小鼠骨肉瘤成骨细胞

[size=15px][color=#595959]骨质疏松[/color][/size][size=15px][color=#595959]症(OP)是一种以骨量减少和骨微结构损伤为特征的全身性骨代谢性疾病，它增加了骨脆性和骨折风险，与人口老龄化密切相关，患病率一直很高，正在成为全球关注的问题。此外，由于绝经后性激素水平急剧下降，女性的患病率远高于男性。目前临床治疗骨质疏松的药物包括特立帕肽、雌激素、降钙素、双膦酸盐等，主要目的是促进骨合成和防止骨吸收。这些药物在长期使用中经常会引起不良反应。因此，寻找一种安全有效的治疗方法尤为必要。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]紫花前胡苷（Nodakenin，NK）是从中药独活（RAB）中分离得到的一种呋喃香豆素类化合物。NK已被证明具有抗炎、抗菌、抗氧化和抗血小板聚集作用，并能改善认知功能。最近，研究发现NK通过调节线粒体改善软骨退变和炎症反应，提高软骨下骨体积，从而缓解骨[/color][/size][size=15px][color=#595959]关节炎[/color][/size][size=15px][color=#595959]。然而，NK对OP影响的相关研究尚未见报道。[/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959]评价NK对OVX小鼠的抗骨质疏松作用，探讨NK对体外成骨细胞和破骨细胞形成的调控机制。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]采用网络药理学、分子对接和分子动力学模拟技术来确定NK在[/color][/size][size=15px][color=#595959]骨质疏松症[/color][/size][size=15px][color=#595959]中的潜在靶点和通路。6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠行卵巢切除术，术后8周给予不同剂量NK (5 mg/kg或20 mg/kg)灌胃治疗，连续6周。从4周龄C57BL/6J小鼠骨髓腔中分离并获得BMSCs和BMMs，进行药效观察及机制验证。[/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959]通过测定碱性磷酸酶活性和各种成骨标志物的表达，发现NK处理显著促进骨髓间充质[/color][/size][size=15px][color=#595959]干细胞[/color][/size][size=15px][color=#595959]成骨分化，同时激活PI3K/AKT/mTOR信号通路。相比之下，PI3K[/color][/size][size=15px][color=#595959]抑制剂[/color][/size][size=15px][color=#595959]LY294002逆转了这些变化，抑制了NK的成骨分化作用。同时，通过下调c-Src和TRAF6抑制Akt和NFκB信号通路，从而有效抑制RANKL诱导的破骨细胞生成。此外，口服NK可显著提高小鼠骨量，改善卵巢切除(OVX)介导的骨微结构紊乱。[/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959]这些数据表明NK通过促进骨生成和抑制破骨细胞生成来减轻OVX诱导的骨丢失。该研究可能为骨质疏松症提供潜在的治疗策略。[/color][/size]

【序号】：2【作者】： 刘嘉鑫【题名】：壳聚糖季铵盐涂层改性镍钛合金对成骨细胞生物活性的研究【期刊】：兰州大学【年、卷、期、起止页码】：2021【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CMFD&dbname=CMFD202101&filename=1020304708.nh&uniplatform=NZKPT&v=lXqGjZ-iu9taSraCVq86JDBpyXisbQMpaOLwbBWThiZmjy-BUD2NsjG8Z5kkZmzV

[font=宋体] [font=宋体]升麻为毛茛科植物大三叶升麻[/font][i]Cimicifuga heracleifolia[/i] Kom.[font=宋体]、兴安升麻[/font][i]C. dahurica [/i](Turcz.) Maxim.[font=宋体]或升麻[/font][i]C. foetida [/i]L.[font=宋体]的干燥根茎，含有三萜皂苷、黄酮、生物碱和色酮等化学成分，具有缓解潮热、抗骨质疏松、抗人类免疫缺陷病毒、抗炎、抗糖尿病、抗疟疾和保护血管等多种生物活性[/font][sup][4][/sup][font=宋体]。同属植物黑升麻[/font][i]C. racemosa[/i] L.[font=宋体]在欧洲广泛应用于防治更年期综合征和骨质疏松症[/font][sup][5][/sup][font=宋体]。有研究表明升麻具有与黑升麻相似的缓解去卵巢大鼠更年期综合征和抗骨质疏松作用，其有效成分为三萜皂苷[/font][sup][6-7][/sup][font=宋体]。升麻三萜皂苷能够增加成骨细胞的骨形成[/font][sup][8][/sup][font=宋体]，但其对破骨细胞形成分化和骨吸收的影响及机制尚不清楚。[/font] 破骨细胞为从骨髓巨噬细胞分化的，唯一具有骨吸收功能的细胞。破骨细胞活性增强，骨吸收大于骨形成，骨重建的平衡破坏，导致骨量减少和骨质疏松症的发生[/font][sup][9-10][/sup][font=宋体]。破骨细胞的典型特征为分泌[/font]TRAP[font=宋体]和形成[/font]F-actin[font=宋体]进行骨吸收。[/font]TRAP[font=宋体]是由破骨[/font][font=宋体]细胞分泌的酸性磷酸酶，具有溶解骨矿化基质的作用，是破骨细胞分化成熟的特异性标志酶[/font][sup][11][/sup][font=宋体]。[/font]F-actin[font=宋体]环是破骨细胞特有的进行骨吸收的细胞骨架蛋白，是破骨细胞附着于骨基质表面的重要结构[/font][sup][12][/sup][font=宋体]。培养的破骨细胞通过骨吸收，可在共培养的骨片上形成骨吸收陷窝，其数目和面积常用于表征破骨细胞的骨吸收活性。本研究以[/font]RANKL[font=宋体]及[/font]M-CSF[font=宋体]诱导[/font]BMMs[font=宋体]形成的破骨细胞为模型，观察升麻三萜皂苷对破骨细胞形成、分化和骨吸收的作用，结果表明升麻三萜皂苷阿克特素、升麻环氧醇苷、升麻醇可显著抑制[/font]RANKL[font=宋体]诱导的破骨细胞[/font]TRAP[font=宋体]活性，减少[/font]TRAP[font=宋体]染色阳性的破骨细胞的数目，抑制[/font]F-actin[font=宋体]环的构建，降低破骨细胞在骨片上形成的骨吸收陷窝的数目和面积，显示出了确切的抑制破骨细胞骨吸收的作用。[/font] [font=宋体]破骨细胞由骨髓巨噬细胞分化形成的过程中，受[/font]c-Fos[font=宋体]和[/font]NFATc1[font=宋体]的调控[/font][sup][13][/sup][font=宋体]。[/font]c-Fos[font=宋体]是破骨细胞分化早期所必需的激活蛋白[/font]-1[font=宋体]家族的关键转录因子，可诱导破骨细胞[/font]NFATc1[font=宋体]的表达，调控前破骨细胞最终分化为成熟破骨细胞[/font][sup][14][/sup][font=宋体]。[/font]NFATc1[font=宋体]参与调控破骨细胞特异性基因[/font][i]TRAP[/i][font=宋体]、[/font][i]CTSK[/i][font=宋体]、树突状细胞特异性跨膜蛋白（[/font]dendritic cell-specific transmembrane protein[font=宋体]，[/font][i]DC-STAMP[/i][font=宋体]）和降钙素受体（[/font]calcitonin receptor[font=宋体]，[/font][i]CTR[/i][font=宋体]）等的表达，刺激破骨细胞的形成、分化和骨吸收[/font][sup][15-16][/sup][font=宋体]。升麻三萜皂苷阿克特素、升麻环氧醇苷、升麻醇能够抑制破骨细胞转录因子[/font]NFATc1[font=宋体]和[/font]C-fos[font=宋体]的表达，抑制破骨细胞的形成分化。[/font]CTSK[font=宋体]是破骨细胞分泌的胶原降解酶，可降解骨基质中的胶原纤维[/font][sup][17][/sup][font=宋体]。[/font]MMP9[font=宋体]也是破骨细胞产生的参与骨基质胶原降解的蛋白酶[/font][sup][18][/sup][font=宋体]。升麻三萜皂苷阿克特素、升麻环氧醇苷、升麻醇可显著抑制破骨细胞[/font]MMP9[font=宋体]和[/font]CTSK[font=宋体]的表达，进一步明确了其对破骨细胞骨吸收的抑制作用。[/font] [font=宋体]网络药理学是预测中药活性成分作用靶点及机制的重要手段[/font][sup][19-20][/sup][font=宋体]。本研究应用网络药理学预测了升麻三萜皂苷抑制破骨细胞骨吸收的潜在靶点和机制。[/font]KEGG[font=宋体]分析显示升麻三萜皂苷可能通过调控[/font]IL-17[font=宋体]、[/font]TNF-α[font=宋体]、脂质和动脉粥样硬化、[/font]MAPK[font=宋体]信号通路发挥抑制破骨细胞功能的作用。[/font]IL-17[font=宋体]和[/font]TNF-α[font=宋体]通路是机体调节炎症的重要机制[/font][sup][21][/sup][font=宋体]。衰老和雌激素缺失导致炎性细胞因子水平升高，抑制成骨细胞的骨形成，增加破骨细胞的骨吸收，导致骨量减少和骨质疏松症的发生[/font][sup][22][/sup][font=宋体]。升麻三萜皂苷参与[/font]IL-17[font=宋体]和[/font]TNF-α[font=宋体]通路的调控，表明其可能通过抑制炎症发挥抗骨质疏松的作用。[/font] [font=宋体]升麻三萜皂苷也可能参与脂质和动脉粥样硬化通路的调控。骨髓间充质干细胞在向成骨细胞分化的过程中，成脂和成骨分化程序具有竞争性平衡，促进脂肪生成的机制会主动抑制成骨细胞的形成与分化[/font][sup][23][/sup][font=宋体]。骨髓脂肪细胞可通过分泌破骨细胞活化因子促进破骨细胞的形成、分化和骨吸收作用[/font][sup][24][/sup][font=宋体]。绝经后骨质疏松患者存在骨量减少、成骨细胞的数量和功能下降、骨髓脂肪增加等现象，表明脂肪细胞的分化可能会影响成骨细胞或破骨细胞的形成分化[/font][sup][25][/sup][font=宋体]。[/font][font=宋体]因此，升麻三萜皂苷也可能通过抑制骨髓基质干细胞向脂肪细胞的分化，增加成骨细胞的骨形成、抑制破骨细胞的骨吸收，发挥抗骨质疏松的作用。[/font] MAPK[font=宋体]是[/font]RANKL/RANK/TRAF6[font=宋体]信号传导下游的一条通路[/font][sup][26][/sup][font=宋体]，[/font]RANKL[font=宋体]与[/font]RANK[font=宋体]的结合导致[/font]MAPK[font=宋体]的[/font]p38[font=宋体]、[/font]JNK[font=宋体]和[/font]ERK[font=宋体]磷酸化，诱导破骨细胞的形成分化[/font][sup][27][/sup][font=宋体]。[/font]p38 MAPK-[font=宋体]环磷腺苷效应元件结合蛋白（[/font]adenosinecyclophosphate-response element binding protein[font=宋体]，[/font]CREB[font=宋体]）通路在[/font]RANKL[font=宋体]介导的破骨细胞分化中发挥重要作用，[/font]p38 MAPK[font=宋体]抑制剂可抑制[/font]TNF-α[font=宋体]或[/font]RANKL[font=宋体]，通过[/font]CREB[font=宋体]磷酸化调节[/font]c-Fos[font=宋体]和[/font]NFATc1[font=宋体]的表达，抑制破骨细胞的形成分化[/font][sup][28][/sup][font=宋体]。[/font]p38[font=宋体]可刺激破骨细胞成熟所必需的小眼相关转录因子（[/font]microphthalmia-associated transcription factor[font=宋体]，[/font]MITF[font=宋体]）的下游激活，调控破骨细胞[/font][i]TRAP[/i][font=宋体]和[/font][i]CTSK[/i][font=宋体]的基因表达[/font][sup][29][/sup][font=宋体]和骨吸收。[/font]ERK[font=宋体]激活是成熟破骨细胞存活的关键[/font][sup][30][/sup][font=宋体]，[/font]M-CSF[font=宋体]刺激的[/font]ERK1[font=宋体]和[/font]ERK2[font=宋体]激活，直接磷酸化[/font]MITF[sup][31][/sup][font=宋体]，影响破骨细胞的骨吸收活性。[/font]RANKL[font=宋体]诱导破骨前细胞[/font]ERK[font=宋体]的激活，通过[/font]TRAF6[font=宋体]诱导[/font]MMP9[font=宋体]的表达和活性，调节破骨细胞迁移和骨吸收[/font][sup][32][/sup][font=宋体]。[/font]JNK[font=宋体]的激活参与破骨细胞的分化、融合和骨吸收的调节，也通过[/font]B[font=宋体]淋巴细胞瘤[/font]-2[font=宋体]（[/font]B-cell lymphoma-2[font=宋体]，[/font]Bcl-2[font=宋体]）通路调节破骨细胞的凋亡和自噬[/font][sup][33][/sup][font=宋体]。在破骨细胞融合前阶段阻断[/font]JNK[font=宋体]活性会导致[/font]TRAP[font=宋体]阳性细胞（代表融合前阶段的破骨细胞）逆转为[/font]TRAP[font=宋体]阴性细胞（代表破骨细胞前体）[/font][sup][34][/sup][font=宋体]。[/font][font=宋体]本研究发现升麻三萜皂苷阿克特素、升麻环氧醇苷、升麻醇与[/font]ERK1/ERK2[font=宋体]、[/font]JNK[font=宋体]、[/font]p38[font=宋体]均有较好的结合特性，可显著抑制[/font]RANKL[font=宋体]和[/font]M-CSF[font=宋体]诱导[/font]BMMs[font=宋体]分化的破骨细胞[/font]p38[font=宋体]、[/font]JNK[font=宋体]和[/font]ERK[font=宋体]的磷酸化和激活，进一步明确了升麻三萜皂苷通过[/font]MAPK[font=宋体]通路抑制破骨细胞的形成分化和骨吸收的作用机制。[/font] [font=宋体]三萜皂苷是升麻属植物的特征性化学成分，目前已从升麻属多种植物中分离鉴定了[/font]400[font=宋体]余个三萜皂苷类成分，其中[/font]44[font=宋体]个化合物显示出抗骨质疏松、抗肿瘤、抗炎、抗氧化及免疫调节等多种生物活性[/font][sup][35][/sup][font=宋体]。本研究考察了升麻三萜皂苷阿克特素、升麻环氧醇苷、升麻醇抑制破骨细胞骨吸收的作用，并通过网络药理学预测了其作用机制。后续还应该深入研究这些化合物抑制破骨细胞活性的靶点及对成骨细胞的作用及机制，为其临床用于骨质疏松症的防治奠定基础。另外，鉴于升麻属植物含有结构多样的三萜皂苷类成分，应采用现代化学生物学的思路和方法，研究升麻三萜皂苷抗骨质疏松的作用靶点、构效关系及深入的机制，为抗骨质疏松新药的研发提供先导化合物。[/font]

[size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]连翘（F. suspensa）是中医临床常用的传统中药，因其解热和抗炎作用而在中医中用于治疗传染病，有清热、解毒、排脓、散肿等功效。最近的研究表明，F. suspensa水提取物（WFS）对抗破骨细胞异常分化和雌激素缺乏引起的骨质流失有益，且WFS的植物化学特征表明丰富的生物碱、木脂素、萜烯类、黄酮类和类固醇成分可能具有抗骨质疏松活性。在这些成分中，连翘脂素（Phi）是尚未在骨代谢中报道的成分之一。2024年2月15日，上海交通大学医学院附属瑞金医院/上海市创伤骨科研究所江敏、徐醒、奚小冰团队在Phytother Res（IF=7.2）上发表题为“Phillygenin prevents osteoclast differentiation and bone loss by targeting RhoA”的文章，发现连翘叶中富含的一种化合物连翘脂素（Phi）在体内外具有抗破骨细胞生成特性。机制上，Phi与RhoA结合可通过NF-κB/NFATc1/c-fos通路和RhoA/ROCK1/Cofilin通路在体外抑制RANKL诱导的破骨细胞生成和骨吸收，研究可能为Phi和F. suspensa在功能性食品中开辟新的应用领域。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]1、连翘脂素减轻体内LPS诱导的小鼠颅骨骨溶解作者通过脂多糖（LPS）诱导的小鼠颅骨骨溶解模型来说明Phi在体内的保护作用，发现Phi显著逆转LPS诱导的骨质破坏。此外，组织切片TRAP染色显示LPS显著增加破骨细胞（OC），而Phi则减少OC的形成，表明Phi抑制OC的形成，从而抑制体内骨质破坏。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]2、Phi 可预防卵巢切除术（OVX）引起的体内骨质流失作者接着评估了Phi在OVX诱导的骨质疏松症小鼠模型中的作用，发现OVX小鼠表现出广泛的骨质疏松，而Phi使其得到改善。此外，对股骨切片也进行了TRAP和HE染色，结果显示OVX组的OCs数量增加，而Phi组的OCs数量减少。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]3、Phi 抑制小鼠BMMs破骨细胞生成作者接着体外评估了Phi的作用，细胞增殖和细胞毒性实验显示Phi不干扰BMMs的增殖，且无细胞毒性，TRAP染色结果表明Phi以剂量依赖性方式抑制成熟OC的形成。随后以Phi干预OCs分化，发现Phi在早期、中期、晚期均不同程度抑制破骨细胞形成。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]4、Phi通过OC分化和骨吸收相关基因表达损害骨吸收接下来，作者利用RNA-seq阐明 Phi 抑制OC分化的潜在分子机制，KEGG发现差异基因主要参与破骨细胞分化途径和肌动蛋白细胞骨架途径的调控等，GO显示骨吸收和骨重建的调控等骨重建过程，肌动蛋白细胞骨架组织过程显著富集。转录组结果和[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]验证均显示Phi处理后与破骨细胞分化相关的基因下调。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]5、Phi与RhoA结合并抑制RhoA激活剂诱导的RhoA活性接着作者采用了Pulldown+MS的方法识别Phi的直接靶点。首先合成生物素化的探针，发现生物素标签不会影响Phi的活性，进一步开展pulldown+MS鉴定到155种蛋白质，PPI显示与细胞骨架相关的簇及RhoA蛋白的存在。已有报道表明RhoA对破骨细胞的生长、运动和骨吸收至关重要。作者采用免疫沉淀法进一步证实了Phi与RhoA的结合，分子对接预测了结合位点，进一步酶活实验发现Phi能够以剂量依赖性的方式抑制RhoA活性。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]6、Phi通过RhoA/ROCK1/NFATc1通路发挥抑制作用NFATc1/c-fos已被证实是破骨细胞生成中最重要的转录因子，作者发现Phi抑制 NFATc1/c-fos 的mRNA和蛋白表达。TRAP染色结果显示C3（RhoA抑制剂）减少OC的形成，降低NFATc1的mRNA表达和蛋白表达，在破骨细胞生成中发挥了与Phi类似的作用。此外，敲低RhoA导致成熟OC数量减少，NFATc1蛋白表达也受到抑制。RhoA通过磷酸化ROCK1下游底物激活ROCK1，从而发挥重塑细胞骨架等作用，作者发现Phi通过RhoA/ROCK1/NFATc1通路发挥其抗破骨细胞生成作用。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]7、Phi靶向RhoA/ROCK1减弱RANKL诱导的NF-κb磷酸化NF-κb信号通路是参与OC分化和吸收的关键信号通路，作者发现Phi显著抑制RANKL诱导的p65磷酸化和IκBα磷酸化。此外，C3（RhoA抑制）和Y-27632（ROCK1抑制剂）显著抑制NF-κB信号通路，与 Phi 的抑制作用一致。结果表明Phi显著抑制NF-κB信号通路，并且RhoA/ROCK1信号通路也可能参与其中。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]8、Phi通过RhoA/ROCK1信号通路抑制OCs F-actin的形成破骨细胞中的关键骨骼蛋白F-actin聚合后形成F-肌动蛋白环，这对破骨细胞介导的骨吸收至关重要。RNA-seq结果也显示Phi抑制了肌动蛋白形成过程。作者使用TRITC鬼笔环肽染色发现Phi、C3和Y27632抑制了F-肌动蛋白环的形成，表明Phi和RhoA/ROCK参与了F-肌动蛋白环的形成。之前有报道称RhoA是Rho家族中调节ROCK1/cofilin通路以实现肌动蛋白丝分布的关键成员，WB结果显示在用Phi、C3或Y-27632处理后，ROCK1和p-cofilin/cofilin表达也降低。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]总结该研究发现Phi与RhoA结合可通过NF-κB/NFATc1/c-fos通路和RhoA/ROCK1/Cofilin通路在体外抑制RANKL诱导的破骨细胞生成和骨吸收。此外，Phi显著降低LPS诱导的颅骨骨吸收，预防和缓解OVX诱导的体内骨质疏松症。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size][size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size]

大神们，帮忙推荐台主要针对小鼠骨髓细胞数检测的仪器，再一个就是能对小鼠血细胞的种类分类，计数。要求不高。。但是这种针对性的仪器还这难找。。

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骨髓间充质干细胞总结 2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为详实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。一、骨髓间充质干细胞的分离 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。1. 直接培养法（全骨髓培养法） 1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法，得到了广泛的应用。culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：（1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞（2）原代培养24 h,48 h各换液一次（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来。（4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。（5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。（6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48 h~72 h后首次换液，一般7~10天可传代。天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6 w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48 h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。2. 密度梯度离心法 裴雪涛等用比重为1.073 g/ml的percoll分离（400 g×20 min）人骨髓MSCs，取界面处细胞层，离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种，72 h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每3 d换液一次。细胞长到80％汇合时1：1传代。菊花与刀利用PERCOLL密度1.073分离大鼠MSC 时，用2400 rpm×20 mins后可见中间有一层约1～2 mm厚的白色层，仔细用吸管吸取这一层再用PBS离心2遍即可加培养基和胎牛血清培养即rMSCs。周进明等利用密度为1.082的percoll分离小鼠MSCs，500g×30min离心后，取中间的单个核细胞层，PBS洗两次，接种于IMDM培养基，1 d后换液，去掉非贴壁细胞，以后每3-4天换液。jetter用过FICOLL,FERCOLL,上海二分厂的淋巴细胞分离液分离MSC细胞效果都不错，当然所获细胞群的纯度不一，Percoll最纯，而上海二分厂的淋巴细胞分离液所获细胞群的传代能力优秀（35 PASSAGE）。本版的部分园友认为MSC贴壁培养得到的细胞不均一，但是多能分化能力和增殖力好，percoll分离得到的细胞较为均一，多能分化性和增殖力不如贴壁培养的，尤其是增殖力相差很远，有人添加bFGF或/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力。二、骨髓间充质干细胞的培养 天之饺子认为，间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs获得或失去这些表面标记物的表达。三、骨髓间充质干细胞的特性 体外培养的MSC体积小，成梭形，核浆比大。不表达分化相关的细胞标志，如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶或Osteopontin；也不表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白，这群细胞特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95％和98％。MSC联系传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能，而且保持正常的核型核端粒酶活性，但不易自发分化，在体外特定的诱导条件下，MSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。四、其他相关内容 Jiang将从成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分离的间充质干细胞（CD45－TER119－）命名为多潜能成年祖细胞，他们证明，MAPC高表达端粒酶，而且随着细胞的扩增，端粒的长度不变，单个MAPC来源的细胞群不仅能在体外向3个胚层的细胞分化，而且能在体内能够向各种组织细胞分化，相比较而言，形态与MSC相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。参考文献 生理学报2003.55（2）：153－159 人骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑内的迁移及分化中华放射医学与防护杂志.2002,22(3).-167-169 培养小鼠骨髓间充质干细胞及其移植后在体内的定位分布Exp Biol Med Vol. 226:507 520, 2001 Mesenchymal Stem CellsNATURE |VOL 418 | 4 JULY 2002 Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow干细胞生物学 裴雪涛 主编

【序号】：1【作者】：杨涛【题名】：不同层软骨细胞与骨髓间充质干细胞在体内外三维共培养时细胞外基质特点的实验研究【期刊】：大连医科大学【年、卷、期、起止页码】：2017【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C447WN1SO36whLpCgh0R0Z-ifBI1L3ks338rpyhinzvy7Kt4RMGSMaxxH2WkQVeTlx_sUqdJWIk0PB_cP8FsBxdg&uniplatform=NZKPT

膝骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）主要表现为膝关节疼痛伴随活动受限、关节畸形，严重影响患者的生活质量。骨质疏松症（osteoporosis，OP）是以骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病，本质上是骨形成与吸收之间的平衡破坏。KOA的发病率随年龄增长呈现上升趋势。据相关研究统计，我国KOA发病率为11.1%～21.9%[1-2]。我国65岁及以上人口OP患病率为32%，并且持续走高，预计2035—2050年，我国居民骨质疏松性骨折发生例次将上升至599万例左右[3]。KOA与OP是临床上2种老年人常见的退行性疾病，且临床上发现很大一部分患者同时出现2种疾病，尤其是绝经妇女，2种疾病总和甚至超过老年高血压发病率。因此2病在病机特点上同属于“本虚标实”，即以肾虚为本、以血瘀为标。肾虚血瘀可从多方面影响KOA及OP的发病，以此病机为基础施以补肾活血法对证治疗已被证实能够取得很好疗效[4]。 中药在治疗KOA与OP“共病”中优势显著，有研究表明，中药在治疗KOA方面疗效优于安慰剂和化学药，中西药联用治疗疗效优于单独使用化学药[5]。中药对OP也同样有着明确治疗作用，中药中的活性成分在发现新型抗OP药物方面存在潜力。中药复方中的活性成分可以结合使用，与单个化合物相比，这些药物可能表现出更好抗骨质疏松作用[6]。补肾活血中药以补肾治肾虚，以活血行血瘀，且具有多途径、多靶点、多信号通路的特点，在KOA与OP“共病”治疗中疗效显著，并取得较好的进展。KOA与OP虽为2种疾病，但在中医理论、分子机制及临床证象等方面存在相关性。本文针对KOA与OP“共病”发病机制，对补肾活血中药治疗KOA与OP“共病”作用机制进行综述，为深入开展中医药治疗KOA与OP“共病”基础研究提供依据。 1 KOA与OP在中医理论层面的相关性 KOA在中医属“痹证”，OP多属“痿证”，肾虚为本，是痹证发生的病机基础，亦是痿证发病的基本条件；血瘀为标，是痹痿重要病机，且肢体之痹痿，内联脏腑。补肾活血中药在治疗KOA与OP方面多表现为痹痿同治。其病因病机大致有以下几类。 1.1 外邪致病 “痹”“痿”最早见于《黄帝内经》。《素问 痹论篇》对痹证成因记载道：“风、寒、湿三气杂至，合而为痹也。”因此，痹证由风、寒、湿、热等外邪侵袭人体，痹阻经络，气血运行不畅所致。另外，《素问》中亦阐述外邪侵袭可致痿，如《素问痿论篇》阐述：“有渐于湿，以水为事，若有所留，居处相湿，肌肉濡渍，痹而不仁，发为肉痿。”说明湿困肌肉，肢体麻痹不仁，形成肉痿。《素问六元正纪大论篇》中指出：“民病寒湿，发肌肉萎，足痿不收。”进一步提出寒湿之邪可相兼致痿。张锡纯在继承《黄帝内经》痿证成因理论基础上，指出：“证之大旨，当为三端，其人或风寒袭入经络；或痰涎郁塞经络；或风寒痰涎，互相凝结经络之间，以致血脉闭塞。”痿证病因可归纳为风、寒、痰涎3个方面，且这些邪气往往相兼致痿，并言：“痹之甚者即令人全体痿废。”因此KOA可逐渐发展成为OP，进一步证明KOA与OP在理论依据上的相关性。 1.2 气虚致病 张锡纯强调元气亏虚在痹痿发病中具有根本性作用，并提出痹痛发生的先决条件是元气壮旺与否，“从来治腿疼、臂疼者，多责之，或血瘀、气滞、痰涎凝滞，不知人身之气化壮旺流行，而周身痹者、瘀者、滞者，不治自愈，知元气素盛之人，得此病者极少”，在治疗气虚痹痛的健运汤方中，黄芪与党参并用，共补大气、元气。张锡纯认为大气虚损在痿证发病中同样具有决定性作用。如振颓汤方中所述：“大气虚，则腠理不固，而风寒易受，脉管湮瘀，而痰涎易郁矣。”胸中大气已虚，风、寒、痰涎方有致痿可能，若大气旺，外邪即难内侵为病。综上，气虚不仅是痹证的病机基础，亦是痿证发病的基本条件。这也从侧面证明分别对应痹证和痿证的KOA与OP在中医学角度具有极强的相关性。 1.3 气血凝滞 气血凝滞是痹证、痿证发生发展的重要病机。闭必得通，通则气血运行正常，肢体得以濡养而活动如常。外邪及气虚皆有可能凝滞气血，血行不畅，不通诱发痹证，不荣诱发痿证。气血凝滞对痹痿发生发展的直接影响，闭必得通，通则气血运行正常，肢体得以濡养而活动如常，因此，治疗痹证与痿证的各方中多配伍通气活血之品。 2 KOA与OP在遗传机制方面的相关性 遗传机制为生物体生命过程提供了表观遗传学修饰等在内的各种蓝图。表观遗传机制参与机体对环境的适应和应对复杂疾病发病的调控[7]。Jeffries等[8]应用DNA甲基化分析了KOA患者的关节软骨和软骨下骨，发现有大量基因在关节软骨及软骨下骨的相同区域共表达。其中G蛋白偶联受体参与骨与软骨发育、炎症和免疫反应等多种生物学过程，是调节骨关节发育和重建的必要物质，其破坏或突变可能导致临床上出现非对称性关节间隙变窄、软骨下骨硬化或囊性病变、关节边缘骨赘形成等证象。陈桐莹等[9]利用生物信息学方法分析了KOA与OP的关系，发现4个微小核糖核酸（microRNA，miRNA）在KOA与OP中有交集，其表观遗传机制在KOA与OP“共病”的发病、病理过程中具有重要的调节作用。综上，KOA与OP在分子层面同样存在关联。 3 补肾活血中药对KOA与OP“共病”的作用机制 3.1 补肾活血中药可促进骨与软骨修复 3.1.1 调节信号通路 补肾活血中药可通过调控转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMPs）信号通路、Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）、Hippo信号通路等，促进骨与软骨修复。 （1）TGF-β/BMPs信号通路：有研究表明，TGF-β/BMPs通路在维持KOA患者关节内环境稳态及关节软骨修复方面具有重要作用，证明TGF-β等一系列促软骨生长因子能够诱导软骨、骨及结缔组织生长[10]。补肾活血中药在基础及临床研究中已被证实能够有效调节TGF-β/BMPs通路。杨帆等[11]通过探讨补肾活血汤对兔KOA模型TGF-β及BMPs的影响，发现骨碎补、桑寄生、川牛膝等补肾活血中药能够调节TGF-β及BMP4、BMP7分泌，促进骨、软骨及相关结缔组织形成。其中BMP7可有效增强碱性磷酸酶活性进而促进骨形成，BMP4在体内、外皆具有促进成骨细胞增值分化的能力，TGF-β除可减轻滑膜炎症外，主要促进软骨细胞及基质的合成并诱导干细胞分化为软骨，在形成和维护骨架中发挥重要作用。王宁宁等[12]通过对KOA患者实施补肾活血汤联合针灸治疗发现补肾活血方中怀牛膝、骨碎补、淫羊藿等补肾活血中药可促进TGF-β及BMPs合成，促进软骨修复从而缓解KOA患者症状。另外也有研究指出OP状态下患者骨组织内BMPs含量降低，使骨生成量减少[13]。因此，补肾活血中药可以通过调节TGF-β/BMPs细胞通路，直接作用于成骨细胞，增强成骨细胞活性，同时改善KOA与OP症状。 （2）Wnt/β-catenin信号通路：Wnt/β-catenin信号通路在调控细胞增殖和分化方面扮演着至关重要的角色，是一类高度保守的基因序列，Wnt信号通路处于过度激活状态时，软骨及软骨下骨的细胞表型和分子功能失衡，同时也会影响细胞外基质的合成，这在KOA的发病过程中具有重要意义[14]。汤鹏[15]通过研究补肾活血中药治疗KOA与Wnt/β-catenin信号通路的作用关系，发现Wnt蛋白在活化状态下能够抑制胞内β-catenin的磷酸化及降解，导致β-catenin持续增多并最终转移进胞核，通过结合淋巴增强因子和T细胞因子（T cell factor，TCF）促进下游靶基因的表达。而补肾活血类中药能够通过抑制Wnt/β-catenin通路，抑制Wnt信号通路活性并恢复软骨细胞增值能力，促进骨与软骨的修复。另外，β-catenin能够直接影响低密度脂蛋白受体相关蛋白5（low density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5），LRP5是低密度脂蛋白受体超家族成员，能够直接影响骨量和骨密度，对成骨细胞的分化有促进作用，其功能的缺失突变直接表现为骨质疏松。许应星等[16]通过研究补肾活血颗粒含药血清影响成骨细胞分化及Wnt/β-catenin信号通路，探究其治疗OP的作用机制。发现含药血清能提高碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，矿化结节形成，并上调β-catenin、LRP5及TCF表达。表明补肾活血颗粒可增加成骨细胞的成骨活性及矿化，促进骨及软骨的修复，从而发挥治疗OP的作用，其机制可能与影响Wnt/β-catenin信号通路有关。综上，Wnt/β-catenin通路可通过促进骨修复起到治疗KOA与OP“共病”的作用。 （3）Hippo信号通路：Hippo信号通路是近年来发现的在骨生长发育中发挥重要调节功能的生长控制信号通路，可以参与细胞膜向细胞核的传递，如细胞生长、细胞增殖等[17]。张晨等[18]研究发现Hippo不仅可以直接参与KOA与OP“共病”的发病过程，还可以作为许多骨性关节相关通路的上游信号，参与骨与软骨的修复。首先，Hippo信号通路可刺激环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）加速软骨细胞修复。其次，Hippo信号通路可促进上述2种信号通路，Hippo信号通路可抑制Wnt-β-catenin通路，进一步诱导基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）和MMP13降低，加速软骨的修复。Hippo信号传导途径可以与TGF-β效应蛋白结合进入细胞核[19]。导致细胞核内积累增加，进而抑制细胞生长并影响各种转录过程，包括修复受损的软骨细胞和维持成骨细胞与破骨细胞间的平衡，影响骨的自我更新过程。补肾活血中药中牛膝总苷、藏红花素等活性成分均可通过增强Hippo信号通路，抑制血清中的白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、MMP13炎性介质，下调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3与促进B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白合成，以增强软骨修复并抑制炎症反应[20]。 3.1.2 调节胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）水平 IGF-1与TGF-β同为促软骨生长因子。KOA是骨刺、骨赘形成的常见病因，OP本质特征是骨量丢失，而IGF-1恰好与骨赘形成及OP时骨量丢失有密切关系[21]。因此，调节IGF-1水平同样能够缓解KOA与OP“共病”症状。马文娟[22]通过测定兔软骨细胞内对应促软骨细胞因子mRNA表达，发现高剂量的补肾活血汤中丹参有效成分等能够显著提高软骨细胞内IGF-1 mRNA表达，抑制关节软骨IL-1β表达强度，保护关节软骨并促进修复因此补肾活血中药能够通过调节TGF-β、BMPs及IGF水平，促进骨及软骨修复。 3.1.3 调节激素水平 软骨细胞、滑膜细胞及软骨下成骨细胞中存在雌激素受体。梁其隆等[23]认为调节雌激素水平的下丘脑-垂体轴近似于中医“天癸”功能，下丘脑-垂体轴功能异常会导致雌激素水平发生变化，进而影响骨代谢。“天癸”最早见于《黄帝内经》中《素问上古天真论》，“天癸”源于先天之精，靠后天之精滋养，是促进与维持男女性机能的物质，这与现代医学中雌激素功能有相似之处。“天癸”藏于肾，并随肾气生理消长而变化。肾气初盛，天癸亦微；肾气既盛，“天癸”蓄极而泌；肾气渐衰，“天癸”乃竭。肾主生殖功能是通过“天癸”体现，同时肾主骨，“天癸”功能一定程度上可以反应骨代谢功能。雌激素水平下降，关节软骨中成骨细胞与破骨细胞功能协调稳定将被打破，造成骨量丢失，这是雌激素失调导致OP形成的主要原因。王岩岩等[24]研究表明补肾活血方可通过降低卵巢异常免疫应答而增加雌激素水平，达到治疗绝经后OP。补肾活血中药中补骨脂有效成分具有雌激素样作用，菟丝子有效成分含黄酮类成分，可促进内源性雌激素产生，促进成骨细胞增殖。淫羊藿主要成分是黄酮类化合物，属于植物激素，其能与骨组织中雌激素β受体结合，抑制破骨细胞活性，使成骨细胞与破骨细胞保持动态平衡，并有效防治OP。蛇床子能够间接性抑制IL-1与IL-6分泌；同时促进降钙素合成。骨碎补主要成分是骨碎补总黄酮可直接作用于下丘脑-垂体-性腺轴功能，并有效改善激素紊乱，调节骨代谢同时起到抗炎作用。鹿茸具有抗骨质疏松作用，其主要成分雌酚酮、雌二醇等具有性激素样治疗作用。杜仲叶醇提取物被证明具有雌激素样作用，增强成骨细胞活性以增加骨量。黄芪主要成分黄芪总黄酮，其雌激素样作用可以抑制破骨细胞活性。葛根有效成分为葛根素、大豆苷具有弱雌激素样作用，促进骨骼形成、增加骨密度[25]。杜仲可以通过促进成骨细胞分泌ALP和骨保护素（osteoclastogenesis inhibitory factor，OPG），并上调OPG/核因子-κB受体激活因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）的值，促进成骨细胞的功能恢复。 3.2 补肾活血中药能够抑制骨与软骨的破坏 3.2.1 调节信号通路 （1）丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号通路：MAPK磷酸酶是MAPK信号传导的负调节因子。在KOA病程中，MKP-1主要发挥抑制关节炎症的作用，其在软骨中的表达能够降低p38磷酸化水平，进而抑制p38的磷酸化过程。这种抑制作用有助于减少COX-2、MMP3、IL-6及软骨下骨前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）[26]，在KOA的治疗中能够协同非甾体抗炎药（NSAIDs）、类固醇药物、透明质酸类药物，抑制关节炎症、软骨退变等病理过程[27]。而在OP相关病程中，MKP-1可诱导破骨细胞分化促进骨吸收[28]。Griffin等[29]发现MKP-1基因敲除后小鼠成骨细胞分化和矿化功能被抑制，导致小鼠骨量减少。杨小四等[30]发现丹皮酚可抑制KOA大鼠p38 MAPK蛋白表达，减轻KOA大鼠继发性关节炎症，改善KOA疼痛的症状。紫云英苷能够下调KOA大鼠软骨组织中c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38 MAPK磷酸化蛋白表达，抑制JNK、p38 MAPK信号通路激活。罗汉果苷IV可通过抑制p38 MAPK信号通路表达，抑制软骨炎症反应和细胞凋亡，减轻OP症状。 （2）RANK/RANKL信号通路：KOA的发生发展同样与RANK/RANKL表达水平有关，林燕云等[31]通过实验证明降低RANK/RANKL表达可抑制OC的分化与成熟，从而有效缓解KOA症状。RANK在OA患者晚期阶段软骨细胞中呈高度表达状态，且RANK多态性与KOA患者个体易感性遗传相关联，RANK基因可能是OA的潜在危险因素，而KOA患者中RANKL在表达水平也会增加，RANKL的过表达可能从软骨细胞扩散到软骨下骨，促进OC的增殖与分化，使得骨破坏进一步加重[32]。此外，RANK/RANKL信号通路也是女性绝经后OP发生、发展的重要路径之一，RANK是诱导破骨细胞成熟的关键细胞因子，其主要功能在破骨细胞及其前体细胞表面与RANKL结合，促进破骨细胞的成熟、分化，且减慢破骨细胞凋亡。肖亚平等[33]通过对淫羊藿、补骨脂、蛇床子、杜仲、续断等补肾中药在RANK/RANKL信号通路的调节作用发现此类中药可通过作用破骨细胞抑制骨吸收。淫羊藿苷及蛇床子素可作用于破骨细胞，显著减少骨吸收陷窝的数目和面积，下调RANK信号通路表达。骨碎补总黄酮作用于去睾丸OP大鼠，可显著提高股骨的骨密度及骨小梁数目，显著上调去势骨质疏松大鼠破骨细胞中OPG/RANKL的值，下调RANK、RANKL的基因表达，达到改善骨质疏松的目的。杜仲中的木脂素、紫云英苷等均可通过OPG/ RANKL/RANK信号通路作用于破骨细胞抑制骨吸收。此外，续断有效成分可显著降低模型组大鼠中Ca、ALP、RANKL的含量，提高OPG和RANK的表达，提高软骨增殖速度，改善OP状。 3.2.2 调控细胞自噬 KOA主要病理学特点为软骨基质持续降解及软骨细胞总量不断降低，而OP主要病理学特点为骨量丢失与骨组织微细结构破坏，2病共同特点均为代谢平衡破坏导致骨细胞减少。自噬是细胞经溶酶体吞噬再循环的一种代谢平衡过程，López等[34]研究发现自噬水平降低会导致软骨细胞损伤。因此，提高自噬水平成为延缓KOA与OP“共病”病情进程手段之一。黄鑫等[35]研究发现补肾活血汤中熟地、独活、秦艽、赤芍、当归、川芎、杜仲等能够增强软骨细胞自噬，使软骨细胞能够祛除多余氧化自由基和功能障碍的细胞结构，改善软骨细胞应对机械压力等各类外界环境变化的适应力，调控膝关节部位的新陈代谢稳态来防治KOA与OP“共病”。miR-140-5p可促进骨关节炎软骨细胞细胞自噬和增殖，减轻细胞损伤，而红花黄色素可促进体外骨关节炎软骨细胞中miR-140-5p表达，并且下调miR-140-5p还可逆转红花黄色素的这种作用，提示红花黄色素可通过上调miR-140-5p的表达促进骨关节炎软骨细胞自噬，减少凋亡，并抑制炎症因子分泌，改善骨关节炎及OP症状[36]。 3.2.3 抑制氧自由基对软骨破坏 氧自由基是一种游离基，指氧分子中2个氧原子间的共价键被光热电离或其他化学反应所断裂，形成2个带有未成对电子的氧离子基团。在KOA及OP病程中，氧自由基可能会引起骨细胞膜破坏、引发骨及软骨细胞DNA突变、损伤及加速老化。Hosseinzadeh等[37]认为氧自由基导致氧化损伤是KOA及OP病程中重要因素。李朝军等[38]研究发现补肾活血中药可通过降低超氧化物歧化酶、一氧化氮、丙二醛表达以抑制氧自由基产生。可见补肾活血中药可通过抑制氧自由基以减少软骨细胞破坏，从而缓解KOA与OP“共病”症状。 3.2.4 抑制MMPs对软骨破坏 骨代谢关键因素之一是软骨细胞合成的蛋白酶，可以促进软骨修复，延缓软骨破坏，改善KOA及OP症状。MMPs增高会激活蛋白酶裂解，加快软骨细胞损伤，KOA患者关节软骨基质中MMP3和金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP）水平均和病变严重程度相关，用于评价KOA病程和进展的有效指标。软骨细胞可分泌MMP3，促使破骨细胞加速破坏软骨质导致病情继续发展。而软骨细胞又能分泌TIMP，通过抑制成骨细胞分化及破骨细胞凋亡来控制骨代谢[39]。此外，MMP9可促进细胞间质成分降解，加快钙盐代谢，致使钙磷代谢紊乱，从而导致骨质代谢异常加重OP病情[40]，使OP患者MMP9高表达，且与患者骨密度有着直接关系[41]。罗静等[42]研究发现补骨脂有效成分可通过NF-κB通路影响MMPs对关节软骨的破坏。当归有效成分当归多糖可以通过调节骨组织中MMP3表达，抑制关节软骨退变[43]。骨碎补可通过抑制MMP3抑制软骨细胞凋亡作用[44]。杜仲可调控MMP13表达从而引起膝关节血清及滑膜组织中IL-1β、TNF-α及MMP13含量降低，延缓软骨破坏同时具有消炎的作用[45]。因此调控MMPs水平能够有效延缓KOA与OP“共病”病程。 3.2.5 抑制炎性反应 KOA与炎性因子之间存在明确的直接联系。卜寒梅等[46]提出KOA患者的膝关节中存在炎性因子的过度表达现象。此外，炎性因子与OP之间也存在密切的关联，OP在绝经后妇女中的发病率相对较高，雌激素水平降低会加快T细胞增值分化，介导炎性因子IL及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）。炎性因子诱导破骨细胞加速增殖并抑制成骨细胞分化，骨吸收强于骨形成，加重OP症状[47]。在KOA合并OP病程中，IL-1是导致骨质疏松和膝关节软骨损伤重要的细胞因子之一，IL-1β则刺激软骨细胞产生MMPs，导致滑膜炎及骨吸收产生。另外，TNF-α能够刺激软骨细胞分泌蛋白水解酶，抑制胶原合成。因此，降低IL-1表达有望成为预防和治疗KOA合并OP的有效方法之一。另外，TNF主要包含TNF-α、TNF-β、TNF-γ 3种，其中TNF-α与OP关系密切，可促使破骨细胞数量增多、活性增强，使成骨细胞数量减少，继而导致骨吸收增加、骨形成降低，另外，TNF也可诱导IL-1、IL-6产生以加速对软骨细胞破坏。KOA患者血清和关节液中IL-1和TNF-α均显著升高，损伤膝关节软骨细胞。因此，降低患者血清中IL-1与TNF-α含量，能够有效改善膝关节功能，从而起到治疗KOA与OP“共病”的作用。补肾活血药物中，红花有效成分红花黄色素能够降低关节液中IL-8水平以抑制退行性改变并抑制炎症。杜仲提取物能够降低血清及关节液TNF-α及IL-1β等关键炎性因子水平[48]。熟地黄有效成分熟地黄多糖可以通过调控miR-140水平抑制炎性因子释放[49]。没药可以通过活化蛋白激酶信号作用于骨代谢系统从而抑制IL-6分泌[50]。肉苁蓉主要成分肉苁蓉多糖能够减少IL-6分泌[51]。牛膝有效成分牛膝总皂苷能够降低关节滑膜液中IL-3以缓解炎症。骨碎补有效成分也能够协同上述各药抑制IL-6、TNF-α水平[52]。炎性因子在KOA及OP发病过程中关键因素，能够以各种方式影响NF-κB信号通路或酶蛋白因子等直接或间接干预成骨与破骨功能平衡及骨组织稳态平衡。补肾活血中药在抑制炎性因子方面效果好、不良反应低，能够同时干预并缓解KOA及OP症状。 此外，除调节成骨细胞与破骨细胞活性外，雌激素也能够抑制炎性因子表达，有效改善KOA与OP“共病”患者症状。雌激素可以抑制炎性因子表达。陈彦飞等[53]认为“天癸竭”近似等同于雌激素水平下降，导致抗炎作用减弱，因此治疗KOA及OP时应考虑雌激素带来影响。蔡心银等[54]研究发现补肾活血中药诸如补骨脂、牛膝、当归、白芍等均含有不同种类植物雌激素成分，可以炎症反应所导致红、肿、热、痛等症状。有效改善KOA与OP“共病”症状。 图片 4 结语与展望 KOA并非单纯软骨退变，还包括软骨下骨改变、骨赘形成、滑膜炎症及韧带和肌肉改变，而引起关节僵硬、疼痛及功能障碍；OP以骨吸收异常活跃，骨代谢平衡失调，致骨微结构改变，骨脆性增加，骨折危险性增加为特点，其可能是KOA早期病理特点，即在KOA早期，软骨下骨吸收增强、软骨下骨骨髓改变、骨强度减弱，而引起或加重软骨退变。中药有效成分防治KOA的研究已显示出巨大潜力。补肾活血中药治疗无论是通过扶正补益效果增强自身免疫，防止外邪侵入，还是通过针对KOA与OP“共病”炎症反应、软骨破坏、细胞凋亡、骨修复抑制等方面都表现出较满意的治疗效果。 尽管补肾活血中药在治疗KOA与OP“共病”研究中不断深入，且与临床疗效相符合，但仍有不足：（1）目前已有研究对炎性因子及雌激素等发病因素研究较为深入，但对于信号通路、促生长因子及其他激素（瘦素、降钙素等）的研究仍停留于基础研究，缺乏临床研究。（2）KOA与OP在病机特点上同属“肾虚血瘀”，符合中医基础理论治法中“同病异治”概念，但现有研究仅罗列了作用机制，未能与中医理论融会贯通，未能体现祖国医学优势。 值得注意的是，补肾活血中药越来越多作用机制被不断发掘，如瘦素、降钙素、IGF、TGF等，这更加证明KOA与OP存在紧密关联，且KOA与OP“共病”治疗路径将更加多样化，同时也证明了中医药科学性。结合补肾活血中药丰富种类以及配伍方法与现代药理学微观层面的研究技术，更多治疗KOA与OP“共病”的补肾活血中药有效成分被发掘也将成为可能，为进一步研究补肾活血中药治疗KOA与OP“共病”提供理论依据。

名 称：骨髓细胞的提取目的：分离并培养骨髓间充质干细胞原理：先分离出单核细胞然后再通过培养分离出骨髓间充质干细胞内容：步骤一：小鼠骨髓细胞的获取1． 断颈处死小鼠（7-12周，雌雄均可），投入盛有250ml左右的0.1%新洁尔灭或75%酒精中浸泡3-5分钟，拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。2． 用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。将它们放入另外一个消毒托盘中，并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。3． 小心剥离肌肉，分别剪下Femurs and Tibias, 剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。4． 拿两支5ml无菌注射器，每支吸取5ml IMDM(10%FBS, 50/50u/ml Pen/Strep)，换装一个4号针头（又称皮针）或1ml注射器的针头，并用无菌的针头套管将之轻轻拧弯。轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管，将细胞冲出。每根骨用2.5ml IMDM培养液左右即可基本冲下骨髓腔内的细胞。5． 300C下离心，1200转/10分钟，去上清，但留1ml，以便用于在振荡器上悬浮细胞。6． 加进氯化铵溶液（NH4Cl: 8.99g/L, KHCO3: 1g/L, Na4-EDTA: 0.037g/L ，过滤灭菌, 40C储存）裂解红细胞，按1: 9比例，即1ml 细胞悬液，加进9ml氯化铵溶液，混匀，冰上10分钟。 7． 300C离心，1200转/10分钟，去上清。步骤二：淋巴细胞分离液分离小鼠骨髓细胞1． 按步骤二方法采集小鼠骨髓细胞，并破红细胞2． 细胞用4ml培养液悬浮，缓慢留置于8ml淋巴细胞分离液液面上，2000rpm for 20min.3． 小心吸取云雾状底层的基质细胞约1.5ml的体积，置于1个盛有1ml无菌细胞培养用PBS的15ml离心管中，颠倒混匀，1200rpm for 10min, 去上清4． 如果是注射用细胞，则用5ml PBS洗涤细胞2次；5． 离心沉淀下来的细胞用50-200ul PBS，计数细胞，并计算所需细胞体积数铺板培养

最新发现与创新 中国科技网讯 对于恶性肿瘤患者而言，最可怕的莫过于肿瘤出现转移扩散，因为这意味着肿瘤病变已经发展到晚期，也是肿瘤治疗失败的重要原因之一。今天（7日）在第七届中国肿瘤学术大会上披露，国际权威学术杂志《抗癌研究》（Anticancer Research）刊发了英国卡迪夫大学关于中药抑制肿瘤转移的研究报告，在国际上引起广泛关注。 英国卡迪夫大学医学院研究证实，我国抗肿瘤创新中药养正消积胶囊可有效抑制肿瘤细胞侵袭转移。研究人员指出，在肿瘤细胞的侵袭转移过程中，磷酸肌醇 3－激酶/蛋白激酶 B(PI3K/AKT) 信号通路的过度激活起到了关键作用，养正消积胶囊可以显著干预 PI3K/AKT 通路，从而对乳腺癌、肠癌、前列腺癌、肺癌、胃癌和骨肉瘤等肿瘤细胞的黏附和迁移起到明显抑制作用，有效控制肿瘤的病变发展。 有关专家介绍，恶性肿瘤细胞非常容易从原发病灶上脱落，每克肿瘤组织每天可向血液中释放300—400万个肿瘤细胞，脱落的肿瘤细胞随血液或淋巴流布全身，一旦条件成熟就会迅速生长，形成转移性病灶。控制肿瘤细胞的侵袭扩散是避免肿瘤恶化、提高肿瘤治疗效果、改善患者生存质量及延长患者寿命的有效措施。 专家认为，这一研究结果对恶性肿瘤的临床治疗具有极高的指导意义，对于尚未出现转移病灶的早中期肿瘤患者，使用养正消积胶囊可以控制肿瘤转移扩散，从而增加手术、介入等治疗手段的成功几率。此外，对于已经发展为全身性病变的晚期肿瘤患者，养正消积胶囊还具有增效减毒作用，可增加化疗疗效，减轻化疗中出现的消化道反应及免疫、造血系统损害，改善患者临床症状，明显提高患者的生存质量，延长患者的生存时间，是辅助治疗恶性肿瘤的一种安全、可靠、疗效满意的治疗方法。（通讯员 杨叁平 李瑞） 《科技日报》（2012-9-8 一版）

维生素K2能够参加骨代谢作用，可以促进成骨细胞的合成，并抑制破骨细胞的产生，从而促进骨的形成和降低骨的分解代谢。

维生素K2能够参加骨代谢作用，可以促进成骨细胞的合成，并抑制破骨细胞的产生，从而促进骨的形成和降低骨的分解代谢。

1.Runx2基因调控及其异构体的最新研究进展李雅琳 肖洲生 《中国药理学通报》2006年 第10期2.转录因子Runx2、Osterix与骨髓间质干细胞的成骨分化孙强（综述） 邱勇（审校） 《江苏医药》2006年 第7期3.成骨细胞分化与骨骼发育的转录因子Cbfα1／Runx2徐道志（综述） 詹红生（审校） 赵咏芳（审校） 《中医正骨》2006年 第114.TGF-β/BMPs、Wnt和MAPK信号通路在间充质干细胞向成骨细胞分化中的作用万晓晨 刘翠平 陈海啸 李继承 《细胞生物学杂志》2008年 第6期相关文献5.间充质干细胞向成骨细胞分化的信号通路曾芬芳 黄河 《细胞生物学杂志》2007年 第3期相关文献6.成骨细胞分化相关转录因子及其调控机制胡铁霞 李祖兵 《国外医学：口腔医学分册》2005年 第3期相关文献7.Cbfα1：成骨细胞分化的关键转录因子裴育 孟迅吾 周学瀛 《国外医学：内分泌学分册》2004年 第6期相关文献8.MAPK信号转导在成骨细胞分化中的作用董世武 《国外医学：分子生物学分册》2003年 第1期相关文献9.p44／42和p38MAPKs在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中发挥不同的功能廖清船 肖洲生 秦艳芳 赵彦 潘玮 《中国骨质疏松杂志》2004年 第3期相关文献10.辛伐他汀在骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中的作用曲强 郭伟 陈翠珠 《中国骨质疏松杂志》2004年 第3期相关文献11.洛伐他汀對成骨細胞骨形態發生蛋白2表達及堿性磷酸酶活性的影響 中華老年醫學雜志 2002 21(5)[color=#DC143C]dong3626： 以后请按照版规要求发帖求助。。。[/color]

原文是Purton, L.E., and Scadden, D.T. (2007). Limiting Factors in Murine Hematopoietic Stem Cell Assays. Cell Stem Cell 1, 263-270.发表在2007年cell stem cell 杂志上，最近由于要进行相应的课题研究，拿来精读了一番，做了一个笔记，发上来和大家分享，由于初涉小鼠造血干细胞这个领域，肯定有很多地方理解不全和错误，请大家指正。下面是我的精读笔记：小鼠造血干细胞研究方法综述一．关于HSC 免疫表型1. Thy1.1lo,Lin-Sca-1+Cells:其缺点是Thy1.1只表达于C57BL/Ka-Thy1.1小鼠，不表达于常用的C57BL/6小鼠；2. Lin- c-Kit+ Sca-1+ Cells（LSK）：异质性，含有祖细胞，HSC含量不超过10%；结合CD34和Flt3可以分为long-term repopulating HSCs (LKS+ CD34- Flt3-) ，short-term repopulating HSCs (LKS+ CD34+ Flt3-) ，以及multipotent progenitors(LKS+ CD34+ Flt3+)；3.荧光染料标记HSC: Rhodamine 123, Hoescht 33342, 以及Side Population，Rhodamine 123为线粒体染料，Hoescht 33342为DNA染料，HSC能够更多地将这两种染料泵出细胞外，所以染色较浅；4. SLAM Family Members：SLAM antigens (CD150+ CD244-CD48- cells)，其优点是不像Thy1.1和Sca-1其表达受到品系和发育阶段等的影响，在更多的种系的小鼠中适用二．克隆形成实验：主要反映的是祖细胞的造血能力，不反映HSC，检测T系和B系需要另外特定的培养条件；三．Cobblestone Area-Forming Cells/Long-Term Culture-Initiating Cells，鹅卵石样区域形成细胞实验/长期培养-启动细胞实验：体外检测更早期造血干/祖细胞的方法，但由于feeder layers和培养条件不同，实验结果在不同实验室间稳定性较差，对于其是否真正能检测造血干细胞也比较有争议，不过在一些情况下，比如归巢（homing）或植入（engraftment）有缺陷导致体内造血重建实验无法进行时，这两个方法是较好的替代方法；四．Colony-forming unit-spleen (CFU-S)脾集落单位形成实验：属于短期（1-3周）体内重建实验，检测的干祖细胞比体外CFC早，但比HSC晚；五．long-term repopulating assays，长期重建实验，包括：1. competitive repopulation assay：竞争重建实验：属于定性或者半定量研究HSC重建能力的方法，不能区别是HSC的数量还是质量造成的结果差异，得到的结果为RU即重建单位；2. limiting dilution assay：统计的指标是造血重建失败的小鼠数目，采用泊松分布来计算HSC的频率，得到的结果为CRU即竞争重建单位；Stem Cell公司的免费软件L-Calc,可用于分析实验结果。limiting dilution assay有两种方法：1CRU assay，采用最小数的HSC作为竞争细胞，可以在单细胞水平检测HSC；2也称为CRU assay，采用标准的，足量的HSC作为竞争细胞，不能在单细胞水平检测HSC；3serial transplant assay，多代移植，最为严格的检测造血干细胞的方法；六：Limiting Dilution Assays需要考虑的几个重要因素：1.竞争细胞：1compromised bone marrow，即连续两代重建成功的骨髓细胞，比较耗时2W41/W41受体小鼠：c-kit基因发生突变，具有更加敏感的宿主微环境，能够检测更少的植入的HSC，不需要另外的HSC作为支持细胞（竞争细胞）；3全骨髓细胞（whole bone marrow cells）：经验表明2 X105 competing bone marrow cells比较适合2.受测细胞（Test Cells, Unknown HSC Potential）：有人用LKS+ CD34- cells，但作者认为全骨髓细胞最好，原因是这种方法是在功能上评价HSC，避免了HSC在基因修饰的小鼠中免疫表型发生变化导致的结果的不可靠，在作者实验室通常采用的受测全骨髓细胞数为8 X 103到2 X106；3.重建失败的标准：现在一般认为受测细胞的重建比例小于1%为重建失败；在重建比例中，红细胞是不计算在内的，因为其不表达CD45,但一般认为只要其他系重建成功，红系应该也会重建成功；4.分析重建的时间点：看长期造血重建，最少要16周，最佳是六个月；5.其他考虑因素：归巢，HSC各系分化阻滞或减弱，祖细胞增殖动力学特性的改变，造血微环境对HSC的影响等等七．区分供体，受体的遗传学标志：最常用的是CD45.1,CD45.2系统，还有可以通过性别（Y染色体）来区分。

骨性关节炎是以软骨细胞去分化、软骨退化和软骨缺损为特征的致残性疾病，目前尚缺乏有效的药物来促进骨性关节炎患者软骨缺损的修复，临床治疗以延缓病情为主[1]。骨性关节炎涉及髌下脂肪垫和滑膜、关节周围肌肉、韧带、软骨下骨，尤其是关节软骨周围的各种组织学病变[2]。关节软骨主要由软骨细胞及其产生的大量细胞外基质组成，软骨细胞负责维持细胞外基质合成代谢和分解代谢之间的平衡，然而炎性细胞因子、异常机械刺激、软骨细胞凋亡和氧化应激等多种因素会破坏软骨细胞生理学和基质转换的平衡，进而导致基质丢失和组织变性，从而导致骨性关节炎的发生[3]。丹参属于传统的活血祛瘀中药，丹参酮ⅡA是丹参中脂溶性成分，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗肿瘤、雌激素样活性等多种药理作用，临床广泛用于心脑血管疾病、糖尿病、肝病、肿瘤等多种疾病的治疗[4]。丹参酮ⅡA可降低炎症反应、保护软骨组织以防治骨性关节炎。本文综述了丹参酮ⅡA防治骨性关节炎的研究进展，总结其作用机制，为丹参酮ⅡA临床治疗骨性关节炎提供参考。 1 降低炎症反应 1.1 阻止Tol样受体4/髓分化因子88/核因子-κB（TLR4/Myd88/NF-κB）信号通路激活 TLR4/Myd88/NF-κB信号通路通过促进多种炎症因子的表达参与骨性关节炎的炎症反应进程，可造成软骨组织炎症损伤，加快软骨退变进程[5]。张金锋等[6]使用丹参酮ⅡA治疗前交叉韧带切断术建立膝骨性关节炎大鼠模型，结果显示，10、20、50 mg/kg丹参酮ⅡA能显著提高大鼠步态行为和热刺激缩足反应潜伏期，降低机械刺激缩足反应阈值，显著改善大鼠软骨厚度、滑膜厚度和Mankin评分，显著减轻软骨表明粗糙、断裂、溃疡等病理损伤，显著降低外周血清和关节组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、胶原羧基端交联肽（CTX）-I、CTX-II的水平，显著降低NF-κB p65蛋白的表达，表明丹参酮ⅡA可通过阻止TLR4/Myd88/NF-κB信号通路激活以降低骨性关节炎的炎症反应。洪瑛等[7]使用丹参酮ⅡA干预小鼠原代软骨细胞，30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、400 μmol/L丹参酮ⅡA呈浓度和时间相关性降低IL-1β引起的原代细胞的增殖抑制率，显著阻止NF-κB p65、TRAF6蛋白和基因的表达，结果证实丹参酮ⅡA通过阻止NF-κB信号通路激活以减轻软骨细胞的炎症损伤。 1.2 抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/核因子-κB（PI3K/Akt/NF-κB）信号通路激活 PI3K/Akt/NF-κB是介导骨性关节炎的重要信号通路，激活后可诱导IL-6、基质金属蛋白酶（MMP）、TNF-α等多种下游炎症因子的分泌，参与骨性关节炎的病理进程，可诱导软骨组织降解，降低软骨的抗应能力[8]。孟如丹等[9]研究使用丹参酮ⅡA干预大鼠原代软骨细胞，发现6.25、12.5、25、50 μmol/L丹参酮ⅡA能促进软骨细胞增殖，12.5、25、50 μmol/L丹参酮ⅡA对IL-1β的干预能促使软骨细胞增殖，还能抑制软骨细胞中前列腺素E2（PGE2）、IL-6、TNF-α、一氧化氮（NO）的分泌，以及MMP-13、环氧化酶-2（COX-2）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、ADAMTS-5基因和蛋白表达，结果证实丹参酮ⅡA可通过抑制PI3K/Akt/NF-κB的激活以阻止软骨细胞的炎症反应，降低软骨组织的降解，对软骨组织发挥保护作用。 1.3 调节微小RNA（miR）-155/叉头框蛋白O3（FOXO3）轴的表达 miR是一类进化上保守的单链非编码小RNA分子，在转录后水平调控基因表达，miR-155在骨性关节炎软骨细胞中显著上调，参与骨性关节炎的发病机制，可靶向促使FOXO3的3′UTR的表达下调，进而加剧骨性关节炎组织间的炎症反应，促进软骨细胞凋亡[10]。Zhou等[11]使用丹参酮ⅡA干预乙酰半胱氨酸处理的人原代软骨细胞，发现5、10 μmol/L丹参酮IIA能显著降低软骨细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白和基因的表达，显著降低miR-155-5p的表达和提高FOXO3的表达，通过下调caspase-3-9的表达以抑制软骨细胞凋亡，通过miR-155抑制剂反向验证丹参酮ⅡA对miR-155的靶向抑制作用，表明丹参酮ⅡA可靶向调节miR-155/FOXO3轴的表达显著降低骨关节炎的炎症反应。 1.4 上调β-arrestin2的表达 β-arrestin2是NF-κB信号通路的上游因子，过表达能阻止TLR4/NF-κB信号通路激活，继而介导多种炎症因子的分泌，诱导并加剧软骨组织的炎症损伤[12]。张建业等[13]使用IL-1β诱导软骨细胞炎症反应并使用Hulth法建立膝骨性关节炎大鼠模型，结果100 μmol/L丹参酮ⅡA能逆转IL-1β引起的软骨细胞活力下降，降低IL-1β引起的软骨细胞中COX-2、iNOS、PGE2、NO、MMP、p65表达的升高，呈浓度相关性促进β-arrestin2、聚集蛋白聚糖、II型胶原蛋白的表达，经0.5 mg/kg丹参酮ⅡA治疗后，大鼠的软骨骨质变薄、粗糙、软骨细胞排列紊乱的病理获得明显改善，还能降低Mankin评分，结果证实丹参酮ⅡA可通过上调β-arrestin2的表达来降低软骨组织的炎症反应，进而控制骨性关节炎的病情发展。 1.5 抑制炎症因子的表达 炎性细胞因子引发炎症反应，参与骨性关节炎的发生、发展，其中多种促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α和iNOS）的水平显著升高，进而诱导软骨细胞凋亡和增加软骨组织降解[14]。Jia等[15]使用前交叉韧带横断术和内侧半月板切除术建立骨性关节炎大鼠模型，使用0.5 mg/kg丹参酮ⅡA进行治疗，结果发现丹参酮ⅡA能有效抑制大鼠软骨降解和软化，降低大鼠的Mankin评分，有助于降低半月板切除引起的滑膜内膜崩解和炎症细胞积累，抑制软骨细胞凋亡，促进基质金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP-1）的表达和降低MMP-13的表达，降低大鼠血清中TNF-α、IL-1β和iNOS的水平，促进软骨细胞中骨形态发生蛋白2（BMP-2）和人转化生长因子β1（TGF-β1）蛋白的表达，证实丹参酮ⅡA可通过降低炎症因子的表达以阻止软骨细胞的降解，用于骨性关节炎的治疗。 2 保护软骨组织 2.1 调节Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路表达 Wnt/β-catenin参与关节软骨形成和分化的调节，β-catenin可促使多种降解酶的表达，加快细胞外基质的降解和软骨组织损伤，Wnt的过表达可增加关节内蛋白酶的活性，促进胶原蛋白的分泌和细胞外基质的形成[16]。宋奕等[17]使用丹参酮ⅡA干预大鼠原代软骨细胞，发现6.25、12.5、25、50 μmol/L丹参酮ⅡA可呈浓度相关性提高软骨细胞的II型胶原蛋白和II型胶原的分泌，并降低β-catenin蛋白的表达，表明丹参酮ⅡA通过调节Wnt/β-catenin信号通路以促进软骨细胞II型胶原蛋白的表达，对关节软骨发挥保护作用。 2.2 上调长链非编码RNA（lncRNA）的表达 lncRNA在骨性关节炎中起着重要作用，与富核丰度转录本1（NEAT1）相互作用，影响软骨细胞增殖、迁移和凋亡以及细胞外基质分泌，NEAT1_2在软骨细胞对炎症因子和去分化引起的应激的反应中起着关键作用[18]。Sun将[19]丹参酮IIA用于IL-1β干预兔软骨细胞，发现2 μg/mL丹参酮IIA能提高兔软骨细胞中NEAT1_2的表达，显著提高细胞中SOX9、ACAN mRNA水平和COL II/COL I比率，继而增强软骨细胞表型基因的转录，有效减轻IL-1β和TNF-α诱导的软骨细胞凋亡，阻断细胞应激的加重，与软骨细胞共同培养能促进软骨组织再生，证实丹参酮IIA通过上调lncRNA NEAT1_2有效促进软骨再生，可望成为治疗骨性关节炎的新策略。 2.3 抑制铁死亡 铁死亡是一种细胞死亡形式，由铁依赖性脂质过氧化引发，活性氧（ROS）过度分泌会破坏氧化还原稳态，增加促死亡元素（如Bax、Bid），并降低促生存因子（如Bcl-2）的表达，谷胱甘肽（GSH）耗竭或谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）失活引起的脂质过氧化是细胞铁死亡的典型特征，铁死亡可加重软骨细胞损伤，加剧骨性关节炎的病情发展[20]。Xu等[21]使用丹参酮IIA干预小鼠软骨细胞系ATDC5，发现40、100 μmol/L丹参酮IIA能显著降低脂多糖诱导的ATDC5细胞凋亡，逆转脂多糖引起的Bax蛋白增加和Bcl-2蛋白降低，降低MMP13、ADAMTS5 mRNA的水平，提高Col II mRNA和蛋白的水平，通过提高ATDC5细胞中GSH、GPX-4的水平，降低ROS水平，缓解脂多糖诱导的炎症反应，降低软骨细胞铁死亡，结果证实丹参酮IIA通过抑制铁死亡来改善软骨细胞凋亡和软骨变性，并可能成为骨性关节炎的潜在治疗剂。 2.4 促进软骨组织形成 关节软骨覆盖了人体滑膜关节的所有关节表面，由细胞外基质和极少数位于该组织内的软骨细胞组成，由于软骨内缺乏血管，极大地限制了关节软骨的自我修复能力，软骨组织工程技术生产的支架是目前临床促进软骨修复的主要治疗手段[22]。Chen等[23]通过冷冻干燥法制备丹参酮IIA递送丝素蛋白支架，通过5、10、20、40 μg/mL丹参酮IIA制作成不同质量浓度的支架，发现10 μg/mL丹参酮IIA组成的支架（SF/T10）促使软骨细胞中COL Ⅱ/COL Ⅰ的表达升高，程度优于其他质量浓度，还能显著促进软骨样细胞外基质的生成和软骨形成，将SF/T10用于裸鼠的皮下区域后发现移植区域均生长出软骨样组织，将SF/T10用于兔软骨缺损修复的实验发现可促使缺损部位完全修复，再生组织与周围软骨相似，结果证实丹参酮IIA递送丝素蛋白支架能促进软骨组织形成。 2.5 阻止软骨细胞去分化 软骨细胞在骨性关节炎病理进程中可发生去分化，失去其软骨生成特征，并显示成纤维细胞样形态，通常从多边形变为纺锤形，软骨细胞去分化程度与骨性关节炎的骨损伤程度呈正相关[24]。Zhang等[25]将100 μg/mL丹参酮IIA与软骨细胞进行体外培养，结果丹参酮IIA能促使软骨细胞早期迅速增殖，促使糖胺聚糖的表达，上调Col II、SOX6 mRNA的表达，基于网络药理学发现丹参酮IIA发挥作用机制的5 020个潜在靶基因，COL2A1、COL10A1、ADAMTS5、MMP13、COMP、GDF5、SOX6 7个枢纽基因是关键靶点，结果证实丹参酮IIA可阻止软骨细胞去分化，可能成为骨性关节炎的候选药物。 3 结语 丹参酮ⅡA可通过阻止TLR4/Myd88/NF-κB信号通路激活，抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路激活，调节miR-155/FOXO3轴的表达，调节Wnt/β-catenin信号通路表达，上调β-arrestin2的表达，上调lncRNA的表达，抑制炎症因子的表达，抑制铁死亡，促进软骨组织形成，阻止软骨细胞去分化等多种途径发挥降低炎症反应和软骨组织保护作用，以防治骨性关节炎。目前丹参酮ⅡA用于骨性关节炎多以基础研究或动物研究为主，在人体的药理作用尚需试验验证，并且丹参酮ⅡA的量效关系、药物安全性还需进一步确认，但是丹参酮ⅡA用于骨性关节炎具有较好前景，值得深入探讨。

【序号】：2【作者】：张小雅【题名】：γ-聚谷氨酸/壳聚糖复合水凝胶的制备及其软骨细胞相容性的检测【期刊】：河南大学【年、卷、期、起止页码】：2022【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=-93ivAxQXRoWpzvnmijM_l1O7kO4p08OzI4shh4Z48M_spDiNyv7zEK1DYOM4745a7bypCSHM2OlQPXqZ-4az5mDBe_vxk9UAQX3EQ7IkMV6z-pdakeD50lyGCOK9l3AUQTRl16TU6wOPRRtbKXh9w==&uniplatform=NZKPT&language=CHS

肌肉能提供干细胞来促进肌肉的生长和受伤肌肉的再生，但肌肉干细胞必须驻留在特殊的部位才能有助肌肉的生长和修复。德尔柏林布吕克分子医学中心（MDC）发育生物学家Dominique Bröhl和Carmen Birchmeier教授已经阐明这些干细胞是如何定植于肌肉干细胞“巢穴”中的。肌肉干细胞也被称为卫星细胞，位于平滑肌细胞的质膜和周围基底层之间。可发育分化为成肌细胞，后者可互相融合成为多核的肌纤维，形成骨骼肌最基本的结构。http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/201209/2012091813042153.jpg在本研究中，Bröhl博士和教授Birchmeier表明，小鼠的肌肉祖细胞缺乏Notch信号后，不能定植于干细胞“巢穴”。相反，肌肉祖细胞会定植于肌纤维之间的组织中。发育生物学家认为，这是肌肉弱化的原因。干细胞定植于错误的地方就不再像以前那样拥有多种生物学功能，难以有助于肌肉生长。此外，Notch信号通路在肌肉的发育过程中具有第二大功能。它可以通过抑制肌肉发育促进因子MyoD防止干细胞分化成肌肉细胞，从而确保肌肉中总会存在能保存有修复和再生功能的干细胞“巢穴”。这项工作对肌肉再生和肌肉无力的研究具有重大意义。这实验势必为肌肉严重损伤和肌肉萎缩的患者提供新的希望！多么希望此技术能在中国普及。

[em0808]我要做的是小鼠的卵细胞的电镜，但是我所能获得的卵细胞的数量有限的，不知道有什么技巧可以保证细胞能包埋进去，听说有人做了好几次就没有作出来呀 急哦 谢谢大家了

胎盘亚全能干细胞定义： 　　亚全能干细胞自胚胎形成的第5到7天开始出现，能分化形成200 多种人体组织器官细胞，但不能形成一个完整的人体。胎盘亚全能干细胞是来源于新生儿胎盘组织的一族亚全能干细胞，其在发育阶段与胚胎干细胞接近，具备分化形成三个胚层的组织细胞的能力，但不会形成畸胎瘤。 　　胎盘亚全能干细胞的主要特性与功能： 　　胎盘亚全能干细胞是取自胎盘组织的一类亚全能干细胞，胎盘亚全能干细胞具有以下特性： 　　1. 具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为间充质干细胞，上皮干细胞、神经干细胞、肝干细胞，肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。可以用来修复受损或病变的组织器官，治疗心、脑血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病、骨组织病、角膜损伤、烧伤烫伤、肌病等多种疾病。 　　2.具有免疫调节作用，通过负性免疫调节功能，抑制机体亢进的免疫反应，使机体免疫功能恢复平衡，从而可以用来治疗造血干细胞移植之后的免疫排斥反应以及克隆氏病、红斑狼疮，硬皮病等自身免疫系统疾病。 　　3.胎盘亚全能干细胞定向培养的间充质干细胞是人体微环境的重要组成部分，移植间充质干细胞可以改变造血微环境，重建免疫系统，促进造血功能恢复，与造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等的治疗效果。 　　4.具有来源方便，细胞数量充足，易于分离、培养、扩增和纯化，传代扩增30多代后仍具有干细胞特性。 　　胎盘亚全能干细胞的用途： 　　胎盘作为理想的亚全能干细胞来源，在抗衰老及疾病治疗领域显示了其独特的功能，治疗疾病种类如下： 　　心脑血管系统疾病 　　糖尿病 　　肝肾损伤 　　脑及脊髓神经损伤 　　自身免疫性疾病 　　移植物抗宿主病 　　与造血干细胞共移植治疗血液病 　　缺血性血管病 　　肺及其它组织器官纤维化 　　抗衰老，恢复健康体态 　　胎盘亚全能干细胞的储存流程： 　　在新生儿娩出、胎盘剥离子宫排出后，由接生的医生尽快按照干细胞库胎盘标准采集规程进行胎盘的采集，然后放置在干细胞库特定的装置工具中，在限定时限内运送到干细胞库，由专业的技术人员进行亚全能干细胞的分离、提取、培养、检测等技术流程，直到根据最终检测结果来确认所获得的干细胞是否具有长期保存的价值。 　　保存和期限 　　目前国际上通用的干细胞保存技术是将获得的干细胞储存在-196℃深低温状态，医学研究与临床实践证明保存一百多年的细胞仍然具有活性。干细胞保存已有几十年的历史，胎盘干细胞库在与客户签订的合同期限内对干细胞库中所保管的胎盘亚全能干细胞活性负责。 　　安全性 　　胎盘的采集简便易行，不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。过去胎盘通常作为废物丢弃，而从胎盘中提取亚全能干细胞进行保存，是宝贵的生命资源再生。 　　而干细胞行业数据显示，胎盘亚全能干细胞基因稳定、不易突变，动物实验证明无致瘤性，使用安全可靠，对适应症范围疾病治疗效果好，优于传统医疗手段。 　　胎盘亚全能干细胞的优势 　　1.取材方便，原料来源充足，是生命资源的再生。 　　2.分化能力强可以定向诱导分化为间充质干细胞、血管干细胞、上皮干细胞、神经干细胞和肝干细胞等多种干细胞。 　　3.数量充足，使用方便，增殖能力强，培养后数目可达10亿，可以供多人多次使用。 　　4.在人群中使用不需要配型，不会产生免疫排斥反应，同时，血缘关系越亲近，生物利用度会越高，使用的效果越好。 　　5.治疗疾病范围广，抗衰老，恢复健康体态，心脑血管系统疾病，糖尿病，肝肾损伤，脑及脊髓神经损伤，自身免疫性疾病，移植物抗宿主病等多种疾病。

最新发现与创新 中国科技网讯 一种治疗骨质疏松的药物特里帕肽（重组人甲状旁腺激素1-34，PTH1-34片段），经皮下注射可缓解侏儒类型的骨骼生长发育障碍。第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤实验室暨骨代谢与修复中心主任陈林教授带领课题组经过4年基础研究，发现了重组人甲状旁腺激素的又一功效，为临床治疗软骨发育不全、致死性软骨发育不全等提供了重要理论依据。日前，相关研究论文发表在国际权威杂志《人类分子遗传》上。 软骨发育不全、尤其是致死性软骨发育不全除手术外，目前尚无有效的治疗方法。虽然生长激素也被用来治疗软骨发育不全，但需要在青春期以前给予生长激素，且长期效果不佳，副作用明显。 陈林课题组在国家973计划项目、国家自然科学基金等多项课题的资助下，利用基因敲入技术建立的模拟上述疾病的小鼠模型，深入研究了软骨发育不全、致死性软骨发育不全的发生机制。实验中发现软骨发育不全模型小鼠生长板软骨细胞增生活性和分化能力降低，伴甲状旁腺激素信号活性降低，而甲状旁腺激素处理可升高甲状旁腺激素信号及降低培养软骨细胞中成纤维生长因子受体3的表达水平与活性。 实验表明，软骨发育不全小鼠注射甲状旁腺激素1-34可降低成纤维生长因子受体3突变对软骨细胞增殖与分化的抑制作用，缓解软骨发育不全的骨骼生长发育障碍，并改善该小鼠成年后的骨量；致死性软骨发育不全小鼠注射甲状旁腺激素1-34后，可使其免于出生后早期死亡。 据陈林介绍，特里帕肽是被美国食品药品监督局批准的治疗骨质疏松药物，已上市10余年。因此，该发现为软骨发育不全和致死性软骨发育不全的生物治疗提供了新的药物选择。（邹争春 记者 陈磊） 《科技日报》（2012-8-10 一版）

食品安全国家标准 小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验

干细胞使与衰老有关的肌无力的速度放缓 在小鼠中的一则新的研究报告指出，用干细胞来增加年轻的肌肉可减缓与年龄老化相关的肌无力的进程。 这些发现可能会导致再生性肌肉疗法的出现，这种疗法也许会对罹患肌营养不良症的病人或是那些虚弱的老年人有帮助。 文章的作者提出，如果科学家们能够发现可刺激肌肉中干细胞的小分子或分子组合（这可能会比将干细胞移植到人体内要更容易些），那么这些分子可被用于增进肌肉修复或减少肌肉丧失。 在成年期，损伤后或疾病后肌肉再生主要是靠卫星细胞，这是一种会分裂并参与修复、重新恢复活力和控制骨骼肌组织的干细胞，它可通过发育成为肌肉细胞而令肌肉生长。 Bradley Olwin及其同事在这里利用了干细胞的能力并防止了在幼小的小鼠中某一单一肌肉的与年龄老化有关的消瘦。 在该研究中，研究人员将少数的干细胞移植到肌肉受伤的幼小小鼠体内。 该研究小组在两年后对这些小鼠进行检查时发现，这种手术永久性地改变了移植的细胞，使得它们能够抵抗肌肉中的老化过程。 明确地说，这些移植的细胞能够控制它们所在的肌肉并与肌肉融合以形成新的肌肉纤维。 尽管人们对这一过程的机制还不了解，但这些发现提示，通过模仿这些移植的干细胞的功效，科学家们也许能够防止肌肉功能和重量的丧失，而这些通常是在人类老化时出现的情况。

一般的骨折、脱位等外伤，基本不需要口服药物加快愈合。因为，人体的骨组织有很强的再生能力，完全可以自我修复。但有的患者治病心切，往往喜欢服用各种促进骨骼生长的药物，结果却延误了病情。为此，现将一些不利于骨折愈合的药物做以简单介绍。 　　消炎痛和水杨酸类药物：如消炎痛、阿司匹林、扶他林等药物是通过抑制前列腺素合成，起到止痛的作用。与此同时，抑制前列腺素的合成不利于骨折断端血管的再生。而且，此类药物在减轻炎症的同时，使血管扩张作用受到抑制，局部血流减少，组织缺氧，长期服用会造成骨折愈合延迟。 　　四环素类药物：迟缓骨骼生长，导致儿童骨骺和干骺端的骨小梁变形、断裂，发生局部的微细骨折。 　　皮质激素类药物：强的松龙、地塞米松等皮质激素类药物会直接影响骨骼的生长及损伤后的修复。长期服用，还可能导致全身性骨质疏松，甚至引起病理性骨折。在骨折愈合初期，如使用上述药物将使骨折断端的血肿吸收缓慢，血管再生、骨化等受到抑制，还可诱发血肿感染。 　　抗凝类药物：各种止血剂肝素，可降低凝血活酶浓度，使骨折端纤维蛋白合成减少，局部多糖降低，延缓骨折愈合。 　　环磷酰胺：该药物的不良反应主要有骨髓抑制引起白细胞及血小板减少，具有细胞毒性，可使骨骺软骨板的成骨细胞损伤，使其纵向生长受到限制，骨干抗弯强度减弱。

各国争相发展的重点项目　　iPS技术，即诱导性多能干细胞技术，是一种将成体成熟、分化的体细胞重编程获得类似胚胎干细胞的新兴技术。2007年11月美国和日本科学家分别独立宣布可将人类皮肤细胞转化为iPS细胞。这一发现被《自然》和《科学》杂志分别评为2007年第一和第二大科学进展。之后，iPS细胞研究迅猛发展，不同的国家和实验室纷纷报道了多种方法建立的iPS细胞系。就连世界第一只体细胞克隆动物多利羊的培育者伊恩·威尔莫特也宣布放弃人类胚胎干细胞克隆研究，转而进行 iPS 细胞研究，因为他认为这种细胞比胚胎干细胞更具潜在优势。　　我国连续多年将干细胞研究列入“863”、“973”、国家自然基金重点项目。国务院2006年发布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年）》中，干细胞作为五项生物技术之一成为未来15年我国前沿技术的重点研究领域。　　致瘤风险浮出水面　　Yamanaka研究组在《自然·生物技术》上发表的文章显示，用iPS细胞诱导的神经干细胞，即使不含c-Myc（曾被认为是导致肿瘤的主要原因），在植入NOD/SCID免疫缺陷小鼠后仍有很强的致瘤性，甚至高于胚胎干细胞。　　　他们共研究了36个iPS细胞克隆，在诱导方式上，有些诱导剂配方中含有c-Myc基因，有些没有，因此具有较好的代表性。同时他们选择了3株胚胎干细胞作为对照。在45周的观察中，移植胚胎干细胞来源神经干细胞的34只小鼠有4只长出肿瘤。在100只移植胚胎成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中34只发现肿瘤，概率和胚胎干细胞相当。在55只移植成人成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中46只发现肿瘤，概率远高于胚胎干细胞。在36只移植肝细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中10只发现肿瘤，概率高于胚胎干细胞。8只移植胃上皮细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中未发现肿瘤。病理学检查证实肿瘤均为畸胎瘤，部分为恶性畸胎瘤。　　研究还发现，以前认为致瘤性很强的c-Myc在去掉后并没有减少iPS神经干细胞的致瘤性，相反以前认为没有致瘤性的Nanog基因却可以明显增强iPS神经干细胞的致瘤性。　　这次试验的另一个意外结果是并未发现在生成的肿瘤细胞中有c-Myc或其他基因的激活。以前的观点认为，转入的癌基因是iPS致瘤性的基础，只要在iPS细胞诱导成功后通过各种方法去除已完成使命的癌基因即可使iPS细胞免于致瘤性。这次试验的结果无疑给这些想法留下了阴影，而且使iPS致瘤的机制更加扑朔迷离。

【序号】：5【作者】： 马鹤成【题名】：可注射型PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶作为药物和基因缓释共载体在骨肉瘤治疗中的应用研究【期刊】：吉林大学 【年、卷、期、起止页码】：【全文链接】：[url]https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CDFD&dbname=CDFDLAST2015&filename=1015597237.nh&v=KpvPp0%25mmd2BJhesB8bRvfi3at1vw%25mmd2FMAPVva0msk2NmLdSeClb1NEVCq4DsIWWoufezxp[/url]

红芪是豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand. -Mazz.的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿的功效，临床主要用于治疗中气下陷、表虚自汗、气虚水肿及气虚血衰等[1]。现代药学研究表明红芪主要活性成分为多糖、黄酮和皂苷等[2-3]，具有抗氧化、调节免疫力、抗肿瘤、降血糖等药理作用，目前研究多集中在红芪多糖类、红芪黄酮类成分，而药理作用研究较少，但红芪黄酮类成分是除红芪多糖外主要的活性成分之一，具有抗肿瘤、抗氧化、改善肺纤维化、抗骨质疏松、降低骨骼肌损伤等药理作用[4]，且在抗氧化和改善肺纤维化方面的疗效优于黄芪。基于此，本文通过总结红芪黄酮类成分的药理作用及机制，为红芪黄酮类成分的进一步研究及临床应用提供理论依据。 1 抗氧化 自由基过氧化对于人体健康有直接或间接的影响，通过提高机体抗氧化能力，为人体氧化损伤疾病提供理论依据。研究表明黄酮类化合物能抑制脂质过氧化，有效清除自由基，具有良好的抗氧化作用[5]。赵沙沙等[6]研究表明，与其他红芪提取溶剂相比，95%乙醇提取物抗氧化活性最高，其中芒柄花素、美迪紫檀素、芒柄花苷单体的含量在95%乙醇提取物中达到2.2 mg/g，且芒柄花苷含量与提取物抗氧化活性存在一定量效关系。杨秀娟等[7]通过优化红芪总黄酮提取工艺，表明红芪黄酮类化合物具有较强的体外抗氧化活性。袁菊丽等[8]用正交法优化红芪总黄酮超声提取工艺，以其抗氧化活性为指标，发现红芪总黄酮溶液1～10 mg/mL具有良好的体外抗氧化能力，且呈一定的量效关系。 除具有良好的体外抗氧化活性，红芪黄酮类化合物还具有显著的体内抗氧化活性。红芪总黄酮对H2O2诱导的脐静脉内皮细胞损伤具有保护作用，且各剂量均可显著抑制丙二醛损伤，降低乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放及细胞内丙二醛含量，提高LDH和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，其作用机制可能与清除氧自由基，提高脐静脉内皮细胞的抗氧化能力有关[9]。王伟等[10]研究表明红芪黄酮荭草素5 μmol/L通过促进核因子E2相关因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）的表达与移位，激活Nrf2发挥较好的抗氧化作用，使细胞中血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）表达量处于较低水平，保持较低的氧化应激水平，进而达到抗氧化作用。综上，红芪黄酮类成分具有显著的体内、外抗氧化活性，其作用机制可能与调控LDH、SOD和丙二醛等多种酶的含量及抗氧化相关因子的表达有关。具体机制见图1。 图片 2 改善肺纤维化 肺纤维化是一类极为复杂难治的呼吸系统疾病，其最重要的病理特点是成纤维细胞增殖、大量细胞外基质聚集、肺组织结构破坏。目前，临床上常用的改善肺纤维化药物多为激素类药物，这些药物不良反应多，价格昂贵[11-13]。研究表明，中医药在防治肺纤维化方面具有独特的优势，单味中药及其有效成分或中药复方可靶向调节相关信号通路而改善肺纤维化[14]。大量研究表明红芪黄酮类化合物具有显著的改善肺纤维化作用，并且红芪黄酮类化合物改善肺纤维化作用优于黄芪黄酮，其作用机制为减少细胞外基质沉积和抑制胶原纤维增生等。 2.1 减少细胞外基质沉积 张毅等[15]通过观察红芪总黄酮对博莱霉素5 mg/kg诱导的肺间质纤维化模型大鼠转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）蛋白表达及肺组织超微结构的影响，发现红芪总黄酮7.5、15.0、22.5 mg/kg均能抑制TGF-β1表达，显著改善肺纤维化大鼠的病理损伤、减少细胞外基质沉积，且以红芪总黄酮高剂量组效果作用最为明显。李娟等[16]通过观察红芪黄酮对博莱霉素5 mg/kg诱导肺间质纤维化模型大鼠肺功能的影响，表明红芪总黄酮7.5、15.0、30.0 mg/kg均能改善肺纤维化核型大鼠肺功能，且对肺的动态顺应性指标、容量指标及体积流量指标等均有不同程度的改善作用，提示红芪黄酮具有一定的抗肺纤维化的作用，其机制仍有待进一步深入探讨。 2.2 抑制胶原纤维增生 蔺兴遥等[17]通过研究红芪总黄酮37.41 mg/kg给药及气溶胶（气溶胶浓度3.5～4.0 mg/m3，给药时间40 min）给药方式对肺纤维化的影响，发现各红芪总黄酮给药组都具有改善肺纤维化的作用，肺组织中透明质酸及层黏连蛋白（laminin，LN）的含量显著下降，且气溶胶给药组疗效更为明显。并且比较了黄芪总黄酮15 mg/kg和红芪总黄酮15 mg/kg对肺间质纤维化疾病大鼠模型肺功能的影响，发现二者均具有抑制大鼠肺间质纤维化的作用，且红芪总黄酮疗效优于黄芪总黄酮[18]。苏韫等[19]在红芪有效部位对肺间质纤维化模型大鼠肺组织胶原面积、透明质酸及LN的影响研究中发现，红芪总黄酮7.5、15.0、22.5 mg/kg均能通过减轻肺泡炎症，抑制胶原纤维增生、沉积，进而降低肺组织中透明质酸及LN的含量，来改善肺纤维化，其中红芪总黄酮疗效优于红芪多糖和红芪皂苷。王艺等[20]研究发现红芪总黄酮7.5、15.0、30.0 mg/kg均能通过降低肺组织中透明质酸、LN、羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）水平抵抗博来霉素诱导的大鼠肺间质纤维化，均可不同程度的改善大鼠肺间质纤维化。舍雅莉等[21]和李娟等[22]研究发现红芪总黄酮7.5、15.0、22.5 mg/kg可通过抑制肺纤维化大鼠微血管新生相关促进因子来改善肺纤维化，且呈剂量相关性。苏韫等[23]采用气管内滴注博莱霉素法建立肺纤维化模型，通过ig红芪总黄酮7.5、15.0、22.5 mg/kg 28 d，在第7、14、28天分3次采集标本并进行相关指标检测，结果发现红芪总黄酮可通过抑制基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）及基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）蛋白表达，使MMPs/TIMPs趋于平衡，来抑制肺纤维化进程。具体机制见图2。 图片 3 抗肿瘤 癌症是我国最难治愈的疾病之一，随着科技的不断发展，治疗癌症的手段也越来越多，但其治疗手段对人体的不良反应较大，而癌症又是一项治疗难度较大的疾病，故优化防治癌症的手段尤为重要。红芪异黄酮类是红芪的主要活性成分之一，且与红芪的生物特性息息相关[1]，其中毛蕊异黄酮、芒柄花素成分是红芪药材质量评价的重要指标性成分[24]，且对肝癌[25]、胃癌[26]、非小细胞肺癌[27]、宫颈癌[28]等均有治疗作用。研究表明，红芪黄酮类成分对胃癌、白血病、肺癌和前列腺癌等均有显著防治作用，其抗肿瘤的作用机制可能是通过抑制细胞生长增殖、诱导细胞凋亡和干扰细胞周期等。 3.1 抑制细胞增殖 红芪异黄酮类成分芒柄花素60 μmol/L通过在体外诱导细胞周期停滞，呈剂量相关性抑制前列腺癌细胞增殖，同时显著下调细胞周期蛋白D1（cyclin-dependent 1，cyclin D1）和细胞周期蛋白依赖激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）的表达，对小鼠的肿瘤生长有明显的抑制作用[29]。王雅莉等[30-31]通过研究红芪总黄酮80 μg/mL对人慢性髓原白血病K562细胞增殖的影响，发现红芪总黄酮对K562细胞的生长具有显著的抑制作用，使K562细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂P21基因表达升高，增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达降低，从而发挥抗肿瘤作用。 3.2 诱导细胞凋亡 红芪异黄酮类成分毛蕊异黄酮50 μmol/L可通过降低胃癌细胞外信号调节激酶、上游核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）及信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的表达，升高细胞色素C和B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）相关的细胞死亡激动剂、降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，诱导细胞凋亡，达到抗胃癌的作用[32]。红芪异黄酮类成分芒柄花素25 μmol/L可通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cystein-asparate protease，Caspase）级联的死亡受体介导外源性及依赖线粒体的内源性凋亡途径使咽鳞癌细胞凋亡进而发挥抗肿瘤作用[33]。Hu等[34]研究发现红芪异黄酮类成分芒柄花素50 mg/kg可能通过增加人骨肉瘤U2OS细胞Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）和凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）的阳性细胞，同时，升高U2OS荷瘤小鼠的阳性细胞和Bax、Caspase-3和Apaf-1蛋白，下调雌激素受体α亚型（estrogen receptor alpha，ERα）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）阳性细胞和蛋白质水平，促进细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。 3.3 干扰细胞周期 邓婉蓉[35-36]通过研究红芪总黄酮80 μg/mL对人体白血病的影响，发现红芪总黄酮可通过调控c-fos基因表达，抑制白血病干细胞G0/G1期DNA合成，从而抑制白血病细胞的增殖，达到红芪总黄酮抗肿瘤作用，并且结果表明其抑制作用具有量效关系。红芪异黄酮类成分芒柄花素150 μmol/L可增加非小细胞肺癌细胞的p21蛋白表达，降低细胞周期调节蛋白如cyclin A和cyclin D1的表达，促进Caspase-3和促凋亡蛋白Bax的表达，降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达，诱导G1期非小细胞肺癌细胞周期停滞和凋亡而成为肺癌治疗的潜在预防药物[37]。具体机制见图3。 图片 4 抗骨质疏松 随着人口老龄化的加重和生活水平的提升，我国骨质疏松发病率逐年上升。骨质疏松症是一种以骨量减少、骨质量下降和骨微结构退化为特征的全身性骨病，其成因是破骨细胞活性大于成骨细胞，导致骨吸收大于骨形成[38]。由于老年人的生理结构和各项生命指征呈下降趋势，故较易发病，严重影响其生活质量[39]。目前临床上用于治疗骨质疏松的药物不良反应较大[40]。而中药具有不良反应小、疗效确切等特点[41]，其中，植物活性成分已经被证明是预防骨质疏松新方法的潜在来源[42]，如多糖、黄酮等活性物质，这些活性物质通过调节骨特异性基质蛋白、转录因子、信号通路、靶点等发挥作用，通过自身特性治疗骨质疏松症[43]，可以最大程度的减少不良反应。目前关注度较高，患者易接受[44]。红芪黄酮类化合物对于多种原因诱导的骨质疏松均有显著防治作用，其机制可能是促进成骨细胞的增殖和分化，降低钙流失等，增大骨密度，维持骨平衡，增强骨质量来防治骨质疏松。 4.1 促进成骨细胞增殖、分化 方瑶瑶等[45-46]通过研究红芪多糖和黄酮类成分对大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow stromal cells，rBMSCs）和大鼠颅骨成骨细胞（rat calvarial osteoblasts，ROBs）成骨分化的影响，发现红芪异黄酮类成分毛蕊异黄酮通过激活胰岛素样生长因子-1受体（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/Akt信号通路发挥作用，其中毛蕊异黄酮1 μmol/L可显著促进rBMSCs和ROBs细胞的成骨分化作用，并且优于红芪多糖。另外在5种黄酮类化合物毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、异甘草素和美迪紫檀素（0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 μmol/L）对rBMSCs和ROBs细胞活性和成骨相关因子的变化研究中发现，5种不同黄酮类化合物均能促进rBMSCs和ROBs的增殖，提高碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，增加Ca含量，增加钙化结节面积和数量，达到抗骨质疏松的作用。陈宇等[47]在红芪活性组分抗骨质疏松作用的谱效关系研究中发现，红芪异黄酮类成分毛蕊异黄酮10 μmol/L可以提高成骨细胞ALP活性，促进成骨细胞分化，进而发挥抗骨质疏松作用。吴虹[48]通过观察红芪异黄酮类成分毛蕊异黄酮15、30 mg/kg对去卵巢大鼠骨质疏松的防治作用，发现毛蕊异黄酮对去卵巢大鼠具有显著的骨保护效应，并存在一定的剂量效应关系，其作用弱于雌激素。槲皮素是一种植物类黄酮，也是红芪中的黄酮醇类成分，具有雌激素作用，Pang等[49]和Li等[50]用槲皮素2.5 μmol/L处理骨髓间充质干细胞，研究发现槲皮素可以增强ALP活性，促进细胞外基质的产生和矿化，并且上调Runt相关转录因子2（Runt-relatedtranscription factor 2，RUNX2）、成骨细胞特异性转录因子和骨桥蛋白等骨母细胞特异性标记基因的表达。此外，槲皮素还可通过雌激素受体调节骨母细胞特异性基因的表达，并且激活骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）/Smad信号通路。表明槲皮素可以通过雌激素受体介导的途径刺激BMSC分化为成骨细胞，并且BMP/Smad信号通路在其中具有重要作用。Zhang等[51]发现槲皮素5 μmol/L可通过抑制微小RNA-206（microRNA-206，miR-206）通路的表达和上调连接蛋白43的表达，从而促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化。 4.2 减少骨流失 袁真等[52]发现山柰酚、芦丁、槲皮素（浓度分别为50 mg/kg）3种活性成分均可以降低尿液中的Ca、P丢失，改善骨微结构并增加骨密度，且山柰酚效果最好。Kim等[53]研究表明高良姜素、淫羊藿苷、山柰酚和槲皮素等（0～50 μmol/L）黄酮类化合物可以增加人SV40转染成骨细胞的增殖，其中高良姜素、淫羊藿苷、山柰酚、槲皮素可减少唑来膦酸钠诱导的细胞损伤，尤其高良姜和山柰酚对唑来膦酸具有显著的细胞保护作用。另有研究发现槲皮素100 mg/kg可改善维甲酸诱导的骨质量系数、骨长、骨径、骨灰分含量和钙磷含量的降低，降低维甲酸诱导的氧化应激和骨质流失[54]。见图4。 图片 5 降低骨骼肌损伤 骨骼肌对于维持人体姿态和运动是必不可少的，但同时骨骼肌损伤也极为常见[55-56]。目前多用非甾体类抗炎药减轻肌肉损伤后的疼痛及炎症反应以恢复肌肉功能，治疗方案较为单一[57]。红芪黄酮类降低骨骼肌损伤的作用机制可能是减缓运动后大鼠骨骼肌中丙二醛、LDH和一氧化氮含量积累，有效清除氧自由基，提高SOD活性及抑制骨骼肌细胞凋亡。 5.1 提高相关酶活性 袁书立[58]研究发现红芪黄酮荭草苷40 mg/kg可有效减轻运动性骨骼肌损伤大鼠的骨骼肌炎症和氧化应激，与空白组相比，实验组的骨骼肌p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）的磷酸化水平降低（P＜0.05），此外，荭草苷可促进运动性骨骼肌损伤大鼠骨骼肌Nrf2的转录和转位，抑制Kelch样ECH关联蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）的转录和表达。其机制可能与p38 MAPK通路和Nrf2/ Keap1通路有关。与肌肉损伤组相比，槲皮素/β-环糊精凝胶可降低脂质过氧化、SOD和过氧化氢酶活性，降低骨骼肌炎症和氧化应激，从而达到降低骨骼肌损伤的作用[59]。红芪总黄酮0.2 mg/kg可延缓离心运动后大鼠骨骼肌活性氧、丙二醛及LDH含量的积累并提高SOD活性，表明红芪总黄酮对高强度运动后氧化应激所导致的骨骼肌损伤有明显的防治作用[60]。段云燕等[61]发现红芪总黄酮0.2 mg/kg对于离心运动后大鼠骨骼肌中一氧化氮含量的下降有一定减缓作用，推测红芪总黄酮可有效清除氧自由基、下调丙二醛及LDH含量、提高SOD活性进而达到降低骨骼肌损伤的作用。 5.2 抑制细胞凋亡 杨雅丽等[62]等研究表明一次离心力竭运动可激活大鼠骨骼肌细胞NF-κB信号分子，启动细胞的凋亡程序，而红芪总黄酮0.2 mg/kg可降低高强度运动引发的应激反应，从而延缓离心运动后骨骼肌疲劳和损伤的发生，其机制可能与降低骨骼肌组织NF-κB、Bcl-2/Bax、细胞色素C、Caspase-3表达水平、抑制骨骼肌细胞凋亡有关，见图5。 图片 6 抗动脉粥样硬化 动脉粥样硬化作为引起冠心病、缺血性脑血管病等疾病的常见病因，严重威胁人们的身体健康与生命安全，且近年来发病呈逐渐增高[63]。流行病学研究发现黄酮类化合物可通过抗氧化、防止血栓形成、改善内皮功能、调节血脂和调节糖代谢等作用发挥抗动脉粥样硬化作用[64-65]。 6.1 改善内皮功能 红芪黄酮类化合物二氢黄酮柚皮苷100 mol/L可以通过调节蛋白激酶Hippo-YAP蛋白下调人脐静脉内皮中促炎因子的表达恢复内皮屏障细胞的完整性，发挥抗动脉粥样硬化作用[66]。 6.2 调节相关酶活性 类黄酮通过调节NF-κB途径来调节抑制因子κB激酶或在NF-κB与脱氧核糖核酸结合的水平上发挥抗炎作用[67]，如槲皮素100 μmol/L可通过p38激酶抑制作用影响NF-κB活化，并抑制小鼠的动脉粥样硬化[68]。 6.3 防止血栓形成 有研究证明黄酮类化合物槲皮素2 mmol/L、芦丁能够阻断血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa受体，抑制血小板活化及钙离子载体的促聚集作用，表明黄酮类化合物相关的抗血小板活性[69]。最新研究也发现槲皮素1.5 mmol/L对环氧合酶的抑制率高达90%，主要通过改变花生四烯酸的代谢来干扰血小板聚集[70]。通过不同细胞模型对柑橘黄酮类化合物进行抗动脉粥样硬化作用评估，结果发现在人肝癌细胞中柚皮素75 μmol/L可抑制胆固醇酯转移蛋白和微粒体甘油三酯转移蛋白，从而限制胆固醇酯和三酰甘油在脂蛋白形成中的可用性[71-72]。 7 防治肝纤维化 肝脏纤维化是一种损伤愈合反应，各种原因造成的肝损伤均可以导致肝纤维化的启动，肝损伤造成的肝细胞坏死、凋亡、炎症细胞浸润和细胞外基质的改变会刺激肝纤维化的形成。肝纤维化进一步会发展为肝硬化甚至肝癌，严重影响人类的健康[73]，由于肝纤维化早期是可逆的，而肝硬化是不可逆的，抑制或逆转肝纤维化是治疗慢性肝病的重要手段之一，因此肝纤维化的防治是国内外研究的热点问题。黄酮类化合物广泛存在于多种植物中，临床应用的多种治疗肝纤维化中药均含有黄酮类成分[74]。红芪黄酮类化合物通过抑制肝纤维化细胞的增殖、活化和转移及胶原纤维增生等来防止肝纤维化。 7.1 抑制细胞增殖、活化和迁移 张蒙蒙[75]研究表明毛蕊异黄酮80 mg/kg可显著抑制四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化，其机制可能是毛蕊异黄酮通过提高Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）和STAT3蛋白表达，激活JAK2/STAT3通路。邓坦[76]研究结果表明，毛蕊异黄酮200 μmol/L对TGF-β1诱导的肝纤维化细胞增殖、活化和迁移具有抑制作用，该作用可能与毛蕊异黄酮结合并下调细胞内雌激素受体β5（estrogen receptor β5，ERβ5）有关。另外槲皮素8～128 μmol/L在0～72 h对肝星状细胞的增殖有明显的抑制作用，并促进其凋亡，可能与调节Wnt/β-catenin信号通路，而达到抗肝纤维化的作用[77]。 7.2 抑制胶原纤维增生 槲皮素15 mg/kg可通过降低β-连环蛋白（β-catenin）和Wnt蛋白表达量，抑制Wnt/β-catenin信号通路，阻止肝纤维化的进展且具有肝保护作用[78]。此外槲皮素50 mg/kg还可通过降低神经源性基因Notch同源蛋白1（neurogenic locus notch homolog protein 1，Notch1）表达来影响Notch1通路，进而抑制M1极化，达到抗炎、抗肝纤维化的作用[79]，柚皮苷15、30 mg/kg均可通过降低丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）和HYP含量，抑制胶原增生进而抗肝纤维化显著降低四氯化碳诱导的肝脏系数升高，抑制胶原增生进而抗肝纤维化[80]。见图6。 图片 8 其他 红芪黄酮类化合物除具有抗氧化、改善肺纤维化、抗肿瘤、抗骨质疏松、降低骨骼肌损伤等药理作用外，还具有抗炎降血糖抑制肾纤维化等作用。姚艺等[81]研究发现芒柄花苷50 mg/kg可显著降低糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）大鼠血清血尿素氮、血肌酐和血糖水平，同时，肾小球内炎症和纤维化程度也有不同程度的改善，说明芒柄花苷可明显改善糖尿病大鼠肾功能。其机制可能是通过腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate- activated protein kinase，AMPK）/沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）/叉头盒蛋白O1（fork head box protein O1，FoxO1）促进DN自噬，减轻肾脏损伤。此外，芒柄花苷可显著减轻DN大鼠糖代谢异常和肾脏损害，抑制肾纤维化，其机制可能与芒柄花苷激活AMPK和SIRT1表达，抑制FoxO1表达，改善肾脏氧化应激状况，抑制自噬，从而缓解DN的发生发展过程。 9 结语及展望 红芪作为甘肃的道地药材，其品质优良，产量宏丰，并有独特的采收加工方式，且已形成地理标志产物——米仓红芪。红芪主要含有多糖、黄酮、皂苷等多种活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、免疫调节多种药理作用。红芪黄酮类成分是除红芪多糖外主要的活性成分之一。黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中，是植物的次生代谢产物，中药中也广泛存在，并且种类繁多，每个种类又有不同的药理作用。中药红芪中含有多种黄酮类化合物，如异黄酮类成分毛蕊异黄酮和芒柄花素、黄酮醇槲皮素、二氢黄酮柚皮苷等，具有抗氧化、抗肿瘤、改善肺纤维等药理作用，其中毛蕊异黄酮、芒柄花素成分是红芪药材质量评价的重要指标性成分，且对肝癌、胃癌、非小细胞肺癌、宫颈癌等均有显著治疗作用。 红芪最早列为黄芪项下，后因发展需要将红芪单独列出。红芪与黄芪具有相似的活性成分及功效，但多项研究表明，红芪黄酮类成分在抗氧化和改善肺纤维方面疗效优于黄芪，目前对于红芪的研究多集中在化学成分提取分离等基础研究上，对于红芪黄酮类成分药理作用及作用机制的研究较少。红芪作为具有升阳举陷、固表止汗、利水消肿等多重功效的中药，其在临床应用及新药研发上缺乏具体研究，故应加强红芪黄酮类活性成分的研究，尤其红芪异黄酮类成分毛蕊异黄酮和芒柄花素在抗肿瘤方面的研究及红芪黄酮类成分在抗氧化和改善肺纤维化方面的优势研究。中药材中化学成分的种类和含量是表征药材质量的重要标志，也是作为临床用药的合理选择，红芪在中医临床及中西药合用方面的研究是当前乃至未来持续关注的前沿领域[82]。因此，应加强红芪药材中黄酮类单体成分药理作用及临床应用的研究，为红芪药材的大规模种植及临床用药提供理论依据。