雷公藤内酯甲对照品

雷公藤内酯醇是中药雷公藤的主要生物活性成分，具有包括抗肿瘤在内的多重生物学作用。中科院上海药物研究所缪泽鸿课题组、李援朝课题组、丁健课题组与意大利博洛尼亚大学Giovanni Capranico实验室合作，在雷公藤内酯醇及其衍生物的抗肿瘤作用和机制研究中取得阶段性进展。 在阐明C14β位羟基取代的雷公藤内酯醇衍生物具有选择性体内抗肿瘤作用 (J Med Chem. 2009; 52: 5115–5123) 的基础上，研究发现雷公藤内酯醇可升高细胞内低氧诱导因子1α(HIF-1α)水平却降低其转录活性，与其抗肿瘤作用相关 (Mol Cancer. 2010; 9:268)。已有研究显示，雷公藤内酯醇可以与通用转录因子TFIIH大亚基XPB直接结合，并引起RNA聚合酶II(RNAPII)大亚基Rpb1降解。 该合作研究深入揭示了雷公藤内酯醇作用于这一核心靶点的分子基础和意义。雷公藤内酯醇降低Rpb1水平与其细胞毒活性紧密相关，即阻滞RNAPII于基因的启动子处，减少基因启动子和外显子处染色质结合的RNAPII，增加Rpb1羧基末端结构域的磷酸化 (5位丝氨酸) 和泛素化。蛋白酶体抑制剂或CDK7抑制剂可减低雷公藤内酯醇降解Rpb1的能力。研究人员由此发现雷公藤内酯醇触发CDK7介导RNAPII降解的新模式，提出了雷公藤内酯醇结合XPB、降解RNAPII的通用机制。该机制可以很好地解释雷公藤内酯醇包括其强效抗肿瘤在内的多重治疗学特性 (Cancer Res.2012; doi:10.1158/0008-5472.CAN-12-1006)。 研究人员还受邀撰写雷公藤内酯醇专题综述，系统总结了雷公藤内酯醇的结构修饰、构效关系、作用与机制以及临床开发的研究进展 (Nat Prod Rep. 2012; 29: 457-475)。 相关论文： 1.Li Z, Zhou ZL, Miao ZH, Lin LP, Feng HJ, Tong LJ, Ding J, Li YC. Design and synthesis of novel C14-hydroxyl substituted triptolide derivatives as potential selective antitumor agents. J Med Chem. 2009; 52:5115-23. 2.Zhou ZL, Luo ZG, Yu B, Jiang Y, Chen Y, Feng JM, Dai M, Tong LJ, Li Z, Li YC, Ding J, Miao ZH. Increased accumulation of hypoxia-inducible factor-1a with reduced transcriptional activity mediates the antitumor effect of triptolide. Mol Cancer. 2010; 9:268. 3.Manzo SG, Zhou ZL, Wang YQ, Marinello J, He JX, Li YC, Ding J, Capranico J, Miao ZH. Natural product triptolide mediates cancer cell death by triggering CDK7-dependent degradation of RNA polymerase II. Cancer Res. 2012; doi:10.1158/0008-5472.CAN-12-1006. 4.Zhou ZL, Yang YX, Ding J, Li YC, Miao ZH. Triptolide: structural modifications, structure-activity relationships, bioactivities, clinical development and mechanisms. Nat Prod Rep. 2012; 29:457-75.http://www.cas.cn/ky/kyjz/201208/W020120829347054661848.jpghttp://www.cas.cn/ky/kyjz/201208/W020120829347054676369.jpg雷公藤内酯醇及其衍生物抗肿瘤研究取得阶段性进展

我的课题是有关雷公藤内酯甲的，内酯甲的分子式C30H22O3，现在要进行含量的测定，我选择的方法是高效液相，我选用C18柱，购买标准品的时候的条件我是严格执行的，但是结果却大相径庭........流动相：乙腈比水＝78比22，加上我是初次接触液相，现在出现的问题是： 1 基线跑好后进溶剂——乙腈，就会出现10min处的一个小峰，15min附近的一个较大的负峰。 2 每次进完样后用甲醇对柱子进行洗脱时都会出现一个很大的峰（约15min），峰形不好。我试着尝试用甲醇做流动相（与水比是3比1），结果在15min后又出现一个很大的峰，峰形也不好，且直到30min我检测时间结束该峰也没下来。 3 我用的色谱工作站的纵坐标单位是AU，见好多文献上是mV，这是不是和仪器的灵敏度有关，怎么修改呀？ 以上是我遇到的几个问题，请各位老师和前辈尽快给予建议和帮助，谢谢！！！

文章来源：科学网 时间：2012.05.21　　近日来自厦门大学药学院的研究人员在新研究中从传统中草药雷公藤分离出活性成分雷公藤甲素（triptolide），并在体内外实验中证实其可以调控tRXRα介导的癌细胞存活信号通路。相关研究论文发布在《Plos ONE》杂志上。　　厦门大学的曾锦章教授和张晓坤教授为这篇文章的共同通讯作者。陆娜和刘金星两位硕士研究生是该文章的共同第一作者。　　从天然产物中寻找抗肿瘤活性成分是发展抗肿瘤药物的重要策略之一，雷公藤是我国一种资源比较丰富的传统中草药，其结构多样的有效成分具有明显的抗炎、免疫抑制和抗肿瘤等作用，是开发治疗药物的一个宝藏，但雷公藤具有很大的毒性，分子靶点和作用机制不清楚，是迄今制约雷公藤发展成真正治疗药物的关键。　　在这篇文章中，研究人员从中药雷公藤中分离出活性成分雷公藤甲素，并证实其调控了tRXRα介导的癌细胞存活信号通路。研究结果显示雷公藤甲素依赖于细胞内的tRXRα表达水平强有力地诱导了癌细胞凋亡，证实了tRXRα是雷公藤甲素一个重要的细胞内靶点。　　tRXRα是核受体视黄醇X受体-α（RXRα）的一种在其N-端截短的突变体，普遍存在于各种肿瘤组织中，与其全长RXRα?主要定位于细胞核不同，tRXRα?通常转位于细胞质，通过与p85相互作用激活PI3K/AKT信号转导通路，是肿瘤微环境中大量表达的肿瘤坏死因子TNFα?所依赖的生存通道，tRXRα的高度表达对于肿瘤的生长有重要的促进作用。　　研究人员证实雷公藤甲素选择性地诱导了tRXRα降解，并抑制了tRXRα依赖的AKT活性，但却没有影响全长的RXRα。研究人员还证实雷公藤甲素靶向tRXRα强有力地激活了TNFα死亡信号，并促进了其他化疗的抗癌活性。　　新研究确定了雷公藤甲素是tRXRα依赖的存活信号通路的一个新的调控物质，从而提供了关于雷公藤甲素作用诱导癌细胞凋亡机制的新见解。雷公藤甲素代表了具有不良副效应的传统中草药天然产物最有希望的一个治疗先导物。新研究发现为开发出用于癌症治疗的改良雷公藤甲素类似物提供了分子基础和新方向。

雷公藤是一种有着悠久历史的中药，被广泛应用于抗癌、治疗炎症及自身免疫疾病。雷公藤甲素(Triptolide, TP)是雷公藤的主要活性成分之一。来自南京大学的研究人员证实在巨噬细胞中TAB1是雷公藤甲素的一个靶点。这一研究发现在线发表在《Chemistry & Biology》杂志上。论文的通讯作者是南京大学的沈萍萍（Pingping Shen）教授。其主要从事细胞应激病变过程中信号转导网络的作用机制，及与之相关的疾病如肿瘤、炎症的发病机理、药物作用机制、疾病的分子诊断方面的研究。在中国传统医学中，雷公藤(TWHf)根提取物被用于治疗诸如类风湿关节炎、全身性红斑狼疮、银屑病关节炎和白塞病（Behcet’s disease）等各种炎症和自身免疫疾病，并可有效延长器官移植物的异体移植存活。雷公藤甲素是一种二萜内酯，作为雷公藤功能提取物中主要的活性成分，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤及阻止生育等功效。雷公藤甲素及其衍生物临床试验表明了其在治疗癌症和自身免疫疾病方面具有极好的前景。一些针对雷公藤甲素各种作用潜在分子机制的研究证实，雷公藤甲素可以显著影响许多细胞类型的细胞命运，也鉴别出了一些特异的雷公藤甲素分子靶点。最成功的一项研究发现表明，在肿瘤细胞中雷公藤甲素可以共价结合人类XPB，抑制它的DNA依赖性三磷酸腺苷酶（ATPase）活性，由此提供了有关雷公藤甲素各种生物活性的一种统一的分子机制。巨噬细胞在引发、维持及消退炎症中起极其重要的作用。巨噬细胞生成各种不同的生物活性因子参与炎症有益及有害效应。当控制机制出错之时，巨噬细胞炎症反应会导致持续的炎症、组织损伤，并最终致癌。靶向巨噬细胞的治疗干预有可能为控制炎症疾病提供了一些新途径。目前，许多潜在候选药物都是通过失活巨噬细胞来消退炎症，包括白藜芦醇、辛伐他汀、莱菔硫烷及茶碱。雷公藤甲素就是这样一类药物。尽管雷公藤甲素对于巨噬细胞的免疫抑制效应某程度上已研究得很透彻。但对于雷公藤甲素调控巨噬细胞功能的分子机制还知之甚少。TAK1是MAPKKK家族中的成员，其参与TGF-b、IL-1、TNF-a或LPSs刺激的促炎细胞信号通路。TAK1需要激活蛋白TAB1来诱导它完全激活。异位表达TAB1以及TAK1，可诱导TAK1自磷酸化，由此激活TAK1激酶。因此TAK1-TAB1复合物在MAPK炎症信号通路中起重要作用。在这篇文章中，研究人员采用一种综合方法结合pull-down实验，以及药物和生物学评估，确定了在巨噬细胞中TAB1是雷公藤甲素的结合靶点。他们发现通过干扰TAK1-TAB1复合物形成雷公藤甲素抑制了TAK1的激酶活性。雷公藤甲素与TAB1的结合亲和力与雷公藤甲素在巨噬细胞中对MAPK信号通路的抑制活性高度相关。研究人员还发现TAB1蛋白373-502位点之间的氨基酸序列是雷公藤甲素互作的必要条件。这些结果表明，雷公藤甲素有可能是TAK1-TAB1复合物的一种选择性小分子抑制剂，TAB1有可能是炎症性疾病一种潜在的治疗靶点。

中药雷公藤的用途很广，它的标准品的研制方法怎样。

据新华社华盛顿10月18日电 （记者任海军）美国明尼苏达大学研究人员日前报告说，小鼠模型显示在传统中药中有悠久使用历史的天然植物产品——雷公藤甲素对治疗胰腺癌有效。 此前有研究表明，胰腺癌细胞可能含有过多HSP70蛋白，后者能保护癌细胞免于死亡。明尼苏达大学研究人员发现，雷公藤甲素可降低胰腺癌细胞中的HSP70浓度，进而减少小鼠体内的肿瘤细胞。 不过，由于雷公藤甲素不溶于水，它在小鼠体内的作用不甚理想。研究人员于是对雷公藤甲素进行加工，最终得到一种水溶性、注射用新药明尼甲素，后者可以更有效地运输到胰腺癌细胞。 研究人员在胰腺癌细胞系以及移植了人类胰腺肿瘤的小鼠中测试了新药。他们发现，该药对杀灭肿瘤细胞及缩小肿瘤效果极佳。

雷公藤红素（celastrol）主要来源于卫矛科雷公藤属的雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.，同时也存在于南蛇藤、独子藤等植物中[1]，蜂蜜中也有发现[2]。雷公藤多生于背阴多湿的山坡、山谷、溪边灌木林中，主要分布于中国东南沿海等地，朝鲜、日本亦有少数分布。雷公藤始载于《本草纲目拾遗》，在我国具有悠久的药用历史，以根入药，味苦、辛，性凉，有大毒，具有祛风、解毒、杀虫的功效。现代医学研究发现，雷公藤对肿瘤、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、免疫性肾病等多种疾病的治疗效果显著，是较为可靠的免疫抑制类中药，被称为“中草药免疫剂”[3]。从雷公藤根部提取出的雷公藤总苷包含多种活性单体成分，其药理活性良好，素有“中草药激素”之称[4]。雷公藤红素是首个从雷公藤根皮中分离得到的天然活性产物，是一种具有醌甲基结构的去甲木栓烷型五环三萜（图1），具有抗肿瘤、抗炎、抗风湿、抗肥胖等作用，常用于治疗各种肿瘤、类风湿关节炎、2型糖尿病等[5-6]。 图片 文献计量学是一门定量分析知识载体的交叉科学，是集数学、统计学、文献学为一体，注重量化的综合性知识体系。通过使用CiteSpace软件对文献进行可视化分析，能够准确把握研究现状，探索新的研究方向。雷公藤红素自2007年被Cell杂志列为最有可能、最值得开发为现代药物的5种天然化合物之一以来[7]，备受关注。本研究采用文献计量学方法，对现存的中英文有关雷公藤红素文献进行可视化处理，旨在呈现相关知识的结构、规律和分布等情况，形成对雷公藤红素的全面认知，有利于解读当前雷公藤红素的研究现状和未来发展趋势，帮助研究者更清晰、透彻地理解雷公藤红素发展现状，并为该领域的今后研究提供有价值的参考依据。 1 资料与方法 1.1 数据来源 在中国知网（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）数据库和Web of Science（WOS）数据库，分别以“雷公藤红素”和“celastrol”为检索词进行文献检索，检索年限为2000年1月1日—2023年6月30日，分别得到中文文献744篇、英文文献1 254篇。 1.2 数据筛选 人工剔除掉数据库中的重复文献、图书、报纸文章、会议论文、成果报告以及不相关的内容。 1.3 数据可视化 将CNKI及WOS的文献分别以Refwork及文本格式导出，并以download_*.txt命名。使用CiteSpace 6.1.R4对得到的数据进行去重、格式转化。设置CiteSpace的参数：（1）时间分区（time slicing）：时间段为2000年1月1日—2023年6月30日，时间切片为1；（2）节点类型（node types）：分别选择“作者（author）”“研究机构（（institution）”“关键词（keyword）”进行分析；（3）阈值选择（selection criteria）：g-index（k＝25），Top N＝50，Top N%＝10.0%；（4）剪切方式（pruning）：“作者”“研究机构”分析选择“pathfinder”“pruning sliced networks”，“关键词”分析选择再加上“pruning the merged network”。对转化的数据进行可视化分析，探究其发文量、作者共现性、研究机构共现性、关键词共现性、关键词爆发时间、关键词聚类、研究方向等。 2 结果与分析 2.1 发文趋势 分析相关论文的发文趋势有助于了解该学科的研究现状、成长速度及未来发展方向。本研究旨在深入了解雷公藤红素的发展状况，通过对CNKI和WOS数据库中的中英文文献进行系统统计，时间跨度覆盖了2000年1月1日—2023年6月30日，筛选去重后获得了中文文献674篇、英文文献1 147篇。从图2中可以清晰地观察到，近20年来雷公藤红素相关文献的年发文量经历了不同的阶段，整体趋势呈现出稳定增长，同时英文文献的数量明显高于中文文献。具体而言，可将发文量的变化分为3个主要阶段。第1阶段跨越了2000—2007年，这一时期的发展相对平稳，研究逐渐积累。第2阶段，从2008—2017年，呈现了渐进的增长态势，显示了雷公藤红素领域受到持续关注并逐渐成熟。第3阶段自2018—2022年，是一个迅猛增长的时期，且为该领域的广泛研究爆发期。需要注意的是，由于本研究截至2023年6月30日，数据统计仅覆盖到112篇，因此出现下降趋势，但并不影响前述趋势的有效性。第2阶段的增长可能与2007年Cell杂志将雷公藤红素列为最有可能也最值得开发为现代药物的5种天然化合物之一，引发广泛关注有关[7]。总地来看，雷公藤红素相关文献的年发文量呈现出上升的趋势，背后的原因可能是随着中医药现代化进程的发展推动，中医药的认可度不断提升，相关领域的研究与应用蓬勃发展。作为具有巨大潜力的天然活性成分，雷公藤红素受到越来越多研究者的关注和探索。这一趋势有望在未来继续，为该领域的研究提供有力支持。 图片 2.2 国家、机构、作者分析 2.2.1 国家分布情况 分析文献作者所在国家的分布情况有助于了解各国对雷公藤红素的研究热度，同时也有助于研究雷公藤红素的植物基原和国家影响因素。全球范围内，共有59个国家和地区参与雷公藤红素的研究，发文量前12的国家见图3。中国的发文量远超其他国家和地区，这可能是因为雷公藤红素主要来源于雷公藤或南蛇藤的根皮、茎和叶，且雷公藤属于中国传统中药，故相较于其他国家，中国对雷公藤红素的研究投入相对更多，也更关注其潜在应用和价值。此外，美国和韩国也在雷公藤红素研究中发挥了重要作用，分别贡献了220篇和63篇文献。这表明雷公藤红素的研究具有国际性的合作和影响，不仅受到中国的关注，还在全球范围内也引起了广泛兴趣。综上所述，各国在雷公藤红素研究领域的贡献不仅反映了该领域的热度，还反映了雷公藤红素作为一种有潜力的天然活性成分的国际重要性。 图片 2.2.2 作者合作网络 在CNKI数据库中，共有674篇文献涵盖了503位作者，其中发文最多的作者是张振海（7篇）。作者合作网络见图4-A，共包含503个节点和638条连线，密度为0.005 1。张振海、陈彦和瞿鼎等作者构成了1个核心的合作团队，专注于雷公藤红素给药系统及抗癌药理作用的研究。总体而言，其他作者尚未形成规模较大且完整的合作研究团队，这可能不利于雷公藤红素研究的协作发展。在WOS数据库中，共有1 147篇文献涵盖了405位作者，其中发文最多的作者是Gao Wei（17篇），主要关注雷公藤红素的生物合成研究。作者合作网络如图4-B所示，包含405个节点和371条连线，密度为0.004 5。Gao Wei、Su Ping和Huang Luqi等作者构成了另1个核心合作团队，在研究雷公藤红素药理作用的同时，更加侧重雷公藤红素的生物合成研究。总体上看，其他作者合作研究团队已有雏形，预示着雷公藤红素的研究具有巨大的发展潜力和希望。 图片 2.2.3 机构合作网络 CNKI数据库中发文量最多的机构是南京中医药大学（7篇）和南京中医药大学附属中西医结合医院（7篇），其次是苏州大学附属第一附属医院（6篇）。推测可能是由于江苏省为雷公藤主要产地之一，且该地机构对雷公藤红素研究较为重视。中文文献研究机构合作网络见图5-A，包含409个节点和211条连线，说明尚未形成完善的合作机构团队，机构间的合作研究较少，有待加强各机构间的团队合作以推动相关研究。WOS数据库中发文量最多的机构是Chinese Academy of Sciences（56篇），其次是Sichuan University（30篇）、China Academy of Chinese Medical Sciences（29篇）。英文文献研究机构合作网络见图5-B，包括405个节点和371条连线，密度为0.004 5。英文文献发表机构间的合作在上述机构的带领下，形成了庞大且完整的机构合作网络，有利于机构间的相关经验交流与合作互补，进而促进雷公藤红素的研究发展。 图片 2.3 关键词分析 关键词是文献的总结凝练，通过分析关键词能够快速地了解论文主旨，有效掌握研究热点和研究方向。 2.3.1 关键词共现分析 对CNKI数据库中雷公藤红素相关文献的关键词进行可视化共现分析，结果如图6-A所示。该关键词共现图谱中包含276个节点和403条连线，排名前30的高频关键词见表1。通过分析共现图谱和高频关键词可知，与雷公藤红素相关的前5高频关键词为凋亡、雷公藤、细胞凋亡、雷公藤甲素、增殖，出现频率分别为41、34、30、24、19次。这表明药理作用、活性成分、化合物来源均是当下研究的热点。出现频率前30的关键词可分为6个大类。（1）药理作用：药理作用是雷公藤红素研究的重点内容，相关高频关键词共有17个，包括药理作用、作用机制、多发性骨髓瘤、凋亡、细胞凋亡、增殖、乳腺癌、小胶质细胞、胶质瘤、抗肿瘤、肝癌、细胞增殖、细胞周期、内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、代谢组学。说明中文文献中药理作用研究的热点是抗肿瘤、抗炎、抗风湿。（2）化学成分：探究雷公藤红素相类似的化学成分是对雷公藤红素研究的拓展，相关高频关键词有5个，包括雷公藤红素、雷公藤甲素、含量测定、化学成分和雷公藤次碱。雷公藤甲素、雷公藤次碱与雷公藤红素均为雷公藤总苷的组成成分，具有相似的化学结构和药理活性，可以为新药源的开发提供思路。（3）植物基原：植物基原的探寻是雷公藤红素研究工作的重要部分，相关高频关键词有3个，包括雷公藤、昆明山海棠、南蛇藤。雷公藤红素主要来自于雷公藤，探究雷公藤红素的植物基原可以拓展其获取途径，选取质最优、量最大的基原植物进行培养，丰富雷公藤红素资源。（4）研究方法：研究方法的选择对研究结果有巨大影响，相关高频关键词有2个，包括分子对接、综述。说明前人对雷公藤红素的总结阐述较多，倾向于用分子对接的方法进行研究。（5）中药：雷公藤红素主要来源于中国传统药材雷公藤，相关高频关键词有2个，包括中药、中医药。表明雷公藤红素研究的背景与传统中药的关联。（6）给药系统：雷公藤红素的给药系统是近年来的新兴热点，对应的相关高频关键词为体外释放。雷公藤红素具有良好的抗肿瘤、抗风湿、抗炎活性，但其人体吸收率较低。以何种方式更好地利用雷公藤红素，成为目前亟待解决的问题。 图片 图片 对WOS数据库中雷公藤红素相关文献的关键词进行可视化分析，如图6-B所示，该关键词共现图谱包括204个节点和294条连线，节点数量较中文文献略少，排名前30的高频关键词见表2。通过分析共现图谱和高频关键词可知，英文研究中频率前5的关键词是activation、celastrol、expression、apoptosis、NF-κB，出现频率分别为213、187、184、179、143次。说明英文文献同样注重雷公藤红素的药理作用。可以大致分为5个大类。（1）药理作用：药理作用是雷公藤红素研究的重点内容，相关高频关键词共有21个，包括activation、expression、apoptosis、NF-κB、growth、inhibition、cells、oxidative stress、inflammation、cancer、induction、mechanisms、obesity、rheumatoid arthritis、down regulation、pathway、disease、cancer cells、proliferation、therapy、autophagy。说明英文文献中涉及的雷公藤红素药理作用主要包括抗肿瘤、抗肥胖、抗炎、抗风湿。与中文文献相比，英文文献雷公藤红素相关药理作用关键词更多，种类也更丰富。除此之外，英文文献与通路相关的高频关键词多于中文文献，说明对雷公藤红素在细胞层面通过信号通路对机体产生影响的研究更多。（2）化学成分：化学成分是雷公藤红素研究的基础，相关高频关键词有4个，包括celastrol、triptolide、identification、triterpene。相较于中文文献稍少，但是提到了雷公藤红素所属的三萜类成分。同时中文文献侧重报道雷公藤红素的含量测定，而英文文献侧重于雷公藤红素的检测鉴定。（3）研究方法：研究方法的选择是雷公藤红素研究中必不可少的一环，出现3个高频关键词，分别为in vitro、design、mice。相较于中文文献采用软件手段的分子对接和综述，英文文献更倾向于使用动物实验相关研究手段，2种研究方式各有优劣，应取长补短。（4）给药系统：给药系统是雷公藤红素近年来的研究热点，出现1个相关高频关键词，为nanoparticles。相较于中文文献报道的体内释放，英文文献显示已经形成较成熟的纳米给药系统。（5）植物基原：植物基原是雷公藤红素探究的重要部分，出现1个相关高频关键词，为Tripterygium wilfordii，与国内研究相比，国外在植物基原方面研究较少，这可能是因为中药材雷公藤主产于中国，国内研究有地理优势和历史渊源。这些关键词共现和高频关键词分析有助于更深入地了解英文文献中对雷公藤红素研究的关注点和趋势，为未来的研究提供了重要线索。 图片 2.3.2 关键词热点聚类分析 将关系较为紧密的关键词进行聚类分析，有助于将研究热点可视化呈现。“聚类#”后的数字越小，说明该类研究的规模越大。本研究将CNKI检索到的与雷公藤红素相关的关键词进行可视化聚类分析，见图7-A。此聚类模块值（Q）＝0.762 5，Q＞0.5，平均轮廓值（S）＝0.980，S＞0.7，说明聚类结果合理显著。将7个聚类模块分为3大类。（1）药理作用：该大类包含了聚类#0（凋亡）、聚类#2（增殖）、聚类#5（抗肿瘤）、聚类#6（抑制作用）4个小聚类，主要反映了雷公藤红素在抗肿瘤药理作用方面的研究。研究表明雷公藤红素对肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、神经胶质瘤等多种肿瘤细胞具有良好的抑制作用[8]。Ni等[9]发现，雷公藤红素能够下调抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和生存素（survivin）的表达，并有效阻断p65亚基的核转位，通过上调p27表达、调控核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），诱导肿瘤细胞周期阻滞和凋亡，从而达到抗肿瘤作用。梁柳春等[10]发现，雷公藤红素还有抗炎及免疫抑制、抗肥胖、神经保护等药理作用。（2）药物资源：该大类包括聚类#1（雷公藤）、聚类#3（中药）。雷公藤甲素主要来源于雷公藤和南蛇藤等传统中药，这些药材一直以来都在中医药中有着重要的地位。（3）化学成分：该大类包括聚类#4（雷公藤甲素），是雷公藤总苷的主要成分之一，雷公藤总苷被称为“中草药激素”，其组成成分还包括雷公藤晋碱和雷公藤次碱等萜类活性成分，具有治疗类风湿性关节炎、糖尿病肾病、紫癜性肾炎、系统性红斑狼疮等疾病的功效[11]。这些聚类分析结果有助于更清晰地了解雷公藤红素研究的热点和不同方向，为未来的研究提供了重要的指导。 图片 将WOS数据库中雷公藤红素相关文献关键词进行可视化聚类分析，见图7-B，Q＝0.766 9，Q＞0.5，S＝0.893，S＞0.7，说明聚类结果合理显著，具有实际意义。将10个聚类分为药理作用、药物资源2大类。（1）药理作用：该大类包括聚类#0（oxidative stress）、聚类#1（extracellular vesicles）、聚类#2（rheumatoid arthritis）、聚类#3（endoplasmic reticulum stress）、聚类#4（expression）、聚类#5（breast cancer）、聚类#7（inhibition）、聚类#9（activation）、聚类#10（growth）。这些关键词反映了英文文献中对雷公藤红素药理作用的研究广泛。研究表明，雷公藤红素在抗肿瘤、抗炎、抗风湿等领域有着丰富的研究内容。与中文文献相比，英文文献在雷公藤红素药理作用领域的研究范围更广泛，研究方向更多元化。（2）药用植物资源：该大类包括聚类#6（Tripterygium wilfordii）和聚类#8（Tripterygium wilfordii Hook. f.），二者含义相同，均代表雷公藤，为其拉丁名的不同写法。这表明中英文文献在药物资源领域研究报道均较为深入，同时药物基原在国内外均有较高关注度。 2.3.3 聚类热点时间分析 为了更好地展示不同时间段的热门研究方向，将图7-A的中文关键词聚类图转化为关键词聚类时间线图（图8）时间线图聚焦于不同聚类在时间维度上的分布，有利于发现不同时期的研究热点。由图8可知，2007年以前以雷公藤红素的聚类#5（抗肿瘤）和聚类#6（抑制作用）研究为主；2007年以后，聚类#0（凋亡）、聚类#1（雷公藤）、聚类#2（增殖）、聚类#3（中药）、聚类#4（雷公藤甲素）相关研究逐渐增多，且聚类#0（凋亡）的研究持续时间较长，表明这一方向的研究在不同时期都备受关注。将图7-B的英文关键词聚类图转化为关键词聚类时间线图（图9）。由图9可知，在2007年以前，WOS数据库中雷公藤红素相关的研究数量和方向较CNKI数据库更多，如聚类#10（growth）和聚类#9（activation），且全部11个聚类研究持续性均较好。总体上相较于雷公藤红素相关中文文献关键词聚类时间线图，英文的时间线图聚类更多，分布更密集，每个聚类持续时间更长。这些时间线图提供了关于雷公藤红素研究的时间演变趋势的重要信息，有助于更全面地了解不同时期的研究热点和发展方向。 图片 图片 2.3.4 关键词突现分析 关键词突现分析是将某段时间内频次变化高的关键词筛选出来，展现关键词出现的起止年份以及突变强度，可以清晰地表现出研究热点和发展趋势，预测雷公藤红素未来发展情况。WOS数据库中的雷公藤红素研究突现关键词更全面，更具有代表性，故以WOS数据库中英文研究关键词突现图为例分析雷公藤红素研究热点的变化。如图10所示，共包含25个突现关键词。其中强度最大的是“triterpene”，为10.7，持续时间为2010—2014年。2007年雷公藤红素被Cell期刊列为最有可能也是最值得开发为现代药物的5种天然化合物之一，其主要药效基团是位于A/B环上的醌甲基等结构。雷公藤红素所属三萜类化合物存在于大多数植物体内，具有多种生物活性，这也可能是“triterpene”关键词强度很高的原因之一。 图片 持续时间最长的突现关键词是“cancer cells”，从2009年持续到2018年。这说明雷公藤红素自被发现以来，其抗肿瘤作用一直备受关注，作为热点研究方向经久不衰。同时突现关键词中还有“heat shock”“kappa b activation”“inhibitor”等与抗肿瘤相关。雷公藤红素已被发现对肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、神经胶质瘤等多种肿瘤细胞具有良好的抑制作用。“drug delivery”和“delivery”分别成为2018年和2019的突现关键词，说明在雷公藤红素药理作用研究较为完善的基础上，大量学者开始关注给药系统的研究。尽管雷公藤红素具有良好的药理活性，但其口服生物利用度较低，毒性较大，导致其临床应用受到限制，因此给药系统成为近年来新的研究热点。靶向叶酸受体和线粒体的载体雷公藤红素聚酰胺-胺树枝状聚合物、透明质酸包被的线粒体靶向脂质体、尺寸可控的雷公藤红素纳米颗粒等相关研究陆续出现，能够在降低雷公藤红素自身毒性、提高口服生物利用度的同时，丰富雷公藤红素给药系统[12-14]。这些研究进展为雷公藤红素更广泛的应用提供了可能性。 2.4 高被引文献分析 文献引用量是反映当前研究情况和未来发展方向的重要指标。CNKI数据库中引用次数排名前10的雷公藤红素相关文献见表3。其中被引频次最多的是出自《中华肿瘤杂志》的“雷公藤红素抑制血管生成的实验研究”，被引170次，该研究通过测定雷公藤红素对血管内皮细胞株增殖的影响，观察其对血管内皮细胞株迁移、小管形成和鸡胚尿囊膜血管生成的影响，发现雷公藤红素可以抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和小管形成，并具有抑制鸡胚尿囊膜血管生成的作用，该研究说明雷公藤红素具有明显抑制血管生成的作用。抗肿瘤作为雷公藤红素最重要的药理作用之一，除了被引频次第1的文献外，被引频次第2、5的文献“雷公藤红素抑制血管内皮细胞株增殖的体外研究”和“雷公藤红素对U937细胞Notch 1、NF-κB信号蛋白通路的调控作用”都与抗肿瘤作用相关，说明雷公藤红素抑制肿瘤生长的作用及其机制一直是研究的重点方向。 图片 被引频次排第4的文献是出自《中华结核和呼吸杂志》的“雷公藤红素抑制支气管哮喘小鼠气道炎症的实验研究”，共被引用61次。该研究发现雷公藤红素可减少哮喘模型小鼠肺组织炎性细胞浸润，降低肺组织干细胞因子蛋白表达强度，证实雷公藤红素具有支气管抗炎作用。另外2篇文献“雷公藤红素对小鼠的免疫抑制作用及其对IL-6 mRNA表达影响的研究”和“雷公藤红素对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中RANKL、OPG及炎性因子表达的影响”同样涉及雷公藤红素的抗炎作用和作用机制。 出自《中草药》的“HPLC法测定雷公藤及其片剂中雷公藤红素”一文中建立了快速高效的雷公藤红素HPLC测定方法，为进一步研究雷公藤红素的化学成分提供了理论基础。“环境胁迫对雷公藤中雷公藤红素含量的影响”则探讨了水分、光照、土壤氮含量的轻度胁迫对雷公藤幼苗中雷公藤红素含量的影响，为提高雷公藤药材品质提供参考。“雷公藤红素的研究进展”为综述性论文，内容丰富广泛，涵盖了雷公藤红素提取工艺、含量分析、药理活性等多项内容。该文被引量较多，较为经典，对雷公藤未来的研究具有参考意义。 WOS数据库中引用量前10的英文文献如表4所示。被引频次最多的文献是2010年在Cancer and Metastasis Reviews杂志发表的“Regulation of survival，proliferation，invasion，angiogenesis，and metastasis of tumor cells through modulation of inflammatory pathways by nutraceuticals”，被引用170次。该研究探索了饮食与健康之间的联系，对饮食习惯预防癌症进行着重分析，讨论包含雷公藤红素在内的香料、豆类、水果、坚果、蔬菜等食物通过调节炎症途径影响肿瘤细胞的生存、增殖、侵袭、血管生成和转移。该文献阐述了肿瘤形成的原因和抑制肿瘤的方式，有助于更好地理解雷公藤红素的抗肿瘤作用。值得一提的是，英文文献被引频次第2、4、5、6、8、10亦与雷公藤红素抗肿瘤的药理作用相关，且多数提到了抗肿瘤通路，说明雷公藤红素抗肿瘤研究一直是一个备受关注且不断深入的研究热点。 图片 “Treatment of obesity with celastrol”揭示了雷公藤红素通过增强瘦素敏感性，抑制食物摄入，阻断能量消耗的减少，从而显著减轻了高瘦素血症饮食诱导的肥胖小鼠体质量，该文献被引频次排名第3位。肥胖一直是人类长期面临的问题之一，也是雷公藤红素未来研究方向之一。“Celastrols as inducers of the heat shock response and cytoprotection”被引342次，该研究发现雷公藤红素能够刺激基因转录，该功能类似于热应激的动力学激活热休克转录因子，从而对致命细胞应激表现出细胞保护作用。该研究表明雷公藤红素有望成为一类新的热休克反应调节剂。排名第5的文献“Chemical and biological approaches synergize to ameliorate protein-folding diseases”被引313次，该研究证明通过使用小分子蛋白稳定调节因子，可以增强先天细胞蛋白稳态，有望改善功能性蛋白失

[size=15px][font=宋体]金黄色葡萄球菌（[/font][font=&]Staphylococcus aureus[/font][font=宋体]）是医院感染最常见的病原体，已成为全球主要的公共卫生威胁之一。随着“超级细菌”耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（[/font][font=&]MRSA[i][/i][/font][font=宋体]）的出现和迅速传播，治疗金黄色葡萄球菌感染变得愈发困难，临床上迫切需要发现新的超级抗生素来应对超级细菌的威胁。[/font][font=&][/font][/size] [size=15px][font=宋体][b]天然产物雷公藤红素[i][/i]在体外和体内均能有效对抗[/b][/font][b][font=&]MRSA[/font][font=宋体]，且雷公藤红素靶向Δ[/font][font=&]1-[/font][font=宋体]吡咯啉[/font][font=&]-5-[/font][font=宋体]羧酸脱氢酶（Δ[/font][font=&]1-Pyrroline-5-Carboxylate Dehydrogenase[/font][font=宋体]，[/font][font=&]P5CDH[/font][font=宋体]）发挥抗[/font][font=&]MRSA[/font][font=宋体]作用。机制上，[/font][font=宋体]雷公藤红素通过与[/font][font=&] P5CDH [/font][font=宋体]结合诱导氧化应激[i][/i]并抑制[/font][font=&] DNA [/font][font=宋体]合成。[/font][/b][font=宋体]这项研究的结果表明雷公藤红素是一种有前途的先导化合物，并证实[/font][font=&] P5CDH [/font][font=宋体]是开发抗[/font][font=&] MRSA [/font][font=宋体]新型药物的潜在靶点。[/font][/size] [size=15px][b][font=&]1[/font][font=宋体]、雷公藤红素在体外表现出对抗[/font][font=&] MRSA [/font][font=宋体]的强效活性[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]作者首先通过[/font][b][font=宋体]体外实验[/font][/b][font=宋体]发现雷公藤红素对[/font][font=&]MRSA USA300[/font][font=宋体]表现出显著的抗菌活性，最低杀菌浓度（[/font][font=&]MBC[/font][font=宋体]）为[/font][font=&]8μg mL ?1[/font][font=宋体]，在浓度为[/font][font=&]1[/font][font=宋体]和[/font][font=&]2 μg mL[/font][font=&]?[/font][font=&]1[/font][font=宋体]时，雷公藤红素完全抑制了菌株的生长，根据[/font][font=&]MBC[/font][font=宋体]和[/font][font=&]MIC[/font][font=宋体]值确认雷公藤红素是一种很有前途的抗[/font][font=&] MRSA[/font][font=宋体]药物[/font][font=宋体]。[/font][font=&][/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]2[/font][font=宋体]、雷公藤红素在不同感染模型中表现出潜在的治疗能力[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]作者通过[/font][b][font=宋体]体内实验[/font][/b][font=宋体]评估雷公藤红素在[/font][font=&]3[/font][font=宋体]种不同感染模型（大蜡螟幼虫模型和两种小鼠感染模型）中的治疗能力，发现雷公藤红素提高了被[/font][font=&]MRSA USA300[/font][font=宋体]感染的大蜡螟幼虫的存活率，改善小鼠的[/font][font=&]MRSA[/font][font=宋体]皮肤感染，提高[/font][font=&]MRSA[/font][font=宋体]菌血症[i][/i]模型的存活率。这些结果表明雷公藤红素具有优异的体内抗[/font][font=&]MRSA[/font][font=宋体]活性[/font][font=宋体]。[/font][font=&][/font][/size] [align=center][img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img][/align][align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]3[/font][font=宋体]、多组学分析发现新型抗[/font][font=&] MRSA [/font][font=宋体]靶点[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]接着研究人员[/font][b][font=宋体]通过转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析了[/font][font=&]MRSA[/font][font=宋体]治疗后的细胞变化[/font][/b][font=宋体]，揭示了雷公藤红素抗[/font][font=&]MRSA[/font][font=宋体]活性的可能靶点，多组学分析表明雷公藤红素上调应激反应[i][/i]和氧化磷酸化，而下调氨基酸和核苷酸、天冬氨酸、谷氨酸和嘧啶代谢的生物合成。这些代谢通路与[/font][font=&]Δ1-[/font][font=宋体]吡咯啉[/font][font=&]-5-[/font][font=宋体]羧酸脱氢酶（[/font][font=&]P5CDH, [/font][font=宋体]由[/font][font=&]rocA[/font][font=宋体]基因编码）相关。因此，作者推测[/font][font=&]P5CDH[/font][font=宋体]是抗菌药物开发的潜在靶点 [/font][/size] [size=15px][b][font=&]4[/font][font=宋体]、[/font][font=&]P5CDH [/font][font=宋体]是一个潜在的抗菌靶点[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][b][font=宋体]为了进一步确定[/font][font=&]P5CDH[/font][font=宋体]作为潜在的抗菌靶点，作者构建了[/font][font=&]MRSA USA300 rocA[/font][font=宋体]敲除菌株和补充菌株（Δ[/font][font=&]:: rocA [/font][font=宋体]）[/font][/b][font=宋体]，发现[/font][font=&]rocA[/font][font=宋体]缺失显著损害细菌生长，而补充菌株在生长方面与[/font][font=&]WT[/font][font=宋体]相同。此外，突变后雷公藤红素对[/font][font=&]MRSA[/font][font=宋体]的[/font][font=&]MIC[/font][font=宋体]由[/font][font=&]1[/font][font=宋体]变为[/font][font=&]8[/font][font=宋体]μ[/font][font=&]g mL[/font][font=&]?[/font][font=&]1[/font][font=宋体]，而补充[/font][font=&]rocA[/font][font=宋体]基因后又恢复到[/font][font=&]1[/font][font=宋体]μ[/font][font=&]g mL[/font][font=&]?[/font][font=&]1[/font][font=宋体]，说明雷公藤红素的抗菌活性部分是通过抑制[/font][font=&]P5CDH[/font][font=宋体]来实现的[/font][/size] [size=15px][b][font=&]5[/font][font=宋体]、雷公藤红素与[/font][font=&]P5CDH[/font][font=宋体]直接结合[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][b][font=宋体]由于蛋白质组学分析中雷公藤红素并没有显著影响[/font][font=&]P5CDH[/font][font=宋体]的表达，因此研究推测雷公藤红素通过靶向[/font][font=&]P5CDH[/font][font=宋体]并影响其功能来发挥抗菌活性。[/font][/b][font=宋体]接着通过分子对接、[/font][font=&]BLI[/font][font=宋体]、[/font][font=&]CETSA[/font][font=宋体]、圆二色谱和酶活性测定，证实雷公藤红素能够直接结合影响[/font][font=&]P5CDH[/font][font=宋体]，影响其酶活 [/font][/size] [size=15px][b][font=&]6[/font][font=宋体]、[/font][font=&]K205A[/font][font=宋体]和[/font][font=&]E208A[/font][font=宋体]是[/font][font=&]P5CDH[/font][font=宋体]与雷公藤红素的关键结合位点[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]接着，[/font][b][font=宋体]作者采用了分子对接和定点诱变技术揭示雷公藤红素结合位点[/font][/b][font=宋体]。分子对接成功预测出[/font][font=&]3[/font][font=宋体]个结合位点，分别为[/font][font=&]Lys205[/font][font=宋体]（[/font][font=&]K205A[/font][font=宋体]）、[/font][font=&]Glu208[/font][font=宋体]（[/font][font=&]E208A[/font][font=宋体]）和[/font][font=&]Asp209[/font][font=宋体]（[/font][font=&]D209A[/font][font=宋体]）。随后，作者构建了三个突变质粒并表达相关蛋白。[/font][b][font=&]BLI[/font][font=宋体]分析显示[/font][font=&]K205[/font][font=宋体]和[/font][font=&]E208[/font][font=宋体]突变后雷公藤红素结合能力显著降低，且不再抑制其酶活，表明[/font][font=&]K205[/font][font=宋体]和[/font][font=&]E208[/font][font=宋体]是结合的关键残基[/font][/b][/size] [size=15px][b][font=&]7[/font][font=宋体]、雷公藤红素促进氧化损伤[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]有文献报道[/font][font=&]P5CDH[/font][font=宋体]通过影响[/font][font=&]P5C-Pro[/font][font=宋体]循环的平衡进而对产生[/font][font=&]ROS[/font][font=宋体]至关重要，[/font][b][font=宋体]作者推测雷公藤红素可能通过氧化损伤发挥抗菌作用。通过对[/font][font=&]WT [/font][font=宋体]或[/font][font=&] Δ:: rocA [/font][font=宋体]组、[/font][font=&]Δ rocA[/font][font=宋体]组菌株采用雷公藤红素或乙醛酸（[/font][font=&]P5CDH[/font][font=宋体]抑制剂）[/font][/b][font=宋体]，发现雷公藤红素扰乱[/font][font=&]P5C-Pro[/font][font=宋体]循环的平衡。此外，[/font][font=&]ΔrocA[/font][font=宋体]、雷公藤红素或抑制剂处理组的[/font][font=&]ROS[/font][font=宋体]水平升高。其中，雷公藤红素治疗组[/font][font=&]ROS[/font][font=宋体]升高最为显著，可能是因为雷公藤红素是一种多途径抗菌剂，可以通过多种方式刺激[/font][font=&]ROS[/font][font=宋体]生成。结果表明氧化损伤是雷公藤红素重要的抗菌机制[/font][/size] [size=15px][b][font=&]8[/font][font=宋体]、雷公藤红素诱导细菌死亡[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]为研究雷公藤红素处理后[/font][font=&]MRSA[/font][font=宋体]死亡情况，作者用[/font][font=&]DAPI[/font][font=宋体]标记细胞中的[/font][font=&]DNA[/font][font=宋体]，在[/font][font=&]ΔrocA[/font][font=宋体]、雷公藤红素或抑制剂处理组均观察到染色体凝聚，提示有细菌死亡发生，特别是雷公藤红素处理的细菌出现了凋亡小体形成和萎缩等细菌死亡形态学特征。在[/font][font=&]TUNEL[/font][font=宋体]染色实验中，与未接受药物处理的[/font][font=&]WT[/font][font=宋体]细胞相比，雷公藤红素处理的[/font][font=&]WT[/font][font=宋体]细菌荧光较强，提示有[/font][font=&]DNA[/font][font=宋体]双链断裂出现 [/font][/size] [size=15px][b][font=&]9[/font][font=宋体]、雷公藤红素抑制[/font][font=&]DNA[/font][font=宋体]合成[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]前面多组学结果发现雷公藤红素影响谷氨酸和嘧啶代谢的生物合成，该过程与[/font][font=&]DNA[/font][font=宋体]合成密切相关，[/font][b][font=宋体]作者推测雷公藤红素可能通过抑制[/font][font=&]DNA[/font][font=宋体]合成发挥抗[/font][font=&]MRSA[/font][font=宋体]活性。[/font][/b][font=宋体]结果显示，用雷公藤红素或抑制剂和[/font][font=&]ΔrocA[/font][font=宋体]组处理的细菌中[/font][font=&]NADP+/NADPH[/font][font=宋体]比率降低，表明[/font][font=&]5-[/font][font=宋体]磷酸核糖的合成受到抑制。[/font][font=&]Asp[/font][font=宋体]是嘌呤和嘧啶合成的重要前体，作者发现[/font][font=&]Glu[/font][font=宋体]和[/font][font=&]Asp[/font][font=宋体]的减少。此外，作者观察到[/font][font=&]DNA[/font][font=宋体]含量下降。考虑到[/font][font=&]DNA[/font][font=宋体]能够影响蛋白质的表达，作者也观察到[/font][font=&]ΔrocA[/font][font=宋体]、雷公藤红素或抑制剂处理组的蛋白质含量均显著降低，表明[/font][font=&]P5CDH[/font][font=宋体]能够影响蛋白质的合成。总之，雷公藤红素可以抑制[/font][font=&]DNA[/font][font=宋体]合成来对抗[/font][font=&]MRSA[/font][/size] [size=15px][b][font=宋体]总结[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]该研究表明，雷公藤红素对标准和临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株表现出强大的抗菌活性，并且耐药性发展水平较低。这种抗菌活性的机制被认为是基于与[/font][font=&]P5CDH[/font][font=宋体]的竞争性结合，从而激活多种途径。雷公藤红素是开发用于对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相关感染的新型抗生素药物的有希望的候选药物[/font][/size]

1、雷公藤红素抑制CML细胞增殖作者首先进行了网络药理学分析，以评估在治疗CML方面最有效的天然产物。通过对3882种天然产物进行了网络药理学分析，发现从传统中药“雷公藤”（Tripterygium wilfordii）根皮中提取的五环三萜雷公藤红素在抑制CML方面排名第一。为了验证网络药理学筛选的可靠性，作者在CML细胞中进行细胞活力测定。选择18β-甘草次酸作为阴参，因为它与雷公藤红素的结构最相似，但在3882 种天然产物中预测得分不高，选择17-AAG（HSP90抑制剂，已有文章报道HSP90是雷公藤红素的靶点）和TKI 药物伊马替尼作为阳参。结果表明雷公藤红素、17-AAG和伊马替尼均能有效抑制CML细胞增殖，而18β-甘草次酸几乎不影响细胞生长。作者进一步开展细胞实验，发现雷公藤红素对K562和K562T315I细胞表现出抗增殖活性，诱导细胞凋亡。尽管对雷公藤红素的研究很深入，但尚未系统地鉴定出雷公藤红素在CML中的直接蛋白质靶点，尤其是在耐药性CML细胞中 雷公藤红素抑制CML细胞增殖2、雷公藤红素处理后 K562T315I 细胞的转录组和蛋白质组学分析接着，作者通过RNA 测序发现富集的通路包括铁死亡、蛋白水解调节、响应p53介导的DNA损伤等。作者还进行了蛋白质组学分析雷公藤红素对K562T315I细胞中蛋白质表达水平的调节，下调蛋白主要富集于DNA和RNA代谢途径以及 DNA损伤反应，以及蛋白质加工途径。MCODE分析发现“对DNA损伤刺激的反应”和“对未折叠蛋白的反应”分别是最具特征性的途径。雷公藤红素与其已知靶标HSP90的相互作用可能是“对未折叠蛋白的反应”上调的关键贡献事件。而目前尚未有报道称雷公藤红素的直接蛋白质靶标与“对DNA损伤刺激的反应”途径有关（ 雷公藤红素处理后 K562T315I 细胞的定量蛋白质组学分析3、雷公藤红素处理后 K562T315I 细胞的CETSA-MS分析作者接着检测了K562T315I细胞中celastrol处理后可溶性蛋白质水平的变化，在雷公藤红素处理后鉴定了178种差异溶解蛋白质，主要位于DNA中心区域，包括细胞核和线粒体，更具体地说是在DNA损伤位点。此外，“分子伴侣复合物”中溶解度降低，这可能是由于雷公藤红素和HSP90之间的互作所致 雷公藤红素处理后 K562T315I细胞的CETSA-MS分析4、雷公藤红素诱导 K562T315I 细胞DNA损伤对 K562T315I细胞经雷公藤红素处理后总蛋白和可溶性蛋白水平变化的系统分析表明，雷公藤红素主要诱导K562T315I细胞中的DNA损伤和未折叠蛋白反应。因此，作者进行了实验来验证这些观察结果。结果显示雷公藤红素显著诱导γ-H2AX（DNA损伤的常见标志物）的表达，并降低DNA损伤修复相关蛋白FANCD2水平，彗星试验进一步证实了雷公藤红素促进的DNA损伤（ 雷公藤红素诱导 K562T315I细胞DNA损伤5、雷公藤红素在K562T315I细胞中的靶点鉴定然后，作者在细胞裂解物中开展质谱耦合等温剂量反应-细胞热位移分析（MS-ITDR-CETSA）实验，以确定雷公藤红素的直接蛋白质靶标，特别是那些参与DNA损伤反应的蛋白质靶标。在检测到的3393种蛋白质中，有12种蛋白质表现出热稳定性的显著变化，代表了最有潜力且可信度高的靶标蛋白质。值得注意的是，雷公藤红素的已知靶标HSP90 (HSP90AA1和HSP90AB1) 的热稳定性仅表现出很小的变化，并且没有超过阈值。对这12个潜在靶标和定量蛋白质组学以及CETSA-MS分析的差异蛋白进行PPI分析，发现 YY1均为最紧密相关的蛋白质。因此，YY1与所有这些DEP/DSP的关联节点数量最多，并且可能是与DNA损伤相关的最重要的靶标。现有研究表明，YY1作为转录因子，可以调节参与DNA修复和细胞存活的各种蛋白质的表达，以响应DNA损伤。此外，HMCES已被确定为通过屏蔽脱碱基位点来保护基因组完整性免受氧化碱基损伤的关键蛋白。因此，作者继续通过蛋白质印迹结合细胞热位移分析（WB-CETSA）验证了celastrol与YY1和HMCES的互作。同样，报道的阳性对照HSP90蛋白也显示出明显的热稳定性增加（ 雷公藤红素在K562T315I细胞中的靶点鉴定6、雷公藤红素与YY1和HMCES相互作用的验证为了进一步验证celastrol与YY1和HMCES的直接相互作用，合成了可点击炔烃标签功能化celastrol探针（Cel-P），该探针保留了celastrol对K562T315I细胞的抑制活性。利用该探针开展Pulldown实验发现Cel-P 能够成功地从细胞中拉下HMCES和HSP90蛋白，但由于尚不清楚的原因，在蛋白质印迹膜上的下拉样本中未检测到YY1。随后，表达并纯化重组YY1（rYY1）蛋白，发现随着Cel-P浓度的增加，rYY1的标记以剂量依赖性方式增加 雷公藤红素与YY1和HMCES相互作用的验证7、雷公藤红素通过靶向YY1和HMCES诱导DNA损伤在验证了celastrol与YY1和HMCES之间的相互作用后，作者继续在K562T315I细胞中敲低 YY1或HMCES。结果显示YY1或HMCES的敲低显著增加了DNA损伤的发生率，同时影响细胞生长，增强细胞对celastrol的敏感性。此外，与HMCES相比，YY1敲低对细胞的影响更为显著，表明YY1发挥着更为重要的作用。对接分析显示，与HMCES相比，celastrol对YY1的亲和力略强，且Celastrol与YY1上的Leu132和Val316形成氢键，与HMCES的Glu127、Arg130和Arg137形成氢键 雷公藤红素通过靶向 YY1 和 HMCES 诱导 DNA 损伤鉴于YY1在雷公藤红素诱导的DNA损伤反应中发挥关键作用，作者对YY1蛋白进行了进一步实验。发现YY1过表达对细胞生长没有显著影响，但减轻了雷公藤红素引起的细胞死亡和DNA损伤，且通过裂解的PARP1和Caspase-3水平发现YY1表达与雷公藤红素诱导的细胞凋亡呈负相关。使用双荧光素酶报告基因发现雷公藤红素显著抑制了YY1的转录活性，BLI结合试验发现celastrol 可以与 rYY1 结合（图8）。图8 YY1在雷公藤红素诱导的 K562T315I细胞DNA损伤和细胞死亡中起关键作用总结研究使用多组学方法对雷公藤红素的作用机理进行了系统研究，利用蛋白质组范围的无标记靶标反卷积方法MS-CETSA来识别雷公藤红素的蛋白质靶标。研究不仅验证了雷公藤红素通过靶向HSP90来诱导未折叠蛋白反应，而且还发现它通过直接靶向耐药 K562T315ICML 细胞中的YY1和HMCES来诱导DNA损伤（图9）。研究有助于更好地理解雷公藤红素的多方面机制。研究提供了一种有效的系统药理学工作流程范例，该范例集成了网络药理学分析、蛋白质丰度和溶解度测量以及 MS-CETSA，以揭示任何天然产物或活性化合物的作用机理。

DB33 T 779-2010 雷公藤种植技术规范

作者：张玉题目：雷公藤中有效成分的提取分离与微球制剂的制备期刊：天津大学年份：2008链接：http://www.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CMFD&QueryID=4&CurRec=130&dbname=CMFDLAST2010&filename=2009073152.nh&urlid=&yx=

[size=15px][font=宋体]雷公藤（[/font][font=&]Tripterygium wilfordii[/font][font=宋体]）在我国多地均有分布，具有悠久的药用历史，广泛用于治疗类风湿关节炎[i][/i]，在《本草纲目》等有记载。雷公藤红素（[/font][font=&]Celastrol[/font][font=宋体]）是从雷公藤植物中提取的一种生物活性分子，对于治疗自身免疫疾病和肿瘤等有显著作用，已被证明具有抗炎特性，然而，其作用机制尚未完全阐明。[/font][font=&][/font][/size] [size=15px][b][font=&]1[/font][font=宋体]、[/font][font=&]COMMD3/8 [/font][font=宋体]复合物缺乏会损害体液免疫[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=&][font=宋体]COMMD3[/font][/font][/size][font=宋体][back=url(&]和[/back][/font][font=&][font=宋体][back=url(&]COMMD8[/back][/font][/font][font=宋体][back=url(&]是[/back][/font][font=&][font=宋体][back=url(&]COMMD[/back][/font][/font][font=宋体][back=url(&]蛋白家族成员，在诱导体液免疫反应过程中形成了介导[/back][/font][font=&][font=宋体][back=url(&]B[/back][/font][/font][font=宋体][back=url(&]细胞迁移所必需的异二聚体，在调节免疫反应方面起着重要作用。作者构建了[/back][/font][font=&][font=宋体][back=url(&]Commd3[/back][/font][/font][font=宋体][back=url(&]基因敲除小鼠（在没有另一个蛋白的情况下，[/back][/font][font=&][font=宋体][back=url(&]COMMD3[/back][/font][/font][font=宋体][back=url(&]或[/back][/font][font=&][font=宋体][back=url(&]COMMD8[/back][/font][/font][font=宋体][back=url(&]蛋白会被蛋白酶体降解），发现[/back][/font][font=&][font=宋体][back=url(&]COMMD3[/back][/font][/font][font=宋体][back=url(&]缺失导致生发中心（[/back][/font][font=&][font=宋体][back=url(&]germinal center[/back][/font][/font][font=宋体][back=url(&]，[/back][/font][font=&][font=宋体][back=url(&]GC[/back][/font][/font][font=宋体][back=url(&]）的[/back][/font][font=&][font=宋体][back=url(&]B[/back][/font][/font][font=宋体][back=url(&]细胞数量降低。[/back]为了分析[/font][font=&]COMMD3[/font][font=宋体]缺乏对免疫细胞的整体影响，作者通过质谱流式（[/font][font=&]CyTOF[/font][font=宋体]）和[/font][font=&]scRNA-seq[/font][font=宋体]均发现[/font][font=&]Commd3[/font][font=宋体]缺失降低[/font][font=&]GC B [/font][font=宋体]细胞的比例。这些发现表明[/font][font=&]B[/font][font=宋体]细胞受到[/font][font=&]COMMD3/8[/font][font=宋体]复合物缺乏的选择性影响[/font][font=宋体]。[/font][font=&][/font] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]2[/font][font=宋体]、[/font][font=&]COMMD3/8 [/font][font=宋体]复合物缺乏可缓解关节炎[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]鉴于[/font][font=&]COMMD3/8[/font][font=宋体]复合物在体液免疫反应中的重要作用以及[/font][font=&]B[/font][font=宋体]细胞靶向疗法在类风湿关节炎（[/font][font=&]RA[/font][font=宋体]，[/font][font=&]Rheumatoid Arthritis[/font][font=宋体]）中的已知疗效，作者利用胶原诱导性关节炎[i][/i]（[/font][font=&]CIA[/font][font=宋体]，一种[/font][font=&]RA[/font][font=宋体]小鼠模型）来测试[/font][font=&]COMMD3/8[/font][font=宋体]复合物在自身免疫性疾病中的作用。结果显示[/font][font=&]COMMD3/8[/font][font=宋体]复合物缺失还改善了[/font][font=&]CIA[/font][font=宋体]，且在[/font][font=&]B[/font][font=宋体]细胞中表达的[/font][font=&]COMMD3/8[/font][font=宋体]复合物在[/font][font=&]CIA[/font][font=宋体]发病机制中起着重要作用。结果表明针对[/font][font=&]COMMD3/8[/font][font=宋体]复合物可能是治疗自身免疫性疾病的有前途的策略[/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]3[/font][font=宋体]、雷公藤红素靶向抑制[/font][font=&]COMMD3[/font][font=宋体]与[/font][font=&]COMMD8[/font][font=宋体]结合[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]接着，为了寻找[/font][font=&]COMMD3[/font][font=宋体]与[/font][font=&]COMMD8[/font][font=宋体]结合的有效抑制剂，[/font][/size][font=宋体][size=15px]研究人员通过天然产物化合物库[/size][/font][size=15px][font=宋体]（[/font][font=&]2555[/font][font=宋体]种化合物）开展筛选，鉴定出雷公藤红素（[/font][font=&]Celastrol[/font][font=宋体]）是一种破坏[/font][font=&]COMMD3/8[/font][font=宋体]复合物的最有效的化合物，并通过生物发光共振能量转移（[/font][font=&]BRET[/font][font=宋体]）分析和[/font][font=&]CO-IP[/font][font=宋体]验证了雷公藤红素抑制[/font][font=&]COMMD3[/font][font=宋体]和[/font][font=&]COMMD8[/font][font=宋体]结合。此外，雷公藤红素处理加速了[/font][font=&]COMMD3[/font][font=宋体]和[/font][font=&]COMMD8[/font][font=宋体]的降解[/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]4[/font][font=宋体]、[/font][/b][/size][size=15px][b][font=宋体]雷公藤红素[/font][/b][/size][size=15px][b][font=宋体]与[/font][font=&] COMMD3 [/font][font=宋体]上的[/font][font=&] C170 [/font][font=宋体]共价结合[/font][font=&][/font][/b][/size][size=15px][font=宋体]雷公藤红素在[/font][font=&]C6[/font][font=宋体]处有一个亲电位点，半胱氨酸残基的亲核硫醇基团已证实可在此发生反应形成共价键。为了测试[/font][font=&] C6 [/font][font=宋体]原子是否参与了雷公藤红素与[/font][font=&] COMMD3/8 [/font][font=宋体]复合物的相互作用，作者获得了二氢雷公藤红素（雷公藤红素衍生物），其中[/font][font=&]C6[/font][font=宋体]位被还原并且失去了进行亲核加成的能力，发现二氢雷公藤红素不会破坏活细胞或纯化形式的[/font][font=&]COMMD3/8 [/font][font=宋体]复合物，表明雷公藤红素可能与[/font][font=&]COMMD3[/font][font=宋体]或[/font][font=&]COMMD8[/font][font=宋体]上的半胱氨酸残基形成共价键，从而解离[/font][font=&]COMMD3/8 [/font][font=宋体]复合物。[/font][font=&][/font][/size] [size=15px][font=宋体]在[/font][font=&]COMMD3[/font][font=宋体]和[/font][font=&]COMMD8[/font][font=宋体]上的半胱氨酸残基中，[/font][font=&]COMMD3[/font][font=宋体]上的[/font][font=&]C170[/font][font=宋体]是位于[/font][font=&]COMM[/font][font=宋体]结构域内的唯一半胱氨酸残基，两个[/font][font=&]COMMD[/font][font=宋体]蛋白通过该结构域相关联。作者，将[/font][font=&]COMMD3[/font][font=宋体]上[/font][font=&]170[/font][font=宋体]位的[/font][font=&]C[/font][font=宋体]突变为[/font][font=&]A[/font][font=宋体]，发现含有[/font][font=&] COMMD3 C170A[/font][font=宋体]的[/font][font=&]COMMD3/8[/font][font=宋体]复合物不再被活细胞中的雷公藤红素解离，表明[/font][font=&]COMMD3[/font][font=宋体]上的[/font][font=&]C170[/font][font=宋体]可能作为雷公藤红素的结合位点。进一步分子对接发现与[/font][font=&]C170[/font][font=宋体]结合的雷公藤红素很可能被埋在[/font][font=&]COMMD3[/font][font=宋体]和[/font][font=&]COMMD8[/font][font=宋体]的[/font][font=&]COMM [/font][font=宋体]结构域之间的界面形成的疏水腔中，用雷公藤红素处理的纯化[/font][font=&] COMMD3/8 [/font][font=宋体]复合物的质谱鉴定发现[/font][font=&]C170[/font][font=宋体]是该结构域内雷公藤红素的唯一共价结合位点。总之，这些发现表明雷公藤红素可能通过与[/font][font=&] COMMD3 [/font][font=宋体]上的[/font][font=&]C170[/font][font=宋体]共价结合来解离[/font][font=&] COMMD3/8 [/font][font=宋体]复合物[/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]5[/font][font=宋体]、[/font][font=&][b][font=宋体]雷公藤红素[/font][/b][/font][font=宋体]重现[/font][font=&] COMMD3/8 [/font][font=宋体]复合物缺乏症[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]接下来，作者想知道雷公藤红素是否能重现[/font][font=&]COMMD3/8[/font][font=宋体]复合物缺乏所导致的功能性后果。结果显示，雷公藤红素抑制小鼠[/font][font=&] B [/font][font=宋体]细胞对[/font][font=&]CXCR4[/font][font=宋体]和[/font][font=&]EBI2[/font][font=宋体]刺激的趋化性迁移，这与[/font][font=&]COMMD3/8 [/font][font=宋体]复合物作为趋化因子受体信号传导的正调节剂的作用一致。此外，与[/font][font=&]COMMD3/8[/font][font=宋体]复合物缺乏的情况一样，雷公藤红素可阻止[/font][font=&]B[/font][font=宋体]细胞中[/font][font=&]GRK6[/font][font=宋体]介导的配体激活的[/font][font=&]CXCR4[/font][font=宋体]磷酸化。质谱流式（[/font][font=&]CyTOF[/font][font=宋体]）显示使用雷公藤红素治疗可选择性降低[/font][font=&]GC B[/font][font=宋体]细胞的比例，同时保持其增殖能力，这与在他莫昔芬[i][/i]诱导的[/font][font=&]Commd3[/font][font=宋体]缺失的小鼠中观察到的情况一样[/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][font=宋体]先前的研究表明，雷公藤红素治疗可抑制[/font][font=&]CIA[/font][font=宋体]的发展。作者证实在[/font][font=&]CIA[/font][font=宋体]发作时开始使用雷公藤红素治疗可阻止疾病进展。并重现[/font][font=&]COMMD3/8[/font][font=宋体]复合物缺乏对[/font][font=&]CIA[/font][font=宋体]中体液免疫反应的影响，降低血清中[/font][font=&] TIIC [/font][font=宋体]特异性抗体的滴度以及[/font][font=&]GC B[/font][font=宋体]细胞数量，而不会影响引流淋巴结中[/font][font=&]T H17[/font][font=宋体]和[/font][font=&]Treg[/font][font=宋体]细胞丰度，这些发现进一步表明雷公藤红素具有[/font][font=&]B[/font][font=宋体]细胞选择性作用。总体而言，雷公藤红素治疗表型模拟了[/font][font=&]COMMD3/8[/font][font=宋体]复合物的缺陷[/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]6[/font][font=宋体]、[/font][font=&]COMMD3[/font][font=宋体]的[/font][font=&]C170A[/font][font=宋体]突变消除了雷公藤红素的活性[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]接着，作者发现[/font][font=&]COMMD3[/font][font=宋体]的[/font][font=&]C170A[/font][font=宋体]突变使[/font][font=&]COMMD3/8[/font][font=宋体]复合物对雷公藤红素具有抗性。为了验证[/font][font=&]COMMD3/8[/font][font=宋体]复合物是雷公藤红素的真正靶标，作者生成了表达来自内源性[/font][font=&]Commd3[/font][font=宋体]基因座的[/font][font=&]COMMD3 C170A[/font][font=宋体]的小鼠，并测试雷公藤红素在这些小鼠中的作用是否被消除。结果显示，从[/font][font=&]COMMD3 C170A/C170A[/font][font=宋体]小鼠中分离的[/font][font=&]B[/font][font=宋体]细胞在[/font][font=&]CXCR4[/font][font=宋体]和[/font][font=&]EBI2[/font][font=宋体]介导的趋化反应以及[/font][font=&]GRK6[/font][font=宋体]介导的[/font][font=&]CXCR4[/font][font=宋体]磷酸化中表现出对雷公藤红素的完全抗性。此外，雷公藤红素治疗不会抑制突变小鼠的体液免疫反应。质谱流式（[/font][font=&]CyTOF[/font][font=宋体]）和[/font][font=&]scRNA-seq[/font][font=宋体]分析均表明，在免疫的突变小鼠中，雷公藤红素治疗不会显著影响任何可检测到的免疫细胞群。此外，[/font][font=&]COMMD3 C170A/C170A[/font][font=宋体]小鼠的[/font][font=&]CIA[/font][font=宋体]进展和[/font][font=&]TIIC[/font][font=宋体]诱导的体液免疫反应并未受到雷公藤红素治疗的抑制，这进一步证实了这些小鼠对雷公藤红素的无反应性。这些发现表明[/font][font=&]COMMD3/8[/font][font=宋体]复合物是雷公藤红素的主要分子靶点[/font][/size]

[font=等线][size=15px]采用ABPP、蛋白组学以及代谢组学联合策略，揭示[/size][/font][size=15px][b][font=&][font=等线]雷公藤红素（[/font]Celastrol, Cel[font=等线]）直接结合[/font][/font][font=等线]多靶点[/font][font=等线]蛋白，[/font][font=等线]影响[/font][font=&][font=等线]能量代谢相关的生物过程，如[/font]TCA[font=等线]循环，糖酵解，脂肪酸代谢等途径，诱导线粒体相关的细胞凋亡，最终诱发肾毒性[/font][/font][/b][font=等线]。[/font][/size][size=15px][font=&][font=等线]雷公藤红素（[/font]Celastrol, Cel[font=等线]）是雷公藤的有效活性成分之一，具有悠久的临床应用历史，在抗类风湿性关节炎、抗肿瘤、抗氧化、神经保护等方面具有显著药效，[/font]2007[font=等线]年被[/font][/font][i][font=&]Cell[/font][/i][font=&][font=等线]评为[/font]“[font=等线]最具成药潜力[/font]”[font=等线]的五种天然化合物之一。在基础研究中，[/font]Cel[font=等线]的心脏毒性、生殖毒性已被明确，而[/font][/font][b][font=&][font=等线]相关的中成药或者复方在临床应用发生的肾脏损伤事件频发，其具体机制不明，[/font]Cel[font=等线]的肾毒性机制亟待阐明[/font][/font][/b][font=等线]。[/font][/size] [size=15px][b][font=等线]中国中医科学院王继刚[/font][font=等线]团队长期致力于天然产物的药物靶标及其机制的研究，建立了成熟的天然产物筛选平台。[/font][/b][font=等线]此前已经对雷公藤主要成分展开了广泛的靶向药理研究。例如：[/font][font=&][font=等线]基于活性的蛋白质谱（[/font]ABPP[font=等线]）通过结合活性探针和蛋白质组学技术，[/font][/font][font=等线]诠释了[font=&]Cel[/font]靶向[font=&]PRDX[/font]家族蛋白发挥抗肝纤维化的药理机制[font=&][Acta Pharm Sin B, (2022) 12(5):2300-2314][/font]。此外，其靶向[font=&]HMGB1[/font]发挥抗炎效应[font=&][Military Medical Research. (2022) 9(1):22.[/font]；[font=&]Journal of Neuroinflammation, (2021) 18(1):174.][/font]。随后[/font][font=&][font=等线]证实了[/font]Cel[font=等线]与寄生虫中的许多蛋白质（[/font]PfSpdsyn[font=等线]和[/font]PfEGF1-α[font=等线]）结合，干扰亚精胺和寄生虫蛋白的从头合成，从而起到抗疟效果[/font][/font][font=&][Cell Commun Signal. (2024) Feb 20 22(1):139][/font][font=&][font=等线]；可以选择性靶向电压依赖性阴离子通道[/font]2[font=等线]（[/font]VDAC2[font=等线]），诱导肝癌细胞中由[/font]ROS[font=等线]介导的铁死亡以及细胞凋亡，而其脂质体在增强其靶向性的同时，还可以降低其毒副作用[/font][[/font][font=&]ASIAN J PHARM SCI, (2023) Nov 18(6):100874[/font][font=&]][font=等线]；[/font]Cel[font=等线]通过共价结合并差异调节多种共脑核（杏仁核、海马体以及中缝背核）中[/font]PDIA3[font=等线]的表达，从而缓解肥胖与抑郁共病表型[/font][[/font][font=&]Journal of pharmaceutical analysis. 2023. doi:10.1016/j.jpha.2022.12.002[/font][font=&]][font=等线]；[/font]Cel[font=等线]直接靶向神经元表达的发育下调[/font]4[font=等线]（[/font]Nedd4[font=等线]），抑制其与[/font]Nrf2[font=等线]之间的相互作用并减少缺血性脑卒中中[/font]Nrf2[font=等线]的降解，从而起到神经保护作用[/font][[/font][font=&]Journal of pharmaceutical analysis. 2024. doi:10.1016/j.jpha.2023.10.002[/font][font=&]][font=等线]。[/font][/font][/size][size=15px][b][font=等线]二、[/font][font=等线]研究思路[/font][font=&][/font][/b][/size][size=15px][font=等线]在此[/font][font=等线]，本研究[/font][b][font=&][font=等线]基于[/font]ABPP[font=等线]的化学蛋白质组学和代谢组学，分析并鉴定了[/font]Cel[font=等线]在肾脏中的共价结合靶[/font][/font][font=等线]点[/font][/b][font=&][font=等线]。本研究结果表明，许多[/font]Cel[font=等线]靶向蛋白参与了一些重要的生物学活动，特别是线粒体功能。[/font][/font][font=等线]随后，[/font][font=等线]使用细胞热迁移实验[/font][font=等线]（[/font][font=&]CETSA-WB[/font][font=等线]）[/font][font=&][font=等线]和[/font]pull down[/font][font=&]-[/font][font=&]WB[/font][font=等线]等生物学技术[/font][font=等线]对几种重要的[/font][font=等线]靶蛋白[/font][font=等线]进行验证[/font][font=等线]，并借助[/font][font=等线]代谢组学和蛋白质组学分析[/font][font=等线]，以及其他技术[/font][font=等线]进一步证明了[/font][b][font=&]Cel[/font][font=等线]的肾毒性与[/font][font=等线]线粒体功能损伤[/font][font=等线]密切相关[/font][/b][font=等线]。[/font][b][font=&]Cel[font=等线]可能通过靶向特定蛋白的复杂机制[/font][/font][font=等线]来诱导[/font][font=等线]肾毒性[/font][/b][font=等线]。[/font][/size][font=等线][/font] [img=,690,547]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/09/202409091652384055_1608_6541583_3.png!w690x547.jpg[/img]

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因未明，以腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重为主要临床表现，于结肠和直肠的表浅且连续的慢性非特异性肠道炎症性疾病[1]。因其病因未明，病程绵长，发病机制复杂的病症特点，属于中医“久痢”的范畴，并且长期的UC是结直肠癌症发生的高危因素[2]。根据最新的专家共识数据推测显示，在我国UC的患病率约为11.6/10万，且近年来医院就诊人数呈现出快速上升的趋势[3]。但目前临床上主要采用激素、氨基酸水杨酸、免疫抑制剂等西医治疗手段，存在不良反应较多、疗效甚微、药物价格昂贵、药物靶向性差等不足，不宜作为长期治疗的最优选择。因此，亟待研究开发一种新型高效低毒且更具有临床价值的UC治疗药物。 近年来关于中医药治疗UC的临床研究逐年增多，因其具有多靶点治疗、复发率低、提高患者生活质量等多项优势，获得越来越多患者的青睐[4-5]。中药雷公藤始载于《神农本草经》，入药部位为卫矛科雷公藤属藤本灌木根的木质部，味苦、辛，有大毒，具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒等功效。现代药理研究证实，雷公藤具有抗炎[6]、免疫抑制、抗肿瘤等多种作用，临床上多用于治疗类风湿关节炎、紫癜性肾炎皆归因于其可抑制炎症反应[7-9]。而诸多现代研究证实，雷公藤的主要活性成分雷公藤红素（celastrol，Cel），干预UC作用显著，疗效确切[10-13]。研究报道Cel通过降低白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）水平，上调E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达水平，抑制核转录因子-κB p65（nuclear transcription factor-κB p65，NF-κB p65）等细胞因子的表达水平，从而发挥抗UC作用[14-15]。但其口服生物利用度差、水溶性差［37 ℃时溶解度为（13.25±0.83）μg/mL］及靶向性差等不足，限制了其临床应用[16]。 纳米递送体系除具有能够提高药物生物利用度、降低用量、提高靶向性、减少不良反应等优势之外，还能够精确递送药物成分抵达病灶部位以及精确控制其释放[17-19]。近年来，越来越多的纳米递送体系用于结肠相关疾病的防治，比如pH敏感、酶敏感、光热敏感等体系[20]，但纳米载体材料毒性及结肠靶向等实际问题尚未完全解决。多糖是一类由单糖结构通过糖苷键连接形成的生物大分子，具有原料来源广泛、生物安全性高、成本低及易于功能化修饰等优点，在针对结肠疾病的靶向递送体系开发中具有独特的应用优势和潜力[21]。在生物安全性方面，大多数多糖都存在于人体摄入食物中，具备优异的生物相容性，在医药及食品领域已有成功应用案例[22]。 透明质酸广泛存在于人体中，具有良好的生物降解性和生物相容性、黏附性较好、安全性较高，其特性能够防止所包载的药物被胃肠道破坏[23-25]；另一方面，透明质酸能够与炎症部位巨噬细胞表面高表达的CD44受体相结合，提高纳米颗粒的主动靶向作用[26]。此外，随着刺激响应式控释系统在药物传递方面受到越来越多的关注，可以充分利用UC炎症部位的微环境特性，设计药物控释系统。肠道酶是一种独特的刺激物，由于其底物特异性高，在控释系统中日益被用作触发器[27]。环糊精（cyclodextrin）是一种由α-1,4-葡萄糖苷键连接的具有锥形结构的天然环状低聚糖，具有亲水性的外表面和相对疏水的内腔，一方面环糊精的疏水空腔使其可同与之空间匹配的客体小分子［例如金刚烷甲酸（adamantanecarboxylic acid，AD）］形成稳定的“主-客体”包合物，另一方面这种结构的递送优势在于能将疏水客体药物有效装载于环糊精内部[28]。同时，环糊精在结肠微生物发酵和酶解作用下打开环状结构，酯键被水解，包载药物在结肠中释放[11]。 本研究立足于环糊精的“内疏水外亲水”空腔结构特性，充分考虑结肠病变部位的炎症性质，通过酯化反应合成透明质酸-金刚烷甲酸（hyaluronic acid-AD，HA-AD）聚合物，利用环糊精的疏水空腔装载疏水Cel客体药物分子，同时利用AD与环糊精的主客体结合力引入具有CD44靶向的透明质酸，制备出一种新型载Cel结肠靶向-酶敏感纳米粒（Cel/NPs）递药系统，以促进Cel结肠病灶部位的靶向递送和定位释放，为Cel精准递送治疗UC提供新思路。 1 仪器与材料 1.1 仪器 Avance Neo-700 MHz型核磁共振仪，瑞士Bruker公司；Advanyage 2.0 & XL-70型冻干系统，美国SP公司；LC-2030C型高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]（HPLC）仪，日本岛津公司；Zetasizer 90型激光粒度仪，英国马尔文公司；JY 92-IIN型超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；JEM-1230型透射电子显微镜（TEM），日本JEOL公司；Nikon A1R+SIM型激光共聚焦显微镜，日本尼康公司；Novo Cyte型流式细胞仪，艾森生物杭州有限公司；Leica RM2235型石蜡切片机，成都容信达科技有限公司；Olympus BX41型正置荧光显微镜，日本奥林巴斯公司。 1.2 药品与试剂 AD（批号P1937331）、环糊精（批号P2514301）、α-淀粉酶（批号L2008186）、4-二甲氨基吡啶（4- dimethylaminopyridine，DMAP，批号P1853043），上海阿达玛斯试剂有限公司；透明质酸（相对分子质量8 000），华熙生物科技有限公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批号H2103262）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺［1-(3- dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide，EDC，批号H2117129］，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RPMI 1640培养基、0.25%胰蛋白酶、青-链霉素溶液，美国Gibco公司；Cel，质量分数≥98%，批号DSTDL00350，成都德思特生物技术有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），杭州四季青公司；苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色试剂盒，广州硕谱生物科技有限公司；葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS），上海泰坦科技股份有限公司；香豆素6（coumarin 6，C6），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈，色谱纯，上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；磷酸，色谱纯，成都诺尔施科技有限责任公司；其余试剂均为分析纯。 1.3 细胞株及实验动物 人正常结肠上皮NCM460细胞，购自广州赛库生物技术有限公司。雄性ICR（institute of cancer research）小鼠，SPF级，体质量（20±2）g，动物许可证号：SCXK-2019-0010，购于北京斯贝福生物技术有限公司。饲养条件：温度为20～26 ℃，相对湿度为40%～70%。实验期间动物自由进食、饮水，昼夜节律正常。动物实验获得成都医学院动物实验伦理委员会的批准，批准号2023-044。 2 方法与结果 2.1 HA-AD材料的合成及表征 采用酯化反应合成HA-AD聚合物，具体方法如下：准确称取2 mmol AD、3 mmol EDC于20 mL DMSO中，在25 ℃条件下，反应2 h，期间持续通入氮气。然后将2 mmol透明质酸（以透明质酸1个分子单元计）和2 mmol DMAP加入反应液中，继续反应48 h。待反应完成后，采用透析法（透析袋相对分子质量为1 000）除去反应液中的杂质，在规定时间点更换介质，透析3 d后，冻干产物，白色团块即为HA-AD，HA-AD合成路线见图1。 采用核磁共振氢谱（1H-NMR）对合成产物进行表征，在核磁管中加入少量待测样品和适量的氘代DMSO溶剂，通过1H-NMR检测相关样品。结果如图2所示，HA-AD的化学结构通过1H-NMR得到证实。HA-AD聚合物的1H-NMR氢谱中，在δ 3.06～4.90处识别出透明质酸糖环的特征峰；此外与透明质酸相比，δ 1.74～1.81、1.91～1.93、1.60～1.65处的特征峰证实AD与透明质酸的成功结合，综上，该结果表明AD在透明质酸上成功偶联。 2.2 Cel/NPs的制备 采用透析法制备Cel/NPs。按处方精密称取Cel和环糊精，加入2.0 mL DMSO，涡旋超声使其充分溶解。取处方量HA-AD溶解于10.0 mL反渗透水（reverses osmosis，RO）中，将上述DMSO溶液逐滴滴入，磁力搅拌器搅拌2.0 h（400 r/min）。将溶液转移到透析袋中（相对分子质量3 000），透析除去DMSO。待有机溶剂除尽后，用超声波细胞破碎仪冰浴探超5 min（超声5 s、停5 s，功率50%）。 最后用0.45 μm微孔滤膜滤过，得到橘黄色Cel/NPs溶液。 2.3 Cel含量测定方法建立 2.3.1 HPLC色谱条件 色谱柱为DiamonsilTM C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（80∶20）；检测波长425 nm；体积流量为1.0 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL。 2.3.2供试品溶液的制备 取2.0 mL甲醇于1.0 mL Cel/NPs溶液中，涡旋、超声破乳，使得制备的纳米颗粒完全破坏，过0.22 μm有机滤膜，即得供试品溶液。 2.3.3 对照品溶液的制备 精密称取Cel对照品10.0 mg于10 mL量瓶中，用甲醇溶液定容，得到1.0 mg/mL Cel对照品母液。 2.3.4 专属性考察 取“2.3.2”项下供试品溶液和“2.3.3”项下对照品溶液，按照“2.3.1”项下色谱条件进样，结果如图3所示，Cel的保留时间为11.76 min，供试品溶液和对照品溶液的出峰时间相同，供试品溶液中的溶剂和辅料对Cel的测定无干扰。 2.3.5 线性关系考察 取“2.3.3”项下Cel对照品溶液，用甲醇稀释成质量浓度分别为500.000、250.000、125.000、62.500、31.250、15.625 μg/mL的Cel对照品溶液，过0.22 μm有机滤膜，进样。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程为Y＝17 130 X＋1 714.5，r＝0.999 0，线性范围15.625～500.000 μg/mL，结果表明，Cel在定量范围内各质量浓度与峰面积线性关系良好。 2.3.6 精密度试验 分别精密吸取同一对照品溶液（62.500 μg/mL），按“2.3.1”项下色谱条件分别连续进样6次，进样量10 μL，结果Cel峰面积的RSD为0.37%，表明仪器精密度良好。 2.3.7 稳定性试验 按“2.3.2”项下制备一份供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h按上述“2.3.1”项下色谱条件进样测定Cel的峰面积，结果Cel峰面积的RSD为2.52%，表明供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。 2.3.8 重复性试验 按照“2.3.2”项下供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，并且按Cel色谱条件分析测定，计算Cel/NPs样品中Cel质量浓度的RSD为2.15%，表明重复性良好。 2.3.9 加样回收率试验 按照“2.2”项下Cel/NPs制备方法制备Cel/NPs溶液，分为6份，每份取500 μL Cel/NPs溶液，加入Cel对照品溶液（1.0 mg/mL）500 μL，涡旋、超声处理，过0.22 μm有机滤膜。平行6份，进样，计算Cel的平均加样回收率为98.72%，RSD为2.19%，表明该方法回收率良好。 2.4 Cel/NPs处方的单因素实验优化 对透析法制备Cel/NPs的处方进行单因素实验，考察Cel加入量、环糊精用量、HA-AD用量、DMSO用量、RO水用量、搅拌时间共6个因素对Cel/NPs包封率的影响。将制得样品加入甲醇破坏纳米颗粒结构释放Cel，HPLC进样分析，计算包封率，结果见表1。根据结果分析，在Cel为2.0 mg、环糊精为30.0 mg、HA-AD为5.0 mg、DMSO用量为3.0 mL、RO水用量为10.0 mL，搅拌时间为2.0 h，所得包封率最好。但DMSO用量、RO水用量以及搅拌时间对包封率影响较小。 2.5 Cel/NPs处方的Box-Behnken设计-响应面法（Box-Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）试验优化 2.5.1 Box-Behnken响应面法试验 在单因素实验基础上，以Cel（X1）、环糊精（X2）和HA-AD（X3）的加入量为自变量，Cel包封率（Y）为因变量，采用Design-Expert V13软件进行响应面试验设计，结果见表2。 2.5.2 模型建立与回归分析 对试验结果进行响应面分析，经过回归拟合后，得出响应值与影响因素X1、X2、X3之间的回归方程为Y＝68.34－3.89 X1＋18.47 X2－9.08 X3－0.892 5 X1X2＋3.73 X1X3－10.59 X2X3＋6.79 X12－13.35 X22－7.20 X32，R2＝0.987 1＞0.8。方程回归分析见表3。 Cel的回归模型F值为59.49（P＜0.05），表明所建立的模型具有显著性；失拟项数值为1.75，P值＞0.05，说明失拟项对于误差不显著，回归方程拟合度较好。响应曲面图直观地反映了Cel、环糊精和HA-AD添加量的交互作用对响应值的影响结果见图4。 2.5.3 最佳处方工艺确定及其验证 在Design Expert V13软件Responses项输入包封率测定结果并进行分析，得到最佳处方工艺为Cel 2.04 mg、环糊精27.19 mg、HA-AD 7.96 mg，Cel包封率为96.09%，按此工艺下进行验证试验，结果Cel的包封率为（94.18±2.36）%（n＝3），与预测值偏差小于±5%，表明该法预测与验证结果基本一致。 2.6 Cel/NPs的表征 2.6.1 粒径、多分散指数（polydispersity，PDI）和电位考察 分别取一定体积的Cel/NPs样品溶液于粒径池和电位池中，采用马尔文粒度仪检测Cel/NPs的平均粒径、PDI和ζ电位。 结果如图5所示，测得Cel/NPs的平均粒径为（152.37±1.42）nm（n＝3），PDI为0.262±0.009（n＝3）；ζ电位为（?32.1±0.8）mV（n＝3），表明制得Cel/NPs粒径较小，均一性良好。 2.6.2 形态学考察 将稀释后的Cel/NPs悬浮液适当转移到铜网格上，然后用2%磷钨酸染色，待样品在室温下挥干后进行TEM观察。结果显示，Cel/NPs的形态圆整光滑，分布均匀（图6）。 2.6.3 储存稳定性考察 对制备的Cel/NPs的体外稳定性进行评价。将制备好的Cel/NPs样品溶液密封放置于4 ℃冰箱保存，连续7 d测量其粒径、PDI和ζ电位值变化，结果见表4，其各项值在低温储存条件下变化不大，表明制得的Cel/NPs具有较稳定的性能。 2.6.4 Cel/NPs酶敏感性考察 将Cel/NPs样品溶液与磷酸盐缓冲液（PBS）和含有10 IU/mL α-淀粉酶的PBS溶液共孵育，孵育24 h后，取出样品，检测其粒径分布，并采用TEM观察刺激后纳米溶液的微观形貌特征。结果如图7所示，采用α-淀粉酶处理后的粒径分布不均一，出现了多个粒径不同的峰。从TEM图中可以观察到纳米结构在α-淀粉酶的作用下发生了裂解，由原来圆整光滑变成裂的碎片。因此，结果可以初步表明所制得的纳米具有酶敏感特性。 2.6.5 包封率和载药量的测定 取2.0 mL甲醇于Cel/NPs样品溶液1.0 mL中，涡旋、超声破乳，使制备的纳米颗粒完全破坏，过0.22 μm有机滤膜，用HPLC测定样品中Cel含量，根据公式分别计算包封率和载药量。计算得到Cel/NPs中Cel的包封率为（94.18±2.36）%，载药量为（5.17±0.13）%。 包封率＝W0/W1 载药量＝W0/(W1＋W2) W0为纳米颗粒中药物含量，W1为药物投加量，W2为纳米材料量 2.7 Cel/NPs的体外释放行为考察 2.7.1 Cel/NPs的胃、小肠、结肠释放行为考察 根据模拟胃肠液动态的pH值变化来测试接近生理状态下Cel/NPs的体外释放度。采用透析袋法考察Cel/NPs的体外释放行为，将2.0 mL游离Cel和纳米溶液装于透析袋（截留相对分子质量3 000）中，扎紧袋口，置于30 mL释放介质中，按如下时间点进行。介质A：人工胃液（SGF，pH 1.2），时间0～2 h；介质B：人工小肠液（SIF，pH 6.8），时间2～6 h；介质C：人工结肠液（SCF，pH 7.4），时间6～48 h。分别于0.5、1、2、4、6、8、10、14、18、24、48 h时，取1.0 mL透析液（后补充1.0 mL透析介质，维持透析液体积不变），进行HPLC检测透析液中Cel含量。以透析时间为横坐标，透析液中Cel的累积释放率为纵坐标，绘制体外释放曲线。结果如图8所示，游离Cel在SGF中累积释放1.14%，然而在Cel/NPs释放液中未检测到Cel的释放；游离Cel在6 h内累积释放量达22.87%，而Cel/NPs的累积释放量明显低于游离Cel的释放；当释放时间达48 h，游离Cel的累积释放量高达92.55%，而Cel/NPs的释放量不到40%。通过对比发现，通过HA-AD和环糊精的装载，纳米粒中Cel得到了保护，延缓了药物的释放行为。 2.7.2 Cel/NPs的结肠突释行为考察 进一步考察Cel/NPs在结肠部位α-淀粉酶作用下的药物释放情况，同样采用透析袋法研究Cel的释放行为。分别将2.0 mL纳米溶液装于透析袋（截留相对分子质量3 000）中，扎紧袋口，置于30 mL释放介质中，介质A为含有0.5%聚山梨酯80的PBS（pH 7.4），介质B为含有0.5%聚山梨酯80和10 IU/mL α-淀粉酶的PBS（pH 7.4）。分别于0、2、4、8、12、24、48 h时，取1.0 mL透析液（后补充1.0 mL透析介质，维持透析液体积不变），进行HPLC检测透析液中Cel含量。以透析时间为横坐标，透析液中Cel的累积释放率为纵坐标，绘制体外释放曲线。结果如图9所示，在α-淀粉酶的刺激下4 h内纳米粒的累积释放量达45%，而无α-淀粉酶的PBS组，纳米粒的累积释放量仅为20.09%；当释放时间为48 h时，无α-淀粉酶的PBS组，纳米粒的累积释放量仅升高到36.49%，而在α-淀粉酶的刺激下，纳米粒48 h的累积释放量可达85.94%，远高于无α-淀粉酶刺激组的累积释放量。因此，结果表明在结肠微环境α-淀粉酶的刺激下，可使环糊精迅速解体，从而瓦解Cel/NPs，快速释放Cel。 2.8 Cel/NPs在NCM460细胞摄取能力考察 考虑到Cel无荧光，本研究采用带绿色荧光的C6作为表征药物，按照“2.2”项下方法制备C6/NPs。将NCM460细胞以每孔1×105的密度接种于激光共聚焦培养皿上，37 ℃孵育过夜。待细胞贴壁后，将培养基分别更换为含游离C6、C6/NPs以及C6/NPs（5 mg/mL透明质酸预先孵育细胞2 h，以C6计为100 ng/mL）的无血清新鲜培养基。在37 ℃孵育4 h后，弃去培养基，用冷PBS洗涤2次。加入DIL染色液染细胞膜15 min，冷PBS洗涤2次。然后用4%多聚甲醛固定20 min，冷PBS洗涤2次。加入Hoechst 33342（终质量浓度为10 μg/mL）染细胞核10 min，弃去染色剂，每孔加入1.0 mL PBS洗3次。加入1滴防荧光猝灭剂，采用激光共聚焦显微镜观察NCM460细胞对药物的摄取情况。 结果如图10，C6呈绿色荧光，C6/NPs的荧光强度显著强于游离C6，表明C6/NPs可以增加NCM460细胞对药物的摄取。但当NCM460细胞经过HA预处理2 h后，其对C6/NPs的细胞摄取量明显减少，结果初步表明透明质酸的存在可增加细胞对递药系统的摄取能力。 采用流式细胞仪，定量分析NCM460细胞对各药物的摄取情况。将NCM460细胞接种于6孔板（3.5×105个/孔）。待细胞贴壁后，弃去培养基，分别加入含游离C6、C6/NPs以及C6/NPs（5 mg/mL透明质酸预先孵育细胞2 h）（以C6计为100 ng/mL）的无血清新鲜培养基，恒温培养箱孵育4 h。弃去培养基，PBS洗3次，胰酶消化，离心收集细胞，用PBS重悬细胞，采用流式细胞仪进行检测，定量分析NCM460细胞对药物的摄取情况。结果如表5所示，NCM460细胞对C6/NPs的摄取量显著高于游离C6（P＜0.01），当细胞表面受体被透明质酸饱和后，细胞摄取量明显降低，与定性分析结果一致。 2.9 Cel/NPs的体内抗UC作用研究 用DSS溶液（30 mg/mL）ig 7 d建立UC小鼠模型。将ICR雄性小鼠（22～25 g）随机分为4组：对照组、模型组、游离Cel组、Cel/NPs组，每组6只。除对照组外，实验第1天将饮用水换成3% DSS水溶液，自由饮用7 d后停止，换成灭菌水。从第3天开始给药，连续7 d每天定时ig。其中对照组和模型组ig生理盐水，游离Cel组和Cel/NPs组每只小鼠ig 2 mg/kg（以Cel计）不同剂型的药物。每日记录小鼠体质量变化，观察其大便性状，便血情况，计算DAI评分（DAI评分标准见表6）。实验结束后解剖小鼠，取脾脏称定质量，记录；剥离小鼠结肠组织，采用H&E染色法对4%多聚甲醛固定的小鼠结肠组织进行染色处理。 DAI＝体质量下降分数＋大便性状分数＋便血分数 小鼠体质量变化结果（图11）表明，模型组小鼠体质量明显下降（P＜0.001），实验结束时体质量下降到75%；相比于模型组，游离Cel组使得小鼠体质量下降明显减轻（P＜0.001）；Cel/NPs组实验结束时，小鼠体质量呈现增长趋势。 DSS破坏结肠黏膜屏障，导致肠道炎症发生、出现体重减轻、便血便稀等临床症状，DAI评分是UC严重程度的一个指标。如图12所示，Cel/NPs组和游离Cel组均可以不同程度的降低小鼠DAI评分，缓解小鼠便血便稀等病理学特征，其中Cel/NPs组效果优于游离Cel组。 DSS诱导的UC模型容易发生纤维化导致结肠缩短，可通过测量结肠长度评价药物改善UC的效果。实验结果如表7所示，与模型组对比发现，Cel/ NPs组和游离Cel组均可以增加小鼠结肠长度。 脾脏作为机体的免疫器官，当机体发生UC炎症时，脾脏会变得肿大，因此脾脏系数可作为评估药物改善UC的又一指标。结果如表7所示，Cel/NPs组和游离Cel组小鼠的脾脏系数相较于模型组下降显著，且Cel/NPs组效果更好，表明通过纳米载体的递送，可使Cel更有效地改善UC。 图13为小鼠结肠组织拍照结果，模型组肉眼可见结肠组织呈充血肿胀状态，结肠内含血性不成形的粪便内容物，游离Cel组形态相较于模型组有一定的好转，Cel/NPs组与对照组小鼠结肠无明显区别，表明Cel/NPs组恢复结肠组织形态最佳。 从小鼠结肠组织病理切片H&E染色结果（图14）分析发现，对照组小鼠结肠黏膜上皮细胞结构完整，肠绒毛结构完整，杯状细胞含量高；但模型组小鼠结肠

国内最大最专业的国家标准物质服务平台坛墨质检-国家标准物质中心（北京坛墨质检科技有限公司），是国家质检总局指定的国家标准物质研制单位，是国内最大最专业的食品、环境、职业卫生标准物质生产商和服务商。 产品编号 产品名称 标准值 BW5018*雷公藤红素对照品,有报告≥98%BW5015*栀子苷对照品,有报告≥98%BW5014*L-苹果酸对照品,有报告≥98%BW5013*琥珀酸对照品(丁二酸),有报告≥98%BW50121,4-苯醌（对苯醌）,有报告,≥98%BW5011*蔗糖对照品,有报告≥98%BW5010*脱氢乙酸对照品,有报告≥98%BW5009维生素P(芦丁水合物),对照品,有报告96.50%BW5008靛蓝对照品（脂溶性）,有检测报告95.50%BW5007*没食子酸对照品,有报告≥98%BW5005*黄芪皂苷IV对照品,有报告≥98%BW5004*雷公藤甲素（雷公藤内酯醇）对照品,有报告≥98%BW5002*野百合碱(猪屎豆碱)对照品,有报告≥98%BW5001冬凌草甲素对照品,有报告≥98% 坛墨质检现有员工79人，办公室面积450平米，实验室1650平米；销售、客服、财务及行政人员35人，实验室工作人员21人，库房14人，市场部8人。实验仪器设备：气相色谱、液相色谱、气质联用、液质联用、离子色谱、紫外分光光度计，原子吸收、ICP-OES和ICP-MS；库房面积450平米，库房工作人员12人，现货产品5万个，坛墨质检自主研发的产品近3000个，已申报国标345项，填补国内空白的产品达到65项。坛墨质检是国内唯一提供标准溶液定制服务的标准物质研制单位，定制范围：特殊浓度定制、特殊溶剂定制、混标定制。

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国内最大最专业的国家标准物质服务平台坛墨质检-国家标准物质中心（北京坛墨质检科技有限公司），是国家质检总局指定的国家标准物质研制单位，是国内最大最专业的食品、环境、职业卫生标准物质生产商和服务商。BW5182 黄杨碱（环维黄杨星D）对照品，有报告 HPLC≥98% BW5183 络塞琳对照品，有报告 HPLC≥98% BW5184 络塞维对照品，有报告 HPLC≥98% BW5185 络缌对照品，有报告 HPLC≥98% BW5186 络塞定对照品，有报告 HPLC≥98% BW5187 槐果碱对照品，有报告 HPLC≥98% BW5188 花旗松素（二氢槲皮素）对照品，有报告 HPLC≥98% BW5189 槲皮素对照品，有报告 HPLC≥98% BW5190 槲皮苷对照品，有报告 HPLC≥98% BW5191 蒿甲醚对照品，有报告 HPLC≥98% BW5192 姜黄素对照品，有报告 HPLC≥98% BW5193 双去氧基姜黄素对照品，有报告 HPLC≥98% BW5194 莪术醇(姜黄醇)对照品，有报告 HPLC≥98% BW5195 金丝桃素对照品，有报告 HPLC≥98% BW5196 绞股蓝皂苷对照品，有报告 HPLC≥98% BW5197 苦杏仁苷对照品，有报告 HPLC≥98% BW5198 咖啡酸对照品，有报告 HPLC≥98% BW5200 硫辛酸对照品，有报告 HPLC≥98% BW5201 硫酸氨基葡萄糖对照品，有报告 HPLC≥98% BW5202 盐酸氨基葡萄糖对照品，有报告 HPLC≥98% BW5203 罗通定对照品，有报告 HPLC≥98% BW5204 落新妇苷对照品，有报告 HPLC≥98% BW5205 雷公藤乙素对照品，有报告 HPLC≥98% BW5206 雷公藤内酯甲;雷公藤酯甲对照品，有报告 HPLC≥98% BW5207 木犀草素对照品，有报告 HPLC≥98% BW5208 蒙花苷对照品，有报告 HPLC≥98% BW5209 莽草酸对照品，有报告 HPLC≥98% 坛墨质检现有员工79人，办公室面积450平米，实验室1650平米；销售、客服、财务及行政人员35人，实验室工作人员21人，库房14人，市场部8人。实验仪器设备：气相色谱、液相色谱、气质联用、液质联用、离子色谱、紫外分光光度计，原子吸收、ICP-OES和ICP-MS；库房面积450平米，库房工作人员12人，现货产品5万个，坛墨质检自主研发的产品近3000个，已申报国标345项，填补国内空白的产品达到65项。坛墨质检是国内唯一提供标准溶液定制服务的标准物质研制单位，定制范围：特殊浓度定制、特殊溶剂定制、混标定制。

[b][size=15px][color=#595959]雷公藤多苷片(TWP)[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]是治疗[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]类风湿[/color][/size][size=15px][color=#595959]性[/color][/size][size=15px][color=#595959]关节炎[/color][/size][size=15px][color=#595959](RA)[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]应用最广泛的中药制剂，但其[b]肝毒性[/b]往往限制了其广泛应用。（TWP治疗RA时，报告了包括肺炎、呕吐、腹泻和上[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]呼吸道感染[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]在内的不良事件。）目前为止，尚无有效的方法来减轻TWP的急性肝毒性。因此，寻找有效的方法预防TWP的肝毒性具有重要意义。[/color][/size] [b][size=15px][color=#595959]丹参（SM）[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的功能，经常用于治疗心[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]血管[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]疾病和作为护肝药物。新的药理学和临床研究还表明，SM具有改善微循环和保护心脏的活性，以及抗肿瘤、保肝、抗氧化、[/color][/size][b][size=15px][color=#595959]免疫[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]调节、抗炎等生物活性。[b]丹参酚酸提取物(SA)[/b]是丹参的亲水成分，具有显著的[b]抗氧化和保肝[/b]作用。[/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size] [size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959]采用[b]代谢组学和转录组学[/b]相结合的方法，研究SA对TWP诱导的大鼠[b]急性肝损伤[/b]的保护作用，并探讨其相关机制。[/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959]采用UPLC-Q/TOF-MS对SA和TWP提取物进行鉴定。连续7天给药SA (200 mg/kg)。第7天灌胃TWP (360 mg/kg)诱导大鼠急性肝损伤。血清生化及H&E染色评价肝损害程度。利用肝脏代谢组学和转录组学探索其潜在机制，并利用q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]和IHC等分子生物学实验验证相关信号通路。[/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959]SA能预防TWP引起的肝损伤症状，如肝指数升高、ALT和AST升高、肝组织病理改变等。肝脏代谢组学研究表明，TWP可以显著改变肝脏中单个胆汁酸的含量，而SA对[b]胆汁酸生物合成途径[/b]的影响最为显著。肝脏转录组学结果显示，SA + TWP组改变的基因主要涉及[b]胆固醇代谢、脂质调节和胆汁酸稳态途径[/b]。编码farnesoid X受体(FXR)的Nr1h4基因表达显著改变，[b]FXR是胆汁酸稳态的重要调节因子[/b]。进一步研究证实，SA可以阻止TWP诱导的FXR及其下游信号下调，从而调节[b]胆汁酸代谢[/b]，最终预防TWP引起的急性肝损伤。[/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size] [size=15px][color=#595959][/color][/size][color=#3573b9]结论[/color][b][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][font=mp-quote, -apple-system-font, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#595959][/color][/size][/font] [b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][font=&][size=16px][color=#232323][/color][/size][/font][b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959]SA可通过调节胆汁酸代谢途径对TWP诱导的肝损伤起到保护作用[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]。SA可能为TWP诱导的急性肝损伤提供一种[b]新的保护策略[/b]。[/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size] [size=15px][color=#595959] [/color][/size]

胆固醇稳态对机体正常的细胞和系统功能至关重要，胆固醇平衡失调是心血管疾病、神经退行性疾病和癌症等其他疾病的基础[1]。胆固醇代谢包括内源性胆固醇合成、吸收和排泄等环节。研究表明，胆固醇在体内不能被降解，有效排泄是维持其稳态的重要环节[2]。体内积累的胆固醇最终通过肠道以粪便消除胆固醇和胆汁酸的形式达到平衡，目前已知的胆固醇排泄途径包括了胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport，RCT）途径和经肠胆固醇排泄（transintestinal cholesterol excretion，TICE）途径；前者是肝脏将胆固醇转化为胆汁酸后经肠排出，后者是由血直接经肠道分泌和排出血浆脂蛋白来源的胆固醇，二者交汇于肠道，因此，肠道在胆固醇稳态中发挥了重要作用[3-4]。调血脂治疗是防治体内高胆固醇含量诱导的相关疾病的有效方法，目前临床常用调血脂药物他汀类的作用是通过降低低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）以限制内源性胆固醇合成，从而防治心血管等疾病的发生发展，但其相关发病率和死亡率仅降低了30%[5]。这意味着需要更多策略来解决这个严重的公共卫生事件。 雷公藤红素（celastrol，CeT）是一种从传统中药雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.中提取分离出的活性成分，具有抗炎、抗癌和抗动脉粥样硬化等多种药理活性[6]，且具有良好的成药性，被《Cell》杂志列为最可能转化为现代药物的5种有潜力传统药物之一[7]。Zhang等[8]前期研究发现，体外有效成分为CeT的南蛇藤能够通过在促进RCT减少脂质蓄积方面具有积极作用，其机制主要是通过激活清除剂受体B类成员1（scavenger receptor class B member 1，SRB1）、ABC转运体和细胞色素P450家族7亚家族A成员1（cytochrome P450 family 7 subfamily A member 1，CYP7A1）途径促进胆固醇代谢。然而，有关CeT调控胆固醇代谢的作用机制探索尚不完善。此外，迄今为止，并无有关CeT通过调控肠道TICE途径介导胆固醇代谢的相关研究。因此，本研究采用网络药理学和系统生物学理论，通过构建“CeT-靶点-肠道胆固醇代谢”多层次网络，初步预测CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢的作用机制[9-10]，并结合实验深入探讨和验证CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢的作用及机制，旨在为维持体内胆固醇稳态提供新的方向和理论依据。 1 材料 1.1 细胞 大鼠小肠隐窝上皮IEC-6细胞（批号ZQ0783）由中国科学院上海细胞库提供。 1.2 药品与试剂 CeT（批号C0869）购自美国Sigma公司；肝X受体α（liver X receptor α，LXRα）抑制剂GSK2033（批号HY-108688）、Bodipy荧光染色（批号HY-W090090）购自美国MCE公司；0.25%胰蛋白酶（批号PB180229）购自美国Hyclone公司；DMEM高糖完全培养基（批号ZQ-121）、DMEM基础培养基（批号09122）购自上海中乔新舟生物科技有限公司；磷酸酶抑制剂（批号CW2383S）、蛋白酶抑制剂（批号CW2200S）、BCA试剂盒（批号CW0014S）、SDS-PAGE试剂盒（批号CW0022S）、Loading buffer（批号CW0028S）液购自康为世纪生物科技股份有限公司；CCK-8试剂盒（批号C0037）、RIPA裂解液（批号P0013B）、ECL化学发光试剂盒（批号P0018S）购自碧云天生物技术股份有限公司；油红O染色试剂盒（批号G1262-4）购自北京索莱宝科技有限公司；PVDF膜（批号ISEQ00010）购自美国Millipore公司；兔抗三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G5（adenosine triphosphate-binding cassette transporters G5，ABCG5）抗体（批号27722-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号10494-1-AP）、山羊抗兔二抗（批号SA00001-2）购自美国Proteintech公司；兔抗ATP结合盒转运蛋白G8（ATP-binding cassette transporters G8，ABCG8）抗体（批号A01482-2）购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗NPC1样细胞内胆固醇转运蛋白1（NPC1 like intracellular cholesterol transporter 1，NPC1L1）抗体（批号PA5-116672）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；兔抗LXRα抗体（批号ab41902）、DAPI染液（批号ab228549）购自英国Abcam公司。 1.3 仪器 ix 73型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；FC型酶标仪、Forma 3系列CO2培养箱、EVOS fl auto全自动荧光倒置荧光学显微镜（美国Thermo Fisher Scientific公司）；ChemiDoc XRS+化学发光成像系统、Mini-PROTEAN Tetra蛋白电泳系统（美国Bio-Rad公司）。 2 方法 2.1 网络药理学研究 将PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到的CeT 3D结构导入PharmMapper（http://www. lilab-ecust.cn/pharmmapper/）进行药物靶点预测。通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）得到肠道和胆固醇代谢靶点。并与CeT靶点取交集得到共有靶点；通过STRING（https://STRING-db.org）进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建，并导入Cytoscape 3.9.1软件构建网络模型并分析；通过DAVID（https://david. ncifcrf.gov/）进行基因本体（gene ontology，GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；利用PDB（https://www.rcsb.org/）筛选并下载分辨率小于0.25 nm的靶点的结晶复合式，结合上述得到的CeT 3D结构，采用Autodock进行分子对接，运用PyMol可视化处理。 2.2 实验验证 2.2.1 IEC-6细胞培养 IEC-6细胞用DMEM高糖完全培养基于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中常规培养。 2.2.2 CCK-8法检测细胞存活率 将对数生长期的IEC-6细胞接种于96孔板中，5×103个/孔。每孔加入100 μL含不同浓度（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 μmol/L）CeT的培养基，另设置加入无药物培养基的对照组，每组设置5个复孔，培养箱中培养24、48 h。每孔加入10 μL CCK-8试剂，于培养箱中孵育1～2 h后，采用酶标仪在450 nm处检测吸光度（A）值，计算细胞存活率。 细胞存活率＝A给药/A对照 2.2.3 油红O染色评估CeT对肠上皮细胞胆固醇的影响 设置对照组、模型组和CeT（0.05、0.10、0.20 μmol/L）组，除对照组外，其余各组加入DMEM基本培养基配制的胆固醇胶束（cholesterol micelles, C-M，10 mmol/L）构建肠上皮细胞高胆固醇模型[11]，给药组加入不同浓度的CeT溶液，对照组加入不含药物的培养基。干预24 h后，加入ORO Fixative固定液固定细胞；加入1 mL 60%异丙醇浸洗；加入油红O染液（ORO Stain A∶ORO Stain B＝3∶2），洗涤至孔内无红色剩余；加入Mayer苏木素染色液，洗涤；加入油红O染液缓冲液；加入蒸馏水覆盖细胞并拍照，使用Image-Pro Plus软件以脂滴与整个图像的面积比进行定量。 2.2.4 Bodipy荧光标记法 按“2.2.3”项下方法进行分组和给药，干预24 h后，PBS洗涤，室温下多聚甲醛固定30 min；每孔加入2 μmol/L Bodipy染色液，于37 ℃细胞培养箱中孵育15 min；弃去染色液，PBS洗涤；DAPI复染核5 min，PBS洗涤；观察并拍照。使用Image-Pro Plus软件以荧光强度进行统计。 2.2.5 Western blotting检测TICE相关蛋白表达 按“2.2.3”项下方法进行分组和给药，干预24 h后，收集细胞；PBS洗涤后使用蛋白裂解液提取总蛋白质，BCA定量法测定蛋白质浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶封闭3 h，用TBST洗涤后加入一抗，4 ℃孵育过夜；洗涤后加入二抗，室温孵育2 h；洗涤后进行显影，使用Image-Pro Plus软件分析条带灰度值。 2.2.6 免疫荧光检测LXRα/ABCG8和LXRα/ NPC1L1通路相关蛋白的影响 设置对照组、模型组、CeT（0.1 μmol/L）组、GSK2033（10 μmol/L）组和CeT＋GSK2033组，除对照组外，其余各组加入DMEM基本培养基配制的胆固醇胶束（10 mmol/L）构建肠上皮细胞高胆固醇模型，各给药组加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基。干预24 h后，PBS洗涤3次；4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次后加入Trition X-100，室温下通透10 min；PBS洗涤3次后，加入免疫染色封闭液封闭60 min，吸去多余的牛血清白蛋白；分别滴加100 μL LXRα（1∶200）、ABCG8（1∶200）、NPC1L1（1∶200）一抗，4 ℃孵育过夜；回收一抗，PBS浸洗3次，滴加100 μL二抗（1∶300），室温避光孵育60 min；PBS洗涤3次，滴加DAPI复染核15 min，PBS洗涤3次；滴加抗淬灭剂10 μL，扣片，正面朝下盖在载玻片上，荧光显微镜下观察并拍照。使用Image-Pro Plus软件分析荧光强度。 2.2.7 统计学分析 采用GraphPad Prism 9.0和SPSS 26.0软件进行统计分析，数据以表示。两组间数据分布的正态性和方差齐性分别以Kolmogo? rov-Smirnov和Levene检验确定。组间均数比较采用t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，组间有差异进一步采用SNK-q检验进行两两比较。 3 结果 3.1 网络药理学研究 3.1.1 CeT-肠道胆固醇代谢靶点 通过TCMSP等数据库得到94个CeT相关靶点。通过NCBI Gene等数据库得到15 415个肠道相关靶点、14 177个胆固醇代谢相关靶点。并构建韦恩图预测CeT-肠道胆固醇代谢共有靶点，见图1。 图片 3.1.2 CeT-靶点-肠道胆固醇代谢网络构建 将PPI导入Cytoscape 3.8.1软件进行可视化，发现1个关键的子网络，见图2。 图片 3.1.3 CeT-肠道胆固醇代谢的GO功能富集分析 对CeT调控肠道胆固醇代谢的作用及机制进行GO富集分析，分别得到855个生物进程、17个细胞组成、53个分子功能，根据P＜0.05，选出排名前10的条目，见图3。 图片 3.1.4 CeT-肠道胆固醇代谢的KEGG通路富集分析 CeT调控肠道胆固醇代谢的通路涉及34条，根据P＜0.05，选出排名前10的通路，见图4。其中，主要涉及脂肪的消化和吸收、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）等信号通路。其中，肠道脂质代谢的关键通路（fat digestion and absorption）的靶点（ABCG5、ABCG8、NPC1L1）主要涉及CeT-靶点-肠道胆固醇代谢网络的关键网络之一（图5）。并且该网络主要涉及胆固醇排泄的关键途径——TICE途径。 图片 图片 3.2 分子对接分析 CeT与NR1H3（LXRα）结合能为?28.131 4 kJ/mol，可视化显示，匹配度良好，化合物与靶点结合的最优构象以氢键的方式呈现，结合活性良好，见图6。 图片 3.3 体外实验研究 3.3.1 CeT浓度筛选 不同浓度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L）的CeT分别干预IEC-6细胞24、48 h后，如图7所示，干预24 h时随着CeT浓度的增加细胞存活率降低，CeT的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）为0.2 μmol/L。本研究在探索CeT安全浓度调控IEC-6细胞胆固醇代谢活性的同时，为了更进一步研究CeT在IC50时是否较安全浓度的效果更好，因此，选择0.05、0.10、0.20 μmol/L的CeT处理细胞24 h进行后续研究。 图片 3.3.2 CeT对IEC-6细胞内脂质的影响 如图8所示，油红O染色与Bodipy荧光标记结果均显示，与对照组比较，胆固醇胶束干预显著增加脂滴染色和荧光强度（P＜0.001），表明造模成功；与模型组比较，各剂量CeT均显著抑制IEC-6细胞中脂质积累（P＜0.05、0.01、0.001）。 图片 3.3.3 CeT对TICE途径关键蛋白的影响 NPC1L1是胆固醇吸收的重要蛋白，ABCG5/G8与胆固醇流出密切相关。如图9所示，与对照组比较，模型组NPC1L1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），ABCG5和ABCG8蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，CeT（0.2 μmol/L）组NPC1L1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），CeT（0.1、0.2 μmol/L）组ABCG5和ABCG8蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。因此，CeT可能通过抑制NPC1L1，促进ABCG5、ABCG8的表达，调控TICE途径介导的胆固醇摄取和流出。 图片 3.3.4 LXRα是CeT调控TICE途径的关键蛋白 如图10所示，与对照组比较，模型组LXRα、ABCG8表达显著降低（P＜0.01），NPC1L1表达显著增加（P＜0.001）；与模型组比较，CeT组LXRα、ABCG8表达显著增加（P＜0.001），NPC1L1表达显著降低（P＜0.01），LXRα抑制剂GSK2033组ABCG8表达显著降低（P＜0.01），NPC1L1表达显著增加（P＜0.05）；与CeT组比较，CeT＋GSK2033组LXRα、ABCG8表达显著降低（P＜0.01），NPC1L1表达显著增加（P＜0.01）。因此，CeT可能通过促进LXRα的表达，调控TICE途径中的关键蛋白NPC1L1、ABCG8介导的胆固醇摄取和流出。 图片 4 讨论 胆固醇广泛存在于机体中，具有广泛的生理作用，是组织细胞中不可缺少的重要物质，它不仅参与细胞膜的形成，也是合成胆汁酸、维生素D及甾体激素的重要原料，但当其过量时便会导致高胆固醇血症，研究表明，心血管疾病、胆石症和肿瘤与高胆固醇血症密切相关[12-13]。胆固醇在体内不能被降解，机体有效排泄胆固醇是维持胆固醇稳态的重要环节[2]。因此，促进体内胆固醇排泄以维持体内胆固醇的动态平衡可能是治疗胆固醇失衡相关疾病的新策略。 基于此，本研究通过网络药理学方法，探讨CeT通过调控肠上皮细胞胆固醇代谢的潜在靶点及相关机制。PPI网络发现，CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢涉及1个核心子网络。其中，ABCG5/8与NPC1L1为胆固醇摄取与流出相关的核心靶点。本研究通过体外构建和模拟肠上皮细胞高胆固醇环境，探索CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢的机制，油红O和Bodipy结果均显示，CeT能够呈浓度相关性地降低胆固醇胶束干预的肠上皮细胞内的脂质积蓄。进一步通过结合KEGG通路分析发现，该子网络中的核心靶点与肠道脂质代谢的关键通路（fat digestion and absorption）相匹配，通过深度分析该通路发现，其主要涉及肠上皮细胞摄取与流出胆固醇中的TICE途径。已有研究表明，胆固醇从体内排出的唯一途径是通过粪便直接排出或转化为胆汁酸后排出，粪便排泄可通过2种独立途径进行，第1种途径是胆汁分泌，该途径已被广泛描述和研究。第2种途径是通过TICE途径[14]。在2009年Van团队初步研究估计，TICE对野生型小鼠体内排出的粪便中性固醇总量的贡献约为30%[15]。接下来，该团队在2010年通过实验得出在小鼠中TICE途径占粪便中性甾醇排泄的70%[16]。在人体生理情况下，TICE途径排泄的胆固醇占粪便胆固醇排泄总量的35%[2,17]。TICE指由血直接经肠道分泌和排出血浆脂蛋白来源的胆固醇。包括肝源性含载脂蛋白B的脂蛋白被基底膜侧低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）和其他可能受体吸收、内化，最终通过ABCG5/G8以及其他可能的转运体从顶端膜流出排泄到肠腔[18]。另有研究发现，利用Ezetimibe抑制NPC1L1介导的胆固醇摄取可显著增强TICE途径[2]。而本研究表明，CeT干预处于高胆固醇环境中的肠上皮细胞后，NPC1L1被抑制，而ABCG5、ABCG8被激活。提示，CeT主要通过抑制NPC1L1减少肠上皮细胞胆固醇摄取和促进ABCG5、ABCG8增加胆固醇流出。 LXRα由于其抗动脉粥样硬化、去除胆固醇和抗炎活性，在胆固醇稳态的转录调控中发挥极其关键作用[19]。研究发现，LXRα可调控NPC1L1在肠上皮细胞中的表达，降低肠道胆固醇的吸收[20]。此外，ABCG5和ABCG8是LXRα的直接靶基因，常形成异二聚体ABCG5/G8发挥作用，负责将细胞内胆固醇泵入肠腔并最终通过粪便排出体外[21]。PPI子网络表明，NPC1L1、ABCG5以及ABCG8主要由LXRα交联。因此，在上述研究的基础上，通过分子对接模拟了CeT与LXRα的对接模式，结合活性良好。采用LXRα抑制剂GSK2033处理，结果显示，NPC1L1和ABCG5/G8主要受LXRα调控。提示，CeT可能通过LXRα/ABCG5/ABCG8和LXRα/ NPC1L1途径分别介导IEC-6细胞胆固醇摄取和流出，进而促进TICE途径介导的胆固醇排泄。 本研究通过网络药理学和相关实验发现，CeT可能通过抑制肠上皮细胞胆固醇摄取和促进胆固醇流出维持机体胆固醇稳态，这一效应与核心靶点LXRα密切相关，本研究拓展了CeT调控体内胆固醇代谢的机制，为维持体内胆固醇稳态和胆固醇失衡相关疾病的新药研发提供了新思路。

国内最大最专业的国家标准物质服务平台坛墨质检-国家标准物质中心（北京坛墨质检科技有限公司），是国家质检总局指定的国家标准物质研制单位，是国内最大最专业的食品、环境、职业卫生标准物质生产商和服务商。 产品编号 产品名称 标准值 BW5171灵芝酸A对照品，有报告HPLC≥98%BW5172隐丹参酮对照品，有报告HPLC≥98%BW5177黄芪总皂苷对照品，有报告UV≥98%BW5178黄芪皂苷I对照品，有报告HPLC≥98%BW5179黄芪皂苷II对照品，有报告HPLC≥98%BW5180黄芪皂苷III对照品，有报告HPLC≥98%BW5183络塞琳对照品，有报告HPLC≥98%BW5184络塞维对照品，有报告HPLC≥98%BW5185络缌对照品，有报告HPLC≥98%BW5186络塞定对照品，有报告HPLC≥98%BW5202盐酸氨基葡萄糖对照品，有报告HPLC≥98%BW5206雷公藤内酯甲;雷公藤酯甲对照品，有报告HPLC≥98%BW5210青蒿素对照品，有报告HPLC≥96%BW5214盐酸育亨宾;17alpha-羟基育亨烷-16alpha-羧酸甲酯盐酸盐对照品，有报告HPLC≥98%BW5216金雀花碱;野靛碱对照品，有报告HPLC≥98%BW5220原薯蓣皂苷;原薯蓣皂甙对照品，有报告HPLC≥98%BW5225芸香柚皮苷对照品，有报告HPLC≥98%BW5242氯化黄连碱；盐酸黄连碱对照品，有报告HPLC≥98%BW5244银杏内酯A对照品，有报告HPLC≥98%BW5245银杏内酯B对照品，有报告HPLC≥98%BW5246银杏内酯C对照品，有报告HPLC≥98%BW5264川芎嗪对照品，有报告HPLC≥98%BW5268羟基积雪草苷对照品，有报告HPLC≥98%BW5269积雪草酸对照品，有报告HPLC≥98%BW5270羟基积雪草酸对照品，有报告HPLC≥98% 坛墨质检现有员工79人，办公室面积450平米，实验室1650平米；销售、客服、财务及行政人员35人，实验室工作人员21人，库房14人，市场部8人。实验仪器设备：气相色谱、液相色谱、气质联用、液质联用、离子色谱、紫外分光光度计，原子吸收、ICP-OES和ICP-MS；库房面积450平米，库房工作人员12人，现货产品5万个，坛墨质检自主研发的产品近3000个，已申报国标345项，填补国内空白的产品达到65项。坛墨质检是国内唯一提供标准溶液定制服务的标准物质研制单位，定制范围：特殊浓度定制、特殊溶剂定制、混标定制。

国内最大最专业的国家标准物质服务平台坛墨质检-国家标准物质中心（北京坛墨质检科技有限公司），是国家质检总局指定的国家标准物质研制单位，是国内最大最专业的食品、环境、职业卫生标准物质生产商和服务商。BW5182 黄杨碱（环维黄杨星D）对照品，有报告 HPLC≥98% BW5183 络塞琳对照品，有报告 HPLC≥98% BW5184 络塞维对照品，有报告 HPLC≥98% BW5185 络缌对照品，有报告 HPLC≥98% BW5186 络塞定对照品，有报告 HPLC≥98% BW5187 槐果碱对照品，有报告 HPLC≥98% BW5188 花旗松素（二氢槲皮素）对照品，有报告 HPLC≥98% BW5189 槲皮素对照品，有报告 HPLC≥98% BW5190 槲皮苷对照品，有报告 HPLC≥98% BW5191 蒿甲醚对照品，有报告 HPLC≥98% BW5192 姜黄素对照品，有报告 HPLC≥98% BW5193 双去氧基姜黄素对照品，有报告 HPLC≥98% BW5194 莪术醇(姜黄醇)对照品，有报告 HPLC≥98% BW5195 金丝桃素对照品，有报告 HPLC≥98% BW5196 绞股蓝皂苷对照品，有报告 HPLC≥98% BW5197 苦杏仁苷对照品，有报告 HPLC≥98% BW5198 咖啡酸对照品，有报告 HPLC≥98% BW5200 硫辛酸对照品，有报告 HPLC≥98% BW5201 硫酸氨基葡萄糖对照品，有报告 HPLC≥98% BW5202 盐酸氨基葡萄糖对照品，有报告 HPLC≥98% BW5203 罗通定对照品，有报告 HPLC≥98% BW5204 落新妇苷对照品，有报告 HPLC≥98% BW5205 雷公藤乙素对照品，有报告 HPLC≥98% BW5206 雷公藤内酯甲;雷公藤酯甲对照品，有报告 HPLC≥98% BW5207 木犀草素对照品，有报告 HPLC≥98% BW5208 蒙花苷对照品，有报告 HPLC≥98% BW5209 莽草酸对照品，有报告 HPLC≥98% 坛墨质检现有员工79人，办公室面积450平米，实验室1650平米；销售、客服、财务及行政人员35人，实验室工作人员21人，库房14人，市场部8人。实验仪器设备：气相色谱、液相色谱、气质联用、液质联用、离子色谱、紫外分光光度计，原子吸收、ICP-OES和ICP-MS；库房面积450平米，库房工作人员12人，现货产品5万个，坛墨质检自主研发的产品近3000个，已申报国标345项，填补国内空白的产品达到65项。坛墨质检是国内唯一提供标准溶液定制服务的标准物质研制单位，定制范围：特殊浓度定制、特殊溶剂定制、混标定制。

国内最大最专业的国家标准物质服务平台坛墨质检-国家标准物质中心（北京坛墨质检科技有限公司），是国家质检总局指定的国家标准物质研制单位，是国内最大最专业的食品、环境、职业卫生标准物质生产商和服务商。 BW6232通关藤苷X对照品，有报告HPLC≥98%BW5024大车前苷对照品，有报告HPLC≥98%BW5475山奈苷对照品，有报告HPLC≥98%BW5133欧前胡素对照品，有报告HPLC≥98%BW5135莱苞迪甙A对照品，有报告HPLC≥98%BW5138秦皮素对照品，有报告HPLC≥98%BW56381-咖啡酰奎宁酸对照品，有报告HPLC≥98%BW51481,3-二咖啡酰奎宁酸对照品，有报告HPLC≥98%BW51491,5-二咖啡酰奎宁酸对照品，有报告HPLC≥98%BW5150盐酸巴马汀（黄藤素，棕榈碱）对照品，有报告HPLC≥98%BW5156异甘草苷对照品，有报告HPLC≥98%BW5162芦荟大黄素对照品，有报告HPLC≥98%BW5166白藜芦醇对照品，有报告HPLC≥98%BW5171灵芝酸A对照品，有报告HPLC≥98%BW5172隐丹参酮对照品，有报告HPLC≥98%BW5177黄芪总皂苷对照品，有报告UV≥98%BW5178黄芪皂苷I对照品，有报告HPLC≥98%BW5179黄芪皂苷II对照品，有报告HPLC≥98%BW5180黄芪皂苷III对照品，有报告HPLC≥98%BW5183络塞琳对照品，有报告HPLC≥98%BW5184络塞维对照品，有报告HPLC≥98%BW5185络缌对照品，有报告HPLC≥98%BW5186络塞定对照品，有报告HPLC≥98%BW5202盐酸氨基葡萄糖对照品，有报告HPLC≥98%BW5206雷公藤内酯甲;雷公藤酯甲对照品，有报告HPLC≥98%BW5210青蒿素对照品，有报告HPLC≥96%BW5214盐酸育亨宾;17alpha-羟基育亨烷-16alpha-羧酸甲酯盐酸盐对照品，有报告HPLC≥98% 坛墨质检现有员工79人，办公室面积450平米，实验室1650平米；销售、客服、财务及行政人员35人，实验室工作人员21人，库房14人，市场部8人。实验仪器设备：气相色谱、液相色谱、气质联用、液质联用、离子色谱、紫外分光光度计，原子吸收、ICP-OES和ICP-MS；库房面积450平米，库房工作人员12人，现货产品5万个，坛墨质检自主研发的产品近3000个，已申报国标345项，填补国内空白的产品达到65项。坛墨质检是国内唯一提供标准溶液定制服务的标准物质研制单位，定制范围：特殊浓度定制、特殊溶剂定制、混标定制。

国内最大最专业的国家标准物质服务平台坛墨质检-国家标准物质中心（北京坛墨质检科技有限公司），是国家质检总局指定的国家标准物质研制单位，是国内最大最专业的食品、环境、职业卫生标准物质生产商和服务商。 产品编号 产品名称 纯度 BW40761,4-苯醌标准品,有证书-（对苯醌）见证书BW4082三聚氰胺标准品,有证书98.50%BW4083D-果糖标准品,有证书99.50%BW4084三氮唑嘧啶酮标准品-催吐剂，有证书见证书BW4085乙基麦芽酚标准品,有证书99.80%BW4086盐酸吡哆醛标准品,有证书见证书BW4087吡哆胺标准品,有证书见证书BW4092苯甲醇标准品,有证书99.90%BW4093精氨酸标准品,有证书见证书BW4094苏氨酸标准品,有证书见证书BW4095甘氨酸标准品,有证书见证书BW4096酪氨酸标准品,有证书见证书BW4097L-酪氨酸标准品，有证书99.00%BW4098靛蓝标准品（水溶性，食品检测用），有证书99.90%BW4099L-半胱氨酸标准品，有证书99.90%BW41002-氯甲苯标准品,有证书见证书BW4101正十六烷标准品,有证书见证书BW4102五氯硝基苯标准品,有证书见证书BW4103吡啶硫酮锌标准品,有证书99.30%BW4104对二氯苯标准品-1,4-二氯苯,有证书见证书BW5001冬凌草甲素对照品,有报告见证书BW5002*野百合碱(猪屎豆碱)对照品,有报告见证书BW5004*雷公藤甲素（雷公藤内酯醇）对照品,有报告见证书BW5005*黄芪皂苷IV对照品,有报告见证书BW5007*没食子酸对照品,有报告见证书BW5008靛蓝对照品（脂溶性）,有检测报告95.50% 坛墨质检现有员工79人，办公室面积450平米，实验室1650平米；销售、客服、财务及行政人员35人，实验室工作人员21人，库房14人，市场部8人。实验仪器设备：气相色谱、液相色谱、气质联用、液质联用、离子色谱、紫外分光光度计，原子吸收、ICP-OES和ICP-MS；库房面积450平米，库房工作人员12人，现货产品5万个，坛墨质检自主研发的产品近3000个，已申报国标345项，填补国内空白的产品达到65项。坛墨质检是国内唯一提供标准溶液定制服务的标准物质研制单位，定制范围：特殊浓度定制、特殊溶剂定制、混标定制。

国内最大最专业的国家标准物质服务平台坛墨质检-国家标准物质中心（北京坛墨质检科技有限公司），是国家质检总局指定的国家标准物质研制单位，是国内最大最专业的食品、环境、职业卫生标准物质生产商和服务商。 产品编号 产品名称 标准值 BW5507香叶木素-7-葡萄糖苷对照品，有报告HPLC≥98%BW5508水仙苷对照品，有报告HPLC≥98%BW5509芍药内酯苷,HPLC=91%对照品，有报告HPLC≥98%BW5511白蜡树素; 涔皮素; 二甲基白蜡树亭对照品，有报告HPLC≥98%BW5512环氧泽泻烯对照品，有报告HPLC≥98%BW5513N-甲基野靛碱；N-甲基金雀花碱对照品，有报告HPLC≥98%BW5514硫酸金雀花碱对照品，有报告HPLC≥98%BW5515百蕊草素I对照品，有报告HPLC≥98%BW5516草质素；蜀葵苷元对照品，有报告HPLC≥98%BW5517菝葜皂苷元; 知母皂苷元对照品，有报告HPLC≥98%BW5520梣酮对照品，有报告HPLC≥98%BW5524白头翁皂苷B4对照品，有报告HPLC≥98%BW5526次野鸢尾黄素对照品，有报告HPLC≥98%BW5532汉黄芩素对照品，有报告HPLC≥98%BW5533松萝酸; 松罗酸对照品，有报告HPLC≥98%BW55358-姜酚对照品，有报告HPLC≥98%BW553610-姜酚对照品，有报告HPLC≥98%BW5537石斛碱对照品，有报告HPLC≥98%BW5538雷公藤内酯酮（雷藤酮）对照品，有报告HPLC≥98%BW5543牡荆素葡萄糖苷对照品，有报告HPLC≥98%BW5544毛蕊异黄酮对照品，有报告HPLC≥98%BW5546黄柏碱对照品，有报告HPLC≥98%BW5548莪术二酮; 姜黄二酮; 莪二酮对照品，有报告HPLC≥98%BW5549氧化槐果碱对照品，有报告HPLC≥98%BW5550杨梅苷对照品，有报告HPLC≥98%BW5552银杏内酯J; 白果苦内酯J对照品，有报告HPLC≥98% 坛墨质检现有员工79人，办公室面积450平米，实验室1650平米；销售、客服、财务及行政人员35人，实验室工作人员21人，库房14人，市场部8人。实验仪器设备：气相色谱、液相色谱、气质联用、液质联用、离子色谱、紫外分光光度计，原子吸收、ICP-OES和ICP-MS；库房面积450平米，库房工作人员12人，现货产品5万个，坛墨质检自主研发的产品近3000个，已申报国标345项，填补国内空白的产品达到65项。坛墨质检是国内唯一提供标准溶液定制服务的标准物质研制单位，定制范围：特殊浓度定制、特殊溶剂定制、混标定制。

国内最大最专业的国家标准物质服务平台坛墨质检-国家标准物质中心（北京坛墨质检科技有限公司），是国家质检总局指定的国家标准物质研制单位，是国内最大最专业的食品、环境、职业卫生标准物质生产商和服务商。BW5506 脱水穿心莲内酯对照品，有报告 HPLC≥98% BW5507 香叶木素-7-葡萄糖苷对照品，有报告 HPLC≥98% BW5508 水仙苷对照品，有报告 HPLC≥98% BW5509 芍药内酯苷,HPLC=91%对照品，有报告 HPLC≥98% BW5510 山奈素对照品，有报告 HPLC≥98% BW5511 白蜡树素; 涔皮素; 二甲基白蜡树亭对照品，有报告 HPLC≥98% BW5512 环氧泽泻烯对照品，有报告 HPLC≥98% BW5513 N-甲基野靛碱；N-甲基金雀花碱对照品，有报告 HPLC≥98% BW5514 硫酸金雀花碱对照品，有报告 HPLC≥98% BW5515 百蕊草素I对照品，有报告 HPLC≥98% BW5516 草质素；蜀葵苷元对照品，有报告 HPLC≥98% BW5517 菝葜皂苷元; 知母皂苷元对照品，有报告 HPLC≥98% BW5520 梣酮对照品，有报告 HPLC≥98% BW5524 白头翁皂苷B4对照品，有报告 HPLC≥98% BW5526 次野鸢尾黄素对照品，有报告 HPLC≥98% BW5532 汉黄芩素对照品，有报告 HPLC≥98% BW5533 松萝酸; 松罗酸对照品，有报告 HPLC≥98% BW5534 7-羟基香豆素,伞形花内酯; 伞形酮对照品，有报告 HPLC≥98% BW5535 8-姜酚对照品，有报告 HPLC≥98% BW5536 10-姜酚对照品，有报告 HPLC≥98% BW5537 石斛碱对照品，有报告 HPLC≥98% BW5538 雷公藤内酯酮（雷藤酮）对照品，有报告 HPLC≥98% BW5539 异阿魏酸; 3-羟基-4-甲氧基肉桂酸对照品，有报告 HPLC≥98% BW5540 豆甾醇对照品，有报告 HPLC≥98% BW5541 刺芒柄花苷; 芒柄花苷对照品，有报告 HPLC≥98% BW5542 没食子儿茶素（棓儿茶酸、没食子酰儿茶素）对照品，有报告 HPLC≥98% 坛墨质检现有员工79人，办公室面积450平米，实验室1650平米；销售、客服、财务及行政人员35人，实验室工作人员21人，库房14人，市场部8人。实验仪器设备：气相色谱、液相色谱、气质联用、液质联用、离子色谱、紫外分光光度计，原子吸收、ICP-OES和ICP-MS；库房面积450平米，库房工作人员12人，现货产品5万个，坛墨质检自主研发的产品近3000个，已申报国标345项，填补国内空白的产品达到65项。坛墨质检是国内唯一提供标准溶液定制服务的标准物质研制单位，定制范围：特殊浓度定制、特殊溶剂定制、混标定制。

国内最大最专业的国家标准物质服务平台坛墨质检-国家标准物质中心（北京坛墨质检科技有限公司），是国家质检总局指定的国家标准物质研制单位，是国内最大最专业的食品、环境、职业卫生标准物质生产商和服务商。 BW5497川续断皂苷VI; 木通皂苷D对照品，有报告HPLC≥98%BW5498大波斯菊苷（ 芹菜素-7-葡萄糖苷）对照品，有报告HPLC≥98%BW5499辽东楤木皂苷V对照品，有报告HPLC≥98%BW5500辽东楤木皂苷X对照品，有报告HPLC≥98%BW5501辽东楤木皂苷VII对照品，有报告HPLC≥98%BW5502阿魏酸乙酯对照品，有报告HPLC≥98%BW5507香叶木素-7-葡萄糖苷对照品，有报告HPLC≥98%BW5508水仙苷对照品，有报告HPLC≥98%BW5509芍药内酯苷,HPLC=91%对照品，有报告HPLC≥98%BW5511白蜡树素; 涔皮素; 二甲基白蜡树亭对照品，有报告HPLC≥98%BW5512环氧泽泻烯对照品，有报告HPLC≥98%BW5513N-甲基野靛碱；N-甲基金雀花碱对照品，有报告HPLC≥98%BW5514硫酸金雀花碱对照品，有报告HPLC≥98%BW5515百蕊草素I对照品，有报告HPLC≥98%BW5516草质素；蜀葵苷元对照品，有报告HPLC≥98%BW5517菝葜皂苷元; 知母皂苷元对照品，有报告HPLC≥98%BW5520梣酮对照品，有报告HPLC≥98%BW5524白头翁皂苷B4对照品，有报告HPLC≥98%BW5526次野鸢尾黄素对照品，有报告HPLC≥98%BW5532汉黄芩素对照品，有报告HPLC≥98%BW5533松萝酸; 松罗酸对照品，有报告HPLC≥98%BW55358-姜酚对照品，有报告HPLC≥98%BW553610-姜酚对照品，有报告HPLC≥98%BW5537石斛碱对照品，有报告HPLC≥98%BW5538雷公藤内酯酮（雷藤酮）对照品，有报告HPLC≥98%BW5543牡荆素葡萄糖苷对照品，有报告HPLC≥98% 坛墨质检现有员工79人，办公室面积450平米，实验室1650平米；销售、客服、财务及行政人员35人，实验室工作人员21人，库房14人，市场部8人。实验仪器设备：气相色谱、液相色谱、气质联用、液质联用、离子色谱、紫外分光光度计，原子吸收、ICP-OES和ICP-MS；库房面积450平米，库房工作人员12人，现货产品5万个，坛墨质检自主研发的产品近3000个，已申报国标345项，填补国内空白的产品达到65项。坛墨质检是国内唯一提供标准溶液定制服务的标准物质研制单位，定制范围：特殊浓度定制、特殊溶剂定制、混标定制。