细胞松弛素对照品

冷冻保存技术是将细胞长期维持在稳定的状态，从而应用于各种疾病的诊断和治疗。据1970年代以来的研究显示，多种类型细胞冷冻保存后的存活率会随着冷冻速率的不同而不同。大多数种类细胞的存活率与冷冻速率呈倒U形关系：即当超过最佳冷却速率后，细胞存活率随冷冻速率的增加而迅速下降，当低于最佳冷却速率时，细胞存活率随冷冻速率的降低而迅速下降。在快速冷冻速率下，细胞内的冰晶形成（Intracellular ice formation，IIF）会对细胞造成损害，并随着冷冻速率的增加导致细胞活性丧失。然而，IIF的机制仍无定论，目前业内存在的主要有以下三个假设：（1）Mazur假设称细胞外冰晶可以穿过膜孔生长进而诱导细胞内冰晶形成；（2）Asahina则认为冷冻直接破坏细胞膜是导致IIF的原因；（3）Toner等人则提出表面催化形成晶核是造成IIF的原因。　　传统低温光学显微镜技术是有限的，高速图像采集和双光子显微镜可以提高观察细胞冷冻的空间和时间分辨率，虽然可以在低温下观察细胞反应，却不能与每个细胞的活性相关联。显微拉曼光谱技术可对细胞进行无标记检测，并可用于细胞内水的热力学状态（即液态水与冰）等化学属性进行识别，因此可作为探究细胞冷冻反应的有力工具。此外，显微拉曼光谱的高空间分辨率和可区分细胞膜、线粒体等亚细胞结构的能力意味着该工具可用于进一步探究IIF及其成因，并通过拉曼光谱能够直接表征IIF对细胞活性的影响进而判别冷冻细胞后的活性。　　明尼苏达大学研究团队在Biophysical Journal发表题为“CharacterizingIntracellular Ice Formation of Lymphoblasts Using Low-Temperature RamanSpectroscopy”的研究成果（图1）[1]。研究结果表明显微拉曼光谱技术可用于研究细胞在不同冷冻速率和冷冻液成分下的冷冻反应。通过拉曼光谱发现胞内冰晶形成并不一定会导致细胞死亡，但细胞内冰晶的数量及大小会影响细胞活性。另外研究还发现，细胞内冰晶形成靠近于细胞膜并靠近于细胞外冰晶，而通过增加细胞膜和细胞外冰晶间的距离可以减少IIF；实验使用细胞松弛素D破坏肌动蛋白细胞骨架以改变细胞膜的渗透性来增加胞内冰晶形成量，当存在胞内冰晶时，可以显著的观察到细胞内渗透梯度，这些观察结果揭示了细胞膜与胞外冰晶的相互作用是导致IIF的原因。图1 研究成果（图源：[1]）　　此项研究选用Jurkat细胞作为淋巴细胞的模型细胞，采用的共聚焦显微拉曼系统Alpha 300R配备：UHTS300光谱仪、600 l/mm光栅以及DV401 CCD检测器。激发光源波长为532 nm，100×物镜(NA=0.9)，聚焦在被测物上的光功率为10mW，显微分辨率约为296 nm。将细胞冷冻至-50℃，并在成像前保持20分钟。每幅图像有60×60个像素，每个像素点采集的积分时间为0.2秒，因此，对整个细胞进行成像总共需要12分钟。分别在第20、80和140分钟时对相同细胞进行拉曼光谱成像采集，以排除来自激光照射带来的光损伤/光漂白的热量影响。　　单细胞中细胞色素c的分布被作为冷冻状态下细胞活性的衡量标准，其拉曼成像结果与台盼蓝染色结果高度一致。细胞色素c的空间分布使用 Moran' s I量化，并被用作细胞活性的标记。Moran' s I是一种基于信号位置和强度的进行空间相关性度量的方法，其值为-1时表示信号完全分散，+1时表示信号完全相关，0时表示信号随机分布。细胞色素c在750、1127、1314和1585 cm-1处具有强烈的拉曼信号，本实验以1127 cm-1作为标记峰用于生成细胞色素c的拉曼成像，并通过吖啶橙/碘化丙啶（Acridine orange/Propidium iodide，AO/PI）染色验证解冻后细胞的活性。根据常见的细胞内、外物质的特征峰位置（表1，图2），整合每个像素的光谱来组合拉曼成像，表征冰晶的大小、冷冻保护剂的细胞内浓度以及外部冰与细胞膜的接近程度。表1 拉曼光谱的波数分布数据来源：[1]∣制表：生物探索编辑团队图2 不同物质的拉曼光谱（图源：[1]）　　注：1)海藻糖；2)葡聚糖；3)DMSO；4)=细胞色素c；5)冰；6)冷冻保存在10% DMSO中的Jurkat细胞。根据左边的特定信号渲染出右边图像，并以光学显微镜图像为参考。　　结果发现：1　　细胞色素c的拉曼光谱可表征细胞复温后活性　　解冻后细胞复苏率与冷冻速率的之间的函数绘制曲线呈倒U形，可知“最佳”冷冻速率为1-3℃/min，当冷冻速率高于该曲线时认为是过快的，并会与IIF相关（图3A）。在冷冻细胞的不同焦平面上获得的拉曼成像显示，细胞中间（中心）的细胞色素c图像提供了最强的信号（图3B）。台盼蓝染色阴性细胞（活细胞）的细胞色素c局部拉曼信号强且最低Moran' s I值为0.65，而台盼蓝染色阳性细胞（死细胞）没有可区分的细胞色素c拉曼峰（图3C）。因此，可使用0.65的Moran' s I值作为区分活细胞和死细胞的阈值水平。图3 Jurkat细胞活性的拉曼检测（图源：[1]）　　注：（A）在10% DMSO中冷冻Jurkat细胞后的复苏率与冷冻速率的函数曲线图。（B）冷冻细胞在三个不同深度焦平面上细胞色素c的拉曼成像。（C）通过拉曼光谱检测冷冻后Jurkat细胞的活性并使用台盼蓝进行验证，对应的细胞色素c的拉曼特征、拉曼成像和计算的Moran' s I值。2　　拉曼光谱可分析细胞内冰晶的形成　　拉曼光谱测定了细胞在1、10和50℃/min冷冻速率下的细胞活性：以1℃/min冷冻保存后的细胞中有80%是活的，以10℃/min冷冻保存后的有60%的细胞是活的，而以50℃/min冷冻保存后的只有20%的细胞是活的（图4A）。每个细胞内冰的相对量可以根据冰的横截面积与细胞的横截面积的比值（Aic）来估计。Aic与不同冷冻速率相关性函数（图4B），Aic随着冷却速率的增加而增加。统计Aic与Moran' s I值的函数曲线图，结果表明活细胞中的冰晶比死细胞少，但存在群体上的差异（图4C）。图4 不同冷却速率下细胞内细胞色素C和冰晶的分布（图源：[1]）3　　基于拉曼图像可计算IIF的冰晶尺寸及位置　　在不同冷冻速率下，大多数细胞仅存在小冰晶。图5 细胞内冰晶的拉曼成像（图源：[1]）4　　拉曼图像可表征冰晶、细胞膜和IIF的相互作用　　分别将细胞以10℃/min的冷冻速率在10% DMSO或10% DMSO+10%葡聚糖中进行冷冻保存。通过拉曼成像分析IIF和Aic，细胞通常存在于相邻冰晶之间的未冷冻溶液中（图6A）。实验观察指定了两个不同的区域：1）细胞外冰晶靠近细胞膜的区域；2）相邻冰晶之间的区域，其中细胞膜远离细胞外冰晶（图6B）。通过测量细胞和细胞外冰晶之间的未冷冻溶液的厚度来表示细胞膜与细胞外冰晶的接近度（图6C）。图6 在10% DMSO或10% DMSO+10%葡聚糖中冰和Aic的拉曼图像（图源：[1]）5　　拉曼验证破坏细胞骨架增加了细胞内冰晶的形成量　　质膜不是孤立地起作用，而是与细胞中的其他结构相互作用，特别是细胞骨架。为了确定破坏膜结构对IIF的影响，将Jurkat细胞放置于50以及250μM细胞松弛素D（Cytochalasin D，CD）中培养30分钟，然后在10% DMSO中以10℃/分钟的速率进行冷冻。对于存在CD的实验，在10个细胞中有2个中观察到大块冰晶（图7A）。约83%的细胞靠近细胞膜存在比例很高的细胞外冰晶，其中带有大块冰晶的细胞确认死亡，而带有小冰晶的细胞部分死亡部分存活。细胞内冰晶与细胞膜的空间定位确证在细胞外冰晶附近（图7B）。在所有实验条件下，IIF的细胞比例相同（100%），但结果显示Aic会随着CD浓度的增加而显著增加（图7C）。图7 细胞松弛素破坏细胞骨架对IF的影响（图源：[1]）此项研究证实了拉曼光谱技术可用于研究细胞在不同冷冻速率、不同冷冻保护剂下的冷冻反应。此外研究还表明了IIF靠近于细胞膜，特别是与细胞外冰晶相邻的位置。随着靠近细胞膜且与胞外冰晶相邻的比例增加，IIF比例也会增加，并且随着细胞膜和胞外冰晶之间的距离减小，IIF比例也会随之增加，这些结果表明细胞膜和细胞外冰晶之间的相互作用是造成IIF的原因。该研究还进一步了解了冷冻保护剂的潜在作用机制，但是，研究中无法通过拉曼技术将细胞骨架与细胞内其他蛋白质成分区分开来，因此也无法明确IIF是否会损害细胞骨架。

在纤维纺丝、薄膜拉伸和塑料注塑成型加工过程中，聚合物结晶一般都发生在高速取向变形过程中，这一过程还伴随着聚合物的应力松弛。因此聚合物结晶、取向和松弛这三种非平衡动力学过程相互竞争，对应的调控因素例如加工温度、应变速率和拉伸应力就共同决定着聚合物材料制品最终的半结晶织态结构及其综合性能。在国家自然科学基金委的项目支持下，南京大学胡文兵课题组在采用动态蒙特卡洛分子模拟研究应变诱导聚合物结晶微观机理方面近年来取得了一系列的进展。分子模拟结果揭示了应变诱导结晶成核阶段所存在的分子内链折叠成核和分子间缨状微束成核之间的竞争关系（Polymer, 2013, 54, 3402）以及结晶成核、晶体生长和后生长三个阶段不同的链折叠变化趋势及其微观机理（Polymer, 2014, 55, 1267）；研究还推广到双链长分布聚合物（Chin. J. Polym. Sci., 2014, 32, 1218），无规共聚物（Soft Matter, 2014, 10, 343 Eur. Polym. J., 2016, 81, 34 Polymer, 2016, 98, 282），溶液聚合物（J. Phys. Chem. B, 2016, 120, 6890），结晶/非晶共混物（J. Phys. Chem. B, 2016, 120, 12988），外消旋共混物（J. Phys. Chem. B, 2018, 122, 10928）和短链支化聚合物（Polym. Int., 2019, 68, 225）等复杂多组分体系。最近，他们将麦克斯韦应力松弛模型引入到每条高分子链中。分子模拟结果揭示了非晶聚合物应力松弛的熵势垒微观机制（Chin. J. Polym. Sci., 2021, 39, 906）以及聚合物重复单元结构间各种局部相互作用对链扩散势垒的贡献（Polymer, 2021, 224, 123740），他们甚至还发现了低温区非晶聚合物非线性粘弹性的微观发生机制（Chin. J. Polym. Sci., 2021, 39, 1496）。他们进一步对比了引入和不引入应力松弛的聚合物拉伸结晶过程，如图1所示，发现应力松弛在结晶成核、晶体生长和后生长阶段三个阶段都发挥了独特的作用。图1：没有应力松弛（Strain-induced）和引入应力松弛（Stress-induced）的聚合物应变诱导结晶对比示意图。在结晶成核阶段，聚合物的取向变形减小了构象熵，提升了聚合物的平衡熔点，导致结晶成核的过冷度，即热力学驱动力增强，于是结晶的起始应变随温度升高而变大。增大应变速率，聚合物链内调整这一动力学效应将推迟结晶成核的发生，结晶的起始应变也相应变大。一开始他们合理地猜想应力松弛将削弱聚合物的取向变形程度，给热力学上带来不利于结晶成核的作用。由于在高速拉伸过程中应力松弛的时间窗口很小，对聚合物取向变形程度的影响较为有限，实际的模拟结果显示这一热力学效应并不明显。实际上引入应力松弛对结晶起始应变的影响与增大应变速率的效果相似，即在高温区都不改变结晶的起始应变，说明聚合物来得及链内调整；在低温区都增大了结晶的起始应变，说明应力松弛对结晶主要起到了动力学阻滞效应，而不是预期的热力学削弱效应。在晶体生长阶段，由于折叠链片晶生长动力学主要由链内次级成核机理所控制，应力松弛同样在动力学上阻滞晶体生长。于是，应力松弛显著减缓了拉伸过程中结晶度随应变增大而提高的动力学过程，导致在相同应变程度下，引入应力松弛的结晶过程所能达到的结晶度相对较低。在后生长阶段，聚合物晶体发生应变诱导的熔融重结晶过程。在这一过程中晶体的折叠链被迫打开转变为伸直链，片晶转化为纤维晶，对应于半结晶聚合物冷拉的细颈化过程。分子模拟观察到熔融重结晶带来显著的应力松弛加速现象，证明外力做功迫使折叠链晶体熔化，然后以重结晶生成伸直链纤维晶的形式将外界冲击能转化为热能耗散到周边的环境中去，从而使得半结晶聚合物表现出优异的韧性特点，不同于金属和陶瓷材料。这一阶段应力松弛与增大应变速率对结晶形态的影响有所不同：在其它条件相同时，应力松弛显著减少晶粒的数目，而增大应变速率显著减小晶粒的尺寸，如图2所示。图2：不同拉伸速率下应变诱导与应力诱导结晶的晶区形貌快照，20000对应于相对慢速的拉伸应变过程，5000对应于中速应变。这项工作揭示了聚合物应力松弛、拉伸变形和结晶这三个非平衡过程之间在聚合物取向结晶过程中的微观相互竞争机理，有助于更好地理解实际聚合物高速取向加工成型过程中的高分子结晶行为以及各种加工因素对半结晶聚合物制品内部结构和性能的调控机制。相关成果发表在Polymer（2021, 235, 124306）。论文的第一作者是博士生罗文。文章链接：https://doi.org/10.1016/j.polymer.2021.124306

本文作者：王文会 清华大学精仪系 长聘副教授王文会，清华大学精仪系长聘副教授，博士生导师，入选国家海外高层次人才引进计划青年项目。主要从事微操作器件和系统、机器人自动化技术、及其在生命科学仪器领域的应用研究工作。项目来源包括国家重点专项、科技创新2030—“脑科学与类脑研究”重大项目、国家自然科学基金仪器项目、面上项目等；在Small，Lab Chip，Small Methods，Biosensors and Bioelectronics，Analytical Chemistry，IEEE Trans等期刊上发表50多篇SCI论文，获得授权发明专利12项（包括2项美国专利）。近年的研究兴趣在于单细胞操控和理化特性表征技术、系统及应用。清华大学王文会教授团队在阻抗流式细胞术上取得系列进展对单细胞生物特性的表征有助于揭示细胞的基本结构、功能信息及其病理状态，基于单细胞的研究可以更深层次揭示生命的本质和规律，对生命科学研究、疾病诊断和个性化医学意义重大。细胞内的生理变化常伴随着化学和物理修饰重组，可以通过生物化学和生物物理的方法对单细胞进行表征。生物化学方法通常利用生化标记识别细胞及其状态，特异性高，但是需要先验知识且检测成本高。而生物物理方法利用细胞的机械、电学等固有表型特征，能够实现对单细胞的快速无创无标记表征，方便对细胞进行后续操作如分选、培养和组学分析等。目前，单细胞生物物理特性表征已有不少经典方法，如原子力显微镜、光镊和膜片钳等，提供了有效的手段，但是这些技术检测流程繁琐、系统复杂且通量低。而作为一种能够精确操控微尺度流体的新兴手段，微流控技术所需样本体积小、生物相容性高且响应速度快，使得其成为当前单细胞研究中不可或缺的工具。微流控技术不断地应用于单细胞生物物理表征。在电学特性方面，研究者已成功利用电旋转、电阻抗谱和阻抗流式技术测量细胞膜电容等电学参数；在机械特性方面，研究者基于诱导变形原理，成功利用光、机、电、声等物理场实现对细胞杨氏模量等机械参数的测量。从Coulter计数器发展而来的阻抗流式细胞术IFC具有通量大的优势，在技术和应用上取得了很大的进展，但在提取单细胞的本征参数方面还存在低效、解算慢、模态单一、准确性未知、易堵塞等问题。基于常用的电阻抗流式器件结构和测量架构（图1），清华大学王文会教授团队近年在解决以上这几个问题方面取得了一系列进展。图1. 阻抗流式细胞术基本架构针对单细胞本征特性是否可用阻抗流式表征的问题，利用最小流阻流体捕获原理（Lab on a Chip, Outside Front Cover, 2021, 2486-2494 Lab on a Chip, Outside Back Cover, 2016, 4507-4511），设计U型微流道结构（图2），可以使同一个细胞以流式流经一组IFC电极后，到达设有另一组EIS电极的捕获点位。在两组电极处分别进行阻抗流式测量和阻抗谱测量，结果发现离散的阻抗流式数据点与阻抗谱数据吻合度极高，在三个量级的流速（10-1000 nL/min）下，其相对偏差5%，证明了阻抗流式术可以替代阻抗谱实现对单细胞阻抗本征参数的提取，同时该结构也允许流式和阻抗谱测量同时进行，实现在通量和准确性上的相互补充（Analytical Chemistry, 2019, 91(23): 15204）。图2. 阻抗流式细胞术与阻抗谱互补针对电学本征参数的计算往往通过复杂的生物物理模型离线拟合，耗时较长，难以满足下游操控分析环节的实时在线需求的问题，提出了神经网络赋能的实时在线电学本征参数提取技术，基于神经网络实现对单细胞电学本征参数的加速求解（图3）。相比传统的梯度拟合计算方法，单细胞事件的推理时间约为0.3 ms，速度提升了10000倍，在实验部署中，电学本征参数测量通量接近100/秒。获得的本征参数用于细胞分类，可将准确率从不到80%提升到93%。通过让同一批细胞来回往复测量区进行十次电学测量，本征参数的变化4%；对细胞的染色与培养表明，细胞仍保持活性且增殖率和控制组的细胞没有特别明显的差别，证明电学表征不会显著影响细胞活力（Lab on a Chip, Outside Back Cover & 2021 Hot Articles, 2022, 240-249）。图3. 神经网络加速求解细胞电学本征参数针对阻抗流式通常只求解电学特性参数的局限，提出基于阻抗数据的电学-机械双模态本征参数提取技术（图4）。利用流道结构和电极的空间耦合以及阻抗测量的高时空分辨率特性，使阻抗信号同时包含细胞电学特性及通过收缩通道过程中挤压的动态形变信息。通过构建电阻抗-细胞形变映射模型，发现测量电阻与细胞伸长量成正比，从而能够将测得的阻抗信号定量映射到细胞机械形变。同时采用分时复用传感策略，利用差分传感信号将电脉冲和幂律时变阻抗信号以分时复用的方式集成，从而实现单细胞电学-机械双模态本征特性表征。在不需要使用相机的情况下，仅使用阻抗数据后，测量的通量大幅提高。通过获得的数据，首次发现1 μM级浓度的细胞松弛素可能是诱导处理细胞骨架发生显著变化的阈值。针对常用的细胞分类任务，基于神经网络利用电学-机械双模态本征参数实现了明显高于基于单一电学特性和机械特性的93.4%高分类准确率，相比电学和机械特性分类准确率的绝对值分别提高了12.3%和5.1%，说明单细胞生物物理特性的多模态测量能够更特异地对细胞进行表型分析（Small Methods, Back Cover, 2022, 6(7), 2200325 Small, Frontispiece, 2023, DOI: 10.1002/smll.202303416）。图4. 使用电阻抗同时求解电学-机械学本征特性参数针对单细胞电学表征准确性未知的不足，利用辛醇辅助脂质体组装方法合成了类细胞大小的脂质体，以脂质体作为单壳模型粒子，结合阻抗测量芯片与测量系统构建了测量平台，提出了单细胞电学模型测量准确性评估和相应的补偿技术（图5）。研究发现，当传感区尺寸接近被测粒子时，通过模型拟合得到的电学本征参数与真值的相对误差小于10%，此时电极间距与流道宽度主要通过影响测量体积分数而对测量准确性产生影响，从而基本验证了单细胞电学测量模型的准确性。但是由于电学测量模型通过对流道中间高度电场强度进行建模计算，共面电极产生的电场在流道高度方向的不均匀衰减将导致流道高度对电学模型测量准确性的影响最大，测量相对误差高达30%（ACS Sensors, 2023, 8(7), 2681–2690）。而这种误差，可以通过在流道中设计合适的电极，将粒子的空间位置与电极上的响应信号对应起来（Analytical Chemistry, Supplementary Cover, 2023, 95(15), 6374-6382）。这样，通过响应信号，推导出粒子的瞬间空间位置，代入对应的电学模型中，即可实现更为准确的单细胞电学特性测量。图5. 合成类细胞脂质体评估电阻抗测量的准确性及位置误差估计针对窄流道电阻抗易堵塞的问题，提出了在阻抗流式术中使用非导电粘性鞘液的方法（图6）。此前的研究还没有搞清使用流道和鞘液在阻抗测量方面的准确性是否有变化，以及使用什么样的鞘液性能更好。因此，首先在流道MC和鞘液SC上下游两处布置了电极测量阻抗，发现文献中报道过的辛醇和去离子水表现不一样，其中去离子水作鞘液时，阻抗准确性降低显著，而辛醇则变化不大。由此推断鞘液-主流道溶液界面的稳定性至关重要。通过使用具有不同粘性的PEG溶液作为鞘液，实验证明粘性越高，鞘液-主流道溶液界面的稳定性越高，准确性越高。此外，PEG溶液还能让阻抗测量的信噪比（1.42x）、灵敏度（7.92x）都有所提升，在半小时的实验中没有观察到堵塞或堵塞的迹象。从获得的电阻抗信号中解算出细胞电学参数，并用于典型的细胞分类应用，其准确度可达93%，与不使用鞘液的阻抗流式取得的最好表现相当（Lab on a Chip, Inside Back Cover, 2023, 23, 2531-2539）。图6. 使用非导电粘附鞘液提升电阻抗测量性能以上这些进展，丰富了阻抗流式细胞术的技术体系，提出的技术和方法对平台的架构关系并不是紧密耦合，其适用性较为宽广，可在阻抗流式细胞术的不同平台实现中灵活选用。致谢：感谢国家自然科学基金的资助，NSFC (no. 62174096, 52105572)。

将小分子、核酸、蛋白质和药物导入细胞是监测和了解细胞行为以及生物功能的重要途径。然而，质膜是阻止外源分子进入细胞的生物屏障。因此，如何在保持细胞活力的同时高效地将外源分子递送到细胞中是细胞生物学领域的一个重要课题。为了克服现有大规模细胞内递送方法的弱点，例如细胞活性和递送效率不一致，主要基于膜破坏介导机制的微技术已成为一种有前景的解决方案。利用化学质膜穿孔进行单细胞递送的尚未得到广泛研究。2024年4月26日，清华大学化学系林金明教授团队在《ACS Applied Materials & Interfaces》杂志在线发表了题为“Chemical Plasma Membrane Perforation Generated by a Microfluidic Probe for Single-Cell Intracellular Protein Delivery”的工作。该研究使用微流控探针将含有毛地黄皂苷和货物的溶液精确地作用到单细胞上。毛地黄皂苷与质膜中的胆固醇结合诱导质膜穿孔，货物通过孔进入细胞。碘化丙啶 (0.67 kDa) 和 FITC-葡聚糖 (10、40 和 150 kDa) 可以在3分钟内成功引入单细胞，同时保持细胞活力。两种蛋白质（细胞色素C和亲环素A）被递送进入细胞，并观察到它们在细胞中得生理功能。图1. 微流控探针诱导单细胞化学质膜穿孔首先，利用Comsol Multiphysics软件对微流控探针形成的微区域进行数值模拟。使用荧光素（扩散系数=500 μm2 /s）来指示溶质扩散。结果表明，注入的溶液可以被完全吸出，并且溶质被限制在液滴状微区域内而不会扩散。微区内溶质浓度分布均匀。计算了基质上的剪切应力，低剪切应力不会对细胞造成额外的机械损伤。实验在与模拟相同的条件下进行，使用荧光素显示微流控探针产生的微区域，与浓度分布模拟结果一致。溶液的连续流动使微区中毛地黄皂苷和货物的浓度几乎恒定，有利于维持递送过程的连续性和稳定性。图2. 流体的数值模拟通过微流控探针进行碘化丙啶（PI）的细胞内递送来验证该方法的可行性以及优化递送条件。尝试使用 20-100 μg/mL 毛地黄皂苷将 PI 递送至U87细胞。随着毛地黄皂苷浓度的增加，ts（PI开始进入时间）和tm（PI进入速度最大时间）逐渐减少，表明细胞穿孔加速。当毛地黄皂苷浓度为60 μg/mL时，ts约为20 s，1 min内即可观察到清晰的荧光。此外，还尝试了不同的PI浓度进行细胞内递送，较高的PI浓度也使得PI能够更快地进入细胞。还测试了流速对递送结果的影响。注入流量保持2 μL/min，抽出流量在6~14 μL/min之间调整。当抽吸流速大于8 μL/min时，进入细胞的PI量随着流速的增长而显着增加。图3. 毛地黄皂苷浓度、PI浓度和流速对细胞内递送的影响为了证明该方法的效率和通用性，使用该方法将PI递送至U87、HUVEC和A549细胞。当递送时间为20秒时，三种类型的细胞几乎不发出荧光。随着递送时间逐渐增加，细胞的相对荧光强度显着增加，递送处理50 s后观察到强烈的红色荧光。由于洋地黄皂苷的作用，质膜逐渐透化，PI通过质膜上形成的孔继续进入细胞。还检查了该方法递送大分子的能力，使用不同分子量（10、40和150 kDa）的 FITC-葡聚糖作为货物。FITC-葡聚糖可以在3min内进入细胞，并且FITC-葡聚糖进入的量随着递送时间的增加而增加。图4. PI和FITC-葡聚糖递送的结果在验证了这种方法用于单细胞胞内递送的可行性后，作者尝试了细胞内蛋白质递送。Cyt C ( Mw = 13 kDa) 是线粒体中的一种蛋白质，可将电子转移到呼吸链以维持ATP的产生。当cyt C释放到细胞质中时，它会引发细胞凋亡。由于外源cyt C在正常情况下不能进入细胞，利用微流控探针将cyt C递送至A549中作为抗肿瘤药物以诱导细胞凋亡。对照组和仅用毛地黄皂苷或cyt C处理的细胞之间未观察到caspase-3水平和Hoechst 33342染色结果的显着差异。毛地黄皂苷诱导的质膜穿孔不会引起细胞凋亡。仅用cyt C处理的细胞中caspase-3的水平也没有增加，表明正常情况下cyt C不能穿过质膜进入细胞激活凋亡途径。然而，在进行毛地黄皂苷介导的cyt C递送的细胞中，caspase-3水平显著增加，蓝色荧光显著增强。细胞形态发生明显变化，细胞体积缩小，并形成凋亡小体。这些结果表明，递送的cyt C成功诱导细胞凋亡，并且外源蛋白可以通过微流控探针有效地引入细胞内并发挥作用。图5. Cyt C被递送至A549以诱导细胞凋亡为了进一步探索这种方法在细胞研究中的潜力，作者利用它来研究肿瘤耐药性。CypA (M w = 18 kDa) 是一种广泛存在的细胞内蛋白质，可充当抗氧化剂。最近有报道称CypA通过重塑细胞氧化状态介导结直肠癌耐药。BCNU是一种常用的抗肿瘤药物，其诱导细胞毒性的机制之一是谷胱甘肽还原酶的抑制导致ROS的积累。利用微流控探针将CypA递送到U87中，研究CypA对胶质瘤耐药性的影响。与对照组相比，未经CypA递送的细胞经BCNU处理1小时后ROS水平显着升高，并且细胞形态发生改变。对于递送CypA的细胞，ROS含量显着低于未递送细胞，并且细胞保持正常形态。结果表明，递送的CypA在细胞中具有抗氧化作用，这可能增强U87对BCNU的耐药性。抑制CypA表达可能是治疗神经胶质瘤的潜在方法。图6. CypA对胶质瘤耐药性的影响总结作者开发了一种基于开放式微流控探针的方法，以方便高效地实现单细胞递送。该方法通过使用化学试剂对单个细胞进行质膜穿孔，将最大分子量为150 kDa 的外源货物递送到细胞中。与载体介导或场辅助递送方法相比，该方法不需要对货物进行额外处理，无需物理场辅助的温和递送条件也避免了对货物和细胞的额外损伤。作者展示了使用微流控探针进行cyt C和CypA的细胞内递送，证明了该方法能够研究外源蛋白质对细胞生命活动的影响。未来，各种货物（肽、蛋白质、mRNA、DNA、质粒、细胞器等）可以通过这种方法导入细胞内，调节细胞的生理功能和命运。而且该方法不需要昂贵的设备，操作简单，有望成为单细胞递送的一种理想方法。清华大学化学系林金明教授为该论文的通讯作者，清华大学化学系2022级博士生宋扬为本论文的第一作者。该研究受到国家重点研发计划（No.2022YFC3400700）和国家自然科学基金（No.22034005）的支持。关于林金明教授工学博士，分析化学专业。1984年福州大学毕业，1992年在日本昭和大学国际交流基金的资助下前往该大学药学部从事访问研究。1994年获得日本政府奖学金转入东京都立大学攻读博士学位，1997年3月获得工学博士学位，同年留校任教，2000年入选中国科学院“百人计划”，受聘中科院生态环境研究中心研究员、博士生导师；2001年获得国家杰出青年科学基金，2002年3月底回国工作，2004年入选清华大学“百名人才引进计划”，受聘清华大学化学系教授、博士生导师。2008年受聘教育部长江学者特聘教授,2014年入选英国皇家化学会会士。目前主要从事微流控芯片质谱联用细胞分析、化学发光/荧光免疫分析、复杂样品前处理分析、空气负离子检测与健康评估等研究。已培养博士研究生43名（含联合培养，其中留学生2名）、硕士研究生28名、博士后11名（其中留学生3名）、访问学者10名（其中外国访问学者1名）。

护肤品中活性成分玻色因的分析检测秦旭阳 金燕玻色因（Pro-xylane，羟丙基四氢吡喃三醇）是一种从木糖衍生而来的糖蛋白混合物，而木糖大量存在于山毛榉树中，因此玻色因最初是从山毛榉树中提取分离得到的。玻色因通过促进胶原蛋白合成来增加皮肤弹性。皮肤会随着衰老而逐渐失去弹性，细胞的活性也开始下降，降低或不再生成促进胶原蛋白的合成。而玻色因可以激活粘多糖的合成，促进IV型和VII型胶原蛋白的合成，通过这种促进合成，增加胶原蛋白纤维数量，使我们的表皮层和真皮层更加稳固，紧密，让皮肤重新变得饱满充盈，变得更加紧致和富有弹性。 玻色因还可以通过刺激葡萄糖胺聚糖（GAGs）的合成来改善皮肤皱纹。皮肤细胞外基质中的GAGs以网状结构存在，可防止皮肤水分流失，连接皮肤中的各组织，维持皮肤的弹性和紧致。随着皮肤衰老，合成GAGs的能力不断下降，导致皮肤松弛，产生皱纹。而玻色因可以刺激葡萄糖胺聚糖（GAGs）的合成来改善皮肤弹性、有效缓解皮肤皱纹。 研究发现玻色因改善皮肤弹性和缓解皮肤衰老的功效，因此化妆品企业便进行大规模的人工合成，并添加进各种护肤品中，深受广大消费者的欢迎。 由于玻色因没有紫外吸收，一般采用通用型检测器进行检测。同时护肤品的基质较为复杂，容易产生干扰，因此对检测器灵敏度有着较高的要求。而CAD电雾式检测器作为新型通用型检测器，较传统紫外检测器、ELSD检测器等有着独特的优势：分析物既不需要发色团也不需要离子化，适用于不挥发及半挥发化合物的高灵敏度检测。CAD检测器有更高的灵敏度、更宽的线性范围、更好的重现性，非常适合作为主要检测手段。本实验利用Vanquish Core液相色谱系统和Charged Aerosol Detector H电雾式检测器来分析护肤品中的玻色因。 仪器配置：Vanquish Core系列泵：Quaternary Pump C自动进样器：Split Sampler CT柱温箱：Column Compartment C检测器：Charged Aerosol Detector H 色谱条件：分析柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E 4.6 mm×250 mm，5 μm柱 温： 30℃CAD检测器参数：过滤常数：3.6s，雾化温度：50℃，采集频率：5Hz流动相：乙腈:水（85:15）流速：0.8mL/min进样量：5µL稀释溶剂：乙腈:水（50:50） 实验结果与讨论：玻色因是由两个非对映异构体组成的混合物（Isomer 1和Isomer 2），故CAD图谱表现为两个峰。玻色因对照品色谱图Isomer 1和Isomer 2在0.0586~1.172mg/mL范围内线性良好，相关系数R2 0.999。对照品溶液连续进样5针，其中 Isomer 1峰面积RSD为1.94%，Isomer 2峰面积RSD为2.31%。本方法Isomer 1和Isomer 2检测限为0.0586mg/mL (S/N4)，定量限为0.1172mg/mL(S/N10)。对照品检测限色谱图样品前处理简单，样品经溶剂稀释后可直接进样分析。两种护肤品精华液色谱图由实验结果可知，本方法利用CAD电雾式检测器检测护肤品中的玻色因，样品前处理简单，灵敏度高，分离度和重复性好，抗干扰能力强，适合常规的产品质量控制。

一、摘要：1型糖尿病是一种会导致胰腺β细胞破坏的自身免疫性疾病，需要终身胰岛素治疗。胰岛移植提供了一个很有前途的解决方案，但也面临着诸如可用性有限和需要免疫抑制等挑战。诱导多能干细胞（iPSCs）为功能性β细胞提供了一个潜在的替代来源，并具有大规模生产的能力。然而，目前的分化方案，主要是在混合或2D环境中进行的，缺乏可延展性和悬浮培养的最佳条件。我们研究了一系列可能影响分化过程的生物反应器放大过程参数。该研究采用了一种优化的HD-DoE协议，该协议设计具有可扩展性，并在0.5L（PBS-0.5 Mini）垂直轮式生物反应器中实现。我们开发了一种三阶段的悬浮生长过程，从贴壁培养过渡到悬浮培养，TB2培养基在规模化过程中支持iPSC的生长。阶段性优化方法和延长分化时间用于增强iPSC衍生的胰岛样簇的标记物表达和成熟。连续的生物反应器运行被用于研究营养和生长的限制以及对分化的影响。将连续生物反应器与对照培养基变化生物反应器进行比较，显示出代谢变化和更类似b细胞的分化谱。从试验中收集的低温保存的聚集物被恢复，恢复后显示出活力和胰岛素分泌能力得到维持，这表明它们具有存储和未来移植治疗的潜力。本研究表明，阶段时间的增加或限制培养基补充以减少乳酸积累可以增加在大规模悬浮环境中培养的胰岛素合成细胞的分化能力。二、实验内容节选：营养消耗和代谢物的分析 为了检测细胞潜在的替代碳源和氮源，我们分析了对照组和连续生物反应器在整个培养过程中的氨基酸代谢（图S5A-B）。使用快速培养基氨基酸维生素分析仪Rebel（908 Devices）来分析氨基酸浓度。必需氨基酸，如组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸在整个培养期间都保持不变。然而，一些氨基酸在两种培养基中都完全耗尽，包括5天后的L-天冬氨酸和16天后的L-谷氨酸。氨基酸代谢对正常的胰腺β细胞功能至关重要，丙氨酸和谷氨酰胺以其调节β细胞功能和胰岛素分泌的作用而闻名。在培养结束时，谷氨酰胺和丙氨酸的浓度高于新鲜培养基，表明它们不限制生长（图S5A-B）。然而，它们增加的来源仍然未知，不像之前的观察而将它们的增加归因于GlutaMAX&trade 添加剂。与起始培养基相比，丙氨酸和谷氨酰胺水平的升高在对照组生物反应器中没有观察到，后者在不同阶段之间和整个延长的内分泌诱导阶段都有频繁的培养基变化。两种生物反应器之间无其他显著性差异。如前所述，限制培养基补充的生物反应器比对照培养基变化的生物反应器具有更好的分化能力。氨基酸浓度调节和血清缺乏与促进来自人类干细胞的胰腺β细胞的发育有关。 此外，使用FLEX2（Nova Biomedical）对两种培养结果进行评估，分析两种反应器的整个培养期间Gln、Glu、NH4+、Na+、K+、Ca++、pH、PCO2和PO2（图S6A-B）。在连续生物反应器中，培养基的渗透压稳定增加，但保持在280-320mOsm/kg范围内。这种增加可以归因于由营养物质代谢和其他废物产生的溶质的积累。相比之下，对照培养基的渗透压变化的生物反应器随着培养基在细胞分化过程的不同阶段被补充而波动。谷氨酰胺和谷氨酸水平也进行了评估，两者都显示随着时间的推移而消耗。这与使用Rebel分析仪进行的测量结果一致。两种生物反应器在生物分化上具有可比性，除了在连续生物反应器中pH的持续下降和预期的耗氧速率方面的主要差异。在反应液中测量的气体可能会受到收集和测量之间时间的影响，但是，对所有样品的总体影响是相同的。总体数据显示，在培养10天或PP诱导分化阶段后，PO2水平开始稳步下降。尽管反应液与两个生物反应器顶空内的气体体积相同(500毫升），但与控制培养基补充变化生物反应器相比，进入反应液的氧气通量可能不足以补充0.5L连续容器中增加的耗氧量。文献来源：doi.org/10.21203

活体光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）技术与荧光（fluorescence）技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，今天，生物发光标记物可以标记到任何一种基因上，使对基因功能的全面细致研究成为现实。而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记，利用荧光蛋白在外源光源或是内源发光照射下被激发产生的荧光作为检测信号。研究人员能够利用一套非常灵敏的光学检测仪器直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。 该技术可被广泛应用于标记细胞或基因的示踪及检测；基因治疗在活体动物体内直接的观察和检测；基因组、蛋白组学、药学及生物技术在活体动物内的研究；药物及化学合成药物的药物代谢及毒理学监测；食品菌落生长成像；皮肤医学中皮肤疾病的体内成像；法医鉴定；微孔板成像，例如：免疫分析、报告基因、基因探针和嗜菌作用分析等；荧光团的体内成像，例如：Alzheimer疾病研究中结合嗪的β-淀粉沉淀物分析；转基因植物中通过报告基因对生理周期节奏的研究；凝胶成像分析等等。 但在研究过程中，研究者们必须事先用基因技术进行荧光素酶基因标记，或者某种荧光报告基团标记。目前活体光学成像系统的知名制造商，如Berthold、GE、Xenogen、Photometrics、Carestream Health等，不仅为客户提供先进的仪器，也提供具体实验所需的整套解决方案，包括试剂、实验手册、特殊用途的质粒、细胞株、转基因动物、细胞处理和动物处理设施等配套技术支持。出色的多任务处理能力，人性化的整体设计，便捷精确的操作系统，使实验室影像分析领域进入了一个全新的时代。 下面以研究干细胞活体移植后的存活率为例，简介一两种内源性荧光色素标记的实验方法，供专业人士参考。 用荧光色素DiD标记 间充质干细胞 1. 先用胰蛋白酶消化待标记材料，使之成为一定密度的悬浮液； 2. 从细胞培养箱中取出间充质干细胞，吸取含原有培养基的细胞悬浮液进行标记； 3. 用10 ml Mg/Ca-free PBS （不含钙镁离子的磷酸缓冲液）清洗细胞，吸去PBS， 钙镁离子会影响胰蛋白酶的活性，必须小心； 4. 加入预热的0.05% 胰蛋白酶液，加液量以T75型瓶为例，每瓶加5ml， 确保瓶的表面被完全覆盖； 5. 在细胞培养箱中37° C 孵育约 5 分钟； 6. 然后在显微镜下确认细胞已经完全分散，如果有细胞贴壁情况，轻拍若干次或延长孵育时间直至酶解消化完全成功； 7. 加入等量含 10% FCS的培养基中和胰蛋白酶； 8. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散； 9. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中； 10. 400 RCF离心5 分钟； 11. 小心移去上清液，不要扰动细胞； 12. 将细胞重新悬浮于DMEM 并进行计数； 13. 需要待标记细胞在无血清DMEM溶液中的密度应为1x106 /ml ； 14. 每ml细胞悬浮液加入5 ?L DiD 染色液； 15. 用移液器将染色液与细胞悬浮液混合均匀； 16. 在6孔低附着性细胞板上37 °C 孵育20分钟； 17. 孵育完全后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中； 18. 400 RCF离心5 分钟； 19. 小心移去染色液，不要扰动细胞； 20. 用PBS清洗细胞，用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散； 21. 重复洗三次； 22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性； 23. 可以进行活细胞成像了！ 用荧光色素ICG标记 人胚胎干细胞 1. 必须先准备好吲哚菁绿溶液（血容量、心输出量、肝功能测定剂）作为对照品 ，然后使之与转染试剂鱼精蛋白（抗凝血作用）混合； 2. 测出1ml吲哚菁绿溶液的活力，然后在100 ?L DMSO中溶解ICG； 3. 向混合物中加入 400 ?L Dulbecco的改良Eagles 培养基 (DMEM + 10% 胎牛血清)， 震荡均匀，吲哚菁绿溶液终浓度为2mg/ml； 4. 加入转染试剂鱼精蛋白，鱼精蛋白作为对照品的载体，使之能够有效进入细胞； 5. 在300 ?L ICG 和 300 ?L 无血清Dulbecco改良 Eagles 培养基中混入 5 ?L 硫酸鱼精蛋白溶液, 使之终浓度为 10mg/ml,； 6. 震荡5分钟使之形成复合物，标记溶液制备完毕； 7. 从 hESC 10mm Petri 培养皿中移去原有培养基； 8. 加入5ml预热的 DMEM； 9. 加入制备好的鱼精蛋白/ICG 溶液， 37 °C下孵育1h； 10. 孵育完全后移去染色液； 11. 用5 ml PBS漂洗培养皿以清除染色液； 12. 移去 PBS 再加入 5ml 0.25 % 胰蛋白酶液，37 °C下孵育5分钟使之酶解，适当震摇培养皿效果会更好； 13. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散； 14. 加入等量含 10% KSR的培养基中和胰蛋白酶； 15. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中，400 RCF离心5 分钟； 16. 在全培养基中悬浮细胞； 17. 如果还有细胞团块，可以移去原有培养基用10ml预热的全ESC培养基重新悬浮细胞，重复酶解再离心； 18. 在这一点上，鼠源饲喂细胞需从hESCs中分离； 19. 然后将细胞悬浮液移至涂布琼脂的10 cm 培养皿中； 20. 37 °C 孵育 45 分钟，注意不要晃动培养皿，如此鼠源饲喂细胞会贴壁而干细胞保持悬浮； 21. 从Petri 培养皿中移出已标记的单细胞人胚胎干细胞悬浮液； 22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性； 23. 可进行活细胞成像了！

胰岛素样生长因子(IGFs)是一种促有丝分裂的生长因子多肽，能刺激各种细胞，包括肌肉、骨和软骨组织在体外的增殖和存活。虽然多种组织可在不同时间产生IGFs，但是IGFs主要由肝脏产生。IGFs属于胰岛素基因家族，其中还包含胰岛素和松弛素(relaxin)。IGFs与胰岛素的结构和功能相似，但其促生长活性远高于胰岛素。IGF-II的表达受胎盘催乳素的影响，而IGF-I的表达受生长激素的调节。IGF-I和IGF-II都可以通过酪氨酸激酶I型受体（IGF-IR）传递信号，但IGF-II也可以通过IGF-II受体/甘露糖-6磷酸受体传递信号。成熟的IGFs由无活性的前体蛋白(含有N-末端和C-末端前肽区)经蛋白水解而得。重组人IGF-I和IGF-II为球状蛋白质，分别含有70和67个氨基酸，并均含及3个分子内二硫键。IGF-I LR3是人IGF-I的类似物，包含完整的IGF-I序列，但用精氨酸替代IGF-I第三位的谷氨酸，并在N末端加上13个氨基酸的延伸肽。 由于体外设计的高生物活性，IGF-I LR3在体内的半衰期比IGF-I长，而且更易与天然蛋白结合，使其非常适用于研究和大规模的培养。重组人IGF-I LR3是分子量为9.1 kDa，含有83个氨基酸残基的非糖基化单链多肽。可用于科研和大规模培养特异性地工程改造，较胰岛素有更高的促进生长活性半衰期长，更易与天然蛋白结合适合于多种类型细胞，如HEK293、CHO、成纤维细胞等提高重组蛋白产量产品名称 货号 规格 目录价(￥) Human IGF-I LR3 100-11R3-200 200 μg 960 Human IGF-I LR3 100-11R3-1000 1000 μg 2340 阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2014070013.html

药物的质量研究与质量标准的制订是药物研发的主要内容之一，药品标准物质也是质量标准和质量研究中不可分割的一部分，是药品质量标准的物质基础。药品标准物质在新药研究中与产品定性、杂质控制及量值溯源密切相关，标准物质的运用贯穿于质量研究与质量标准的制订工作中。一、概述标准品、对照品系指用于药品鉴别、检查、含量测定的标准物质，即药品标准中使用的具有确定的特性或量值，用于对供试药品赋值、定性、评价测定方法或校准仪器设备的物质，其中标准品系指用于生物检定、抗生素或生化药品中含量或效价测定的标准物质。《药品注册管理办法》规定“中国药品生物制品检定所负责标定和管理国家标准物质”，“申请人在申请新药生产时，应当向中国药品生物制品检定所提供制备该药品标准物质的原材料，并报送有关标准物质的研究资料”。但在新药研究中，普遍存在对照品（标准品）的应用超前于中检所制备和标定的情况，鉴于新药研究的连续性以及标准物质在新药研究中涉及量值溯源、产品定性、杂质控制及其在药品质量控制中的重要性，标准物质的制备和标定与药品的质量研究、稳定性研究乃至药理毒理学研究中剂量的确定等临床前基础研究间存在密切关系，因此，药品对照品（标准品）的研究（制备与标定）也是药品审评的一项重要内容。二、对照品来源1、所用对照品（标准品）中检所已经发放提供，且使用方法相同时，应使用中检所提供的现行批号对照品（标准品），并提供其标签和使用说明书，说明其批号，不应使用其他来源者；如使用方法与说明书使用方法不同（如定性对照品用作定量用、效价测定用标准品用作理化测定法定量、UV法或容量法对照品用作色谱法定量等），应采用适当方法重新标定，并提供标定方法和数据；若色谱法含量测定用对照品用作UV法或容量法，定量用对照品用作定性等，则可直接应用，不必重新标定。2、申报临床研究时，如中检所尚无供应，为不影响注册进度，可先期与中检所接洽制备和标定，申报时提供标定报告、标签（应标明效价或含量、批号、使用效期）和使用说明书；也可与省所合作标定，申报时提供标准品或对照品研究资料，“说明其来源、理化常数、纯度、含量及其测定方法和数据”；标定有困难时，可使用国外药品管理当局或药典委员会发放的对照品（标准品）或国外制药企业的工作对照品（标准品），进行标准制订和其他基础性研究，但应提供其标签（应标明其含量）和使用说明书，能保证其量值溯源性；也可使用国外试剂公司（如sigma公司等）提供的对照品（标准品），但应提供试剂公司该批对照品（标准品）的检测报告（用作含量测定时，应有确定的含量数据），如为高纯度试剂，提供了国外试剂公司检测报告（用作含量测定时，应有确定的含量数据）时，也可使用，并应能保证其量值溯源性，但申请人应及时与中检所接洽对照品（标准品）的标定事宜，临床研究期间完成此工作。3、直接申报生产品种，如中检所尚无供应，可参照2中要求进行，并提供相应研究资料，但申请人在标准试行期间应与中检所接洽并完成的标定事宜。三、对照品（标准品）标定的技术要求1、创新药物应说明对照品（标准品）原料的制备路线、精制方法、质检报告，提供理化常数和纯度的测定数据及分析结果（包括相关图谱），提供标定方法的研究和验证资料（如与原料药质量研究项下相同，可不再提供）、含量测定数据及经统计分析得到的对照品（标准品）含量结果，并说明进行临床前药学研究、药理毒理学研究所用样品的含量是否用该批对照品（标准品）确定或可用该批对照品（标准品）进行量值溯源。纯度测定方法应选用色谱法，并采用两种以上不同分离机理或不同色谱条件并经验证的色谱方法相互验证比较，同时采用二极管阵列检测器或其它适宜方法检测HPLC法的色谱峰纯度，而后根据测定结果经统计分析确定对照品（标准品）原料的纯度。对于组份单一、纯度较高的药物，对照品（标准品）标定方法宜首选可进行等当量换算、精密度高、操作简便快速的容量法。可根据药物分子中所具有的官能团及其化学性质，选用不同的容量分析方法，但应符合如下条件：（1）反应按一个方向进行完全；（2）反应迅速，必要时可通过加热或加入催化剂等方法提高反应速度；（3）共存物不得干扰主药反应，或能用适当方法消除；（4）确定等当点的方法要简单、灵敏；（5）标化滴定液所用基准物质易得，并符合纯度高、组成恒定且与化学式符合、性质稳定（标定时不发生副反应）等要求。标定方法的选择要关注如下事项：（1）供试品的取用量应满足滴定精度的要求（消耗滴定液约20ml）；（2）滴定终点的判断要明确，提供滴定曲线。如选用指示剂法，应考虑其变色敏锐，并用电位法校准其终点颜色；（3）为排除因加入其它试剂而混入杂质对测定结果的影响，或便于剩余滴定法的计算，可采用“将滴定的结果用空白试验校正”的办法；（4）要给出滴定度（采用四位有效数字）的推导过程。标定结果要根据3个以上实验室各不少于15组测定结果经统计分析，去除离群值和可疑值后的结果，并报告可信限。如该药物没有可进行等当量换算并符合要求的容量法时，可采用反复纯化的原料，色谱法确定纯度后扣除有关物质、炽灼残渣、水分和挥发溶剂等后的理论含量确定为标准品含量，以此为基准进行对照品（标准品）的换代和量值传递。用于抗生素微生物检定法的第一代基准标准品可参照上述方法标定，如为多组份抗生素，其组份比例应与拟上市产品组份比例一致或接近，或以其中某一组份纯品为基准标准品，但要注意标准品换代时量值传递的恒定。仅用于鉴别定性的化学对照品，注重其结构确证的研究资料，纯度和含量的要求一般可适当降低。杂质对照品，用作限度要求时，应提供其来源（合成路线）、结构确证的研究资料，应具备较高的纯度和含量，并提供纯度和含量的的测定结果，提供质量控制标准。2、其他类别药物用于抗生素微生物检定法的标准品须用上市国的国家标准品或原发厂的工作标准品为基准标准品进行标定。标定时采用的原料药应符合相应要求，并提供原料的制备路线、精制方法、质检报告，提供理化常数和纯度的测定数据及分析结果（包括相关图谱）。标定须用现行版中国药典附录收载的“抗生素微生物检定法”－三剂量法，并提供详细的方法学研究，包括检定菌和培养基的选择、剂量和剂距选择、缓冲液选择（如与质量研究项下相同，可不再提供）。每次标定结果均应照“生物检定统计法－量反应平行线测定法（3.3）”法进行可靠性测验及效价计算。对照品是质量标准的重要组成部分，从日常工作中发现，研发单位在对照品的制备、研究、标定、使用及保存过程中，仍存在部分问题。作为对照品，其研究工作的质量以及质量标准的高低直接影响新药研究的质量，对其提出技术要求是为了保证药品的质量控制与新药研究的结果准确有效，需重视起来。

“ 内吞作用是EGFR功能的一个重要调节因子，在胶质瘤细胞中经常发生失调，并与治疗耐药性有关。然而，在GBM细胞中从未检测过TKIs对EGFR内吞作用的影响。超分辨率dSTORM成像显示，在吉非替尼处理的细胞内膜室中，β1整合素和EGFR非常接近，表明它们潜在的相互作用。有趣的是，整合素的消耗延迟了吉非替尼介导的EGFR内吞作用。EGFR和β1整合素的共内吞作用可能会改变胶质瘤细胞对吉非替尼的反应。利用球状体胶质瘤细胞扩散的体外模型，我们发现α5整合素缺失的细胞比表达α5的细胞对TKIs更敏感。这项工作首次为EGFR TKIs可以触发大量EGFR和α5β1整合素共内吞作用提供了证据，这可能在治疗过程中调节胶质瘤细胞的侵袭性。”01—研究结果1、吉非替尼可引起EGFR的内吞作用胶质母细胞瘤(GBM)是融合星形细胞和少突胶质细胞肿瘤的一个亚群，是最常和比较具有侵袭性的脑肿瘤。GBM的特征是肿瘤间和肿瘤内的异质性和高度侵袭性的表型。表皮生长因子受体(EGFR、HER1、ErbB1)的过表达或突变是GBM中反复发生的分子改变，与不良预后相关。EGFR是一种跨膜受体酪氨酸激酶，属于ERBB家族，负责胶质瘤细胞的增殖、存活、侵袭性和干性调节。尽管EGFR在GBM中是一个有吸引力的治疗靶点，但使用EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的靶向治疗未能改善患者的护理。EGFR的过表达驱动胶质母细胞瘤(GBM)细胞的侵袭，但这些肿瘤仍然对EGFR靶向治疗，如酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)产生耐药性。在本研究中，作者发现吉非替尼和其他酪氨酸激酶抑制剂诱导EGFR在早期核内体中积累，从而导致内吞作用增加。此外，TKIs触发另一种膜受体的早期核内蛋白受体重新定位，即纤维连接蛋白受体-β1整合素，这是GBM中一个很有前途的治疗靶点，调节癌细胞的生理EGFR内吞和再循环。EGFR阻断调节失调参与了GBM的进展和侵袭性。然而，TKIs在EGFR迁移中的意义和作用尚不清楚。为了解决这个问题，作者用吉非替尼处理U87GBM细胞，并通过共聚焦显微镜检测了EGFR的定位，考虑到胶质母细胞瘤的异质性，作者分析了吉非替尼在其他3个具有不同水平EGFR表达的细胞系中对EGFR分布的影响。发现吉非替尼增加了T98G和LN443细胞中EEA1/EGFR的共定位，以及LN443、T98和LNZ308细胞中EGF的内吞作用。这些实验表明，吉非替尼在体外导致GBM细胞大量EGFR内吞。图1. 吉非替尼诱导U87细胞的EGFR内吞作用。用DMSO（对照细胞）或吉非替尼(20µM)处理4小时后，免疫检测肌动蛋白（绿）、EGFR（红）和内吞体标记物EEA1（青）。2、整合素和EGFR通过吉非替尼治疗而被共同招募到早期核内体中作者之前的实验清楚地表明，吉非替尼显著增加了EGFR的内吞率。整合素α5β1促进EGFR循环，全基因组基因筛选发现α5β1整合素是EGFR内吞作用的强启动子。因此，作者假设α5β1整合素，作为GBM中潜在的治疗靶点，可能会影响吉非替尼介导的EGFR内吞作用。作者接下来研究了EGFR和整合素是否被运输到相同的核内体。在未处理的细胞中，α5β1整合素和EGFR在质膜上或作为点状细胞内染色，令人惊讶的是，在短期吉非替尼治疗后，α5β1整合素明显被重新分配到大的EGFR阳性核内体中。吉非替尼治疗增加了核周区域整合素/EGFR的共定位，表明这两种受体在同一核内体中募集。图2. 吉非替尼引起EGFR和α5β1整合素的共内吞作用。用载体（对照）或吉非替尼处理的U87细胞的共聚焦图像。EGFR和β1的免疫检测接下来，作者对瞬时表达α5-GFP或Rab5-YFP的U87细胞进行了免疫标记和共聚焦分析。在吉非替尼治疗后，整合素β1和EGFR均定位于rab5阳性的早期核内体同样，EGFR和α5-GFP均在eea1阳性的早期核内体中被发现图3. 表达Rab5-YFP或α5-eGFP的U87细胞经吉非替尼处理后的共聚焦图像。在核周区域的插入物的高倍放大图像。箭头突出了标记有EGFR、整合素和早期核内体标记的囊泡接下来，作者使用2色dSTORM超分辨率显微镜来整合早期核内体中整合素和EGFR之间的潜在相互作用。在吉非替尼处理的细胞中，显示EGFR和整合素β1标记在核内体样结构中存在强覆盖，但不是在细胞外周处，这表明这两种受体更可能在核内体中相互作用，而不是在质膜上相互作用。此外，作者也在另外三个GBM细胞系中观察到内吞体整合素/EGFR共标记。图4. 吉非替尼处理的细胞的双色dSTORM图像显示细胞外周和核内体上的EGFR/β1整合素复合体02—研究总结 综上所述，这些数据表明EGFRTKIs增加了GBM细胞早期内吞体中EGFR的内吞作用和α5β1整合素的共积累。EGFR/α5β1整合素内吞作用和膜破坏。由于这些受体在癌细胞的侵袭和传播中发挥着关键作用，未来的挑战将评估TKIs对整合素生物学功能的影响，以及整合素/EGFR如何改变TKIs处理的细胞的内吞作用可能有助于GBM细胞逃避。并且，最近的一份报告强调了靶向治疗的靶标细胞毒性被低估的重要性。这项工作强调了需要更好地了解药物机制，以确定适当的生物标志物来预测药物的疗效。因此，描述吉非替尼等药物对内体转运的影响并揭示参与这些机制的分子将是很重要的。这可能为新的治疗方案提供理论基础，并改进脑肿瘤的精确医学方法。在本研究中，研究者主要借助STORM技术在更深一层次了解整合素之间的位置关系。这项2014年诺贝尔化学奖的发现已在国内实现产业化。宁波力显智能科技有限公司(INVIEW)现已发布超高分辨率显微系统iSTORM，采用3D随机光学重构技术、高精度细胞实时锁定技术、多通道同时成像技术等，以纳米级观测精度、高稳定性、广泛环境适用、快速成像、简易操作等优异特性，获得了超过50家科研小组和100多位科研人员的高度认可。参考文献：1. Blandin, Anne-Florence, et al. "Gefitinib induces EGFR and α5β1 integrin co-endocytosis in glioblastoma cells." Cellular and Molecular Life Sciences 78.6 (2021): 2949-2962.

受访专家： 　　欧阳学农，南京军区福州总医院肿瘤科主任、主任医师，国家中西医结合肿瘤重点学科主任、国家药物临床试验机构(肿瘤专业)主任、全军中医药学会副会长、全军肿瘤专业委员会常委，《临床肿瘤学杂志 》编委、《肿瘤学杂志 》编委，从事肿瘤临床工作近30年。 　　牵头或参与国际和国内药物临床试验项目20项，与美国 M.d. Anderson 癌症研究中心、加拿大UBC 大学、日本爱知癌症中心、中国医科院肿瘤医院、军事医学科学院等国内外著名肿瘤研究机构保持广泛合作。 　　“40%—50%的淋巴癌患者病因是病毒感染，但现在九成食品中含有添加剂，这也可能是淋巴瘤发病的重要原因之一。”国家中西医结合肿瘤重点学科主任欧阳学农主任医师日前告诉记者，加工食品中滥用的非法食品添加剂已经成为导致淋巴癌发病重要因素之一。 　　食品添加剂或可导致淋巴细胞变异 　　“在长期过量食用食品添加剂的不良影响下，有可能促使淋巴细胞在生长过程中发生变异，增加患上淋巴瘤的风险。”欧阳学农说。 　　据了解，淋巴癌是发生于淋巴结的恶性肿瘤，除了我们平时所知道的颈部、腋窝、腹股沟等处会长肿块之外，还可能存在于全身各处，比如脑淋巴瘤、肺淋巴瘤、胃淋巴瘤、口腔淋巴瘤等。 　　“人越年轻，淋巴细胞就越有活力，也就越容易得淋巴癌。恶性淋巴瘤多发生在20岁到40岁的青壮年。”欧阳学农说，淋巴癌的产生原因仍然不明确，与人自身免疫防御系统缺陷、病毒感染、化学物质、射线、基因突变等有关，如今，当人类的食物97%都含有添加剂时，几千种添加剂充斥我们的生活时，对于癌症的重新认识，应当谨慎考虑添加剂这一风险因素。 　　食品添加剂是人为添加到食品中的天然物质或人工合成的化学物质，在使用标准范围以下，人体的代谢能力可以降解出去，是相对安全的，但是一旦超过标准，过量的添加剂就会沉积在体内伤害各个器官，造成病变甚至致癌。尽管尚未有人类肿瘤的发生和食品添加剂有关的直接证据，但许多动物实验已证实大剂量的食品添加剂能诱使动物发生肿瘤。 　　“淋巴系统是身体重要的防御系统，就像人体的‘军队’，它可以帮助身体抵抗各种病原体，像细菌、霉菌等，让我们免于疾病的侵害。和这新病原体‘作战’的淋巴细胞容易在食品添加剂的不良影响下，有可能发生变异，直接或间接影响淋巴瘤的形成。”欧阳学农说。 　　动物实验多证实添加剂有致淋巴瘤作用 　　“许多动物实验已证实大剂量的食品添加剂能诱使动物发生淋巴瘤。”欧阳学农说。 　　如亚硝酸钠是食品添加剂亚硝酸盐的一种，国外试验证实，同时服用乙胺丁醇和亚硝酸钠，小鼠淋巴瘤的发生率提高，而单用乙胺丁醇对淋巴瘤发生率无影响。 　　作为人造甜味剂之一的蔗糖素，常用于食物和饮料。然而，美国食品药品管理局(FDA)在批准蔗糖素的报告中明确指出：在一个老鼠淋巴瘤突变试验中，科学家发现蔗糖素具有轻微的诱变性，根据检测致癌物的一种标准方法——艾姆斯试验结果，蔗糖素被消化时分解的物质也有“轻微的诱变性”。 　　“一些非法的添加剂致癌作用就更不用说了。”欧阳学农告诉记者，苏丹红作为一种非法食品添加物，对人体具有潜在致癌性，国际癌症研究机构将苏丹红一号归为三类致癌物，主要基于体外和动物试验的研究结果：苏丹红一号在特定存在的条件下，对小鼠淋巴细胞具有致突变作用。 　　此外，有的食品添加剂本身即可致癌，作为牛奶酸化剂的花楸酸、淀粉变性剂的琥珀酐、面包防硬剂的聚氧化乙烯乙醇硬脂酸等，在动物实验中都具有致癌活性 有的添加剂可在使用过程中，与食品中的存在成分发生作用转化为致癌物质，如能保持肉色鲜嫩的亚硝酸盐，会与蛋白质代谢后产生的胺类物质结合，形成亚硝胺，具有很强的致癌性。其他种类的防腐剂如苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸等，经毒理研证，较多剂量的摄入，也会影响人体的正常机能，削减人的免疫力，这就为人体细胞的变异提供了前提。 　　加工食品多含添加剂 自己动手最健康 　　“食品添加剂最主要的作用是为了让快速生产出的食品，看起来更鲜亮、闻起来更香，吃起来可口、保质期更长，同时由于它大多来自边角边料，所以有可能价格更便宜。”欧阳学农说，食品加工商为了让食品在经历漫长的运输和保存之后仍旧色彩诱人、香气扑鼻，绞尽脑汁的合成和添加各种食品添加剂。 　　如加入次亚氯酸钠可以给切过的蔬菜杀菌，让蔬菜更鲜亮 加入苯甲酸钠可以让碳酸饮料保持新鲜口感 加入碳酸氢钠可以使曲奇饼干膨松可口 加入环己基氨基磺酸钠(甜蜜素)能增加蛋糕和饮料的甜度 加入胭脂红，可以让食物的颜色红亮诱人。 　　“一个三餐都通过这些食品解决的成年人，每天添加剂摄入量约为10克左右，种类高达六七十种。”欧阳学农说，“要想远离他们，最好自己购买新鲜食品原料，亲自烹饪。” 　　“购买的食物加工度越高，使用的添加剂也越多。如果一味追求方便快捷，必然要牺牲健康，甚至是生命。”欧阳学农说。 　　———————— ■相关链接 —————————— 　　发热、消瘦、盗汗 或是淋巴瘤症状 　　淋巴癌临床早期症状不痛不痒、隐匿不易察觉，很多患者会将发烧等症状与感冒病症混淆。因此，有三种常见并发症要注意： 　　发热，体温长期徘徊在38℃—39℃之间，有持续高热，也有间歇低热，少数有周期热。消瘦，多数病人有体重减轻的表现，在短时期内减少原体重的10%以上。盗汗，夜间或入睡后出汗。 　　欧阳学农强调，并不是所有的淋巴结肿大都是癌，其中不少是炎症或良性病变等正常反应。此外，直径超过一厘米大小的肿块才有临床检查的意义，所以，发现异常时要警惕，及时就医，但不要过分紧张。 　　早期的淋巴瘤，通过以放疗为主的治疗手段就能治愈，到了中晚期的时候，需要用化疗为主的手段。欧阳学农主任指出，确诊患了淋巴瘤不必害怕，大量临床实验证实，50%—60%早期患者使用免疫化疗可以被治愈，晚期也有30%—40%的治愈率，疾病能否治愈的关键是首次治疗是否成功。 　　他提醒，工作压力大的白领、经常熬夜的人、长期过度疲劳者、经常处于电子辐射或射线环境者，都需要定期自查，触摸身体表层是否有肿大的淋巴结。平时，多接受日照，生活规律 尽量不要在新房装修好后即入住 购买新车后，进行甲醛测试，并保持较长时间开窗通风。此外，常吃葡萄、茶叶、海带、大豆、红萝卜、番茄、香蕉、橘子、菠菜等碱性食物，防止酸性废物的累积。

黑色素瘤组织中，与细胞焦亡相关的基因（PRGs）GZMA、GSDMB、NLRP1、IL18和CHMP4A的阳性细胞比例低于正常皮肤。细胞焦亡是一种影响肿瘤微环境和肿瘤免疫治疗的新领域。然而，细胞焦亡的作用仍有争议，部分原因是由于黑色素瘤的细胞组成异质性。2023年8月，上海中医药研究院皮肤病研究所李斌教授团队在Cell Death& Disease杂志上发表题为 Clinical-mediated discovery of pyroptosis in CD8+ T cell and NK cell reveals melanoma heterogeneity by single-cell and bulk sequence 的研究论文。本文对黑色素瘤标本的单细胞转录组进行了全面分析。我们发现PRGs的表达在免疫细胞中，如CD8+细胞（代表CD8+ T细胞）和CD57+细胞（代表NK细胞）中失调。此外，免疫组化和多重免疫荧光染色实验结果进一步证实了GZMA+细胞和GSDMB+细胞主要在免疫细胞中表达，特别是在CD8+ T细胞和NK细胞中。黑色素瘤标本中，GZMA+合并CD8+ T细胞（0.11%）和GSDMB+合并CD57+细胞（0.08%）的存在量很少，而对照组分别为4.02%和0.62%。这些发现表明，肿瘤中免疫细胞的减少可能降低了细胞焦亡的能力，从而对抗黑色素瘤的特性构成了潜在的风险。我们根据单细胞和整体RNA-seq分析，构建了一个预后风险模型和个体化的预测模型（C指数=0.58，P = 0.002），提示PRGs在恶性黑色素瘤的预防中可能发挥作用。总之，通过实验验证鉴定了免疫细胞群和免疫基因模块，有助于我们更好地理解黑色素瘤中的细胞焦亡。实验部分本文中，研究者使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光谱组织扫描定量分析系统获取图像。获取到图像利用StrataQuest软件进行定量分析。Panel 1 ：DAPI，CD8，GZMA，GSDMBPanel 2：DAPI，CD57，GZMA，GSDMB虽然细胞焦亡对癌症的影响尚为有定论，但是也正因为如此，针对细胞焦亡的研究仍然有广泛的未知等待探索。考虑到细胞焦亡的研究和炎症反应过程密切相关，借助于TissueFAXS Cytometry技术，结合多色免疫荧光染色，不但可以精准识别焦亡相关特异性蛋白表达的细胞，还可以实现对细胞焦亡水平在组织中的空间分布、形态特征、与其他细胞类型的相互作用等方面的高通量、高精度、高信息量的定量分析。在单细胞定量水平上，先通过识别细胞核标记对细胞进行计数，继而借助于Tissue Cytometry的核扩张算法精准对细胞质/膜染色的形态进行识别。在获得单细胞真实染色的轮廓区域后，对每个细胞蛋白标记的所有像素强度进行统计分析，最终获得单个细胞蛋白表达的真实强度水平。这种方法用于阳性阈值的精准筛选划分，甚至更进一步鉴定了阳性细胞与相邻的阴性细胞的作用关系。在本文中作者还利用了多组学研究的思路，对黑色素瘤发病机制有关的细胞 - 细胞相互作用网络提出了新的见解思路，以CD8阳性T细胞作为研究线索观察到CD8细胞边缘浸润的失调，进一步为肿瘤免疫的相关机制研究拓展了研究领域的广度。除此之外，针对NK细胞、GZMA 细胞和 GSDMB 细胞也均进行了原位精准空间定量分析，为后续的深入研究奠定了扎实的基础。在这些研究中，在切片原位的多重免疫组化标记，针对不同表型细胞的蛋白表达及细胞分布分析，也都是利用TissueFAXS Cytometry技术来进行的个体化精准定量分析。Figure 1 GZMA+细胞和GSDMB+细胞由CD8+T细胞分泌。A：对照组和黑色素瘤组织的多色免疫荧光染色图像。DAPI(蓝色)、CD8(粉色)、GZMA(绿色)和GSDMB(红色)。B：CD8+GZMA+共定位和CD8+GSDMB+共定位散点图。Figure 2 NK T细胞分泌GZMA+细胞和GSDMB+细胞A：对照组和黑色素瘤组织的多色免疫荧光染色图像。DAPI(蓝色)、CD57(粉色)、GZMA(绿色)和GSDMB(红色)。B：CD8+GZMA+共定位，CD8+GSDMB+共定位，CD57+GZMA+和CD57+GSDMB+散点图。

对照品系指用于鉴别、检查、含量测定的标准物质，包括杂质对照品，不包括色谱用的内标物质。在药品检验工作中我们常会用到一种用来检查药品质量的特殊参照物——药品标准物质(对照品)。它在药品检验中具有十分重要的地位。随着仪器分析的广泛使用，必将越来越多地使用药品标准物质。下面远慕生物就来介绍一下如何对对照品进行保存和使用：　　(1)对照品应按说明书规定的条件妥善保存，一般置干燥阴凉处保存，某些对照品如维生素E等需避光低温保存。要注意对照品的使用期限，过期、变质的对照品不宜再使用。开瓶后建议短期内用完，避免开瓶后长期不用，同时，在重复使用过程中应尽量避免对照品的分解、污染或吸潮。　　(2)使用中检所对照品时，应严格按说明书执行。一般情况下，供鉴别、检查用的对照品不能用于含量测定。红外鉴别用的对照品使用时应注意与样品在晶型上的差异，必要时可采用相同的方法对样品和对照品重结晶。例如氨苄西林钠具有多种不同的晶型，可用丙酮对样品和对照品重结晶后测定，以确保二者晶型和红外光谱图的一致。　　(3)由中国药品生物制品检定所提供的对照品或国际对照品为法定对照品，以法定对照品作对照标化的原料可称为二级对照品或工作对照品。药品生产单位为节约成本，可使用工作对照品进行日常检验，但药品检验所必须使用法定的对照品，出具的检验报告书才具有法律效力。　　(4)除另有规定外，对照品使用时应采用适宜的方法测定其水分的含量，按干燥品(或无水物)进行计算后使用，否则会造成含量测定结果偏高。对热稳定的对照品可直接干燥后使用；对热不稳定的对照品可同时另取一份作干燥失重，扣除水分后使用。此外，对照品若含有结晶水或盐基，使用时应注意其换算。　　远慕生物提供以下服务：　　1.中药提取物的定制研发和生产，中药提取物代加工相关服务。　　2.中药高含量提取物的工业化高效分离及分离纯化生产　　3.天然产物原料药和中间体的生产，定制（包括合成，半合成）

基于免疫检查点抑制剂（ICIs）的免疫治疗正在成为一种革命性的肿瘤治疗方案，仅适用于一小部分癌症患者。ICIs的临床反应主要依赖于肿瘤组织中浸润的效应T淋巴细胞（CTL）识别并杀死肿瘤细胞。然而，肿瘤组织中CTL浸润较为有限，且复杂的瘤内物理屏障严重阻碍CTL的浸润，削弱了ICIs的治疗效果。因此，如何重塑肿瘤内物理屏障以增强CTL的浸润成为提高ICIs介导的免疫治疗迫切需要解决的难题。　　1月29日，中国科学院上海药物所研究员张志文、李亚平，以及沈阳药科大学教授王思玲团队合作完成的最新研究成果，以Bioinspired lipoproteins of furoxans-oxaliplatin remodels physical barriers in tumor to potentiate T-cell infiltration为题，在线发表在《先进材料》（Advanced Materials）上。该研究提出并证实利用仿生脂蛋白系统高效递送一氧化氮（NO）供体-奥沙利铂前药，通过重塑肿瘤物理屏障促进CTL瘤内浸润、增强ICIs免疫治疗的新策略。 　　对乳腺癌及结肠癌的临床样本检测发现，肿瘤部位广泛存在各种细胞外基质组分但CD8+ T浸润严重缺乏。基于此，科研团队设计合成了一种细胞内还原响应的NO供体-奥沙利铂前药（FO），构建高效靶向瘤内各种基质细胞的仿生脂蛋白系统（S-LFO）。研究显示，S-LFO能够在肿瘤部位高效蓄积、渗透进入肿瘤深部区域，并可到达瘤内肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和血管内皮细胞（ECs）等基质细胞。S-LFO处理后能够显著促进肿瘤血管正常化、灌注能力和血管密度，降低TAMs和CAFs的比例，清除Collagen、Fibronectin和chondroitin sulfate等主要细胞外基质成分，为促进CTL的瘤内浸润铺平了道路。进一步研究发现，S-LFO能够显著增加肿瘤部位CD3+CD8+ T细胞以及表达IFN-γ、Granzyme B亚型的比例，与对照组相比分别提高2.96、5.02和8.65倍，并显著促进CD8+ T细胞向瘤内4T1-GFP癌细胞区域的浸润和扩散能力，进而在胰腺癌PANC02、乳腺癌4T1和结直肠癌CT26等肿瘤模型中，与aPD-L1合用显著增强了抑制肿瘤生长和延长存活期的疗效。该策略为重塑肿瘤基质屏障提高CTL浸润增强ICIs的免疫治疗效果提供了新方法。　　　　　　　　　　研究工作得到国家自然科学基金、山东省自然科学基金和复旦-SIMM联合研究基金等的资助。　　论文链接

项目编号：2022zfcg00371项目名称：甘肃省药品检验研究院2022年实验用试剂、耗材、对照品项目预算金额：396.48(万元)最高限价：396.48(万元)采购需求：具体品目、技术参数和数量详见招标文件第五章 技术规格书合同履行期限：按合同约定执行本项目（是/否）接受联合体投标：否

Hendriks L., Skjolding L. M., Robert T., 确定细胞中金属元素的生物利用率的传统方法一般需对细胞进行酸消解，然后利用溶液进样电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）进行后续分析。这种方法的缺点是需要大量的细胞，并且只能为给定的细胞群体提供平均值1。众所周知，千人千面，不同群体以及同群体细胞的特异性在文献中也多有报道2。基于这个大前提，使用特定的分析方法对不同群或同群细胞进行逐序单个分析，获取与单个细胞特异性有关的大数据就尤其重要（见图1）。本文中介绍的单细胞-电感耦合等离子体质谱法（sc-ICP-MS）与之前介绍过的单颗粒ICP-MS（sp-ICP-MS）基本类似（微信公共号：粒粒皆信息：什么是单颗粒物ICP-MS质谱分析法?）。事实上，上述两种技术都依赖于相同的基本原理和icpTOF瞬时事件全谱多元素测量能力，从而可以获得由单一个体产生的微秒时间区间内的瞬时信号，例如单个纳米颗粒（NPs）或单个细胞。（译者注：这等同在拍一段有很多快速武术对打的电影场景，需要使用高速摄像机来捕捉每一个武打动作细节和变化，同时也不漏过颜色，声音等关键信息，这样才能最终呈现出高清120Hz的作品。） 单颗粒ICP-MS方法的基础概念和硬件构架3源于2003年Degueldre等发表的第一篇论文。在过去的二十年间，通过进样系统，数据采集硬件和数据处理专用软件的进一步发展和商业化，不断增加的科研文献见证了该技术领域的迅速成熟。在单颗粒ICP-MS上投入的研究和应用开发同样的也使单细胞ICP-MS分析受益。 在单细胞ICP-MS中，细胞悬浮液经超声波雾化后形成的液滴被带入ICP-MS等离子体中。细胞在等离子体中依次被汽化、原子化和最终离子化。每个细胞产生一个含有多种元素的离子云，在仪器上被检测为高于背景的时长几百微秒的单个信号峰。与单颗粒ICP-MS类似，记录到的尖峰频率与细胞数量浓度成正比，这些尖峰的强度则与细胞中该元素质量有关。这种技术已经成功的应用在测定海藻中的镁元素含量4，并进一步用于纳米颗粒物毒理学研究中评估细胞对纳米颗粒物的摄取情况5，6，7。 虽然单细胞ICP-MS的测量方法看起来很简单，但要获得真实可靠的数据，实施起来需要注重的细节很多。除了需要额外注意来自培养基的可能高背景信号和细胞在样品导入系统中的潜在破损，在单细胞研究中反复报道的一个主要瓶颈是细胞进样装置的低运输效率，这是因为与纳米颗粒物相比，细胞的尺寸更大，在传输过程中也更容易损失。事实上，传统的系统通常包括一个旋风式雾化室，是专为引入较小的溶液液滴而设计的，导致细胞传输效率低于10％。而用于单细胞导入的定制系统，包括改进的雾化器或全消耗喷雾室8，9，以及其他创新设计10，11，经过多年反复测试，已被验证可以高效传输单细胞进入ICP-MS。 另一个瓶颈在于质谱仪器质量分析器的性能：传统的ICP-MS仪器具有单四极杆或扇形场质量分析器，在进行单细胞分析时最多只能同时检测一到两种元素信息（只能拍黑白影片）。而在常见的单颗粒分析场景中，比如在纳米毒理学研究中，在试图量化纳米颗粒物（特征金属元素）和细胞（蛋白固有元素）的关联时，需要同时获得单细胞事件内多种元素浓度信息。为了获得微秒级事件信息全貌，快速且广谱分析的质量分析器，如飞行时间质量分析器等高精尖‘摄影器材’是必不可少的（译者注：例如，等同于可提供高清彩色120Hz影片给观众更加真实的IMAX观影体验）。图1：a）在对细胞进行酸消解后，通过传统的雾化法将溶液样品引入ICP-MS，并记录仪器获得的稳态信号。这种整体分析法对初始样品中所包含的数千个细胞获得一个平均值。然而这种实验是基于细胞是均匀的假设，而忽略了细胞具有多样性的事实。因此，少数细胞群（用绿色和紫色表示），在元素组成上虽与主类细胞有差异，却没有被体现在结果中，这完美的诠释了辛普森悖论。b）在单细胞ICP-MS方法中，将细胞悬浮液稀释后，在单位时间内仅有一个细胞个体被引入ICP-MS等离子体。每个细胞产生一个独立的离子云，作为信号峰被ICP-MS仪器记录。这种方法允许检测每一个单独的细胞，从而保证了细胞特异性信息的无损获取和保存。简单来说，在单细胞ICP-MS中，细胞是以个为单位进行分析的，可以根据它们不同的分析物含量识别出不同的群体，而不是仅仅产生一个平均值。icpTOF飞行时间质谱法 在飞行时间质谱法（TOF-MS）中，其基本原理是根据离子到达检测器前通过固定长度的飞行管的飞行时间来精确分辨离子。离子束在脉冲加速电压后具有相同的动能，但轻的离子会比重的离子获得更高的速率，进而更早到达检测器。测量所有离子的陆续到达时间可以得到一个连续时间谱，经过简单的校准和换算后可以得到一张全质谱谱图（一般6-280 Th）。TOF质量分析仪的主要优点是：对分析的元素及同位素的数量没有限制，而且全谱数据采集速度快（通常几十微秒就可以获得一张全元素谱图）。这样的快速全谱数据采集能力在处理单一实体（如单细胞）检测时尤其重要，因为单细胞产生的瞬时事件长度很短，一般在200-500微秒区间。 飞行时间技术在单细胞分析领域并不是一个新概念，最初是由Bandura在2009年提出的，其原型机12用于单个细胞的时间分辨分析13，从而为众所周知的 "质谱流式 "领域打开了大门。这项应用使用稳定的稀土金属同位素来标记细胞，从而允许通过其金属标记物来检测相应细胞14。除了展现了生物研究和药物筛选应用中的巨大潜力，质谱流式也被用于检测细菌细胞中的银纳米颗粒15。然而，由于质量检测范围有限（80 Da）和涉及染色的样品制备程序，质谱流式细胞技术无法检测许多固有元素。 与质谱流式不同的，如图2a) 所示的ICP-TOF (TOFWERK AG, 瑞士) 可以测量从质荷比6到280的全谱图16，从而可以覆盖轻质元素，如Na, Mg, P, S, K, Ca, Mn, Fe, Cu, Zn等。这些元素是活细胞的固有元素，它们的分布（也被称为细胞离子组17）可以作为细胞发育状态的指标18。例如，磷存在于核酸（DNA和RNA）中，也是ATP、CTP、GTP和UTP等能量化合物的重要成分。钠和钾在电信号的传输中起作用，而锌被不同的生物过程中的多种酶用作催化剂。由于ICP-TOF-MS的同时多元素检测能力，可以在多种元素的相关分析基础上进行指纹识别19。如图2b) 所示，镁、磷、锰、铁、铜和锌被鉴定为被分析藻类的本征指纹元素。不需要标记或染色，即可依据细胞的 "天然 "元素指纹来进行单细胞分析20,21。通过测量特定细胞类型的金属微量元素，则可以获得更细致的指纹信息。例如，海藻细胞富含镁等金属微量元素，镁是叶绿素的核心组成部分，对光合作用至关重要。因此，金属微量元素的组成可以作为一种独特的指纹来明确识别不同的细胞种类。通过测量单细胞的金属元素组分，可更好地了解由金属蛋白和金属酶调节的基本生物过程，从而解密细胞生命周期不同状态22。尽管细胞的生物化学并不完全反映在其离子组上，但通过监测其金属含量的变化，可以确定地获得对细胞状况和生物过程的更深入了解。 通过使用TOF质量分析仪作为检测器，可以动态系统地获得完整的质谱数据，从而可以对发现特定实体本身及其所处环境进行连续或高通量表征。因此在纳米毒理学背景下，人们可以很容易地确定纳米颗粒物是否与细胞相关联。图2：a) icpTOF仪器（TOFWERK AG, Thun,Switzerland）的示意图：在iCAP Q（Thermo Scientific, Bremen, Germany）的框架上搭配一套高分辨率飞行时间质量分析器。因此，ICP-TOF受益于与iCAP Q相同的ICP离子源、离子光学、碰撞/反应池技术和样品引入设备。b) 用48 µ s时间分辩率采集的淡水藻类细胞raphidocelis subcapitata的瞬时信号速率。c) 藻类细胞通常用于毒理学风险评估研究，这里在暴露于金纳米颗粒一段时间后进行分析，以调查其摄取情况。在ICP-TOF的全质量数范围内，可以根据检测细胞的本征元素指纹对细胞进行追踪，并能直接定量测量纳米颗粒物-细胞的关联。icpTOF单细胞分析应用实例 单一实体分析，与批量样品测量相比，能产生信号的质量相对有限，这对仪器灵敏度要求更高。下面的应用案例研究展示了icpTOF S2仪器（TOFWERK AG，瑞士）的性能指标：具有与单四极杆ICP-MS类似的高灵敏度，又可同时快速检测全谱信号，特别适合分析单一实体，如单细胞或纳米颗粒（NPs）等。随着工业和日常生活中纳米颗粒物的广泛使用，纳米安全和纳米毒理学在过去20年一直是深入研究的课题。纳米颗粒物的安全评估研究中的一个重要参数是其在细胞摄取的分析和量化。 透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）具有高空间分辨率，它们经常被用于细胞内纳米颗粒物的分析23,24。尽管有令人印象深刻的成像能力，基于电子显微镜方法的一个主要缺点是对样品制备的繁琐要求。此外，由于没有额外的元素定量或自动图像分析，获得的图像是定性的且结果较难被解读25,26。如前所述，单细胞ICP-MS也可用于量化细胞对纳米颗粒物的摄取，根据观察到的信号峰的强度大小，提供与细胞相‘关联’的纳米颗粒数量的信息5,6。这类实验通常有以下三个明显的观察结果： 只检测到纳米颗粒物中的特征元素，表明溶液中存在纳米颗粒物 只检测到细胞固有元素而没有任何纳米颗粒物中的元素，表明细胞并没有与纳米颗粒物相关联 同时检测到细胞固有元素和纳米颗粒物中的元素，意味着两者有关联 根据观察到的相关联的纳米颗粒/细胞峰的频率和幅度，可以确定摄取了纳米颗粒物的细胞的百分比以及与每个藻类细胞相关的纳米颗粒数量的估计值。在理想的情况下，可以根据浓度和暴露时间动态地对海藻细胞和纳米颗粒数量的相关性的进行评估。 在本案例研究中，将海藻细胞暴露在BaSO4（NM-220）溶液中72小时，接着按照Merrifield等人提出的程序进行清洗5，去除未与细胞结合的纳米颗粒。在暴露后并在ISO8692藻类培养基中进行冲洗后27，样品中预计只包含与藻类细胞相关联的纳米颗粒物。随后，样品被储存在15毫升的试剂管中，用锡纸包裹，等待分析。 在使用四极杆ICP-MS进行单细胞的初始研究中，我们发现清洗后的细胞悬浮液中仍存在BaSO4纳米颗粒，如图3a所示。有学者认为未关联的纳米颗粒已经去除，而这些检测到的纳米颗粒是与海藻细胞相关联的。然而由于只测量了一种元素138Ba，并不能完全证实这一猜想。 我们使用单细胞ICP-TOF-MS（见图2a）重复了一个类似的实验。从图2b中我们可以知道被分析的藻类细胞的本征元素指纹，即只有同时检测到Mg、P、Mn和Fe等元素时才被认为检测到了藻类细胞。令人惊讶的是，即使暴露72小时后，BaSO4 纳米颗粒与水藻细胞的指纹信号没有显著关联（图3b）。可以看到，Ba仅与Mg和Fe的信号同时被检测到，而没有水藻的其他指纹信号同时出现。虽然缺失的元素信号强度有可能是低于仪器检测极限，但至少这说明检测到的元素与藻类细胞的本征元素指纹不一致。然而在检测到藻类细胞的指纹信号中，没有观测到Ba元素信号。综上所述，如果没有icpTOF瞬时多元素检测能力，在清洗后细胞悬浮液中检测到的纳米颗粒的Ba信号很容易被误解为是与藻类细胞相关联的颗粒物。图3：a）实验流程图。在样品暴露于纳米颗粒物72小时后，细胞被清洗以去除上清液中游离态的纳米颗粒物。b) 通过使用飞行时间质谱仪重复单细胞测量，可以跟踪细胞的元素指纹，以验证纳米颗粒物信号和细胞信号的是否同时出现。结果显示虽然纳米颗粒物和细胞没有直接关联，但Ba信号与Mg和Fe信号是一起出现的。 这些结果导致了对可能引发该现象的机制的讨论。一个合理的解释是海藻细胞通过释放胞外聚合物物质（EPS）来清除粘附在细胞表面的纳米颗粒物。EPS被认为是影响藻类细胞对纳米颗粒的生物利用率的关键因素28,29。EPS产量的增加可使藻类细胞主动脱落纳米颗粒，从而减轻摄取或吸附到细胞外部，而纳米颗粒仍然以被包含在EPS中的形式存在于溶液中。虽然缺乏关于这种行为的定量数据，但足以解释BaSO4纳米颗粒信号与Mg和Fe信号的契合。当然Fe与Ba信号的同时出现还可以被解释为溶解的Ba与ISO 8692培养基中的EDTA络合在了一起，而EDTA被添加在溶液中以保持Fe的生物可利用率。要回答这个问题，我们使用TEM观察到EPS聚集体中包裹有纳米颗粒（图4）。由于TEM局限于定性分析，再加上EPS结构微妙，这种包裹的确切机制和发生频率很难被量化。然而单细胞ICP-TOF-MS则可以直接对这一现象进行定量分析，而不需要对样品进行复杂的制备，同时还可以在较短的时间内分析更多的藻类细胞及EPS聚集体，提供更可靠的统计数据。此外，单细胞ICP-TOF-MS可以动态地从藻类悬浮液中不间断取样，评估这种清除行为的发生频率与样品浓度和时间的关系，进一步了解藻类细胞和纳米颗粒之间的相互作用。这种利用ICP-TOF研究动态摄取和清除行为的研究思路不仅限于藻类细胞，还可以扩展到纳米医学或纳米生物技术的其他类型细胞，如哺乳动物细胞或细菌。图4：一个藻类细胞（Raphidocelis subcapitata）的透射电子显微镜图像，该细胞之前暴露在银纳米颗粒物中，脱落的细胞外聚合物物质（EPS）含有银纳米颗粒。(由Louise H. S. Jensen和Sara N. Sø rensen提供）。 正如本研究强调的那样，尽管传统的四极杆质谱（sc-ICP-Q-MS）可以测量单细胞，但它最多只能同时测量一种或两种元素或同位素，所以即使检测到纳米颗粒信号也不能100%确定其与细胞直接关联。另外还需要TEM来确定颗粒物是否被藻类吸收在内部或简单附着在细胞外部。然而使用ICP-TOF-MS可以将被暴露在纳米颗粒物中藻类的离子组与对照藻类的离子组进行比较，从而评估它们的状况。这些信息对于从机理上理解海藻细胞与纳米颗粒物的相互作用非常有价值，并可以进一步促进开发以生理学为基础的纳米颗粒物风险评估工具。icpTOF结论与展望 单细胞ICP-TOF-MS是一个新兴的、令人兴奋且快速发展的研究领域。虽然尚需数年时间才能达到质谱流式技术在单细胞多参数分析方面的水平，但ICP-TOF-MS得益于灵敏度的提高和同时全谱检测能力，能够基于元素指纹检测未被标记的细胞，从而为新的实验设计创意提供可能性。例如，除了测量纳米颗粒物和细胞的相关性外，ICP-TOF-MS记录的多元素数据可用于评估细胞在纳米颗粒介导毒性影响下的不同状态。 除了液体样品引入方法之外，也可以使用激光剥蚀(LA)-ICP-TOF-MS进行单细胞分析30,31。通过将制备有细胞的载玻片放在样品台上并使用激光扫描，可以产生单个完整细胞层面上的元素分布二维图像，其中每个像素包含一个完整的全元素谱图。LA-ICP-TOF-MS成像的高空间分辨率对纳米毒理学研究特别有意义，因为它可以观察和定位纳米颗粒物在亚细胞结构中的聚集，以进一步了解和解释各种现象（如摄取、积累和释放纳米颗粒）。 此外，所生成的大量数据可以通过降维技术进行处理，如主成分分析（PCA）或机器学习工具，并提取与细胞状态和类型有关的信息，从而使细胞的分类变得更容易。这在质谱流式工作流程中是常见的处理方法。这项技术不仅限于纳米毒理学研究，还可以扩展到金属组学和细胞生物学中。无论如何，我们将继续努力改进飞行时间质谱ICP-TOF-MS技术，使其在更广阔的应用领域发挥作用。icpTOF致谢作者感谢Olga Meili和Aiga Mackevica校对本文并提供反馈。Lars M. Skjolding得到了PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing项目资助（760813）。感谢Louise Helene Sø gaard Jensen和Sara Nø rgaard Sø rensen允许使用图4中的TEM图像。最后特别感谢Robert Thomas邀请在Spectroscopy杂志中的 "原子视角专栏 "刊登此文。原文链接：Hendriks L., Skjolding L. M., Robert T., Single-Cell Analysis by Inductively Coupled Plasma–Time-of-Flight Mass Spectrometry to Quantify Algal Cell Interaction with Nanoparticles by Their Elemental Fingerprint, Spectroscopy, 2020, Volume 35, Issue 10, Pages 9–16https://www.spectroscopyonline.com/view/single-cell-analysis-by-inductively-coupled-plasma-time-of-flight-mass-spectrometry-to-quantify-algal-cell-interaction-with-nanoparticles-by-their-elemental-fingerprint （请点击左下角“阅读原文”跳转）本文由TOFWERK中国-南京拓服工坊科技编译，结论以英文原文为准。参考文献1 S. J. Altschuler and L. F. Wu, Cell, 2010, 141, 559–563.2 W. M. Elsasser, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1984, 81, 5126–5129.3 C. Degueldre and P. Y. Favarger, Colloids Surfaces A Physicochem. Eng. Asp., 2003, 217, 137–142.4 K. S. Ho and W. T. Chan, J. Anal. At. Spectrom., 2010, 25, 1114–1122.5 R. C. Merrifield, C. Stephan and J. R. Lead, Environ. Sci. Technol., 2018, 52, 2271–2277.6 F. Abdolahpur Monikh, B. Fryer, D. Arenas-Lago, M. G. Vijver, G. Krishna Darbha, E. Valsami-Jones and W. J. G. M. Peijnenburg, Environ. Sci. Technol. Lett., 2019, 6, 732–738.7 I. L. Hsiao, F. S. Bierkandt, P. Reichardt, A. Luch, Y. J. H

【真正可用于动物细胞培养的国产新品】 2019年01月11日由上海市高新技术成果转化项目认定办公室召开的2018年度第10批高新技术成果转化认定颁证大会上，共有70个项目被认定为上海市高新技术成果转化项目，其中上海智城分析仪器制造有限公司自主研制生产的“ZWYC-290A精密细胞培养振荡器”（简称：“细胞摇床”）名列其中。 在一家具有美资背景的培养基专业制造商设立在上海浦东的研发中心生物实验室内，上海智城的“细胞摇床”与国际顶级品牌的“细胞摇床”进行了一场母细胞的对照实验，其提供的实验结果表明，在“细胞密度”、“细胞活率”和“细胞产量”三个重要指标中，智城的＂细胞摇床＂完全可以与这一世界顶级产品媲美。 国内最大的动物疫苗制造商也做了同样的母细胞对照实验，也得出了同样的结果. ZWYC-290A精密细胞培养振荡器是智城公司推出的具有我国自主知识产权的细胞振荡器新品。该产品凝聚了智城公司中国研发团队二十年恒温振荡器的专业设计经验和现代生物技术的应用经验，携手海外专家攻关，在引进、消化、吸收国外一线同类旗舰产品的基础上，再创新提高而形成的技术成果。 产品广泛应用于微生物细胞发酵、动物细胞和植物细胞培养，在生物医药、食品开发、生物农业环境治理等领域进行微生物培育、菌种或细胞系筛选等有着很好的应用前景，也可应用于对温度、供氧、剪切等具有较高要求的细菌培养、动植物细胞培养、杂交和生物化学反应以及酶反应研究。

《化学药品对照品图谱集》整理了600余种常用化学药品对照品各类谱图数据，从结构到性质对对照品进行了比较全面的描述。化学药品对照品是国家标准物质的重要组成部分，是依法实施药品质量控制的基础。药品标准物质的质量和水平，与医药工业的健康发展和公众安全用药休戚相关。首次结集出版的《化学药品对照品图谱》分为6本——总谱，质谱，红外、拉曼、紫外光谱，核磁共振，热分析，动态水分吸附。 《化学药品对照品图谱集-质谱》分册由中国食品药品检定研究院出版，全部质谱数据采集由岛津企业管理（中国）有限公司采用岛津产品完成，其中十种使用岛津GCMS，其余品种使用岛津LCMSMS。该书实际包含近700个常用化学药品对照品的二级质谱图，裂解规律及相关物性，是目前最全的化学药品对照品质谱图集，对药品生产企业、检验检测机构和高校科研院所人员有很好的参考价值。 关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司，在中国全境拥有13个分公司，事业规模不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心，并拥有覆盖全国30个省的销售代理商网络以及60多个技术服务站，已构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。本公司以“为了人类和地球的健康”为经营理念，始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务，为中国社会的进步贡献力量。 更多信息请关注岛津公司网站www.shimadzu.com.cn/an/ 。 岛津官方微博地址http://weibo.com/chinashimadzu。岛津微信平台

在细胞治疗过程中，评价免疫细胞的增殖能力，以其对靶细胞的杀伤能力是细胞治疗过程中非常关键的环节。其中DELFIA® EuTDA细胞毒法和DELFIA® BrdU细胞增殖方法，凭借其高灵敏度、易操作性性等诸多优势，已逐渐成为主流的检测技术。在此，通过以下一系列的应用案例，我们将向大家展示DELFIA® EuTDA、DELFIA® BrdU、活体影像及放射性检测等方法如何助力免疫细胞杀伤研究。 一，CAR-T细胞杀伤毫无疑问，CAR-T疗法已成为当下最火的肿瘤细胞疗法之一。同样作为CAR-T大国，中国多数CAR-T疗法已进入临床研究，并且产业化发展迅速，而美国则还集中在临床前研发[1]。安全性是CAR-T疗法的一大挑战。除了细胞因子风暴外，CAR-T疗法还会诱发移植物抗宿主反应 （graft versus host disease GVHD）等安全隐患。鉴于选择性去除CD45RA阳性细胞能有效抑制GVHD发生[2]，研究利用CD45RA阴性T细胞群体开展靶向CD19的 CAR-T疗法，来提高治疗安全性。结合DELFIA的细胞杀伤检测法和基于Calcein-AM标记的流式法，研究证明CD45RA阴性 CAR-T细胞能有效杀伤CD19阳性肿瘤细胞系，并能作用于原代NK细胞杀伤耐受的MLL重排白血病原始细胞SJ4-11（K562为敏感细胞对照，RS4 11为耐受细胞对照）[3]。由于CD45RA-细胞主要为CD3+CD45O+记忆T细胞，因此针对常见的病原体和疫苗应有更好的回忆应答（Recall response）。通过使用DELFIA Cell Proliferation Assay 检测掺入的BrdU，研究确认CD45RA- T细胞对人CMV、Epstein–Barr 病毒、 herpes simplex 病毒和tetanustoxoid有更为显著的免疫反应（下图a，增殖指标）。基于同样的增殖检测平台，研究利用PBMC开展Mixed lymphocyte reaction (MLR)，对比不同细胞亚群的同种异体反应。相较于CDRA-效应细胞群体，CD45RA+细胞在MLR实验中具有更高的增殖能力（下图b）和IFN-γ分泌能力（下图c）[3]。 进一步的体内实验研究继续利用了PerkinElmer IVIS活体成像平台，在白血病小鼠模型的基础上，研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法在不诱导GVHD的同时，发挥强效的抗癌效果[3]。借助活体成像的优势，研究追踪CD19+ SEM细胞在小鼠体内的扩增情况，确认在接种18天后肿瘤的信号强度足以模拟顽固性白血病小鼠模型。在此模型的基础上CD45RA-的 CAR-T疗法同样能迅速发挥作用，两周内强力抑制生物发光信号至检测限以下。最后，基于同样的检测平台结合重复接种肿瘤细胞，研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法还能作用于复发白血病小鼠模型。 二，CAR-NK细胞杀伤CAR-T细胞疗法的成功和兴起也推动了其他类型的CAR研究，其中就包括针对实体瘤的CAR-NK疗法。相较于T细胞，NK细胞可以在没有抗体和MHC的帮助下靶向疾病细胞，因此能发动更为快速的免疫反应并能有效针对无MHC I表达的肿瘤细胞。同时, NK细胞更为安全，支持“Off-the-Shelf”的大规模生产和直接异体治疗。目前在国内已有多家医疗企业推动CAR-NK治疗，如博生吉的CD7 CAR-NK。在6月份的Molecular Therapy期刊上，广州医科大学附属第三医院的研究向我们展示了最新的CAR-NK临床应用。为了特异靶向肿瘤细胞表面抗原NKG2DLs，研究在NKG2D受体的胞外结构域基础上融合参与NK细胞活化的核心分子DAP12，并进一步通过RNA转染途径提升CAR-NK安全性。基于DELFIA的细胞杀伤检测法，研究证明NKG2D-DAP12 (NKG2Dp)能有效的裂解多种肿瘤细胞系，优于对照NK和NKG2D-CD3z(NKG2Dz)[4]。借助Perkinelmer提供的HCT116-luc报告细胞系，研究通过活体成像方法，在体内水平证明CAR-NK能有效控制肿瘤发展。进一步的临床研究证明CAR-NK的引入能迅速引起肿瘤退缩和肿瘤细胞减少，强调NKG2D CAR是一种很有前景的细胞治疗方案[4]。 三，T细胞杀伤T细胞不仅是免疫系统的核心成员，也是适应性免疫反应的基石。因此，T细胞功能的全面评价在肿瘤免疫疗法的开发过程中至关重要，其中就包括肿瘤疫苗的研发。早期基于经典肿瘤相关抗原gp100的研究证明细胞因子RANTES的引入能显著提升小鼠脾脏细胞的杀伤能力。同时，RANTES表达的时间点非常关键。疫苗引入前12和24小时表达RANTES能有效提升T细胞的杀伤能力，而48小时则没有这个现象。基于动物实验，研究推测多种细胞参与杀伤，包括CD8+，NK细胞和CD4+细胞群体。进一步基于DELFIA细胞毒法研究证明TRAIL和FasL参与了杀伤过程[5]。 除了传统T细胞杀伤外，DELFIA细胞毒法还可以被用于检测靶向T细胞的新型免疫治疗分子，如双特异抗体(BiTE)等的细胞杀伤功能[6]。 四，NK细胞杀伤鉴于NK细胞在天然免疫系统的重要性，其活力检测也是免疫检查点抑制剂研发过程中的核心项目。此外，NK细胞活力检测还可以用于衡量用于免疫疗法开发的新型小鼠模型。在2016年发表的一份研究中，基于DELFIA的细胞杀伤检测法证明PD-1抗体可以显著提升NOG-MHC Double Knockout小鼠脾中NK细胞靶向K562的杀伤活力。靶向免疫治疗的新小鼠模型不仅能加速新型免疫检查点药物（组合）研发，同时可以协助发现新的标志物预测疗效[7]。 除了直接杀伤靶细胞外，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）也是评价NK细胞功能的一个关键指标。在今年的一份研究中，DELFIA细胞毒法被用于衡量静脉注射免疫球蛋白( intravenous immunoglobulin, IVIG)对NK细胞功能的影响。从结果可以看出，除了阻断NK细胞的直接杀伤能力外，IVIG几乎完全抑制ADCC活力（下图上）[8]。在该研究中，除了ADCC检测外，Perkinelmer的放射检测解决方案（3 [H]-Thymidine和MicroBeta 2）也被用于衡量IVIG和免疫抑制药物对NK细胞增殖的影响。H3-掺入法证明相较于IVIG，免疫抑制药物能有效抑制NK细胞增殖（下图下），而IVIG则特异作用于T细胞活力。鉴于ADCC是单抗药物发挥临床效果的核心机制之一，其活力检测也成为大分子药物研发的必须环节[9]。 欢迎扫码登录珀金埃尔默生命科学试剂耗材平台，点击进入car-t细胞治疗应用专题关注二维码：进入试剂耗材平台：参考资料：[1] Jia Xin Yu, et al. The global pipeline of cell therapies for cancer. https://www.nature.com/articles/d41573-019-00090-z[2] Triplett BM, et al. Rapid Memory T-cell Reconstitution Recapitulating CD45RA-depleted Haploidentical Transplant Graft Content in Patients with Hematologic Malignancies. Bone Marrow Transplant. 2015 Jul 50(7): 968–977.[3] Chan WK, et al. Chimeric antigen receptor-redirected CD45RA-negative T cells have potent antileukemia and pathogen memory responsewithout graft-versus-host activity. Leukemia. 2015 Feb 29(2):387-95.[4] Xiao L, et al. Adoptive Transfer of NKG2D CAR mRNA-Engineered Natural Killer Cells in Colorectal Cancer Patients. Mol Ther. 2019 Jun 5 27(6):1114-1125.[5] Aravindaram K, et al. Transgenic expression of human gp100 and RANTES at specific time points for suppression of melanoma. Gene Ther. 2009 Nov 16(11):1329-39.[6] Lewis SM, et al. Generation of bispecific igG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat Biotechnol. 2014 Feb 32(2):191-8.[7] Ashizawa T, et al. Antitumor Effect of Programmed Death-1 (PD-1) Blockade in Humanized the NOG-MHC Double Knockout Mouse. Clin Cancer Res. 2017 Jan 1 23(1):149-158.[8] Pradier A, et al. Small-Molecule Immunosuppressive Drugs and Therapeutic Immunoglobulins Differentially Inhibit NK Cell Effector Functions in vitro. Front Immunol. 2019 Mar 27 10:556. [9] DELFIA经典技术应用于单抗研发及细胞治疗——AD0116细胞杀伤专题之ADCC https://mp.weixin.qq.com/s/0lkBdDHL5MFIyoeoFV4wWQ关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

遗传性视网膜营养不良（Inherited retinal dystrophies, IRDs）是可导致进行性视网膜退化的遗传缺陷性罕见疾病，常见的IRD相关基因缺陷超过200种。近几年，眼科领域的基因治疗临床试验项目数量激增，包括基因替换、基因编辑和基因沉默多个技术方面。2017年美国FDA首次批准了视网膜Voretigene Neparvovec基因疗法（Luxturna, Spark Therapeutics），用于治疗RPE65.1双等位基因突变引起的罕见眼科疾病，称为Leber先天性黑蒙。这个里程碑意义的决定为眼科疾病基因疗法打开了大门。目前大部分临床研究疗法目标是通过导入正常功能基因，从而恢复缺陷基因编码蛋白质的正常表达。在非临床研究和临床研究中，检测转基因目的蛋白表达是基因疗法开发的一个关键方面。 目前，有多种技术可实现目的蛋白表达定量检测包括配体结合法(Ligand binding assay，LBA)如酶联免疫吸附方法（ELISA）、液相色谱-质谱（LC-MS）、流式细胞术、蛋白质免疫印迹（Western Blot）和组织染色技术。每种技术都有各自优势和局限，如目的蛋白为分泌性表达，可采用ELISA方法检测细胞培养上清液或体液系统中目标蛋白含量；如目的蛋白不能分泌表达，可采用Western Blot或质谱方法；如需要检测细胞膜蛋白，可采用流式细胞术；如要确定蛋白质在细胞和组织内分布，可采用免疫荧光检测。 在体内和体外模型中研究基因治疗产物与治疗靶点的相关作用机制和效应，选择生物相关性模型来检测目的基因表达和生物学活性非常重要。对于眼部疾病可探索选择临床前研究模型如细胞系模型、人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的视网膜类器官疾病模型、啮齿动物和非人灵长类动物等，根据生物学相关性和测定时间可在不同阶段综合选择特异性评估模型。眼部疾病细胞模型案例1：iPSC衍生视网膜色素上皮细胞（RPE）中低丰度大分子量蛋白质表达检测 从三名Stargardt病人皮肤活检样本产生多个iPS细胞系，这些患者都携带一个致病性ABCA4基因变异。采用RNA-Sep和Digital WB分析正常对照和患者细胞衍生的RPE。这个细胞模型与活检组织相比，可用于评估难以检测的非表达变异体，患者来源的细胞可能更密切地反映患者体内发生的剪接和编辑事件，可用于病人药物敏感性研究，指导临床试验。采用全自动Digital WB技术分析pABCA4蛋白质表达，制备了20 μg 总蛋白 dRPE 细胞匀浆，阳性和阴性对照分别是20 μg野生型和 ABCA4 敲除小鼠视网膜匀浆。参考下图，小鼠视网膜（Mouse ret）在野生型(WT)中pABCA4表达丰度很高，敲除（KO）小鼠没有表达。人类对照（NHDF）具有比WT小鼠视网膜更高表观分子量，同时有更高的表达丰度。与对照相比，所有患者细胞系（H、J和S）中均可检测到pABCA4 ，但这些低丰度pABCA4蛋白可能被降解，作为截短蛋白或降解产品形式存在（除S2外）。与mRNA表达谱结果一致，S2细胞系具有相对正常的pABCA4表达水平和修饰后成熟膜蛋白的分子量。本研究利用了Digital WB对低丰度和大分子量蛋白质分析检测能力。案例2：眼角膜内皮细胞信号通路中多重蛋白质表达检测 本研究采用人源和鼠源细胞，分别是敲低了SLC4A11表达水平的原代人角膜内皮细胞（primary human corneal endothelial cells, pHCEnC），即SLC4A11 (SLC4A11 KD pHCEnC)；还有Slc4a11+/+和Slc4a11-/-鼠角膜内皮细胞系（murine corneal endothelial cells, MCEnC），即 Slc4a11-/- MCEnC和Slc4a11+/+ MCEnC。比较转录组学分析揭示了SLC4A11 KD pHCEnC和Slc4a11-/- MCEnC中细胞代谢和离子转运功能抑制以及线粒体功能障碍，导致ATP生产减少。AMPK-p53/ULK1通路激活也表明线粒体功能障碍和线粒体自噬。稳态 ATP 水平降低和随后 AMPK-p53 通路激活提供了代谢功能缺陷和转录组改变之间的联系，以及 ATP 不足以维持 Na+/K+-ATPase角膜内皮泵的证据，这是 SLC4A11 相关角膜内皮营养不良特征性水肿的原因。所以SLC4A11缺陷角膜内皮中分子作用导致内皮功能障碍，是先天性遗传性角膜内皮营养不良 (congenital hereditary endothelial dystrophy, CHED) 和Fuchs 角膜内皮营养不良的主要特征。 下图结果表明SLC4A11缺陷角膜内皮中AMPK-p53 通路激活，采用Digital WB检测信号通路中各蛋白质表达水平。图B说明与 scRNA pHCEnC 对照相比，SLC4A11 KD pHCEnC 中 p53 Ser15 磷酸化水平增加，表明p53转录翻译后激活。图C在Slc4a11-/- MCEnC晚期传代中观察到相似结果（p53 Ser18磷酸化增加，对应于人p53 Ser15）。图C和D结果表明在Slc4a11-/- MCEnC 早期和晚期传代中总 p53 水平增加，代表p53转录激活。进一步研究磷酸化和p53转录激活的激酶，根据报道AMPK介导 Ser15（小鼠中Ser18）磷酸化和p53转录激活，图B和C实验结果也说明AMPKα的Thr172磷酸化增加，AMPKβ1的Ser182磷酸化没有变化。图E和F，与 scRNA pHCEnC 相比，AMPK 另一种下游底物 Unc-51 样自噬激活激酶 1 (ULK1) 在SLC4A11 KD pHCEnC中磷酸化水平(Ser555)增加。综合这些结果表明，ATP水平下降导致AMPK及其下游底物p53 和 ULK1 激活，分别导致转录组改变和线粒体自噬增加。同样，鉴于 SLC4A11 在预防氧化损伤中的作用，SLC4A11 缺失导致线粒体 ROS 产生增加，随后线粒体功能障碍和线粒体自噬增加。此发病机制支持使用Slc4a11-/-小鼠作为SLC4A11相关角膜内皮营养不良的模型，评估各种治疗方法的转化潜力。 基于Digital WB技术的全自动蛋白质表达分析系统Jess可实现化学发光和荧光两种检测模式，是多重蛋白质表达分析有力工具。2022年，ProteinSimple发布了Stellar全自动双色荧光蛋白质表达检测方案，特别适合同步分析细胞信号通路磷酸化蛋白和总蛋白表达，将细胞信号通路研究工具带到一个新高度。iPSC衍生视网膜类器官模型案例1：Digital WB检测iPSC衍生的视网膜类器官中视紫红质表达含量 美国NIH研究人员利用成纤维细胞重编程获得诱导多能干细胞（iPSC），再分化产生视网膜类器官。通过转录组学分析，确定了视网膜类器官发育过程中调节信号，在体外生成了更成熟视网膜，可促进疾病建模和基因治疗研究。本研究采用Digital WB技术揭示了不同培养条件下类器官培养物种视紫红质（Rhodopsin）表达差异。下图结果表明，DHA处理的类器官在32天时视紫红质表达增加了30%，而亚油酸（LA）处理类器官视紫红质表达降低，这表明DHA处理的类器官中视紫红质表达增加不是脂肪酸添加带来的。案例2：AAV基因治疗的RetGC-GUCY2D视网膜类器官疾病模型 Leber先天性黑蒙可由多种不同突变基因导致包括RPE65、CEP29、GUCY2D和CRX等。其中Leber先天性黑蒙1型由GUCY2D基因突变导致，可导致严重视力损害或失明。GUCY2D基因正常拷贝编码了一种鸟苷酸环化酶（RetGC），其是感光器生理学中关键酶之一，视网膜中光敏杆状细胞和视锥细胞使用该酶将光转换为电化学信号。 英国MeiraGTx公司研究人员利用CRISPR/CAS9 技术生成 RetGC 敲除 (RetGC KO) 视网膜类器官，iPSC衍生视网膜类器官分化后，将RetGC KO 视网膜类器官与同一细胞系的野生型类器官进行对比研究。总共设计了四种 AAV 载体来测试RetGC 蛋白在光感受器中的恢复情况，所有载体采用AAV7递送。CMV 和视紫红质激酶 (RK) 两个启动子，并评估了WoodChuck肝炎病毒翻译后调控元件 (WPRE) 影响。采用Digital WB检测6组类器官中RetGC蛋白表达水平。实验结果揭示，与非转导样本组比，所有载体设计均以不同效率产生RetGC蛋白。加入WPRE似乎显示出效力降低趋势，通过其他量化指标验证了这个趋势。 Digital WB相比传统Western blot，只需要几十分之一样本量就可实现类器官等珍贵样本中蛋白质定量检测，而且重复性更高和速度更快，非常适合眼部疾病类器官模型的转基因目的蛋白及相关通路蛋白表达分析。“全自动Digital WB技术是眼部疾病蛋白质表达定量的重要工具 Jess全自动数字化蛋白质表达定量分析系统 (Digital WB) 是Bio-Techne集团旗下蛋白质分析品牌ProteinSimple所有。系统利用毛细管电泳免疫学分析技术，可从微量样品中自动吸取、分离、捕获蛋白质，并通过化学发光或荧光检测目的蛋白含量。针对眼部疾病基因治疗应用技术优势Digital WB技术适合眼科基因治疗体外和体内各种模型中转基因目的蛋白表达定量分析，用于视网膜细胞系、iPSC衍生视网膜色素上皮细胞（RPE）和类器官、小鼠动物模型和非人灵长类动物模型的关键蛋白质分析。适合于基因治疗研发的不同阶段对转基因目的蛋白及相关信号通路蛋白检测需求。满足类器官和视网膜微量样本蛋白质分析需求，Digital WB技术样本量需求是传统Western Blot几十分之一，只需要3 μL样本量就可实现多重蛋白质表达检测，特别适合眼部疾病微量珍贵样本蛋白质分析。Digital WB精准定量检测，传统Western Blot只能满足样本半定量需求，重复性比较差。基因治疗某些目的蛋白表达与临床治疗效果相关联，可作为替代生物标志物，建立量效关系。要求目的蛋白分析检测标准需要提高，要求技术需要经过严格验证，Digital WB可满足这些需求。符合基因治疗产业对自动化标准化和效率的需求，面对行业激烈竞争，需要提升研发效率。Digital WB实现了全自动化和标准化，软件符合FDA 21 CFR Part 11合规性需求。系统3个小时完成一批次蛋白质分析，比传统Western Blot快4倍，大大提高了实验效率，同时减少人力成本。 Digital WB自动化程度高、重复性好、灵敏度高和具有较宽动态检测范围，这些特点满足眼部疾病基因治疗项目不同阶段的目的蛋白定量需求。Digital WB已被国内外知名基因治疗机构采用如Biogen, Sarepta Therapeutics, MeiraGTx，ATGC, Spark Therapeutics，Regenxbio，CRISPR Therapeutics, Editas Medicine, Bluebird bio，杭州嘉因生物、中国食品药品检定研究院等，必将在基因治疗研发阶段、非临床研究和临床研究阶段发挥更大的作用。扫描下方二维码，获取更多关于Digital WB资料参考文献：

前言吾日三省吾身，定量实验做对照了吗？在荧光定量PCR实验中遇到没有曲线、曲线异常等情况，我们总是会在第一时间去看阳性对照和阴性对照的扩增情况来分析原因。由此可见，实验中做对照的重要性不言而喻。在荧光定量PCR实验中，我们通常会按照如下的流程进行实验：样品采集，运输，样品处理，核酸提取，反转录（RNA 病毒），扩增 ，结果读取。为了提高实验结果的精准度，我们通常会通过设置对照的方式对检测的各个环节进行监控。阴性对照荧光定量PCR的灵敏度较高，对实验室的污染也非常敏感，阴性对照可以用来监控和发现污染的发生。常用的阴性对照包括以下几种：无模板对照（No Template Control, NTC）使用水代替荧光定量 PCR反应中的核酸，其它试剂按比例正常加入，用于监控扩增反应体系中的污染。正常情况下，NTC孔不会有扩增；当NTC出现扩增，则预示体系中有污染。在SYBR Green实验中，引物二聚体的形成也可能导致NTC出现扩增。阴性样本对照（Negative Sample Control）阴性样本对照指不含有目的基因或者靶序列的样本，也可以是样本保存液。和含有目的基因的样本一起进行核酸提取等过程。如果出现扩增，则说明实验过程中存在污染，结合NTC结果进行判断。无逆转录酶对照（No Reverse-Transcriptase Control, No RT）当进行RNA定量实验时，如果引物和探针设计在同一个外显子上，扩增有可能来源于未去除干净的DNA，此时可以设置无逆转录酶对照。无逆转录酶对照中不加逆转录酶。由于没有cDNA，DNA聚合酶无法扩增mRNA，则不应发生扩增。如果检测到扩增，则样本中可能含有未去除干净的DNA。阳性对照阳性对照必然是阳性的结果，用于排除假阴性。如果检测出来了这个样本不是阳性，则说明实验有问题，不可靠。阳性样本对照（Positive Sample Control）阳性内对照虽然可以在一定程度上反应核酸提取效率，但是却很难反馈提取流程中对核酸释放的效率。为了能更好的反映提取效率，可以选择已知阳性的样本或者保存在相似基质中已知浓度的病原体，作为单独的样本进行提取和后续的RT-PCR，通过Ct值评断实验流程。内参基因（Endogenous Control）内参基因可以用于反应样本本身的质量，比如拭子是否刮取到样本、RNA在运输和保存过程中是否有严重的降解等问题。内参基因一般选择在取样组织或细胞中均有足量表达的基因，且其表达量不受环境、实验处理条件和取样时间等因素影响，常用内参基因如表1所示。没有某个内参基因是万能的，内参基因需要根据样本类型和实验处理方式进行评估和选择。实验中通过内参基因的Ct值来判断取样和样本降解情况。在相对定量实验中，内参基因亦可用于对取样量进行均一化。▲ 表1: 已报道的部分物种qPCR内参基因扩增对照（Amplification Control）可使用含有扩增片段的质粒、假病毒或者基因组DNA/cDNA作为扩增阳性对照，监控荧光定量PCR的体系是否正常。当扩增对照没有扩增，或者Ct值大于预期，则说明定量PCR体系存在问题。内部阳性对照（Internal Positive Control, IPC）如果想监控每一份样本的整个实验过程，可以在提取之前在每个样本中加入一段外源DNA或RNA（不含目的片段），并在定量PCR时进行单管多重PCR，同时检测目的基因和这段序列。在每个样本中加入特定拷贝数的IPC，进而从该段序列的Ct值判断对应样品孔中的核酸富集和扩增效率。

随着精准医学与人工智能概念的不断提出和发展，精准的病理组织学和细胞学诊断越来越重要，人工智能在细胞学诊断中的作用也越来越多的引起关注。由国家卫健委北京医院与北京市病理质控中心联合主办的京医论坛——细胞病理学与人工智能高峰论坛于10月19-23日在北京举行，滨松受邀参加，并携手91360为细胞病理学AI软件+细胞病理学提供一体化数字病理解决方案。四川大学华西医院病理科教授、病理研究室主任，中华医学会病理学分会主任委员步宏老师做了精彩的开场发言，表达了对人工智能技术的渴望，细胞病理学的AI发展不是替代病理医生，而是更好的辅助医生诊断，使病理的诊断更加高效。作为主办方的卫生部北京医院病理科刘东戈主任，介绍了此次细胞病理学人工智能诊断比赛的参赛规则，由六家医院各提供20张细胞学病理切片，在1小时内完成切片的数字化扫描和AI软件的病变判读，刘主任并在赛后做了精彩点评，从病理科实际使用角度为参赛的扫描仪厂家和细胞学AI软件厂家提供了改进建议。论坛以宫颈癌细胞学人工智能诊断为主要内容进行现场测试，滨松病理切片扫描仪NanoZoomer-S360于本次论坛中亮相，联合91360开发的AI软件进行参赛。在现场测试的过程中，许多专家学者惊叹于NanoZoomer S360 “高速、高通量”这一特点，其数字病理切片20倍/40倍扫描（15mm*15mm）只需30秒。此款扫描仪很快完成了20张宫颈癌液基细胞切片的扫描工作，91360的AI软件迅速抓取图像数据，以精准的算法进行了细胞阅片诊断。滨松数字病理技术进入中国已有十余年，一直陪伴并支持着中国数字病理从最初到如今的发展，获得了业界广泛认可。在人工智能兴起的当下，“AI+数字病理”成为热门话题，亦是本次论坛的一个重要主题，滨松数字病理技术也积极参与到了该应用的建设中。通过此次比赛，众多病理学AI软件开发公司也亲眼见证了滨松的硬件制造实力，纷纷表达了后期开展深入合作的想法，今后滨松亦将持续发展，通过提供高性价的硬件产品，为病理学行业的人工智能时代发展助力。

p style=" text-align: left " 　　近日，台湾省食药署7月26日预告《细胞及基因治疗产品管理法草案》(以下简称草案)，《草案》明确了细胞及基因治疗产品的定义，同时在确保安全状况下核淮暂时性许可证，意味着病人在药品未核淮上市前也能抢先用药。 /p p style=" text-align: center " img width=" 450" height=" 300" title=" 20170802011202157.jpg" style=" width: 450px height: 300px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/61c7f0d7-7818-463a-9b30-dc5efa0f6125.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / /p p 　　据悉，台湾食药署以现行法规《药事法》来管理细胞治疗、基因治疗等新兴疗法，根据规定，试验用药物必须先经核淮，再送交教学医院进行一至三期的临床试验，台湾食药署药品组副组长祈若凤表示：有些患者情况紧急，需要立即用药，而在无药可用的情况下，患者只能出国治疗，同时，用《药事法》来管理这类具独特性的产品，的确也有不足及不合适之处，因此， /p p 　　综合以上情况，食药署决定另立专法管理，即设定暂时性许可证机制，只要确认了捐赠者的合适匹配，并使细胞或基因治疗产品无传染性疾病的风险，在能确保安全性的前提下，不一定要完成三期试验也能核淮暂时许可使用。 /p p 　　祁若凤说，因为细胞及基因治疗产品回牵涉到捐赠者的合适性问题，如若品质管理不当，极易衍生感染风险，而《草案》可提供确保细胞及基因治疗产品品质、安全及疗效的法律规范，促进病人接受新兴产品治疗权利。 /p p 　　目前，对于细胞及基因疗法的暂时性许可证机制的细节还在商讨中，而《草案》将进行为期60天的评论期以及向各界征求意见，之后会送到行政院核定，再送立法院立法。 /p

隔壁的直男师兄今年喜得千金，最近总在实验室诡异地傻笑，问他为何，说是时常想起女儿的可爱模样。 这种感情，没养育过孩子的人恐怕理解不了。但生物汪在实验室养育细胞，也一样寄托感情，生怕细胞被养坏了。一个闪失，就前功尽弃。实验结果不可靠，没有一致性和稳定性，还重复不出来，再浓密的头发也经不住这样的考验。所以，有一个稳定、一致的培养环境，那就很重要了。 培养细胞不可能24小时值守，快快请出四大护法相助！ 1. 大护法：二甲基亚砜（DMSO） 成功冻存和复苏细胞是细胞培养研究的常规操作。细胞低温储藏时，防止冰晶形成是维持细胞活力的关键。大护法DMSO作为冷冻保护玻璃化剂，可以让细胞免受冰晶导致的机械损伤。大护法法力无边，能够用于原代、继代培养和重组的异倍体和杂交瘤细胞系、胚胎干细胞 (ESC) 以及造血干细胞的冻存。 下面为大家解密DMSO这个既熟悉又陌生的细胞培养大护法～～l DMSO的摩尔浓度是多少？DMSO的摩尔浓度为14.1 M，依据是密度1.1 g/mL和分子量78.13 g/ml。l DMSO的来源？过去，DMSO是从树皮中分离出来的。现在，它是一种商业合成的溶剂。l 细胞冻存培养基中应使用什么浓度的DMSO？DMSO通常以1-10％的浓度使用，具体取决于细胞系。 l DMSO应该是液体，为什么我收到后却是固体？DMSO的熔点为16-19℃，室温过低就凝固。这并不妨碍使用，可以缓慢加热令其重新液化，不会有任何影响。l 哪种类型的过滤器可用于无菌过滤DMSO？DMSO可以用带0.2 μm PTFE膜的过滤器进行无菌过滤。 每个伺候细胞宝宝的“宝爸宝妈”对棕瓶子白盖子的DMSO应该都不陌生。没错！正是Sigma-Aldrich® 品牌热卖的这款DMSO（货号：D2650）：明星产品，质量过硬，口碑积累，适用性广，久经验证。 2. 二护法：血清 血清里的生长因子能促进细胞的繁殖，附着因子可促进细胞的贴壁，此外矿物质、脂类及激素对细胞也大有裨益。常用的血清有胎牛血清和小牛血清，公认澳洲来源的血清品质更优、更安全。 赶快来了解一下保护细胞宝宝的二护法吧～～l 如何解冻血清？血清应在2-8°C过夜解冻以避免降解，或者在室温条件下，定期轻轻摇动使组分重悬。解冻的血清在加入细胞培养基前应该混合均匀。反复冻存会严重影响血清品质，建议将解冻的血清分装成单次使用量，并冻存于-20°C。如果储存于2-8°C的环境中，应该在2-4周内尽快使用。温度超过37°C时血清会降解，功能遭到破坏。l 如果血清收到时存在部分解冻，还能继续使用吗？血清是干冰包装运输，到达时应该是冷冻状态。运输超期，会部分解冻，但依然可以继续使用。l 培养基中加入血清和所有补充物后可以储存多久？如果正确无菌操作，添加血清的培养基可以在2-8°C最长储存6周。不论储存时间长短，一旦培养基变浑浊，应该使用适当的方法丢弃。l 为什么血清会出现浑浊或絮状物质？原因很多，主要有二：1. 反复的冻融会使血清脂蛋白发生变性造成浑浊，所以，一定要分装哦～～2. 血清加工中遗留的纤维蛋白原在解冻时会转化成纤维蛋白，过量的纤维蛋白就呈现为絮状物。不要着急，可以离心移除；不推荐过滤哦，因为容易堵。l 什么是γ辐照的血清？γ辐照的血清通过暴露于放射性60Co产生的25-40 kGy剂量的γ射线来灭活病毒和其他外来微生物(比如支原体)。γ辐照处理不影响血清的理化性质或细胞培养性能。l 为什么有些血清是热灭活的？如何热灭活？哺乳动物血清中天然存在的补体蛋白参与细胞溶解事件、收缩平滑肌、从肥大细胞和血小板中释放组胺和激活淋巴细胞和髓细胞。热灭活破坏了血清中补体的活性，因此免疫学应用，培养胚胎干细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时推荐使用。热灭活方法是在56°C水浴中处理30分钟，并每隔大约10分钟旋转一次瓶子。为了保持精确，可使用一个类似大小的瓶子作为对照，对照瓶内放入同等体积的水，并放置一个温度计，在温度到达56°C时开始计时30分钟。热灭活过程必须小心控制，避免血清中支持细胞和组织繁殖的关键蛋白组分发生降解。l 胎牛血清的颜色和之前使用的批次不同，会影响血清使用效果吗？血清的颜色取决于血红蛋白浓度，颜色差异不影响血清性能。 说了这么多，从哪里请到这尊神呢？当然首选默克啦～～澳洲来源的牛血清，满足培养细胞的不同需要！货号产品描述F8318-500ML胎牛血清，澳大利亚来源，无菌，适合细胞培养，适合杂交瘤细胞，500mLF8687-500ML胎牛血清，澳大利亚来源，γ辐照，无菌，适合细胞培养，适合杂交瘤细胞，500mLB7446-1000ML小牛血清，澳大利亚来源，无菌，适合细胞培养，适合杂交瘤细胞，1000mLB7447-1000ML小牛血清，澳大利亚来源，γ辐照，无菌，适合细胞培养，适合杂交瘤细胞，1000mL 3. 三护法：胰蛋白酶 在细胞培养中，从组织上解离或从贴壁基质上分离细胞的步骤很关键，一般使用胰蛋白酶。胰蛋白酶作用于赖氨酸或精氨酸的C末端，在37°C时具有最佳的效率，因此使用期前要预热。当然，高浓度的胰蛋白酶长期孵育会去除细胞表面蛋白而损伤细胞，甚至杀死细胞。看来，这个护法的脾气可不好哦～～ 根据应用和细胞类型的不同，胰蛋白酶的组分和浓度也不同。比如，粘附分子在钙离子存在时决定细胞-细胞和细胞-基质的相互作用，为了削弱折衷联系，通常使用含EDTA的胰蛋白酶螯合二价阳离子（Ca, Mg）（点击这里，了解更多：T4049）。 胰蛋白酶的主要来源是猪的胰脏，产品是冻干粉或溶液。为了避免动物或微生物物质，现在也有技术可以在玉米中重组表达牛胰蛋白酶，厉害吧？(点击这里，了解更多：T3449)。 胰蛋白酶的使用浓度也很有讲究。对于强贴壁细胞系，常使用0.25%-2.5%的胰蛋白酶。如果实验需要细胞表面蛋白完整，则应降低使用浓度（0.05%胰蛋白酶）。 4. 四护法：抗生素 细菌宝宝的生存环境这么好，肯定有坏蛋觊觎，这就需要请出四护法——抗生素。 常见的生物污染由细菌、真菌和支原体造成，部分由病毒、化学物和细胞交叉污染造成。抗生素可以控制细胞培养中的生物污染。灵活使用抗生素是控制污染的方法，但千万不要偷懒，还是要注意无菌操作哦～～ 青霉素对大多数革兰氏阳性菌和少数革兰氏阴性菌有效，链霉素对革兰氏阴性菌和少数革兰氏阳性菌有效，联合使用青霉素和链霉素（简称双抗），就能有效控制细胞培养中大多数细菌的污染啦～～ 默克旗下有相当靠谱的抗生素。Sigma-Aldrich® 品牌热卖的青链霉素溶液（货号为V900929）不仅性能稳定，超高性价比；而且还是即用型经典配方（10KU青霉素和10mg链霉素/mL），直接以1:100比例添加到培养基中就全搞定！ 怎么样？这四大护法，是不是各个身手不凡呀！有了他们，细胞宝宝就可以健康无忧啦～～ 友情提醒，11月起我们会推出四大护法优惠组合套装，敬请留意~也欢迎大家在留言区分享自己培养细胞的心得体会～～我们会精选出五个有趣有料的留言，送上默克超可爱的萌娃家族盲盒一个，共有5位幸运儿，快来留言参与吧！ 留言截止时间：2020年10月30日12：00

隔壁的直男师兄今年喜得千金，最近总在实验室诡异地傻笑，问他为何，说是时常想起女儿的可爱模样。 这种感情，没养育过孩子的人恐怕理解不了。但生物汪在实验室养育细胞，也一样寄托感情，生怕细胞被养坏了。一个闪失，就前功尽弃。实验结果不可靠，没有一致性和稳定性，还重复不出来，再浓密的头发也经不住这样的考验。所以，有一个稳定、一致的培养环境，那就很重要了。 培养细胞不可能24小时值守，快快请出四大护法相助！ 1. 大护法：二甲基亚砜（DMSO） 成功冻存和复苏细胞是细胞培养研究的常规操作。细胞低温储藏时，防止冰晶形成是维持细胞活力的关键。大护法DMSO作为冷冻保护玻璃化剂，可以让细胞免受冰晶导致的机械损伤。大护法法力无边，能够用于原代、继代培养和重组的异倍体和杂交瘤细胞系、胚胎干细胞 (ESC) 以及造血干细胞的冻存。 下面为大家解密DMSO这个既熟悉又陌生的细胞培养大护法～～l DMSO的摩尔浓度是多少？DMSO的摩尔浓度为14.1 M，依据是密度1.1 g/mL和分子量78.13 g/ml。l DMSO的来源？过去，DMSO是从树皮中分离出来的。现在，它是一种商业合成的溶剂。l 细胞冻存培养基中应使用什么浓度的DMSO？DMSO通常以1-10％的浓度使用，具体取决于细胞系。 l DMSO应该是液体，为什么我收到后却是固体？DMSO的熔点为16-19℃，室温过低就凝固。这并不妨碍使用，可以缓慢加热令其重新液化，不会有任何影响。l 哪种类型的过滤器可用于无菌过滤DMSO？DMSO可以用带0.2 μm PTFE膜的过滤器进行无菌过滤。 每个伺候细胞宝宝的“宝爸宝妈”对棕瓶子白盖子的DMSO应该都不陌生。没错！正是Sigma-Aldrich® 品牌热卖的这款DMSO（货号：D2650）：明星产品，质量过硬，口碑积累，适用性广，久经验证。 2. 二护法：血清 血清里的生长因子能促进细胞的繁殖，附着因子可促进细胞的贴壁，此外矿物质、脂类及激素对细胞也大有裨益。常用的血清有胎牛血清和小牛血清，公认澳洲来源的血清品质更优、更安全。 赶快来了解一下保护细胞宝宝的二护法吧～～l 如何解冻血清？血清应在2-8°C过夜解冻以避免降解，或者在室温条件下，定期轻轻摇动使组分重悬。解冻的血清在加入细胞培养基前应该混合均匀。反复冻存会严重影响血清品质，建议将解冻的血清分装成单次使用量，并冻存于-20°C。如果储存于2-8°C的环境中，应该在2-4周内尽快使用。温度超过37°C时血清会降解，功能遭到破坏。l 如果血清收到时存在部分解冻，还能继续使用吗？血清是干冰包装运输，到达时应该是冷冻状态。运输超期，会部分解冻，但依然可以继续使用。l 培养基中加入血清和所有补充物后可以储存多久？如果正确无菌操作，添加血清的培养基可以在2-8°C最长储存6周。不论储存时间长短，一旦培养基变浑浊，应该使用适当的方法丢弃。l 为什么血清会出现浑浊或絮状物质？原因很多，主要有二：1. 反复的冻融会使血清脂蛋白发生变性造成浑浊，所以，一定要分装哦～～2. 血清加工中遗留的纤维蛋白原在解冻时会转化成纤维蛋白，过量的纤维蛋白就呈现为絮状物。不要着急，可以离心移除；不推荐过滤哦，因为容易堵。l 什么是γ辐照的血清？γ辐照的血清通过暴露于放射性60Co产生的25-40 kGy剂量的γ射线来灭活病毒和其他外来微生物(比如支原体)。γ辐照处理不影响血清的理化性质或细胞培养性能。l 为什么有些血清是热灭活的？如何热灭活？哺乳动物血清中天然存在的补体蛋白参与细胞溶解事件、收缩平滑肌、从肥大细胞和血小板中释放组胺和激活淋巴细胞和髓细胞。热灭活破坏了血清中补体的活性，因此免疫学应用，培养胚胎干细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时推荐使用。热灭活方法是在56°C水浴中处理30分钟，并每隔大约10分钟旋转一次瓶子。为了保持精确，可使用一个类似大小的瓶子作为对照，对照瓶内放入同等体积的水，并放置一个温度计，在温度到达56°C时开始计时30分钟。热灭活过程必须小心控制，避免血清中支持细胞和组织繁殖的关键蛋白组分发生降解。l 胎牛血清的颜色和之前使用的批次不同，会影响血清使用效果吗？血清的颜色取决于血红蛋白浓度，颜色差异不影响血清性能。 说了这么多，从哪里请到这尊神呢？当然可以选择默克啦～～澳洲来源的牛血清，满足培养细胞的不同需要！货号产品描述F8318-500ML胎牛血清，澳大利亚来源，无菌，适合细胞培养，适合杂交瘤细胞，500mLF8687-500ML胎牛血清，澳大利亚来源，γ辐照，无菌，适合细胞培养，适合杂交瘤细胞，500mLB7446-1000ML小牛血清，澳大利亚来源，无菌，适合细胞培养，适合杂交瘤细胞，1000mLB7447-1000ML小牛血清，澳大利亚来源，γ辐照，无菌，适合细胞培养，适合杂交瘤细胞，1000mL 3. 三护法：胰蛋白酶 在细胞培养中，从组织上解离或从贴壁基质上分离细胞的步骤很关键，一般使用胰蛋白酶。胰蛋白酶作用于赖氨酸或精氨酸的C末端，在37°C时具有最佳的效率，因此使用期前要预热。当然，高浓度的胰蛋白酶长期孵育会去除细胞表面蛋白而损伤细胞，甚至杀死细胞。看来，这个护法的脾气可不好哦～～ 根据应用和细胞类型的不同，胰蛋白酶的组分和浓度也不同。比如，粘附分子在钙离子存在时决定细胞-细胞和细胞-基质的相互作用，为了削弱折衷联系，通常使用含EDTA的胰蛋白酶螯合二价阳离子（Ca, Mg）（点击这里，了解更多：T4049）。 胰蛋白酶的主要来源是猪的胰脏，产品是冻干粉或溶液。为了避免动物或微生物物质，现在也有技术可以在玉米中重组表达牛胰蛋白酶，厉害吧？(点击这里，了解更多：T3449)。 胰蛋白酶的使用浓度也很有讲究。对于强贴壁细胞系，常使用0.25%-2.5%的胰蛋白酶。如果实验需要细胞表面蛋白完整，则应降低使用浓度（0.05%胰蛋白酶）。 4. 四护法：抗生素 细菌宝宝的生存环境这么好，肯定有坏蛋觊觎，这就需要请出四护法——抗生素。 常见的生物污染由细菌、真菌和支原体造成，部分由病毒、化学物和细胞交叉污染造成。抗生素可以控制细胞培养中的生物污染。灵活使用抗生素是控制污染的方法，但千万不要偷懒，还是要注意无菌操作哦～～ 青霉素对大多数革兰氏阳性菌和少数革兰氏阴性菌有效，链霉素对革兰氏阴性菌和少数革兰氏阳性菌有效，联合使用青霉素和链霉素（简称双抗），就能有效控制细胞培养中大多数细菌的污染啦～～ 默克旗下有相当靠谱的抗生素。Sigma-Aldrich® 品牌热卖的青链霉素溶液（货号为V900929）不仅性能稳定，超高性价比；而且还是即用型经典配方（10KU青霉素和10mg链霉素/mL），直接以1:100比例添加到培养基中就全搞定！ 怎么样？这四大护法，是不是各个身手不凡呀！有了他们，细胞宝宝就可以健康无忧啦～～ 友情提醒，11月起我们会推出四大护法优惠组合套装，敬请留意~也欢迎大家在留言区分享自己培养细胞的心得体会～～我们会精选出五个有趣有料的留言，送上默克超可爱的萌娃家族盲盒一个，共有5位幸运儿，快来留言参与吧！ 留言截止时间：2020年10月30日12：00

岛津分析仪器专用试剂、标准品和对照品是由岛津企业管理（中国）有限公司联合四川中测标物科技有限公司共同推出。由中国测试技术研究院确保质量，按照岛津仪器性能特点研发生产。用于评估分析仪器的分析能力和工作状态，确保仪器达到设计需要的分析能力和精密度，保证分析仪器处于稳定可靠、灵敏准确的优良工作状态。 岛津（上海）实验器材有限公司作（简称SGLC）为岛津集团在中国成立的专门经营销售岛津分析仪器纯正部件、色谱消耗品及相关小型仪器的子公司。现全面负责岛津分析仪器专用试剂、标准品和对照品在国内的对外销售业务。 岛津分析仪器专用试剂、标准品和对照品现已涵盖的机种类型有岛津GC、GC-MS、GC-MS/MS，HPLC，LCMS-IT-TOF，LC-MS、LC-MS/MS，UV，AAS，ICP-OES，ICP-MS，TOC等机型。包括仪器重现性测试标准物质、灵敏度测试标准物质、调谐标准物质和验收标准物质等。具体产品选择请参考“岛津分析仪器专用试剂、标准品和对照品”产品目录。（下载产品目录） SGLC一直秉持为仪器分析客户提供更丰富的解决方案，此次引入岛津仪器专用试剂产品，将进一步扩充产品阵容，为分析仪器领域的客户提供更多专业利器。

空间代谢组学：单细胞空间代谢流分析新方法原创 飞飞 赛默飞色谱与质谱中国 关注我们，更多干货和惊喜好礼刘甜生物体内的代谢物和脂质不仅是细胞的关键组成模块，它们在信号传导、表观基因组调控、免疫、炎症和癌症发展中同样具有重要作用和意义。代谢组学分析是我们了解、评估生物体、器官和细胞状态的重要方式。而单细胞技术通过展示组织内部甚至单克隆细胞之间的细胞异质性，将生物学研究推进至新维度。质谱成像（MSI）技术可以从样品中创建特定化合物的图像，这些图像是由样品表面获得的数千个质谱生成的。每个记录的质谱都会为图像贡献一个像素，而每个质谱中的峰都可以生成一个图像。与其他成像方法相比，MSI无需化合物标记，可实现非靶向分析。本次与大家分享的是一篇最新发表于bioRxiv上的有关单细胞空间代谢流分析方法的文章[1]。研究人员基于AP-SMALDI Orbitrap平台开发了一种命名为“13C-SpaceM”的新方法，通过13C标记的葡萄糖示踪葡萄糖依赖性脂肪酸从头合成途径（glucose-dependent de novo lipogenesis）。本方法应用超高分辨率的基质辅助激光解吸/电离实现了单细胞质谱成像，并通过全离子碎裂模式（AIF）模拟了脂肪酸分析前处理过程中的皂化反应，对包括甘油磷脂在内的主要脂质中的脂肪酸部分实现了共同分析。超高灵敏度、高分辨质谱检测器为单细胞内脂肪酸同位素检测提供了准确的定性、定量结果。研究人员通过鼠肝癌细胞的常氧-低氧模型，对检测方法进行了验证，确认方法的有效性。之后应用本方法分别检测了ATP柠檬酸裂解酶基因敲降（ACLY knockdown）鼠肝癌细胞以及携带异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变的小鼠胶质瘤脑组织切片，通过比较脂肪酸的同位素丰度变化评估脂肪酸从头合成比例以及外源性脂肪酸摄取的变化。分析结果揭示了在脂肪酸从头合成过程中，乙酰辅酶A池（Acetyl-CoA pool）中存在大量的空间异质性，这表明在微环境适应过程中发生了代谢重编程。01研究背景脂质在生物体生命过程中承担着多种重要作用，多数脂质是由脂肪酸合成而来。成年哺乳动物体内的细胞通常由血液中摄取脂肪酸，而脂肪、肝脏以及癌细胞还可以Acetyl-CoA为底物，从头合成脂肪酸[2]。Acetyl-CoA经过一系列代谢反应，可以生成含有16个碳的饱和脂肪酸棕榈酸（16:0），之后棕榈酸发生碳链延长或去饱和反应生成不同的饱和、不饱和脂肪酸，从而影响脂质组成。而Acetyl-CoA同样有多种来源，除了葡萄糖经由TCA循环生成的柠檬酸在ACLY作用下生成Acetyl-CoA以外，在缺氧环境下，葡萄糖后续代谢产物丙酮酸会转化为乳酸，从而无法合成Acetyl-CoA、进入脂肪酸合成途径。在此情况下，谷氨酰胺可通过还原羧化反应生成柠檬酸，进而合成Acetyl-CoA [3,4] 。另有文献报道，缺氧环境下的癌细胞还可以将乙酸作为脂肪酸合成的前体 [5,6] 。而Acetyl-CoA除了作为脂肪酸合成底物以外，对于蛋白翻译后修饰、基因表达等均有重要作用。通过监控脂肪酸合成和Acetyl-CoA代谢间的互动可以帮助我们深入理解癌细胞的生存状态。02分析方法大气压MALDI成像分析是通过AP-SMALDI5离子源配合Q Exactive plus高分辨质谱仪实现的。激光像素设置为 10×10 µ m，激光衰减器角度设置为33°。质谱在负离子模式下采用一级全扫描和全离子碎裂（AIF）扫描模式。AIF模式的隔离范围为 m/z 600-1000，扫描范围为m/z 100-400，分辨率 140k，最大注入时间500 ms，碰撞能量NC 25%。（图1）图1. 单细胞代谢流质谱成像分析流程（点击查看大图）MALDI分析前后，分别应用显微镜检测，确定细胞影像位置及MALDI消融标记位置。通过检测MALDI的消融标记，将其与细胞影像叠加，并通过应用数学公式进行解卷积，从而整合显微镜图像和MALDI图像。实现了应用MALDI成像质谱检测到的单细胞分子轮廓。（图2）图2. 整合显微镜和MALDI-MS分析结果实现单细胞质谱成像（点击查看大图）03鼠肝癌细胞常氧-低氧模型单细胞成像分析鼠肝癌细胞在添加25 mM的12C-葡萄糖或U-13C-葡萄糖后，用含1mM醋酸、2 mM谷氨酰胺和10%透析胎牛血清的无葡萄糖DMEM细胞培养基培养，在37°C、5% CO2的培养箱中在常氧（20% O2）或低氧（0.5% O2）条件下培养72小时。选择72小时的时间点是为了确保棕榈酸的同位素标记已经达到稳态。（图3）在低氧条件下培养的细胞被表达绿色荧光蛋白（GFP）标记。在共培养实验中，常氧和低氧细胞使用胰酶分离，每种条件下混合10000个细胞，在同一张玻璃片上进行培养，并在固定之前允许其附着3小时。图3. 由稳定同位素标记的13C6-葡萄糖生成细胞质Acetyl-CoA以及后续的脂肪酸和脂质合成途径（点击查看大图）通过质谱一级全扫描分析，质谱成像共检测到64种脂质，包括磷脂酸（PA）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）等。具体脂质鉴定结果经过了常规LCMS脂质分析确认。在AIF模式下，检测到了11种含量最高的脂肪酸，相应检测结果同样与常规LCMS分析结果相符。为了验证本方法，研究人员检测了常氧-低氧培养的鼠肝癌细胞混合样本。通过对氨基酸同位素峰的定量分析，发现13C标记的棕榈酸（M0）主要在正常细胞中检出，而缺氧细胞中的棕榈酸以未标记状态（M+0）为主。通过GFP标记结果的对照，证明了本方法可以通过同位素峰分布有效识别不同培养状态的细胞。图4. 在常氧（GFP阴性）和低氧（GFP阳性）条件下的原代鼠肝癌细胞共培养模型的显微镜和质谱成像结果（点击查看大图）图5. 通过GFP标记验证识别不同培养模式细胞的准确性（点击查看大图）04单细胞Acetyl-CoA池标记水平分析研究人员使用了两种表达不重叠的shRNA序列（ACLYkd oligo1和ACLYkd oligo 2）细胞系以及一个对照组细胞系。通过使用1 μg/mL的四环素处理细胞72小时实现了ACLY沉默。质谱成像数据是以10 μm的像素大小获得的，每个细胞的平均面积为550μm2，平均每个细胞有12个像素。通过应用二项式模型计算每个细胞的acetyl-CoA池标记程度p值，从而量化细胞质中acetyl-CoA池中从葡萄糖衍生的同位素标记acetyl-CoA的比例。测试结果与预期相符，ACLYkd细胞中的acetyl-CoA池标记水平低于对照组。值得注意的是，两种ACLYkd细胞之间的差异非常明显。ACLYkd oligo1的结果呈双峰分布，p值的差异明显较大，表明该细胞系存在两个亚群体。其中一个模式显示的p值与对照组相近，说明存在一个“沉默失败”的细胞亚群。ACLYkd oligo1第二个模式具有的p值明显则低于ACLYkd oligo 2，表明ACLYkd oligo 1中还存在一个“强沉默”的亚群，在这些细胞中，沉默效率非常高，导致acetyl-CoA同位素标记比例大幅降低。在ACLYkd oligo 2中，acetyl-CoA池的标记程度以及GFP报告基因强度显示出更均一的分布。M+2峰是最能表现出ACLYkd oligo1细胞中“强沉默”群体的低acetyl-CoA标记表型的质谱峰。M+8峰则为对照组细胞的特征标记峰。M+2和M+8之间的差异可以作为显示异质性的指标，用于展示葡萄糖对细胞质中acetyl-CoA的相对贡献。因此，13C-SpaceM能够检测ACLY敲降细胞中的异质性，并识别不同的亚群体。这种单细胞和空间异质性无法通过整体分析揭示，显示了13C-SpaceM方法的独特优势。图6. 细胞ACLY敲降后acetyl-CoA的同位素标记程度分析（点击查看大图）05肿瘤组学中氨基酸合成异质性的空间组学分析研究人员分析了从横向植入表达突变型异柠檬酸脱氢酶（IDH）和红色荧光蛋白（RFP）的GL261胶质瘤细胞的小鼠大脑组织切片。在采集组织前的48小时，小鼠被喂食未标记的或含有U-13C葡萄糖的液体饮食。首先，研究人员分析了12C-葡萄糖饮食的肿瘤携带小鼠大脑切片中的酯化脂肪酸组成。通过比较质谱TIC与显微镜明场和荧光成像，发现整个大脑（包括肿瘤区域）的质谱离子响应很高（图7a）。测试过程中，肿瘤区域与组织切片的其余部分分别采用10μm和50μm激光分辨率进行分析。对不同脂肪酸的空间分析揭示了在非肿瘤携带的脑半球组织中，脂肪酸丰度存在高度的异质性，我们可以仅根据它们的脂肪酸组成来识别的某些结构，如胼胝体和前连合部，这两个区域都富含油酸（18:1）且棕榈酸（16:0）、硬脂酸（18:0）和花生四烯酸（20:4）的含量低。有趣的是，尽管棕榈酸、油酸、硬脂酸和花生四烯酸在肿瘤和周围的大脑组织中的含量相似，肉豆蔻酸（14:0）和棕榈酸（16:1）在肿瘤组织中则明显增加。与大脑其它部分相比，肿瘤中必需脂肪酸亚麻油酸（18:2）和α/γ亚麻酸（18:3）也明显增高。之后，研究人员分析了喂食含有U-13C葡萄糖饮食的小鼠肿瘤组织，从肿瘤组织中选择性分离出的5种主要从头合成的脂肪酸的同位素分布（图7c）。三种饱和脂肪酸肉豆蔻酸（14:0）、棕榈酸（16:0）和硬脂酸（18:0）的13C摄入丰度较高，同位素分布最大分别可至M+10，M+12和M+14。其中，肉豆蔻酸M+0的强度极低，几乎完全源自脂肪酸从头合成。由于肉豆蔻酸对一些重要信号蛋白的翻译后修饰很重要，这一发现表明胶质瘤可能选择性地上调肉豆蔻酸的合成以促进自身生长。相比之下，两种单不饱和脂肪酸，棕榈酸（16:1）和油酸（18:1）的M+0同位素的相对丰度较高。硬脂酸和油酸的M+2同位素丰度明显增加，表明它们是由未标记的前体（即棕榈酸和棕榈酸）延长形成的。研究人员进一步利用棕榈酸的同位素分布计算acetyl-CoA池中源自葡萄糖的比例，发现肿瘤组织内的该比例同样具有显著的空间异质性（图7d）。图7. 小鼠脑胶质瘤组织内部脂肪酸代谢空间异质性分析（点击查看大图）总结本文作者开发了一种全新的单细胞代谢流成像检测方法，将超高激光分辨率的大气压MALDI与高分辨率、高灵敏度的质谱检测器相结合，对细胞和肿瘤组织内的葡萄糖依赖性脂肪酸从头合成途径实现单细胞层面的空间分析。不仅为单细胞水平空间探测代谢活动提供了新的方法，还为正常和癌症组织中的脂肪酸摄取、合成和修饰分析提供了前所未有的视角。参考文献：1. Buglakova E, Ekelö f M, Schwaiger-Haber M, et al. 13C-SpaceM: Spatial single-cell isotope tracing reveals heterogeneity of de novo fatty acid synthesis in cancer. Preprint. bioRxiv. 2024 2023.08.18.553810. Published 2024 Feb 28. doi:10.1101/2023.08.18.5538102. Rö hrig F, Schulze A. The multifaceted roles of fatty acid synthesis in cancer. Nat Rev Cancer. 2016 16(11):732-749. doi:10.1038/nrc.2016.893. Metallo CM, Gameiro PA, Bell EL, et al. Reductive glutamine metabolism by IDH1 mediates lipogenesis under hypoxia. Nature. 2011 481(7381):380-384. Published 2011 Nov 20. doi:10.1038/nature106024. Wise DR, Ward PS, Shay JE, et al. Hypoxia promotes isocitrate dehydrogenase-dependent carboxylation of α-ketoglutarate to citrate to support cell growth and viability. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108(49):19611-19616. doi:10.1073/pnas.11177731085. Kamphorst JJ, Chung MK, Fan J, Rabinowitz JD. Quantitative analysis of acetyl-CoA production in hypoxic cancer cells reveals substantial contribution from acetate. Cancer Metab. 2014 2:23. Published 2014 Dec 11. doi:10.1186/2049-3002-2-236. Schug ZT, Peck B, Jones DT, et al. Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress. Cancer Cell. 2015 27(1):57-71. doi:10.1016/j.ccell.2014.12.002如需合作转载本文，请文末留言。

精准药物分析的工作，离不开稳定的分析系统和可靠的标准物质（标准品/对照品等）。标准物质具有复现、保存和传递量值的基本作用，对实现测量结果的溯源性，保证测量结果在时间与空间上的连续性与可比性，进而确保测量结果的准确可靠、有效与国际互认具有关键作用。 岛津为制药行业客户提供稳定可靠的标准品/对照品制备解决方案：制备液相系统（Prep LC）、质谱引导的制备液相系统（MS-trigger Prep LC），超快速制备纯化液相色谱系统（UFPLC）、制备超临界流体色谱（Prep SFC）。 超快速制备纯化液相色谱系统（UFPLC）可在线完成从分离、浓缩、纯化到回收的制备全过程。 2020年，中国药科大学药物分析系吴春勇博士于新药仿药CMC实操讨论群进行了精彩而全面的主题分享，并发表在“新药仿药CMC实操讨论”公众号，经过“新药仿药CMC实操讨论”的授权，在此分享吴春勇博士的《化学药物研发过程中的对照物探讨》。 概述案例 对于吴春勇博士的《化学药物研发过程中的对照物探讨》，新药仿药CMC实操讨论群也进行了较为热烈的探讨。PPT正文后续延申的讨论内容如下（基本按照时间先后顺序列出）。 沈晓斌博士（前FDA资深审评员，FDA报批咨询顾问）：very nice.吴博士论述的非常全面、非常细。我们就说比如说在FDA做review的时候呢，我们个人不会接触那么全面，各种各样的方式，这个标准品的这个去就是抽点它的含量呀，就是拿到他的COA，通常不会把各种方法都是看过一遍的。 就是它这个PPT呢，把所有的东西都给想细细的捋了一遍，个人觉得就是这是一个对知识体系的全面的补充，有些东西，因为你以前没有接触过，你不会考虑那么细，当在FDA的时候你看到的是公司怎么做，然后你来评估他是否合理，是否可以接受，或者跟FDA的现有要求，来评估。 想要就说一点，FDA本身他不去说去该怎么去定量，这个标准品他只是负责审评，就是评审你（的资料），外界可以自己去建议你想要的方式，但是你要有足够多的科学依据，然后他（FDA）来评估是否可以接受，就是完全靠自己来论述清楚。 另外就是说国内看起来，这个我以前对国内这个没有太多的，而且也没有特别去关注，因为我这个工作最早才从FDA报批方面的东西，吴教授这个主题一讲，觉得国内在有些方面其实要求是似乎是比USP、FDA的要求更细更多一些，有一种感觉就是弯道超车已经超了，在有些方面实际上是做的更好。只不过，过去这些年，西方就是设定了这种既定的质量标准，那其他国家，就因为你要照着西方去做仿药嘛，你就必须根据他的规则来走，更多的是这方面的区别。 孙亚洲老师（长沙晶易首席科学家）：意见1：研发人员买的非法定对照品，外标法测定杂质含量时，很多人直接采用了COA的赋值，也直接采用相应的测定结果订入了标准，有些不妥。包括批检验，最初的朔源需要是法定对照或者经过标定的对照品。 意见2：在吴博士的ppt中，对于非法定来源的如百灵威，sigma等买到的杂质对照品，拿到后是否需要再行进行研究工作或者分析一下是否存在风险，似乎没有提出来。这个问题建议大家是否深入思考一下。 群主补充：只有经过标化赋值且可溯源（过程，方法，验证）的，风险才是最低的。 群主补充：尽管杂质测定中，如5%的误差是可以接受的（这属于科学性的范畴）；但不等同于对照品/标准品可以草率拿来，草率采用他人的赋值，这完全是两个范畴。也许某份杂质对照品中含水量10%，无机成分包括前处理过程带来的硅胶等30%，若草率定量，杂质的真实含量会被低估如40%。 沈晓斌博士：同意以上的观点。 群友1：通过药品杂质的公司购买的对照品，我们就碰到了，欧美的一家知名公司提供的对照品结构出现偏差，我们通过多次比对都无法拿到和代谢产物吻合的结果，多次交涉和讨论之后才发现该公司的产品是另外一个同分异构体。 吴春勇博士（中国药科大学药物分析系副教授）：看来概率虽然小，这个问题还是客观存在的。 沈晓斌博士：提供化合物的公司没有责任和义务。使用者必须做该做的来证明给监管机构标准品的使用是合理的。 刘国柱博士（长沙晨辰医药创始人、技术总监）：我请教吴博士一个问题，目前国内杂质对照品市场非常混乱，大部分购买的杂质对照品都是经几手倒卖才到厂家手里，对照品塑源存在问题，谱图与赋值真实性也存在问题，请问对此引入的风险有何看法？ 群友2：在购买对照品的时候，在COA的同时能否得到该合成方法的信息，这个在技术层面上是有难度的。没有哪个合成公司愿意提供产品合成路线给对方的。 群友3：好多杂质对照品本身不稳定，需要在-20℃保存，有可能在运输过程中就发生了变化，拿到的第一时间应该进行确认，遇到好几次这种情况。 吴春勇博士：在现有的条件下，购买的商业化对照品全部自己赋值，实践上还是存在相当的困难，成本上也没法控制。所以我个人观点：1）尽量选择知名公司；2）自己对风险进行评估，尤其是校正因子与各国药典不同，或者结构上与待测药物的生色团类似，分子量相当，校正因子却有显著不同。 【插话：知名公司依旧有风险或风险大】 是的，分享的那个案例，购买公司是业界相当知名的！ 群友4：购买杂质时能同时获得合成信息的可能性非常小，最多提供四大谱（还不带解谱的），那就需要公司内部有比较强大的解谱能力，有碰到过解谱结果和供应商提供的不一致的情况，所以购买“商业化”的杂质对照风险是很大，市场良莠不齐，缺乏有效的管控。 群友5：我们碰到问题的那家公司就是业界知名对照品公司，也有出失误的概率。 刘国柱博士：另请教吴博士及大家一个问题，目前国内许多企业对于杂质对照品的结构确证，很多时候都只做了质谱与NMR氢谱与碳谱，不做二维；而事实上不做二维NMR谱，NMR信号是无法归属的，从而不足以确定杂质结构，有可能确证的结构是错的；请问这个问题大家如何看待？ 吴春勇博士：我个人只要做结构确认，一定做二维。 刘国柱博士：那我和您观点一致，强烈呼吁大家做结构确证一定要做二维。 购买的杂质对照品一般只提供质谱与NMR氢谱与碳谱，不做二维与结构解析；在此习惯引导下，国内许多企业自已做杂质结构确证也只做个质谱与NMR氢谱与碳谱，个人观点这是存在风险的做法。 代孔恩（安士研发总监）：法规有明确规定必须这么表征，很多标准品量很小，做全应该不容易。【插话：情况多，复杂，没法一刀切】 黄常康博士（南京百泽医药创始人）：有些杂质是定向合成的，或者是有文献数据的。我觉得根据实际情况来判断需不需要。不用二维定不了结构的，该做就做，有些简单的杂质，其实氢谱已经足够了，质谱只是多一个证据。 自己做的话，还需要加上做结构确证的杂质的钱，很多时候会差很多。 群友6：对照品的检测分析，既要有普遍性的，也要特殊性的，这个普遍性与特殊性的界点怎么界定，很难有一个文件化的说法。 以上讨论内容来源： 新药仿药CMC实操讨论公众号

全国规模最大的现代中药及天然产物活性物质对照品与标准品资源库，将落户中山健康科技产业基地。 　　全国标准样品技术委员会天然产物标样专业工作组常务副组长张天佑在接受记者采访时说，我国个别中药药品近年来相继出现的问题，正是标准缺失所致。从现代中药及天然产物活性物质中提取有效成分制作对照品与标准品，使之成为溯源性的根据、分析检测仪器的校准标准物质和质量控制的标准，可为中药新药研发、生产提供标准，“这是中药走向国际市场，突破国际技术壁垒的途径。” 　　国家药监局原副局长任德权称，选择在中山建立这个资源库，不仅因为中山国家健康科技产业基地已经具备承载这个项目的成熟条件，而且由于中山毗邻港澳，可联合粤、港、澳的资源共同打造一个国家级的标准平台，为中国争取在国际标准化中的话语权。 　　“这样，中药出口就拿到了‘国际通行证’。”中山国家健康科技产业基地公司总经理梁兆华形象地比喻。 　　该项目由中山健康科技产业基地、全国标准样品技术委员会、中山大学药学院和广东新龙和药业有限公司合作，项目运营后，3至5年内可以建成拥有几千种对照品与标准品的资源库。该项目有望在今年“328”招商经贸洽谈会上签约。

据美国物理学家组织网10月16日报道，美国俄亥俄州立大学科学家开发出一种名为“纳米隧道电穿孔”的新技术，或称为NEP。利用其给细胞注射基因治疗药剂时，不用针头，而是用电脉冲通过微小的纳米隧道，几毫秒内就能把精确剂量的治疗用生物分子“注射”到单个活细胞内。该研究发表在最近的《自然纳米技术》杂志网站上。 　　长期以来，在进行基因治疗时，人们对插入细胞的药剂数量无法控制，因为人体绝大部分细胞都太小，最小的针头也无能为力。而“NEP让我们能研究药剂和其他生物分子是怎样影响了细胞的生物和基因路径的，现有其他技术都无法达到这么细微的水平。”该校化学与生物分子工程教授詹姆斯李说。他们用这种方法，将定量的抗癌基因成功插入到白血病细胞中并杀死了它们。 　　研究人员用聚合物压制成一种电子设备样机，用DNA(脱氧核糖核酸)单链作为模板来构建纳米隧道。詹姆斯李发明了一种使DNA链解旋的技术，并使其按照需要形成精确结构。他们给DNA链涂上一层金涂层并加以拉伸，使之连接两个容器，然后将DNA蚀去，在设备内部留下一条连通两个容器的尺寸精确的纳米隧道。 　　隧道中的电极将整个设备变成一个微电路，几百伏特的电脉冲从一个装药剂的容器经纳米隧道到达另一个装细胞的容器，在隧道出口处形成了强大的电场，与细胞自身的电荷相互作用，迫使细胞膜打开一个小孔，足够投放药物而不会杀死细胞。调整脉冲时间和隧道宽度，就能控制药物剂量。 　　为了测试NEP能否递送活性药剂，他们把一些治疗用RNA(核糖核酸)插入了白血病细胞，发现5毫秒的电脉冲能递送足够剂量的RNA杀死这些细胞 而更长的脉冲，如10毫秒，能杀死几乎所有的白血病细胞。作为对照，他们还插入了一些无害的RNA到白血病细胞中，这些细胞都没死。 　　詹姆斯李指出，由于这种方法一次只能给一个或几个细胞注射，更适合用在实验室。目前他们正在开发一种机械式细胞装载系统，一次能给10万个细胞注射，有望用于临床诊断和治疗。 　　“我们希望NEP能最终用于早期癌症检测与治疗，比如在干细胞或免疫细胞中插入精确剂量的基因或蛋白质，引导它们分化改变，不必担心过量注射带来的安全问题，然后把这些细胞放回体内作为一种细胞基础疗法。”詹姆斯李说，这种方法还可能用于白血病、肺癌及其他肿瘤。