢组学、毒理学等生命科学的重大问题，具有非常重要的应用前景。 /p p 　　大脑中有亿万个神经细胞，这些神经细胞在细胞形态，突触连结，细胞结构，电生理以及生理功能上具有高度的多样性。不同种类的神经细胞中，其化学分子组成、含量、代谢也都有着很大的差别。因此，对脑内单个神经元的化学成分进行分析，则具有重要的生物学价值。质谱分析因为具有高灵敏度，大的线性范围以及高通量分析化学分子的特点，逐渐被用于单细胞的细胞代谢分析。但目前的方法需要使用大量有机试剂对细胞进行处理，无法保持采样时细胞的活性 冗长的处理和分离过程也导致较慢的分析速度，无法短时间内完成大量单细胞分析 并缺乏来自同一细胞的电生理信号 最终导致单细胞代谢物的质谱分析无法大规模用于神经细胞的分析。 /p p 　　此研究成功建立了一套稳定的单细胞质谱分析技术，并对不同年龄段的小鼠海马、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元中的谷氨酰胺、谷氨酸以及GABA等化学小分子进行定性、定量分析并对其进行神经元分类，最后利用该技术成功鉴定单个神经元内谷氨酰胺的代谢路径。这项方法的成熟与普及，必会为后续单个神经元组分分析、神经元分类以及病理状态下单个神经元中组分变化分析提供强有力的手段。 /p p 　　该项工作由中科大生命学院博士后朱洪影、生命学院博士研究生邹桂昌、王宁在熊伟教授和黄光明教授的共同指导下完成。该研究工作得到了国家自然科学基金委重大研究计划、科技部、中科院战略性先导科技专项(B类)以及国家青年千人计划等的资助。该工作还得到中国科学技术大学同步辐射实验室光电离质谱线站的仪器与技术支持。 /p

7月20日，《柳叶刀-区域健康（西太平洋）》这一国际知名医学期刊发布了全球首个重症肌无力抗体诊断I级方法学推荐证据，证实了基于细胞的抗体检测新技术CBA在诊断可靠性方面优于放射免疫等传统诊断技术。这一突破性成果源自于“SCREAM”研究（NCT05219097），这项全国多中心、前瞻性和双盲试验由京津神免中心领导完成，得到金域医学和天海新域的诊断平台和试剂支持，为指导临床医生选择重症肌无力等神经免疫病的临床诊断提供了重要参考。重症肌无力（MG）是一种由自身抗体介导的神经免疫疾病，早期明确诊断对于患者的治疗和病情控制至关重要。MG患者血清中存在多种相关自身抗体，包括乙酰胆碱受体（AChR）抗体、肌肉特异性受体酪氨酸激酶（MuSK）抗体、连接素（titin）抗体、兰尼碱受体（RyR）抗体等，其中AChR和MuSK抗体是国内外MG诊治指南推荐的首选实验室诊断指标。MG自身抗体的检测方法包括放射免疫沉淀法（RIPA）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）和细胞免疫荧光法（CBA）等多种，然而这些方法的特异度和敏感度存在差异，选择不同的检测技术可能会影响自身抗体检测结果的准确性。目前缺乏针对不同检测技术敏感性和特异性的大样本多中心研究证据，无法满足神经免疫病的诊治、患者转诊抗体检测结果互认以及全球药物临床试验认可的技术需求。为解决这一难题，由天津医科大学总医院/北京天坛医院施教授团队领导，全国多家神经免疫中心共同发起了“SCREAM”研究，得到了金域医学和天海新域的CBA诊断平台和试剂支持，完成了这项前瞻性双盲研究（The Specificity, Sensitivity and Clinical Correlation of CBA, RIPA and ELISA Assay in Detecting AChR and MuSK-IgG, NCT05219097 “SCREAM”研究），为AChR和MuSK抗体检测方法学选择提供了指导性建议，将进一步推动MG自身抗体诊断的规范化。“SCREAM”研究是迄今纳入样本量最多的MG抗体诊断方法学大型队列研究，也是首个前瞻性、双盲研究。由此产生的循证医学证据达到I级推荐标准，为临床医生选择最佳实验室诊断方法提供了关键依据，同时对其他神经免疫病抗体检测及临床试验也具有重要参考价值。神经免疫疾病是全球青壮年致残的首要原因，包括多发性硬化、视神经脊髓炎和重症肌无力等。目前，金域医学联合京津神免中心、天海新域建立了神经免疫病诊断技术的创新研发、产品标准化和应用的联动体系。CBA+TBA诊断体系涵盖常见的重症肌无力、中枢神经系统炎性脱髓鞘、自身免疫性脑炎等疾病近百个抗体检测项目。同时，金域医学与天海新域共同参与神经免疫病大样本数据研究，为“重症肌无力及中枢神经免疫病抗体检测专家共识2022”、诊断方法学I级推荐证据研究等提供支持。从金域医学此次新动态可知，双方还为临床医生提供诊疗决策支持工具，帮助实现患者管理、减缓免疫损伤和疾病进展，助力提升神经免疫专业临床医生诊治水平，为我国神经免疫专科的高质量发展贡献力量。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Anal Chem.上的文章，Distinguishing Histidine Tautomers in Proteins Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry [1]。该文章的通讯作者是来自马萨诸塞大学阿默斯特分校的Richard W. Vachet教授。组氨酸是人体蛋白质结构中的重要组成氨基酸，研究发现，组氨酸具有Nδ-H和Nε-H两种互变异构体，通过两种互变异构体的转换，可以在蛋白质中介导质子转移。目前常使用2D NMR技术进行区分，但操作相对繁复。共价标记质谱是一种研究蛋白质结构的有力方法，具有操作简单，灵敏度高，结构分辨率高等优点。在本文中，作者尝试以焦碳酸二乙酯（DEPC）为标记试剂，采用共价标记质谱区分组氨酸互变异构体。组氨酸侧链的咪唑上具有两个氮原子，其中一个氮上的孤电子对参与芳香环π键的组成，而另一个氮原子仍保留孤对电子，更容易与DEPC等亲电子试剂反应。而组氨酸的两个互变异构体中都只有一个保留孤对电子的氮原子，且该氮原子位置不同，Nδ-H互变异构体中的Nε2与DEPC反应，而Nε-H互变异构体中的为Nδ1。因此以DEPC标记组氨酸以区分两个互变异构体的方法是可行的（图1）。图1. DEPC 结构及其与两种不同组氨酸互变异构体的反应 为了测试DEPC 标记区分两种互变异构体的能力，作者以几种含组氨酸的肽，在确保DEPC仅标记组氨酸条件下进行实验。以Fmoc-DGHGG-NH2为例子，该肽在N端包括一个Fmoc基团以确保仅标记组氨酸。采用等度洗脱来最大限度地利用LC分离两种异构体，并确保流动相组成不影响肽段电离效率，从而可以更好地量化每个互变异构体的比率。结果发现，在11.4和13.6分钟洗脱的峰具有相同的m/z值（图2）。根据串联MS数据，发现这两个峰代表着组氨酸上成功标记DEPC的单一物质（图3）。并且，这些同量异位离子的串联质谱不同，表明这两种物质为带有不同组氨酸互变异构体的物质。作者将先洗脱出的物质命名为修饰物质1，后洗脱出的为修饰物质2。根据MS/MS数据，两者的主要区别为修饰物质2具有更加丰富的羧基化a3离子（a3*）。图2. 未标记（蓝色迹线）和 DEPC 标记（红色迹线）肽 Fmoc-DGHGG-NH 2的提取离子色谱图。DEPC浓度比肽浓度高10倍，反应1分钟图3. 两种修饰的His异构体的串联质谱。(a)来自图2中的色谱图的修饰物质 1 的串联质谱。(b)来自图2中的色谱图的修饰物质2的串联质谱。标有星号 (*) 的产物离子包含羧基化产物此外，在重复实验中，作者发现物质2与物质1的丰度比为3.9± 0.2。而研究发现，在中性pH条件下，游离氨基酸Nε-H 互变异构体与 Nδ-H 互变异构体的比接近于4:1。因此，两物质的峰面积比表明物质1可能为 Nδ-H 互变异构体，而物质2可能为 Nε-H 互变异构体。结合以上发现，并考虑肽解离途径等因素，作者对两物质质谱图谱差异做出推测。当物质2为Nε-H互变异构体侧链时，DEPC 标记在Nδ1上，有利于肽通过bx-yz途径解离，随后通过bx-ax途径损失CO，因此物质2富含a3*离子。当物质1为Nδ-H 互变异构体时，DEPC 标记在Nε2上，肽通过组氨酸途径解离，并形成了稳定五元环，因此优先形成更稳定的b3*离子（图4）。以上发现进一步证明了Fmoc-DGHGG-NH2中物质1为 Nδ-H 互变异构体，物质2为 Nε-H 互变异构体。根据丰度比以及肽解离途径不同，作者在其他模型肽标记实验中也成功区分两互变异构体。由于组氨酸的pKa在一定程度上会影响互变异构体的比例，因此两互变异构体的丰度比可能会略有变化。总之，以上结果表明，DEPC共价标记质谱可以识别两个组氨酸互变异构体。图4. DEPC 标记的含组氨酸肽 CID 过程中两种异构体的肽片段化途径。左侧通路为物质1（Nδ-H互变异构体），右侧通路为物质2（Nε-H互变异构体）之后，作者还进一步研究了不同DEPC浓度对实验的影响。结果发现，在 DEPC 浓度范围超过一个数量级时，Fmoc-DGHGG-NH2的两种修饰形式的比率基本在4左右保持恒定，其他模型肽的比率略有不同（图5），但随着 DEPC 浓度的增加，给定肽的标记比率保持不变。在质谱可以确认互变异构体结构的肽中，Nε-H互变异构体总是丰度相对更高，洗脱相对较晚。此外，作者发现当组氨酸不是位于N末端残基时，Nε-H 互变异构体的an */bn *比率总是比Nδ -H 互变异构体的更高。但是，若组氨酸残基位于肽的N末端时，在质谱中观察不到b1和a1离子，将对结果造成影响。图 5. 在 DEPC 浓度增加时选择肽的两种修饰形式的标记比率。(a) Fmoc-DGHGG-NH2；(b) Ac-IQVYSRHPAENGK(Ac)；(c) Ac-VEADIAGHGQEVLIR；(d) Ac-LFTGHPETLEK(Ac)。MS/MS 用于通过测量an /bn离子的比率来确认每个互变异构体总而言之，作者成功使用DEPC共价标记质谱区分肽与蛋白质中的组氨酸互变异构体，利用丰度比与洗脱时间，以及CID期间的肽解离模式，区分两种互变异构体。利用该方法，作者团队已经确定了几种蛋白质组氨酸互变异构体比率，并且相对于2D NMR方法，该方法更简单、更快、更精确，有利于探索蛋白质中组氨酸残基周围的局部结构，提供高分辨率的结构信息。[1]Pan X, Kirsch ZJ, Vachet RW. Distinguishing Histidine Tautomers in Proteins Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Anal Chem. 2022 Jan 18 94(2):1003-1010.

果汁检测用试剂&mdash &mdash 钾、总磷、总黄酮、可溶性固形物（折光率）、L-脯氨酸、总D-异柠檬酸 &ldquo 烂果门&rdquo 事件，怎可坐以待毙！ 近期有媒体暗访指多家内地果汁生产商涉嫌使用腐烂果汁。国产果汁巨头卷入&ldquo 烂果门&rdquo ，你是否忧心忡忡？大多果汁含量无据可依，你该如何选择？国家统计局的数据显示，2012年全国饮料行业总产量为13024.01万吨，比上年增长10.73%，其中，国内果汁和蔬菜汁饮料产量为2229.17万吨（最主要为果汁饮料），占到饮料总产量的17.16%，较2011年增长16.09%。这些果汁真的如消费者理解的哪样健康自然高品质吗？ 上海甄准生物科技有限公司是一家专业经营标准物质、标准品、化学试剂及相关技术服务创新型高科技企业，坐落于人才荟萃的上海张江高科技园区。 自公司成立以来，一直以"客户满意"为公司核心价值观，产品主要应用于制药、生物、食品、环境、材料和农业等领域。本着始终拥有的创业激情和服务热忱，甄准生物已成长为我国重要的标准物质和标准品领域集成服务的领导者、中国最大的标准物质/标准品供应商之一。 上海甄准生物提供果汁检测的钾、总磷、氨基酸态氮、总黄酮、可溶性固形物（折光率）、L-脯氨酸、总D-异柠檬酸检测标准品和试剂。 产品信息： 货号 描述 规格 可溶性固形物检测ZZSRIBS07S 折光率标准液1.343253 (± 0.00004)@20C 15ml ZZSRIBS10S 折光率标准液1.347824 (± 0.00004)@20C 15ml ZZSRIBS112S 折光率标准液1.349682 (± 0.00004)@20C 15ml ZZSRIBS115S 折光率标准液1.350149 (± 0.00004)@20C 15ml ZZSRIBS12S 折光率标准液1.35093 (± 0.00004)@20C 15ml ZZSRIBS125S 折光率标准液1.35093 (± 0.00004)@20C 15ml ZZSRIBS15S 折光率标准液1.355679 (± 0.00004)@20C 15ml ZZSRIBS20S 折光率标准液1.363842 (± 0.00004)@20C 15ml ZZSRIBS25S 折光率标准液1.372328 (± 0.00004)@20C 15ml ZZSRIBS30S 折光率标准液1.381149 (± 0.00004)@20C 15ml ZZSRIBS35S 折光率标准液1.390322 (± 0.00004)@20C15ml ZZSRIBS40S 折光率标准液1.39986 (± 0.00004)@20C 15ml ZZSRIBS45S 折光率标准液1.409777 (± 0.00004)@20C 15ml ZZSRIBS50S 折光率标准液1.420087 (± 0.00004)@20C 15mlZZSRIBS55S 折光率标准液1.4308 (± 0.00004)@20C 15ml ZZSRIBS60S 折光率标准液1.441928 (± 0.00004)@20C 15ml 总D-异柠檬酸检测 ZZK-ISOC D-异柠檬酸检测试剂盒 100 test L-脯氨酸检测 ZZS1568506 L-脯氨酸标准品 200MG ZZR70501 茚三酮显色液 2L 钾检测 ICCS03 钾离子 K+ 1mg/ml 1000ppm 100ml ICCT03 钾离子 K+ 0.2mg/ml 200ppm 100ml 甄准，甄心倾听您每一个标准！

中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所“天然药物活性物质与功能”国家重点实验室再帕尔•阿不力孜研究员团队，在《药学学报》英文刊（Acta Pharmaceutica Sinica B）发表了题为“时空分辨代谢组学与同位素示踪方法揭示中枢神经系统药物靶标”的研究论文。由于大脑结构与功能的复杂性，中枢神经系统（CNS）药物的作用机制研究及其靶标的发现与解析是具有挑战性的科学问题。围绕天然来源药物多靶标解析及其CNS药物的作用机制研究，该研究团队采用自主研制的敞开式空气动力辅助离子化质谱成像（AFADESI-MSI）技术，提出将空间分辨代谢组学与同位素示踪分析方法进行整合的研究策略，采用建立的质谱成像可视化分析方法开展了镇静催眠候选新药YZG-331的药物作用机制与多靶标解析研究。研究基于高灵敏、高覆盖的AFADESI-MSI分析方法，系统考察了YZG-331干预下内源性代谢物在大鼠脑微区中的时空动态分布特征，结合原位代谢组学数据处理方法，发现与YZG-331药物作用相关的功能代谢物，并由此定位至两条代谢通路。其中，“谷氨酰胺-谷氨酸-GABA”代谢通路分析与同位素葡萄糖示踪分析二者结果同时显示，GABA/谷氨酸比值在下丘脑区明显升高，则表明给予YZG-331后下丘脑中谷氨酸脱羧酶（GAD）活性可能增强。而“组氨酸-组胺-1-甲基组胺”代谢通路分析与同位素组胺示踪分析二者结果共同表明，给药后松果体区大量增加的组胺主要来源于外周组胺的升高及其对松果体的渗透。此外，给药后1-甲基组胺在丘脑和下丘脑区显著增加。结合体外方法和模型的验证，发现YZG-331可激动GAD酶活性增加GABA含量，并通过激动有机阳离子转运体3（OCT3）和氨基酸转运体1（LAT1）在外周释放组胺，同时可能通过激动OCT3转运体以及利用大鼠脑内HNMT酶自身的高活性，加速组胺代谢为1-甲基组胺。研究手段与策略有助于阐释CNS候选新药的药效作用机制和发现潜在的多靶标，为CNS药物研发及有效性、安全性评价等提供新的视角和可视化分析手段。博士生金波和逄雪超博士为共同第一作者；贺玖明研究员和再帕尔•阿不力孜教授为该论文的共同通讯作者。研究工作得到了国家自然科学基金、中国医学科学院医学与健康科技创新工程等项目的资助。Spatiotemporally resolved metabolomics and isotope tracing reveal CNS drug targetsBo Jin, Xuechao Pang, Qingce Zang, Man Ga, Jing Xu, Zhigang Luo, Ruiping Zhang, Jiangong Shi, Jiuming He*, Zeper Abliz*Acta Pharm Sin B 2022. https://doi.org/10.1016/j.apsb.2022.11.011作者简介再帕尔阿不力孜，博士生导师，二级教授，《药学学报》英文刊编委。中国医学科学院药物研究所研究员、北京协和医学院特聘教授，“天然药物活性物质与功能国家重点实验室”副主任、药物分析学系主任、药物分析研究室主任。中央民族大学药学院教授、“质谱成像与代谢组学”国家民委重点实验室主任。新世纪百千万人才工程国家级人选，享受国务院特殊津贴专家，国家民委领军人才。国务院学位委员会第七届药学学科评议组成员，教育部第七届科学技术委员会委员和第八届科技委药学与中医药学部委员，中国分析测试协会副理事长，中国化学会质谱分析专业委员会副主任委员等。先后担任“863”计划项目首席专家、国家重点研发计划项目负责人。长期从事质谱分析新方法与技术及其应用研究，在PNAS、Adv Sci、Anal Chem、Acta Pharm Sin B等学术期刊上发表论文120余篇；这些年在代谢组学、质谱成像新技术、空间分辨代谢组学与应用等方面取得一批创新成果。贺玖明，博士生导师，药物分析专业；中国医学科学院北京协和医学院药物研究所研究员，主要研究方向：质谱成像空间分辨代谢组学新技术新方法及其生物医药应用研究。开发出空气动力辅助离子化及质谱成像新技术和空间分辨代谢组学新方法，建立了以空间分辨代谢组学技术为特色的新药代谢研究平台。国家药品监督管理局创新药物安全与评价重点实验室学委委员；担任《药学学报》、Acta Pharm Sin B、J Pharm Anal青年编委，Molecules、TMR Modern Herbal Medicine和《药学研究》编委；中国医药生物技术协会药物分析技术分会常务委员，中国质谱学会常务委员。å

p 　　在国家自然科学基金项目(项目编号：81530080,81661128007, 81773062, 81788101)等资助下，中国医学科学院基础医学研究所黄波教授课题组揭示了具有干性的肿瘤再生细胞利用色氨酸代谢途径启动肿瘤组织中T细胞PD-1表达上调的机制。相关结果以“Tumor-Repopulating Cells Induce PD-1 Expression in CD8+ T Cells by Transferring Kynurenineand AhR Activation”(肿瘤再生细胞通过犬尿氨酸转移以及芳香烃受体激活诱导CD8+ T细胞表达PD-1)为题，于2018年3月12日在Cancer Cell(《癌症· 细胞》)上在线发表。黄波为文章的通讯作者，中国医学科学院基础医学研究所、临床免疫中心刘玉英副研究员及中国医学科学院基础医学研究所博士研究生梁晓雨和董文茜为共同第一作者。 br/ /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/noimg/9fd5759f-c0c0-4d5f-a0d6-af4081a93b96.jpg" title=" 001.jpg" / /p p style=" text-align: center " 图. TRC诱导激活CD8+ T细胞高表达PD-1的机理 /p p 　　肿瘤免疫治疗是是当前肿瘤研究的热点领域之一，通过利用免疫细胞、免疫分子直接或间接杀伤肿瘤细胞，以控制或清除肿瘤，被认为是人类战胜癌症的希望所在。肿瘤免疫治疗主要依赖活化的T细胞杀伤肿瘤细胞，然而，免疫检查点(checkpoint)分子PD-1(programmed cell death protein 1，程序性死亡受体1)具有重要的免疫抑制功能，在肿瘤组织中的T细胞表面表达上调，通过传递抑制信号阻止T细胞活化。因此，如果能阻断PD-1信号，就能够使T细胞重新活化。目前针对免疫检查点PD-1的治疗性抗体已在临床肿瘤患者的免疫治疗中取得了巨大成功，然而，PD-1抗体药物价格昂贵，且副作用大。因此，寻找PD-1的小分子阻断剂成为当前肿瘤免疫治疗药物研发的重要方向，但困难在于肿瘤组织中的T细胞PD-1分子表达上调的机理尚未完全清楚。 /p p 　　色氨酸作为一种必需氨基酸，其在体内不仅通过代谢生成5-羟色胺和褪黑素等重要活性分子，而且能够通过吲哚胺-2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)催化产生犬尿氨酸(kynurenine, Kyn)直接激活胞浆转录因子芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor, AhR)。黄波教授课题组前期研究发现，高成瘤性的肿瘤再生细胞(Tumor repopulating cells，TRC)中，IDO-Kyn-AhR通路非常活跃，而T细胞释放的免疫因子IFN-γ则进一步激活此通路，诱导TRC进入休眠(Nat Commun. 2017 8:15207) 另外该课题组还发现抗病毒的免疫因子IFN-β同样激活此通路，并更强地诱导TRC休眠(J Clin Invest. 2018 128:1057-1073)。T细胞可以通过IDO-Kyn-AhR通路调控TRC，TRC是否反过来也可以调节T细胞呢?对此，课题组通过将活化的T细胞和肿瘤细胞共培养，发现活化的T细胞不但无法杀死TRC，反而上调PD-1表达，提示TRC能够调节T细胞PD-1的表达。进一步研究发现，T细胞释放的IFN-γ促进TRC显著上调色氨酸转运蛋白以及IDO，使得色氨酸大量进入TRC并代谢为Kyn Kyn被TRC释放到细胞外后，通过T细胞膜表面的Kyn转运子，又进入到T细胞内，从而激活T细胞的AhR，AhR入核后直接结合PD-1启动子，启动PD-1的表达(如图)。该研究发现，在理论上加深了当前对肿瘤免疫的认识，而且有望发展新的肿瘤免疫治疗策略。 /p

这是一档关注“生命科学行业变化”的专题栏目。我们将从合作伙伴入手，每一期研究和解读一家科研机构或科研课题组、实验室的背后故事、相关方法论、使用的工具等等，帮助科研从业者获得启发和思考。不久前，西湖大学贾洁敏团队在Nature Neuroscience期刊上发表题为Synaptic-like transmission between neural axons and arteriolar smooth muscle cells drives cerebral neurovascular coupling的研究论文，该研究证实单个谷氨酸能神经元轴突通过神经-小动脉平滑肌细胞(arteriolar smooth muscle cells, aSMCs)连接之间的突触样传递来扩张其支配的小动脉。这一发现揭示了神经元与脑血管直接对话的一座“新桥梁”，也为理解脑血流的快速和精准调控提供了一个全新的认知。本期【沃的研究所】，我们将对话文章的第一作者张冬冬博士，一起了解神经血管耦合的机制。冲破历史研究，为脑血流调节机制提供全新认知血液供应为大脑中的神经计算提供能量，计算活动的波动会在数秒内引起局部脑血流(cerebral blood flow, CBF) 的相应变化，这一现象称为神经血管耦合(Neurovascular coupling, NVC)。NVC功能受损，可导致脑微循环缺血缺氧，影响局部神经信号传导，引起并加重脑小血管疾病，甚至造成认知功能障碍、痴呆等。由于大脑的代谢神经元活化是需要能量的，且本身不能储存能量，所以这些能量主要来源于血液供给。张冬冬博士说道，“既然血液供给对于大脑活动如此重要，那么神经元活化后是如何将信息传递给血流的？”这成为了研究团队进行实验探索的出发点。事实上，虽然神经元活化对血流的调控机制已经有130多年的研究历史，但是对相关机制的探索研究目前仍处于探索阶段。“神经元活化如何去调节脑血流？这个过程中传递了哪些信息？什么时候来传递这个信息？是否还存在已知调节机制之外的其他未知机制来调节血流呢？”张冬冬博士在谈及实验初衷时提到，“对于神经血管耦合，我们能做的还有很多。”采用先进设备，用时间沉淀成果为了探究大脑神经元活化调节血流的结构基础，研究团队利用了大体积三维扫描电镜和光电联合技术，通过三维扫描电镜成像，解析出整个动脉以及动脉周围脑组织其他细胞之间空间上的关联。科学探索，路漫漫而长远。张冬冬博士从2017年便开始了该项实验研究，历经6年时间才有了今天的成果。“结构决定功能”，而在对动脉与周围血管组织、细胞间的结构探讨这一过程中，他不禁感慨：“我们采集了近30个T的电镜数据，并且还要再继续分析重构脑组织、细胞超微结构以及血管结构。仅在这个过程，前前后后就花费了两三年的时间，工作量特别大。”在该项实验中，终足对于穿支动脉的包裹率，是全世界首次进行解析。张冬冬博士介绍道，通过三维电镜扫描，他们发现星形胶质细胞终足对穿支动脉的包裹率并不是100%，反而存在“漏洞”。血管周围神经元轴突的子突触前会穿过这些漏洞，直接与动脉血管形成物理连接。这一结构为神经元与血管之间的对话提供了一座前所未见的“新桥梁”。在功能基础验证过程中，研究团队用到了瑞沃德激光散斑血流成像系统，张冬冬博士表示，通过使用该仪器，能够大范围看脑血流的变化，从而发现了神经元轴突末端跟动脉循环细胞之间形成的连接，可以调节血流以及调节动脉的舒张。研究团队用到瑞沃德激光散斑血流成像系统来监测血流变化“非常感谢瑞沃德激光散斑血流成像系统，这成为了我们实验过程中探究生理功能上脑血流变化的一个非常重要的仪器，帮助到我们很多”。除此之外，在研究团队的实验室中还能见到不少瑞沃德其他产品的身影，比如手术器械、脑立体定位仪、移动式呼吸麻醉等。“这些产品用下来感觉都很好”，张冬冬博士再一次对瑞沃德产品给予了认可，并对其中一些产品的优化方向也提出了宝贵建议。西湖大学实验室瑞沃德散斑不惧失败，讲究方法，科研是人生的一种选择2017年，那时的西湖大学叫做浙江西湖高等研究院，张冬冬博士是当时的第一批博士研究生。而在这之前，他在硕士时期的研究方向是中风，这和当时西湖大学生科院里五位PI中贾老师的研究方向最匹配，考虑到将来的研究方向和个人发展，他顺利地加入了贾老师课题组。“当时加入，贾老师并没有要求我要待几年，而是和我强调博士期间你有了什么样的科学发现，你能解决什么科学问题，你能给领域甚至是社会带来什么价值，这些才是最重要的。”张冬冬博士深受贾老师启蒙。“所以，就这样，我成为了贾老师的第一个学生。”该研究成果第一作者2017级博士研究生张冬冬（左）与导师贾洁敏（右）合影（摄于2017年）科研需要投入大量时间、经历去进行一些重复性的工作热情，需要保持足够的兴趣，高度的专注，才能有所收获。张冬冬博士内心也早已明确自己选择科研，坚持读博是为了享受科学探究带来的快乐。“原本博士三年我就可以发一篇文章然后顺利毕业，但我依然选择坚持做到5年，至今7年。正如贾老师当时所言，相比博士毕业，博士期间研究的课题有什么样的意义才更重要。”说来，还是内在驱动力，让张冬冬博士自始至终都坚定信念，对科研路上的困难和挑战甘之如饴。“从事科研，首先你要问自己为什么要做科研，是否对它感兴趣。”张冬冬博士并不屈于日复一日重复枯燥的实验与工作，而探索未知，满足好奇心正是他觉得科研充满乐趣所在。“其次，科学实验必定存在着失败，你抱着什么样的心态面对失败这很重要,一定要有一种在失败中站起来的勇气。”科研路上，勇于面对失败，才能走向真正的成功。由于张冬冬博士是贾老师的第一个学生，加上那时的西湖大学很多平台都还没有建立起来，所以大部分实验都是他自己在进行探索。提及当时一些陌生的实验手段和技术，他也非常感谢专业人员给予的帮助。“遇到困难时，很重要的一点，就是一定要学会向一些领域内的专家虚心请教。即便你是从零开始，也会更有利于你去解决一些问题。”对于如何克服实验过程中的失败与困难，张冬冬博士也和我们分享着他自己的经验。经过时间的沉淀和个人的努力付出，张冬冬博士在自己的研究领域下也有了不少收获，对于从事科研有着自己的见解。当被问及目前血管神经耦合领域比较有潜力的研究方向，他继续和我们分享。神经血管耦合机制有着漫长的130多年的研究历史，在这期间，大家一直在问同一个问题——神经元是如何调节神经血管耦合的机制。“但更深层次之下，神经元耦合除了调节能量的代谢之外，它是否具备调节一些其他生理行为的功能？这是一个非常有意思的研究方向。”“神经元活化可以调节血流，那么反之，血流的改变是否可以调节神经元的一些功能呢？这也是贾老师课题组关注的另一个有意思的方向。”科研之路，道阻且长，唯行则将至。期待张冬冬博士在自己专注的领域继续发光发热，为行业乃至社会带来更大的价值。- END -如果您想了解试用张冬冬博士实验室同款瑞沃德激光散斑血流成像系统长按识别下方二维码我们将会有专业人员与您联系

2021年9月，教育部组织开展了2021年度生命科学领域重点实验室评估工作，评估了各实验室2016—2020年的运行情况，全国共有201个实验室参加本次评估，北大6个实验室参评。近日，教育部公布了评估结果，共有31个实验室获得“优秀”。北大细胞增殖与分化、分子心血管学、慢性肾脏病防治、辅助生殖4个实验室获得“优秀”，评优数位列第一。北京大学2021年度生命科学领域教育部重点实验室评估结果教育部重点实验室是高等学校组织高水平科学研究、培养和集聚创新人才、开展学术合作交流的重要基地。教育部对各实验室定期开展5年周期评估工作，每年评估1—2个领域，主要对实验室的研究水平与贡献、研究团队建设、学科发展与人才培养、开放与运行管理等整体运行状况进行综合评估。高校是国家战略科技力量的重要组成部分。有组织科研是高校成体系服务国家和区域战略需求的重要形式。北大将不断加强教育部重点实验室等各类科技创新基地的建设与管理，依托科技创新基地变革科研范式和组织模式，强化有组织科研，面向科学前沿，聚焦国家战略需求和行业、区域发展需求，组织实施重大科技任务和重大工程，培养国家战略人才，为实现高水平科技自立自强、加快建设世界重要人才中心和创新高地提供有力支撑。1、细胞增殖与分化教育部重点实验室细胞增殖与分化教育部重点实验室成立于2005年，围绕细胞增殖分化调控机制的前沿科学问题，在评估期内取得一系列原创性成果：1）首次在人和小鼠中建立同时具有胚内和胚外发育潜能的多能干细胞EPS，证明体外建立全能性干细胞的可行性；2）建立了哺乳动物肝脏、胰腺分化谱系；3）利用高精度单细胞转录组和DNA甲基化组图谱技术解析人类胚胎着床过程；4）发现DNA甲基化在维持特定细胞谱系的发育过程中发挥重要作用，获评2019年度中国生命科学十大进展；5）发现多种蛋白酶（Caspases）调节天然免疫及锰离子的重要免疫学功能，为深入认识免疫系统如何抵抗感染及肿瘤提供了新的思路。系列成果对于进一步理解细胞增殖分化、机体发育、器官再生等，具有重要理论和实践意义。细胞增殖与分化教育部重点实验室2、分子心血管学教育部重点实验室分子心血管学教育部重点实验室成立于2002年，面向“健康中国”建设的国家重大需求和代谢性心血管疾病的前沿科学问题，聚焦国人特有的心血管疾病危险因素、发病机制以及诊疗方法等开展研究。评估期内取得一系列重要成果：1）建立了以国人为研究对象的全球最大的人群研究队列，发现坚持健康生活方式可显著降低心血管急性事件风险；2）针对冠心病的残余风险，发现非降脂依赖的潜在干预靶点金属蛋白酶ADAMTS7；3）发现了国人特有的血管疾病危险因素——高同型半胱氨酸，并对此成果开发2个国家I类新药。实验室已成为国内代谢性心血管疾病的引领机构，推动了我国心血管疾病的防治策略优化，为心血管疾病发病率和死亡率早日出现“拐点”提供科技支撑。分子心血管学教育部重点实验室3、慢性肾脏病防治教育部重点实验室慢性肾脏病防治教育部重点实验室于2010年获批，围绕肾脏病防治的关键科学问题，在流行病学、发生发展机制、循证治疗等方面开展研究。评估期内取得一系列重要成果：1）揭示糖尿病相关肾病已成为我国成人慢性肾脏病（CKD）首位病因；2）连续发布“中国肾脏疾病年度科学报告”为CKD防治决策提供数据支撑；3）自身抗原、免疫反应、补体系统成分等研究成果拓展了病因学研究、提供了新靶点；4）急性肾损伤（AKI）预警系统和早诊平台有效降低漏误诊率，AKI诊断、狼疮肾炎病理分型等成果纳入国际指南/共识；5）创立腹膜透析管理新模式及国际首个腹膜透析互联网平台。实验室已成为我国CKD防治的研究、转化和人才培养基地，为我国肾脏病防治及卫生政策制定提供支撑。慢性肾脏病防治教育部重点实验室4、辅助生殖教育部重点实验室辅助生殖教育部重点实验室于2010年获批。鉴于我国当前育龄人群生育力下降、出生缺陷发生率居高不下等严峻形势，实验室面向国家人口健康的重大战略需求，以“促进生殖健康”为核心，开展辅助生殖相关基础、临床与转化研究，评估期内取得以下成果：1）系统揭示人类生殖细胞与早期胚胎发育调控机制；2）阐明常见生殖障碍性疾病发病机制及干预途径；3）开发胚胎植入前遗传学诊断新技术并临床推广；4）自主研发生育力评估、保存产品并实现成果转化；5）明确新冠肺炎对孕产妇母婴安全及育龄人群生殖健康的影响。实验室推动了我国辅助生殖领域的全链条科技创新，为提高国民生殖健康水平和出生人口质量提供科技支撑。辅助生殖教育部重点实验室5、神经科学教育部重点实验室神经科学教育部重点实验室成立于2002年，继承针刺研究特色，聚焦“神经遗传发育损伤修复与退行性疾病、物质成瘾及疼痛”机制，开展从基础到临床的转化研究。评估期内取得系列成果：1）发现慢性痛及相关负性情绪、神经发育调控及相关神经精神疾病的新机制；2）建立了亚洲最大的物质成瘾数据库，筛选出多种相关遗传风险位点；3）建立国际最大规模单中心肌萎缩侧索硬化（ALS）患者注册队列，首次揭示中国ALS患者发病率和患病率的流行病学特点；4）创立了孤独症智能诊断与精准治疗一体化平台；5）代表中国在国际上领导制定电针仪ISO国际标准。实验室成为集基础研究、临床研究、医学教育及国际学术交流等于一体的重要科技创新平台。神经科学教育部重点实验室6、恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室成立于2007年，面向肿瘤病因预防、发病机制、智能诊断、疗效评价、转移预测等临床转化难点开展研究，以期实现肿瘤的预防、早诊和精准治疗。评估期内取得以下成果：1）首次揭示食管鳞癌的遗传变异特征图谱；2）证实根除幽门螺杆菌可有效降低胃癌发病率和死亡率；3）证实微创D2手术对局部进展期胃癌安全可行；4）构建CT诊断胃癌隐匿性腹膜转移OPM的双标影像组学模型；5）将首个靶向HER2单抗药物用于晚期胃癌的临床试验；6）牵头“泽布替尼”项目，成为第一个在美国获批上市的中国本土自主研发抗癌新药；7）针对难治性B细胞淋巴瘤研发更为安全有效的CAR-T疗法。实验室有力推动了恶性肿瘤研究的临床转化。恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室

国家市场监督管理总局（国家标准化管理委员会）批准《液压传动连接 金属管接头 第1部分：24°锥形》等431项推荐性国家标准和2项国家标准修改单，现予以公告。国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会2023-08-06附件相关标准如下：序号标准编号及标准名称代替标准号实施日期1GB/T 20706-2023 可可粉质量要求GB/T 20706-20062024-03-012GB/T 20705-2023 可可液块及可可饼块质量要求GB/T 20705-20062024-03-013GB/T 22427.7-2023 淀粉黏度测定GB/T 22427.7-20082024-03-014GB/T 26174-2023 厨房纸巾GB/T 26174-20102024-09-015GB/T 42957-2023氨基酸产品和添加剂预混合饲料中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸含量的测定2024-03-016GB/T 42762-2023 杯壶类产品通用技术要求2024-03-017GB/T 42821-2023 贝类包纳米虫病诊断方法2024-03-018GB/T 15000.5-2023 标准样品工作导则 第5部分：质量控制样品的内部研制2023-08-069GB/Z 42962-2023 产业帮扶 猪产业项目运营管理指南2023-08-0610GB/Z 42963-2023 产业帮扶 竹产业项目运营管理指南2023-08-0611GB/T 42893-2023 电子商务交易产品质量监测实施指南2023-12-0112GB/T 41247-2023 电子商务直播售货质量管理规范2023-10-0113GB/T 42958-2023 肥料产品使用说明编写指南2024-03-0114GB/T 42954-2023 肥料中植物生长调节剂的测定 气相色谱-质谱联用法2024-03-0115GB/T 42955-2023 肥料中总氮含量的测定 杜马斯燃烧法2024-03-0116GB/T 27021.12-2023 合格评定 管理体系审核认证机构要求第12部分：协作业务关系管理体系审核与认证能力要求2023-08-0617GB/T 27000-2023 合格评定 词汇和通用原则GB/T 27000-20062023-08-0618GB/T 1270-2023 化学试剂 六水合氯化钴（氯化钴）GB/T 1270-19962024-03-0119GB/T 667-2023 化学试剂 六水合硝酸锌（硝酸锌）GB/T 667-19952024-03-0120GB/T 669-2023 化学试剂 硝酸锶GB/T 669-19942024-03-0121GB/T 686-2023 化学试剂 丙酮GB/T 686-20082024-03-0122GB/T 684-2023 化学试剂 甲苯GB/T 684-19992024-03-0123GB/T 9722-2023 化学试剂 气相色谱法通则GB/T 9722-20062024-03-0124GB/T 603-2023 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T 603-20022024-03-0125GB/T 649-2023 化学试剂 溴化钾GB/T 649-19992024-03-0126GB/T 678-2023 化学试剂 乙醇（无水乙醇）GB/T 678-20022024-03-0127GB/T 26176-2023 家用和类似用途豆浆机GB/T 26176-20102024-03-0128GB/T 42812-2023 连作障碍土壤改良通用技术规范2024-03-0129GB/T 29344-2023 灵芝孢子粉采收及加工技术规范GB/T 29344-20122024-03-0130GB/T 22638.11-2023 铝箔试验方法 第11部分：力学性能的测试2024-03-0131GB/T 42916-2023 铝及铝合金产品标识2024-03-0132GB/T 22648-2023 铝塑复合软管、电池软包用铝箔GB/T 22648-20082024-03-0133GB/T 42817-2023 农产品产地土壤改良剂使用技术规范2024-03-0134GB/T 42819-2023 农产品产地重金属污染土壤钝化通用技术规程2024-03-0135GB/T 29490-2023 企业知识产权合规管理体系 要求GB/T 29490-20132024-01-0136GB/T 42936-2023 设施管理 过程管理指南2023-08-0637GB/T 42931-2023 设施管理 基准比较分析指南2023-08-0638GB/T 42935-2023 设施管理 信息化管理指南2023-08-0639GB/T 14699-2023 饲料 采样GB/T 14699.1-20052024-03-0140GB/T 42959-2023 饲料微生物检验 采样2024-03-0141GB/T 22260-2023 饲料中蛋白质同化激素的测定 液相色谱-串联质谱法GB/T 22260-20082024-03-0142GB/T 13882-2023 饲料中碘的测定GB/T 13882-20102024-03-0143GB/T 8381.3-2023 饲料中林可胺类药物的测定 液相色谱-串联质谱法GB/T 8381.3-20052024-03-0144GB/T 42956-2023饲料中泰乐菌素、泰万菌素、替米考星的测定 液相色谱-串联质谱法2024-03-0145GB/T 13883-2023 饲料中硒的测定GB/T 13883-20082024-03-0146GB/T 13093-2023 饲料中细菌总数的测定GB/T 13093-20062024-03-0147GB/T 12956-2023 卫生间配套设备要求GB/T 12956-20082024-03-0148GB/T 10510-2023 硝酸磷肥、硝酸磷钾肥GB/T 10510-20072024-03-0149GB/T 42828.1-2023 盐碱地改良通用技术 第1部分：铁尾砂改良2024-03-0150GB/T 42828.2-2023 盐碱地改良通用技术 第2部分：稻田池塘渔农改良2024-03-0151GB/T 42828.3-2023 盐碱地改良通用技术 第3部分：生物改良2024-03-0152GB/T 13217.7-2023 油墨附着力检验方法GB/T 13217.7-20092024-03-0153GB/T 42944-2023 纸、纸板和纸制品 有效回收组分的测定2024-03-0154GB/T 42945-2023 纸浆 细小纤维质量分数的测定2024-03-0155GB/T 42943-2023 纸浆模塑制品技术通则2024-03-0156GB/T 42748-2023 专利评估指引2023-09-0157GB/T 22461.1-2023 表面化学分析 词汇 第1部分：通用术语及谱学术语GB/T 22461-20082024-03-0158GB/T 27921-2023 风险管理 风险评估技术GB/T 27921-20112023-08-0659GB/T 27914-2023 风险管理 法律风险管理指南GB/T 27914-20112023-08-0660GB/T 7139-2023 塑料 氯乙烯均聚物和共聚物 氯含量的测定GB/T 7139-20022024-03-01

方法摘要： Venusil AA 氨基酸分析的原理为目前广泛使用的PITC（异硫氰酸苯酯）衍生法。经过简化后的衍生方法有很多优点：方便、快速；衍生物单一、稳定，－20℃可贮存数月；采用Venusil AA 柱分析时间短；结果准确；试剂、副产物、溶剂等多种干扰因素可通过快速萃取去除；紫外检测（254nm）灵敏度高。样品：取某品牌牛奶0.5g，按照博纳艾杰尔氨基酸分析方法包进行水解衍生，并取混合氨基酸标准溶液（准确量取氨基酸标准溶液1.0 mL，置于5mL容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液定容至刻度）加内标正亮氨酸，然后进行衍生。（异硫氰酸苯酯为衍生剂）色谱柱：Agela Venusil AA，4.6×250mm，5µ m，100Å （订货号：VA952505-K）流动相：A：称取15.2g无水醋酸钠，加水1850mL，溶解后用冰醋酸调pH至6.5，然后加乙腈140mL，混匀，用0.45µ m滤膜过滤。B：80%（V/V）乙腈溶液 时间 流动相A 0 0 2 0 15 10 25 30 33 45 33.1 100 39 100 39.1 0 45 0 流速：1.0mL/min进样体积：10μL温度：40℃波长：254nm Agela Venusil AA HPLC法测定牛奶中羟脯氨酸混和标准品图谱 （6.50min为羟脯氨酸） Agela Venusil AA HPLC法测定牛奶中羟脯氨酸图谱（6.51min为羟脯氨酸） 技术咨询请拨打18622038116