酮戊二酸用于细胞培

1 实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术,要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响.细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响,要求工作环境清洁,空气清新,干燥和无烟尘.细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作和封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一室. 2 常用设施及设备 (1)超净工作台:也称净化工作台,分为侧流式,直流式和外流式三大类. (2)无菌操作间:一般由更衣间,缓冲间和操作间三部分组成.操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱,离心机,倒置显微镜等.缓冲间可放置电冰箱,冷藏器及消毒好的无菌物品等. (3)操作间:普通培养箱,离心机,水浴锅,定时钟,普通天平及日常分析处理物(4)洗刷消毒间:烤箱,消毒锅,蒸馏水处理器及酸缸等. (5)分析间:显微镜,计算机及打印机等. 3 培养器皿 常用细胞培养器皿有培养瓶,培养板,培养皿等.常准备量是使用量的三倍.器皿应选择透明度好,无毒,利于细胞粘附和生长的材料,常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品.常用的器皿有下面几种. (1)液体储存瓶:用于储存各种配制好的培养液,血清等液体,常用规格有500ml,250ml, 100ml等几种. (2)培养瓶:根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异,用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀,便于细胞贴壁生长和观察,瓶口要大小一致,口径一般不小于1cm,允许吸管伸入瓶内任何部位,规格有200ml,100ml,50ml,25ml,10ml等几种. (3)培养皿:用于开放式培养及其它用途.分直径30mm,60mm,120mm等几种. (4)吸管:常用的有长吸管和短吸管两类,长吸管也称刻度吸管.其改良后管上部有球型刻度称改良吸管,刻度吸管用于移动液体.常用1ml和10ml两种.短吸管也叫滴管,分弯头和直头两种. (5)离心管:离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿,根据用途不同形态各样,常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类.前者分别为50ml,30ml,15ml;后者则多为10ml和5ml. (6)其它:如三角烧瓶,烧杯,量筒,漏斗,注射器等.4 细胞培养温度 维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定而适宜的温度.不同种类的细胞对培养温度要求也不同.人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡.培养细胞对低温的耐受力较对高温强,温度上升不超过39℃时,细胞代谢与温度成正比;人体细胞在39-40℃1小时,即能受到一定损伤,但仍有可能恢复;在40-41℃1小时,细胞会普遍受到损伤,仅小半数有可能恢复;41-42℃1小时,细胞受到严重损伤,大部分细胞死亡,个别细胞仍有恢复可能;当温度在43℃以上1小时,细胞全部死亡.相反,温度不低于0℃时,对细胞代谢虽有影响,但并无伤害作用;把细胞放入25-35℃时,细胞仍能生存和生长,但速度减慢;放在4℃数小时后,再回到37℃培养,细胞仍能继续生长.细胞代谢随温度降低而减慢.当温度降至冰点以下时,细胞可因胞质结冰受损而死亡.但是,如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂(二甲亚砜或甘油),可在深低温下如-80℃或-196℃(液氮)长期保存. 5 合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳.氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分.开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中.二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值.大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响.但细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境中更利于细胞生长.但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如成纤维细胞最适合pH是7.4-7.6.每种细胞都有其最适pH值.

简单介绍一下细胞培养技术，本人这段时间主要做细胞工作，和大家共勉吧！细胞培养技术一、细胞培养的条件和要求 二、细胞分离 三.体外培养细胞龄的计算四.细胞鉴别试验 五、细胞计数六、细胞传代 七、细胞的冻存和复苏 八、细胞培养用水处理 九、选择小牛血清的微量细胞培养检查法 十、葡萄糖测定法 十一、乳酸测定法十二、细胞培养方式

大规模动物细胞培养的问题及对策动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求，动 物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前，世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。1.细胞培养环境细 胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。氨的积聚使细胞内UDP氨基己 糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影响细胞的生长及蛋白的糖基化过程。氨抑制Gln代谢途径，使Asp和Glu消耗增加。细胞消耗Asp增加，可能是细胞线粒体膜上苹果酸－天冬氨酸泵转运NADH加快，使细胞维持糖酵解途径的需要。Asp消耗增加可能会从Gln代谢多经天冬氨 酸转氨酶途径而不是丙氨酸转氨酶或谷氨酸脱氢酶途径得以补偿。氨来源于两方面：一是直接来源于培养基，一是细胞代谢所产生。但两者都涉及谷氨酰胺，因此需要防止培养基中Gln自然分解，限制Gln用量，并尽量去除培养基中的氨。乳酸是细胞糖代谢的产物。高浓度乳酸会抑制乳酸脱氢酶(LDH），从而减少乳酸产生。LDH受抑制后阻止了NADH向NAD的再生及其偶联的丙酮酸/乳酸转 换，从而导致NADH[font=T

注意事项： 1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。2.安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45 微米 和 0.22 微米滤膜各一张，放置位置为 0.45 的位于 0.22 微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。 3.配制 RPMI1640 培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液 PH 值最终为 7.2 ，可在配制时调 PH 至 7.4 。 细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。R 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置 4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的 PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和 CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度?－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入 37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

从大小来讲，细胞培养瓶约可分为约600ml，250ml，50ml和25ml的，一般都经过表面改性处理，适合细胞贴壁和生长。600ml 、300ml的多用于大规模培养时用（如单克隆细胞的培养等），50ml的多用于一般性细胞实验用（一般性的传代，保存细胞，为实验提供细胞等），25ml一般是用来复苏细胞或细胞较少时的培养，还有做原代细胞时也可以做多瓶而避免交叉污染。当然还有其他如圆形的等，都可根据个人爱好和实验需要自己选择。 根据细胞培养瓶制作材料的不同，也有玻璃和塑料之分，这里谈一点自己的浅见（欢迎不同意见的战友拍砖）。不同的细胞对胰酶的敏感度不一样，所以在实验中我们常常会遇到一些细胞消化半天也没有起色，导致细胞状态不断下滑，直至最后的死亡以至于实验进展的不顺利。当然，有时候是可以通过加一些EDTA等来增强胰酶的能力，或者提高胰酶的浓度来实现，在培养一些细胞过程中，我发现，一些细胞对玻璃和塑料制品粘附能力不同，如RAW264.7，平滑肌细胞等，在转换培养瓶之后，可以发现好消化了很多，并且在回到原制品的培养瓶时不会改变它的贴壁能力。这里希望有经验的战友可以分享你们的经验。 关于培养板的购买其实我也没有什么经验，想说的就是要尽量避免购买国产的培养板，国产的一些培养瓶还可以，但是培养板我们买过很多国产的，确实效果不是很好，细胞在里面基本上长的非常非常磕碜。所以经费富余的情况下，这些东西能买进口的就买吧。大公司的基本都可以买，BD，Corning等等。这些东西原则上是一次性的，但是我们大部分实验室根本不可能做到，其实泡酸，洗干净再用也没问题，毕竟我们没有老外那么富足的经费，所以我们就累点吧，多做点体力活锻炼一下身体吧。滴管其实也没什么好说的，国产的就足够了。要说的是图中我比较喜欢用C类的滴管，原因就是塞上棉花后吹打细胞不会怕棉花湿掉而引起污染，而且用完棉花也方便取出，便于下次再用。

体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。 我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一.鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。1． 材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置 灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧 排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料 培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。2． 结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。二．新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRG细胞，进行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。

我想做细胞培养的课题，用几个药物处理细胞，不知道文献上的药物浓度都是怎么得来的呀？还有药物要选择溶液，怎么和临床药物浓度折算呀？我是学临床的，请教高人指点呀！多谢多谢！

1、搅拌式动物细胞培养罐　　搅拌式培养罐靠搅拌桨提供液相搅拌的动力，它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性，因此在生物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护，因此对剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容易对其造成损害，传统的用于微生物的搅拌培养罐用作动物细胞的培养显然是不合适的。所以，动物细胞培养中的搅拌式培养罐都是经过改进的，包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在培养罐内加装辅件等。　　(1)供氧方式的改进　　一般情况下搅拌式培养罐还常伴有鼓泡，为细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感，所以人们在供氧方式的改进上做了许多工作。笼式供氧是搅拌式动物细胞培养罐供氧方式的一种，即气泡用丝网隔开，不与细胞直接接触。培养罐既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力，以满足细胞生长的要求。北野昭一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞培养罐，整体呈梨形，搅拌置于培养罐底部，在搅拌轴外装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动。轴心处的鼓泡管在丝网内侧鼓泡，丝网外侧的细胞不与气泡直接接触。　　(2)搅拌桨的改进　　搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大，这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。有人对搅拌桨的形式作了改进，并在反应器内加装了辅件，实验证明改进后的反应器适用于对剪切力敏感的细胞进行高密度培养。反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨，顶部的法兰盖上安装了3块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30°，垂直插入液面。挡板的存在减小了液面上的旋涡。这个反应器维持了较小的剪切力，实验中用于昆虫细胞的培养，最终的培养密度达到6×106个/mL，成活率在98%以上。　　2、非搅拌式动物细胞培养罐　　搅拌式细胞培养罐用于动物细胞培养存在的最大缺点是剪切力大，容易损伤细胞，虽然经过各种改进，这个问题仍很难避免。相比之下，非搅拌式培养罐产生的剪切力较小，在动物细胞培养中表现出了较强的优势。　　(1)填充床反应器填充是在反应器中填充一定材质的填充物，供细胞贴壁生长。营养液通过循环灌流的方式提供，并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可以在反应器外通过循环的营养液携带，因而不会有气泡伤及细胞。这类反应器剪切力小，适合细胞高密度生长。　　(2)中空纤维反应器中空纤维培养罐由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养。这类培养罐由中空纤维管组成，每根中空纤维管的内径约为200μm，壁厚为50～70μm。管壁是多孔膜，O2和CO2等小分子可以自由透过膜扩散，动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长，可以很方便地获取氧分。　　(3)气升式细胞培养罐气升式生物反应器(airliftbioreactor)也是实现动物细胞高密度培养的常用设备之一，其特点是结构简单，操作方便。有人在气升式反应器中利用微载体培养技术，研究了Vero细胞高密度培养的工艺条件。证明气升式反应器中悬浮微载体培养Vero细胞，在加入适量保护剂、营养供应充足的情况下，细胞可以正常生长至长满微载体表面，终密度可达1.13×106个/mL。

[b][font=宋体]细胞培养实验室组建的基本要求[/font]:[/b]1[font=宋体]、细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。[/font]2[font=宋体]、细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。[/font]3[font=宋体]、细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，为[/font]10[font=宋体]万级洁净环境的洁净室。而洗刷消毒工作设在洁净室外，避免物品污染洁净室内环境。细胞洁净室需要一个空调系统并对外界保持一定的正压。[/font]4[font=宋体]、解剖实验室主要用于对器官组织的分离，需要有无菌操作台、解剖显微镜、各种手术器材等。[/font] [align=center][url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/shiyanshilixinji/2018-10-12/301.html][img=实验室离心机]http://www.hexiyiqi.com/d/file/hexi2012chanpinzhongxin/luodishigaosulengdonglixinji/2019-05-14/4b60dacaa256bcc4fe665e2eb3536c0a.jpg[/img][/url][/align][align=center][b]智能台式高速冷冻实验室离心机 3H24RI[/b][/align][font=宋体]组织细胞培养室除一般实验室的普通常规设备外，尚有一些特殊需要的设备。基本可分为两大类：[/font][font=宋体]第一类为常用的基本设备；[/font][font=宋体]第二类为较高级的特殊设备。[/font][b]1. [font=宋体]细胞培养实验室常用的基本仪器设备[/font]1.[font=宋体]显微镜：[/font][/b][font=宋体]倒置显微镜——是组织细胞培养室所必需的日常工作常规使用设备之一，便于掌握细胞的生长情况并观察有无污染等。[/font][b]2.[font=宋体]培养箱：[/font][/b][font=宋体]体外培养的细胞和体内细胞一样，需要在恒定的温度下生存，大多数情况下，最适温度是[/font]37[font=宋体]℃，温差变化一般不应超过±[/font]0.5[font=宋体]℃，细胞在温度升高[/font]2[font=宋体]℃[/font] [font=宋体]时，持续数小时即不能耐受，[/font]40[font=宋体]℃以上将很快死亡。因此需要有能控制温度的培养箱，如具有较高灵敏度的恒温培养箱及[/font]CO2[font=宋体]培养箱。[/font][b]3.[font=宋体]干燥箱：[/font][/b][font=宋体]用于细胞培养箱的有些器械、器皿需要烘干后才能使用，玻璃器皿等须干热消毒。[/font][b]4.[font=宋体]水纯化装置：[/font][/b][font=宋体]细胞培养对水的质量要求较高，细胞培养以及与细胞培养工作相关的液体的配制用水必须事先严格纯化处理。进行细胞培养时配制各种培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水：即使是用于玻璃器皿的冲洗，也应使用二次以上蒸馏水。[/font][b]5.[font=宋体]冰箱：[/font][/b][font=宋体]细胞培养室必须配备。[/font]a[font=宋体]、普通冰箱或冷藏柜——储存培养液、生理盐水等培养用的物品及短期保存组织标本。[/font]b[font=宋体]、低温冰箱（[/font]-20[font=宋体]℃）——用于储存需要冷冻保存生物活性及较长时期存放的制剂，如酶、血清等。[/font][b]6.[font=宋体]细胞冷冻储存器：[/font][/b][font=宋体]储存器常用的是液氮容器。根据使用需要分为不同的类型及多种规格。选择购置液氮容器时要综合考虑容积大小，取放使用方便及液氮挥发量（经济）三种因素。[/font][b]7.[/b][font=宋体][url=http://www.hexiyiqi.com/][b]离心机[/b][/url][b]：[/b]进行细胞培养时，常规需要进行制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤、收集细胞等工作，通常需要使用[url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/shiyanshilixinji/]实验室离心机[/url]。一般可常规配置[/font]4000rpm[font=宋体]的国产台式离心机，例如细胞沉降，使用[url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/]低速离心机[/url]即可，离心力过大有时可能引起细胞的损伤。[/font][align=center][url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/2012-10-17/69.html][img=低速离心机]http://www.hexiyiqi.com/d/file/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/2012-10-17/0e080cd46b2ee061b55caabaaee8cbf2.jpg[/img][/url][/align][align=center][b]台式低速离心机TD5A[/b][/align][b]8.[font=宋体]天平：[/font][/b][font=宋体]常用的有扭力天平、精密天平及各种电子天平。[/font][b]9.[font=宋体]消毒器：[/font][/b][font=宋体]一般为高压蒸汽灭菌锅，直接或间接与细胞接触的物品均需消毒灭菌处理。[/font][b]10.[font=宋体]滤器：[/font][/b][font=宋体]目前细胞培养工作中采用的培养用液，包括人工合成培养液、血清、消化用胰酶等常含有维生素、蛋白、多肽、生长因子等物质，这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能，因而上述液体多采用滤过消毒以除去细菌。目前常使用的滤器有玻璃滤器和微孔滤器，各种滤器有其使用原理和特点。[/font][b][font=宋体]常用的培养器皿：[/font][font=宋体]培养用器皿[/font][/b][font=宋体]是[/font][font=宋体]供细胞接种、生长等用的器皿，可由透明度好、无毒的中性硬质玻璃或无毒而透明光滑的特制塑料制成。[/font][font=宋体]细胞培养中需要的各种耗材[/font],[font=宋体]各类细胞培养板，细胞培养瓶，平皿移液管等。[/font][b][font=宋体]培养瓶[/font][/b][font=宋体]：由玻璃或塑料制成。主要用于培养、繁殖细胞。进行培养时培养瓶瓶口加盖螺旋瓶盖或胶塞，胶塞多用于密封培养。国产培养瓶的规格以容量（[/font]ml[font=宋体]）表示，如[/font]250ml[font=宋体]、[/font]100ml[font=宋体]、[/font]25ml[font=宋体]等；进口培养瓶则多以底面积（[/font]cm2[font=宋体]）表示。[/font][b][font=宋体]培养皿：[/font][/b][font=宋体]由玻璃或塑料制成，供盛取、分离、处理组织或做细胞毒性、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验使用。常用的培养皿规格有[/font] 10cm[font=宋体]、[/font]9cm[font=宋体]、[/font]6cm[font=宋体]、[/font]3.5cm[font=宋体]等。[/font][font=宋体]多孔培养板：为塑料制品。可供细胞克隆及细胞毒性等各种检测实验使用。其优点是节约样本及试剂，可同时测试大量样本，易于进行无菌操作。培养板分为各种规格，常用的规格有：[/font]96[font=宋体]孔、[/font]24[font=宋体]孔、[/font]12[font=宋体]孔、[/font]6[font=宋体]孔、[/font]4[font=宋体]孔等。[/font][b][font=宋体]培养操作有关的器皿[/font][font=宋体]贮液瓶：[/font][/b][font=宋体]常见的为蓝盖瓶，主要用于存放或配制各种培养用液体如培养液、血清及试剂等。贮液瓶分为各种不同规格，如[/font]1000ml[font=宋体]、[/font]500ml[font=宋体]、[/font]250ml[font=宋体]、[/font] 100ml[font=宋体]、[/font]50ml[font=宋体]、[/font]5ml[font=宋体]等。[/font][b][font=宋体]吸管：[/font][/b][font=宋体]主要分为刻度吸管、无刻度吸管。刻度吸管主要用于吸取、转移液体，常用的有[/font]1ml[font=宋体]、[/font]2ml[font=宋体]、[/font]5ml[font=宋体]、[/font]10ml[font=宋体]等规格。无刻度吸管分为直头吸管及弯头吸管，除可以作吸取、转移液体外，弯头尖吸管还常用于吹打、混匀及传代细胞。[/font][b][font=宋体]加样器（[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]）[/font][/b][font=宋体]：分为微量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]和[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]电动[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]。用于吸取、移动液体或滴加样本。可根据需要调节量的大小，吸量准确、方便。可保证实验样品（或试剂）含量精确，重复性良好。[/font][b][font=宋体]其他用品：[/font][/b][font=宋体]尚有收集细胞用的离心管，放置试剂或临时插置吸管用的试管，装放吸管以便消毒的玻璃或不锈钢容器，用于存放小件培养物品便于高压消毒的铝制饭盒或贮槽，套于吸管顶部的橡胶吸头，封闭各种瓶、管的胶塞、盖子、冻存细胞用的安瓿或冻存管、不同规格的注射器、烧杯和量筒以及漏斗，超净工作台使用的酒精灯，供实验人员操作前清洁消毒手使用的盛有酒精或其他消毒液的微型喷壶等。[/font][b][font=宋体]器械[/font][/b][font=宋体]主要用于解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件。常用的有：手术刀或解剖刀、手术剪或解剖剪（弯剪及直剪），用于解剖动物、分离及切剪组织，制备原代培养的材料；眼科虹膜小剪（弯剪或直剪），用于将组织材料剪成小块；血管钳及组织镊、眼科镊（弯、直），用于持取无菌物品（如小盖玻片）夹持组织等；口腔科探针或代用品，用以放置原代培养之组织小块。[/font][b]2[font=宋体]、细胞培养实验室特殊设备[/font][/b][font=宋体]细胞培养实验室除了应配备上述的常用基本设备以外，如有条件，可添置一些特殊或先进的设备仪器，以便更有效、更精确、更深入地进行实验室工作。例如：[/font][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）酶联免疫检测仪——可用于进行免疫学测定及细胞毒性、药物敏感性检测等。[/font][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）[/font] [font=宋体]超低温冰箱（[/font]-80[font=宋体]℃）——便于储存某些试剂及标本。[/font][font=宋体]（[/font]3[font=宋体]）旋转培养器——用于某些特殊细胞或需要收获大量细胞的培养。[/font][font=宋体]（[/font]4[font=宋体]）[/font] [font=宋体]荧光显微镜——进行荧光染色样本的观察。[/font][font=宋体]（[/font]5[font=宋体]）[/font] [font=宋体]流式细胞仪——可更精确及快速检测细胞。[/font][font=宋体]（[/font]6[font=宋体]）用于检测细胞培养条件的各种仪器，例如专门为快速分析细胞培养基中主要或关键营养成分、代谢产物及气体含量设计的多功能细胞培养分析仪、手提式[/font]CO2[font=宋体]浓度测定仪等。[/font][b][font=宋体]其余仪器[/font][/b][font=宋体]对于细胞实验还可能需要振荡器及磁力搅拌器用于混匀液体；还有一些沾满细胞的难清洗的不锈钢类或玻璃类器皿，则需要超声波清洗机的帮助；如果涉及免疫实验，肯定需要冰浴，碎冰的需求量大的话，则需要购买制冰机；另外破碎细胞可能会需要超声波细胞破碎仪；[/font]

细胞培养是细胞和分子生物学中最重要的一项技术。广泛应用于现代医学、农业科学、生物科学、材料科学和环境科学等领域，培养的细胞为上述领域提供研究的模型和实验材料。目前细胞间可以供从事蛋白质表达工作的昆虫细胞培养实验及如HEK293T细胞系,Hela细胞系，CHO细胞系等常用细胞系的培养、传代及其他分子实验的操作条件。

【序号】：1【作者】：刘娇【题名】：用于细胞三维培养的明胶/海藻酸钠水凝胶研究【期刊】：中国医科大学【年、卷、期、起止页码】：2021【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C475KOm_zrgu4lQARvep2SAkueNJRSNVX-zc5TVHKmDNksVmI2vEAbaqYGffULOB-kwB7M13LixCbzWL169dXUr7&uniplatform=NZKPT

1、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 2、哪种培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，(特别是雌激素)。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 3、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。4、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？ 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 5、室温下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少？ 缓冲液PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同PH值。 50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同PH值 4°C 25°C 37°C 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 9.0 9.1 9.2 9.3 9.4 8.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5

1培养基中丙酮酸钠的作用是什么？答：丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。2GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？答：GlutaMAX-I 即谷丙氨酸二肽，是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。3二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？答：二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。4细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗？答：不见得！因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++, Mg++离子和血清等因素有关。通常情况下pH8.0、温度37oC其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液浓度为：（1）0.05％胰蛋白酶＋0.02％EDTA；（2）0.25% 胰蛋白酶 多数细胞传代消化可使用0.25％胰蛋白酶＋0.02％EDTA这种消化液。

1. 如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。2. 何时须更换培养基？视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。4. 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。5. 何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。6. 培养细胞时应使用5% 或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO3 2-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5% CO2 培养细胞。7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。8. 细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。9. 悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。10. 冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后， 须立即放入37℃水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。11. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15 ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。12. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于-20 ℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。13. 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg (约1 000 rpm)，5-10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。14. 细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。15. DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4℃， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。16. 冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃30~60 分钟→ (-20℃ 30 分钟*) → -80℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃至-80℃以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20℃不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。17. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

新华社华盛顿7月6日电（记者任海军）据美国新一期《细胞－干细胞》杂志报道，加拿大研究人员对小鼠进行的研究显示，常用Ⅱ型糖尿病药物二甲双胍能促进脑细胞分裂及新细胞形成。这项研究表明，二甲双胍将来有望用于治疗阿尔茨海默氏症等疾病。 二甲双胍的主要靶点是糖尿病患者肝细胞内的一个特殊通道。加拿大分子遗传学家弗雷达·米勒等研究人员发现，二甲双胍也能激活实验鼠脑细胞中的同样通道，促进新的脑细胞生长。 对在实验室培养皿中培养的人类脑细胞而言，这一结论同样成立。米勒表示，新生的脑细胞能修复阿尔茨海默氏症等神经退行性疾病给大脑带来的不利影响。 2008年曾有研究显示，同时患糖尿病和阿尔茨海默氏症的人如果服用二甲双胍，其阿尔茨海默氏症的症状有所改善。当时科学家认为，其机制可能在于二甲双胍治疗糖尿病时改善了患者的身体状况，这有助于改善阿尔茨海默氏症症状。 米勒认为，他们的新研究表明，二甲双胍本身就有改善脑功能的作用。目前，加拿大研究人员已着手开展二甲双胍治疗神经退行性疾病的临床试验。 二甲双胍是一种具有长期用药安全记录的药品。此前曾有研究显示，二甲双胍可抑制肺部和乳腺肿瘤的生长，降低糖尿病患者患乳腺癌的风险。

关键词（必填项目）：胚胎干细胞培养目的（必填项目）：正确规范胚胎干细胞培养背景知识（选填项目）：无。原理（选填项目）：无主体内容：目录一、细胞二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代三、体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法四、移植细胞的准备细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制备。2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。贮存液 DMEM(高糖) [/s

按照欧洲法律，制药和化妆品领域用动物做实验是受到限制的，但这些产品必须保证对人体的安全，为此一些大的公司不得不寻找替代性方法。据美国科学促进会网站近日报道，最近发表在网络期刊《生物医学中心：基因组学》上的一篇论文提出了一种前卫的替代方法，用实验室培养的人类细胞替代动物实验。通过检测这些培养细胞的反应，就能区分出哪些化学品会造成过敏，并能预测过敏程度。 人们在日常的工作和生活中，每天都会接触到各种各样的化学制品，如机器油、洗涤剂、肥皂、各种日用化妆品等。而过度频繁地接触某种化学品，有可能导致过敏性皮炎、发痒和湿疹。除非找到造成过敏的化学药品源头，否则很难根治湿疹和其他过敏症状。 欧盟2009年发布的化妆品行业指导第7修正案规定，禁止在动物身上试验化妆品及其成分，这也意味着很难保证新开发的化妆品不会造成人体过敏。 瑞典伦德大学的研究人员利用全基因组特征检测了人类骨髓白血病细胞系对已知化学药品的反应。根据检测结果，他们确定了200个基因的“生物标记特征”，能精确区分出会造成过敏的化学药品。将这些特征和已知的化学品性质相对照，就能预测该化学品是否造成过敏和过敏程度。 “根据化学制品登记、评估与批准管理规定，欧盟所有新出的和原有的化学制品都要经过安全测试，这一规定涵盖的化学品数量已经超过3万种，而且还在增加。”论文合著者卡尔·伯瑞贝克教授说，这要求有合适的方法来测试，“新替代方法中所用的细胞来自人体，尽管还处于初期阶段，但其效果更快也更好。它提供了一种通过识别低免疫原性的化学品来降低过敏风险的方法，确保消费者长期使用的化学制品是安全的”。

新型细胞培养系统研制成功作者：张笑 来源：科学网美国威斯康辛大学麦迪逊分校的科学家们近日开发出一套新细胞培养系统，有望为细胞治疗提供更加一致和安全的细胞培养物。11月14日的《自然—方法学》刊登了这一成果。领导这项研究的Laura Kiessling教授表示这套系统并不昂贵，可承担多能细胞培养中的大量预估工作。这项技术“很简单”，“任何人都能使用”。目前，大部分人类胚胎干细胞的培养都是作为实验室研究用途的，而通常所采用的培养方法又容易造成各种污染。这套新系统采用一种化学合成制得的可与干细胞相结合的蛋白片段底物，并通过与特定培养基结合，可将细胞培养固定在未分化阶段达三个月或者更长时间。据报告显示，该系统亦可用于诱导多功能干细胞培养。“科学家现在普遍采用的培养系统都有着非特定的缺点，并且缺乏一致性，以致出现质量差异”， 领导这项研究的Laura Kiessling教授解释，“我们研发的这套系统特定性很好，而且并不贵”。（科学网 张笑/编译）相关仪器及方法：新型细胞培养系统 IX81显微镜 7500 Fast实时PCR系统 发光光度计

常用设备 准备室的设备： 单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。 配液室的设备： 扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。 培养室的设备： 液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。

市场上供应的大多数培养液的配方非常接近，这使得细胞很容易适应新的培养液。这里我将详细介绍一个方法，这个方法是保守的，在大多数情况下可以进行删减一些步骤。最简单最节省时间的情况是把细胞直接分装到新的培养液中，观察几代以保证细胞的生长参数是可以接受的。这个方法适于悬浮细胞，不过也很容易扩展到贴壁细胞。细胞的生长参数1. 翻倍时间（ Doubling Time ）细胞的翻倍时间在评价昆虫细胞健康程度的参数中是最容易测量的。翻倍时间应该在细胞处于对数期复制时测量，对于 Sf9 和 Sf21 细胞来说通常是介于 16-24 小时之间，不过大多数在 20-22 小时。dt=t × ln2/ln(Ct/Co) ，其中 dt 为翻倍时间， Co 为起始细胞数目， Ct 为经过时间 t 后的细胞数目， t 为 Co 和Ct 两次计数之间的间隔时间，所有的时间都以小时为单位。2. 细胞大小（ Cell Size ）细胞的大小是监测细胞健康程度的一个非常有用的参数。如果细胞是健康的，细胞的大小均一，都处于该细胞株体积正常变化范围的下限。细胞的大小在不同的细胞株变化是很大的。对于我用过的 Sf9 和 Sf21 ，典型的直径是 16-18 m m ，不过我知道有些细胞株小至 14 m m 或者大至 19 m m 仍然很健康。3. 滞后期（ Duration of Lag ）当细胞的密度较低时，会有一个滞后期，其长短取决于分装或者传代后细胞的密度。一般说来，该密度越低，滞后期越长。对于一个特定的细胞株来说，当这个密度高出一个阈值时，滞后期的长短与密度无关；而低于一个阈值时，滞后期无限长，细胞不再增殖。4. 低密度分装极限（ Low Density Split Tolerance ）能够在一个较短的滞后期（小于 12 小时）复苏的细胞形状较好。不过这是细胞株的特性，需要进行实验来确定你的细胞株的密度极限。我的细胞株有些在分装成密度为 5 × 104 细胞 /ml 时仍然可以很好复苏，有些细胞株分装成 5 × 105 细胞 /ml 就不能复苏了。5. 高密度极限（ High Density Maximum ）这是你的细胞能生长的最大密度，高于这个密度你的细胞将进入平台期。这个指标既和细胞株有关，又和使用的培养液有关。我建议先把你的细胞株培养至平台期，然后把一些分装到新鲜的培养液中以后，使剩下的继续生长至平台期，同时密切监测细胞状况。一般来说，细胞的培养要避免密度超过高密度极限的 80% 。对于我培养的细胞，这个极限值从 2 × 106 至 12 × 106 细胞 /ml 不等。实验步骤第一阶段：1. 准备合适体积的由 25% 体积新培养液和 75% 旧培养液（即细胞原先适应的培养液）组成的混合培养液 I。2. 将细胞以通常分装时使用的最低分装密度的两倍分装到混合培养液 I 中。3. 使细胞生长到通常培养时的较高密度，监测细胞生长参数。4. 继续以步骤 2 中的密度分装细胞到新鲜的混合培养液 I 中，直到生长参数达到可以接受的水平。有时候分装一次就可达到要求。5. 一旦细胞稳定下来，以通常使用的最低分装密度分装细胞至新鲜的混合培养液 I 中，同样监测细胞参数。6. 细胞达到较高密度后，继续以步骤 5 中的分装密度把细胞分装到新鲜的混合培养液 I 中，直到细胞的生长参数达到可以接受的水平。7. 如果细胞恢复到正常状态，进行第二阶段的实验。8. 如果细胞不能达到正常状态，新培养液可能不适于培养这种细胞。9. 如果细胞在新培养液中的生长参数达到平衡状态，虽然与正常状态不同，但是可以为实验接受，也可进行第二阶段的实验。第二阶段：1. 准备适量的由 50% 新培养液和 50% 旧培养液组成的混合培养液 II 。2. 将细胞以两倍最低分装密度分装至混合培养液 II 中。3. 如第一阶段一样，监测细胞生长指数，使细胞达到稳定状态。然后将分装密度降到最低分装密度，再使细胞达到稳定状态。第三阶段：步骤同第一阶段和第二阶段，使细胞适应混合培养液 III （ 75% 新培养液和 25% 旧培养液）。第四阶段：1. 步骤同第一阶段、第二阶段和第三阶段，使细胞适应新培养液。2 . 当细胞在新培养液中达到稳定后，监测细胞的生长指数，看是否波动过大。

细胞培养知识1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。 2 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

细胞培养FAQ： 1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。 2 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。 7 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 8 培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外， [font=宋

【序号】：1【作者】：张宁李小佩肖倩茹【题名】：梯度交联水凝胶用于骨髓间充质干细胞的三维培养与分化【期刊】：东南大学学报(医学版). 【年、卷、期、起止页码】：2018,37(04)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7i0-kJR0HYBJ80QN9L51zrPykMtHqC9zZyLumdUzSnd49uxratj2CePE0w9L8JUMwY&uniplatform=NZKPT

【序号】：3【作者】：张宁李小佩肖倩茹【题名】：梯度交联水凝胶用于骨髓间充质干细胞的三维培养与分化【期刊】：东南大学学报(医学版). 【年、卷、期、起止页码】：2018,37(04)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7i0-kJR0HYBJ80QN9L51zrPykMtHqC9zZyLumdUzSnd4-Vv49Lrf5qmxCA42hyYsyg&uniplatform=NZKPT

张韧，王建超，陈文庆，刘华杰，高飞，徐舸辰，林龙飞（北京清大天一科技有限公司，北京102200） 反应器悬浮培养技术是目前国内外疫苗生产的热点之一，它可以极大提高疫苗的质量和生产率。介绍了该技术在国内外疫苗生产中的研发和应用现状，表明国内该技术目前已经在口蹄疫疫苗生产中获得成功应用，利用MDCK、Vero等细胞培养生产禽流感疫苗的技术也正在积极研发中，并将逐步替代传统的鸡胚生产工艺。积极推广和应用这一新型疫苗生产技术将是我国兽用生物制品行业升级换代的必然趋势。 生物反应器；悬浮培养；微载体培养；口蹄疫；禽流感 在我国，细胞反应器悬浮培养和微载体培养技术在动物疫苗生产领域的研发和应用正成为行业技术革新、产业升级的重要内容。农业部公告第1708号中明确规定，自2012年2月1日起，各省级兽医行政管理部门停止转瓶培养生产方式的兽用细胞苗生产线项目兽药GMP验收申请。该公告对动物疫苗生产技术升级做出了强制性规定。本文就反应器细胞悬浮培养和微载体培养技术在口蹄疫疫苗和禽流感疫苗生产中的国内外应用和发展进行了综述，分析了动物疫苗产业发展趋势和我国疫苗产业技术升级所面临的机遇和挑战。1 反应器悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用口蹄疫被认为家畜传染性疾病中传染性最强的一种疾病，国际兽医局（OIE）将之列为A类传染病。2010和2011年，在亚洲、非洲都有口蹄疫局部的爆发。接种安全、高效的疫苗是预防口蹄疫疫情发生的最有效策略之一。通常主要通过浓缩技术提高口蹄疫疫苗的有效抗原量来实现其高效性；通过病毒纯化工艺、有效的病毒灭活工艺来保证疫苗的安全性。反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒能显著提高口蹄疫病毒抗原浓度。国际上先进的口蹄疫疫苗的生产工艺都采用反应器悬浮培养BHK21细胞技术、有效的病毒纯化工艺及二次病毒灭活工艺。当前，面对国内外严峻的口蹄疫防控形势，高质量的口蹄疫疫苗必将在口蹄疫防控中发挥关键作用。1.1 国外应用现状和发展趋势 BHK21细胞是繁殖口蹄疫病毒的理想宿主。20世纪60年代，许多国家实验室建立起了转瓶培养BHK21细胞繁殖口蹄疫病毒的生产系统。1962年BHK21细胞悬浮培养成功，细胞增殖迅速，并成功应用于口蹄疫病毒的生产。反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒也就成为最普遍的口蹄疫疫苗生产方式，主要集中在印度、土耳其、巴西、阿根廷等国家（表1）。印度口蹄疫生产企业使用8000L反应器生产口蹄疫疫苗，南美口蹄疫疫苗生产企业一般采用3000~5000 L反应器生产口蹄疫疫苗，口蹄疫病毒抗原146S浓度大约在2 μg/mL。因为口蹄疫疫苗保护力与146S有正相关性，这些企业根据口蹄疫病毒146S来配制疫苗有效地保证了疫苗的质量。表1 国外部分悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗企业及其生产工艺http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1375859824_small.jpg*来自作者所属公司的客户信息调查但是，这种20世纪60年代开发的口蹄疫疫苗生产工艺延续至今，存在许多技术上的缺陷。国外口蹄疫疫苗生产使用的BHK21细胞培养液是添加磷酸肉汤（Tryptosephosphate broth, TPB）或水解乳蛋白（Lactalbumin hydrolysate, LAH）的GMEM及EMEM，再补加5%~10%牛血清（表1）。不同批次间血清质量差异引起细胞培养效果不稳定，导致影响疫苗生产工艺的稳定性和疫苗质量。疫苗中残留的血清蛋白使接种动物过敏反应升高，一定程度上影响疫苗的安全性。在口蹄疫强制免疫的国家，牛血清中存在含有抗口蹄疫病毒抗体的可能性，不仅影响病毒繁殖，而且可能导致口蹄疫病毒在抗体压力下选择性变异。牛血清中潜在污染朊病毒或疯牛病病毒可给动物疫苗带来潜在的生物危害，TPB或LAH等动物来源成份也存在安全隐患。为提升产品质量及安全性，目前国外多数口蹄疫疫苗生产厂家急于将现使用的含血清生产工艺升级为不含血清生产工艺。自从20世纪的80年代起，细胞培养基（液）发展迅速，低血清细胞培养基、无血清细胞培养基、无血清无动物来源成分细胞培养基已商品化，为疫苗生产中少使用或不使用血清奠定了物质基础。1.2 国内应用现状 默克密理博北京清大天一科技有限公司（以下简称“清大天一”）在国内较早开发了BHK21低血清细胞培养基和BHK21无血清无动物来源成分细胞培养基。2008年，清大天一开发了BHK21低血清细胞培养基及反应器悬浮培养BHK21技术，并于2009年成功应用到国内一家口蹄疫疫苗生产企业中。使用该工艺生产的口蹄疫抗原146S浓度可以达到3 μg/mL左右，工艺全过程管道化操作，产品内毒素含量低，口蹄疫疫苗生产和质量显著提高，同时生产成本下降30%。2009年，清大天一成功开发了BHK21无血清无动物来源成分培养基和反应器无血清悬浮培养BHK21细胞技术，并 2010年成功应用到国内某口蹄疫生产企业。相比于含血清悬浮培养工艺，无血清悬浮培养工艺具有巨大的技术优势。从种子库复苏BHK21细胞开始，到口蹄疫病毒繁殖、直至收获的全过程，不添加任何的血清和动物来源成分，消除了血清抗体对病毒繁殖的干扰，同时减轻了纯化压力。无血清悬浮培养BHK21细胞的细胞密度可以达到5×106~6×106/mL以上，为生产高浓度口蹄疫疫苗奠定了技术基础。图1是反应器无血清培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒的工艺流程图，相比于含血清口蹄疫病毒生产工艺，因实现细胞无血清培养，工艺过程无需沉降换液。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1375859832_small.jpg 图1 4000L反应器无血清悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒工艺流程目前国内某企业使用该工艺生产的口蹄疫疫苗正处于报批阶段，其他多家口蹄疫疫苗生产企业及研究单位也在研发或寻求无血清悬浮培养生产口蹄疫疫苗的工艺。

[url=http://www.hexiyiqi.com/]离心机[/url]是一种结构复杂的高速旋转机械，它是利用离心力，不同物质在离心场中沉淀速度的差异，对混合溶液进行快速分离的专门设备，是一种将装有样品溶液的离心管、瓶或袋通过离心机转子置于离心轴上，利用转头绕轴高速旋转所产生的强大离心力，使样品中不同性质颗粒相互分离的特殊装置。可以实现样品的分析、分离。从转速看，台式离心机基本属于低速、高速离心机的范畴，因此，具有低速、高速离心机的特点。与落地式离心机相比，只不过只是尺寸和容量小一些。[align=center][url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/2012-10-17/69.html][b][img]http://www.hexiyiqi.com/d/file/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/2012-10-17/0e080cd46b2ee061b55caabaaee8cbf2.jpg[/img][/b][/url][/align][align=center][b]台式低速离心机TD5A[/b][/align]离心机的式样和型号很多，有国产的和进口的，按用途可分为分析式离心机和制备式离心机；按转速可划分为：普通离心机（低速）80000r／min；特定细胞株的功能、行为和生化特性的分析在现有技术水平上只能通过相对纯的细胞株才能弄清，然而从组织、血液和其它体液标本中获得的细胞都是不同类型细胞的混合物，并且不同细胞或同一细胞株的不同周期与其它细胞相比，其代谢过程、生物特性和理化参数大多都有差异。细胞分离技术包括离心技术、流式细胞术和细胞电泳。离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。细胞电泳是指在一定PH 值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。分离不同细胞株的方法概括起来可分为两大类：一是：根据细胞的物理学特性差异分离，包括低速离心机分离法、物理吸附法、凝胶色谱法和细胞电泳法等 二是：根据细胞的生物学特性差异分离，包括花环形成法和单层细胞免疫吸收法等。在诸多分离方法中，[url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/]低速离心机[/url]分离法根据细胞大小和密度进行分离，分离介质选择广泛，原理简单，对细胞损伤小，可适用于各种不同的研究目的，已成为生物学实验室最常规的分离工具。[align=center][url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/disulengdonglixinji/2013-06-15/228.html][b][img=台式低速冷冻离心机,550,550]http://www.hexiyiqi.com/d/file/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/2019-05-14/73cd477dd28d613eb3c077a58b94614a.jpg[/img][/b][/url][/align][align=center][b]台式低速冷冻离心机TDL5M[/b][/align]

常用设备 准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、 PH 计（测量培养用液 PH 值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（ -80℃ ）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、 CO2 孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、 4℃ 冰箱（放置 serum 和培养用液）。无菌操作基本技术 无菌室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用 3‰ 来苏尔或者新洁尔灭或者 0.5 ％过氧乙酸擦拭。2.CO2 孵箱（培养箱）灭菌：先用 3‰ 新洁尔灭擦拭，然后用 75 ％酒精擦拭或者 0.5 ％过氧乙酸，再用紫外灯照射。3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各 20-30 分钟 。4.实验后灭菌：用 75 ％酒精（ 3‰ 新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。 5.定期检测下列项目：钢瓶之CO 压力；CO2培养箱之CO２浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)；无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。6.水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。 2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75 ％酒精棉球擦净双手。 无菌操作的演示：1.凡是带入超净工作台内的酒精、 PBS 、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75 ％酒精擦拭瓶子的外表面 2.靠近酒精灯火焰操作。 3.器皿使用前必须过火灭菌 4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。 6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 器械的清洗和消毒 玻璃器械洗消：一、新的玻璃器皿的洗消： 1.自来水刷洗，除去灰尘。 2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5 ％稀盐酸中 12 小时以除去脏物、铅、砷等物。 3.刷洗、烘干： 12 小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。 4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g ：浓硫酸 200ml ：蒸馏水 1000ml ）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗 15 次，最后蒸馏水冲洗 3-5 次和用双蒸水过 3 次。 5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向 15 磅 时，维持 20-30 分钟。 7.高压消毒后烘干

一、酶消化法1、胰酶。这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要作用于细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。保存于-20度。2、胶原酶。这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下细胞。这种方法作用温和，对细胞损伤较小，但是，价格也较贵。中止同样是用血清。二、离子螯合剂 不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测细胞表面分子的话，尽量，甚至是一定不要用酶消化法。1、EDTA。用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此，配制时应调节好酸碱度。它不能被终和。因此，消化下来的细胞要洗一遍。2、商品化的无酶消化液。个人的使用经常觉得对细胞的损伤比较大，但是分离成单细胞悬液的能力确实比较强。三、物理法 直接吹打或用细胞刮子将细胞刮下来。四、冷冻法 这是本人做细胞培养时发现的方法。此方法仅能用于细胞传代时。无法使组织上的细胞脱落下来。本方法的原理，我想是因细胞冷冻后收缩，从而从培养瓶上脱落下来。优点是：对细胞损伤小，不需要中止或洗细胞，方便，不需要另外配制消化液。特别适用那些贴壁不是特别紧，又特别娇气的细胞。不足是细胞常成小片脱落。此种方法曾用于因用其它方法传代导致大量细胞死亡操作的间充质干细胞、DC细胞的培养，效果非常满意。具体过程是：1、用较多的4度的PBS洗涤一遍细胞(以6孔板为例，加1.5 ml/孔)；2、再加0.5 ml 4度的PBS，静置操作台上，很快细胞就小片脱落；3、轻轻吹打，细胞即完全脱落；4、按一定比例传代。

10月6日出版的新一期英国《自然》杂志刊登报告说，美国研究人员用人类卵细胞培养出了胚胎干细胞，虽然这项成果还存在一些缺陷，但已是“黄禹锡造假事件”后最接近培养出正常人类胚胎干细胞的成果。这一成果可能引起有关克隆问题的新一轮大争论。http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/201110/2011100911202350.jpg（图片来自原文）将体细胞中的遗传物质植入卵细胞中，将其培育成为胚胎干细胞甚至最终培养出新的个体，就是常说的克隆技术，著名的克隆羊“多利”就是用这种技术得到的。2004年，韩国研究人员黄禹锡曾宣称用这种方法培育出了人类胚胎干细胞，引起一时轰动，但后来证明这是一起造假事件。此后，许多科研人员都进行了这方面的尝试，但一直没有成功。相关研究面临的障碍是，如果先将人类卵细胞中的遗传物质去掉，再植入另一个体细胞的遗传物质，这样得到的卵细胞分裂几次后就会停止发育。而美国纽约干细胞基金实验室等机构的研究人员报告说，如果留下一部分原有卵细胞中的遗传物质，再另外加上体细胞的部分遗传物质，这样得到的卵细胞可以发育到具有70至100个细胞的囊胚阶段，达到可以提取胚胎干细胞的阶段。胚胎干细胞具备发育成各种组织和器官的潜力，如果能够培育出人类胚胎干细胞，就意味着能够培育出属于某个人自己的组织和器官，可用于个性化的医疗。当然这也会引起有关克隆人的争议。本次研究虽然能够培育出人类胚胎干细胞，但也存在一些缺陷。最重要的是这些细胞中存在3组染色体，即卵细胞原有的1组染色体和来自体细胞的2组染色体，而正常的人类细胞只有2组染色体。因此，这种人类胚胎干细胞还不具备实用性。但是《自然》杂志同时发表的社论指出，这是自“黄禹锡造假事件”后最接近培养出可用人类胚胎干细胞的成果，在大方向上证明这仍然是一条可行的道路。社论认为，这将引起新一轮的有关克隆人的大争论，甚至提出联合国有必要开始考虑制订监管克隆的规章制度。