小鼠肾小球系膜细胞

大神们，帮忙推荐台主要针对小鼠骨髓细胞数检测的仪器，再一个就是能对小鼠血细胞的种类分类，计数。要求不高。。但是这种针对性的仪器还这难找。。

我们准备取大鼠肾皮质观察足细胞计数、足突平均宽度(FPW )及足突融合率、基底膜(GBM)平均厚度，参考资料方法如下(1)3500倍足细胞计数:每例观察3个肾小球,随机取10个视野,计数足细胞数。(2)8000倍FPW:测定裂孔膜水平上足突两侧膜间的距离,取其平均值。(3)8000倍足突融合率:首先量出基底膜总长度,设为X,然后量出基底膜上足突融合的总长度,设为Y,最后以Y /X,即得融合率。(4)8000倍GBM:以1 cm为单位,把基底膜分成若干个点,然后测定每点基底膜的厚度,再把各点基底膜的厚度相加设为X,计算其测定的点数设为Y,最后以X /Y,即得各组基底膜的平均厚度。 我们因为对电镜没有经验，有几个问题麻烦指点： 1、3500倍电镜下观察3个肾小球,随机取10个视野,计数足细胞数，这个方法可行吗？这个方法需要多少张照片？ 2、3500倍下每个视野大概能观测到几个肾小球？ 随机取十个视野怎么计算出每个肾小球足细胞数？ 3、8000倍下可以使用医学统计软件计算出足突平均宽度(FPW )及足突融合率、基底膜(GBM)平均厚度吗？ 多谢各位，急盼回复！

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[em0808]我要做的是小鼠的卵细胞的电镜，但是我所能获得的卵细胞的数量有限的，不知道有什么技巧可以保证细胞能包埋进去，听说有人做了好几次就没有作出来呀 急哦 谢谢大家了

[b][size=15px][color=#595959]金匮肾气丸(JGSQW)[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]是一种传统的中药配方，传统上用于缓解[b]泌尿系统疾病[/b]，如尿频和多尿。临床研究表明，JGSQW与降糖药物联用时具有协同作用，可改善[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]糖尿病[/color][/size][size=15px][color=#595959]肾病(DN)[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]，但其作用机制和作用靶点尚不清楚。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]采用DN [b]db /db小鼠[/b]模型，探讨中药金匮肾气丸的治疗作用及其机制。[/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][align=center] [/align] [size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959]采用超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-质谱联用技术对复方金匮肾气丸的主要活性成分、血药浓度和药动学进行分析。此外，采用db/db小鼠模型研究了JGSQW和[b]二甲双胍[/b]对糖尿病肾病小鼠血糖水平、血脂水平、肾功能和肾脏病理的治疗作用。蛋白质组学分析确定了JGSQW治疗DN的主要靶点。[b]免疫印迹[/b]、免疫组织化学和免疫荧光验证了其作用机制。然后通过分子对接和分子动力学、转染、药物亲和反应靶稳定性(DARTS)实验和细胞热迁移实验(CETSA)进一步验证了靶向结合效果。[/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][font=mp-quote, -apple-system-font, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#595959][/color][/size][/font] [align=center] [/align][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959]JGSQW联合二甲双胍可显著改善DN小鼠的血糖水平、血脂、肾功能和肾脏病理。JGSQW主要通过靶向主要组织相容性复合体II类[b](MHC II类)分子[/b]发挥其对DN的治疗作用。免疫组化结果显示，JGSQW抑制I型胶原、纤维连接蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。免疫荧光和Western blot结果显示，JGSQW抑制MHC II类分子H2-Ab1和H2-Aa的表达，从而抑制CD4+ T细胞浸润，改善糖尿病[b]肾纤维化[/b]。[b]芍药苷与H2-Aa的结合能力[/b]通过分子、DARTS和CETSA检测进行了预测和验证。80 μM芍药苷可有效减轻高糖诱导的MPC-5损伤模型。在此模型浓度下，H2-Aa过表达，Western blotting进一步证实[b]芍药苷通过调节H2-Aa减轻肾小球足细胞纤维化[/b]。[/color][/size][color=#3573b9]结论[/color][size=15px][color=#595959][/color][/size] [b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][size=15px][color=#595959][font=&][/font][/color][/size][b][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][size=15px][color=#595959][/color][/size][b][size=15px][color=#595959]JGSQW联合二甲双胍可能通过下调免疫复合物MHC II类分子，减弱MHC II类对CD4的抗原递呈作用，具有协同缓解糖尿病肾病肾纤维化的作用。[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][font=&][/font][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size]

原文是Purton, L.E., and Scadden, D.T. (2007). Limiting Factors in Murine Hematopoietic Stem Cell Assays. Cell Stem Cell 1, 263-270.发表在2007年cell stem cell 杂志上，最近由于要进行相应的课题研究，拿来精读了一番，做了一个笔记，发上来和大家分享，由于初涉小鼠造血干细胞这个领域，肯定有很多地方理解不全和错误，请大家指正。下面是我的精读笔记：小鼠造血干细胞研究方法综述一．关于HSC 免疫表型1. Thy1.1lo,Lin-Sca-1+Cells:其缺点是Thy1.1只表达于C57BL/Ka-Thy1.1小鼠，不表达于常用的C57BL/6小鼠；2. Lin- c-Kit+ Sca-1+ Cells（LSK）：异质性，含有祖细胞，HSC含量不超过10%；结合CD34和Flt3可以分为long-term repopulating HSCs (LKS+ CD34- Flt3-) ，short-term repopulating HSCs (LKS+ CD34+ Flt3-) ，以及multipotent progenitors(LKS+ CD34+ Flt3+)；3.荧光染料标记HSC: Rhodamine 123, Hoescht 33342, 以及Side Population，Rhodamine 123为线粒体染料，Hoescht 33342为DNA染料，HSC能够更多地将这两种染料泵出细胞外，所以染色较浅；4. SLAM Family Members：SLAM antigens (CD150+ CD244-CD48- cells)，其优点是不像Thy1.1和Sca-1其表达受到品系和发育阶段等的影响，在更多的种系的小鼠中适用二．克隆形成实验：主要反映的是祖细胞的造血能力，不反映HSC，检测T系和B系需要另外特定的培养条件；三．Cobblestone Area-Forming Cells/Long-Term Culture-Initiating Cells，鹅卵石样区域形成细胞实验/长期培养-启动细胞实验：体外检测更早期造血干/祖细胞的方法，但由于feeder layers和培养条件不同，实验结果在不同实验室间稳定性较差，对于其是否真正能检测造血干细胞也比较有争议，不过在一些情况下，比如归巢（homing）或植入（engraftment）有缺陷导致体内造血重建实验无法进行时，这两个方法是较好的替代方法；四．Colony-forming unit-spleen (CFU-S)脾集落单位形成实验：属于短期（1-3周）体内重建实验，检测的干祖细胞比体外CFC早，但比HSC晚；五．long-term repopulating assays，长期重建实验，包括：1. competitive repopulation assay：竞争重建实验：属于定性或者半定量研究HSC重建能力的方法，不能区别是HSC的数量还是质量造成的结果差异，得到的结果为RU即重建单位；2. limiting dilution assay：统计的指标是造血重建失败的小鼠数目，采用泊松分布来计算HSC的频率，得到的结果为CRU即竞争重建单位；Stem Cell公司的免费软件L-Calc,可用于分析实验结果。limiting dilution assay有两种方法：1CRU assay，采用最小数的HSC作为竞争细胞，可以在单细胞水平检测HSC；2也称为CRU assay，采用标准的，足量的HSC作为竞争细胞，不能在单细胞水平检测HSC；3serial transplant assay，多代移植，最为严格的检测造血干细胞的方法；六：Limiting Dilution Assays需要考虑的几个重要因素：1.竞争细胞：1compromised bone marrow，即连续两代重建成功的骨髓细胞，比较耗时2W41/W41受体小鼠：c-kit基因发生突变，具有更加敏感的宿主微环境，能够检测更少的植入的HSC，不需要另外的HSC作为支持细胞（竞争细胞）；3全骨髓细胞（whole bone marrow cells）：经验表明2 X105 competing bone marrow cells比较适合2.受测细胞（Test Cells, Unknown HSC Potential）：有人用LKS+ CD34- cells，但作者认为全骨髓细胞最好，原因是这种方法是在功能上评价HSC，避免了HSC在基因修饰的小鼠中免疫表型发生变化导致的结果的不可靠，在作者实验室通常采用的受测全骨髓细胞数为8 X 103到2 X106；3.重建失败的标准：现在一般认为受测细胞的重建比例小于1%为重建失败；在重建比例中，红细胞是不计算在内的，因为其不表达CD45,但一般认为只要其他系重建成功，红系应该也会重建成功；4.分析重建的时间点：看长期造血重建，最少要16周，最佳是六个月；5.其他考虑因素：归巢，HSC各系分化阻滞或减弱，祖细胞增殖动力学特性的改变，造血微环境对HSC的影响等等七．区分供体，受体的遗传学标志：最常用的是CD45.1,CD45.2系统，还有可以通过性别（Y染色体）来区分。

食品安全国家标准 小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验

最新发现与创新 新华社广州1月8日电（记者肖思思）中山大学附属第一医院8日发布IgA肾病重要研究成果——对亚洲受试者的研究中发现了IgA肾病新的易感基因。 中山大学附属第一医院肾内科余学清教授带领科研团队联合国内二十多家医院和研究机构，并与新加坡专家合作，完成了基于汉族人群IgA肾病全基因组易感基因筛查研究。 余学清介绍，IgA肾病是全球最常见的原发性肾小球疾病，在亚太地区占原发性肾小球疾病的比例高达40%—50%。该病是以IgA或IgA为主的免疫球蛋白在肾小球沉积，肾小球系膜细胞增生和细胞外基质积聚为主要特征。根据目前的资料，有15%—40%的患者最终发展至终末期肾脏病（尿毒症）。研究发现，IgA肾病存在明显的家族聚集倾向，被列入多基因遗传病范畴。IgA肾病发病隐匿，早期诊断和治疗对延缓肾功能恶化具有重要意义。 余学清介绍，这次研究是迄今为止最大样本的亚洲全基因组关联分析研究，包括1万多名受试者（4137例IgA肾病患者与7734例健康人群），利用先进的遗传学分析方法和策略，在全基因组水平进行研究。 “研究人员既验证了欧美学者的部分研究结果，更为重要的是首次发现了中国人群中IgA肾病独有的两个新的易感基因位点——17号染色体和8号染色体，证明了遗传因素在IgA肾病的发病机制中起重要作用，并能够影响IgA肾病的发病过程及临床表现。”他说，由于遗传基因的差异，IgA肾病的临床表现差异很大，有慢性肾脏病历史的家族中的后代和一级亲属的发病率，要高于没有该病历史的家族。 《科技日报》（2012-1-9 一版）

[b][size=15px][color=#595959]丹参酮IIA[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959] (TIIA)[/color][/size][size=15px][color=#595959]是中药丹参的主要脂溶性活性成分，具有延缓[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]动脉粥样硬化[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959](AS)[/color][/size][size=15px][color=#595959]的作用。[/color][/size][size=15px][color=#595959]TIIA还可以通过发挥抗炎和抗氧化作用来治疗帕金森病等神经系统疾病。[/color][/size][size=15px][color=#595959]然而，目前尚不清楚TIIA是否[/color][/size][size=15px][color=#595959]可以通过调节[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]胞葬作用(e[/color][/size][size=15px][color=#595959]fferocytosis)[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]从而改善动脉粥样硬化。[/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959]该研究旨在[b]确定TIIA是否可以通过增强胞葬作用来减少脂质积累和治疗AS[/b]。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]首先，对LDLR敲除(LDLR-/-)小鼠进行为期24周的体内实验，分别采用组织病理学染色、[/color][/size][size=15px][color=#595959]免疫[/color][/size][size=15px][color=#595959]荧光和Western blot实验从疗效和机制两部分进行验证；此外，利用细胞在体外再次验证。具体实验设计方案如下：在体内，以西方饮食（高脂肪饮食）喂养12周的LDLR-/-小鼠为AS模型，以正常饮食喂养的LDLR-/-小鼠为空白对照组。TIIA组和阳性对照组(阿托伐他汀，ATO)分别通过腹腔注射(15 mg/kg/d)和灌胃(1.3 mg/kg/d)干预12周。体外分别用ox-LDL (50 ug/mL)或ox-LDL (50 ug/mL) + TIIA (20 uM/L或40 uM/L)培养RAW264.7细胞。[/color][/size] [size=15px][color=#595959]采用Masson染色和油红O染色分别评价[/color][/size][size=15px][color=#595959]主动脉[/color][/size][size=15px][color=#595959]斑块和RAW264.7细胞泡沫细胞形成的病理变化。采用生化方法检测小鼠血脂水平。采用免疫荧光法检测斑块中凋亡细胞和胞葬作用相关信号的表达。采用RT-q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]和Western blot方法观察小鼠主动脉和RAW264.7细胞中胞葬作用相关分子的变化趋势。还使用中性红法评估RAW264.7细胞的吞噬能力。[/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959]与模型组比较，TIIA降低了血清TC、TG、LDL-C水平(p 0.01)，减少了小鼠主动脉富含脂质斑块的相对管腔面积(p 0.01)，增强了小鼠主动脉斑块的稳定性(p 0.01)，减少了ox-LDL诱导的RAW264.7细胞脂质堆积(p 0.01)，上调了ox-LDL诱导的RAW264.7细胞的胞葬作用相关分子表达，提高了胞葬作用率。[/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959]TIIA可能[b]通过增强巨噬细胞的胞葬作用功能来减少脂质积累[/b]，从而治疗AS。继续深入研究TIIA使巨噬细胞在AS中保持[b]强吞噬和[/b][/color][/size][b][size=15px][color=#595959]消化[/color][/size][size=15px][color=#595959]吸收[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]的具体机制，可能会推动TIIA作为巨噬细胞胞浆作用的靶向治疗剂的进展。[/color][/size]

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）最常见且严重的微血管病变之一，常伴有肾小球硬化和肾小管间质纤维化，最终可发展为终末期肾脏病（ESRD），严重危及生命。西医治疗DN主要以降糖、降压、调脂、抗感染为主，但这些手段仍难以阻止炎症反应与肾纤维化的发生，且存在一定的局限性及不良反应，因此，探寻行之有效的DN防治策略，提高治疗水平迫在眉睫［1-3］。中医药根据辨证分型对DN进行治疗已有上千年的历史，对其记载可追溯至《黄帝内经》之“消瘅”及“消渴病”继发的“虚劳、水肿、尿浊、关格、肾劳”等，可通过调节代谢、自噬、抗氧化、抗炎、抗纤维化等机制，对DN进行多靶点调控治疗。在改善DN客观指标、保护肾功能及远期疗效方面，中医药都显示出了独特的优势［4-5］。 黄芪六一汤始载于《太平惠民和剂局方》，由黄芪60 g、甘草10 g组成，具有大补肺气、滋益肾水、调和脾胃的功效［6］。课题组前期发现［7-11］，由黄芪六一汤提取、分离出来的黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖、甘草酸所组成的黄芪六一汤组分（简称“HQD”）具有防治DN、显著改善肾功能的作用。并鉴定出HQD中6个主要原型入血成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、甘草酸）。然而，HQD作为中药复杂化学成分的混合体，其在体内发挥抗DN药效的分子作用机制尚不完全明确，制约了其深层次开发利用。 网络药理学能高效整合中药、成分和靶点之间关系，构建中药-成分-靶点网络，诠释药物与疾病之间的复杂关系，为中药及其复方作用机制研究提供了行之有效的新方法［12-13］。故本实验首先采用网络药理学技术对HQD抗DN的机制进行探索，发现HQD发挥药理作用可能与细胞自噬缺陷有关。据报道［14-15］，自噬缺陷可导致肾小管上皮细胞的损伤，而激活自噬能够减轻这一损伤从而保护肾功能。根据药效学及网络药理学实验结果，推测HQD发挥抗糖尿病肾病的作用机制可能和肾小管上皮细胞自噬水平失调有关，为验证推测结果，本研究从细胞自噬角度出发，采用DN大鼠模型对筛选出的核心通路进行验证，以期为黄芪六一汤及中药复方的分子作用机制研究及深层次开发提供创新思路与借鉴。 1　材料 1.1　仪器 EnVision酶标仪（PerkinElmer）；H1-16KR台式高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；Rayto全自动生化分析仪（Chemray 800）；Tissuelyser-24L多样品组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；三诺血糖仪（长沙三诺生物传感技术有限公司）；Multiskan FC酶标仪（Thermo Scientific）；免染蛋白印迹系统（ChemiDooTM）、蛋白快速转印仪（Trans-Blot Turbo）、胶凝成像系统（GBOXChemiXL1.4）均购自美国Bio-rad公司；电泳仪（PowerPacBasic）、核酸蛋白紫外检测仪（Biomate 3S）、垂直电泳槽，均购自美国Thermo公司；纯水超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；透射电子显微镜（日本电子JEOL）生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；台式高速微量离心机（大龙兴创实验仪器北京股份）；超薄切片机（LEICA）；组织脱水机（LEICA）。 1.2　试药 黄芪（批号220604、211104、220901，四川盛世锦荣药业有限公司）、甘草（批号201024、200306、220805，四川盛世锦荣药业有限公司），黄芪、甘草经贵州中医药大学谢军丽讲师鉴定分别为豆科植物膜荚黄芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.干燥根和根茎。细胞凋亡检测试剂盒（货号E-CK-A322，Elabscience），DAPI（货号C1002，上海碧云天生物技术有限公司），抗荧光淬灭封片剂（货号0100-01，southernbiotech），苏木素（货号H9627，Sigma）；二甲苯（货号10023418）、包埋石蜡（货号69019361）、伊红Y（水溶性，货号71014544）、中性树胶（货号10004160）均购于中国医药集团有限公司；肌酐（Scr，货号C074-d）、尿素氮（BUN，货号C010-a）、总胆固醇（TC，货号C048-a）、三酰甘油（TG，货号C019-a）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C，货号C047-a）检测试剂盒均购于长春汇力生物科技有限公司；尿蛋白测试试剂盒（货号C035-2，南京建成生物工程研究所），RIPA裂解液、PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒、1xTBST 缓冲液、5x蛋白上样缓冲液、β-actin 兔多克隆抗体（货号AC230205001）均购于武汉塞维尔生物科技有限公司；mTOR（货号66888-1-lg）、Beclin 1（货号66665-1-lg）、p-mTOR（货号66882-1-lg）、HRP标记的羊抗鼠 IgG（货号SA00001-2）、HRP标记的羊抗兔 IgG（货号20000373）鼠单克隆抗体均购于武汉Proteintech有限公司；LC3α/β（货号R10241506）、PI3K（货号N09263380）、Akt（货号M04201652）兔多克隆抗体购于沈阳万类生物科技有限公司，链脲佐菌素（STZ，索莱宝生物有限公司，批号2230520002）。 根据本课题组前期确定的HQD制备工艺［10］，按照原处方黄芪与甘草6∶1比例，取符合药典标准的黄芪饮片12 kg和甘草饮片2 kg，制备得质量分数为72.04%的黄芪总皂苷干浸膏76.02 g（含黄芪甲苷2.69%）；质量分数为70.03 %的黄芪总黄酮干浸膏31.64 g（含毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.72%、毛蕊异黄酮1.52%、芒柄花苷0.94%、芒柄花素0.31%）；质量分数为67.12%的黄芪总多糖干浸膏185.04 g，质量分数为80.05%的甘草酸精制品22.01 g。将上述制备所得黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖干浸膏与甘草酸精制品全部混合均匀，即得本实验所需HQD样品。 1.3　实验动物 SPF级雄性SD大鼠35只，体质量（300.00±10.82）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（湘）2022-0011，饲养于通风良好，室温18～25 ℃，相对湿度50%～70%，按常规定期消毒的动物房。按每笼4只分装，由专人饲养管理，自由饮水及饲料，实验操作和处理严格遵循国际准则。 2　方法 2.1　HQD抗DN的药效实验 2.1.1 　DN模型大鼠的制备 大鼠适应性喂养1周后，选取8只作为对照组，对照组大鼠喂食普通饲料。其余大鼠高糖高脂饲料喂养2周，尾iv STZ（溶于pH 4.5，0.01 molL-1无菌柠檬酸钠缓冲液）33 mgkg-1，注射4周后测定空腹血糖（FBG）及24 h尿蛋白（24 h U-Alb）含量，以FBG≥11.1 mmolL-1［16-17］，肾组织出现病变为造模成功。其中，24只大鼠造模成功，3只血糖低于11.1 mmolL-1，无死亡大鼠。 2.1.2　分组及给药 将造模成功大鼠随机分为模型组，HQD高、低剂量给药组，每组8只。以黄芪六一汤临床生药用量（黄芪60 g、甘草10 g）的4倍、1倍剂量，换算本实验的HQD高剂量（0.66 gkg-1）与低剂量（0.17 gkg-1）。按照给药剂量，每日固定时间ig 1次，对照组与模型组ig等量的0.9%氯化钠溶液，连续给药8周。 2.1.3　各组大鼠相关生化指标检测 实验期间观察各组大鼠活动情况、精神状态、毛色、进食、饮水量及排泄量状况等。末次给药后，代谢笼收集24 h尿液并记录尿量（禁食不禁水），1 400 rmin-1离心5 min，收集上清。尾静脉采血测FBG，于腹主动脉取血，4 ℃下3 000 rmin-1离心15 min，收集上清。取血后断颈处死各组大鼠，取肾脏，除去被膜，部分肾组织用于病理学、细胞凋亡等检测，其余组织于-20 ℃保存备用。采用全自动生化分析仪，检测血清Scr、BUN、TG、TC、LDL-C水平。按照尿蛋白定量测试盒说明书操作测定尿总蛋白。 2.1.4　肾脏组织病理学观察 取上述部分肾脏置于4%多聚甲醛中固定，蒸馏水冲洗，将组织包裹在石蜡块中，组织脱水，浸蜡、包埋、切片、烤片、切片脱蜡，HE染色、Masson染色，封片，光镜下观察肾脏组织病理学改变。 2.1.5　TUNEL检测细胞凋亡情况 取肾组织石蜡切片进行脱蜡、水化，以蛋白酶K工作液在25℃下消化组织15 min，PBS漂洗，按照说明书对切片进行TUNEL染色，荧光显微镜下观察采集图像，计算细胞凋亡率。 2.1.6　数据统计分析 所有数据以±s表示，统计分析采用SPSS 27单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 2.2　网络药理学研究 2.2.1　活性成分靶点预测 以HQD中6个主要原型入血成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、甘草酸）为研究对象。采用PubChem数据库 （https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载活性成分的SDF格式，将其导入SwissTargetPrediction 数据库（http：//swisstargetprediction.ch/）进行活性成分的靶点预测。剔除重复靶点，获取与6个活性成分相关的靶点。通过UniProt数据库 （https：//www.uniprot.org/）将得到的活性成分靶点蛋白名称进行标准化。 2.2.2　DN的靶点预测 通过GeneCard（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（https：//www. disgenet.org/）和OMIM（https：//omim.org/）数据库以“Diabetic nephropathy”为关键词进行检索，剔除重复得到疾病靶点，并用Venny工具将6个活性成分的作用靶点与DN靶点进行交集比对，得到其共同作用的靶点作为6个活性成分治疗DN的潜在靶点。 2.2.3　蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 为了进一步明确HQD治疗DN预测靶点之间的直接或间接调控关系，将潜在靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/）中构建PPI网络，限定物种为“Homo sapiens”，为了具有高置信度，设置minimum required interaction score≥0.9，并隐藏游离蛋白，以TSV格式保存结果，将其导入可视化的Cytoscape 3.6.0软件进行拓扑分析，筛选得到核心靶点。 2.2.4　基因本体（GO）注释及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将交集靶点导入Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html），进行GO功能富集分析；将交集靶点导入KOBAS 3.0数据库（http：//kobas.cbi. pku.edu. cn/ kobas3/genelist/），进行KEGG通路富集分析。下载分析结果，将其分别按P值和“Count”（每条通路中含有的潜在基因靶点的数量）值的大小进行排序。 2.3　实验验证网络药理学预测结果 2.3.1　透射电镜观察肾小管上皮细胞中自噬体及自噬溶酶体的形成 取“2.1.3项”下对照组、模型组、HQD高剂量给药组大鼠部分肾组织约1 cm3，经3%戊二醛预固定24 h左右，1%四氧化锇再固定2 h；依次加入30%、50%、70%、80%、95%、100%的丙酮溶液进行逐级脱水，每次20 min；脱水后，采用丙酮和Epon812包埋剂对其进行渗透和包埋；采用超薄切片机制备60～90 nm的超薄切片；并以醋酸铀避光染色10～15 min，再用柠檬酸铅避二氧化碳染色1～10 min，超纯水清洗3次，滤纸吸干、室温干燥过夜后，采用JEM-1400FLASH透射电镜对各组肾组织中的肾小管上皮细胞外形及其中的自噬体及自噬溶酶体进行观察。 2.3.2 Western blotting检测肾脏组织中自噬相关蛋白及磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信号通路关键蛋白的表达 随机从对照组、模型组、HQD高剂量给药组选取3只大鼠的肾组织，加入含蛋白酶和磷酸化酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上匀浆，裂解1 h后，12 000 rmin-1离心10 min，收集上清液；BCA法测定总蛋白浓度。每孔以20 μg蛋白上样，100 V电泳，100 V湿转；5%的脱脂牛奶封闭2 h，加入Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，显色曝光。扫描胶片，分析胶片灰度值。考察HQD对肾组织中Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、PI3K、Akt、mTOR及p-mTOR蛋白表达的影响。 3　结果 3.1　HQD抗DN的药效实验 3.1.1　各组大鼠相关生化指标检测 结果见图1。对照组大鼠精神状态良好，饮食、饮水与大小便正常，皮毛有光泽，体质量逐渐增加。模型组大鼠呈明显的多饮、多尿、多食、体质量下降等糖尿病“三多一少”症状，后期出现不同程度的体毛暗淡、稀疏、精神萎靡，反应迟钝症状。与对照组比较，模型组大鼠FBG、Scr、BUN、TG、TC、LDL-C、24 h U-Alb显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，HQD高剂量组均能显著降低上述药效指标（P＜0.05、0.01）；低剂量组FBG、Scr、BUN、TG、24 h U-Alb显著降低（P＜0.05、0.01）。 3.1.2　肾脏组织病理学观察 HE染色结果显示，细胞核呈蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。对照组肾小球结构清晰，肾小球系膜区未见明显改变。模型组大鼠肾小球系膜基质增宽、增多，基底膜弥漫增厚，肾小囊腔狭窄，肾小球体积增大。HQD给药组大鼠肾小球系膜轻度增生，肾组织损伤情况较模型组明显减轻，见图2。 Masson染色结果显示，胶原纤维、黏液、软骨呈蓝色，肌肉、胞浆、纤维素、红细胞呈红色，胞核呈蓝黑色。主要用于区分肌纤维和胶原纤维。与模型组相比，HQD给药组大鼠的肾纤维化程度较轻，见图3。 3.1.3　TUNEL检测细胞凋亡情况 荧光显微镜下组织切片上凋亡的细胞呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。每个样品选取3个高倍视野（400倍），每个高倍视野计数各视野总细胞数，同时计数各视野的凋亡阳性细胞。结果见图4。与对照组比较，模型组细胞凋亡率明显上升（P＜0.01）；而HQD高、低剂量组细胞凋亡率显著下降（P＜0.05）。 3.2　网络药理学研究 3.2.1　潜在靶点 通过检索SwissTargetPrediction得到各个活性成分所对应的靶点基因共600个，去掉重复的244个，剩余356个靶点。通过GeneCard、DisGeNET和OMIM 数据库共获得1 480个与DN相关的靶点，通过制作韦恩图分析，得到114个药物-疾病共同靶点作为活性成分治疗DN的潜在靶点，见图5。 3.2.2　潜在靶点的PPI网络分析 为了获得有关潜在靶点交互作用的信息，将114个潜在靶点上传到STRING平台，进行PPI网络分析，结果见图6。并将结果的TSV文件导入Cytoscape 3.6.0 进行可视化和拓扑分析，PPI网络包括102个节点和451条边，选择“度”（degree）、“介数中心性”（betweenness centrality）和“接近中心性”（closeness centrality）高于中位数的靶点作为关键目标，首次筛选值为degree＞6，betweenness centrality＞0.003 836 8，closeness centrality＞0.413 800 8，筛选后，获得了一个包含41个节点和258条边的新网络；随后筛选值为degree＞10，betweenness centrality＞0.007 837 44，closeness centrality＞0.571 428 57，获得包含19个节点和107条边的中心网络；为了在PPI网络中找到最关键的目标，最后一次筛选值为degree＞11，betweenness cenTrality＞0.014 000 41，closeness centrality＞0.72，筛选获得STAT3、EGFR、VEGFA、JUN、TNF、AKT1、CASP3、mTOR及IL2作为PPI网络中的核心靶点，见图7。其中，mTOR是调节自噬的关键激酶，抑制mTOR可促进自噬。 3.2.3　GO分析和KEGG分析 将114个交集靶点导入Metascape平台进行GO富集分析，共获得 1 581条结果，包含1 388条生物过程（BP）结果，122条分子功能（MF）结果，71条细胞组成（CC）结果，分别选取显著丰富的前15个结果进行可视化处理，见图8。BP主要对激素的反应、MAPK级联调节、细胞对氮化合物的反应、细胞对有机氮化合物的反应和蛋白质磷酸化的正调控等；CC主要涉及膜筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）、细胞外基质（extracellular matrix）、膜面（side of membrane）和囊泡腔（vesicle lumen）等；MF主要涉及激酶结合（kinase binding）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）、激酶活性（kinase activity）、内肽酶活性（endopeptidase activity）和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）等。表明HQD治疗DN的机制涉及多种生物学过程，体现多重治疗作用。 使用KOBAS3.0共检索到235条富集通路，选取P＜0.001的结果，获得147条显著富集通路，并按“Count” 值由高到低排列，选取前20条通路作为核心通路进行展示，见图9。显示6个成分治疗DN的靶点主要涉及癌症通路、癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等信号通路，其中PI3K-Akt信号通路、MAPK通路均与自噬调控相关。与上述“3.2.2 ”项下PPI网络分析得出的“HQD核心作用靶点”进行联合分析后，选择对自噬经典通路PI3K/Akt/mTOR进行验证。 3.3　实验验证 3.3.1　透射电镜观察肾小管上皮细胞中自噬体及自噬溶酶体的形成 结果见图10。检测自噬的金标准是电镜下可观察到结构完整的自噬体及自噬溶媒体。采用透射电镜观察对照组、模型组、HQD高剂量组大鼠肾小管上皮细胞中自噬体及自噬溶酶体的数量。结果显示，对照组肾小管上皮细胞形态结构较正常；细胞核呈椭圆形或类圆形，核仁明显；线粒体呈圆形、椭圆形或长梭形，嵴排列较紧密，胞浆中可见大量溶酶体、自噬溶酶体和空泡。模型组肾小管上皮细胞形态结构出现明显异常。细胞核呈类圆形或椭圆形，核仁明显；线粒体发生肿胀，仅可见少量残留嵴结构，基质颗粒大量丢失；胞浆中自噬溶酶体数量较对照组明显降低。HQD高剂量组肾小管上皮细胞形态结构轻度异常。细胞核呈类椭圆形或类圆形，核仁明显；部分线粒体轻度肿胀，嵴溶解断裂，基质颗粒减少；胞浆中自噬溶酶体及自噬小体数量较模型组有所增加，溶酶体与自噬小体融合较好。 3.3.2　Western blotting检测肾脏组织中自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ及PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白的表达 结果见图11。与对照组比，模型组PI3K、Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平显著升高；Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比，HQD高剂量给药组PI3K、Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平显著降低；Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。 4　讨论 自噬是真核细胞的一种自我保护机制，也是细胞内蛋白质降解的主要途径之一。自噬活性正常时，细胞能够及时降解自噬小体内包裹的受损细胞器、侵入的病原体及衰老的蛋白质等，以维持细胞稳态、能量生成及细胞器的更新［19-20］。研究表明［21-23］，DN发生时，肾脏存在显著的自噬失调。自噬缺陷可导致肾小管上皮细胞的损伤，激活自噬能够减轻这一损伤从而保护肾功能。恢复自噬活性可能成为保护肾脏免受高糖损伤的一种新的治疗选择，有望成为防治DN的新靶点。 课题组前期已鉴定出HQD中6个主要原型入血成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、甘草酸）。文献报道［24-28］，黄芪甲苷可通过激活AMPK/eNOS信号通路，改善大鼠糖尿病肾损伤；毛蕊异黄酮葡萄糖苷具有保护血管内皮细胞的作用，能延缓DN患者的血管病变；毛蕊异黄酮能通过调节NF-κB/p65/NLRP3/TXNIP炎症小体信号通路延缓DN的发展；芒柄花素可通过调节Sirt1/PGC-1α通路减轻DN大鼠的肾小管及线粒体损伤；芒柄花苷能通过降低氧化应激和炎症标志物减轻链脲佐菌素诱导的DN大鼠模型的肾损伤；甘草酸能通过调节SNARK/AMPK信号通路保护高糖诱导的肾小球足细胞损伤。然而， HQD在体内发挥抗DN药效作用的分子机制尚不完全明确，限制了其深层次研究。网络药理学能基于中药多靶点效应，从生物信息学上整体分析在HQD治疗DN上所涉及的靶点及信号通路。故本实验以HQD中6个主要原型入血成分为研究对象，采用网络药理学方法对HQD作用靶点及信号通路进行预测，并将114个潜在靶点进行了PPI分析，发现HQD可能主要作用于STAT3、EGFR、VEGFA、JUN、TNF、AKT1、CASP3、mTOR及IL2等核心靶点。其中，mTOR是调控自噬的重要因子。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白酶，是磷脂酰肌醇3激酶的相关激酶（PIKK），mTOR复合体是调节细胞自噬的关键分子之一，可作为多条信号通路的中间环节参与细胞自噬调节过程，并影响自噬标志性蛋白LC3的表达。mTOR可与其他调控蛋白相互作用至少形成两个不同的复合物，分别是mTOR复合物1（mTORC1）和复合物2（mTORC2）。虽然这两个复合物含有相同的催化亚基——TOR，但均可磷酸化不同的下游靶点，从而显示出不同的细胞功能。抑制mTOR可促进自噬，响胰岛素抵抗和炎性反应［29-30］。因此，调控mTOR不同的上游信号通路可能是治疗DN的一个新思路。 KEGG通路功能富集分析显示，HQD可能通过作用于癌症通路、癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、MAPK等信号通路发挥药理作用。其中PI3K/Akt/mTOR通路为自噬调控的经典通路，通路活化后可激活mTORC1抑制细胞自噬过程［31］。据报道［32］，Beclin-1、LC3蛋白参与自噬小体的形成与自噬溶酶体降解过程，是经典的自噬标志物。自噬小体的减少会导致Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平降低，而激活Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ表达可诱导细胞发生自噬。故本项目选择对经典自噬调控通路PI3K/Akt/mTOR进行验证，并进一步考察HQD对自噬标志蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的调节作用。Western blotting结果表明，HQD可以上调肾组织自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达，抑制PI3K/Akt通路活化，抑制mTOR的激活；透射电镜观察显示，HQD可以增加肾小管上皮细胞自噬体及自噬溶酶体数量。研究结

【序号】：3【作者】：朱琳邹德庆范作卿【题名】：蚕蛹羧甲基壳聚糖对小鼠成纤维细胞增殖与生长的影响【期刊】：蚕业科学. 【年、卷、期、起止页码】：2017,43(03)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iAEhECQAQ9aTiC5BjCgn0RurLuDBf62EN5lCHC3tB7EA_NCYlyZxEZRugsuO02raR&uniplatform=NZKPT

各国争相发展的重点项目　　iPS技术，即诱导性多能干细胞技术，是一种将成体成熟、分化的体细胞重编程获得类似胚胎干细胞的新兴技术。2007年11月美国和日本科学家分别独立宣布可将人类皮肤细胞转化为iPS细胞。这一发现被《自然》和《科学》杂志分别评为2007年第一和第二大科学进展。之后，iPS细胞研究迅猛发展，不同的国家和实验室纷纷报道了多种方法建立的iPS细胞系。就连世界第一只体细胞克隆动物多利羊的培育者伊恩·威尔莫特也宣布放弃人类胚胎干细胞克隆研究，转而进行 iPS 细胞研究，因为他认为这种细胞比胚胎干细胞更具潜在优势。　　我国连续多年将干细胞研究列入“863”、“973”、国家自然基金重点项目。国务院2006年发布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年）》中，干细胞作为五项生物技术之一成为未来15年我国前沿技术的重点研究领域。　　致瘤风险浮出水面　　Yamanaka研究组在《自然·生物技术》上发表的文章显示，用iPS细胞诱导的神经干细胞，即使不含c-Myc（曾被认为是导致肿瘤的主要原因），在植入NOD/SCID免疫缺陷小鼠后仍有很强的致瘤性，甚至高于胚胎干细胞。　　　他们共研究了36个iPS细胞克隆，在诱导方式上，有些诱导剂配方中含有c-Myc基因，有些没有，因此具有较好的代表性。同时他们选择了3株胚胎干细胞作为对照。在45周的观察中，移植胚胎干细胞来源神经干细胞的34只小鼠有4只长出肿瘤。在100只移植胚胎成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中34只发现肿瘤，概率和胚胎干细胞相当。在55只移植成人成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中46只发现肿瘤，概率远高于胚胎干细胞。在36只移植肝细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中10只发现肿瘤，概率高于胚胎干细胞。8只移植胃上皮细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中未发现肿瘤。病理学检查证实肿瘤均为畸胎瘤，部分为恶性畸胎瘤。　　研究还发现，以前认为致瘤性很强的c-Myc在去掉后并没有减少iPS神经干细胞的致瘤性，相反以前认为没有致瘤性的Nanog基因却可以明显增强iPS神经干细胞的致瘤性。　　这次试验的另一个意外结果是并未发现在生成的肿瘤细胞中有c-Myc或其他基因的激活。以前的观点认为，转入的癌基因是iPS致瘤性的基础，只要在iPS细胞诱导成功后通过各种方法去除已完成使命的癌基因即可使iPS细胞免于致瘤性。这次试验的结果无疑给这些想法留下了阴影，而且使iPS致瘤的机制更加扑朔迷离。

1. 利用诱导性多功能干细胞构建出小鼠精子祖细胞日本京都大学研究人员通过体外诱导胚胎干细胞(ESCs)和诱导性多功能干细胞(iPSCs)，形成原始生殖细胞样细胞(primordial germ cell-like cells, PGCLCs)，最后进一步分化，通过体内植入不能生育的小鼠睾丸中，产生了外观正常的精子。将这些精子注射到雌性小鼠的卵细胞中，不久雌性小鼠生出了健康的小鼠后代。2. 鉴定出阿尔茨海默病Alzheimer's disease的生物标记美国研究人员利用一种一般性和无偏差的方法---组合文库筛选(Combinatorial Library Screening)来鉴定出诊断上有用的抗体，而避免进行抗原鉴定。该方法涉及利用非自然的合成分子组合文库对病人血清样品和对照样品进行比较性筛选，这样就可鉴定出病人血清样品中要比和对照样品中保留极其多IgG抗体的分子，随后利用这些分子作为捕获试剂来捕获诊断上有用的抗体。研究人员利用多发性硬化症(multiple sclerosis)小鼠模式动物和证实这种方法的实用性，并利用该方法在阿尔茨海默病小鼠模式动物中鉴定出两种候选的IgG抗体生物标记。3. 发现干细胞多能性的选择性剪接开关加拿大多伦多大学研究人员发现了进化上保守的特异的FOXP1选择性剪接开关,可调控干细胞的多能性。研究人员发现这种剪接开关产生的FOXP1胚胎干细胞特异性异构体，与典型的FOXP1异构体相比，着不同的DNA结合性质。选择性剪接事件改变了FOXP1胚胎干细胞特异性异构体的DNA结合性质，促进维持多能性所需的转录因子基因的表达，包括OCT4、NANOG、NR5A2和GDF3，同时抑制胚胎干细胞分化所需的基因。同时，研究小组还发现FOXP1胚胎干细胞特异性异构体促进体细胞高效重编程为诱导性多功能干细胞(iPSC)。4. 追踪神经胶质瘤的起源美国研究人员利用双标记嵌合分析(Mosaic Analysis with Double Markers，MADM)---该技术的精髓在于用绿色荧光蛋白明确标示突变细胞，还有一个关键特色就是无论一个突变的绿色细胞何时产生，总是同时产生一个正常的红色细胞---来分析神经胶质瘤(glioma)的起源。他们将胶质瘤病人体内发现的两种流行突变p53与NF1导入神经干细胞(neural stem cells, NSCs)中，对源自神经干细胞的所有细胞系所作的进一步分析清楚地显示了少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte precursor cells,OPCs)是该肿瘤的来源细胞，因为任何可见的肿瘤标志可被检出之前，变异的绿色少突胶质前体细胞的数量大大超过了其正常的红色对应物数量，足足超了130倍。为了进一步证实这点，研究人员也将p53与NF1突变直接导入小鼠少突胶质前体细胞，结果发现这些小鼠产生神经胶质瘤，从而再次证实少突胶质前体细胞是神经胶质瘤的来源。5. 发现新的组蛋白修饰方式美国芝加哥大学Ben Mary癌症研究所研究人员在细胞中筛查出了67个新组蛋白修饰标记，并从中发现了一种新型组蛋白翻译后修饰方式---赖氨酸巴豆酰化(lysine crotonylation)修饰。通过进一步的结构及基因组定位分析，研究人员证实氨酸巴豆酰化修饰是一种进化高度保守，且在生物学功能上完全不同于组蛋白赖氨酸乙酰化的蛋白质修饰方式。研究人员还发现在人类体细胞和小鼠精子细胞基因组中，组蛋白赖氨酸巴豆酰化分布于基因活性转录启动区域或增强子上。在减数分裂后的精子细胞中，赖氨酸巴豆酰化高丰度集中在性染色体上，被用来标记睾丸特异性基因。

第四种淋巴细胞—NKT细胞 通常认为，构成机体免疫系统的淋巴细胞有三种细胞系组成，一是由胸腺产生的T细胞，二是由骨髓分化而来的产生抗体的B细胞，三是自然杀伤（NK）细胞。而新近发现存在第四种淋巴细胞—NKT细胞。1. NKT细胞的发现1986年，克隆成功了NKT细胞的特征性抗原受体基因。将其命名为Va14基因，与其他T细胞抗原受体的（TCR）基因不同，有其独特的结构特征。1987年美国国立卫生研究所的Fawlkes与瑞士的Budd分别领导的两个研究小组报告指出，胸腺细胞中的T细胞通常不能表达受体，仅有部分未成熟T细胞选择表达V-β8.2受体。随后的研究证明这种细胞不是T细胞，考虑是NK细胞的受体，这种细胞集团的数量极少，生理意义不明。1994年，这两个研究小组的研究人员发现，他们报道的细胞为同一细胞，从此NKT细胞的研究引起人们的广泛关注。T细胞识别的抗原是蛋白质，而NKT细胞是别的抗原是α-Gal-Cer即所谓的糖脂质，这是该免疫系统与通常的免疫系统重要的不同点。NKT细胞的分化与T细胞不同的是在胸腺形成前的胎生初期6.5日在胸腺外组织分化。NKT细胞与T细胞比较，机能处于不发达状态。T细胞分化为功能不同的Th1和Th2细胞群，Th1细胞产生INFγ及IL-2，引起迟发行过敏症等细胞性炎症。Th2细胞能产生IL-4和IL-10，参与变态反应及抗体产生等体液免疫反应。而NKT细胞不但能分泌Th1和Th2细胞因子，同时还具有与CD8+伤害性T细胞（cytotox-ic Tlymphocyte,CTL）相同的杀伤靶细胞作用。毫无疑问，NKT细胞在免疫调节系统中占有重要位置。NKT细胞与疾病可能有诸多关系，可能与自身免疫性疾病的发病机制、变态反应的调节、抗肿瘤作用、及抑制寄生虫感染等有关。2. NKT细胞的多样性分化NKT细胞具有T细胞和NK细胞细胞两重性质，既能表达Va14/Ja281特定的T细胞受体又能由CD1介导识别脂质抗原。NKT细胞的分化是否依赖胸腺尚有争议。根据其表达TCR等多种表面抗原的不同，提示NKT细胞存在两个以上细胞群。从CD4/8的表达看，可将其分为（1）CD4-NKT细胞，（2）CD8-NKT细胞，（3）CD4和CD8均不能表达的DN-NKT细胞。第一类的全部和第二类的半数是Va14/Ja281-T细胞。3.人类NKT细胞人末梢血中的DN-NKT细胞V区域，可高度表达Va24/JaQ（这与鼠的Va14/Ja281高度相似）及Vβ11(与鼠Vβ18高度相似)。这种TCR的组合表达可见于DN-NKT细胞和CD4+细胞。而未见于CD8+细胞。小鼠的CD1相当于人的CD1d的Va24/JaQ。此外，人末梢血中1～2%的T细胞能表达抑制性受体，即抑制型NK细胞受体（KIR），而Va24/JaQ+细胞则不能表达。它的NK相关分子是CD16、CD56或CD57，Va24/JaQ+细胞异不能表达这些分子。在小鼠中还可以看到Va24/Ja281+T细胞以外的NKT细胞。人类Va24/JaQ+细胞与KIR+T细胞能形成不同的亚群。且具有不同的功能。4. NKT细胞分化的胸腺依赖性这是目前存在争议的问题，可以肯定地说NKT细胞分化过程中胸腺是有作用的。NKT细胞多见于胸腺及脾脏以外的肝脏和骨髓种，胸腺缺损的小鼠与正常小鼠比较，NKT的分化并不少。将出生三日小鼠的胸腺摘除，虽然NKT细胞的分化显著受到抑制，但此时CD8+NKT细胞的分化未受到影响。由此认为CD8+NKT细胞在胸腺外分化的可能。5. NKT细胞产生细胞因子的意义 NKT细胞是指能够表达NKT细胞标志NKT1.1的T细胞,其机能具有T细胞和NKT细胞双重特征。NKT细胞在TCR和NKR介导下，产生大量的IL-4及INFγ,对肿瘤细胞有细胞伤害作用。 NKT细胞能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-P1两种受体，特别是NKT细胞多数表达Va14TCR，识别CD1抗原，而NKR-P1识别各种糖链。 NKT细胞，特别是CD4-NKT细胞，对TCR刺激可产生大量IL-4及IFNγ,同时具有ThO型细胞因子产生能力。NKT细胞不但产生IL-4的主要细胞，而且强力产生IFNγ。IFNγ参与自身Th1诱导，具有极强的Th1诱导能力，从而是IL-2产生亢进。它同时还具有Th2细胞分化抑制功能。IL-12能诱导NKT细胞产生IFNγ。IL-12对TCR的刺激是IFNγ的产生显著亢进。综上所述，NKT细胞不但是IL-4和IFNγ的强力产生细胞，同时参与Th1/Th2分化的抑制，而这些作用都不是单纯的。 虽然NKT细胞能大量产生细胞因子，但仅在机体内保持这种功能。当初一度认为，NKT细胞只是IL-4的产生细胞，而不是Th2分化的必需细胞。并不认为在CD1缺损的小鼠中NKT细胞的分化和对TCR刺激使IL-4产生减少，且对Th2分化必需的IL-4及IgE的产生没有多大影响。但给小鼠投于α-GalCer可使NKT细胞活化，IL-4的产生诱导Th2的应答。有报告指出，同样投于α-GalCer，可使NKT细胞产生IFNγ而致IgE产生低下。由此可见，NKT细胞能产生IL-4与IFNγ两种功能相反的细胞因子。这种微妙的协调作用可能是NKT机能表达的重要特征。NKT细胞的活化通常伴有T细胞、B细胞及NK细胞的活化，这对NKT细胞活化后的免疫应答有较大影响。

新华社东京1月7日电 日本研究人员经临床试验发现，因高血压造成肾功能低下的慢性肾脏病患者，如果连续3年服用降压药令血压恢复到正常值，肾功能也会随着血压的下降得到改善。 慢性肾脏病是绝大多数肾脏疾病的临床统称，诸如肾小球肾炎、肾盂肾炎、膜性肾病、糖尿病肾病、高血压肾病等都可归为慢性肾脏病的范围。慢性肾脏病目前尚无根治方法，病情恶化会发展为肾衰竭，并可能并发心血管疾病。 据日本《每日新闻》日前报道，以京都大学为中心的研究小组，以354所医院的780名患者为对象进行分析研究。这些患者都是坚持服用降压药的高血压患者，并且他们的肾小球滤过率指标和血压记录都较完善。 肾小球滤过率（eGFR）是判断肾功能的重要指标，数值越低表示肾功能越差。正常成年人的这一数值应该在90以上，低于60且超过3个月，就可能存在慢性肾脏病，低于15就可能需要透析。 在试验中，有98名患有慢性肾脏病的患者在服用降压药3年后血压恢复到了正常值，同时他们的肾小球滤过率也从试验开始时的平均52上升到58，表明肾功能得到了改善。 研究人员认为，降压药改善肾功能是因为，血压下降后肾脏过滤体内废物的负担也有所减轻，本次研究的结果有望用于开发预防肾功能恶化的新方法。

名 称：骨髓细胞的提取目的：分离并培养骨髓间充质干细胞原理：先分离出单核细胞然后再通过培养分离出骨髓间充质干细胞内容：步骤一：小鼠骨髓细胞的获取1． 断颈处死小鼠（7-12周，雌雄均可），投入盛有250ml左右的0.1%新洁尔灭或75%酒精中浸泡3-5分钟，拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。2． 用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。将它们放入另外一个消毒托盘中，并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。3． 小心剥离肌肉，分别剪下Femurs and Tibias, 剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。4． 拿两支5ml无菌注射器，每支吸取5ml IMDM(10%FBS, 50/50u/ml Pen/Strep)，换装一个4号针头（又称皮针）或1ml注射器的针头，并用无菌的针头套管将之轻轻拧弯。轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管，将细胞冲出。每根骨用2.5ml IMDM培养液左右即可基本冲下骨髓腔内的细胞。5． 300C下离心，1200转/10分钟，去上清，但留1ml，以便用于在振荡器上悬浮细胞。6． 加进氯化铵溶液（NH4Cl: 8.99g/L, KHCO3: 1g/L, Na4-EDTA: 0.037g/L ，过滤灭菌, 40C储存）裂解红细胞，按1: 9比例，即1ml 细胞悬液，加进9ml氯化铵溶液，混匀，冰上10分钟。 7． 300C离心，1200转/10分钟，去上清。步骤二：淋巴细胞分离液分离小鼠骨髓细胞1． 按步骤二方法采集小鼠骨髓细胞，并破红细胞2． 细胞用4ml培养液悬浮，缓慢留置于8ml淋巴细胞分离液液面上，2000rpm for 20min.3． 小心吸取云雾状底层的基质细胞约1.5ml的体积，置于1个盛有1ml无菌细胞培养用PBS的15ml离心管中，颠倒混匀，1200rpm for 10min, 去上清4． 如果是注射用细胞，则用5ml PBS洗涤细胞2次；5． 离心沉淀下来的细胞用50-200ul PBS，计数细胞，并计算所需细胞体积数铺板培养

中国科技网讯 （记者何屹）据每日科学网站2月20日（北京时间）报道，斯坦福大学的科学家开发出一种系统，可以实时观察活鼠大脑活动情况，对研究诸如阿尔茨海默氏症等神经退行性疾病的新治疗手段具有十分重要的作用。该研究发表在近期出版的《自然·神经科学》杂志上。 研究人员首先利用基因疗法令老鼠神经细胞表达绿色荧光蛋白，该蛋白对钙离子敏感。当神经元受到刺激时，细胞内充满钙离子，荧光蛋白被激活，整个细胞会发出明亮的绿色荧光，就像一朵灿烂的绿色小烟花在黑色背景下绽放。随后，研究人员在老鼠大脑负责空间和情景记忆的海马体上方植入一个微型显微镜，显微镜与相机芯片相连，并可将数字图片传送到电脑，在电脑屏幕上显示老鼠大脑活动的实时视频。 海马体对环境非常敏感，在不同的环境下会有不同的细胞响应。当老鼠在实验环境的某个特定区域挠墙时，刺激特定的神经元闪烁绿色荧光。当小鼠流窜到别的区域时，绿色荧光会从某个神经元褪色，转而刺激新的神经元细胞发光。科学家在掌握了小鼠行为和神经元之间的关联后，仅仅通过小鼠脑部荧光闪烁的混乱图景，就能够清楚地了解老鼠究竟位于何处。 该研究小组发现，小鼠神经元的刺激模式十分稳定，实验间隔时间长达一月之后，仍可保持不变。而观察相同的细胞对于了解脑部疾病非常重要。如果某一个特定的神经元在测试时发生功能障碍，表明正常神经元已经死亡或出现神经退化疾病。研究人员就可以利用某些实验性的治疗试剂进行治疗，然后在相同刺激条件下，确定神经元能否恢复功能。 目前这项技术尚不能应用于人类，但小鼠模型是研究人类神经退行性疾病新疗法的一个重要起点，该系统将成为临床前研究评估的一种非常有用的工具。目前研究人员已经成立了一个公司，生产和销售该设备。 总编辑圈点 一般所说的“读脑仪”，通常指对脑意识进行探测和显现的电子设备，譬如测谎仪就算一种读脑设备。但在本文的研究中，“读脑”是为了找出实验对象的行为和神经元之间的关联，再进行医学药理学的分析。与意识探测相同的是，关乎“脑”研究，人类都还只是接触到皮毛，不过，随着近几年新进展的不断出炉，无论是“倾听大脑的思想”，还是将小鼠模型应用于研究人类神经退行性疾病新疗法，相信只是时间问题。 《科技日报》（2013-02-21 一版）

哈佛育出能“闻”出光线的小鼠 为气味和感受间关系的研究开辟新途径 据美国物理学家组织网10月18日（北京时间）报道，哈佛大学神经生物学家培养出一种能“闻”出光线的小鼠，为研究人员更好地理解嗅觉功能的神经机制提供了一种新工具。本周的《自然·神经科学》杂志详述了这项研究，这为未来研究气味和感受之间的关系以及其他感知系统的神经机制开辟了新方向。 要分析大脑的嗅觉感知是如何辨别气味的，最好的方法是研究大脑的活动方式。但气味种类繁多，化学成分非常复杂，变化微细让人难以捉摸，因此追寻这些由嗅觉刺激形成的大脑模式非常困难。 如果让鼻子作为视网膜那会怎么样呢？哈佛大学分子与细胞生物学教授温卡泰斯·默西和冷泉港实验室的同事利用遗传光学技术，把一种光敏蛋白质跟小鼠的嗅觉输入系统结合，培育了一批转基因小鼠，它们的所有嗅觉感受神经元都能表达视网膜素转导通道2（channelrhodopsin-2）蛋白质，这些转基因小鼠的嗅觉路径因此变成由光来激活，代替气味来研究大脑神经细胞如何区别不同气味。 嗅觉信息会在大脑中形成不同的三维空间组织形态，由于光输入很容易被控制，研究人员因此能设计一系列试验，利用光选择性地刺激鼻子里的特定感觉神经，研究大脑中嗅球的激活模式。 默西说，因为用外来光照代替气味在大脑中形成的空间组织只是一种临时性结构，新研究也存在一定的局限，并不能完全解释气味感受能力。研究还显示，在气味被感受的过程中，“嗅闻”的时机起着很大作用。

分子成像和基于细胞的检测可以对临床前的疗效研究给出非常重要的提示。组织样本和非侵入性成像可以对疾病及其前景提供极其重要的预测。生命科学中多达70%的数据是图像格式的并且这个数字不断上涨。实验室的高通量图像采集设备每天正产生成千上万的图片。现在，图像的分析主要是医疗领域的专家依靠他们多年的经验完成的，这种手动的过程非常慢，而且带有主观性。为整个企业作自动图像分析解决方案，并且实验室实验台和病床之间联系的需求加大，然而，尽管进行了数十年的研发，自动图像分析解决方案已经远远落后于他们当初承诺的那样。Definiens Cognition Network Technology是由扫描隧道显微镜和原子力显微镜的发明者之一，1986年诺贝尔物理学奖获得者Gerd Binnig和他的开发团队开发的，这种革命性的技术模仿人类从图片提取信息的认知过程。为了模拟人类思维认知的能力，Definiens公司从根本上摆脱了传统方法，利用Definiens专利技术中的分割和分类程序，开发了展示语义网络知识的有效的方法。该项技术检测像素不是孤立的，而是联系环境的。它建立一个图像，反复识别对象的像素群。正如人类的思维一样，它利用对象的颜色、形状、纹理、大小以及它们的环境和相互关系来得出结论和推断，且同经验丰富的分析家得出结论的一样。以下为Definiens一些解决方案。案例： 一、微核探测 Definiens智能图像分析软件可实现全自动化探测微核并对其进行定量分析。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/11/A1384364997_small.jpg可输出以下统计学信息：1. 单个细胞面积2. 单个细胞核面积3. 图像中细胞总数4. 图像中细胞核总数5. 图像中微核总数6. 微核细胞比例二、肾盂上皮组织探测 肾盂中全自动化探测：1. 上皮组织2. 阳性及阴性细胞核探测和区分3. 增值指数的计算http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/11/A1384365004png_small.jpg图1. 原始图像http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/11/A1384365005png_small.jpg图2. 所探测到的上皮组织、阳性和阴性细胞核轮廓线描述http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/11/A1384365007_small.jpg图3. 所探测到的上皮组织面积，阳性与阴性细胞核数量信息三、肾小管增值细胞检测 Definiens智能图像分析软件可实现全自动化分割并分类肾小管中BrdU染色阳性与阴性细胞。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/11/A1384365008_small.jpg1. 精确提取肾小管中细胞核，忽略肾小球与结缔组织中的细胞核2. 根据BrdU染色区分阴性与阳性细胞核3. 增值指数计算4. 批量处理上千张图像http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/11/A1384365010_small.jpg四、肾皮质与髓质判定 Definiens智能图像分析软件可实现全自动区分肾皮质与髓质，并对其进行详细的形态学定量分析。分析策略与途径：1. 探测肾小球2. 根据肾小球的分布辨别并提取皮质3. 辨别并提取髓质http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/11/A1384365014_small.jpg五、肌细胞荧光染色 Definiens智能图像分析软件可以实现从多噪点图像数据中全自动化探测肌细胞抗体染色区域，并对其进行定量分析。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/11/A1384365016_small.jpg

1、 选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG（10 IU）。2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG（0.8 IU），并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠（2月龄以上）作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。(一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)

干细胞使与衰老有关的肌无力的速度放缓 在小鼠中的一则新的研究报告指出，用干细胞来增加年轻的肌肉可减缓与年龄老化相关的肌无力的进程。 这些发现可能会导致再生性肌肉疗法的出现，这种疗法也许会对罹患肌营养不良症的病人或是那些虚弱的老年人有帮助。 文章的作者提出，如果科学家们能够发现可刺激肌肉中干细胞的小分子或分子组合（这可能会比将干细胞移植到人体内要更容易些），那么这些分子可被用于增进肌肉修复或减少肌肉丧失。 在成年期，损伤后或疾病后肌肉再生主要是靠卫星细胞，这是一种会分裂并参与修复、重新恢复活力和控制骨骼肌组织的干细胞，它可通过发育成为肌肉细胞而令肌肉生长。 Bradley Olwin及其同事在这里利用了干细胞的能力并防止了在幼小的小鼠中某一单一肌肉的与年龄老化有关的消瘦。 在该研究中，研究人员将少数的干细胞移植到肌肉受伤的幼小小鼠体内。 该研究小组在两年后对这些小鼠进行检查时发现，这种手术永久性地改变了移植的细胞，使得它们能够抵抗肌肉中的老化过程。 明确地说，这些移植的细胞能够控制它们所在的肌肉并与肌肉融合以形成新的肌肉纤维。 尽管人们对这一过程的机制还不了解，但这些发现提示，通过模仿这些移植的干细胞的功效，科学家们也许能够防止肌肉功能和重量的丧失，而这些通常是在人类老化时出现的情况。

文章出处：Natural killer cell education and tolerance. Cell. 2010. 142:847-856综述背景与主要内容：NK细胞作为继T细胞、B细胞之后的第三大类淋巴细胞，对它的研究已经超过了30年，对其的认识也在一步一步的加深。NK细胞最主要的功能是杀伤病毒感染细胞和转化了的肿瘤细胞，从而起到免疫防御和免疫自稳的作用。从一开始，大家就提出了关于NK细胞如何识别“自我”与“非我”的问题，也就是为什么NK细胞不会杀伤正常的细胞，而专杀病毒感染细胞和肿瘤细胞呢？随着NK细胞众多活化性受体和抑制性受体的发现似乎解释了这一问题，尤其是识别自身MHC I类分子的抑制性受体的发现，认为机体有核细胞都表达MHC I类分子，NK细胞接受自身MHC I类分子的抑制性信号所以不会杀伤自身正常细胞，而病毒感染细胞和肿瘤细胞MHC I类分子下调，NK细胞抑制性信号下降，活化性信号占主导，NK细胞活化从而杀伤这些细胞。但是，随着研究的深入，发现事实并不是如此简单，有些NK细胞并不表达识别MHC I类分子的抑制性受体，或者表达的抑制性受体不识别自身的MHC I类分子。但是这些NK细胞却并不杀伤正常细胞，也不杀伤MHC I类分子缺陷的细胞。另外，无核的红细胞并不表达MHC I类分子，NK细胞也并不杀伤正常的红细胞。虽然自身免疫性疾病有很多，但是没有证据表明NK细胞是导致自身免疫性疾病的主要细胞，自身免疫性疾病一般都是由T细胞或B细胞自身耐受被打破导致的，说明NK细胞自身耐受机制比T细胞和B细胞要完善。逐着研究的深入，对NK细胞耐受的机制的研究也取得了重要突破，本文全面介绍了NK细胞耐受机制研究的重要进展。NK细胞耐受机制（本人总结）：1、经典方式：NK细胞表达识别自身MHC I类分子的抑制性受体，机体正常细胞通过表达MHC I类分子抑制NK细胞对机体正常细胞的杀伤。2、NK细胞表达的识别自身配体的活化性受体长期接触机体正常细胞表达的自身配体能够诱导NK细胞耐受。证据1：NKG2D是NK细胞重要的活化性受体，其配体是Rae-1家族，该配体在机体出生前高表达，出生后不表达。所以，NK细胞可以直接杀伤表达Rae-1配体的细胞。但是转基因持续表达该配体的小鼠的NK细胞则表现为对这些配体的耐受，无法杀伤表达该配体的细胞。证据2：Ly49D识别H-2Dd，来源于H-2Dd缺陷小鼠的Ly49D阳性NK可以杀伤表达H-2Dd的细胞。证据3：Ly49H识别MCMV编码的m157，野生型Ly49H阳性NK细胞可以杀伤表达m157的细胞；但是转基因表达m157小鼠来源的Ly49H阳性NK细胞则无法杀伤表达m157的细胞。而且，将野生型Ly49H阳性NK细胞过继转移到转基因表达m157小鼠内，该NK细胞也将耐受，无法杀伤表达m157的细胞。3、正常机体内存在不表达识别自身MHC I类分子的抑制性受体的NK细胞，这些NK细胞在正常机体内表现为耐受状态。在感染或者炎症条件下，这些NK细胞将打破耐受状态，具有较强的杀伤功能，但是，此时这些NK细胞也不会杀伤自身正常的细胞，因为这些NK细胞表达识别其它自身抗原分子的抑制性受体，如识别CD48的CD244抑制性受体，识别LLT1的CD161抑制性受体等。

10多年来，干细胞疗法一直被认为能够给那些遭受遗传和退行性疾病折磨的人带来希望。而就在几天前，随着两个研究团队在于日本横滨召开的国际干细胞研究学会（ISSCR）年会上宣告了他们在人类临床研究中取得的成果——一项聚焦于罕见的遗传神经病，另一项则着眼于老年人的视力丧失，这一希望又朝着现实迈出了一步。　　美国加利福尼亚州纽瓦克市干细胞公司报告了用人体神经干细胞治疗梅氏病（PMD）所取得的鼓舞人心的研究成果。PMD是一种渐进式的致命疾病，该病通过基因突变抑制了髓鞘的正常生长，后者是大脑中包裹神经纤维的一种保护物质。缺乏髓鞘，神经信号便会流失；病人，通常是婴儿，便会经历运动协调能力退化以及其他神经病症状。据干细胞公司负责研究的副总裁Ann Tsukamoto介绍，该公司之所以选择PMD来测试其神经干细胞技术，缘于目前尚没有这种疾病的治疗方法，且通过基因检测和磁共振成像能够确诊这种疾病。她说：“这便为最有效的早期介入创造了一个机会。”　　该公司建立了一个从成熟神经组织中分离出的高度纯化的神经干细胞库。研究人员将这些神经干细胞注入啮齿动物体内后，它们并没有形成肿瘤，事实上，这些细胞在小鼠的大脑中游走，并分化成不同类型的神经细胞，其中就包括分泌能够保护神经纤维的髓鞘的细胞。Tsukamoto介绍说，当神经干细胞被注入小鼠后，它们表现出了“强大的移植和迁移能力，并形成新的髓鞘”。　　该公司如今正赞助对4名PMD婴幼儿患者进行该技术的初期安全试验。加利福尼亚大学旧金山分校的研究人员，向每位患者大脑中的4个区域中的每一个区域移植了7500万个神经干细胞，并随之进行了免疫抑制治疗，这样受体才不会排斥外来的细胞。Tsukamoto报告说，在试验过程中并没有出现安全隐患。此外，在18个月后进行的磁共振成像显示，在轴突周围形成了新的髓鞘，并且对患者进行的临床观察表明，他们的运动机能保持稳定或出现了小幅提升。干细胞公司如今正计划进行更大规模的试验。Tsukamoto表示，一旦这种疗法被证明是有效的，它将带来多发性硬化、大脑性麻痹和阿尔茨海默氏症的神经干细胞新疗法。　　在这次会议上，神户市日本理化研究所（RIKEN）发育生物学中心的干细胞研究人员Masayo Takahashi，报告了她的研究小组在针对与年龄相关的黄斑变性（AMD）的临床前研究所取得的进展。在AMD中，视网膜色素上皮（RPE）细胞的生长出现了问题，并且位于视网膜下部的血管出现了渗漏。这些情况导致眼睛中心部位的视力下降。Takahashi的研究小组研制出一种方法，即用外科手术摘除有问题的血管，同时用源自病人自身细胞的新RPE细胞替代受损的RPE细胞。利用被称为细胞再编程的一项技术，研究人员采集了病人的皮肤细胞，并将其转化为所谓的诱导多能干（iPS）细胞，这种细胞能够分化成人体中的所有细胞。研究人员随后将iPS细胞转化为RPE细胞。由于iPS方法使用的是病人自身的细胞，因此避免了对免疫抑制药物的需求。　　由Takahashi小组生成的RPE细胞表现出了真正人体RPE细胞的特征结构和基因表达模式。她报告说，将它们注入小鼠并没有引发肿瘤，并且这些细胞在移植到猴子体内后存活了6个多月。Takahashi希望在得到必要的批准后，能够在1年内开展人体试验。　　英国剑桥研究学院癌症中心的干细胞研究人员Fiona Watt指出，在ISSCR上发表的这些研究结果将帮助该领域“积攒力量”。而美国哈佛医学院的干细胞科学家George Daley则更为乐观。他说，记住这次年会上报告的这些进展；并表示对明年在波士顿召开的2013年ISSCR年会充满期待。

日本理化学研究所（REKIN）的小保方晴子等人 2014 年年初在《自然》上发表了两篇干细胞研究领域的重磅论文，但很快被质疑其研究存在学术不端。日本理化学研究所和《自然》（Nature）随后分别展开调查。日本理化学研究所在 4 月 1 日认定小保方晴子篡改及捏造实验数据。但目前对于该研究的争议还有一个关键性的问题尚未解决：小保方晴子等人在研究中观察到的现象究竟存在吗？或者说 STAP 真的存在吗？日本媒体 6 月 3 日发表的报道称，在对 STAP 实验中用到的细胞进行了基因检测后，结果显示，不存在。根据小保方晴子等人的研究结果，对体细胞进行简单的酸浴刺激，或者施加物理应激，就可以得到 STAP 细胞。这些细胞具有和胚胎干细胞相同的特性。对这些细胞进行进一步操作后，它们也可以形成可自我更新的干细胞系，这就是 STAP 干细胞，它们具有和胚胎干细胞系几乎相同的特性。之前《自然》上发表的论文中报告称，小保方晴子所在的实验室共创建了 8 个 STAP 干细胞系。今年3月，论文合作者之一、山梨大学的若山照彦曾要求文章的第一作者向其提供用某一品系的小鼠细胞制备的 STAP 细胞，但当若山照彦对细胞进行了简单的遗传分析后发现，文章的第一作者小保方晴子给他的干细胞，是由其他品系的小鼠细胞制备的。这表明这些细胞可能受到了污染。但是若山照彦并没有发现《自然》发表的论文中提到的 STAP 干细胞系存在问题。为了验证他的结论，若山照彦将 20 个干细胞系（包括论文中提到的 8 个），寄送给了一家匿名的独立遗传分析小组进行检测。根据日媒援引多方信源的报道，这次检测的结果已经送回理研。检测结果显示，所有 STAP 干细胞系都与论文声称的小鼠品系不符，这一结果对 STAP 现象是否存在提出了质疑。若山照彦表示，他将尽快召开媒体发布会公布相关检测细节。另据报道，日本理化所将有可能支持小保方晴子继续研究工作，设法重演STAP结果。

自去年10月开始，分子生物学家Katsuhiko Hayashi就陆陆续续收到了许多夫妻的邮件，这些夫妻大多人到中年，仍然在为了一件事情焦急：要一个孩子。其中有一位英国的更年期妇女，希望到他位于日本京都大学的实验室，在他的帮助下怀上孩子，她写道：“这是我唯一的愿望。”这些请求开始于Hayashi一篇文章的发表——他原以为只有发育生物学家才会对他的实验结果感兴趣。在体外条件下，利用小鼠的皮肤细胞创造可以发育成精子和卵子的原始生殖细胞（PGCs）。为了证明这些实验室培养的原始生殖细胞与自然发育而成的原始生殖细胞类似，他利用它们生成了卵子，进而创造小鼠生命。他表示，这个创造出来的小鼠生命仅仅是他研究的一个“副产品”，他的研究将意味着更多——利用不孕妇女的皮肤细胞为她们提供可受精的卵细胞。与此同时他还提出，男性的皮肤细胞也可以用来创造卵子，同样，女性的皮肤细胞也可以生成精子。（事实上，研究结果发表后，许多同性恋发邮件给Hayashi ，索要更多的信息。）尽管这是一项创新研究，但是公众的广泛关注还是令Hayashi和他的教授Mitinori Saitou感到非常惊讶。他们花了十多年不断挖掘哺乳动物配子产生的微妙细节，然后在体外条件下重新创建该过程——一切都是为了科研，而非医疗。现在他们的方法使研究人员能够创建无限的原始生殖细胞，这种在以前很难获得的珍贵细胞的正常供应有助于推动哺乳动物生殖研究。但是，当他们将这个科学挑战自小鼠到猴子，再到人类推进时，这一过程被公众定义为治疗不孕不育的过程，于是相关的道德争议随之出现。“毫无疑问，他们在小鼠身上给这一领域带来了重大的改变，” 洛杉矶加州大学的生育专家Amander Clark说，“但是，在这项技术展示它的实用性之前，我们必须讨论一下使用这种方式创造配子的伦理问题。”回到最初在小鼠体内，胚胎发育一周后，便出现约40个左右的原始生殖细胞。这个小小的细胞团进而在雌性小鼠体内形成成千上万的卵细胞，在雄性小鼠体内每天都能生成几百万个精细胞，并能够遗传小鼠的全套遗传信息。Saitou想要了解在这些细胞发育过程中受到了那些信号的控制。在过去的十年中，Saitou已经通过辛苦研究确定了几个基因——包括Stella, Blimp1 和Prdm14 ——这些基因的某种组合在某些时候对于PGCs的发育起到了至关重要的作用。利用这些基因作为标记，可以从其他细胞中筛选原始生殖细胞以观察这些细胞的变化。2009年，在日本神户的RIKEN发育生物学中心，他发现，当培养条件适当时，在精确的时间加入骨形态发生蛋白4（BMP4），可以胚胎干细胞转化为原始生殖细胞的。为了验证这一发现，他向胚胎干细胞提供高浓度的BMP4，结果显示，几乎所有的胚胎干细胞都变成了PGCs。他和科学家们都预计这一过程非常复杂。http://www.ibioo.com/data/attachment/portal/201308/25/095620gaqefeejnqejxuu3.jpg人造小鼠生殖细胞产生小鼠胚胎的过程（点击图片查看大图）Saitou的方法严格遵循了自然过程，这与其他从事类似研究的人形成了鲜明的对比，以色列魏茨曼科学研究所的干细胞专家Jacob Hanna说。许多科学家尝试通过信号分子轰击干细胞在体外创造特定类型的细胞，然后筛选细胞混合物得到他们想要的细胞。但是他们忽略了这些细胞的自然形成过程和这些人造细胞与自然形成细胞的相似程度。Saitou找出了形成生殖细胞所需的条件，去除多余的信号干扰并将每个过程的时间精确控制，给他的同事们留下了深刻的印象。英国谢菲尔德大学的干细胞生物学家Harry Moore将这种生殖细胞发育的精确重现视为一场“胜利”。到了2009年， Saitou在小鼠生殖细胞出现之前从外胚层取了一些细胞，这成了研究的起点。但是想要真正掌握这个过程中，Saitou希望从细胞培养开始。当时正值Hayashi从英国剑桥大学回到日本，和Saitou一样，Hayashi在该领域先驱Azim Surani英国的实验室里完成了4年的研究。Surani盛赞这两位科学家说，他们的“气质、风格和解决问题的方法能够相互补充”。 Saitou “处理事情时很有系统性、完成目标一心一意”，而Hayashi“工作时更有直觉、视角更广阔、处理问题方法相对更加宽松”，他说。“他们确实形成了一个非常强大的团队。”Hayashi加入了Saitou京都大学的团队，他很快就发现，那里不同于剑桥。在京都大学，Hayashi用在理论讨论上的时间比曾经少得多，而更多的时间都花在实验上。他说“在日本，我们只管‘做’，这有时是非常低效的，但有时又酝酿着巨大的成功”。Hayashi同样以外胚层细胞作为起点，但与Saitou不同的是，他试图培养一个能够产生原始生殖细胞的稳定细胞系。可惜这种方法没有奏效。Hayashi借鉴其他研究结果——一个关键调控分子(activin A)和生长因子（bFGF）可以将培养的早期胚胎干细胞转化成类似于外胚层细胞的细胞类型。这引发了Hayashi将这两个因素结合起来的想法，诱导胚胎干细胞分化为外胚层，然后采用Saitou之前的方法把这些细胞成为的PGCs。通过这种新的方法，他最终获得了成功。为了证明这些人造的原始生殖细胞是真实的拷贝，他们必须证明这些细胞可以进一步发育成精子和卵子。这一进程是非常复杂和难以理解的。所以研究小组将这一工作留给了自然——Hayashi将PGCs植入无法产生精子的小鼠的睾丸，观察这些细胞是否会发育。Saitou认为，这是可行的，但还是感到有些担忧。当实验进行到第3或4只小鼠时，他们发现小鼠的输精管里充满了精子。“这一切都发生得恰如其分，我知道他们会产生幼仔，”Hayashi说。研究小组将这些精子注入卵细胞中并植入雌性小鼠的胚胎，结果产生了大量的雌性和雄性后代。他们利用诱导多能干细胞（iPS）进行反复的实验，成熟的细胞被重新编程为胚胎状态。此外，精子被用于生产幼仔，证明它们具有基本功能——这是干细胞分化领域的罕见成就。Clark说：“这是整个多能性干细胞研究领域里在培养皿中生成全功能细胞类型少有的成功案例之一。”他们预计形成卵细胞更复杂，但是在去年，Hayashi在体外条件下制作有正常着色的原始生殖细胞并转入白化小鼠的卵巢，将产生的卵细胞体外受精后植入代孕。当透过幼崽半透明的眼睑看到黑色的眼睛时，他知道这一切又成功了。生殖细胞的回馈目前，许多研究人员已经能够复制验室培养原始生殖细胞的过程。人造原始生殖细胞特定用于表观遗传学研究：通过修饰DNA确定哪些基因表达。最常见的修饰就是为DNA碱基加上甲基，这些修饰在有些情况下，能够反映生物所经历的历史过程。与其它类型的细胞类似，表观遗传标记改变了原始生殖细胞在胚胎发育过程中的命运，但原始生殖细胞有个与众不同的特点，就是当它们发育成精子和卵子后，表观遗传标记被擦除。这就允许细胞创建能够形成任何类型细胞的受精卵。表观遗传微妙变化中出现错误将会导致不孕不育并出现器官故障，如如睾丸癌。Surani和Hanna的团队已经利用人造原始生殖细胞研究不同酶在表观遗传调控中的作用，也许有一天，能够解答表观遗传网络如何参与疾病调控。事实上，体外产生的原始生殖细胞可以为研究提供数百万个细胞，而不是供科学家研究了40个左右，这些细胞可以通过解剖早期胚胎获得。Hanna说：“这是一个大问题，因为我们这里有这些稀有的原始生殖细胞正在经历我们尚不了解的全基因组表观遗传变化。”“体外模型为科学家们提供了前所未有的方便，” Clark表示认同。临床意义但是Hayashi和Saitou没有办法向乞求帮助的不孕夫妻提供帮助。在这种方法被运用在临床之前，还有许多问题需要梳理。Saitou和Hayashi发现，虽然运用他们的技术所产生的后代通常似乎是健康和大量的，但这些后代产生的原始生殖细胞并生不完全“正常”。 第二代原始生殖细胞产生的卵细胞往往是脆弱、畸形的，并且从支持它们生长的组织上脱离。当受精时，卵细胞内部会分为三组染色体，而不是正常的两组，体外受精的成功率也只有正常原始生殖细胞的三分之一。哈佛医学院从事表观遗传学研究的Yi Zhang，使用Saitou的方法在研究中发现，体外受精过程中，人造的原始生殖细胞不能像自然状态下产生的原始生殖细胞一样，抹去它们的表观遗传标记。“我们必须要知道，这些都是PGCs的类似细胞，而不是真正的原始生殖细胞，”他说。此外，这项技术还存在两个大的挑战。首先是在不将PGCs放回睾丸或卵巢的前提下买入和使它们变成成熟的精子和卵子，Hayashi目前正在试图破解PGCs生成卵子或精子的生物信号，使人工培育条件下完成这一阶段成为可能。但最可怕的挑战是在人体重复上述所有的工作。该小组已经在利用Saitou找到的关键调控基因来调整人类的iPS细胞，但是Saitou 和Hayashi都知道，人类的信息调控网络不同于小鼠。此外，Saitou有无数的小鼠胚胎进行解剖，但无法在人类胚胎进行

微离子导入疗法从病人免疫角度入手，以人体各组织器官发出的生理病理信息和药物作用信息为依据，以治疗肾脏的病理破坏为宗旨，通过清除肾脏破坏性物质和免疫复合物，治疗系膜增生，改变肾小球硬化，改善肾脏血流灌注，增加肾小球滤过率而使病人康复。具体说来，微离子导入疗法就是将常用中药微离子化，通过外用导入人体肾区，以达到调整和维持人体的内部平衡的效果。这种疗法避免了单纯口服药物无法被肾脏充分吸收的问题，可以使药物尽可能充分的到达肾脏，被肾脏吸收，大大提高了药物的利用率。同时辅之以口服中草药，达到内外结合、互相促进的效果。本文摘自：[url]http://www.jixingshen.com/html/20091121/article96.html[/url]

目的：通过观察盐酸林可霉素对小鼠肠道菌群，肠道组织病理学改变，血中淋巴细胞数的影响规律，以期为科学研究正确使用盐酸林可霉素造成菌群失调动物模型提供参考资料。方法：盐酸林可霉素连续灌胃3d停止给药，于停药后第1天，第4天，第7天，和第10天检测肠球菌数，双歧杆菌数，血中淋巴细胞数和肠道病理改变，评价盐酸林可霉素对小鼠肠道菌群的影响规律。结果：灌胃3d停止用药后第1天和第4天双歧杆菌减少，肠球菌增加，与正常组比较差异有统计学意义(P0．05)，肠道黏膜皱褶变浅，上皮内杯状细胞减少。停药后第1天出现血中淋巴细胞数减少。结论：盐酸林可霉素短期大量给药，可造成小鼠菌群失调，肠道组织损伤，免疫功能受损，该损伤持续约1周。盐酸林可霉素是科学研究中用于造成菌群失调动物模型的常用抗生素，其抑制细菌生长，尤其抑制益生菌的作用非常明显，但各家用该药的方法、剂量有较大差别，由于动物的耐受性较强，菌群失调能持续的时间不清，本实验尝试在肠道菌群变化、肠组织损伤等方面来研究林可霉素造成菌群失调的规律。以期为该药在科学研究中的使用提供数据依据，现报告如下。

95%。目前细胞分选主要用于研究，临床应用较少。血液学应用最多的是造血干细胞的研究，最近随着造血理论的深入研究关于造血干细胞究竟是否都是CD34+细胞出现一些争论,实验研究证明, CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞更具造血潜能,这些实验研究所用的CD34- 和CD34+细胞就是通过细胞分选获得的。小鼠造血干细胞分选一般按lin-c-Kit+CD34+/ lin-c-Kit+CD34-分选,人造血干细胞分选一般按lin-CD34+/ lin-CD34-分选。 为避免某些遗传性血液病如海洋性贫血、异常血红蛋白病的纯合子出生，产前诊断非常重要，这些疾病的主要靶细胞是红细胞，而孕妇血循环中存在着胎儿有核红细胞，只是数量非常少，利用流式细胞仪可从孕妇血液中分选出胎儿有核红细胞（分选条件：CD45-GPA+）进行基因分析，作出产前诊断。利用流式细胞仪分选免疫担当细胞进行细胞免疫学研究也是目前的热门课题。总之，流式细胞仪能够分选出你想得到的任何一亚群细胞，只要你想得到的某一亚群细胞有合适的单克隆抗体标记，流式细胞仪的分选功能将得到越来越多的科学研究和临床应用。二十二. 流式细胞术在血液学中的应用 其他流式细胞仪可能在两方面对骨髓增生异常综合症（MDS）有用，一是测定CD34阳性细胞数，以监测病情，二是测定核蛋白增殖因子（PCNA）,有报告PCNA再在生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症、白血病三种疾病中表达有明显差异，可辅助鉴别诊断。 此外流式细胞仪也可检耐药蛋白,如肺耐药相关蛋白（LRP）、多药耐药蛋白（MRP）、 P170等。 流式细胞仪也可检测细胞因子，细胞内细胞因子如白介素系列（IL-1—IL-14）,肿瘤坏死因子(TNF),干扰素(IFN)等,[/color