小鼠睾丸间质细胞

近日，为了提高医院医疗水平，进一步规划和凝练医疗方向，深州市人民医院对小鼠细胞的观察效果提出了更高的要求。明美专业工程师经过详细的沟通了解，针对博士的特殊需求，为其推荐了明美生物倒置显微镜mi52搭配研究级1250万高像素显微数码相机msx2的组合方案，并免费提供专业的样机演示服务，展现了明美在显微成像领域的专业素养。此次项目中，博士需要观察的是小鼠细胞中的贴壁细胞，这种细胞在培养过程中，必须有可以贴附的支持物表面，其依靠自身分泌或培养基中的贴附因子才能在该表面生长增殖，因此，对观察使用的显微成像产品要求极高。通过明美专业工程师的多次沟通，以及产品推荐使用，最终选定使用明美生物倒置显微镜mi52搭配研究级显微数码相机msx2来进行观察研究。msx2是明美最新研发的1250万高像素科研级数字相机，采用1英寸大靶面高性能的成像芯片，设计usb3.0数据传输接口，具有高分辨率、颜色还原准确和高灵敏度的特点，其优秀的色彩表现，是液基细胞分析、免疫组化、骨髓细胞分析等对颜色要求高的病理诊断的理想工具。此外在明暗场、相衬、偏光、dic、荧光成像等领域同样表现出色。下图为使用明美生物倒置显微镜mi52与研究级显微数码相机msx2、ms60进行观察： 下图为明美生物倒置显微镜mi52与研究级显微数码相机ms60镜头下的小鼠细胞图片： 下图为明美生物倒置显微镜mi52与研究级显微数码相机msx2镜头下的小鼠细胞图片： 使用机型：明美生物倒置显微镜mi52 研究级显微数码相机msx2。

小鼠原代海马神经元细胞的分离培养方法！海马体主要负责记忆和学习，日常生活中的短期记忆都储存在海马体中。神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元具有长突起，由细胞体和细胞突起构成。小鼠海马神经元细胞的组织来源于实验小鼠的正常脑组织，因为海马神经元细胞类似于干细胞属于高分度分化的细胞特性，具有不能传代，不能增殖等特点，所有收到细胞后尽快使用。为了更好的服务于广大科研工作者，百欧博伟生物技术人员特提供了海马神经元细胞分离培养方法，技术因人而异仅供参考：1、试验所需仪器设备及试剂（1）仪器生物安全柜CO2细胞培养箱荧光倒置显微镜高速冷冻离心机电热恒温鼓风干燥箱（2）试剂耗材T25细胞培养瓶血球计数板细胞培养孔板红细胞裂解液神经元完全培养基0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）多聚甲醛（PFA）DAPITriton X-100山羊血清NSEGoat anti-Rabbit lgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary antibody，Alexa Fluor 594Fluoromount-G荧光封片剂2、分离培养方法1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡，2) 在冰浴的PBS中分离海马，PBS洗涤3次，剪碎，3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min，4) 用FBS终止消化，轻轻吹打，5) 过100 μm 滤网，6) 收集滤液，300 g离心5 min，7) 用完全培养基重悬沉淀，铺瓶。3、免疫荧光3.1.实验步骤（1）细胞爬片取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。（2）固定细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。（3）破膜封闭将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10% 血清，取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。（4）一抗孵育一抗配制：抗体与PBS 1:100（200）稀释破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（最多可放置一周）（5）二抗孵育室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。（6）包埋玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。鉴定细胞为P1代细胞3.2.检测结果（1）细胞免疫荧光鉴定照片阴性100X-DAPINSE100X-DAPI（2）检验基本情况：经免疫荧光鉴定，该细胞纯度达到90%以上。除了上述的细胞分离方法以外，百欧博伟还有很多关于其他细胞的分离方法，想要学习的小伙伴可以来百欧博伟进行现场学习，如果想要其他原代分离培养方法，可打电话或咨询相关技术人员哦。

2022年5月4日，北京大学生命科学学院、生命联合中心邓宏魁课题组与李程课题组、北京大学医学部基础医学院徐君课题组在Cell Research杂志上发表了题为“Derivation of totipotent-like stem cells with blastocyst-like structure forming potential”的研究论文。该研究通过化学小分子筛选组合，建立了一个新的全能性干细胞培养条件，可以支持从小鼠二细胞胚胎及扩展型多能干细胞（EPS细胞）建立全能性干细胞系。这种新型全能性干细胞可在体外长期稳定培养，在分子特征和发育潜能上与小鼠二细胞胚胎高度相似，并且可以在体外被诱导形成在转录组水平上类似于体内囊胚的类囊胚结构。从左到右分别是李程、邓宏魁和徐君（来源：北京大学官网）如何在体外制备全能性干细胞，长期以来一直是干细胞领域的重要科学问题。在小鼠中，只有受精卵及二细胞胚胎具有全能性：单个细胞能够形成一个完整生命个体。随后发育形成的囊胚细胞可以被用于建立多潜能干细胞，滋养层干细胞及原始内胚层干细胞。然而，这些干细胞的发育潜能是受限的，无法同时发育到胚内和胚外组织。近年的研究发现：在小鼠多能干细胞群中存在极少量的表达小鼠二细胞胚胎分子标记MERVL的细胞，被称为二细胞样细胞（2-cell like cells），具有二细胞胚胎的部分分子特征(1)。然而，这种细胞无法在体外进行稳定的培养。此外，最近的研究发现，二细胞样细胞与体内二细胞胚胎仍存在较大差异，作为体外研究全能性的模型仍存在较大局限性（2）。北京大学邓宏魁团队长期以来致力于采用化学小分子调控的手段来建立调控干细胞的发育潜能的新方法（3-6）。2017年邓宏魁团队报道了一个新的小分子组合（LCDM），可以在人和小鼠中建立扩展型多能干细胞（EPS细胞）（4）。EPS细胞具有胚内胚外发育潜能，并且可以被诱导形成类囊胚（Blastoid）结构（7）。然而，与小鼠二细胞胚胎相比，这种细胞的分子特征与二细胞胚胎还有较大差异，细胞的胚外分化潜能也存在局限性，诱导获得的类囊胚结构中存在较高比例的中间态和中胚层样细胞（8）。最近北京大学杜鹏团队、中山大学王继厂团队等报道了全能性干细胞的诱导条件（9-10）。当前，如何直接自小鼠全能性胚胎建立全能性干细胞，仍是全能性干细胞研究的“金标准”。在本研究中，团队通过化学小分子高通量筛选，鉴定了能够在EPS细胞中诱导提高MERVL及Zscan4阳性细胞比例的化学小分子。通过进一步的组合优化，发现了一个可以将EPS细胞诱导为全能性干细胞的小分子组合CD1530，VPA，EPZ004777，CHIR 99021 (CPEC组合)，诱导获得的全能性干细胞能长期稳定地在体外培养。更为重要的是，CPEC组合可以在体外支持从小鼠二细胞胚胎直接建立全能性干细胞系。研究者将由CPEC组合支持建立的全能性干细胞命名为全能潜能干细胞（totipotent potential stem cells, TPS细胞）。研究者进一步从转录组、表观特征、嵌合能力等多个方面深入分析了TPS细胞的分子特征和发育潜能。他们发现TPS细胞在单细胞水平上表达大量的全能性特征基因，并且下调了多能性的分子标记。进一步的单细胞转录组分析发现，TPS细胞群中存在一个在转录组水平与中期二细胞胚胎高度相似的细胞亚群（约10%）。他们定量分析了TPS细胞、杜鹏团队报道的TBLC中的全能干细胞亚群、二细胞样细胞与二细胞胚胎的转录组相似度，发现TPS细胞中的全能干细胞亚群与二细胞胚胎的相似程度是最高的。ATAC-seq和全基因组甲基化分析也表明：TPS细胞具备了二细胞胚胎的表观修饰特征。在发育潜能分析方面，他们通过在不同发育阶段的单细胞嵌合实验证明了：单个TPS细胞具备了同时向胚内和胚外发育的能力。为了严格证明TPS细胞在体内的胚外发育潜能，他们对E17.5的嵌合胎盘进行了单细胞转录组分析，结果表明TPS来源的细胞可以分化形成多种胚外滋养层细胞类型。并且，他们发现tdTomato标记的TPS细胞与有GFP标记的受体胚胎形成的嵌合胎盘中，存在大量的tdTomato单阳性嵌合细胞，高表达滋养层细胞的分子标记，排除了由细胞融合导致的假阳性可能。这些结果表明了TPS细胞具备了与二细胞胚胎相似的分子特征和发育潜能。自组装形成类囊胚结构的能力是评估细胞全能性最为关键的功能性标准之一。研究者证明了通过调控早期胚胎发育的信号通路，可诱导TPS细胞高效形成类囊胚结构。单细胞转录组分析表明，TPS诱导的类囊胚结构中存在与小鼠E4.5囊胚中类似的上胚层、滋养外胚层、原始内胚层细胞，并且在转录组水平上高度相似。通过转录组数据的定量分析，研究者进一步比较了TPS-类囊胚结构中的滋养层细胞、小鼠滋养层干细胞/多能干细胞组合诱导类囊胚中的滋养层细胞，发现TPS-类囊胚结构中的滋养层细胞更类似于着床前囊胚中的小鼠滋养外胚层细胞。并且，不同于EPS细胞诱导的类囊胚结构，TPS-类囊胚结构中并不存在大量的中间态细胞及中胚层样细胞。将TPS来源的类囊胚结构植入体内后，可以诱导蜕膜化反应，但是仍无法像正常囊胚那样发育成个体，提示诱导类囊胚的方案仍需优化。最后，研究者分析了CPEC组合在TPS细胞中诱导和调控全能性的分子机制。他们发现抑制HDAC1/2和Dot1L的活性、以及特异激活RARγ通路，对TPS细胞的诱导和维持具有重要作用。有趣的是，当用CPEC组合的小分子联合处理小鼠二细胞胚胎时，他们发现这些小分子处理能在一定程度上帮助维持小鼠胚胎中的全能性分子标记的表达。这些结果表明HDAC1/2、Dot1L、RARγ通路的协同调控对于小鼠全能性调控的重要作用。综上所述，该研究利用化学调控的方法从小鼠二细胞胚胎中建立了新型的全能性干细胞，该细胞具有与二细胞胚胎相似的分子特征及双向发育潜能，能够形成与体内着床前囊胚更相似的类囊胚结构。这一工作不仅为体外研究全能性提供了更为合适和可靠的模型，而且朝着在不同哺乳动物物种中利用全能性胚胎捕捉、维持全能性干细胞的目标迈出了重要的一步。邓宏魁教授，李程研究员，徐君研究员是这一研究成果的共同通讯作者。北京大学徐亚星，赵晶薷，任奕璇，王旭阳和吕钰麟为该研究成果的第一作者。本工作获得了生命科学联合中心、国家重点研发计划项目、国家自然科学基金等支持。

在哺乳动物的大脑中，许多不同类型细胞形成复杂的相互作用网络，从而实现广泛的功能。由于细胞的多样性和复杂的组织，人们对大脑功能的分子和细胞基础的理解受到了阻碍。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞表观基因组分析的发展使发现大脑中许多分子上不同的细胞类型成为可能[1，2]。然而，这些研究中有限的样本量可能导致对大脑细胞多样性的低估。此外，了解大脑功能背后的分子和细胞机制不仅需要对细胞及其分子特征进行全面的分类，还需要详细描述分子定义的细胞类型的空间组织和相互作用。在更精细的尺度上，细胞之间的空间关系是通过相邻分泌和旁分泌信号传递的细胞间相互作用和通信的主要决定因素。虽然突触通信可以发生在细胞体相距较远的神经元之间，但神经元和非神经元细胞之间的相互作用以及非神经元细胞之间的相互作用通常借助直接的体细胞接触或旁分泌信号，因此需要细胞之间的空间接近。而且涉及局部中间神经元的相互作用也倾向于发生在空间近端神经元之间。因此，一个高空间分辨率的全脑细胞图谱对于理解大脑的功能极其重要。来自美国哈佛大学的庄小威教授课题组使用多重误差鲁棒荧光原位杂交（MERFISH）技术对整个成年小鼠大脑中大约1000万个细胞中的1100多个基因进行了成像，并通过整合MERFISH和scRNA-seq数据，在全转录组尺度上进行了空间分辨的单细胞表达谱分析。研究人员在整个小鼠大脑中生成了5000多个转录不同的细胞簇（属于300多种主要细胞类型）的综合细胞图谱，将该图谱与小鼠大脑共同坐标框架进行定位，可以系统量化单个大脑区域的细胞类型组成和组织，并进一步确定了具有不同细胞类型组成特征的空间模块和以细胞渐变为特征的空间梯度。这种高分辨率的细胞空间图—每个细胞都具有转录组表达谱，有助于推断数百种细胞类型对之间的细胞类型特异性相互作用和预测这些细胞-细胞相互作用的分子（配体-受体）基础和功能。总之，此研究不仅为大脑的分子和细胞结构提供了丰富的见解，而且为其在健康和疾病中的神经回路和功能障碍奠定了基础。该结果于近日发表在Nature上，题为“Molecularly defined and spatially resolved cell atlas of the whole mouse brain”。研究小组通过MERFISH技术对横跨4只成年小鼠（1雌3雄）大脑整个半球的245个冠状面和矢状面切片上进行成像，根据DAPI和总RNA信号，单个RNA分子被识别并被分配到细胞，进而得到单个细胞的表达谱。总之，该研究对成年小鼠大脑中大约1000万个细胞进行成像和分割，包括11个主要的大脑区域：嗅觉区、等皮层（CTX）、海马形成、皮质底板（CS）、纹状体（ST）、苍白球、丘脑、下丘脑（HT）、中脑、后脑和小脑。基于典型相关性分析整合MERFISH数据和scRNA-seq数据，采用K最近邻(k-NearestNeighbor,KNN)分类算法对MERFISH细胞进行分类。为了对不同大脑区域的细胞类型组成和组织进行系统定量，他们将MERFISH生成的细胞图谱注册到艾伦脑科学研究所发布的小鼠脑三维图谱第三版（Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework，CCFv3）[3]，可将每个单独的MERFISH成像细胞及其细胞类型身份标签放入3D CCF空间（图1）。图1 对整个小鼠大脑的分子定义和空间分辨的细胞图谱（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）据统计，整个小鼠大脑由46%的神经元和54%的非神经元细胞组成，神经元细胞与非神经元细胞的比例在后脑中最低、在小脑中最高。神经元细胞包括315个亚类和超过5000个集群，其类型也表现出很强的区域特异性，大多数神经元亚类仅在11个主要区域中的一个区域富集。这11个主要区域包含了不同数量的细胞类型，尤其是后脑、中脑和下丘脑所包含的神经元细胞类型的数量以及局部复杂性远远高于其它大脑区域。基于神经递质转运体和参与神经递质生物合成相关基因的表达，他们将成熟的神经元分为8个部分重叠的组别。其中，谷氨酸能神经元和γ-氨基丁酸（GABA）能神经元分别约占神经元总数的63%和36%，谷氨酸能与GABA能神经元的比例在不同的大脑区域中差异很大，而5-羟色胺（5-HT）能、多巴胺能、类胆碱能、甘氨酸能、去甲肾上腺素能和组胺能神经元仅占神经元总数的2%（图2c）。谷氨酸能神经元和GABA能神经元广泛分布于全脑，可分为具有不同空间分布的不同细胞类型；在谷氨酸能神经元中，Slc17a7（Vglut1）、Slc17a6（Vglut2）和Slc17a8（Vglut3）在不同的脑区分布存在差异，Slc17a7主要位于嗅觉区、CTX、海马形成、CS和小脑皮层，而Slc17a6主要位于HT、中脑和后脑（图2d，e）。他们还观察到两个未成熟神经元（IMNs）亚类：一种是抑制性的，一种是兴奋性。抑制性IMNs由30个簇组成，沿脑室下区（SVZ）分布，通过前连合处延伸至嗅球；兴奋性IMNs由七个簇组成：簇516主要位于嗅觉区域，而其它簇沿海马体形成的齿状回分布（图2f），这与之前关于海马形成中成人神经发生的发现一致[4]。图2 神经元细胞的类型和空间分布（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）非神经元细胞包括23个亚类和117个簇。通过量化，研究小组发现在整个大脑中，非神经元细胞由30%少突胶质细胞、6%少突胶质细胞前体细胞（OPCs）、28%血管细胞、23%星形胶质细胞、8%免疫细胞和5%其它类型细胞组成。一些非神经元细胞类型，特别是星形胶质细胞和心室系统中的细胞也表现出很强的区域特异性。星形胶质细胞包括36个细胞簇，最大的两个集群Astro 5225和Astro 5214，分别占星形胶质细胞总数的48%和33%。基本上每个Astro星团都显示出独特的空间分布，Astro 5225只位于端脑区，Astro 5214只位于非端脑区，Astro 5215位于丘脑，Astro 5216位于后脑，Astro5231-5236位于嗅球，Astro 5207位于小脑，Astro 5222位于齿状回，Astro 5208富集于靠近软脑膜表面的髓质，Astro 5228、5229和5230位于SVZ沿线，延伸至嗅球，并与抑制性IMNs广泛共定位（图3d）。少突胶质细胞在纤维束中富集，在整个脑干中十分丰富，而OPCs则均匀分布地整个大脑；在集群水平上，一些少突胶质细胞和OPCs也表现出区域特异性，如Oligo 5277在皮层中富集，而Oligo 5286在后脑中富集（图3e）。与心室系统相关的细胞也呈现区域特异性分布，在第三脑室，下丘脑室管膜—胶质细胞位于腹侧区域，而ependymal细胞占据背侧区域，Hypendymal细胞位于第三脑室背侧的下联合器，心室内的主要细胞是脉络膜丛细胞和血管软脑膜细胞（VLMCs）。除了VLMC 5301和VLMC 5302，大多数VLMC集群被限制在软脑膜（图3f）。图3 非神经元细胞的类型和空间分布（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）接下来，研究团队为每个细胞定义了一个局部细胞类型的组分矢量，并使用这些矢量聚类细胞，从而得到了包含相似邻域细胞类型组成的细胞的“空间模块”（图4a）。他们确定了16个一级空间模块和130个二级空间模块，一级空间模块将大脑分割成与CCF中定义的主要大脑区域基本相吻合的区域，一个显著的差异是中脑和后脑之间的边界（图4b，c）。许多2级空间的模块与CCF中定义的子区域一致，但观察到更多的差异（图4d）。此研究中的空间模块描述是基于单个细胞的转录组范围内的表达谱所定义的细胞类型，因此比CCF中脑区描述的信息具有更高的分子分辨率，空间梯度代表了对该区域的分子轮廓的更精确的描述。图4 空间模块：分子定义的大脑区域（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）考虑到在某些情况下，细胞的基因表达谱可能会表现出渐进或连续的变化，他们因此检查了所有的细胞亚类，结果发现细胞的空间梯度广泛分布在大脑的许多区域。例如，颅内（IT）神经元在整个CTX上形成了一个连续的梯度，在这个区域，基因表达沿皮层深度方向逐渐变化，但第2/3层IT神经元的分离更为明显（图5a）。在纹状体中，D1和D2中棘神经元均沿背外侧-腹内侧轴形成空间梯度（图5b，c）。在外侧间隔复合体（LSX）中，几个GABA能亚类沿着背腹轴形成了一个梯度（图5d）。在海马体的CA1、CA3和齿状回区域和中脑的下丘中也观察到空间梯度。他们也观察到了一些非神经元细胞之间的空间梯度，如下丘脑室管膜—胶质细胞，沿着第三脑室的背腹轴形成了一个连续的梯度（图5e）。通过基于UMAP（一致的多方面逼近和投影以进行降维）的基因表达可视化分析，他们发现一个大规模的跨越HT、中脑和后脑区域的空间梯度（图5f）。图5 分子定义的细胞类型的空间梯度（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）最后，他们分析了亚类水平上的细胞类型，并推断单个大脑区域中细胞类型特异性的细胞-细胞相互作用（包括非神经元细胞间，非神经元细胞和神经元之间以及神经元间）。几百对细胞亚类被确定，统计学结果显示有显著的相互作用。预测的大多数具有相互作用的细胞类型对包含多个配体-受体对，与同一细胞类型对中的非近端细胞对相比，近端细胞对的表达显著上调，为这些细胞间相互作用的分子基础提供了见解。在非神经元细胞之间，发现内皮细胞和周细胞均与大脑中的边缘相关巨噬细胞（BAMs）、巨噬细胞有显著的相互作用。在这两种情况下，与非近端细胞对相比，来自层粘连蛋白信号通路的配体-受体对在近端细胞对中均明显上调，一些细胞因子（内皮细胞中的Cytl1和周细胞中的Ccl19）在BAMs近端血管细胞中表达上调，这说明大脑中的血管细胞可能利用这些细胞因子来招募巨噬细胞（图6d，e）。小胶质细胞也被发现与内皮细胞、周细胞之间的显著相互作用；与内皮细胞相比，周细胞与小胶质细胞相互作用的可能性更高，而与BAMs相互作用的趋势则相反（图6f，g）。他们还观察到神经元和非神经元细胞之间的显著相互作用，例如星形胶质细胞和抑制性IMNs在嗅球中、星形胶质细胞和兴奋性IMNs在海马形成中表现出显著的相互作用。此分析也预测了一些神经元亚类之间的相互作用，例如，海马形成过程中Pvalb枝形吊灯状GABA神经元和CA3谷氨酸能神经元之间、IPN Otp Crisp1 GABA神经元和中脑的DTN-LDT-IPN Otp Pax3 GABA神经元之间的相互作用。图6 细胞间的相互作用和通信（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）文章结论与讨论，启发与展望通过MERFISH技术成像约1000万个细胞，并将MERFISH数据与全脑scRNA-seq数据集整合，该研究生成了一个具有高分子和空间分辨率的、横跨整个小鼠大脑的分子定义的细胞图谱。进一步将该图谱注册到了艾伦脑科学研究所发布的CCF中，提供了一个可被科学界广泛使用的参考细胞图谱，使科研人员能够确定每个大脑区域不同转录细胞类型的组成、空间组织和潜在的相互作用。一方面，非神经元细胞与神经元细胞或非神经元细胞之间的相互作用，以及配体-受体对、基因的相关上调，为测试不同非神经元细胞类型的功能作用提供了切入点。另一方面，将转录组成像与不同行为范式下的神经元活动成像相结合可以揭示神经元的功能角色[5]。未来的研究将结合空间分辨的转录组学分析和各种其它特性的测量（如表观基因组谱、形态学、细胞的连通性和功能、系统的基因扰动方法），将有助于大家阐述大脑的分子和细胞结构的功能和功能障碍在健康和疾病中的作用。MERFISH（Multiplexed Error-Robust Fluorescence In Situ Hybridization），一种空间分辨的单细胞转录组学方法，经过近年的发展已成为生命科学领域中最具有前景的单细胞测序技术之一。该技术独特的原理和方法,可实现对单细胞进行多重靶向探测,从而深入研究细胞的生物学特性,对于疾病诊治及药物研发等方面也有着广泛的应用价值。

2022年8月，上海科技大学生命科学与技术学院杨扬团队与中国科学院自动化研究所韩华团队合作，在Cell Press细胞出版社期刊Cell Reports上以长文形式发表了题为“Fear memory-associated synaptic and mitochondrial changes revealed by deep learning-based processing of electron microscopy data”的研究论文，该研究通过对恐惧学习小鼠听觉皮层突触的三维电镜重建和大规模比较分析，探究了小鼠听觉皮层中与恐惧记忆相关的神经元突触等亚细胞结构的变化情况，并用模型分析方法揭示了突触连接模式变化引起的信息存储容量的大幅提升。中国科学院自动化研究所刘静助理研究员、上海科技大学生命科学与技术学院漆俊倩博士、中国科学院自动化研究所陈曦研究员和李贞辰博士生为本文的共同第一作者，杨扬研究员、韩华研究员、谢启伟教授为本文的共同通讯作者。大脑中的神经网络由神经元通过复杂的突触连接构成，神经元编码、处理和存储信息从根本上依赖于突触的连接模式以及在此基础之上的协调活动，解析突触的连接模式对理解大脑的结构与功能至关重要。在哺乳类动物大脑中，除了由单个轴突小结（axonal bouton）与单个树突棘（dendritic spine）形成的1-1型连接，即单位点突触连接外，大脑中的突触连接模式还包括由单个轴突小结与多个树突棘形成的1-N型连接，或多个轴突小结与单个树突棘的N-1型连接，统称为多位点突触（multiple-contact synapses，MCS）。此前，已有很多研究通过光学显微镜发现学习记忆可以改变突触的组织结构，由于突触间隙宽度仅有几十纳米（低于一般光学显微镜的衍射极限），因此在光学显微镜下观察突触结构的精细变化非常困难。与此同时，突触三维结构的光学数据获取和分析高度依赖于人工，更是极大限制了突触结构的重建数量和分析规模。为探究学习记忆如何促进突触多位点连接模式的形成及效果，本项研究以经典的听觉条件恐惧学习（auditory fear conditioning）为范式设置了实验组和对照组，基于大规模序列电子显微镜成像技术和深度学习识别模型，实现了电镜图像中多种亚细胞三维结构的自动提取，重构了小鼠听觉皮层135,000个线粒体和160,000个突触。实验组和对照组的大规模对比分析表明，尽管恐惧学习训练没有改变突触的空间密度与空间分布，却特异性地增加了1-N型突触的比例。进一步分析发现，绝大多数1-N型突触中的树突棘来自不同树突主干，并且这种多树突1-N型突触在神经元网络中能够起到信号广播的作用。为了进一步分析多树突1-N型突触的信息编码能力，本项研究建立了基于香农信息熵来计算突触信息存储容量（information storage capacity，ISC）的组合数学模型。在无新增突触的静态网络和包含新增突触的可塑性动态网络两种条件下，分别计算了引入多树突1-N型突触的ISC增量。在静态网络中，引入此类突触只是略微增加了ISC容量，而在动态可塑性网络中，此类突触将信息存储容量显著提高了50%。综上，基于序列电子显微镜成像技术和深度学习计算方法，研究者开发了小鼠听觉皮层亚细胞结构的三维电镜重构算法，自动重建精度可以满足大规模分析的精度需求，有效地节省了人工校验时间消耗，极大提高了分析效率。大规模电镜重构和对比分析结果在亚细胞水平揭示了学习记忆对大脑皮层突触、线粒体的组织结构和连接模式的影响，为类脑计算仿生模型的精确建模提供了结构基础和启发依据。图：（上左）听觉条件恐惧学习的对照组和实验组。（上右）轴突小结与树突棘替换或增加的示意图。（中左）不同突触连接模式的电镜图像及三维重构结果。1-N型突触由单个轴突小结与多个树突棘形成，N-1型突触由多个轴突小结与单个树突棘形成。（中右）不同突触连接模式示意图。绿色：树突；蓝色：轴突。（下左）密集重构揭示绝大多数1-N型突触中的树突棘来自不同树突主干。（下右）无新增突触的静态网络和包含新增突触的可塑性动态网络。该研究获得了国家科技创新2030重大项目、中国科学院战略性先导科技专项、国家自然科学基金、北京市科技计划的经费支持。作者专访Cell Press细胞出版社公众号特别邀请杨扬研究员、刘静博士和韩华研究员代表研究团队接受了专访，请他们为大家进一步详细解读。CellPress：过去也有基于电镜图像重构来探究突触和线粒体的研究报道，有的还完成了更大规模的密集重构。本文的方法和思路与过去的研究有何不同？杨扬研究员：电镜图像的密集重构对运算量的要求很高，工作量极大。而本文所使用的方法可以在不做密集重构的前提下，选择性识别和分割出研究者感兴趣的亚细胞结构，如本文关注的突触、线粒体，也可以推广到其他有特殊结构的细胞器。已有的突触或线粒体的自动重构算法多是像素或体素分割模型，也就是将图像中的像素或体素分类成前景或者背景。本文所使用的region-based卷积神经网络是一种实例分割网络，可端到端的完成目标实例的检测和分割。另外，针对强各向异性的序列电镜数据，本文提出一种2D到3D的重构方法，首先在2D上识别和分割亚细胞结构，随后应用3D连接算法完成3D的重构。这种方式可有效避免直接应用3D卷积神经网络带来的目标尺度在特征空间和图像空间不一致的问题。CellPress：多位点突触是一个新的概念吗？本文对此类突触的研究有何特别之处？杨扬研究员：一个突触前轴突小结与多个突触后树突棘形成的1-N多位点突触，和多个突触前轴突小结与一个突触后树突棘形成的N-1多位点突触，在过去的文献中都有过报道。但限于电镜图像人工识别的效率，过去的工作未能对这种特殊突触进行大规模的定量研究。本文通过基于机器学习的自动识别与重构算法实现了这一突破。此外，连接同一个多位点突触中的多个树突棘是来自同一根树突还是不同树突，代表了两种不同的神经元连接方式：前者仍是1对1的神经元连接，后者则是1个神经元对多个神经元的信息广播。本文通过密集重构，首次对这两类多位点突触进行了区分和定量，并发现后者在大脑皮层中，特别是学习之后占据了绝大多数，提示这种连接可能表征了大脑中突触层面的记忆痕迹。CellPress：人工智能算法在这个研究中发挥着怎样的作用？刘静博士、韩华研究员：近年来，人工智能算法已经深入应用到生命科学领域，加速甚至革新了生物学的研究进程。在连接组（Connectomics）领域，面对海量的高分辨电镜数据，借助人工智能算法绘制神经元的线路图是一个必不可少的环节。在本文中，我们设计了一套深度学习算法工具集，可以自动识别序列电镜图像中神经元、突触以及线粒体并恢复其三维形态。深度学习算法的应用大大提高了识别效率，将人从大量冗余复杂的标注工作中解放出来，加速了研究进程。CellPress：可否用简要的语言解释文中所提及的突触连接静态网络和动态网络，两者最核心的区别是什么？具有何种生物学意义？刘静博士、韩华研究员：突触连接网络是指根据神经元的几何拓扑特征来模拟突触连接模式的一种建模方式。其中，静态模型中仅考虑稳定的突触连接，假设没有新突触的形成或旧突触的消亡，本文使用信息熵定义静态网络的信息存储容量。而动态模型则将突触可塑性引入到网络中，允许新突触的形成，本文使用信息熵的增益表示新突触形成带来的信息存储容量的增加。动态模型通过模拟突触可塑性，与真实的大脑神经网络更为相似。CellPress：您认为该项研究对类脑计算有什么启发吗？刘静博士、韩华研究员：类脑智能（Brain-inspired Intelligence）本身就是通过模仿和借鉴人类神经系统的工作原理以构建新型的计算结构和智能形态。然而，目前人对大脑的生理机制还知之甚少。类脑研究的第一步就是要理解大脑，突触作为神经元连接的桥梁，是大脑中最重要的结构之一。突触的可塑性（synaptic plasticity）被认为与长时程记忆（long-term memory）有关。本文通过恐惧学习实验范式和电镜成像技术，发现了恐惧记忆能促进小鼠听觉皮层中一种特殊的1-N突触连接模式的形成，且这种连接模式大大增强了局部环路的信息编码能力。本研究中发现的这种局部神经环路信息传递模式或许能够作为一种记忆存储模块启发新型的类脑计算模型。作者介绍谢启伟教授谢启伟，北京工业大学现代制造业基地教授研究兴趣、领域：数据挖掘、图像处理和复杂系统智能；应用图像处理、机器学习和深度学习等方法研究基于电镜数据的神经元重建，集中于神经元电镜图像的前处理、超体素分割、图融合后处理等方法的研究，为神经科学提供有力工具，期待从脑的结构中挖掘出智能的本源。韩华研究员韩华，中国科学院自动化所研究员研究兴趣、领域：高通量显微成像技术产生海量影像数据，如何重构数据、分析数据、可视数据等已成为脑科学与类脑研究领域的重大挑战。我们致力于建立我国微观脑图谱的高通量技术体系和自主可控技术平台，持续突破大体块神经组织样品制备、长时程超薄切片连续收集、高通量扫描电镜三维成像、高精度神经结构三维重建等关键技术，开展多个百TB规模的微观脑图谱绘制工程，为构建类脑计算仿真提供生物真实网络和仿生建模依据。杨扬研究员杨扬，上海科技大学生命科学与技术学院助理教授、研究员研究兴趣、领域：以条件恐惧学习和增强式学习为行为范式，使用在体双光子成像、双光子全息光遗传、电镜、电生理等技术，研究与学习记忆相关的神经环路活动性和可塑性，及神经调制系统在其中所起的作用。

人类生育力下降，已经成为越来越严重的社会问题。相关数据显示，全球不孕不育患病率从1997年的11.0%上升到了2017年的15.0%，根据推算，在人口增速放缓的当下，到2023年时，在不足7亿的育龄人口中，预计将有超过1.12亿人面临不孕不育。中国育龄夫妇的不孕不育率从20年前的2.5%-3%攀升到近年18%左右，不孕不育夫妻约有6000万对。随着环境污染、生育年龄推迟、生活压力等原因，不孕不育夫妇人数还在不断增加。　　生育危机的到来，让更多科学家瞄准生育问题，希望能够借助更多科学手段缓解这一难题。近日，日本京都大学的研究人员在 Cell 子刊 《Cell Stem Cell 》上发表了题为“In vitro reconstitution of the whole male germ-cell development from mouse pluripotent stem cells ”的研究文章，研究人员通过小鼠多能干细胞分化出了有功能的精子，并且用这些精子给雌鼠授精，成功诞生了健康、有生育能力的后代。研究人员表示，这为在试管中产生男性生殖细胞提供了迄今为止最全面的模型。　　多能干细胞(Pluripotent Stem Cells)是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞，它不仅可以帮助我们理解人类发育过程中的复杂事件，更重要的是，它在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。此前，国内外都已经拥有了利用干细胞培育人造精子的案例，但是，很少有研究会考虑培育阶段的关键生理过程，而此次发表的研究，则填补了这一空白，以一种忠实于发育和生理学的方式在体外重建了男性生殖细胞发育过程。　　男性生殖细胞发育包括三个不同的阶段：第一阶段开始于原始生殖细胞(PGC)的规范化，并通过表观遗传重编程将其分化为生殖细胞 第二阶段涉及男性的性别决定以及随后的精原细胞/精原干细胞(SSC)的分化，这一阶段将同时获得雄激素表观基因组 第三阶段是精原细胞/精原干细胞的精子生成阶段，通过减数分裂和精子生成产生单倍体精子。　　研究人员模拟了这一自然发育阶段来培育人造精子：首先，将干细胞分化为原始生殖细胞 然后分化为精原细胞 最后分化为精子。其中，第二阶段面临的挑战最大，先前建立的小鼠精原干细胞制造方法所需的培养时间长，比在体内分化慢一周左右，并且生成精子的效率较低，不到20%，因此，研究团队决定对这一分化过程进行优化。　　(图注：在小鼠模型中体外重建雄性生殖细胞发育流程图)　　针对第二阶段，研究人员建立了一种“重建睾丸新方法”(new reconstituted testis method)，改进中间培养液，以气相-液相培养法制造出雄性生殖细胞。他们在8种不同的条件下测试了10000多个细胞。幸运的是，分化得到的精原干细胞与小鼠睾丸中的细胞有许多共同的特性，包括关键基因的表达、表观遗传学以及逆转录转座子的瞬时上调。　　为了证实分化得到的精原干细胞与体内产生的相同，研究人员将这些精原干细胞注入到小鼠睾丸，让它们发育成精子细胞，然后收集这些精子并注射到卵子中形成胚胎。这些胚胎最终帮助小鼠成功产下健康、可育的后代。　　此次的研究，向我们真实再现了雄性生殖细胞发育的第二阶段，同时也表明了将小鼠多能干细胞分化为精原细胞样细胞和健康精子的可行性，而这一试验下的培育过程，让多能干细胞分化出的精原细胞在体内和体外均具有强大的生精功能。随着生物技术的进一步迭代，体外配子形成研究将成为促进基本生殖细胞生物学和创造新医学应用的基础。希望这一技术研究能够带来更快速的进展，为更多群体谋福音。

这将使科学家借助动物模型更方便地对人类顽疾进行研究 　　美国南加州大学一个科研小组12月24日宣布，他们首次成功地从大鼠胚胎中提取干细胞，这将使科学家借助动物模型更方便地对诸多人类顽疾进行研究。 　　英国科学家马丁埃文斯早在1981年就成功地从小鼠胚胎中提取出第一个小鼠胚胎干细胞。但大鼠胚胎干细胞的提取尚属首次。 　　研究负责人、华人科学家应其龙在新闻公报中说，这是干细胞研究领域的一项重大进展，“因为我们知道，与小鼠相比，大鼠在生物学的许多方面与人类更为相近”。应其龙认为，提取大鼠胚胎干细胞研究被证实可行之后，世界许多干细胞实验室的研究方向都将因此而改变。 　　此前，科研人员尝试提取大鼠胚胎干细胞都因为技术障碍宣告失败。此次，应其龙的科研小组采取了一种特殊的“信号阻断”方法，他们利用特殊的分子抑制大鼠胚胎中3个特定基因发出信号。正常情况下，这3个基因发出的信号是胚胎干细胞分化的“命令”。信号被阻断后，大鼠胚胎干细胞就能够“停下分化的脚步”，保持在原始胚胎阶段。 　　科研小组认为，能够提取大鼠胚胎干细胞，朝着今后科学家通过基因敲除技术人为地给大鼠胚胎剔除一个或多个基因、培养“定制”大鼠进行疾病研究又向前迈进了一步。 　　这一成果将发表在定于12月26日出版的《细胞》杂志上。

近几年具有出色变形能力和可控性的磁流体机器人受到广泛关注。然而，这些研究大多是在体外进行的，将磁流体用于体内医疗应用仍然是一个巨大的挑战。同时，将磁流体机器人应用于人体也需要解决许多关键问题。本研究创建了基于磁流体的毫米机器人，用于体内肿瘤靶向治疗，其中考虑了生物相容性、可控性和肿瘤杀伤效果。针对生物相容性问题，磁流体机器人使用玉米油作为基载液。此外，该研究使用的控制系统能够在复杂的生物介质中实现对机器人的三维磁驱动。利用1064纳米的光热转换特性，磁流体机器人可以在体外杀死肿瘤细胞，在体内抑制肿瘤体积、破坏肿瘤间质、增加肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖。这项研究为基于磁流体的毫米机器人在体内实现靶向治疗提供了参考。近日，北京航空航天大学机械学院冯林课题组提出了一种通过具有生物相容性的磁流体机器人实现肿瘤的光热治疗方法。该方法将磁流体的基载液改为具有生物相容性的植物油，通过三维电磁控制系统实现磁流体机器人的靶向控制，对该种磁流体机器人在体外与体内的生物相容性和光热肿瘤杀伤效果进行了细致的研究。本研究中的所有3D模型均使用摩方精密nanoArch® S140设备打印。相关研究内容以“Biocompatible ferrofluid-based millirobot for tumor photothermal therapy in Near-Infrared II window”为题发表在《Advanced Healthcare Materials》期刊上，冯林教授为通讯作者，硕士生纪易明为第一作者。图1.用于近红外 II 窗口肿瘤光热治疗的生物兼容磁流体液滴机器人（BFR）概念图。图2. BFR表征。(A)Fe3O4纳米粒子的 XRD 图。(B)Fe3O4纳米颗粒的傅立叶变换红外图。(C)油酸包裹Fe3O4纳米颗粒的傅立叶变换红外图。(D) BFRs 中纳米粒子的透射电子显微镜（TEM）结果。(E) 所制备磁流体的磁滞线。(F) 磁流体的紫外-可见-近红外吸收光谱。(G) 不同浓度的BFR在 1064 纳米近红外照射下的温度曲线。(H) 5个加热-冷却循环过程中BFR的光热稳定性研究。该研究制备了一种生物相容性磁流体（BFR），并对其进行了详细表征，如图2所示。该生物相容性磁流体由超顺磁性纳米颗粒（磁响应组分）和生物相容性植物油（基载液）构成。双层的油酸包裹磁颗粒使磁流体获得较好的稳定性。磁滞回线展现出该磁流体良好的磁响应能力。红外吸收光谱和光热升温曲线体现了该磁流体较好的光热转换效率和光热稳定性。图3. BFR在体外模拟血液循环环境中的运动。(A) BFR 可被控制移动到全血环境中三维血管模型的任意分支。比例尺：5 毫米：(B) BFR 在肝门静脉血管模型中的运动控制，显示了 BFR 由于可变形性和分裂能力而在血管中的可移动性。比例尺：2 毫米。(C) 磁流体机器人越过障碍物的侧面示意图。(D) BFR 在磁阻力作用下穿过障碍物和心脏组织表面的沟槽。(E) BFR 超声成像示意图。比例尺：5 毫米：(F) BFR 在一块牛心血管组织的内表面形成一个稳定的球体。(G) 超声成像视频快照，显示运动控制过程中 BFR 在不同时间的位置。比例尺：2 毫米。(H) BFR 在全血环境中逆流而上。比例尺：1 毫米。同时该研究对BFR在针对模拟体内靶向治疗环境的运动控制进行了详细研讨。通过四线圈三维电磁系统，磁流体机器人可以实现高精度三维运动控制。由于其具有极强的变形、分裂和融合能力，BFR可以在更为复杂的血管环境（如模拟肝门静脉模型）中运动，以及逆血流的运动。此外，因所选磁流体基载液材为有机液体，该种磁流体并不会与血管和心脏内壁发生粘连，可以实现在血管中和心脏表面的运动控制。磁颗粒与体内环境的密度差异也使得超声成像对BFR在体内的位置进行实时显示。图4. 体内肿瘤杀伤实验。(A) 各实验组裸鼠在治疗六天后的肿瘤情况，(B) 体重曲线。(C) 肿瘤大小曲线。(D) 六天治疗后离体肿瘤组织的体积统计。(E) 小鼠肿瘤切片的 H&E 染色结果。比例尺：50 微米。(F) 和 (G) 肿瘤切片的 TUNEL 和 KI67 染色结果。黑色背景图像为荧光图像，白色背景图像为特征荧光图像。比例尺：100 μm。此外，该种磁流体对体内肿瘤的治疗效果得到了验证。通过小鼠实验可以观察到治疗组小鼠的肿瘤体积有明显的减小。在染色结果中治疗组也展现出了对肿瘤组织的杀伤和抑制生长效果。

环形RNA是一类在真核细胞中广泛存在的内源性非编码RNA分子，在生物体发育过程中发挥重要作用。之前研究已在不同物种中鉴定出数百万个环形RNA分子，并产生了大量用于揭示生物体组织表达模式的环形RNA数据资源。然而，由于大多数环形RNA表达量较低，传统的转录组测序方法无法表征单个细胞环形RNA表达谱系特征及异质性。近年来，随着单细胞全长转录组测序技术的发展，已可对单个细胞中环形RNA进行捕获测定。尽管效率较低，仍可部分揭示单细胞分辨率下环形RNA的表达模式。因此，单细胞水平的环形RNA表达及功能研究已成为该领域重点关注的问题。 中国科学院北京生命科学研究院研究员赵方庆团队致力于环形RNA方面的研究。6月10日，该团队在《自然-通讯》（Nature Communications）上，发表了题为Exploring the cellular landscape of circular RNAs using full-length single-cell RNA sequencing的研究论文。该研究基于海量单细胞全长转录组测序数据集，实现了单细胞分辨率下环形RNA的高效识别及深度挖掘，基于大规模时空组学数据的整合分析，探索了环形RNA的细胞异质性，揭示了环形RNA作为细胞类型标志物的应用潜力。该研究将目前环形RNA研究从传统组织水平提升至单细胞水平，为探究不同细胞类型中环形RNA的生物学功能提供了重要的数据资源和分析技术。 科研人员收集整理了171个已发表的单细胞全长转录组数据集（图1），包含人和小鼠中58种组织和细胞类型，共计172,137个细胞。同时，研究建立了基于单细胞转录组数据的环形RNA识别和整合分析方法，在人和小鼠中共识别出40,604和131,533个高度可靠的环形RNA分子。基于以上数据所生成的单细胞环形RNA综合表达图谱，为环形RNA的研究提供了有力的数据支持，并为揭示环形RNA在不同细胞类型及发育阶段的动态变化提供了重要资源。 该研究深度剖析了单细胞数据中环形RNA的表达模式，发现它们在不同细胞类型上具有高度特异性。研究对小鼠大脑不同细胞类型中环形RNA的表达的分析表明，抑制性和兴奋性神经元的差异性表达与RNA结合蛋白的表达具有高度相关性。此外，研究观察到胚胎发育不同阶段的特征性环形RNA，阐释了环形RNA从母体来源至合子表达发生的动态转变过程。 进一步地，基于单细胞测序技术可有效的揭示肿瘤发展和转移过程中细胞水平的异质性，研究建立了20名乳腺癌患者的单细胞数据集，分析发现环形RNA在正常和肿瘤细胞的上皮间质转换过程中的表达规律和潜在功能。研究筛选出人和小鼠中细胞类型特异性环形RNA，并验证了其可作为生物标志物在解析肿瘤浸润性免疫细胞中的适用性。最后，研究构建了目前首个单细胞环形RNA数据分析和资源平台——circSC（http://circatlas.biols.ac.cn）（图2），为环形RNA研究奠定了独特而重要的数据和技术基础。 研究工作得到国家杰出青年科学基金、国家自然科学基金基金重点项目和国家重点研发计划的支持。赵方庆团队致力于建立高效的算法模型和实验技术，探索人体微生物与非编码RNA的结构组成与变化规律，解析它们与人类健康和疾病的关系。近年来，相关成果先后发表在Cell（2020）、Gut（2022/2020/2018）、Nature Biotechnology（2021）、Nature Computational Science（2022）、Nature Communications （2022a/2022b/2021/2020/2017/2016）、Genome Biology（2021/2020/2016）、Molecular Biology and Evolution（2022）、ISME J（2019）等上，这些研究丰富了科学家对人体微生物与非编码RNA多样性、结构组成与功能的认识，并为相关数据挖掘及功能机制研究提供了重要方法学工具。 　　论文链接 图1.基于单细胞全长转录组的环形RNA识别和整合分析 图2.环形RNA单细胞表达图谱及数据平台——circSC 精彩会议预告：点击图片免费报名参加“第五届基因测序网络大会”

3月18日，国内首家“男性生精细胞学实验室”成立仪式暨“转化医学”研讨会在北京同济医院举行。 　　原卫生部副部长，现卫生部健康教育首席专家、中国医师协会会长殷大奎，北京市东城区卫生局有关负责人，以及北大男科中心、北医三院、北京协和医院、中日友好医院等医院的国内知名男科学专家参加了成立仪式和研讨会。 　　转化医学是“从实验台到临床”的一个连续、双向、开放的研究过程，是新世纪医学研究和发展的必由之路，是现代和未来医学研究的主要模式。我国的转化医学尚处于起步和探索阶段，但发展很快，一些院校和科研单位都成立了转化医学研究中心，为我国转化医学的进一步发展打下了坚实的基础。由曹兴午教授创立的“精液脱落细胞学”，就是男科领域转化医学的一个成功典范。 　　曹兴午教授首先做了题为《“精液脱落细胞学”与“转化医学”》的专题演讲，为大家讲解了这种全新的男性不育诊治模式和医学理念。曹教授倾毕生之力开创了具有划时代意义的新学说，他严谨的治学态度、对患者反哺式的无私帮助以及对后继者的谆谆教诲令人感佩。 　　同济医院李翠英博士则用具体病例为大家介绍了“生精细胞学”在男性不育临床治疗上的应用价值和意义。 　　殷大奎先生对由曹兴午教授于国内首创的“精液脱落细胞学”予以充分肯定，认为“男性生精细胞学实验室”的成立，标志着我国男性不育诊断已从传统的精液分析和睾丸活检，跨越到了精子形态和细胞分析的新阶段。专家们对穷尽曹兴午教授的“精液脱落细胞学”予以高度评价，认为它开辟了男性不育诊断的新路径。 　　成立仪式上，殷大奎先生和北京同济医院院长黄海先生向曹兴午教授颁发了聘书，聘请他担任“生精细胞学实验室”主任，向李翠英博士颁发北京同济医院不育科学科带头人聘书，并共同为实验室揭牌。 　　来自北京各大医院的国内知名男科学专家们就诊疗过程中所遇难点病例以及我国转化医学的重点、模式、前景等问题，进行了充分而热烈的研讨，专家们一致认为男科学在未来应成为转化医学研究关注的重点领域之一。

p 　　病痛常常使人们放弃一些生活的追求做出一些妥协，肢体的缺陷使人被迫放弃运动，皮肤的敏感可能需要惜别明媚的阳光，但一些恶毒的疾病比如肺病，总让人避无可避，因为没有人可以放弃呼吸。 /p p 　　对于一些慢性肺病，传统的药物无法使肺器官恢复原状，只能减缓其纤维化的速度，而这些伤害都是不可逆的，如慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD，下文简称“慢阻肺”)。这种疾病被认为是全世界最痛苦的疾病之一，想象一下，你在游泳憋气，在水下1分钟会是什么感觉?可是有每100人中就有6个人，每天就如同在水下挣扎呼吸。如今，这些肺病患者终于迎来了新的希望!在左为教授的带领下，来自同济大学的研究团队在肺干细胞移植人体临床实验上做出重大突破，这也是世界第一例成体肺干细胞移植。 /p p 　　 span style=" color: rgb(31, 73, 125) " strong 比传统肺移植更安全高效的肺干细胞移植 /strong /span /p p 　　在此次实验中，研究团队成功在患者肺部支气管上皮分离出 SOX9+ 阳性的肺脏干细胞并将其应用于临床实验中，术后 3-12 个月，患者肺功能有效改善且保持良好。该研究发表于《Protein & amp Cell》杂志上。 /p p 　　在传统的治疗中，上文提到的慢阻肺只能通过吸入支气管扩张药和皮质类固醇进行治疗，有些患者甚至需要长期供氧，肺脏移植是唯一可以“一劳永逸”的终极希望。肺脏是人体最复杂的器官，数十种不同细胞的协同工作保证了正常功能的进行。而正是由于其复杂的结构，增加了临床病症诊断的难度，因而一经确诊，肺病往往已经产生不可逆的伤害(至少已丧失50%的功能)。 /p p 　　在一般的肺移植手术，患者经常面临着极高的风险。毕竟，在众多器官移植中，肺移植手术属于最复杂、高难的一类：手术允许的冷缺血时间短 大部分脏器暴露在空气中，感染问题突出，易引起败血症。但左为教授团队成功实施的肺干细胞移植通过纤维支气管镜即可无创移植，患者入院观察3天就出院了，无需像肺移植那样进行开胸，这样就大大避开了上述的这些风险。 /p p 　　同时，异体移植常伴随着非常强烈的免疫排斥反应，甚至可能危及生命。与异体肺移植相比，肺干细胞移植这种自体干细胞移植的优势还在于基本不会激发免疫排斥。所以，该研究不仅可以帮助慢性肺病患者维持正常生活需求，延续生命，今后或许有可能应用于肺癌切除后肺的重建。它也标志着再生医学在临床应用上的巨大希望，更多不同疾病的患者将受益于此。 /p p 　　 span style=" color: rgb(31, 73, 125) " strong 慢阻肺“新救星” /strong /span /p p 　　生命依赖于呼吸，而呼吸的重要器官就是肺。如今，人们最关心的健康话题就少不了肺癌，到2017年，中国肺癌发病率已经上升到80万例，死亡人数已达到70万例，约占全国癌症死亡人数的四分之一。但是，慢阻肺作为慢性肺病也非常值得重视，它的致死率与致残率均高于肺癌。有数据显示，中国乡镇地区，该病是第四大主要死因，而在城市地区，慢阻肺是第三大主要死因。 /p p 　　在美国，慢阻肺患者的数目同样触目惊心，以两种常见的慢阻肺为例，2012年，特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)的发病患者数约为20万，而慢阻肺则表现的更为普遍，目前美国患有该疾病的患者超过3000万，而它也正在成为世界范围内致残和致死的重要原因，预计2030年将成为全世界第三位主要死因。 /p p 　　慢性阻塞性肺病：亦可称为慢性阻塞性肺炎(COLD)或慢性阻塞性呼吸道疾病(COAD)，常简称为慢阻肺，主要表现为持续性的气流受限，病情会随着时间推移而加重。 /p p 　　特发性肺纤维化：又称隐源性纤维化肺泡炎，弥漫性纤维化肺泡炎，是一种无明显原因的，进行性的肺纤维化。肺间质的广泛纤维化形成而肺组织增厚，造成不可逆转地丧失肺组织氧气交换的能力。 /p p 　　因此，此次研究所带来巨大的希望是不言而喻的。肺干细胞移植成为逆转败局的又一可能，但移植的肺干细胞又从哪而来呢?人体内每天都在经历着细胞的增殖和凋亡，而干细胞，就是“细胞库”的源头。干细胞是一种未充分分化、具有再生各种组织器官的潜在功能的细胞。根据发育过程和分布可分为胚胎干细胞(embryonic stem cell)和成体干细胞(adult stem cell)。 /p p style=" text-align: center " img title=" 1.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/b3019add-2051-4c4a-a4ea-6544c5e1d4ec.jpg" / /p p 　　成体干细胞，也称成人干细胞，存在于成人体内特定的组织中，具有由干原细胞形成先驱细胞，分化成具特定功能细胞的能力，用以维持组织和器官生长、衰退的动态平衡。相比胚胎干细胞，成体干细胞对于患者来说更为易得方便，并且正如上文提到的，自体干细胞诱导分化的器官可以使患者有效避免免疫排斥反应。 /p p 　　由左为教授带领的团队以此为实验思路，通过支气管镜检的方法，从人类肺部支气管上皮刷取细胞，从中筛选出 SOX9 阳性的肺脏干细胞(Sox9是这类干细胞的蛋白标志物)。为了验证肺脏干细胞的再植修复能力，研究者将标记了GFP荧光蛋白的肺脏干细胞移植到小鼠受损的肺脏内，三周后，小鼠的肺脏变得十分健康-人类肺细胞大面积整合到小鼠的肺内，形成了“人-鼠嵌合肺”-小鼠的肺脏“重生”了。 /p p 　　不仅如此，在细胞移植的过程中辅以抗纤维化药物吡非尼酮(Pirfenidone)，抑制TGF-β信号通路，也会进一步提升移植效率。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(31, 73, 125) " 人类正在将“种子”变成“果实” /span /strong /p p 　　基于良好的初期动物实验结果，左为教授团队联合附属东方医院、第三军医大学附属西南医院开展全球首个基于成体干细胞的肺脏再生临床试验，初期招募了10名患者。研究者首先从患者支气管无损刷取出一些带有细胞的黏液，在体外完成筛选、扩增，再次将这些干细胞用纤维支气管镜无创移植回患者的病灶部位。 /p p 　　本研究论文对两名支气管扩张患者的症状进行了描述，自体干细胞移植后，经过3-6个月的增殖、迁移和分化，干细胞逐渐形成了新的肺泡和支气管结构，完成了对损伤组织的修复替代。移植一年之后两位患者均自述咳嗽、咳痰和气喘等症状出现改善。 /p p 　　这一技术体系的建立，不仅是很多患者的希望，同时也为健康人群提供了选择的余地。左为教授的合作伙伴之一，来自附属东方医院的任涛主任对肺脏干细胞的临床广泛应用前景信心满满：“目前我国各种肺部疾病正处于高发状态。肺部组织一旦被破坏发生纤维化，病情往往持续进展且无法逆转，除了全肺移植之外，肺脏干细胞移植是患者最后的希望所在，我们肩上的责任很大。同时，我们也呼吁把健康人群和疾病早期患者的肺脏干细胞存储提上日程。” /p p 　　2016年，由左为教授和任涛教授共同主导的“人自体支气管基底层细胞(肺脏干细胞)移植治疗间质性肺病临床研究”通过专家组评审，成为我国8家干细胞临床研究项目之一，正式从基础研究转入临床治疗研究阶段，迄今已有20多名患有肺纤维化、肺气肿等肺脏疾病病人接受治疗。 /p p 　　对于人类来说，成体干细胞就像是进化长河中一粒粒遗珠，是自然赠予人类“重生”的种子。而此次成体肺干细胞移植的成功意味着人类有能力将“希望”的种子变成现实的“果实”，随着临床试验的进一步展开及深入，终有一日，每名患者都可以阳光下，尽情肆意的呼吸。 /p

p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 8月10日23点， i Nature Biotechnology /i 在线发表了由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室研究员王凯研究组完成的题为《共聚焦光场显微镜对小鼠和斑马鱼大脑快速体成像》的研究论文。该研究发展了一种新型体成像技术：共聚焦光场显微镜(Confocal light field microscopy)，可以对活体动物深部脑组织中神经和血管网络进行快速大范围体成像。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 跨脑区大规模的神经元如何整合信息并影响行为是神经科学中的核心问题，解答这一问题需要在更高时空分辨率上捕捉大量神经元活动动态变化的工具。共聚焦显微镜和双光子显微镜等运用于活体脑成像的传统工具基于点扫描，时间分辨率较低，难以研究大范围脑区中神经元的快速变化。因此，近年来科研人员一直致力于开发更快的成像方法。在多种新技术中，光场显微镜具有潜力，得到广泛关注，其特点在于可以在相机的单次曝光瞬间，记录来自物体不同深度的信号，通过反卷积算法重构出整个三维体，实现快速体成像，在线虫、斑马鱼幼鱼等小型模式动物上已获得初步应用。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 传统光场显微镜存在两个难以解决的问题，限制了其在生物成像上的应用。首先，重构的结果会出现失真。2017年，王凯研究组研发的新型扩增视场光场显微镜（eXtended field-of-view Light Field Microscopy, XLFM）解决了这一问题，并应用于自由行为斑马鱼幼鱼的全脑神经元功能成像上，首次三维记录了斑马鱼幼鱼在完整捕食行为中的全脑神经元活动的变化。其次，现有光场显微成像技术缺乏光学切片能力，无法对较厚组织，如小鼠的大脑进行成像。让光场显微镜具有共聚焦显微镜一样的光学切片能力，滤除大样品中焦层之外的背景信号来提高信噪比，是提高成像质量、可广泛应用的关键所在。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 然而，传统共聚焦显微镜采用激光逐点扫描和共轭点针孔检测来降低焦面外噪声的策略不适用于三维光场显微镜。面对这一挑战，研究团队创新提出广义共聚焦检测的概念，使其可以与光场显微镜的三维成像策略结合，在不牺牲体成像速度的前提下有效滤除背景噪声，提高了灵敏度和分辨率。这种新型的光场显微成像技术称为共聚焦光场显微镜。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 研究团队在不同动物样品上测试了共聚焦光场显微镜的成像能力。团队成员对包埋的活体斑马鱼幼鱼进行全脑钙成像，对比共聚焦和传统光场显微镜的成像结果，发现加入光学切片能力后，图像分辨率和信号噪声比提高，可以检测到更多较弱的钙活动。进一步的，将共聚焦光场显微镜和高速三维追踪系统结合，对自由行为的斑马鱼幼鱼进行全脑钙成像，在ø 800 μm x 200 μm的体积内达到2 x 2 x 2.5 μm sup 3 /sup 的空间分辨率和6Hz的时间分辨率。受益于更高的分辨率和灵敏度，可以识别出斑马鱼幼鱼在捕食草履虫过程中单个神经元的钙离子活动的变化。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 团队成员验证了共聚焦光场显微镜对小鼠大脑的成像效果，对清醒小鼠的视皮层进行钙成像，可以同时记录ø 800 μm x 150 μm的体积内近千个神经元的活动，最深可达约400 μm，且连续5小时以上稳定记录超过10万帧，没有明显的光漂白。团队成员进一步尝试使用共聚焦光场显微镜对鼠脑中的血细胞进行成像，深度可达600 μm，拍摄速度70 Hz，同时记录上千根血管分支中群体血细胞的流动情况并计算血细胞的速度，相比之前的传统成像方法通量提高了百余倍。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 研究团队在自由行为的斑马鱼幼鱼和小鼠大脑上证明了共聚焦光场显微镜有更高的分辨率和灵敏度，为研究大范围神经网络和血管网络的功能提供了新的工具。同时，该技术不仅适用脑组织的成像，还可以根据所需成像的样品种类灵活调整分辨率、成像范围和速度，应用在其他厚组织的快速动态成像中。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 研究在王凯的指导下，主要由博士研究生张朕坤、白璐，以及助理研究员丛林共同完成。王凯研究组余鹏、张田蕾，中国科学技术大学本科生石万卓，杜久林研究组李福宁做出贡献，研究员杜久林参与合作并给予指导意见。研究得到中科院脑智卓越中心实验动物平台的支持。研究工作受到科技部、中科院、国家自然科学基金委员会和上海市的资助。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/9bfa0661-24ad-4d0d-9ccd-10db465617c7.jpg" title=" 图1.jpg" alt=" 图1.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图1.（上）共聚焦光场显微镜原理示意图。（下）不同于传统光场显微镜，共聚焦光场显微镜采用片状照明，选择性激发样本的一部分，在垂直照明的方向上扫描，采集到的信号被遮挡板过滤掉焦层范围之外的部分。对采集到的图像进行重构可以得到焦层内的三维信息。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/28e2bd6d-59f5-4ff1-8085-355f6d295cbf.jpg" title=" 图2.jpg" alt=" 图2.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图2.（左）斑马鱼幼鱼捕食行为的一个例子。0s 为斑马鱼吞食草履虫的时刻。（右）左图斑马鱼捕食行为中，共聚焦光场显微镜记录到的两个不同脑区的神经元活动。箭头所指为过程中激活的单个神经元。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/c26412e7-a408-4c67-8533-1c5a118fdb4b.jpg" title=" 图3.jpg" alt=" 图3.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(68, 68, 68) font-family: 微软雅黑 background-color: rgb(255, 255, 255) " 　 /span 图3.（左）共聚焦光场显微镜拍摄得到的小鼠视皮层中的复杂血管网络。6个在不同深度拍摄的体积连接为一个深度达600 μm的三维结构。（中）100 μm到250 μm深度血管网络的平面投影，颜色代表不同血管分支中血细胞的平均流速。（右）图中箭头所指的区域中五个血管分支在一段时间内流过血细胞数量的计数。 /p

p style=" text-indent: 2em " 据《自然· 通讯》杂志发表的一项概念验证研究，英国弗朗西斯· 克里克研究所和伦敦大学学院的科学家利用人类干细胞和生物工程支架，重建了人类免疫系统中的重要器官——胸腺，该项研究朝着构建可用于移植的人工胸腺迈出了重要一步。 /p p style=" text-indent: 2em " 胸腺是一个胸部器官，在免疫系统中起着至关重要作用的T淋巴细胞成熟于此。如果胸腺无法正常工作或无法在子宫内胎儿发育期间形成，则可能导致疾病，例如人体无法抵抗传染病或癌细胞的严重免疫缺陷疾病，或是免疫系统错误攻击患者健康组织的自身免疫疾病。 /p p style=" text-indent: 2em " 在新研究中，科学家们使用了在手术期间必须切除的患者器官的干细胞来重建胸腺。当被移植到小鼠体内时，经过生物工程改造的胸腺能够支持成熟的功能性人类T淋巴细胞的发育。这是科学家首次成功地重建完整人类胸腺。 /p p style=" text-indent: 2em " 为了重建该器官，研究人员从患者那里收集了胸腺，并在实验室中将捐赠组织的胸腺上皮细胞和胸腺间质细胞培养成数十亿个细胞的菌落。为获得胸腺的结构支架以便于用培养的胸腺细胞重新组装，研究人员开发了一种从小鼠胸腺中去除所有细胞仅保留结构支架的新方法。 /p p style=" text-indent: 2em " 研究人员给器官支架注入了多达600万个实验室培养的人类胸腺上皮细胞以及间质细胞。细胞生长在支架上，仅5天后，器官已发展到与9周大的胎儿相似的阶段。最后，研究人员将这些胸腺植入小鼠体内。他们发现，超过75％的胸腺能够支持人类淋巴细胞的发育。 /p p style=" text-indent: 2em " 研究人员表示，胸腺移植后常常导致免疫系统排斥移植体。通过移植从器官供体的胸腺中提取的细胞生长出的胸腺，或许能克服这一问题，从而消除患者在余生中服用免疫抑制剂的需求。 /p p br/ /p

近日，国家卫生健康委临床检验中心(NCCL)公布了2022年全国实体肿瘤体细胞突变高通量测序室间质量评价统计结果。华测检测认证集团股份有限公司旗下子公司——华测艾普医学实验室再次满分通过此次NGS室间质评，持续体现着华测艾普医学在NGS检测方面扎实的实验能力、强大的生物信息分析能力以及可靠的质量管理体系运营。 　　全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价计划，是保证各临床实验室检测质量的重要手段，主要旨在确定各个参评实验室实体肿瘤体细胞突变高通量测序检测的能力，发现在检测过程中存在的共性问题以及实验室存在的特殊问题，促进各实验室提高检测水平。 　　本次测评上报的检测范围包括：点突变、短片段插入/缺失突变等，涉及的所有基因突变类型均被华测艾普医学检出，无任何假阳性或假阴性结果，与公布的结果一致，满分通过！ 　　华测艾普医学作为“CTI华测检测”的一份子，将继续保持检测的钻石品质，以高标准、高质量的专业技术，不断进取、精益求精，为广大客户提供医疗检测服务，守护大众健康，为品质生活传递信任。

在细胞治疗过程中，评价免疫细胞的增殖能力，以其对靶细胞的杀伤能力是细胞治疗过程中非常关键的环节。其中DELFIA® EuTDA细胞毒法和DELFIA® BrdU细胞增殖方法，凭借其高灵敏度、易操作性性等诸多优势，已逐渐成为主流的检测技术。在此，通过以下一系列的应用案例，我们将向大家展示DELFIA® EuTDA、DELFIA® BrdU、活体影像及放射性检测等方法如何助力免疫细胞杀伤研究。 一，CAR-T细胞杀伤毫无疑问，CAR-T疗法已成为当下最火的肿瘤细胞疗法之一。同样作为CAR-T大国，中国多数CAR-T疗法已进入临床研究，并且产业化发展迅速，而美国则还集中在临床前研发[1]。安全性是CAR-T疗法的一大挑战。除了细胞因子风暴外，CAR-T疗法还会诱发移植物抗宿主反应 （graft versus host disease GVHD）等安全隐患。鉴于选择性去除CD45RA阳性细胞能有效抑制GVHD发生[2]，研究利用CD45RA阴性T细胞群体开展靶向CD19的 CAR-T疗法，来提高治疗安全性。结合DELFIA的细胞杀伤检测法和基于Calcein-AM标记的流式法，研究证明CD45RA阴性 CAR-T细胞能有效杀伤CD19阳性肿瘤细胞系，并能作用于原代NK细胞杀伤耐受的MLL重排白血病原始细胞SJ4-11（K562为敏感细胞对照，RS4 11为耐受细胞对照）[3]。由于CD45RA-细胞主要为CD3+CD45O+记忆T细胞，因此针对常见的病原体和疫苗应有更好的回忆应答（Recall response）。通过使用DELFIA Cell Proliferation Assay 检测掺入的BrdU，研究确认CD45RA- T细胞对人CMV、Epstein–Barr 病毒、 herpes simplex 病毒和tetanustoxoid有更为显著的免疫反应（下图a，增殖指标）。基于同样的增殖检测平台，研究利用PBMC开展Mixed lymphocyte reaction (MLR)，对比不同细胞亚群的同种异体反应。相较于CDRA-效应细胞群体，CD45RA+细胞在MLR实验中具有更高的增殖能力（下图b）和IFN-γ分泌能力（下图c）[3]。 进一步的体内实验研究继续利用了PerkinElmer IVIS活体成像平台，在白血病小鼠模型的基础上，研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法在不诱导GVHD的同时，发挥强效的抗癌效果[3]。借助活体成像的优势，研究追踪CD19+ SEM细胞在小鼠体内的扩增情况，确认在接种18天后肿瘤的信号强度足以模拟顽固性白血病小鼠模型。在此模型的基础上CD45RA-的 CAR-T疗法同样能迅速发挥作用，两周内强力抑制生物发光信号至检测限以下。最后，基于同样的检测平台结合重复接种肿瘤细胞，研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法还能作用于复发白血病小鼠模型。 二，CAR-NK细胞杀伤CAR-T细胞疗法的成功和兴起也推动了其他类型的CAR研究，其中就包括针对实体瘤的CAR-NK疗法。相较于T细胞，NK细胞可以在没有抗体和MHC的帮助下靶向疾病细胞，因此能发动更为快速的免疫反应并能有效针对无MHC I表达的肿瘤细胞。同时, NK细胞更为安全，支持“Off-the-Shelf”的大规模生产和直接异体治疗。目前在国内已有多家医疗企业推动CAR-NK治疗，如博生吉的CD7 CAR-NK。在6月份的Molecular Therapy期刊上，广州医科大学附属第三医院的研究向我们展示了最新的CAR-NK临床应用。为了特异靶向肿瘤细胞表面抗原NKG2DLs，研究在NKG2D受体的胞外结构域基础上融合参与NK细胞活化的核心分子DAP12，并进一步通过RNA转染途径提升CAR-NK安全性。基于DELFIA的细胞杀伤检测法，研究证明NKG2D-DAP12 (NKG2Dp)能有效的裂解多种肿瘤细胞系，优于对照NK和NKG2D-CD3z(NKG2Dz)[4]。借助Perkinelmer提供的HCT116-luc报告细胞系，研究通过活体成像方法，在体内水平证明CAR-NK能有效控制肿瘤发展。进一步的临床研究证明CAR-NK的引入能迅速引起肿瘤退缩和肿瘤细胞减少，强调NKG2D CAR是一种很有前景的细胞治疗方案[4]。 三，T细胞杀伤T细胞不仅是免疫系统的核心成员，也是适应性免疫反应的基石。因此，T细胞功能的全面评价在肿瘤免疫疗法的开发过程中至关重要，其中就包括肿瘤疫苗的研发。早期基于经典肿瘤相关抗原gp100的研究证明细胞因子RANTES的引入能显著提升小鼠脾脏细胞的杀伤能力。同时，RANTES表达的时间点非常关键。疫苗引入前12和24小时表达RANTES能有效提升T细胞的杀伤能力，而48小时则没有这个现象。基于动物实验，研究推测多种细胞参与杀伤，包括CD8+，NK细胞和CD4+细胞群体。进一步基于DELFIA细胞毒法研究证明TRAIL和FasL参与了杀伤过程[5]。 除了传统T细胞杀伤外，DELFIA细胞毒法还可以被用于检测靶向T细胞的新型免疫治疗分子，如双特异抗体(BiTE)等的细胞杀伤功能[6]。 四，NK细胞杀伤鉴于NK细胞在天然免疫系统的重要性，其活力检测也是免疫检查点抑制剂研发过程中的核心项目。此外，NK细胞活力检测还可以用于衡量用于免疫疗法开发的新型小鼠模型。在2016年发表的一份研究中，基于DELFIA的细胞杀伤检测法证明PD-1抗体可以显著提升NOG-MHC Double Knockout小鼠脾中NK细胞靶向K562的杀伤活力。靶向免疫治疗的新小鼠模型不仅能加速新型免疫检查点药物（组合）研发，同时可以协助发现新的标志物预测疗效[7]。 除了直接杀伤靶细胞外，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）也是评价NK细胞功能的一个关键指标。在今年的一份研究中，DELFIA细胞毒法被用于衡量静脉注射免疫球蛋白( intravenous immunoglobulin, IVIG)对NK细胞功能的影响。从结果可以看出，除了阻断NK细胞的直接杀伤能力外，IVIG几乎完全抑制ADCC活力（下图上）[8]。在该研究中，除了ADCC检测外，Perkinelmer的放射检测解决方案（3 [H]-Thymidine和MicroBeta 2）也被用于衡量IVIG和免疫抑制药物对NK细胞增殖的影响。H3-掺入法证明相较于IVIG，免疫抑制药物能有效抑制NK细胞增殖（下图下），而IVIG则特异作用于T细胞活力。鉴于ADCC是单抗药物发挥临床效果的核心机制之一，其活力检测也成为大分子药物研发的必须环节[9]。 欢迎扫码登录珀金埃尔默生命科学试剂耗材平台，点击进入car-t细胞治疗应用专题关注二维码：进入试剂耗材平台：参考资料：[1] Jia Xin Yu, et al. The global pipeline of cell therapies for cancer. https://www.nature.com/articles/d41573-019-00090-z[2] Triplett BM, et al. Rapid Memory T-cell Reconstitution Recapitulating CD45RA-depleted Haploidentical Transplant Graft Content in Patients with Hematologic Malignancies. Bone Marrow Transplant. 2015 Jul 50(7): 968–977.[3] Chan WK, et al. Chimeric antigen receptor-redirected CD45RA-negative T cells have potent antileukemia and pathogen memory responsewithout graft-versus-host activity. Leukemia. 2015 Feb 29(2):387-95.[4] Xiao L, et al. Adoptive Transfer of NKG2D CAR mRNA-Engineered Natural Killer Cells in Colorectal Cancer Patients. Mol Ther. 2019 Jun 5 27(6):1114-1125.[5] Aravindaram K, et al. Transgenic expression of human gp100 and RANTES at specific time points for suppression of melanoma. Gene Ther. 2009 Nov 16(11):1329-39.[6] Lewis SM, et al. Generation of bispecific igG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat Biotechnol. 2014 Feb 32(2):191-8.[7] Ashizawa T, et al. Antitumor Effect of Programmed Death-1 (PD-1) Blockade in Humanized the NOG-MHC Double Knockout Mouse. Clin Cancer Res. 2017 Jan 1 23(1):149-158.[8] Pradier A, et al. Small-Molecule Immunosuppressive Drugs and Therapeutic Immunoglobulins Differentially Inhibit NK Cell Effector Functions in vitro. Front Immunol. 2019 Mar 27 10:556. [9] DELFIA经典技术应用于单抗研发及细胞治疗——AD0116细胞杀伤专题之ADCC https://mp.weixin.qq.com/s/0lkBdDHL5MFIyoeoFV4wWQ关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

据《科学进展》杂志2日在线报道，美国莱斯大学的生物工程师表示，他们使用针头大小的可植入“药物工厂”持续提供高剂量白细胞介素-2，在短短6天内根除了小鼠体内的晚期卵巢癌和结直肠癌。该疗法或在今年晚些时候开始人体临床试验。白细胞介素-2是一种可激活白细胞以对抗癌症的天然化合物。试验使用的药珠可通过微创手术植入，每个都含有可产生白细胞介素-2的细胞，这些细胞被包裹在保护壳中。莱斯大学生物工程助理教授奥米德魏瑟的实验室研发了这种治疗方法。他说，人体临床试验最早可能在今年秋天开始。该团队只选择了已证明可安全用于人体的成分，并在多项测试中证明了新疗法的安全性。魏瑟说：“我们只给一次药，但‘药物工厂’每天都在生产药物，直到癌症被消除。一旦确定了正确的剂量，即需要多少家‘药物工厂’，我们就能够根除全部的卵巢癌和7/8的结肠直肠癌。”在新发表的研究中，研究人员将产生药物的珠子植入在肿瘤旁边和腹膜内，腹膜是一种支持肠道、卵巢和其他腹部器官的囊状内层，植入的白细胞介素-2集中在肿瘤内，并限制在其他地方暴露。该研究合著者、美国MD安德森癌症中心妇科肿瘤学和生殖医学教授埃米尔贾再瑞博士说：“免疫治疗领域的一个主要挑战是增加肿瘤炎症和抗肿瘤免疫，同时避免细胞因子和其他促炎药物的全身副作用。在这项研究中，我们证明了‘药物工厂’可在几种小鼠模型中进行可调节的白细胞介素-2局部给药和根除肿瘤。”白细胞介素-2是一种细胞因子，一种免疫系统用来识别和对抗疾病的蛋白质。这是一种FDA批准的癌症治疗方法，但研究人员表示，与现有的白细胞介素-2治疗方案相比，“药物工厂”引发了更强的免疫反应，因为药珠直接提供更高浓度的蛋白质到肿瘤。研究人员称：“如果你通过静脉注射泵给予相同浓度的蛋白质，那将是剧毒的。而对于‘药物工厂’，我们在远离肿瘤部位的身体其他部位观察到的浓度，实际上低于患者在接受静脉注射治疗时必须承受的浓度，高浓度仅处于肿瘤部位。”药珠的外壳保护其产生细胞因子的细胞免受免疫攻击。外壳由被免疫系统识别为异物但不视为直接威胁的材料制成。研究团队发现，异物反应在30天内“安全而有力”地关闭了胶囊中细胞因子的流动。如果有必要，可进行第二个疗程。总编辑圈点“药物工厂”可放置在肿瘤旁边，围绕在这些器官和大多数其他器官的内膜内。如果医生需要不同的细胞因子来靶向特定形式的癌症，还可在药珠上装载工程细胞，制造相关免疫治疗的化合物。更值得欣喜的是，这一方法未来将不局限于文中的两种癌症，也可用于治疗胰腺癌、肝癌、肺癌和其他器官的癌症。

进击的流式细胞术，浅谈百花齐放的FCM新技术与应用2021年08月26日，为期3天的第三届流式细胞技术网络大会（iCFCM 2021）圆满结束。本届大会由仪器信息网主办，开创性设置海外澳洲分会场，首次由中国分析测试协会标记免疫学会分会指导，开设临床应用分会场。本届网络会议吸引来自海内外高校科研单位、生物技术企业、科学仪器技术企业在内百余家单位，远超2000人参加。流式细胞技术(Flow Cytometry, FCM)是一种可以快速、准确、客观地同时检测单个微粒(通常是细胞)的多项特性，并加以定量的技术，具有速度快、精度高、准确性好等优点。流式细胞分析仪正是采用这一技术，普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域，同时也可以应用于外周血内皮细胞测定、调节性T细胞等尖端领域。流式细胞仪作为最重要的细胞研究工具之一，在生命科学基础研究、临床诊断等领域有重要应用。随着诊断、制药等应用级市场对流式技术的需求日益增加，流式技术得到极大普及。近年来处于上游的研发制造创新活力高涨，随着光谱流式、质谱流式等新技术的推广，对流式的应用越来越深入、多元，应用场景还在不断丰富和扩大。本届大会上有哪些新的创新技术和应用领域呢？就技术发展而言，质谱流式和光谱流式都扮演着重要的角色。技术发展篇质谱流式技术质谱流式是近年来发展起来的细胞表征新技术，相比于传统流式细胞术，质谱流式对细胞的分类更精准，不仅可发现以往被忽略的但可能在疾病发生发展中扮演重要角色的细胞亚群，还可以细胞亚群间组合的方式提供全新的观测指标。恶性肿瘤伴随着可逆的全身系统性免疫改变，运用质谱流式技术可能为恶性肿瘤等疾病的早筛早诊提供新的可能。质谱流式技术将荧光染料替换为金属标记，能够获得单个细胞的多种参数，并且克服了传统流式荧光发射基团光谱重叠的问题。质谱流式检测通道理论上可高达百余个，可以同步对更多的细胞特征进行分析。与荧光流式相比，质谱流式技术能够同时检测更多目标蛋白，打破了荧光配色的局限，避免了复杂的补偿操作。更重要的是，从2009年质谱流式正式推出以来，质谱流式（mass cytometry）在肿瘤、免疫、干细胞、代谢等研究领域的影响不断扩大。在这场肆虐全球的新冠疫情中，质谱流式在通道数量、标签稳定性等方面的优势，也使其成为研究病毒感染机制的重要手段。在应用不断扩展的同时，质谱流式技术本身也在不断迭代发展。本届大会中，清华大学张四纯教授、浙江大学盛剑鹏研究员以及浙江大学医学院附属第一医院章琦副主任医师均在质谱流式技术的应用方面深入研究，主要涉及单细胞分析以及肿瘤早期诊断应用。质谱流式典型的技术企业有：富鲁达（Fluidigm）、上海宸安生物光谱流式随着免疫学和诊断医学领域的研究不断深入，如今的流式实验仍然聚焦于同时检测更多颜色，很多研究已经对30色乃至40色以上的多色方案提出了需求。光谱流式细胞术是一种基于常规流式细胞术的技术，其中光谱仪和多通道检测器（通常为CCD）代替了常规系统中的传统反射镜，滤光器和光电倍增管（PMT）。流式细胞仪可以快速进行多参数收集并分析单个细胞或颗粒上的数据。将多色的光谱分析与强大的分选功能相结合，可以更好地帮助科学家开展单细胞层面的基因组学及功能研究。此外，辅以智能化的操作模块，可节省大量的仪器准备时间，并实现高速、高纯度、高活性的细胞分选。可以说，光谱流式代表了近几年新的仪器端技术发展趋势，大幅度增加了流式检测光学信息含量，由简单的信号强度分析扩展到光谱特征分析。该技术能够有效降低试剂选择、试验方案、荧光补偿等复杂度问题，代表了流式技术进入了一个新时代。2011年，索尼获得了普渡大学（Purdue University）的光谱技术专利许可，并致力于开发光谱流式细胞仪。目前典型的光谱流式技术企业有：SONY、Cytek、还有年初收购Bigfoot的赛默飞。流式细胞分选技术流式细胞分选技术是将研究者感兴趣的目标细胞在流式分析鉴定的基础上，重新回收用于后续研究的精确的细胞分选技术，在生物学与医学领域的诸多研究方向如免疫学、肿瘤学、细胞生物学、神经生物学和病原微生物学等中均有重要应用，是现代生命科学、生物医药等广泛的研究领域中不可或缺的实验技术。实现最优良的分选实验，需要在包括仪器、样本、分选操作等大量细节的优化，并且依赖于对分选原理的理解。因此，详细掌握样品制备、仪器准备、上样控制、圈门分选等各个环节的优化操作对于流式分选至关重要。典型的流式分选技术企业：BD、Bio-Rad、Cytek、美天旎等应用领域篇就应用领域而言，流式细胞术已成为分子生物学、医学、免疫学、病理学、植物生物学、海洋生物学等多个研究领域对荧光信号进行高速、灵敏分析的有效方法。肿瘤免疫&临床应用 流式细胞术在临床转化中的应用意义重大，目前，流式细胞术已实现了单细胞分选及测序技术。随着该技术了解的愈发深入，流式细胞术相关的研究论文发表数量逐年增多。据不完全统计，目前借助流式细胞技术平台或相关主题，每年发表的科研论文数量超30万篇。免疫疗法由于其特异性靶向且高治愈率的优势特点，正在不断革新癌症治疗的临床方案和疗效，且愈来愈要求个性化精准治疗。从基础医学到临床诊断，稀有细胞得到越来越多的关注，如循环肿瘤细胞（CTCs），抗原特异性T细胞外泌体等数量稀少，但对恶性肿瘤进行早期诊断、预后评估，以及获得肿瘤耐药性评估等重要信息。流式细胞术除在临床转化中的应用外，在血液病诊疗中的应用也十分广泛。流式细胞技术可应用于血液系统恶性疾病免疫表型及MRD的判断，借助免疫表型判断白血病的不同疾病时期。流式细胞术不仅可用于CAR-T治疗患者的监测，同时在各种良、恶性疾病的诊断、治疗，感染的免疫指标评价，移植物抗宿主病、CMV、EBV或者其他感染等移植后并发症的诊断、评价，噬血综合征等特殊免疫状态的监测与防治中，都起到极为重要的作用。自身免疫病中自身抗体非常复杂，一种自身免疫病可能有多种自身抗体，一种自身抗体也可能见于多种自身免疫病。多种自身抗体的联合检测，对疾病的辅助诊断、鉴别诊断、疗效监测、预后评估等具有重要的价值。近年来，随着技术的进步，越来越多自身免疫病特异性或相关性自身抗体在临床得到推广使用，临床也对实验室自身抗体检测菜单、检测效率、能否给出定量结果等提出更高的需求。流式荧光技术因其可多项联检、高效、定量等优势，能很好地助力自身抗体检测，助力疾病诊疗，技术进步，恰逢其时。此外，流式荧光技术在HPV、细胞因子、肿瘤标志物以及Torch检测领域均表现出重要的应用。北京大学第一医院闫存玲主任、中国医学科学院肿瘤医院陈汶教授、青岛市海慈医疗集团（青岛市中医医院）宗金宝主任、上海市华东医院赵虎主任、浙江省儿童医院尚世强主任等重磅专家为大家呈现精彩的报告分享。（敬请观看流式大会的精彩报告视频回放https://www.instrument.com.cn/webinar/video/collection/10897）。外囊泡/纳微医药应用纳微米颗粒、外泌体以及近红外材料在生物示踪以及生物医药领域的研究越来越受关注。其中细胞外囊泡是肿瘤液体活检的重要生物标志物。由于纳米尺寸的细胞外囊泡超出了流式细胞术的检测限，通过将囊泡吸附在微球上并借助抗体的特异性识别，实现了对细胞外囊泡表面特定蛋白分子信息的放大，从而可通过流式细胞术对细胞外囊泡的检测和分析。实现了乳腺癌、脑胶质瘤、垂体瘤等的肿瘤进展评估、预后评价等临床应用。流式作为一种重要定量手段，有助于最大程度实现对特定类微纳米颗粒的精准设计，可应用于药物载体和疫苗佐剂研究。基于流式技术，可以开展颗粒/细胞表征、有效性/安全性评价工作，为该领域相关研究提供参考。重要的是，成像流式作为独特的流式技术，因其超高灵敏度和可视化的流式数据，突破了长期以来存在于外泌体、纳米材料等微颗粒检测中的瓶颈。通过提供明场和多通道的荧光图像，清晰分辨每个微颗粒的表征，溯源其与亲源细胞间的关系，以及与靶向细胞间的相互作用，在微颗粒研究、体外诊断、药物开发等领域有着独特的、不可或缺的应用。动、植物/微生物检测应用围绕水环境保护、渔业可持续发展、微藻生物能源方面的重大战略需求，流式细胞技术在鱼类遗传育种学、藻类生物学、淡水生态学、水环境工程学和保护生物学的应用具有一定的优势。流式技术在除人、小鼠以外其他多种模式生物中具备组织特异性的流式检测及分选应用也十分广泛。病毒是颗粒很小、以纳米为测量单位的非细胞型微生物。它在疾病预防、传染病爆发等方面扮演重要角色。对病毒生物学、病毒与宿主相互作用、免疫应答机制等研究，有利于药物与疫苗的研发，建立快速有效的临床诊断和治疗体系。流式细胞术在病毒颗粒检测、疫苗效价评估、免疫细胞亚群及免疫反应分析等流程中是必不可少的方法之一。此外，仪器的质控是流式课题必须和不可或缺的步骤。流式仪每天都需要通过质控以确保数据的准确性。熟悉日常流式仪器质控的主要参数，掌握如何进行和解读质控，仪器性能跟踪和故障排除。长期流式课题的实验间质控的必须性和方法，并且掌握如何通过质控获得可重复性的结果都非常重要。

肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一，已发展成为继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗模式。肿瘤免疫学治疗的方法种类繁多，目前各大医药研发企业的关注焦点主要包括：免疫检查点抗体药物，CAR-T疗法，溶瘤病毒等等，但新型的免疫疗法如何进行可靠有效的临床前效果评估，是推进肿瘤免疫疗法的一关键节点。百奥赛图自主研发了一系列免疫检查点人源化小鼠，为免疫检查点抗体药物筛选提供了可靠的体内药效模型，此外基于重度免疫缺陷B-NDG小鼠建立的免疫系统人源化小鼠模型也为药物验证提供了更多的选择。本期转化医学系列webinar邀请到的是百奥赛图药理药效事业部总监郭雅南博士，郭博士将给大家介绍：1. 免疫检查点抗体单用或联用在体内药效筛选的策略2. 利用免疫重建小鼠和B-hCD3e人源化小鼠进行双特异性抗体的体内药效评估与毒性检测3. 利用重度免疫缺陷小鼠B-NDG小鼠对CAR-T药物进行体内药效评估与毒性检测转化医学系列网络讲座第五期讲座题目：人源化模式小鼠在肿瘤免疫药物研究中的应用讲座时间：7月25日下午14:00-15:00主讲人：郭雅南 博士（百奥赛图）讲座形式：网络讲座，手机或PC即可参与（会议链接和如下报名链接相同）即刻报名扫描下方二维码主讲人简介郭雅南 博士百奥赛图 药理药效事业部总监清华大学生物科学与技术系本科；美国罗切斯特大学神经生物学/药理学博士学位；2009-2013年，在哈佛大学医学院伯明翰妇女医院转化医学系从事博士后研究工作；2014年回国，担任百奥赛图基因生物技术有限公司研发部副总监。拥有10多年癌症生物学和神经生物学的研究经验，现担任药理药效事业部总监。更多转化医学系列网络讲座安排，具体时间以珀金埃尔默微信推送时间为准。敬请关注！主题预计时间高内涵筛选助力个性化癌症医疗8月小分子激酶抑制剂研究最新进展9/19/2019使用Alpha技术研究RNA甲基化“橡皮擦” （ALKBH5）10/24/2019研究蛋白相互作用就是这么简单11/7/2019细胞成像分析前沿应用案例心得分享11/28/2019原来药物研发还可以这样做——基于表型筛选的药物研发11月小动物活体成像技术助力脑靶向载体的研究12/19/2019关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

陈良怡团队合作揭示小鼠偏好“喜新厌旧”的神经元集合和孤独症小鼠的缺陷社交行为是个人和人类社会生存和发展的基础。有关大脑通过何种方式编码社交行为信息这一科学问题，目前尚无确切答案。此外，孤独症、抑郁症、精神分裂症、社交恐惧症或创伤后应激障碍（PTSD）等患者，均存在显著社交识别或互动障碍，给家庭、社会和国家带来诸多问题和负担，当前仍缺乏行之有效的干预手段或治疗方法，原因之一在于对大脑处理和编码社交行为信息的神经机制知之甚少。既往研究表明，大脑内侧前额叶皮层（mPFC）在社交探索、社交恐惧和社会竞争等方面均发挥重要调控功能[1-4]。当小鼠进行社交探索行为时，mPFC脑区前边缘皮质（PrL）内部分兴奋性锥体神经元活动会显著增强[5, 6]，mPFC神经元集群在处理不同社交对象信息时，其活动表现出较强的异质性[7, 8]，而且mPFC脑区内抑制性GABA能中间神经元也同社交行为密切相关[1, 4, 9]，然而，由于缺乏在体单细胞分辨率水平、实时动态可视化的神经编码研究方法，这些不同亚型神经元集群是如何编码特定社交对象信息的尚不明了。北京大学未来技术学院分子医学研究所、IDG麦戈文脑科学研究所、北大-清华生命科学联合中心、生物膜国家重点实验室陈良怡实验室，联合军事医学研究院吴海涛实验室以及北京大学工学院张珏实验室，在Science Advances杂志发表了题为“Encoding of social novelty by sparse GABAergic neural ensembles in the prelimbic cortex”的研究论文，解析了孤独症小鼠“喜新不厌旧”社交缺陷下的神经编码机制。在陈良怡实验室和程和平院士团队联合开发两代高时空分辨率的微型化双光子显微成像系统基础上[10, 11]，通过建立改进型小鼠两箱社交行为学研究范式，利用MeCP2转基因孤独症小鼠模型和细胞亚型特异性Cre小鼠，借助微型化双光子显微镜钙成像技术，结合基于Tet-off系统的细胞特异性化学遗传学操控技术、CRISPR-Cas9介导的基因编辑和功能挽救等前沿技术，系统探讨了正常和孤独症小鼠模型不同社交行为过程中，PrL脑区内不同亚型神经元集群编码特定社交信息的模式差异。首先，借助微型化双光子钙成像技术，研究人员发现在小鼠自由社交活动过程中，PrL脑区内抑制性中间神经元较之于兴奋性锥体神经元具有更强的相关性。数学分析揭示其中存在稀疏分布的“社交特异”神经元，与之前研究的“社交相关”神经元不同，它们特异性地参与了同“陌生”或“熟悉”老鼠的社交行为。通过化学遗传学技术，特异性抑制社交行为过程中被激活的这些抑制性中间神经元亚群，能够显著破坏小鼠社交偏好及社交新颖性行为。提示PrL脑区内这群稀疏分布的中间神经元集群在调控小鼠社交偏好性以及“喜新厌旧”行为模式中，扮演着极为关键的角色。进一步，研究人员在进行小鼠两箱社交行为学观察时发现，MeCP2转基因孤独症小鼠社交偏好性并无显著缺陷，但会丧失典型的“喜新厌旧”样社交新颖性行为。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在MeCP2转基因孤独症小鼠PrL脑区中间神经元内特异性剔除外源性MeCP2转基因后，可显著挽救孤独症小鼠“喜新厌旧”样社交缺陷表型。表明PrL脑区抑制性中间神经元内过表达MeCP2转基因可能是诱发孤独症小鼠产生社交新颖性行为缺陷的罪魁祸首。最后，通过系统分析野生型和MeCP2转基因孤独症小鼠模型PrL皮层内编码“陌生”和“熟悉”社交对象信息、且稀疏分布的抑制性中间神经元钙信号动力学特征，研究人员发现，当野生型小鼠分别与“陌生”或“熟悉“小鼠发生社交时，其PrL皮层中编码相关社交对象特异性神经元的发放概率、钙信号变化幅度以及达峰时间均存在显著差别。这两群细胞通过“跷跷板”式的协同增强效应，帮助小鼠确定面对不同类型对象采取不同的社交策略。而孤独症小鼠PrL脑区内相关神经元集群均明显异常，总体表现为“陌生”或“熟悉”社交对象引起社交特异神经元间反应差异消失，从而无法区分“陌生”和“熟悉”不同社交对象之间的差别，最终导致社交新颖性行为缺陷。综上，该研究工作发现在小鼠前额叶皮层内存在一群稀疏分布的中间神经元集群，分别负责编码社交行为中的“熟悉”和“陌生”社交对象信息，这些稀疏分布的神经集群在调控小鼠社交行为，尤其是社交新颖性行为中发挥着重要作用，揭示了个体在面对不同类型对象进行社交行为时的神经编码机制。该研究为深入理解孤独症等神经精神疾病患者社交行为缺陷的神经机制，探索精准靶向诊疗新策略提供了新的证据和线索。PI简历陈良怡北京大学未来技术学院学院教授北大-清华生命科学联合中心PI邮箱：lychen@pku.edu.cn实验室主页：http://www.cls.edu.cn/PrincipalInvestigator/pi/index5489.shtml研究领域：我们发展自驱动的活细胞智能超分辨率成像技术，并应用这些技术来研究生物医学重要问题。目前一方面的工作主要集中在引入物理光学中新成像原理、数学和信息学科中的图像重建新方法等，致力于发展可以在活细胞中实现两种以上模态光学信号探测的三维超分辨率成像的通用工具，实现同一活细胞样本上长时间、超分辨率、三维成像特定生物分子（荧光）和主要细胞器（无标记）。建立基于深度学习等手段Petabyte级的图像数据的高速处理以及分割手段，自动化、定量化描述活细胞内不同蛋白等分子以及细胞器的形状、位置以及相互作用等参数，找到新的细胞器并定义它们生化特性，最终目标是建立单细胞细胞器互作组学以及活细胞超分辨率病理学的概念，利用成像来揭示细胞内的异质性动态变化以及如代谢类疾病的发生发展机制。另一方面，我们也应用发展的高时空分辨率生物医学成像的可视化手段，系统研究血糖调控紊乱激素分泌在活体组织、细胞水平以及分子代谢水平的关系。参考文献：1.Xu, H., et al., A Disinhibitory Microcircuit Mediates Conditioned Social Fear in the Prefrontal Cortex. Neuron, 2019. 102(3): p. 668-682 e5.2.Kingsbury, L., et al., Cortical Representations of Conspecific Sex Shape Social Behavior. Neuron, 2020.3.Báez-Mendoza, R., et al., Social agent identity cells in the prefrontal cortex of interacting groups of primates. Science, 2021. 374(6566): p. eabb4149.4.Zhang, C., et al., Dynamics of a disinhibitory prefrontal microcircuit in controlling social competition. Neuron, 2021.5.Murugan, M., et al., Combined Social and Spatial Coding in a Descending Projection from the Prefrontal Cortex. Cell, 2017. 171(7): p. 1663-1677 e16.6.Liang, B., et al., Distinct and Dynamic ON and OFF Neural Ensembles in the Prefrontal Cortex Code Social Exploration. Neuron, 2018. 100(3): p. 700-714 e9.7.Pinto, L. and Y. Dan, Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior. Neuron, 2015. 87(2): p. 437-50.8.Rigotti, M., et al., The importance of mixed selectivity in complex cognitive tasks. Nature, 2013. 497(7451): p. 585-90.9.Cao, W., et al., Gamma Oscillation Dysfunction in mPFC Leads to Social Deficits in Neuroligin 3 R451C Knockin Mice. Neuron, 2018. 97(6): p. 1253-1260.e7.10.Zong, W., et al., Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods, 2021. 18(1): p. 46-49.11.Zong, W., et al., Fast high-resolution miniature two-photon microscopy for brain imaging in freely behaving mice. Nat Methods, 2017. 14(7): p. 713-719.

癌症是由渐进的基因和表观遗传变化驱动，在整个过程中，癌细胞可以获得复杂的异质性，进而更具侵袭性和转移性，并扩散到身体其他部位形成新的肿瘤，加速疾病的进程。因此，深入了解肿瘤亚克隆选择和转移的分子基础、转录状态的起源和转变以及肿瘤进化路径的遗传决定因素，不仅有助于阐明肿瘤进化的基本原则，还具有临床意义。基因工程小鼠模型（Genetically engineered mouse models, GEMMs）是研究肿瘤进展的一个关键工具，研究人员能够通过GEMMs研究肿瘤在原生微环境和实验定义的条件下的演化过程。其中，KrasLSL-G12D/+ Trp53fl/fl（KP）模型通过病毒传递Cre重组酶到少量肺上皮细胞引发肿瘤，导致致癌基因Kras的激活、P53肿瘤抑制基因的纯合缺失和肿瘤的克隆生长等，真实模拟了新生细胞转化成侵袭性转移肿瘤的主要步骤，从分子和组织病理学上再现了人肺腺癌的进展。因此，我们可以通过KP模型来探究肿瘤演变过程中尚未解决但非常关键的问题。 近日，美国加州大学Jonathan S. Weissman研究团队及合作者在Cell上发表了题为“Lineage tracing reveals the phylodynamics, plasticity, and paths of tumor evolution”的文章。研究团队将基于单细胞RNA-seq的进化谱系示踪系统引入KP小鼠模型中，连续并全面监测了一个携带致癌突变的单细胞演变为侵袭性肿瘤的全过程，揭示罕见的亚克隆可以通过独特的转录程序驱动肿瘤扩张。此外，研究团队还发现肿瘤通过典型、独特的进化轨迹发展，干扰额外的肿瘤抑制因子可以加速肿瘤的进展。该研究以前所未有的规模和分辨率重建了从单一转化细胞到复杂、侵袭性肿瘤群体的肿瘤演化全过程。 文章发表在Cell主要研究内容KP-Tracer小鼠可以连续和高分辨率追踪肿瘤的起始和进展为生成高分辨率的肿瘤演化系统，研究团队开发了一种具有谱系追踪能力的肺腺癌小鼠模型KP-Tracer，能够连续数月进行细胞谱系追踪。后续实验证实，在5-6个月后，该模型成功追踪了肿瘤发生，并且示踪剂能够在相应部位表达。此外，在对癌细胞进行单细胞转录组测序分析后，发现细胞状态、谱系、样本身份和肿瘤克隆性在肿瘤中的表达与预期一致。 图1. KP-Tracer小鼠模型的构建。来源：Cell罕见的亚克隆在肿瘤发展过程中显著扩增肿瘤进化中的一个关键问题是，基于肿瘤生长促进基因或表观遗传变化的亚克隆选择以及由此产生的亚群动态变化如何导致侵略性亚克隆对同一肿瘤的其他部分的扩展。为研究KP肿瘤的亚克隆动力学，研究团队采用了一种统计检验方法，即将每个亚克隆的相对大小与没有亚克隆被选择的“中性”进化模型中的大小进行比较分析。结果显示，有些肿瘤似乎是中性进化的，即没有证据表明阳性选择；有些亚克隆则显示出明显的阳性选择迹象。此外，研究团队发现肿瘤主要由一个（有时两个）正在扩增的亚克隆驱动。在肿瘤中，扩增细胞的比例分布广泛， 表明了亚克隆扩展的侵袭性；扩增细胞以增加的DNA拷贝数变异、细胞周期评分和适应度评分为标志。 图2. 罕见亚克隆的显著扩增及其特性。来源：Cell绘制细胞状态之间的系统发育关系揭示肿瘤进化的共同路径原则上，KP模型中观察到的细胞可塑性、转录异质性可能来自于通过转录状态的随机或结构化进化路径。为了研究肿瘤进化路径的一致性，研究团队开发了一个称为“进化耦合”的统计数据，扩展了克隆耦合统计数据来量化成对细胞状态之间的系统发育距离。基于不同转录状态的占比和进化耦合的全套肿瘤的数据驱动分层聚类显示，肿瘤可以分为三个不同的组（Fate Cluster1、Fate Cluster2及Fate Cluster3）。Fate Cluster1、2之间共享一些转录状态，Fate Cluster1主要通过包括胃样和内胚层样状态进化；Fate Cluster2通过肺混合状态进化，Fate Cluster3以高适应度状态为主，如前上皮间质转化（Pre-EMT）和间质状态。进一步，研究团队开发了“Phylotime”对Fate Cluster 1、2背后的转录变化进行分析。分析结果证实，Fate Cluster1、Fate Cluster2是两条独立的进化途径，并且每条途径显示出与Phylotime相关的不同转录变化。上述结果表明，KP肿瘤可能主要通过两种途径进化，一条是胃样和内胚层样状态，另一条是肺混合状态，且每种进化轨迹都显示出明显的转录变化。 图3. 细胞状态之间系统发育关系的构建。来源：Cell肿瘤抑制因子的缺失会改变肿瘤的转录组、可塑性和进化轨迹肿瘤抑制基因可以调节多种细胞活动，其丧失与肿瘤侵袭性的增加有关，但这些基因对体内肿瘤进化动力学的影响目前尚不清楚。因此，研究团队结合基因干预和定量系统动力学方法探索了额外的致癌突变如何改变KP肿瘤的进化轨迹，重点研究了人类肺腺癌中两种频繁突变的肿瘤抑制因子LKB1和APC，以及经CRISPR sgRNA敲除LKB1和APC后产生两种动物模型（KPL和KPA）。结果显示，靶向LKB1或APC会增加肿瘤负担，但亚克隆扩增的数量和相对大小没有改变；与肿瘤适应性相关的基因在遗传背景中差异较大。 图4. 遗传扰动会改变肿瘤的转录适应性和可塑性。来源：Cell 为检测LKB1和APC的异常是否改变了KP肿瘤的转录图谱，研究团队整合了KPL、KPA肿瘤和之前的KP肿瘤的单细胞转录组数据集。结果显示，经额外的LKB1和APC干扰后产生了四个新的转录状态。此外，针对LKB1/APC的干预也导致主导转录组状态的改变：KPL肿瘤主要富集在上皮细胞-间充质转化前状态（Pre-EMT），KPA肿瘤富集在APC特异性早期、间质和转移状态。 为研究肿瘤抑制因子的缺失如何改变进化轨迹，研究团队对单个肿瘤的转录状态占比和进化耦合进行了主成分分析。结果显示，靶向性肿瘤抑制因子LKB1或APC均可促进肿瘤生长，但其对细胞状态、可塑性和进化路径的影响差异较大 。具体而言，KPL肿瘤能够迅速发展到Pre-EMT状态下并稳定下来；KPA肿瘤则通过新的APC特异性状态开辟了一条独特的进化路径。图5. 肿瘤抑制因子的缺失对肿瘤进展及细胞状态的影响。来源：Cell结 语综上所述，该研究首次在基因工程肺腺癌小鼠模型中使用基于CRISPR的谱系示踪剂追踪肿瘤从单一转化细胞到侵袭性肿瘤的演化过程，以连续、高分辨率的肿瘤谱系追踪为肿瘤进化建模提供了一个重要参考，绘制了从激活单个细胞的致癌突变发展成为具有侵袭性的转移肿瘤的路径图，揭示了细胞转录图谱、细胞可塑性、进化路径以及肿瘤抑制因子在肿瘤发展中的作用。研究团队表示，随着谱系示踪工具的发展和其他新兴数据的集成，也期望该研究提出的实验和计算框架为未来构建肿瘤演化的高维、定量和预测模型奠定良好的基础，从而为新的治疗策略提供新思路。 图6. 研究总结概图，来源：Cell

简介作为一种成像技术，磁共振成像（MRI）广泛应用于日常临床诊疗中。为了在检查过程中增强对比度，可以使用几种不同的造影剂。由于五个或七个不成对电子具有出色的顺磁性，因此最常使用Fe3+、Mn2+或Gd3+。因游离形态的Gd3+具有毒性，此探针与氨基羧酸一起作为复合物给药。大多数钆造影剂（GBCA）是全身分布的，一些靶向特异性GBCA也正在研究中。图1 Gadofluorine P的结构Gadofluorine P是一种靶向造影剂，对富含胶原蛋白的细胞外基质（ECM）具有高亲和性，ECM在发生心肌梗塞（MI）时分泌。多模式生物成像技术能够可视化靶向造影剂的分布。使用激光剥蚀与电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）以高空间分辨率在元素水平上生成定量图像，而基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）用于在分子水平上验证研究结果，提供更多分布信息，例如磷脂或血红素b的分布。材料和方法动物实验此项动物实验在明斯特大学医院临床放射学研究所Moritz Wildgruber教授的研究小组进行。使用诱导心肌梗塞六周的小鼠，注射照影剂Gadofluorine P后进行MRI检查。小鼠被处死后，取出心脏并快速冷冻。用冷冻切片机制备厚度为10μm的切片。标准品制备对于LA-ICP-MS分析，用明胶制备基体匹配标准品，用于外标 校正。明胶（10%w/w）添加9种不同浓度，范围为0至5000 μg/g Gd。另制备了厚度为10μm的标准品切片。样品制备对于MALDI-MS成像分析，将切片放置于氧化铟锡（ITO）涂层的载玻片上。先用升华法涂敷α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）至组织表面，然后用500μl水和50μl甲醇混合溶液喷雾于组织表面2.5分钟进行再结晶。分析条件对于LA-ICP-MS分析，使用Tygon管，将ICPMS-2030与激光剥蚀系统LSX-213 G2+（Teledyne CETAC）连接，此系统配有HelEX II池和波长为213nm的Nd-YAG激光。氦气用于剥蚀池的冲洗和传输。ICP-MS 2030配有镍采样锥和截取锥。在碰撞模式下，31P、57Fe、66Zn、158Gd和160Gd的积分时间为100ms条件下进行测量。每种标准品的标准曲线使用了10个浓度水平进行分析，并且同样的条件下分析了样品（表1）。表1 LA-ICP-MS的实验条件MALDI-MS分析使用了配有离子阱-飞行时间（IT-TOF）质谱分析仪iMScope TRIO。选择正离子模式，质量范围为m/z 700到1200。其他实验条件列于表2中。基质使用iMLayer升华20分钟。表2 MALDI-MS的实验条件结果LA-ICP-MS用基体匹配标准品进行的外标法定量分析结果显示，在高达5000μg/g的浓度范围内存在良好的线性关系，相关系数R2为0.997。采用15μm光斑尺寸时，基于158Gd的检测限（LOD）为43ng/g Gd，定量限（LOQ）为140ng/g Gd（根据Boumans[1]算出）。图2 小鼠心脏组织切片的H&E染色图2所示为连续切片的苏木精伊红染色结果，检测出心肌梗塞的区域（以黑线标出）。图3 两个连续切片的显微图像（a.和b.）；经LA-ICP-MS测定的Gd定量分布（c.）；Gadofluorine P的配体分布（d.）；配体结构及理论峰值（青色条）、MALDI-MS测定峰值（黑线）（e.）图3所示为两个连续切片的显微图像（a.和b.）。使用LA-ICP-MS（c.），检测到健康心肌中Gd的均匀分布，平均浓度约为50μg/g。梗塞区的Gd浓度高两倍，约为110μg/g，最高值可达370μg/g。由于静脉注射造影剂的作用，心室中也存在较高浓度的Gd。这些分布可以通过MALDI-MS成像进行验证（d.）。该实验中，只能检测到Gadofluorine P的质子化配体，而不是完整的复合物（e.）。结果显示，主峰m/z 1168.39的质谱成像图与LA-ICP-MS检测的Gd分布具有良好的相关性。在心机梗塞和心室区发现了分子探针的最高强度，而健康心肌则显示出低而均匀的强度。结论 该应用表明，元素选择性（LA-ICP-MS）和分子选择性（MALDI-MS）成像技术的组合是可视化心机梗塞后小鼠心脏组织中靶向钆造影剂分布的有力工具。通过LA-ICP-MS技术实现了高空间分辨率和定量，并通过MALDI-MS在分子水平上验证了其分布。参考文献[1] P.W.J.M.Boumans, Spectrochimica Acta 1991, 46 B, 641-665.文献题目《Gadofluorine P多模式生物成像分析用于小鼠心肌梗塞研究》使用仪器岛津iMScope TRIO作者Rebecca Buchholz1、Fabian Lohofer2、Michael Sperling1,3、Moritz Wildgruber4、Uwe Karst11 明斯特大学无机和分析化学研究所 2 慕尼黑工业大学放射学研究所3 明斯特欧洲物种分析虚拟研究所（EVISA） 4 明斯特大学医院临床放射学研究所声明1、本文不提供文献原文。2、所引用文献仅供读者研究和学习参考，不得用于其他营利性活动。本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

科学创新 | 白藜芦醇有效改善母体免疫激活(MIA) 诱导的小鼠自闭ASD症样行为自闭症谱系障碍（Autism spectrum disorder，ASD）是一种主要在儿童中出现的神经发育障碍性疾病，主要特征是社交功能障碍和局限、重复的行为或兴趣。妊娠期母体感染是子代发生ASD的重要原因，母体免疫激活(Maternal immune activation，MIA)引起的炎症浸润可导致胎儿神经发育障碍。根据流行病学调查，全球大约有7800万人患有ASD，而且在过去20年里，ASD患者的数量迅速增加。然而，一些用于治疗ASD的药物效果有限，而且还会引起高血糖、血脂异常、体重增加等副作用。因此，迫切需要找到更有效的治疗方法。近期，哈尔滨医科大学公共卫生学院儿少卫生与妇幼保健教研室在《Journal of Nutritional Biochemistry》发表题为“Resveratrol regulates Thoc5 to improve maternal immune activation-induced autism-like behaviors in adult mouse offspring”（第一作者：曾心、范琳琳；通讯作者：武丽杰、梁爽）的研究成果，基于中医药食同源的概念，验证了白藜芦醇对母体免疫激活诱导的小鼠ASD样行为的治疗作用。研究团队采用综合生物信息学方法，对药食同源的中草药和药物靶点进行了大规模筛选和分析，确定白藜芦醇和Thoc5分别是治疗母体免疫激活诱导的小鼠ASD样行为的最佳小分子成分和药物靶点，经体外实验结果显示，发现白藜芦醇能够增加Thoc5的表达。为更好的验证白藜芦醇的药用潜力，研究人员对小鼠进行了体内实验，通过 SOPTOP激光共聚焦扫描显微镜 观察Iba-1（小胶质细胞的标志物）在胎鼠大脑中的表达情况。实验结果显示，MIA胎鼠大脑中Iba-1的表达水平明显高于PBS组，但经过白藜芦醇预处理后，Iba-1在胎脑中的表达显著降低。▲免疫荧光法观察Iba-1表达情况本研究首次全面探索了药食同源草药治疗ASD的有效成分和靶点。通过体外和体内实验，成功证明了白藜芦醇能够增加Thoc5的表达，降低IL-6的水平，并抑制MIA引起的胎盘、胎脑和后代大脑皮层的炎症，改善成年后代的ASD样行为。论文信息：Zeng X, Fan L, Li M, Qin Q, Pang X, Shi S, Zheng D, Jiang Y, Wang H, Wu L, Liang S. Resveratrol regulates Thoc5 to improve maternal immune activation-induced autism-like behaviors in adult mouse offspring. J Nutr Biochem. 2024 Apr 5:109638. doi:10.1016/j.jnutbio.2024.109638. Epub ahead of print. PMID: 38583499.

本文由中国药科大学天然药物国家重点实验室药物代谢与药代动力学重点实验室所作，发表于Talanta 165 (2017) 128–135。 近年来，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱成像（MALDI-TOF-MSI）技术受到了广泛的关注，因为它可以对动植物组织切片中不同的分子进行定位，尽管在逐点绝对定量中仍存在一些障碍。奥曲肽是一种合成的生长抑素类似物，在临床上广泛应用于预防胃肠道出血。 本研究的目的是建立一种定量显示奥曲肽在小鼠组织中空间分布的MALDI-TOF-MSI方法。在这个过程中，一个结构相似的内标物与基质溶液一起被点到组织切片上，以尽量减少信号变化，并给出良好的定量结果。通过比较奥曲肽与不同基质共结晶后MALDI-TOF-MSI产生的信噪比，选择2,5-二羟基苯甲酸作为最合适的基质。通过测定不同浓度的新鲜组织切片中奥曲肽的含量，验证了MALDI-TOF-MSI在线性、灵敏度和精密度方面的可靠性。验证的方法成功地应用于奥曲肽在小鼠组织中的分布研究。 结果表明，MALDI-TOF-MSI不仅能清晰地显示奥曲肽的空间分布，而且可以计算关键的药代动力学参数（Tmax和t1/2）。更重要的是，MALDI-TOF-MSI测定的奥曲肽的组织浓度-时间曲线与LC-MS/MS测定的结果一致。这些发现说明了MALDI-TOF-MSI在药物开发过程中的药代动力学分析潜力。使用仪器：岛津MALDI TOF、 LC–MS/MS 图1 内标对MALDI-TOF-MSI分析小鼠肝切片中奥曲肽线性的影响。(A) 小鼠肝脏切片上的兰瑞肽(内标)的质谱图，(B)加入奥曲肽标准溶液的肝脏切片光学图像，(C)5个浓度水平的奥曲肽的代表性质谱图像([M+H]+离子 m/z 1019 Da)，(D) 用奥曲肽的平均信号强度绘制的奥曲肽校准曲线(n=5)，(E)经内标校正后的奥曲肽的代表性质谱图像，(F) 用奥曲肽/内标的平均强度比绘制的奥曲肽校准曲线(n=5) 图2 对口服20 mg/kg奥曲肽后0、10、30、60、90和120 min采集的小鼠组织进行成像MS分析。(A)胃切片的代表性光学和质谱图像，(B)肠切片的代表性光学和质谱图像，(C)肝切片的代表性光学和质谱图像 图3 MALDI-TOF-MSI和LC-MS/MS测定奥曲肽的组织浓度-时间曲线。(A) MALDI-TOF-MSI法测定小鼠胃中奥曲肽的浓度-时间曲线 (B) LC-MS /MS法测定小鼠胃中奥曲肽的浓度-时间曲线 (C) LC-MS/MS法和MALDI-TOF-MSI法测定小鼠胃中奥曲肽的含量的相关性分析。 本研究开发了一种基于MALDI-TOF-MSI的小鼠组织切片奥曲肽定量分析方法。首次通过比较DHB、CHCA和SA提取的奥曲肽在一系列激光功率水平下的信噪比，系统研究了激光能量对MALDI基质选择的影响。结果表明，DHB、CHCA和SA的最优功率水平应分别设置为50、70和60，DHB因其较高的灵敏度和较低的基质效应最终被选为最合适的MALDI基质。兰瑞肽是一种与奥曲肽结构相似的生长抑素类似物，被用作内标，通过减小组织异质性、基质晶体异质性和激光功率波动引起的离子信号变化，提高分析的线性、准确性和精密度。然后成功地应用所开发的MALDI-TOF-MSI方法，观察口服20 mg/kg剂量后，奥曲肽在小鼠胃、肠、肝中的分布和消除过程。 结果表明，MALDI-TOF MSI不仅能清晰地显示奥曲肽在小鼠组织中的空间分布，而且使关键药物动力学参数(Tmax和t1/2)的计算成为可能。更重要的是，MALDI-TOF-MSI测定的奥曲肽的组织浓度-时间曲线与LC-MS/MS绝对定量的结果吻合较好。 文献题目《Optimization and evaluation of MALDI TOF mass spectrometric imaging for quantification of orally dosed octreotide in mouse tissues》 使用仪器岛津MALDI TOF、 LC–MS/MS作者Tai Rao, Boyu Shen，Zhangpei Zhu, Yuhao Shao, Dian Kang, Xinuo Li, Xiaoxi Yin, Haofeng Li,Lin Xie, Guangji Wang, Yan Liang Key Lab of Drug Metabolism &hamacokinets,State Key Laboratory of Natural Medicines,China Pharmaceutical University, Tongjiaxiang 24, Nanjing 210009 PR China

肿瘤异质性对癌症预后和治疗反应有显著影响。传统的基因组和转录组分析被广泛用于研究不同的癌症类型，在预测预后和对不同治疗的反应以及为癌症治疗提供靶点方面具有潜在作用。不同癌症类型的单细胞分析表明，肿瘤免疫微环境的详细信息在多种癌症类型之间共享。目前，自从发现检查点抑制剂以来，免疫治疗彻底改变了癌症治疗并引起了越来越多的关注。肿瘤免疫微环境由非细胞成分(血管、细胞外基质、信号分子等)和细胞成分(T细胞、髓细胞、成纤维细胞等)组成。尽管传统的基因组和转录组学分析，也强调免疫相关途径和计算方法，并已应用于预测免疫细胞成分，但技术限制阻碍了时间的精确表征。传统的批量基因组和转录组分析获得的信号均来自不同细胞，掩盖了特定细胞类型和状态的识别。原位杂交和免疫组织化学已被用于探索单个细胞的基因组、转录组和蛋白质组学特征，但其产量相对较低。流式细胞术能够分析数千或数百万个单细胞蛋白质组学图谱；然而，这些方法需要事先选择感兴趣的抗体。随着细胞分离和测序技术的突破，单细胞转录组测序已经能够在单次运行中在单细胞水平上对许多细胞进行无偏好的全基因组分析。单细胞转录组测序已被用于分析单个细胞的转录组学，用于解析细胞间的异质性。肿瘤免疫微环境在诊断、治疗和预测不同类型癌症的预后方面显示出了潜力。与传统方法相比，scRNA-seq可用于识别新的细胞类型和相应的细胞状态，加深了我们对肿瘤免疫微环境的理解。1.介绍了scRNA-seq的原理，并比较了不同的测序方法。2.根据肿瘤免疫微环境中新的细胞类型、持续的过渡状态以及肿瘤免疫微环境成分之间的相互通讯网络找到了癌症的预后预测和治疗的潜在靶点。3.总结出在肿瘤免疫微环境中应用scRNA-seq后发现的由癌症相关成纤维细胞、T细胞、肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞组成的新型细胞簇。4.提出了肿瘤相关巨噬细胞和耗尽的T细胞的发生机制，以及中断这一过程的可能靶点。5.对肿瘤免疫微环境中细胞相互作用的干预治疗进行了总结。几十年来，肿瘤免疫微环境中的细胞成分定量分析已被应用于临床实践，预测患者生存率和治疗反应，并有望在癌症的精确治疗中发挥重要作用。总结目前的研究结果，我们认为单细胞技术的进步和单细胞分析的广泛应用可以导致发现癌症治疗的新观点，并应用于临床。最后，作者提出了肿瘤免疫微环境研究领域的一些未来方向，并认为通过scRNA-seq对这些方向进行辅助。相关会议预告：8.30召开，点击报名scRNA-seq在刻画肿瘤免疫微环境中的应用scRNA-seq技术进展scRNA-seq程序主要包括单细胞的分离和提取、cDNA合成、核酸扩增、测序和数据分析。与传统的批量测序相比，scRNA-seq单个细胞中的RNA量相对较少。因此，需要更有效的扩增方法。研究人员已经成功建立了稳定的单细胞文库构建过程，以产生足够的cDNA用于测序。单细胞分离和捕获是scRNA-seq在不同方法中的基本程序。目前单细胞分离和捕获的常用方法。这些程序分为四大类：激光捕获微切割、油滴包裹技术、流式细胞荧光分选技术和微流控微孔技术。scRNA-seq技术的未来发展可能会降低成本并增加细胞产量，使scRNA-seq成为研究单个细胞转录组的标准工具。肿瘤免疫微环境的细胞成分肿瘤免疫微环境的细胞成分包括淋巴细胞(T和NK细胞)、髓细胞(巨噬细胞和树突状细胞)、成纤维细胞和其他免疫细胞。成纤维细胞传统上被归类为基质细胞，因为它们在构建细胞外基质中发挥着重要作用。在这里，作者将肿瘤免疫微环境的癌相关成纤维细胞包括在内，因为它们分泌丰富的促炎和抗炎因子来重塑免疫微环境。细胞毒性CD8+T细胞识别肿瘤细胞上的特异性抗原并随后消除它们，是免疫微环境最常见和最有效的免疫细胞。CD8+T细胞的细胞毒性功能依赖于CD4+T Th1细胞。其他CD4+T细胞，包括Th2细胞和Th17细胞，也促进肿瘤微环境中的免疫反应。调节性T细胞抑制肿瘤免疫微环境并加剧肿瘤进展。自然杀伤T细胞和自然杀伤细胞也参与其中。它们的受体识别肿瘤细胞，从而激活其他免疫细胞。作为先天免疫的重要组成部分，骨髓细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞，在肿瘤免疫微环境中发挥着重要作用。巨噬细胞通常分为促炎M1和抗炎M2表型。肿瘤相关巨噬细胞主要由M2巨噬细胞组成，通过产生生长因子和细胞因子促进肿瘤生长、肿瘤存活和血管生成。DC对于T细胞的抗原呈递至关重要，连接先天免疫和适应性免疫。癌症相关成纤维细胞在肿瘤免疫微环境中维持增殖和分泌调节因子，可分为炎症性CAF和肌纤维母细胞CAF。炎症性CAF具有较高的细胞因子和趋化因子分泌，而肌纤维母细胞CAF高度表达收缩蛋白，成纤维细胞对免疫微环境起相互抑制作用。研究表明，成纤维细胞募集M2巨噬细胞和调节性T细胞，抑制肿瘤微环境中的免疫反应。肿瘤相关成纤维细胞也被发现在某些情况下会支持抗肿瘤免疫。除了分泌抗体，B细胞还通过产生与T细胞相互作用的细胞因子参与细胞免疫。研究表明，B细胞抑制细胞毒性T细胞并诱导CD4+T细胞分化为调节性T细胞。B细胞也是最近引入的三级淋巴结构的重要组成部分，富含B细胞的三级淋巴结构与各种肿瘤的生存和免疫治疗反应有关。先前的研究强调了细胞成分在时间中的重要作用。然而，免疫细胞的鉴定常基于有限的细胞标记，并借助免疫组织化学。个体免疫细胞的转录组图谱是探索不同免疫细胞及其相应功能所必需的。为了理解细胞进化过程及其决定因素，有必要应用scRNA-seq观察每个细胞的转录动态。利用scRNA-seq探索免疫微环境的新发现聚类和注释对于解释scRNA-seq数据探索至关重要。根据细胞相似性对数据进行划分，挑战在于在不提供先验知识的情况下估计固有的簇数或密度。可能的解决方案是采用分层聚类方法来揭示细胞的分层结构，这也与细胞本体相一致。给定聚类方法产生的数据划分结果，需要细胞类型注释来提供生物学意义。注释的主要挑战是确定每个聚类中存在多少细胞类型，以及是否存在当前未发现的细胞类型。在实践中，研究人员通常首先识别每个聚类的标记基因，然后根据专业知识和文献对其进行注释。scRNA-seq使研究人员能够以更高的分辨率将免疫细胞分类为具有不同功能的亚群，描述了免疫细胞的常规亚型。利用scRNA-seq发现的淋巴细胞(T和NK细胞)、髓细胞(巨噬细胞和树突状细胞)和成纤维细胞的组成(图2)。人和小鼠样本的scRNA-seq表明，成纤维细胞可分为抗原呈递CAFs、癌症相关成纤维细胞或肌成纤维细胞。抗原提呈CAFs独特地表达主要组织相容性复合体(MHC)II类基因，包括激活CD4+T细胞的CD74。在结直肠癌中也观察到类似的抗原提呈CAFs亚群。乳腺癌症基因工程小鼠模型中成纤维细胞的scRNA-seq进一步鉴定了血管CAF、基质CAF、发育CAF和循环CAF。血管CAF、基质CAF和发育CAF似乎起源于固有成纤维细胞和恶性细胞发生上皮-间充质转化时的血管周围位置。循环CAF是血管CAF群体中增殖的部分。在其他小鼠模型中也发现了血管CAF和基质CAF，它们在患者乳腺肿瘤样本中是保守的，并且发现它们会增加乳腺癌症细胞的转移。提高CAF的分辨率为开发精确靶向CAF的药物提供了生物标志物。另一项关于乳腺癌症的scRNA-seq研究将调节性T细胞分为五类：共表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4的调节性T细胞、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体，以及相互或仅表达相同基因的GITR和其他调节性T细胞，它们具有不同的功能。不同预后的患者具有不同比例的调节性T细胞簇，为个性化治疗提供了靶点。免疫微环境对T细胞和髓细胞进行了更详细的泛癌研究，发现存在颗粒酶K+T细胞、干扰素刺激基因+T细胞、杀伤细胞免疫球蛋白样受体在记忆性T细胞和NK细胞上表达、转录因子7+CD8+T细胞，ficolin 1+常规DC2、分泌性磷酸蛋白1+TAM，以及肿瘤微环境中的叶酸受体β+TAMs。基于scRNA-seq数据，免疫微环境还发现了新的免疫细胞亚群。葡萄膜黑色素瘤的scRNA-seq鉴定了以前未识别的细胞类型，包括主要表达检查点标记LAG3而不是程序性死亡-1或CTLA-4的CD8+T细胞。同时，在肝细胞癌中发现浸润耗尽的CD8+T细胞和具有高表达layilin的记忆T细胞的克隆富集，这些研究为癌症免疫治疗提供了新的靶点。因为CD8+T细胞是参与消除恶性细胞的主要成分。大肠癌CXC基序趋化因子的scRNA-seq鉴定配体BHLHE40+Th1样细胞与干扰素-γ调节转录因子BHLHE40。在不稳定肿瘤中，这些细胞对免疫检查点阻断有良好的反应，可能会提高免疫疗法的疗效。树突状细胞对于呈递抗原以激活肿瘤免疫微环境中的T细胞是必不可少的。胃癌的scRNA-seq揭示了一个新的树突状细胞簇，表达吲哚胺2,3-双加氧酶1和趋化因子C–C基序趋化因子配体(CCL)22、CCL17、CCL19和白细胞介素-32，它们参与T细胞的募集。胰腺导管腺癌的scRNA-seq还鉴定了除了常规细胞标记物之外还高表达吲哚胺2,3-双加氧酶1的树突状细胞簇。吲哚胺2,3-双加氧酶1对于催化色氨酸消耗和犬尿氨酸产生、抑制T细胞增殖和细胞毒性至关重要，这揭示了树突状细胞和T细胞之间的密切相互作用。此外，通过scRNA-seq鉴定了溶酶体相关膜蛋白3+树突状细胞，并且似乎是经典树突状细胞族的成熟形式。溶酶体相关膜蛋白3+DC可以迁移到淋巴结，并高度表达与T细胞相互作用的配体。这些表达特异性标记物的新型树突状细胞簇的发现为癌症免疫治疗提供了一个新的视角。使用scRNA-seq在肺腺癌中发现了肿瘤相关巨噬细胞的新特征基因，包括髓系细胞触发受体2、CD81、具有胶原结构的巨噬细胞受体和载脂蛋白E。此外，乳腺癌症的scRNA-seq表明，除了M2型基因如CD163、跨膜4域A6A和转化生长因子β1外，血管生成因子纤溶酶原激活剂、尿激酶受体和IL-8也在肿瘤相关巨噬细胞中表达。肿瘤相关巨噬细胞中这些新的基因特征图谱与患者生存相关，并为癌症治疗提供了新的潜在靶点。肿瘤样本scRNA-seq显示，一个肿瘤相关巨噬细胞亚群呈现出SPP1、巨噬细胞清除剂受体MARCO和MHC II类基因的高表达。MARCO和SPP1是巨噬细胞激活中的抗炎和免疫抑制信号，而MHC II类基因与促炎功能有关。其他scRNA-seq研究表明，肿瘤相关巨噬细胞经常同时具有促炎和抗炎特征。这一现象表明，肿瘤微环境中的巨噬细胞活化与传统的M1/M2极化不一致。图2：利用scRNA-seq揭示免疫微环境中的新的免疫亚群单细胞数据揭示免疫细胞进化大多数免疫细胞都处于细胞发育过程中。大量的免疫细胞处于发育轨迹的瞬态状态，而不是分化良好的细胞的离散状态。借助scRNA-seq和深入分析，研究人员可以探索分化细胞的特征、特定细胞类型的转变及其可能的机制。最常用的计算方法是拟时序分析。轨迹描述了细胞的发育过程，其特征是基因表达的级联变化。分支点代表细胞分化的显著差异。各种机器学习计算方法已被用于构建轨迹，包括Monocle3、DTFLOW、DPT、SCORPIUS和TSCAN，这些方法已在单独的综述中进行了评估和比较。由于肿瘤相关巨噬细胞和T细胞代表了免疫微环境中最丰富的免疫细胞类型，这里主要关注这两种细胞类型。scRNA-seq显示，TAMs经常共表达M1基因，包括TNF-α和M2基因，如IL-10，并且肿瘤相关巨噬细胞的分化和状态与其抗肿瘤作用直接相关。拟时序轨迹分析证实，肿瘤相关巨噬细胞在M1和M2表型之间连续转换。转录因子IRF2、IRF7、IRF9、STAT2和IRF8似乎在决定TAMs分化中很重要，并可作为表观遗传学靶点诱导肿瘤相关巨噬细胞的M1极化，从而产生促炎和抗肿瘤的微环境。使用环境刺激和抗原T细胞受体(TCR)刺激测定T细胞表型。不同状态的细胞之间TCR库的重叠，即TCR共享，也可用于研究T细胞的进化。结合scRNA-seq和TCR追踪在结直肠癌中发现20个具有不同功能的T细胞亚群。在黑色素瘤肿瘤的耗竭T细胞中发现了28个基因的耗竭特征，包括TIGIT、TNFRSF9/4-1BB和CD27，并且在大多数肿瘤的高耗竭细胞中也被发现上调。另一项关于T细胞的研究进一步鉴定了CD8+T细胞中的其他耗竭标记物，如LAYN、普列可底物蛋白同源物样结构域家族A成员1和突触体相关蛋白47。拟时序轨迹分析表明，T细胞在时间上处于连续激活和终末分化(衰竭)状态(图3)。已经进行了额外的研究来研究耗尽的T细胞的进化和逆转T细胞耗尽的潜在靶点。scRNA-seq与TCR分析相结合表明，功能失调的衰竭T细胞和细胞毒性T细胞可能在时间上与发育有关。因此，研究集中在CD8+T细胞从效应细胞到衰竭T细胞的过渡过程。scRNA-seq鉴定出两个CD8+T细胞簇为非小细胞肺癌中预先耗尽的T细胞。在肺腺癌中，预先耗尽与耗尽的T细胞比率与更好的预后相关。因此，在耗尽前中断预先耗尽的T细胞可能对癌症免疫治疗至关重要。由于免疫细胞和恶性细胞之间的密切相互作用，恶性细胞的进化在免疫细胞进化中也起着至关重要的作用。拟时序轨迹分析表明，转移性肺腺癌的轨迹分支不同于向纤毛细胞和肺泡型细胞的正常分化。受恶性细胞进化的影响，正常的骨髓细胞群体被单核细胞衍生的巨噬细胞和新型树突状细胞取代。T细胞也被发现会衰竭，从而构建免疫抑制的肿瘤微环境。同样，另一项研究表明甲状腺癌症细胞来源于乳头状甲状腺癌症细胞亚簇，其中构建了不同的肿瘤免疫微环境，导致预后显著恶化。图3：肿瘤相关T细胞和巨噬细胞的进化过程免疫微环境中不同细胞间的通讯网络免疫微环境上的细胞通讯与肿瘤进展有关。配体-受体相互作用是一种重要的细胞通讯类型，对于构建免疫微环境和识别潜在的治疗靶点至关重要。scRNA-seq是在细胞基础上进行的，这使得研究未发现的细胞相互作用变得可行。已经开发了许多基于scRNA-seq数据研究配体-受体相互作用的分析工具，包括iTALK、CellTalker和CellPhoneDB。这些工具利用了已知配体-受体对相互作用的数据库。其中，CellTalker利用差异表达的基因，而CellPhoneDB包括配体和受体的亚基结构。其他工具，如NicheNet，也考虑了受体细胞下游通路的变化。在肿瘤进展过程中，恶性细胞导致免疫细胞的募集和功能障碍，从而相互影响肿瘤的发生和恶性细胞的进化，形成恶性循环(图4)。发现TAMs通过表皮生长因子受体-双调节蛋白配体受体对与恶性细胞相互作用。在基底样乳腺癌细胞系中AREG的调节导致抗炎TAMs的招募。同时，基于scRNA-seq，发现了一种EGFR相关的反馈回路可促进胰腺腺鳞癌的进展。来源于TAMs的抑瘤素M也与其在恶性细胞上的受体相互作用，以激活信号转导子和转录激活子3。研究人员通过整合素受体与胶原蛋白、纤维连接蛋白、血小板反应蛋白1配体和富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4-R-反应蛋白3的相互作用，发现CAF与胃癌细胞之间的通信，这些配体调节干细胞。此外，胰腺导管腺癌的scRNA-seq揭示了TIGIT与T细胞和NK细胞中的甲型肝炎病毒细胞受体2之间的相互作用，以及它们在恶性细胞中的相应配体PVR和LGALS9，导致免疫细胞功能障碍和胰腺癌症进展。因此，基于单细胞数据探索免疫细胞和恶性细胞之间的细胞相互作用提供了可能治疗靶点，以打破肿瘤进展的恶性循环。除了恶性细胞外，scRNA-seq和随后的分析还预测了免疫细胞之间在时间上的相互作用，这表现出相反的功能(图3)。例如，研究发现TAM降低了CXCL12-C-X-C基序趋化因子受体3和CXCL12-CXCR4的相互作用，增强了鼻咽癌细胞毒性T细胞和Tregs之间的CD86-CTLA-4相互作用，导致肿瘤免疫微环境加重癌症进展。此外，CAFs通过分泌CXCL12募集Tregs，并通过periostin与M2巨噬细胞相关。图4：免疫微环境中的细胞通讯网络基于scRNA-seq的肿瘤免疫微环境的临床应用和潜在靶点几十年来，临床实践中一直采用时间的量化来预测患者的生存率和对治疗的反应。利用免疫组化分析的免疫评分，量化肿瘤中的原位免疫细胞浸润。与传统的免疫评分相比，scRNA-seq在免疫微环境上提供了前所未有的渗透免疫细胞分辨率。已经鉴定出与预后相关的新的免疫细胞簇。例如，在早期复发的肝细胞癌中发现了一种独特的低细胞毒性先天性样CD8+T细胞表型。这些T细胞过表达KLRB1，同时下调共刺激和耗竭相关分子，包括肿瘤坏死因子受体超家族、成员9、CD28、诱导型T细胞共刺激因子、TIGIT、CTLA-4和HAVCR2。这种T细胞簇的浸润与癌症的不良预后相关。此外，基于scRNA-seq的细胞相互作用也被计算在预测模型中。基于细胞间通讯相关基因构建了机器学习模型，以预测肺腺癌的复发。将八个细胞间通讯相关基因和患者的临床信息相结合，获得了0.841的受试者-操作者特征曲线下面积。除了预后预测外，肿瘤免疫微环境中独特的细胞相互作用也与免疫疗法的反应有关。scRNA-seq分析发现，抗PD-1治疗的应答者和非应答者之间存在不同的细胞-细胞通信网络，有可能预测患者对抗PD-1疗法的反应。因此，在scRNA-seq的帮助下，可以更准确地预测患者的预后和对免疫疗法的反应。利用scRNA-seq在精准医学中具有启发性，例如帮助靶向治疗克服耐药性。例如，医生在使用替比法尼治疗的非CR肌肉浸润性膀胱癌症患者治疗前后应用患者衍生异种移植物的scRNA-seq。在治疗后的PDX中发现PD-L1的上调，并降低了免疫细胞的抗肿瘤作用。因此，选择了用PD-L1抑制剂进行额外治疗。随后，患者获得了良好的反应。此外，在单药耐药性肿瘤中，通过scRNA-seq鉴定了新的免疫亚型。用抗集落刺激因子1受体阻断TAMs不能减少胆管癌的肿瘤进展。scRNAs-eq鉴定了表达APOE的粒细胞髓系衍生抑制细胞的补偿富集，其介导T细胞抑制。TAMs和粒细胞性骨髓源性抑制细胞的双重抑制与抗CSF1R和抗淋巴细胞抗原6复合物、基因座G治疗联合增强了小鼠的免疫检查点阻断效果小鼠模型，这在临床实践中很有前景。除了治疗耐药肿瘤外，scRNA-seq在免疫微环境上的应用也突出了需要进一步研究的潜在新靶点。T细胞是免疫微环境中去除恶性细胞最重要的免疫细胞。然而，在不同的肿瘤中，耗尽的CD8+T细胞会导致不利的预后。除了众所周知的免疫抑制检查点外，scRNA-seq还鉴定了高表达内皮前体蛋白、酪氨酸酶相关蛋白1和内皮素受体B型的耗尽CD8+T细胞，这些细胞可以作为新的潜在靶点。髓细胞是免疫微环境招募免疫细胞所必需的。通过scRNA-seq鉴定TREM2/APOE/补体组分1，q亚组分阳性巨噬细胞浸润为透明细胞肾癌复发的预后生物标志物。另一项研究证实，小鼠中靶向TREM2的抗体与缺乏MRC1+和CX3CR1+巨噬细胞以及表达免疫刺激分子的髓系簇的扩增有关，这促进了T细胞反应并导致更好的预后。细胞相互作用也可以用作治疗靶点。肝内胆管癌的scRNA-seq揭示了血管CAFs与肝内胆管细胞之间的串扰。血管CAFs分泌的IL-6诱导Cajal间质细胞细胞的表观遗传学改变，从而增强恶性肿瘤。因此，IL-6信号在Cajal间质细胞的中断变得非常有趣。表1总结了scRNA-seq显示的癌症治疗的潜在靶点。表1：scRNA-seq显示的癌症治疗的潜在靶点总结scRNA-seq可以绘制全面的肿瘤免疫微环境细胞图谱，为各种肿瘤的临床应用提供了新的视角。此外，免疫微环境的细胞成分和通讯为癌症治疗提供了潜在靶点，并有助于精确医学的发展。技术的进步和单细胞分析的广泛应用可以发现癌症治疗的新观点，助力临床研究。作为突破性的新技术，单细胞分析技术有望逐渐取代传统的整体样本二代测序。单细胞分析技术在临床和药物开发方面的应用前景更为广阔，可以代替或补充分子、细胞和组织病理检测的现有技术，也可以用于新兴的细胞治疗。

质谱流式细胞术可在数百万个单细胞中同时采样并量化分析50多种蛋白质或蛋白质修饰水平。应用质谱流式可从全新的角度判别细胞种类、细胞表型，评估其功能状态和异质性以研究疾病发生和发展的机制。然而，作为一种新兴单细胞蛋白组方法，质谱流式因其技术特性也存有一些功能上的不足之处。目前该技术最大的瓶颈在于其灵敏度的极限，在单细胞中的每种抗原表位需要累积上百个金属标签标记的抗体才可在质谱流式分析中检测到特异性信号。灵敏度不足的问题，使得一些在人类疾病中至关重要的低丰度蛋白，如大量的转录因子、一部分细胞表面受体蛋白以及某些与特定功能相关的磷酸化位点难以被准确分析。在对小体积细胞，例如免疫细胞和微生物细胞的研究中，质谱流式在技术上则更具挑战性。而之前在多个不同实验室进行的放大质谱流式信号的尝试由于信噪比低、放大效果不强、可控性差等问题并没有获得显著效果。如何在不影响信噪比的情况下对质谱流式进行信号放大是一直以来亟待解决的问题。2024年7月29日，哈佛大学Wyss研究所尹鹏教授团队（伦小康博士、盛宽玮博士为共同第一作者）等在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Signal amplification by cyclic extension enables high-sensitivity single-cell mass cytometry 的研究论文。该研究开发了一种名为循环延伸扩增（Amplification by Cyclic Extension，ACE）的信号放大技术，通过设计DNA动态探针实现对质谱流式技术（mass cytometry）中抗原表位金属同位素标记信号的高效放大，解决了质谱流式分析中的灵敏度瓶颈问题。ACE技术可同时放大30种以上蛋白表位信号。应用在悬浮质谱流式和成像质谱流式（imaging mass cytometry或IMC）中，ACE皆可大幅提升低丰度蛋白信号检测的灵敏度及准确性。在这项最新研究中，研究团队运用独特的DNA动态探针设计方法，创立了单链DNA循环延伸信号放大（Amplification by Cyclic Primer Extension，ACE）技术，实现了同时对多通道抗原表位信号的高信噪比高效放大，并应用于质谱流式技术上以大幅提高其灵敏度。ACE利用超短DNA序列作为起始探针（initiator）标记抗体并对胞内靶蛋白进行染色（图1）。在低温条件下，反应体系内的延伸探针（extender，含有两个相邻的起始探针互补序列）可互补结合在起始探针上，体系中的DNA聚合酶应用延伸探针为模版延长起始探针。提高体系温度后，延伸探针从延长过起始探针上解离，此时一个反应循环结束。当体系温度再次降低时，下一个延伸循环开始，起始探针进一步被延长。通过对起始探针序列的温控循环延伸，ACE可快速复制金属检测探针（detector）结合位点，引入检测探针后，单个抗体所携带的金属同位素标记物数量大幅提升。为提升DNA结构的热稳定性，该团队又结合3-cyanovinylcarbazole phosphoramidite (CNVK) 紫外交联方法将携带金属标记的检测探针共价结合在延伸后的起始探针上，使得检测探针在质谱流式仪内高温环境中不易解离（图1）。线型ACE（linear ACE）信号放大技术可平均提升信号13倍（图2）。但当分析极低丰度蛋白的单细胞信号或微生物单细胞蛋白信号需要更强信号时，可在线型ACE基础上应用分支ACE（branching ACE）以达到对抗原信号的500倍以上的放大。为配合质谱流式多维度蛋白表位分析特点，该团队通过设计正交DNA探针序列实现了对33种蛋白表位互不干扰的同时信号放大。图1. ACE技术流程示意图图2. 应用ACE逐级提高质谱流式抗原表位信号ACE技术建立后，研究团队首先将其应用与分析上皮-间质转化（EMT）和间质-上皮转化（MET）过程中的分子调控机制。通过对32个上皮和间质标记物、信号分子和转录因子的单细胞分析，将单个小鼠乳腺癌细胞从上皮状态到间质状态再回到上皮状态的转化过程进行时间重构，精准的展示细胞如何通过调节关键转录因子如Zeb-1和Snail/Slug的数量变化来驱动了EMT和MET分子程序。在第二个应用中，团队聚焦于单个T细胞胞内磷酸化信号网络。由于T细胞体积较小，在单细胞分辨率下每种磷酸化位点的表位数量有限，所以此前针对单个T细胞信号网络反应异质性的研究一直较难开展。团队应用ACE同时放大T细胞受体（TCR）信号网络内的30种关键磷酸化位点（图3），研究样本中T细胞在受到外部信号刺激时的胞内磷酸化网络特异性激活状态是如何分别调控介导应激、炎症、细胞增殖等反应的。应用该技术，团队分析了“组织损伤诱导T细胞麻痹”的分子信号机理，利用从手术患者获取的“术后引流液”（POF）样本刺激T细胞，并捕捉TCR信号网络的动态特征，揭示出导致部分CD4+ T细胞停止分裂并引起免疫抑制的胞内信号网络变化。图3. 应用ACE技术分析T细胞胞内信号网络动态变化最后，团队使用ACE结合成像质谱流式（Imaging mass cytometry，IMC）对人体肾脏组织切片中的蛋白表位进行高维度空间分析。通过检查从一名多囊肾病患者获得的肾皮质切片并对经信号放大后的20种肾脏标记物的空间表位分析，团队发现了存在于肾皮质部位细胞和组织结构的新病理特征：与组织修复相关的干细胞标记物Nestin在肾小球中的不均匀表达可能意味着组织的不同部位可能同时经历不同的病理阶段。ACE质谱流式信号放大技术是单细胞蛋白分析中一项革命性的突破。这套独特的生物技术在生物医学的各个层面都有着广泛的应用前景，尤其可将单细胞高维蛋白表位定量分析扩展到之前由于技术限制而从未涉及到的低丰度蛋白组。另外，结合成像质谱流式IMC，可在未来实现基于ACE信号放大的超分辨率空间蛋白组学成像分析。

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一个世纪之前，诺贝尔奖得主、德国化学家Paul Ehrlich 曾经说过：如果我们可以设计出特异性靶向某个病原体的化合物，那么，我们就可以在不伤害宿主的基础上杀死这一病原体【1】。多年过去了，尽管Ehrlich尝试了多种方法来寻找特异性肿瘤靶点，但精准抗癌，也就是在不伤害机体的情况下靶向杀伤肿瘤细胞这一概念，似乎仍停留在概念阶段【2】。时隔多年，以免疫细胞修饰为基础的免疫治疗，包括抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugates，简称ADCs）、双特异性T细胞衔接器（bispecific T cell engagers，简称BiTEs）和嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cells，简称CAR-T）似乎是现今的新方向。有报道指出，靶向CD19的CAR-T疗法，可以将一些B细胞淋巴瘤的治愈率提高至43%～71%【3】，但是，有40%患者出现一定程度的神经损伤。这一“脱靶效应”很可能是由其他表达CD19的细胞类型引起的【4】。事实上，作者通过提取数目稀少的血脑屏障壁细胞，并进行全基因组单细胞测序确定，上述CAR-T疗法靶向B细胞淋巴肿瘤的同时，也会靶向这些壁细胞。这也说明，单细胞全基因组测序这一方法，不但可以预测免疫治疗的脱靶效应，还可以以数据为基础分析出特异的靶标。2021年12月13日，来自美国斯坦福大学Caleb A. Lareau，Ansuman T. Satpathy和来自Cartography 公司的Kevin R. Parker 在Cancer cell上发表题为Charting the tumor antigen maps drawn by single-cell genomics的评论性文章，全面展示了这一研究方法。在概念上，作者认为，寻找和确定免疫治疗的靶点应该基于数据。下图展示了通过结合大尺度但细胞图谱和特定肿瘤分析来确定抗原靶点。高通量的单细胞全基因组测序数据库可以提供肿瘤细胞抗原的潜在靶点以及这些靶点是否存在于其他细胞上。接下来，作者阐述了目前精准抗癌的现状和存在的问题。首先，目前在临床上精准抗癌的靶点主要有三类：一是在肿瘤细胞和正常体细胞上同时表达的细胞特异性标签，比如上述针对B细胞的CD19。这一类目前应用最为广泛，并且，如果其对应的体细胞不算十分重要的话，这一诊疗方案可以说是行之有效；二是与正常体细胞相比，在肿瘤细胞上过表达的分子，比如HER2。靶向这类分子可以使得杀伤作用更为精准和强大，并且，其过表达程度，还可以表征肿瘤发展水平；三是特异性表达在肿瘤细胞上的分子，比如1997年发现的NY-ESO-1【5】。当然，高通量基因组学数据库显示这一分子还表达在免疫豁免器官和组织，比如睾丸和胎盘。这也就是说，仅通过传统手段来确定表达靶标分子的细胞类型不够精确，还需要高通量单细胞基因组数据库来进行有力补充。其次，上述数据库可以用来预测和减低免疫治疗的脱靶效应所带来的细胞毒性。如上述靶向CD19治疗B细胞淋巴瘤案例所示，免疫治疗常常会出现脱靶效应。虽然研究脱靶效应对病人的副作用这方面至关重要，但是从单细胞基因组学分析来确定特定免疫疗法对正常体细胞的影响也十分必要。接下来，作者表明，单细胞全基因组测序这一方法也适用于表达量十分稀少的细胞类型，比如CD4+T细胞，CD4的RNA水平很低，但是蛋白质水平却很高，这一类分子需要高通量数据库进行修正。最后，作者提出了单细胞全基因组测序所面临的挑战：一是如何界定某一类型细胞重要与否，并且，随年龄、性别等影响，其重要性是否有所区别。二是如何确定一标准，使得某分子在肿瘤细胞与体细胞的表达量超过这一标准，才可以认定为是潜在靶标。三是影响抗原表达水平的因素都有什么。最后，理论上可行的靶标在临床上也可能出现各类未知问题。综上所述，作者给出了有别于组织学水平和单一突变水平研究肿瘤以及肿瘤治疗的方法，也就是基于高通量单细胞全基因组测序和图谱数据分析方法。并预测，这一方法可以在预测免疫治疗靶标和临床精准抗癌方面发挥重要作用。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.11.005

近日，顺义区科委公布了2020年顺义区科技政策第二批支持项目立项结果，北京莱伯泰科仪器股份有限公司申报的“单细胞多元素飞行时间质谱智能检测系统研发” 喜获顺义区重大科技研发项目立项。 该项目旨在通过2年研究，开发基于ICP-Q-TOF-MS的单细胞多元素同时快速智能检测系统，通过研究电感耦合等离子体四极杆质谱（ICP-MS）和飞行时间质谱（TOF）的串级联用技术，开发电感耦合等离子体四极杆传输过滤系统，设计高速TOF检测系统和研制单细胞自动前处理进样系统，实现单个细胞内多种元素的同时快速检测，满足尖端生物医疗领域研究对于检测单个细胞内成分的深切需求，开发智能控制软件系统，实现差异化竞争，完成ICP-Q-TOF-MS单细胞多元素智能检测系统在生物医疗领域的应用示范，并完成工程化和产业化，形成我公司生物医疗领域的拳头产品，填补我国在高端质谱设备的一项空白。 近年来，如何对重大疾病进行有效地早期检测及诊断，降低发病率和死亡率是当今社会非常关注的一个话题，也是众多科学家为之努力的方向。单细胞分析是当今生命分析的重要前沿技术，通过分析检测单细胞，可以获得细胞在微环境中准确的个体信息，对于研究细胞的信号传导、生理病理和重大疾病的早期诊断具有十分重要的意义。单细胞分析对分析技术的定量检测极限、分辨率和精密操控能力要求极高，传统的四极杆等离子质谱（简称ICP-Q-MS或者ICP-MS）只能检测到单细胞中的一个元素，无法判断不同细胞之间的差异。而该项目在传统的ICP-Q-MS上再增加一个飞行时间质谱（TOF）形成ICP-Q-TOF-MS系统，就能对单细胞中的多元素进行同时检测，从而能够了解单细胞更多的详细元素分布，为疾病的早期诊断和治疗提供更多的信息，具有非常广阔的应用前景。 莱伯泰科一直在持续努力加大对于细分领域的专业化研究，积极进行公司战略布局。该项目是继莱伯泰科自主研发ICP-MS之后的又一项高端质谱仪器研发项目，后续将项目研究成果应用于生物医疗检测领域，有望开创国产仪器发展的又一新赛道。 做为顺义区高新技术企业的代表之一，莱伯泰科受到顺义区政府的邀请，将于9月24日参加由科技部、国家知识产权局、中国贸促会和北京市人民政府共同主办的第二十四届中国北京国际科技产业博览会（简称科博会）。科博会期间，莱伯泰科将携带新款质谱LabMS 3000 ICP-MS亮相“智慧科技展区”A112号展位，展示自主可控的关键核心技术和科研成果，发挥示范引领产业高质量发展的效应。 9月27日，莱伯泰科还将“盛装出席”科学仪器届规模最大的展会--第十九届北京分析测试学术报告会暨展览会（BCEIA 2021），观众除了能近距离接触新款质谱LabMS 3000 ICP-MS外，还将收听到ICP-MS在半导体行业和传统行业中的完整解决方案，让观众领略莱伯泰科潜心打造国产ICP-MS品牌的实力和决心。

飞纳 Pharos-STEM 在细胞生物学和病理学的应用一直以来，透射电镜（TEM）是观察和研究超微结构的首选工具，可用于观察整个细胞结构，包括细胞壁、细胞膜、细胞核和各种细胞器的变化，以及外源物质与细胞之间的关系等。不仅有助于许多重要细胞器的结构和功能的研究，而且有助于解剖病理学、血液学和微生物学等学科的病理诊断研究。 扫描透射（STEM）模式作为 TEM 的附加配件，可以显著提高生物样品的衬度，特别是未染色的组织切片。应对此类生物样品，TEM 操作人员通常也会选择相对较低的加速电压（80kV）来增加图像的衬度，并提高清晰度。但是由于其操作的复杂性，在对细胞生物学和病理学的超微结构的研究中，还没有被广泛应用（除专业的电镜中心外）。 飞纳台式场发射扫描电镜，体积小巧，具有低电压成像的优势，配备了新型的扫描透射（STEM）探测器后，可以结合扫描电镜和透射电镜的功能特点，在 15kV 的低加速电压下，就可以获得高分辨率的扫描透射成像。在观测电子束敏感的生物样品时，可以获得高成像质量图片。 以下为大家分享生物组织样品的制样方法以及 4 个使用 Pharos-STEM 拍摄的案例。（加速电压 15kV，工作距离 8.9mm） 具体过程如下：使用 2.5% 的戊二醇溶液（溶解于 PH 值为 7.4 的 0.1M 碳酸钠缓冲液中）进行固定，固定完成后，组织样品在碳酸钠缓冲液中清洗 1-2 天。这个过程具体包括使用 2% 四氧化饿清洗 4h，2% 醋酸铀清洗 1h，醋酸钠清洗 1h；然后使用梯度乙醇和丙酮进行脱水处理；接着按照标准配方使用低粘度环氧树脂 Spurr 进行包埋，将树脂在 70℃ 下固化 15h；最后使用超微切片机制备 70nm 厚的组织切片，将组织切片安装在 300 目的铜网上。接下来将具有样品的铜网放入 Pharos-STEM 中进行观测，结果如下。 案例一：被肾小囊（Bowman's capsule）包裹的正常肾小球 图1 小鼠肾标本样品（肾小球和临近的肾血管）的 STEM 图。红色箭头处可以看到含有红细胞的肾小球毛细血管，毛细血管被肾小球基底膜和足细胞的足突包围。 图1 为被肾小囊（Bowman's capsule）包裹的正常肾小球的超微结构。 STEM 图显示了正常肾小球毛细血管袢和肾小球系膜，与 TEM 下的微观图像类似。STEM 图中的红色箭头处清晰显示了肾小球基底膜、系膜基质、系膜胞质、足细胞足突的细节以及与基底膜毗邻的裂孔结构。STEM 图像显示了高分辨的超微结构，图像衬度明显，可以快速捕捉到极小的细胞变化，并快速分析感兴趣部位的微观结构。 案例二：正常的小鼠胰腺腺泡细胞 图 2 正常的小鼠胰腺腺泡细胞结构 STEM 图。图中显示了酶原颗粒（Z）、液泡、线粒体（M）、腺泡腔（L）和粗面内质网（R）。上图为胰腺星形细胞，下图为内质网的精细结构。 案例三：人类脑肿瘤组织 图 3 人类脑肿瘤组织 STEM 图。图中清晰显示了细胞的超微结构特征，髓鞘轴突、线粒体和嵴结构（M）、包含细胞间质纤维和囊泡的星形细胞结构（红色箭头处）。图中可以清晰观测到细胞结构和细胞器之间的关系。 图4 培养的全能干细胞的 STEM 图。晶状体上皮细胞内有大量的细胞质器，如线粒体和卵圆形细胞核。均质的细胞外观与早期细胞分化阶段的细胞相似（数据来自 ROR1e LECs）。图中可以清晰看到晶状体的微结构，包括靠近组织周围的晶状体上皮细胞，以及与之相邻的具有杆状细胞核的未成熟的晶状体纤维细胞，具有圆形细胞核的细胞和晶状体纤维细胞类似。 总结 通过以上 4 个案例，可以看出，使用配备 STEM 探测器的飞纳台式场发射扫描电镜，在观察生物类样品时，在较低的加速电压下，几分钟内便可以获得高衬度、高分辨图像。如您对此产品感兴趣，欢迎联系我们。 参考文献 Cohen Hyams T Mam K Killingsworth MC, 2020, ‘Scanning electron microscopy as a new tool for diagnostic pathology and cell biology’, Micron, vol. 130, pp. 102797 -102797, http://dx.doi.org/10.1016/j.micron.2019.102797.C. U., Devi, M. Masona, T. Cohen Hyams, M. C. Killingsworth, D. G. Harmana V. Gnanasambandapillai, L. Liyanage and M. D. O’Connor, ‘A simplified method for producing human lens epithelial cells and light-focusing micro-lenses from pluripotent stem cells’, Experimental Eye Research (2020) https://doi.org/10.1016/j.exer.2020.108317

单细胞分析技术对生物医学研究意义重大,目前在单细胞组学中,基因组学和转录组学技术相对成熟,单细胞转录组学和蛋白组学分析技术近年来获得越来越多的关注和投入。与其他组学相比，单细胞脂质组学分析刚刚起步，面临诸多技术难点。近期，威斯康星大学麦迪逊分校的李灵军教授团队报道了离子淌度（IMS）与双极性离子化质谱成像相结合的单细胞脂质组学方法，实现了单细胞脂质组高通量、原位和双极性成像，揭示了小鼠小脑皮质细胞层特异性脂质分布。该项工作以“Single-cell lipidomics enabled by dual-polarity ionization and ion mobility-mass spectrometry imaging”为题发表在Nature Communications（https://www.nature.com/articles/s41467-023-40512-6），文章第一作者为张华博士。该研究实施了捕集离子淌度分离（TIMS）与双极性电离（dual-polarity ionization）以及质谱成像（MSI）相结合，以实现单细胞（SC）脂质组的高通量原位分析。使用来自单培养和共培养的人胰腺癌 (PANC-1) 和活化的胰腺星状细胞 (PSC) 以及神经母细胞瘤细胞 (SK-N-SH) 的 SC 样本的 MSI 分析来评估该方法的性能 使用 MALDI 捕集离子淌度飞行时间质谱(MALDI-timsTOF-MS) 平台进行分析。研究结果表明, 高分辨率 MALDI-MSI 可为单细胞分析提供良好的重现性和质量准确度。整体来说,该研究建立了单细胞脂质组学分析的新技术,为揭示细胞间及细胞内脂质异质性研究提供了重要工具。更多关于李灵军教授研究团队的最新研究进展欢迎登陆课题组网站：https://www.lilabs.org/