异黄芪皂苷对照品

[align=center][b]HP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS法测定黄芪醇提物中的黄芪甲苷的含量[/b][/align][b]黄芪甲苷是黄芪皂苷提取物中的特征性成分，也是具有代表性的主要成分，黄芪甲苷可以促进患者心肌细胞的供氧能力，使冠状动脉供血区供血充足，避免因缺血导致的大范围心肌坏死，继而缓解患者心绞痛症状，平稳心跳速率[sup][/sup]。药典中有关于黄芪药材中黄芪甲苷含量的测定方法，但此方法并不完全适用于黄芪醇提物中的黄芪甲苷的含量测定，而且黄芪水提物与黄芪醇提物中化学成分有差异，预实验中发现测定黄芪水提物中黄芪甲苷含量建立的方法也不适应于黄芪醇提物中中黄芪甲苷含量的测定。本章实验利用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用仪[/color][/url]建立黄芪醇提物中黄芪甲苷含量测定方法，并利用该方法测定其含量，计算出黄芪甲苷的转移率，用于黄芪醇提最佳提取工艺的优选。同时，本章实验系统地验证所建立的方法的可行性，为选择黄芪甲苷的含量测定方法提供参考。[b]1 材料和仪器1.1 样品 [/b] 收集9组黄芪醇提物样品，所有黄芪药材均由济宁华能制药厂提供。[b]1.2 试剂 [/b]黄芪甲苷对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司批号H-013-170117）；乙腈为色谱纯（赛默飞世尔科技有限公司）；D101大孔吸附树脂（廊坊淼阳化工有限公司生产20160310）；盐酸溶液（国药集团化学试剂有限公司生产）；氢氧化钠溶液（国药集团化学试剂有限公司生产20160824）；超纯水。[b]1.3 仪器 [/b]液相色谱仪系统（美国Agligent Technology 公司1260型液相色谱仪，包括G1312B二元泵，G1322A在线脱气机，G1316A柱温箱）；NASCA F5100型自动进样器（日本SHISEIDO公司）；资生堂CAPCELL PAC CN 色谱柱（2.0*150 mm，5 mm，日本SHISEIDO公司）；API 4000型三重四级杆串联离子肼质谱仪（美国Applicated Biosystem Scuex公司）。[b]2 方法学考察2.1 色谱条件[/b]色谱柱为 Synergi C18 80A（250 mm×4.6 mm，4 μm），以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水（35 : 65）进行等度洗脱；进样量10 μL；检测波长为203 nm；柱温30 ℃，流速为1 mL/min。黄芪甲苷保留时间约为10 min。黄芪醇提物和黄芪甲苷标准品HPLC色谱图见表5-1，表5-2。[/b][align=center][img=,690,365]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131711071808_2711_3237657_3.png!w690x365.jpg[/img][/align][align=center]图5-1 黄芪醇提物HPLC色谱图[/align][align=center][img=,690,373]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131711240945_4181_3237657_3.png!w690x373.jpg[/img][/align][align=center]图5-2 黄芪甲苷标准品HPLC色谱图[/align][b]2.2 质谱条件 [/b]电喷雾电离，正离子模式（喷雾电压：4.5 kV）；鞘气压力：30 arb；辅助气压力：10 arb；离子传输管温度：550 ℃；扫描模式：全扫描；扫描范围：m/z 100-1000。按“2.1.3”项下色谱条件进样，进样量10 μL。为进一步验证10 min出峰的物质是黄芪甲苷，利用LC/MS技术对黄芪皂苷提取物的化学成分进行研究，采用正离子源ESI检测。黄芪甲苷分子量784.97 Da，由于仪器差异，黄芪甲苷出峰时间后移至12.5 min，此峰的鉴定结果质谱图显示含大量黄芪甲苷。图5-3为黄芪皂苷提取物的正离子模式HP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]总离子流图、分离子流图和质谱图。[align=center][img=,690,426]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131711415732_2681_3237657_3.png!w690x426.jpg[/img][/align][align=center]图5-3 黄芪甲苷正离子模式HP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url] 总离子流图、分离子流图和质谱图[/align][b]2.3 供试品溶液的制备[/b]对D101大孔吸附树脂预处理：第一步用乙醇或甲醇清洗吸附柱内壁，向柱内加入称量好的树脂体积0.4-0.5倍的乙醇或甲醇，然后将新的D101大孔吸附树脂投入吸附柱中，使乙醇液面高于D101大孔吸附树脂层0.5 m，浸泡过夜。用2 个柱体积的乙醇或甲醇通过D101大孔吸附树脂层，用乙醇缓慢浸泡D101大孔吸附4-5 h，观察洗脱液加水后不呈白色浑浊为止。再用蒸馏水以2 BV洗柱，洗至洗脱液呈中性。用2 BV的5 %盐酸溶液以4-6 BV/h过柱，浸泡2-4 h。用蒸馏水以2 BV/h洗至洗脱液呈中性。用2 BV的2 %氢氧化钠溶液以4-6 BV/h过柱，浸泡2-4 h。最后用蒸馏水洗D101大孔吸附树脂，洗至洗脱液显中性即可。上样：取黄芪醇提物加水溶解至15 mL得黄芪提取液，以1 mL/min过树脂，先以4 BV蒸馏水洗脱，弃去水液，再用4 BV的70 %乙醇溶液洗脱，用烧杯收集吸附柱内的洗脱液，转入蒸发皿，水浴蒸干后，用甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶定容。[b]2.4 对照品溶液的制备[/b]用万分之一天平精密称取10.1 mg黄芪甲苷对照品至10 mL容量瓶，加甲醇定容，得1.01mg/mL的对照品溶液，用0.22μm的微孔滤膜过滤，备用。[b]3 结果3.1 线性关系考察[/b]精密量取黄芪甲苷标准品10.1 mg黄芪甲苷，用甲醇10 mL制备成1.01 mg/mL黄芪甲苷储备液，然后吸取相应体积稀释成浓度梯度为150 μg/mL、250 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL 、500 μg/mL的对照品溶液，上述对照品溶液按“2.3”项下色谱条件分别进样10 μL，利用自动积分功能测定峰面积积分值，以黄芪皂苷提取物中黄芪甲苷的峰面积积分值对标准品浓度进行线性回归，所得回归方程为y = 2821.6x + 12.438（回归系数[i]R[sup]2[/sup][/i]= 0.9989），证明蒙古黄芪中黄芪甲苷在150~500 μg/mL范围内线性关系良好，黄芪甲苷对照品标准曲线如图5-4所示。[align=center][img=,542,346]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131711574358_4557_3237657_3.png!w542x346.jpg[/img][/align][align=center]图5-4 黄芪甲苷标准曲线[/align][b]3.2 精密度试验[/b]在拟定分析条件下，精密吸取供试品溶液10 μL，连续进样 6 次，记录提取离子流图峰面积，测定黄芪甲苷量，计算得相对标准偏差RSD为1.9% ，提示该方法具有较好的精密度。[b]3.3 重复性实验[/b]取同一黄芪样品 6份，按2. 2 项下方法制备供试品溶液，在拟定分析条件下，准确吸取10 μl 进样分析，测定黄芪甲苷量，计算得 RSD为2.0%，提示该方法重复性良好。[b]3.4 稳定性试验[/b]取黄芪药材供试品溶液，分别在0 h、3 h、6 h、9 h、24 h、48 h后，在拟定分析条件下，准确吸取10 μl 进样分析，测定黄芪甲苷量，计算得RSD为 4.4% ，提示黄芪供试品溶液稳定性较差。[b]3.5 加样回收率试验[/b]精密称取 6 份黄芪甲苷量已知的黄芪水提物样品，每份折合黄芪药材 0. 5 g，分别准确加入浓度为 0. 0 342 mg /ml 黄芪甲苷溶液1 ml，1 ml，2ml，2ml，3ml，3ml，按 2. 2 项下方法制备供试品溶液，准确吸取 1. 0 μl 进样分析，测定黄芪甲苷量，计算回收率，结果见表3-1。由表3-1可见，方法平均回收率为 97.92%，表明该方法具有较好的回收率。[align=center]表5-1 黄芪甲苷加样回收率测定结果[/align] [table][tr][td] [align=center]样号[/align] [/td][td] [align=center]样品中的量/mg[/align] [/td][td] [align=center]加入量/mg[/align] [/td][td] [align=center]测得量/mg[/align] [/td][td] [align=center]回收率/%[/align] [/td][td] [align=center]平均值/%[/align] [/td][td] [align=center]RSD/%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1.94 [/align] [/td][td] [align=center]0.96 [/align] [/td][td] [align=center]2.88 [/align] [/td][td] [align=center]97.92 [/align] [/td][td=1,6] [align=center]97.92 [/align] [/td][td=1,6] [align=center]0.7 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1.94 [/align] [/td][td] [align=center]0.96 [/align] [/td][td] [align=center]2.89 [/align] [/td][td] [align=center]98.96 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1.94 [/align] [/td][td] [align=center]1.92 [/align] [/td][td] [align=center]3.83 [/align] [/td][td] [align=center]98.44 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]1.94 [/align] [/td][td] [align=center]1.92 [/align] [/td][td] [align=center]3.81 [/align] [/td][td] [align=center]97.40 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]1.94 [/align] [/td][td] [align=center]2.88 [/align] [/td][td] [align=center]4.76 [/align] [/td][td] [align=center]97.92 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]6[/align] [/td][td] [align=center]1.94 [/align] [/td][td] [align=center]2.88 [/align] [/td][td] [align=center]4.73 [/align] [/td][td] [align=center]96.88 [/align] [/td][/tr][/table][b]3.6 黄芪甲苷的含量测定结果[/b]取9组黄芪水提物按照“2.3”项下操作，制备供试品溶液，准确吸取 1 0 μL 进样分析，在拟定的分析条件下，测定黄芪甲苷峰面积积分值，计算相应的黄芪甲苷含量。9组蒙古黄芪中黄芪甲苷含量测定结果如表5-2所示。[align=center]表5-2 9组蒙古黄芪中黄芪甲苷含量测定结果[/align] [table][tr][td] [align=center]试验号[/align] [/td][td] [align=center]峰面积[/align] [/td][td] [align=center]含量（mg/g）[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]560.07 [/align] [/td][td] [align=center]0.13 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]501.70 [/align] [/td][td] [align=center]0.12 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]564.61 [/align] [/td][td] [align=center]0.13 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]507.19 [/align] [/td][td] [align=center]0.12 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]524.05 [/align] [/td][td] [align=center]0.12 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]6[/align] [/td][td] [align=center]477.02 [/align] [/td][td] [align=center]0.11 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]7[/align] [/td][td] [align=center]921.07 [/align] [/td][td] [align=center]0.21 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]8[/align] [/td][td] [align=center]783.88 [/align] [/td][td] [align=center]0.18 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]9[/align] [/td][td] [align=center]924.71 [/align] [/td][td] [align=center]0.22 [/align] [/td][/tr][/table][b]3.7 黄芪甲苷转移率正交试验设计及结果[/b]醇提的黄芪甲苷转移率考察正交试验与醇提的出膏率考察正交试验设计相同，首先以乙醇作为提取溶剂，把影响药材提取效果的提取溶剂乙醇用量（A）、提取次数（B）、提取时间（C）确定为考察因素，以上三个考查因素各分3个水平考察，见表5-3。[align=center]表5-3 实验因素水平表[/align] [table][tr][td=1,2] [align=center]水平[/align] [/td][td=3,1] [align=center]因素[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]A（乙醇用量/倍）[/align] [/td][td] [align=center]B（提取次数/次）[/align] [/td][td] [align=center]C（提取时间/h）[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]8[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]10[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][/tr][/table]黄芪甲苷转移率=各实验组黄芪提取物中黄芪甲苷含量/原黄芪药材中黄芪甲苷含量×100%。原药材中毛蕊异黄酮苷的含量按照药典的方法测得的结果为0.4042mg/g。跟据实验数据，得到水提实验中设定的不同工艺条件下的毛蕊异黄酮苷的转移率，其中因素D为误差项，作直观分析表和方差分析表，见表5-4，5-5。[align=center]表5-4 黄芪甲苷转移率考察 L[sub]9[/sub](3[sup]4[/sup])正交试验表[/align] [table][tr][td] [align=center]试验号[/align] [/td][td] [align=center]A[/align] [/td][td] [align=center]B[/align] [/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]D[/align] [/td][td] [align=center]黄芪甲苷 转移率/%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]32.01 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]28.60 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]32.28 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]28.92 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]29.91 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]6[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]27.16 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]试验号[/align] [/td][td] [align=center]A[/align] [/td][td] [align=center]B[/align] [/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]D[/align] [/td][td] [align=center]黄芪甲苷 转移率/%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]7[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]53.11 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]8[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]45.09 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]9[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]53.33 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]K1[/align] [/td][td] [align=center]92.89[/align] [/td][td] [align=center]114.04[/align] [/td][td] [align=center]104.26[/align] [/td][td] [align=center]115.25[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]K2[/align] [/td][td] [align=center]85.99[/align] [/td][td] [align=center]103.60[/align] [/td][td] [align=center]110.85[/align] [/td][td] [align=center]108.87[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]K3[/align] [/td][td] [align=center]151.53[/align] [/td][td] [align=center]112.77[/align] [/td][td] [align=center]115.30[/align] [/td][td] [align=center]106.29[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]优水平[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]R[/align] [/td][td] [align=center]65.54[/align] [/td][td] [align=center]9.17[/align] [/td][td] [align=center]11.04[/align] [/td][td] [align=center]8.96[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][/table][align=center]表5-5 黄芪甲苷转移率考察方差分析结果[/align] [table][tr][td] [align=center]方差来源[/align] [/td][td] [align=center]离差平方和[/align] [/td][td] [align=center]自由度[/align] [/td][td] [align=center]F[/align] [/td][td] [align=center]显著性[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]A[/align] [/td][td] [align=center]864.64[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]46.01[/align] [/td][td] [align=center]*[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]B[/align] [/td][td] [align=center]21.63[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]0.07[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]20.57[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]0.07[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]D [/align] [/td][td] [align=center]14.18[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][/tr][/table]注：F[sub]0.1[/sub]（2,2）=9，F[sub]0.05[/sub]（2,2）=19，*为有显著性，-为无显著性。从正交试验结果可知：醇提实验中，各因素对黄芪甲苷转移率的影响大小顺序为：A（乙醇用量）B(提取次数)C(提取时间)；每个因素3水平之间的趋势为A[sub]3[/sub]A[sub]1[/sub]A[sub]2[/sub]，B[sub]1[/sub]B[sub]3[/sub]B[sub]2[/sub]，C[sub]3[/sub]C[sub]2[/sub]C[sub]1[/sub]，直观分析得最佳提取工艺为A[sub]3[/sub]B[sub]1[/sub]C[sub]3[/sub]，即加醇10倍量，提取1次，每次3h。表5-5的方差分析结果表明： A因素的影响具有统计学差异(PB(提取次数)C(提取时间)；每个因素3水平之间的趋势为A[sub]3[/sub]A[sub]1[/sub]A[sub]2[/sub]，B[sub]1[/sub]B[sub]3[/sub]B[sub]2[/sub]，C[sub]3[/sub]C[sub]2[/sub]C[sub]1[/sub]，直观分析得最佳提取工艺为A[sub]3[/sub]B[sub]1[/sub]C[sub]3[/sub]，即加醇10倍量，提取1次，每次3h。表5-7的方差分析结果表明： A因素的影响具有统计学差异(P0.05)，即乙醇用量对黄芪甲苷转移率具有显著影响。[b]4 讨论[/b]本章实验利用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]技术，测定了黄芪醇提物中黄芪甲苷的含量，并系统地验证所建立的方法的可行性，经过试验条件的摸索，黄芪甲苷的色谱条件为35 %乙腈洗脱，所建立的方法能够较好的将黄芪甲苷与其他成分分开，可用于黄芪皂苷中黄芪甲苷含量测定，黄芪甲苷稳定性试验结果RSD值高于2 %，可能是由于黄芪皂苷Ⅰ或黄芪皂苷Ⅱ在酸性水解的条件下易转化成黄芪皂苷Ⅳ，即黄芪甲苷，使黄芪水提物中黄芪甲苷在48h内的稳定性不好。根据三个因素水平趋势可知，随着乙醇的用量增加，黄芪甲苷的提取效率越来越高，实验设置中每次10倍量是最大乙醇用量，这是从大工业生产和节能降耗等方面考虑的结果。根据煎煮次数水平趋势，提取1次的黄芪甲苷转移率最大，这有可能是因为黄芪皂苷Ⅰ或黄芪皂苷Ⅱ在酸性水解的条件下易转化成黄芪皂苷Ⅳ，即黄芪甲苷，而黄芪皂苷Ⅰ或黄芪皂苷Ⅱ在第一次就较完全的被提取出来，随着时间增加，转换成黄芪皂苷Ⅳ，即黄芪甲苷，第二次时黄芪皂苷Ⅰ或黄芪皂苷Ⅱ的结构可能被破坏，影响其转化成黄芪甲苷。第三次时可能黄芪甲苷被提取的更彻底，转移率又开始小幅增大。在3h内，当提取时间增加，黄芪甲苷会逐渐增大，原因可能是黄芪甲苷的提取更加彻底，黄芪皂苷Ⅰ或黄芪皂苷Ⅱ转化成黄芪甲苷最多。实验设置中每次3h是最大提取时间，这也是从综合成本与效率的角度考虑的结果。因此，综合考虑，将加醇10倍量，提取1次，共3h作为最佳醇提实验工艺。由黄芪甲苷转移率结合出膏率的到的综合评分的结果可以看出，不同提取工艺对黄芪醇提物中黄芪甲苷的含量和出膏率的影响不同，其中7、8、9组评分较高，三个组的黄芪甲苷转移率相较于其他组也是最高，但第8组出膏率却相对较低，另外出膏率高低的顺序也不与黄芪醇提物中黄芪甲苷的转移率高低的顺序项一致，这说明出膏率与黄芪醇提物中黄芪甲苷的转移率并无明显的对应关系。[align=center]参考文献[/align] 朱燕辉, 严奉祥. 黄芪甲苷及其生物学活性.现代生物医学进展,2008, 8 ( 4 ) : 781-783.

【作者】 刘近荣；【机构】 山西泰盛制药有限公司；【摘要】 目的建立以高效液相色谱法测定黄芪总皂苷氯化钠注射液中黄芪甲苷含量的方法。方法色谱柱为DiamonsilC18(5μm,4.6×250mm),流动相为乙腈-水(36:64),流速为0.8ml/min,柱温为室温。结果黄芪甲苷进样量在5μg～40μg范围内与峰面积积分值线性关系良好(r=0.9993,n=5),平均加样回收率为99.75%(RSD=0.57%)。结论本方法测定结果准确、操作简便、灵敏度高、重复性好,可用于本品的质量控制。 更多还原http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/08/201208131255_383443_2379123_3.jpg

[align=center][b]UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS法测定黄芪水提物中的黄芪甲苷含量[/b][/align][b] 传统中药的煎煮，大多是用水作为溶剂，因此研究药材的水提物中有效成分的含量对药材的工业生产和实际应用具有不可忽视的指导意义。据文献报道[sup][/sup]，黄芪水提物中主要为糖类和皂苷类成分,而水提物药渣中则是提取后剩余的淀粉、纤维素、木质素等原药材的基体成分和一些不易溶于水的酯类、酮类和芳香类成分。黄芪甲苷作为黄芪皂苷中一类重要的物质，已被药典收录为黄芪含量测定的指标成分。为了保证临床应用制剂的质量和进一步开发利用中药黄芪，研究黄芪水提物中黄芪甲苷的含量显得格外重要。在预实验中，笔者发现药典中测定黄芪中黄芪甲苷含量的方法并不完全适用于黄芪水提物中黄芪甲苷含量的测定，预处理时出现乳化现象导致萃取不完全，另外利用药典中规定的蒸发光检测器液相色谱仪测定无法得到理想的线性方程。因此，笔者结合黄芪水提物的性质和仪器灵敏性等特点，利用UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS法考察黄芪水提物中的黄芪甲苷含量测定的方法学和并利用该方法测定黄芪水提物中黄芪甲苷的含量。[b]1 材料和仪器1.1 样品 [/b] 收集9组黄芪水提取物样品，黄芪饮片为济南济成堂中药饮片有限公司提供（批号18033101）。[b]1.2 试剂 [/b]黄芪甲苷对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司批号H-013-170117），乙腈为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；超纯水。[b]1.3 仪器 [/b]Waters XevoTQ-S三重四级杆质谱仪（美国Waters公司）。ACQUITY UPLC H-CLass超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；超声波清洗机KS-300E（宁波科生仪器厂）；电子天平MS205DU（梅特勒/瑞士）。[b]2 方法学考察2.1 色谱与质谱条件[/b]色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1*50 mm，1.7 mm）。流动相为乙腈-水（A∶B）系统。梯度洗脱，A相：0→1 min A保持30%；1→2 min A为30→60%；2→3 min A为60→70%；3→4 min A保持70%；4→4.5 min A为70→30%；A相：4.5→5.5 min A保持30%。流速 0. 2 mL/min，柱温为40 ℃，进样体积 1. 0 μL。质谱条件：电喷雾正离子检测模式，毛细管电压；3.0 kV；脱溶剂气流：N2，流速800 L h[sup]-1[/sup]，脱溶剂温度400 ℃；锥孔电压：40 V，锥孔气流：N2，流速150 Lh[sup]-1[/sup]；离子源温度: 400 ℃；雾化气压力为7.0 bar碰撞气体: 氩气。采用MRM 定量模式，质量扫描范围为100～1 000 amu。该条件下，获得黄芪甲苷的分子离子峰 m /z 785. 42，子离子峰m /z 143.08。黄芪甲苷提取总离子流图和一级质谱图分别见图3-1和图3-2。[/b][align=center][img=,690,322]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131701299261_9069_3237657_3.png!w690x322.jpg[/img][/align][align=center]图3-1 黄芪甲苷的总离子流图[/align][align=center][img=,690,331]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131701493040_8991_3237657_3.png!w690x331.jpg[/img][/align][align=center]图3-2 黄芪甲苷的一级质谱图[/align][b]2.2 供试品溶液的制备[/b]精密称定1/200重量的黄芪水提物样品（折合黄芪药材0.5g）置于锥形瓶中，精密加入4%氨水溶液100 mL，称定重量，超声30 min，取出放至室温，用4%氨水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，精密吸取续滤液10 mL过Dikma ProElut C18-U-SPE柱（先以甲醇20 mL活化，再以水20 mL平衡），上样后用10 mL水淋洗，弃去，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，定容至10 mL容量瓶中，摇匀，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，即得。[b]2.3 对照品储备溶液的制备[/b]精密称取黄芪甲苷标品1.01mg至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，吸取1 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇定容，制成浓度为1.01 μg/mL的对照品储备溶液。[b]3 结果3.1 线性关系考察[/b]精密吸取 2. 3 项下对照品储备溶液 1，3，5 mL，用甲醇稀释并定容到 10mL 容量瓶中，制备0.1，0.3，0.5 mgmL[sup]-1[/sup]质量浓度对照品溶液。另吸取0.1，0.3 mg/mL质量浓度对照品溶液5 mL至10 mL容量瓶，用甲醇定容，得到0.05，0.15 mg/mL质量浓度对照品溶液。在拟定分析条件下，准确吸取 10. 0 μL 进样分析。黄芪甲苷离子选择 m/z 785. 42 为母离子，143.08 为子离子，准确吸取1 0 μL 进样分析。以质量浓度为横坐标，以提取离子流图峰面积为纵坐标进行线性回归，如图3，得回归方程为：Y=46.135X + 1938.8（r[sup]2[/sup]= 0. 9984），提示黄芪甲苷在0. 05～0.5 mg/m L 范围内线性关系良好。黄芪甲苷对照品标准曲线如图3-3所示。[align=center][img=,690,423]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131702057366_9110_3237657_3.png!w690x423.jpg[/img][/align][align=center]图3-3 黄芪甲苷标准曲线[/align][b]3.2 精密度实验[/b]在拟定分析条件下，精密吸取供试品溶液1.0 μL，连续进样 6 次，记录提取离子流图峰面积，测定黄芪甲苷量，计算得相对标准偏差RSD为1.1% ，提示该方法具有较好的精密度。[b]3.3 重复性实验[/b]取同一黄芪样品 6份，按2. 2 项下方法制备供试品溶液，在拟定分析条件下，准确吸取 1. 0 μL 进样分析，测定黄芪甲苷量，计算得 RSD为2.0%，提示该方法重复性良好。[b]3.4 稳定性实验[/b]取黄芪药材供试品溶液，分别在0 h、3 h、6 h、9 h、24 h、48 h后，在拟定分析条件下，准确吸取 1. 0 μL 进样分析，测定黄芪甲苷量，计算得 RSD 为 4.7% ，提示黄芪供试品溶液稳定性较差。[b]3.5 加样回收率实验[/b]精密称取 6 份黄芪甲苷量已知的黄芪水提物样品，每份折合黄芪药材 0. 5 g，分别准确加入浓度为 0. 0 342 mg /mL 黄芪甲苷溶液1 ml，1 ml，2 ml，2 ml，3 ml，3 ml，按 “2. 2 ”项下方法制备供试品溶液，准确吸取 1. 0 μL 进样分析，测定黄芪甲苷量，计算回收率，结果见表3-1。由表3-1可见，方法平均回收率为 102.35% ，表明该方法具有较好的回收率。[align=center] [/align][align=center]表3-1 黄芪甲苷加样回收率测定结果[/align] [table][tr][td] [align=center]样号[/align] [/td][td] [align=center]样品中的量/mg[/align] [/td][td] [align=center]加入量/mg[/align] [/td][td] [align=center]测得量/mg[/align] [/td][td] [align=center]回收率/%[/align] [/td][td] [align=center]平均值/%[/align] [/td][td] [align=center]RSD/%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]0.069[/align] [/td][td] [align=center]0.034[/align] [/td][td] [align=center]0.1[/align] [/td][td] [align=center]101.68[/align] [/td][td=1,6] [align=center]102.35[/align] [/td][td=1,6] [align=center]2.8[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]0.069[/align] [/td][td] [align=center]0.034[/align] [/td][td] [align=center]0.11[/align] [/td][td] [align=center]104.44[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]0.069[/align] [/td][td] [align=center]0.068[/align] [/td][td] [align=center]0.14[/align] [/td][td] [align=center]104.17[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]0.069[/align] [/td][td] [align=center]0.068[/align] [/td][td] [align=center]0.13[/align] [/td][td] [align=center]96.42[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]0.069[/align] [/td][td] [align=center]0.10 [/align] [/td][td] [align=center]0.17[/align] [/td][td] [align=center]102.78[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]6[/align] [/td][td] [align=center]0.069[/align] [/td][td] [align=center]0.10 [/align] [/td][td] [align=center]0.18[/align] [/td][td] [align=center]104.63[/align] [/td][/tr][/table][align=center] [/align][b]3.6 黄芪甲苷的含量测定结果[/b]取9组黄芪水提物按照“2.2”项下操作，制备供试品溶液，准确吸取 1. 0 μL 进样分析，测定黄芪甲苷的含量。黄芪甲苷对照品和黄芪水提物样品的MRM 离子流图见图3-4、图3-5。供试品黄芪甲苷含量测定结果见表3-2。[align=center][img=,690,348]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131702286759_7988_3237657_3.png!w690x348.jpg[/img][/align][align=center]图3-4 黄芪甲苷对照品的 MRM 离子流图[/align][align=center][img=,690,344]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131702391650_7279_3237657_3.png!w690x344.jpg[/img][/align][align=center]图3-5 黄芪水提物样品的 MRM 离子流图[/align][align=center] [/align][align=center]表3-2 9组黄芪水提物中黄芪甲苷含量测定结果[/align] [table][tr][td] [align=center]试验号[/align] [/td][td] [align=center]峰面积[/align] [/td][td] [align=center]含量(mg/g)[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]5120.00 [/align] [/td][td] [align=center]0.14 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]6744.00 [/align] [/td][td] [align=center]0.21 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]10275.67 [/align] [/td][td] [align=center]0.36 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]26955.00 [/align] [/td][td] [align=center]1.08 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]10599.00 [/align] [/td][td] [align=center]0.38 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]6[/align] [/td][td] [align=center]7212.33 [/align] [/td][td] [align=center]0.23 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]7[/align] [/td][td] [align=center]11247.33 [/align] [/td][td] [align=center]0.40 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]8[/align] [/td][td] [align=center]8008.33 [/align] [/td][td] [align=center]0.26 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]9[/align] [/td][td] [align=center]9171.00 [/align] [/td][td] [align=center]0.31 [/align] [/td][/tr][/table][align=center] [/align][b]3.7 正交试验设计及结果[/b]水提的黄芪甲苷转移率考察正交试验与水提的出膏率考察正交试验设计相同，即以水作为提取溶剂，把影响药材提取效果的用水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）确定为考察因素，以上三个考查因素各分3个水平考察，见表3-3。[align=center]表3-3水提实验因素水平表[/align] [table][tr][td=1,2] [align=center]水平[/align] [/td][td=3,1] [align=center]因素[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]A（用水量/倍）[/align] [/td][td] [align=center]B（提取时间/h）[/align] [/td][td] [align=center]C（提取次数/次）[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]8[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]10[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][/tr][/table][b] [/b]黄芪甲苷转移率=各实验组黄芪提取物中黄芪甲苷含量/原黄芪药材中黄芪甲苷含量×100%。原药材中毛蕊异黄酮苷的含量按照药典的方法测得的结果为0.4042mg/g。跟据实验数据，得到水提实验中设定的不同工艺条件下的毛蕊异黄酮苷的转移率，其中因素D为误差项，作直观分析表和方差分析表，见表3-4，表3-5。[align=center]表3-4 黄芪甲苷转移率考察L[sub]9[/sub](3[sup]4[/sup])正交试验表[/align] [table][tr][td] [align=center]试验号[/align] [/td][td] [align=center]A[/align] [/td][td] [align=center]B[/align] [/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]D[/align] [/td][td] [align=center]黄芪甲苷 转移率/%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]34.12 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]51.54 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]89.41 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]268.30 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]92.88 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]6[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]56.56 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]7[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]99.83 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]试验号[/align] [/td][td] [align=center]A[/align] [/td][td] [align=center]B[/align] [/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]D[/align] [/td][td] [align=center]黄芪甲苷 转移率/%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]8[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]65.10 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]9[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]77.56 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]K1[/align] [/td][td] [align=center]175.07 [/align] [/td][td] [align=center]402.25 [/align] [/td][td] [align=center]155.78 [/align] [/td][td] [align=center]204.56 [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]K2[/align] [/td][td] [align=center]417.74 [/align] [/td][td] [align=center]144.42 [/align] [/td][td] [align=center]397.40 [/align] [/td][td] [align=center]207.93 [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]K3[/align] [/td][td] [align=center]242.49 [/align] [/td][td] [align=center]223.53 [/align] [/td][td] [align=center]282.12 [/align] [/td][td] [align=center]422.81 [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]优水平[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]R[/align] [/td][td] [align=center]242.67 [/align] [/td][td] [align=center]257.83 [/align] [/td][td] [align=center]241.62 [/align] [/td][td] [align=center]218.25 [/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][/table][align=center] [/align][align=center]表3-5 黄芪甲苷转移率考察方差分析结果[/align] [table][tr][td] [align=center]方差来源[/align] [/td][td] [align=center]离差平方和[/align] [/td][td] [align=center]自由度[/align] [/td][td] [align=center]F[/align] [/td][td] [align=center]显著性[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]A[/align] [/td][td] [align=center]10460.75[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1.13[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]B[/align] [/td][td] [align=center]7698.00[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]0.75[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]9736.83[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1.02[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]D[/align] [/td][td] [align=center]10424.20[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][/tr][/table]注：F[sub]0.1[/sub]（2,2）=9，F[sub]0.05[/sub]（2,2）=19，*为有显著性，-为无显著性。从正交试验结果可知，水提实验中，各因素对黄芪甲苷转移率的影响大小顺序为：A（用水量）C(提取次数)B(提取时间)；每个因素3水平之间的趋势为A[sub]2[/sub]A[sub]3[/sub]A[sub]1[/sub]，B[sub]1[/sub]B[sub]3[/sub]B[sub]2[/sub]，C[sub]2[/sub]C[sub]3[/sub]C[sub]1[/sub]，直观分析得最佳提取工艺为A[sub]2[/sub]B[sub]1[/sub]C[sub]2[/sub]，即加水8倍量，提取2次，每次1h。表3-5的方差分析结果表明： A、B、C三因素对黄芪甲苷转移率的影响都无统计学差异(P0.05)。[b]4 讨论[/b]本章实验利用超高效液相串联三重四级杆质谱仪测定黄芪水提物中黄芪甲苷的含量，相比药典中测定黄芪药材中黄芪甲苷的方法，此方法预处理步骤更少，用时更短，目标峰与其他相邻峰的分离度也更大，适合于黄芪水提物中黄芪甲苷含量的测定。但美中不足的是，供试品的预处理需要过SPE柱，仪器的使用和维护费用更高，实验者在测定样品的含量前需要综合考虑。从测定结果来看，设置的三个因素中，用水量对黄芪甲苷的转移率影响最大，但仍无统计学差异(P0.05)，说明用水量、提取次数、提取时间三种工艺的改变对黄芪水提物中黄芪甲苷的含量无显著性影响。第4、5、7组的黄芪甲苷转移率相比其他组的更高，尤其是第4组测得的黄芪甲苷的含量远高于用药典方法测得的药材中黄芪甲苷的含量，正交实验分析结果也说明加水8倍量，提取2次，每次1h是最佳提取工艺。这一结果与水提实验中第3、4、7组测得的出膏率较高有些差异，第4组实验的出膏率也不算低，但不是最高，而出膏率最高的第3组黄芪甲苷的转移率却不高，这说明出膏率与黄芪水提物中黄芪甲苷的转移率并无明显的对应关系。合乎标准要求的有效成分含量是保证药物疗效稳定可靠的硬性指标，实现有效成分提取的最大化是优化工艺条件的重要目标。本章关于不同提取工艺条件下黄芪甲苷转移率的考察研究，对芪龙胶囊和黄芪配方颗粒工艺的优化具有指导性意义。[align=center]参考文献[/align] 黄冬兰,徐永群,陈小康. 黄芪药材及其水提物的红外光谱分析. 光谱实验室，2012，29（5）：2823-2826.

[align=center][b]HPLC法测定黄芪水提物中的毛蕊异黄酮苷含量[/b][/align][b]黄芪中的主要有效成分除皂苷外就是异黄酮类化合物。异黄酮类成分具有调节免疫、抗肿瘤、抗突变、抗氧化、抗炎、抗突变抗辐射、抗心肌缺血、抗心律失常、抗病毒、抗细胞凋亡、保肝、防止动脉粥样硬化等作用[sup][/sup]，其代表成分就是毛蕊异黄酮 7-O-β-D 吡喃葡萄糖苷（即毛蕊异黄酮苷）。2010版药典才开始将毛蕊异黄酮苷收录为黄芪中有效成分含量测定项。本章实验借鉴药典中的测定方法，对不同工艺条件下获得的黄芪水提物中的毛蕊异黄酮苷含量进行考察，以期为优化芪龙胶囊和黄芪配方颗粒中黄芪的提取工艺参数提供科学基础和理论依据。[b]1 材料和仪器1.1 样品 [/b] 收集9组黄芪水提取物样品，黄芪饮片为济南济成堂中药饮片有限公司提供（批号18033101）。[b]1.2 试剂 [/b]毛蕊异黄酮苷对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司批号M-020-170926），乙腈为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；超纯水。[b]1.3 仪器 [/b]液相色谱系统，包括日本岛津公司LC-20AT型液相色谱仪，LC-20AT岛津输液泵，CTO-20A柱温箱，SIL-20A自动进样器，SPD-20A紫外-可见光检测器；超声波清洗机KS-300E（宁波科生仪器厂）；电子天平MS205DU（梅特勒/瑞士）。[b]2 方法学考察2.1 色谱条件及系统适应性试验[/b]DiamonsiL（钻石）C18柱（250*4.6 mm，5 mm）。以乙腈为流动相A，0.2%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱，A相：0→20 min A为20→40%；20→30 min A保持40%；30→40 min A保持20%。检测波长260 nm；流速为1 mL/min；柱温35 ℃进样量为10 μL。毛蕊异黄酮苷对照品溶液以及黄芪水提物样品色谱图见图4-1与图4-2。[/b][align=center][img=,690,365]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131706005051_4964_3237657_3.png!w690x365.jpg[/img][/align][align=center]图4-1 毛蕊异黄酮苷对照品色谱图[/align][align=center][img=,690,384]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131706118782_6652_3237657_3.png!w690x384.jpg[/img][/align][align=center]图4-2 黄芪水提物样品色谱图[/align][b]2.2 供试品溶液的制备[/b]精密称定1/50重量的黄芪水提物样品（折合黄芪药材2 g）置于锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，超声30 min，过滤，将滤液放至水浴锅上蒸干，残渣用甲醇溶解，并定容至25 mL，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，即得。[b]2.3 对照品储备溶液的制备[/b]精密称取黄芪甲苷标品5.10mg至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，摇匀，即得浓度为0.51 mg/mL的对照品储备溶液。[b]3 结果3.1 线性关系考察[/b]精密吸取 2. 3 项下对照品储备溶液 4，2，1，0.5，0.25 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为204.00，102.00，51.00，25.50，12.75 μg/mL的对照品溶液。按“2.3”项下色谱条件分别进样10 μL，利用自动积分功能测定峰面积积分值，并以峰面积积分值与浓度进行线性回归。如图3，得回归方程为：Y =25445X + 44225（r[sup]2[/sup]= 0.9994）提示毛蕊异黄酮苷在12.75～204.00 μg/mL范围内线性关系良好。毛蕊异黄酮苷对照品标准曲线如图4-3所示。[align=center][img=,690,406]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131706302801_395_3237657_3.png!w690x406.jpg[/img][/align][align=center]图4-3 毛蕊异黄酮苷标准曲线[/align][b]3.2 精密度实验[/b]按2. 2 项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，重复进样 6 次，记录色谱图峰面积，测定毛蕊异黄酮苷含量，计算得相对标准偏差RSD为1.6% ，提示该方法精密度良好。[b]3.3 重复性实验[/b]取同一黄芪样品 6份，按“2. 2”项下方法制备供试品溶液，在拟定分析条件下，精密吸取供试品溶液10 μL，测定毛蕊异黄酮苷含量，计算得RSD为1.1%，提示该方法重复性良好。[b]3.4 稳定性实验 [/b]按2. 2 项下方法制备供试品溶液，分别在0 h、3 h、6 h、9 h、24 h、48 h后，准确吸取 10 μL 进样分析，测定毛蕊异黄酮苷含量，计算得 RSD 为 0.6%，提示黄芪供试品溶液在48h内稳定性良好。[b]3.5 加样回收率实验[/b]精密称取 6 份毛蕊异黄酮苷含量已知的黄芪水提物样品，每份折合黄芪药材 0. 5 g，分别准确加入样品中毛蕊异黄酮苷含量的50%，50%，100%，100%，150%，150%重量的毛蕊异黄酮苷标品，按2. 2 项下方法制备供试品溶液，准确吸取 10 μL 进样分析，测定毛蕊异黄酮苷含量，计算回收率，结果见表4-1。方法平均回收率为108.48%，表明该方法具有较好的回收率。[align=center]表4-1 毛蕊异黄酮苷加样回收率测定结果[/align] [table][tr][td] [align=center]样号[/align] [/td][td] [align=center]样品中的量/mg[/align] [/td][td] [align=center]加入量[/align] [align=center]/mg[/align] [/td][td] [align=center]测得量/mg[/align] [/td][td] [align=center]回收率[/align] [align=center]/%[/align] [/td][td] [align=center]平均值/%[/align] [/td][td] [align=center]RSD[/align] [align=center]/%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]0.52 [/align] [/td][td] [align=center]1.64 [/align] [/td][td] [align=center]111.54 [/align] [/td][td=1,6] [align=center]108.85 [/align] [/td][td=1,6] [align=center]2.9 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]0.52 [/align] [/td][td] [align=center]1.64 [/align] [/td][td] [align=center]112.08 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]2.22 [/align] [/td][td] [align=center]109.20 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]2.24 [/align] [/td][td] [align=center]111.02 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]1.59 [/align] [/td][td] [align=center]2.72 [/align] [/td][td] [align=center]104.57 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]6[/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]1.59 [/align] [/td][td] [align=center]2.72 [/align] [/td][td] [align=center]104.67 [/align] [/td][/tr][/table][b]3.6 毛蕊异黄酮苷的含量测定结果[/b]取9组黄芪水提物按照“2.2”项下操作，制备供试品溶液，准确吸取 10 μL 进样分析，测定毛蕊异黄酮苷的含量。结果见表2。[align=center]表4-2 9组黄芪水提物中毛蕊异黄酮苷含量测定结果[/align] [table][tr][td] [align=center]批号[/align] [/td][td] [align=center]峰面积[/align] [/td][td] [align=center]含量(mg/g)[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1123989.50 [/align] [/td][td] [align=center]0.53 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2707047.50 [/align] [/td][td] [align=center]1.31 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1947171.50 [/align] [/td][td] [align=center]0.93 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]3573103.75 [/align] [/td][td] [align=center]1.73 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]1824562.00 [/align] [/td][td] [align=center]0.87 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]6[/align] [/td][td] [align=center]2767419.00 [/align] [/td][td] [align=center]1.34 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]7[/align] [/td][td] [align=center]2077551.50 [/align] [/td][td] [align=center]1.00 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]8[/align] [/td][td] [align=center]1677225.50 [/align] [/td][td] [align=center]0.80 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]9[/align] [/td][td] [align=center]1725416.00 [/align] [/td][td] [align=center]0.83 [/align] [/td][/tr][/table][b]3.7 毛蕊异黄酮苷转移率测定正交试验结果[/b]水提的毛蕊异黄酮苷转移率考察正交试验与水提的出膏率考察正交试验设计相同，即以水作为提取溶剂，把影响药材提取效果的用水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）确定为考察因素，以上三个考查因素各分3个水平考察，见表4-3。[align=center]表4-3水提实验因素水平表[/align] [table][tr][td=1,2] [align=center]水平[/align] [/td][td=3,1] [align=center]因素[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]A（用水量/倍）[/align] [/td][td] [align=center]B（提取时间/h）[/align] [/td][td] [align=center]C（提取次数/次）[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]8[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]10[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][/tr][/table][b] [/b]毛蕊异黄酮苷转移率=各实验组黄芪提取物中毛蕊异黄酮苷含量/原黄芪药材中毛蕊异黄酮苷含量×100%。原药材中毛蕊异黄酮苷的含量按照药典的方法测得的结果为0.1425mg/g。跟据实验数据，得到水提实验中设定的不同工艺条件下的毛蕊异黄酮苷的转移率，其中因素D为误差项，作直观分析表和方差分析表，见表4-4，4-5。[align=center]表4-4 毛蕊异黄酮苷转移率考察L[sub]9[/sub](3[sup]4[/sup])正交试验表[/align] [table][tr][td] [align=center]批号[/align] [/td][td] [align=center]A[/align] [/td][td] [align=center]B[/align] [/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]D[/align] [/td][td] [align=center]毛蕊异黄酮苷[/align] [align=center]转移率/%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]37.21[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]91.77[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]65.58[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]121.62[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]61.36[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]6[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]93.85[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]7[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]70.08[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]8[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]56.28[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]9[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]57.94[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]K1[/align] [/td][td] [align=center]194.56[/align] [/td][td] [align=center]228.91[/align] [/td][td] [align=center]187.34[/align] [/td][td] [align=center]156.51[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]K2[/align] [/td][td] [align=center]276.83[/align] [/td][td] [align=center]209.41[/align] [/td][td] [align=center]271.33[/align] [/td][td] [align=center]255.70[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]K3[/align] [/td][td] [align=center]184.30[/align] [/td][td] [align=center]217.37[/align] [/td][td] [align=center]197.02[/align] [/td][td] [align=center]243.48[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]优水平[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]R[/align] [/td][td] [align=center]92.53[/align] [/td][td] [align=center]19.50[/align] [/td][td] [align=center]83.99[/align] [/td][td] [align=center]99.19[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][/table][b] [/b][align=center]表4-5 毛蕊异黄酮苷转移率考察方差分析表[/align] [table][tr][td] [align=center]方差来源[/align] [/td][td] [align=center]离差平方和[/align] [/td][td] [align=center]自由度[/align] [/td][td] [align=center]F[/align] [/td][td] [align=center]显著性[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]A[/align] [/td][td] [align=center]1715.05[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1.50[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]B[/align] [/td][td] [align=center]64.09[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]0.04[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]1407.78[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1.13[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]方差来源[/align] [/td][td] [align=center]离差平方和[/align] [/td][td] [align=center]自由度[/align] [/td][td] [align=center]F[/align] [/td][td] [align=center]显著性[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]D [/align] [/td][td] [align=center]1950.20[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][/tr][/table]注：F[sub]0.1[/sub]（2,2）=9，F[sub]0.05[/sub]（2,2）=19，*为有显著性，-为无显著性。从正交试验结果可知：水提实验中，各因素对毛蕊异黄酮苷转移率的影响大小顺序为：A（用水量）C(提取次数)B(提取时间)；每个因素3水平之间的趋势为A[sub]2[/sub]A[sub]1[/sub]A[sub]3[/sub]，B[sub]1[/sub]B[sub]3[/sub]B[sub]2[/sub]，C[sub]2[/sub]C[sub]3[/sub]C[sub]1[/sub]，直观分析得提取工艺为A[sub]2[/sub]B[sub]1[/sub]C[sub]2[/sub]，即加水8倍量，提取2次，每次1h。表4-5的方差分析结果表明： A、B、C三因素的对毛蕊异黄酮的转移率影响都无统计学差异(PC(提取次数)B(提取时间)；每个因素3水平之间的趋势为A[sub]2[/sub]A[sub]3[/sub]A[sub]1[/sub]，B[sub]1[/sub]B[sub]3[/sub]B[sub]2[/sub]，C[sub]2[/sub]C[sub]3[/sub]C[sub]1[/sub]，直观分析得提取工艺为A[sub]2[/sub]B[sub]1[/sub]C2，即加水8倍量，提取2次，每次1h。表4-7的方差分析结果表明：A、B、C三因素对综合评分的影响都无统计学差异(P0.05)。[b]4 讨论[/b]本章实验借鉴药典中测定黄芪药材中毛蕊异黄酮苷含量的方法，利用紫外-可见光检测器的高效液相色谱仪测定黄芪水提物中毛蕊异黄酮苷的含量。与药典中方法测得的结果相比，本实验测得的结果除色谱峰分离度稍差外，其他方法学考察指标显示良好。从毛蕊异黄酮苷转移率测定正交试验结果来看，第4组实验毛蕊异黄酮苷转移率最高，这也是正交结果分析中最佳提取工艺，即加水8倍量，提取2次，每次1小时。本结果与上一章实验中第四组黄芪水提物中黄芪甲苷的转移率最高结果一致，但其他组别毛蕊异黄酮苷的转移率高低顺序与上一章黄芪甲苷的转移率高低顺序并不一致，这说明毛蕊异黄酮苷和黄芪甲苷对提取工艺的要求并不完全一致。同一种原药材，加工成不同功效的药物，那么发挥药效的物质也有可能不同，因此相应的提取工艺也是需要根据药效物质适时调整的。另外，用水量在设置的三个因素中对毛蕊异黄酮苷的转移率影响最大，但仍无统计学差异(P0.05)，说明用水量、提取次数、提取时间三种工艺的改变对黄芪水提物中毛蕊异黄酮苷的含量无显著性影响。从综合评分计算正交试验结果来看，第4组实验综合评分最高，这也是正交结果分析中最佳提取工艺，即加水8倍量，提取2次，每次1小时。用水量在设置的三个因素中对综合评分影响最大，但仍无统计学差异(P0.05)，说明用水量、提取次数、提取时间三种工艺的改变对黄芪水提工艺的综合评分无显著性影响。综合出膏率、黄芪甲苷和毛蕊异黄酮苷的含量得出综合评分来优选黄芪水提的最佳提取工艺，能够从化学成分的角度来客观全面地评价和研究黄芪水提的关键环节，这也为芪龙胶囊和黄芪配方颗粒水提环节工艺的优化提供借鉴和指导。[align=center] [/align][align=center]参考文献[/align] 陈建真,吕圭源, 叶磊, 等.黄芪黄酮的化学成分与药理作用研究进展. 医药导报, 2009, 28(10): 1314-1316. 赵四清,周日宝, 陈胜璜, 等.不同的产地加工方法对中药材金樱子质量的影响. 湖南中医学院学报, 2005, 25(3): 21-22.

[align=center][color=#333333]黄芪含量测定[/color][/align]1 材料与试剂 乙腈（色谱级）、正丁醇、氨水、甲醇（分析纯）、黄芪甲苷（购自中检院）、血竭样品（送检样品）。2 色谱条件 LC-20AT液相色谱仪（日本岛津），色谱柱：Zorbax SB C18(250mm*4.6μm*5μm)（安捷伦），流动相：以乙腈-水（30：70）；蒸发光检测器（奥泰）；柱温35℃。3 样品制备（参照2015年版药典） 3.1 标准品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，即得。[align=center][img=,555,177]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909121553061421_926_1858223_3.jpg!w555x177.jpg[/img][/align]3.2 样品溶液的制备 取本品中粉约4g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40ml，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4小时，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径为1.5cm，柱高为12cm），以水50ml洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。[align=center][img=,583,180]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909121553295651_9515_1858223_3.jpg!w583x180.jpg[/img][/align]3.3 计算方法 分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。小结：每次接到黄芪样品大家都会来一句怎么又有黄芪，大概黄芪是比较受嫌弃的中药材之一了，药典上的方法过程比较繁琐，一般需要2-3天才能把前处理处理完。检测简述流程：浸泡过夜——索氏提取4h——旋干——萃取 （4次+2次）——蒸干（这个正丁醇不太好旋干比较耗时）——过大孔树脂柱（上样之前要洗至无醇味，然后上样后用3种溶剂洗脱）——旋干——定容待测。为了减少误差及节省时间，我们考察了正丁醇的萃取次数对含量的影响，我们用2次80ml和4次40ml进行对比发现结果相当，实验操作过程中萃取次数越多反而容易引起操作误差，值得大家注意的是大孔树脂上样前要洗至无醇味，这个对结果影响还是有的，保证数据的平行性，用同体积的水进行洗至无醇味。

[color=#00008b]前言：本篇是以黄芪含量测定的方法为例来介绍两点对数方程的应用，有关安捷伦1100的操作方法和蒸发光检测器的知识大家可以在本网和回帖中找到，如有疑问我们共同探讨。并在此感谢大家对文章的建议，也使我学到了很多知识，谢谢大家！[/color][size=4][b] 解析外标两点对数方程计算黄芪药材含量[/b][/size][b]方 法[/b]： 照高效液相色谱法，ODS柱，以乙腈-水（32：68）为流动相，流速1ml/min，经蒸发光检测器检测，用外标两点对数方程计算黄芪药材中黄芪甲苷的含量。[b]仪 器[/b]： 安捷伦1100型液相色谱仪、蒸发光检测器（ELSD）、ODS柱（4.6um*5mm*200mm）[b]供试品[/b]： 黄芪药材（检测成分：黄芪甲苷）[b]关键词[/b]： 高效液相法、蒸发光检测器、黄芪甲苷、粉碎、提取物、外标两点对数方程[b]正 文[/b]：[color=#dc143c]前处理：[/color]取约20g的黄芪药材放置于小型粉碎机内，粉碎后，盛装在密闭的容器中待用。[color=#dc143c]供试品制备：[/color]取黄芪药材粉末两份，Ⅰ.4.0037g；Ⅱ.4.0022g。分别置索氏提取器中，加甲醇40ml，浸泡过夜（大于8小时）。第二天，加甲醇适量，加热回流4小时，提取液浓缩至干，残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇（制法：把水加入正丁醇中至饱和）振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液；用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷；通过D101型大孔吸附树脂柱(备注：自己装填)，并以水50ml洗脱，弃去水液；再用40%乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液；继用70%乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干；用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。简单讲，即把黄芪药材最后提取物（黄芪甲苷）溶解到5ml甲醇中。[color=#dc143c]对照品制备：[/color]称取黄芪甲苷对照品（中检所购入）0.0512g至100ml容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，摇匀，即得。[color=#dc143c]测定：[/color]系统平衡后，精密吸取对照品溶液10ul进样，得色谱峰面积Ⅰ.259457 ；进样20ul，得色谱峰面积Ⅱ.523039。供试品溶液进样20ul，两针，色谱峰面积为：Ⅰ.909836，Ⅱ. 902925 。根据对照品峰面积和进样量，以外标两点对数方程计算供试品含量。[color=#dc143c]两点对数方程定义：[/color]是利用两点的对数值呈线性关系求解二元一次方程y=ax+b。本题是利用对照品溶液两针进样量的对数值和所得峰面积的对数值呈线性的关系，把两组数据带入方程y=ax+b中，求得a和b，即求解了该方程式。然后带入供试品峰面积的对数值，求得供试品进样量的对数值，对其求反对数得供试品进样量（黄芪甲苷的量）。方程中x、y值均为进样量和峰面积取对数（lg）后的数值。简单讲，就是通过对照品溶液两针的进样量和峰面积（均取对数lg）求解方程式后，把供试品峰面积（取对数lg）带入方程式求得供试品的进样量。[color=#dc143c]数据处理：[/color]根据外标两点对数方程，应先计算得到方程式中的x、y值，才能求解此方程式。即取对照品进样量的对数值为x，取对照品峰面积对数值为y，计算结果如下：---------对照品-----------Ⅰ--------------------------Ⅱ---------进样量：---0.0512g×10ul（5.12ug）-----0.0512g×20ul（10.24ug）进样量取lg，得x：--------0.7093 --------------------1.0103 -----色谱峰面积：--------259457---------------------523039峰面积取lg，得y：--------5.4141---------------------5.7185 [color=#dc143c]方程式求解：[/color]根据“数据处理”中求得的x、y值，通过Excel图表中的XY散点图，以（0.7093，5.4141）、(1.0103, 5.7185)两点，求得方程如下：[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/09/200909021104_169264_1622024_3.jpg[/img][color=#dc143c]供试品进样量求解：[/color]取供试品色谱峰面积的对数值，得y，带入已求得的方程式y=1.0112x+4.6969，求得x，如下：---------供试品------------Ⅰ----------------------Ⅱ ---------称样量：--------4.0037g -----------------4.0022g -----色谱峰面积：--------909836-------------------902925峰面积取lg，得y：--------5.9590-------------------5.9557 通过方程，求得x：--------1.2481-------------------1.2448根据lg(进样量)=x，求x（1.2481、1.2448）的反对数，得供试品进样量:Ⅰ.17.7052ug 、Ⅱ.17.5711ug（黄芪甲苷）[color=#dc143c]含量计算：[/color]根据供试品称样量、样品的稀释倍数5ml及20ul进样量中黄芪甲苷的量，求得：供试品Ⅰ含量：（17.7052ug×5ml/4.0037g/20ul）×100%=0.1106%供试品Ⅱ含量：（17.5711ug×5ml/4.0022g/20ul）×100%=0.1098%平均值为：（0.1106%+0.1098%）/ 2 = 0.11%[color=#dc143c]结 果：[/color]该批黄芪药材中含黄芪甲苷的量为0.11%。[color=#dc143c]数据处理Excel表：[/color]见附件：[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=169305]黄芪含量测定数据处理全过程[/url][b]参考文献[/b]：1.《中国药典》2005版一部2.《高效液相色谱法及其在药物分析中的应用》（中华康网）3.《你了解蒸发光检测器吗？》（仪器信息网）（全文完，请大家指导！）===============================================================================================蒸发光检测器知识：一.[b]ELSD检测步骤[/b]：1）雾化：在雾化器中，洗脱液通过1个针孔与氮气（也可以用空气）混合，形成均匀的雾状液滴。2）流动相蒸发：液滴通过加热的漂移管时，流动相被蒸发，样品组分形成气溶胶，进人检测室。3）检测：在检测室内，用激光来照射气溶胶，产生散射，测定散射光强，记录散射光强度随时间的变化关系，就得到了色谱图。二.[b]ELSD检测原理[/b]：气溶胶受固定光强的激光照射后，待测组分的质量(m）和散射光强度(I)有以下的关系：I=Kmb lgI=blgm+lgK式中K和b为与蒸发室温度和流动相性质有关的常数。上式说明散射光的对数响应值与组分的质量的对数成线性关系。

全自动固相萃取-比色法测定保健食品中总皂苷 作者：赵晓冬http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/11/201511261708_575182_2904170_3.jpg目的：建立保健食品中总皂苷的含量测定方法。方法：采用Sepline全自动固相萃取装置对保健食品中的总皂苷富集,通过70%乙醇回收，以香草醛-高氯酸为显色剂，采用比色法测定。结果：比色法测定的线性范围为0.038～0.268mg，相关系数 r=0.9997; 在不同保健食品中的平均加样回收率均在98.3%～102.4%，RSD〈2.2% (n=6)。结论：本法简便、准确、灵敏度高、重复性好，可用于不同类型保健食品中总皂苷的含量测定。　　目前保健食品中的总皂甙测定方法尚无国家标准，大多都是按照《保健食品检验与评价技术规范 (2003年版) 》“保健食品中总皂甙的测定”方法检测，该方法采用人参皂苷 Re为对照，用香草醛比色法测定总皂苷。其显色体系为:香草醛-冰醋酸-高氯酸，但在实际操作中和据相关文献报道中，但采用该方法检测结果误差较大，尤其是不同实验室间测定结果差异更大,不利于产品的质量控制。有文献报道，卫生部食品卫生监督所2000年组织全国22个省、市、自治区省级疾病预防控制中心对这一方法进行比对试验，结果显示:离散度较大，有的浓度水平还出现离群值，各实验室间的RSD达80%，因此需要对测定方法加以改进。本文采用莱伯泰科公司Sepline全自动固相萃取提取装置 具有洗脱液流速恒定可控、大批量产品自动化处理，保证试验系统的密闭性等优点可保证结果的平行性和准确性。在对大孔树脂进行品牌筛选的基础上，定制统一规格固相萃取柱、对总皂苷测定前处理过程进行了优化，整套方法简单，数据结果离散性小，平行性得到提高。1材料与方法1.1 仪器 　 UV-2450 紫外可见分光光度计(日本，岛津公司)，CP2250分析天平，AS10200ADT超声波清洗仪，TLL-DCⅡ型氮吹仪，Sepline全自动固相萃取系统（北京莱伯泰科有限公司），固相萃取柱（底层有砂芯隔板,内装XAD-2大孔树脂2.7g,Alumina-N中性氧化铝，6ml,北京莱伯泰科有限公司）。1.2 试药　　人参皂苷Re对照品（中国食品药品检定研究院，含量92.7%），冰醋酸、香草醛、高氯酸、乙醇均为分析纯，水为纯化水。1.3 供试品　　上普牌西洋参含片 (厦门上普药业有限公司，批号14040201)；天信减肥茶( 福建安溪馨隆保健品有限公司，批号: 20140504 ) ；辅助降血脂片（哈尔滨久盛医药科技开发有限公司，批号:20140714）珍迪牌黄芪阿胶口服液（南昌健民营养补品厂，批号: 20130701）２方法与结果2.1 标准溶液制备精密称取20mg人参皂苷Re对照品置于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。吸取10mL人参皂苷Re标准溶液（0.2mg/ml）放蒸发皿中，放在水浴挥干（低于60℃），准确加入10ml水溶解，作为标准溶液2.2 样品溶液制备　　精密称取适量样品，置于50mL容量瓶中，加水适量溶解，超声30min，放置至室温，用水稀释至刻度，摇匀， 3000r·min-1离心5min,0.45um微孔滤膜过滤。若为非乙醇类液体试样，先经0.45um微孔滤膜过滤，取精密过滤后样品1mL (根据试样含总皂苷量定) 进行固相萃取。2.3 样品溶液吸附及洗脱 取样品溶液上清液置于收集管中（大于2ml）, 放置于Sepline全自动固相萃取系统中，按以下步骤进行吸附及洗脱（详见图1）。2.3.1 活化：在固相萃取柱中，以2.5 ml·min-1 流速冲洗70%乙醇25ml、然后以2.5 ml·min-1 流速冲洗水25ml。2.3.2 上样：以1ml·min-1 流速加1ml样品溶液于固相萃取柱中。2.3.3 洗脱：以0.8ml·min-1 流速, 依次用25ml水，25ml70%乙醇进行洗脱，收集70%乙醇洗脱液,在收集结束时氮气吹扫管理残留洗脱液50s。2.3.4 挥干：将收集的洗脱液转入50ml的离心管中，在60℃下氮气吹干。https://mmbiz.qlogo.cn/mmbiz/1M6WGftQWKcMCtAjjEeTO31icqxEfIgZXHUdyj5UNWFsWqjnVFOfw77OyyjdE8AtsH0V1ibNylQgZibv2FialaXicibA/0?wx_fmt=jpeg2.4 显色与测定　　在上述已挥干的洗脱液中准确加入0.2ml5%香草醛冰乙酸溶液，使残渣都溶解，再加0.8ml 高氯酸，混匀后60℃水浴上加热 10min，冰浴冷却后，准确加入冰乙酸 5.0ml，摇匀后，以 1cm 比色池于 560nm 波长处与标准管一起进行比色测定。2.5 线性关系考察　　精密吸取“2.1”项标准溶液0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、、1.4人参皂苷Re标准溶液（0.2mg/ml），按 “2. 3”“2.4”项下方法进行前处理并测定。以吸光度值为横坐标， 以人参皂苷Re含量 (mg) 为纵坐标进行回归计算，回归方程为y =0.3521x+0.0018，r=0.9997，结果表明，总皂苷( 以人参皂苷Re计) 在0.038～0.268mg 范围内线性关系良好。2.6 加样回收率试验　　采用加样回收率法，精密称取4类保健品适量，分别按样品量的100%的比例各6份加入对照品 ，按“2.3”项下和“2.4”项下进行测定，并分别计算回收率(见表1-表5)，结果各品种平均加样回收率均在98.3%～102. 4% ，RSD＜2.2% ，并与传统方法（手填层析柱、人工进行柱洗脱）进行比较，表明该方法准确度良好，且离散度低于传统方法。https://mmbiz.qlogo.cn/mmbiz/1M6WGftQWKcMCtAjjEeTO31icqxEfIgZXpKdklF1UoeMzvU6eQJEseF6P0shyEyUViacyO2M0iaBmcQmLVtq4YUIQ/0?wx_fmt=jpeghttps://mmbiz.qlogo.cn/mmbiz/1M6WGftQWKcMCtAjjEeTO31icqxEfIgZXcxdobibU0cPzwap5qsdShaQtxlrmMbDxOG6AKyWSTxYHbwu085loQog/0?wx_fmt=jpeghttps://mmbiz.qlogo.cn/mmbiz/1M6WGftQWKcMCtAjjEeTO31icqxEfIgZXudGTrHbh0Eu8R6zY3PNo4iaHwJMh58wAxhK00QPk76bje6KXTQ6LWAA/0?wx_fmt=jpeghttps://mmbiz.qlogo.cn/mmbiz/1M6WGftQWKcMCtAjjEeTO31icqxEfIgZXO3ae9XyfEiaaUU6Qkibib1WgWDiaAVh9AQEFhV6tJ8oJxfsibuHW7tMWHUw/0?wx_fmt=jpeghttps://mmbiz.qlogo.cn/mmbiz/1M6WGftQWKcMCtAjjEeTO31icqxEfIgZXfVUKQfmpzF7ootVP2rp4VREoKIGLKDM54tMwEK2GyZ8DazgJL6tfug/0?wx_fmt=jpeg2.7 稳定性试验 将显色后样品分别放置 0、0.5、1、1.5、2、2.5、3h， 测定吸光值。结果表明该显色体系在1 h内吸光度基本不变，1h后吸光度有所降低，故在显色后1 h内测定。2.8 样品含量测定　　取4类保健食品 ，按“2.3”项下和“2.4”项下进行测定，于 560nm 波长处测定吸光度值， 根据所得到的标准曲线计算样品中总皂苷的含量(见表6) 。[align

问题：启脾口服液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re的检测：对照品中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re的分离度是多少？答案：2.467获奖名单：吕梁山（ID：shih20j07）dahua1981（ID：dahua1981）m3071659（ID：m3071659）http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/02/201602231542_584931_708_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/02/201602231543_584932_708_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/02/201602231543_584933_708_3.jpg【活动奖励】幸运奖（2钻石币）：抽奖软件，当天随机抽取3个回答正确的版友ID号（最后一个ID号，截止至下午3：00），每人奖励2个钻石币积分奖励：所有回答正确的版友奖励10个积分（幸运奖获得者除外）。【注意事项】同样的答案，每人只能发一次PS：该贴浏览权限为“回贴仅作者和自己可见”，回复的版友仅能看到版主的题目及自己的回答内容，无法看到其他版友的回复内容。下午3点之后解除，即可看到正确答案、获奖情况及所有版友的回复内容。启脾口服液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re的检测样品制备 制备方法1. 对照品：取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL各含0.25 mg的混合溶液，摇匀，即得。2. 供试品：精密量取本品50 mL，加三氯甲烷振摇提取3次，每次30 mL，弃去三氯甲烷提取液，水液加水饱和正丁醇振摇提取5次(50 mL、30 mL、30 mL、20 mL、20 mL)，合并正丁醇提取液，加氨试液洗涤4次，每次50 mL，弃去氨试液，再加正丁醇饱和的水轻轻振摇洗涤2次，每次50 mL，弃去水洗液，正丁醇液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分析条件 色谱柱Diamonsil C18(2) 250 × 4.6 mm，5 μm (Cat#：99603) 流动相A：水 B：乙腈 梯度流速1.0 mL/min 柱温35 ℃ 检测器UV 203 nm 进样量5 μL 色谱图对照品http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/02/201602231201_584890_708_3.png 峰号 保留时间 min 峰面积 μV*s 峰高 μV 理论塔板数* N USP拖尾因子 分离度 1 52.603 387347 6585 18460.678 1.019 -- 2 56.668 262702 4169 16820.782 0.971 2.467 *药典要求理论板数按人参皂苷Re峰计算应不低于2500 供试品http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/02/201602231202_584891_708_3.png 峰号 保留时间 min 峰面积 μV*s 峰高 μV 理论塔板数* N USP拖尾因子 分离度 1 52.664 117855 2108 18875.714 0.982 -- 2 56.654 291453 4502 18266.289 1.019 2.486 *药典要求理论板数按人参皂苷Re峰计算应不低于2500本品种同时使用了Leapsil C18色谱柱，在药典规定条件下进行人参皂苷Rg1[/sub

问题：颈痛颗粒中三七皂苷、人参皂苷的检测使用了哪几款液相色谱柱？答案：Platisil ODS、Leapsil C18、Spursil C18-EP【活动奖励】幸运奖（2钻石币）：抽奖软件，当天随机抽取3个回答正确的版友ID号（最后一个ID号，截止至下午3：00），每人奖励2个钻石币mengzhaocheng（ID：mengzhaocheng）999youran（注册ID：999youran）WUYUWUQIU（注册ID：wulin321）http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/01/201601291556_583923_1610895_3.pnghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/01/201601291556_583924_1610895_3.png积分奖励：所有回答正确的版友奖励10个积分（幸运奖获得者除外）。【注意事项】同样的答案，每人只能发一次PS：该贴浏览权限为“回贴仅作者和自己可见”，回复的版友仅能看到版主的题目及自己的回答内容，无法看到其他版友的回复内容。下午3点之后解除，即可看到正确答案、获奖情况及所有版友的回复内容。=======================================================================颈痛颗粒中三七皂苷、人参皂苷的检测样品制备制备方法1. 对照品：取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品和三七皂苷R1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每 1 mL含人参皂苷Rg1 0.5 mg、人参皂苷Rb1 0.5 mg、三七皂苷R1 0.1 mg的混合溶液，即得。2. 供试品：取装量差异项下的本品适量，研细，取约1.3 g，精密称定，加乙醚40 mL，加热回流30分钟，滤过，弃去乙醚液，药渣及滤纸挥尽乙醚，再精密加入甲醇40 mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，回收溶剂至干，残渣加水10 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次10 mL，合并正丁醇提取液，用2%碳酸钠溶液洗涤2次，每次20 mL，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20 mL，取正丁醇液回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。分析条件色谱柱Platisil ODS 250 x 4.6 mm，5 μm (Cat#：99503)流动相A：水 B：乙腈 梯度流速1.0 mL/min柱温30 ℃检测器UV 203 nm进样量10 μL色谱图对照品 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/01/201601290942_583886_1610895_3.jpg 峰号 保留时间 min 峰面积 μV*s 峰高 μV 理论塔板数* N USP拖尾因子 分离度 1 36.408 264983 25847 265850.102 1.018 -- 2 38.915 1775914 178004 318998.439 0.998 8.983 3 54.506 1316933 127848 597818.242 0.870 55.926 *药典要求理论板数按三七皂苷 R1峰计算应不低于3000供试品http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/01/201601290943_583887_1610895_3.jpg 峰号 保留时间 min 峰面积 μV*s 峰高 μV 理论塔板数* N USP拖尾因子 分离度 1 36.344 250230 25147 274216.739 0.996 --

液相质谱方法优化了很长时间，样品处理办法由开始的沉淀蛋白换成了液液萃取，还是在血浆中没有检测到。该化合物分子量为785.6，我的MRM是+,即807.6-627.5我看到文献有做成功的，可含量也很低Cmax=16ng，请问是黄芪甲苷在大鼠胃内被酸化了吗？还是有别的原因？灌胃液中含黄芪甲苷大于1mg/mL。[img=,555,239]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/03/201903211951256531_6859_3255306_3.jpg!w555x239.jpg[/img]