猫尾草异黄酮对照品

[align=center][b]HPLC法测定黄芪水提物中的毛蕊异黄酮苷含量[/b][/align][b]黄芪中的主要有效成分除皂苷外就是异黄酮类化合物。异黄酮类成分具有调节免疫、抗肿瘤、抗突变、抗氧化、抗炎、抗突变抗辐射、抗心肌缺血、抗心律失常、抗病毒、抗细胞凋亡、保肝、防止动脉粥样硬化等作用[sup][/sup]，其代表成分就是毛蕊异黄酮 7-O-β-D 吡喃葡萄糖苷（即毛蕊异黄酮苷）。2010版药典才开始将毛蕊异黄酮苷收录为黄芪中有效成分含量测定项。本章实验借鉴药典中的测定方法，对不同工艺条件下获得的黄芪水提物中的毛蕊异黄酮苷含量进行考察，以期为优化芪龙胶囊和黄芪配方颗粒中黄芪的提取工艺参数提供科学基础和理论依据。[b]1 材料和仪器1.1 样品 [/b] 收集9组黄芪水提取物样品，黄芪饮片为济南济成堂中药饮片有限公司提供（批号18033101）。[b]1.2 试剂 [/b]毛蕊异黄酮苷对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司批号M-020-170926），乙腈为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；超纯水。[b]1.3 仪器 [/b]液相色谱系统，包括日本岛津公司LC-20AT型液相色谱仪，LC-20AT岛津输液泵，CTO-20A柱温箱，SIL-20A自动进样器，SPD-20A紫外-可见光检测器；超声波清洗机KS-300E（宁波科生仪器厂）；电子天平MS205DU（梅特勒/瑞士）。[b]2 方法学考察2.1 色谱条件及系统适应性试验[/b]DiamonsiL（钻石）C18柱（250*4.6 mm，5 mm）。以乙腈为流动相A，0.2%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱，A相：0→20 min A为20→40%；20→30 min A保持40%；30→40 min A保持20%。检测波长260 nm；流速为1 mL/min；柱温35 ℃进样量为10 μL。毛蕊异黄酮苷对照品溶液以及黄芪水提物样品色谱图见图4-1与图4-2。[/b][align=center][img=,690,365]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131706005051_4964_3237657_3.png!w690x365.jpg[/img][/align][align=center]图4-1 毛蕊异黄酮苷对照品色谱图[/align][align=center][img=,690,384]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131706118782_6652_3237657_3.png!w690x384.jpg[/img][/align][align=center]图4-2 黄芪水提物样品色谱图[/align][b]2.2 供试品溶液的制备[/b]精密称定1/50重量的黄芪水提物样品（折合黄芪药材2 g）置于锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，超声30 min，过滤，将滤液放至水浴锅上蒸干，残渣用甲醇溶解，并定容至25 mL，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，即得。[b]2.3 对照品储备溶液的制备[/b]精密称取黄芪甲苷标品5.10mg至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，摇匀，即得浓度为0.51 mg/mL的对照品储备溶液。[b]3 结果3.1 线性关系考察[/b]精密吸取 2. 3 项下对照品储备溶液 4，2，1，0.5，0.25 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为204.00，102.00，51.00，25.50，12.75 μg/mL的对照品溶液。按“2.3”项下色谱条件分别进样10 μL，利用自动积分功能测定峰面积积分值，并以峰面积积分值与浓度进行线性回归。如图3，得回归方程为：Y =25445X + 44225（r[sup]2[/sup]= 0.9994）提示毛蕊异黄酮苷在12.75～204.00 μg/mL范围内线性关系良好。毛蕊异黄酮苷对照品标准曲线如图4-3所示。[align=center][img=,690,406]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131706302801_395_3237657_3.png!w690x406.jpg[/img][/align][align=center]图4-3 毛蕊异黄酮苷标准曲线[/align][b]3.2 精密度实验[/b]按2. 2 项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，重复进样 6 次，记录色谱图峰面积，测定毛蕊异黄酮苷含量，计算得相对标准偏差RSD为1.6% ，提示该方法精密度良好。[b]3.3 重复性实验[/b]取同一黄芪样品 6份，按“2. 2”项下方法制备供试品溶液，在拟定分析条件下，精密吸取供试品溶液10 μL，测定毛蕊异黄酮苷含量，计算得RSD为1.1%，提示该方法重复性良好。[b]3.4 稳定性实验 [/b]按2. 2 项下方法制备供试品溶液，分别在0 h、3 h、6 h、9 h、24 h、48 h后，准确吸取 10 μL 进样分析，测定毛蕊异黄酮苷含量，计算得 RSD 为 0.6%，提示黄芪供试品溶液在48h内稳定性良好。[b]3.5 加样回收率实验[/b]精密称取 6 份毛蕊异黄酮苷含量已知的黄芪水提物样品，每份折合黄芪药材 0. 5 g，分别准确加入样品中毛蕊异黄酮苷含量的50%，50%，100%，100%，150%，150%重量的毛蕊异黄酮苷标品，按2. 2 项下方法制备供试品溶液，准确吸取 10 μL 进样分析，测定毛蕊异黄酮苷含量，计算回收率，结果见表4-1。方法平均回收率为108.48%，表明该方法具有较好的回收率。[align=center]表4-1 毛蕊异黄酮苷加样回收率测定结果[/align] [table][tr][td] [align=center]样号[/align] [/td][td] [align=center]样品中的量/mg[/align] [/td][td] [align=center]加入量[/align] [align=center]/mg[/align] [/td][td] [align=center]测得量/mg[/align] [/td][td] [align=center]回收率[/align] [align=center]/%[/align] [/td][td] [align=center]平均值/%[/align] [/td][td] [align=center]RSD[/align] [align=center]/%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]0.52 [/align] [/td][td] [align=center]1.64 [/align] [/td][td] [align=center]111.54 [/align] [/td][td=1,6] [align=center]108.85 [/align] [/td][td=1,6] [align=center]2.9 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]0.52 [/align] [/td][td] [align=center]1.64 [/align] [/td][td] [align=center]112.08 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]2.22 [/align] [/td][td] [align=center]109.20 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]2.24 [/align] [/td][td] [align=center]111.02 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]1.59 [/align] [/td][td] [align=center]2.72 [/align] [/td][td] [align=center]104.57 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]6[/align] [/td][td] [align=center]1.06 [/align] [/td][td] [align=center]1.59 [/align] [/td][td] [align=center]2.72 [/align] [/td][td] [align=center]104.67 [/align] [/td][/tr][/table][b]3.6 毛蕊异黄酮苷的含量测定结果[/b]取9组黄芪水提物按照“2.2”项下操作，制备供试品溶液，准确吸取 10 μL 进样分析，测定毛蕊异黄酮苷的含量。结果见表2。[align=center]表4-2 9组黄芪水提物中毛蕊异黄酮苷含量测定结果[/align] [table][tr][td] [align=center]批号[/align] [/td][td] [align=center]峰面积[/align] [/td][td] [align=center]含量(mg/g)[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1123989.50 [/align] [/td][td] [align=center]0.53 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2707047.50 [/align] [/td][td] [align=center]1.31 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1947171.50 [/align] [/td][td] [align=center]0.93 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]3573103.75 [/align] [/td][td] [align=center]1.73 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]1824562.00 [/align] [/td][td] [align=center]0.87 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]6[/align] [/td][td] [align=center]2767419.00 [/align] [/td][td] [align=center]1.34 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]7[/align] [/td][td] [align=center]2077551.50 [/align] [/td][td] [align=center]1.00 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]8[/align] [/td][td] [align=center]1677225.50 [/align] [/td][td] [align=center]0.80 [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]9[/align] [/td][td] [align=center]1725416.00 [/align] [/td][td] [align=center]0.83 [/align] [/td][/tr][/table][b]3.7 毛蕊异黄酮苷转移率测定正交试验结果[/b]水提的毛蕊异黄酮苷转移率考察正交试验与水提的出膏率考察正交试验设计相同，即以水作为提取溶剂，把影响药材提取效果的用水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）确定为考察因素，以上三个考查因素各分3个水平考察，见表4-3。[align=center]表4-3水提实验因素水平表[/align] [table][tr][td=1,2] [align=center]水平[/align] [/td][td=3,1] [align=center]因素[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]A（用水量/倍）[/align] [/td][td] [align=center]B（提取时间/h）[/align] [/td][td] [align=center]C（提取次数/次）[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]8[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]10[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][/tr][/table][b] [/b]毛蕊异黄酮苷转移率=各实验组黄芪提取物中毛蕊异黄酮苷含量/原黄芪药材中毛蕊异黄酮苷含量×100%。原药材中毛蕊异黄酮苷的含量按照药典的方法测得的结果为0.1425mg/g。跟据实验数据，得到水提实验中设定的不同工艺条件下的毛蕊异黄酮苷的转移率，其中因素D为误差项，作直观分析表和方差分析表，见表4-4，4-5。[align=center]表4-4 毛蕊异黄酮苷转移率考察L[sub]9[/sub](3[sup]4[/sup])正交试验表[/align] [table][tr][td] [align=center]批号[/align] [/td][td] [align=center]A[/align] [/td][td] [align=center]B[/align] [/td][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]D[/align] [/td][td] [align=center]毛蕊异黄酮苷[/align] [align=center]转移率/%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]37.21[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]91.77[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]65.58[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]121.62[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]61.36[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]6[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]93.85[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]7[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]70.08[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]8[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]56.28[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]9[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]57.94[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]K1[/align] [/td][td] [align=center]194.56[/align] [/td][td] [align=center]228.91[/align] [/td][td] [align=center]187.34[/align] [/td][td] [align=center]156.51[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]K2[/align] [/td][td] [align=center]276.83[/align] [/td][td] [align=center]209.41[/align] [/td][td] [align=center]271.33[/align] [/td][td] [align=center]255.70[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]K3[/align] [/td][td] [align=center]184.30[/align] [/td][td] [align=center]217.37[/align] [/td][td] [align=center]197.02[/align] [/td][td] [align=center]243.48[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]优水平[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]R[/align] [/td][td] [align=center]92.53[/align] [/td][td] [align=center]19.50[/align] [/td][td] [align=center]83.99[/align] [/td][td] [align=center]99.19[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][/table][b] [/b][align=center]表4-5 毛蕊异黄酮苷转移率考察方差分析表[/align] [table][tr][td] [align=center]方差来源[/align] [/td][td] [align=center]离差平方和[/align] [/td][td] [align=center]自由度[/align] [/td][td] [align=center]F[/align] [/td][td] [align=center]显著性[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]A[/align] [/td][td] [align=center]1715.05[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1.50[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]B[/align] [/td][td] [align=center]64.09[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]0.04[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]C[/align] [/td][td] [align=center]1407.78[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1.13[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]方差来源[/align] [/td][td] [align=center]离差平方和[/align] [/td][td] [align=center]自由度[/align] [/td][td] [align=center]F[/align] [/td][td] [align=center]显著性[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]D [/align] [/td][td] [align=center]1950.20[/align] [/td][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][/tr][/table]注：F[sub]0.1[/sub]（2,2）=9，F[sub]0.05[/sub]（2,2）=19，*为有显著性，-为无显著性。从正交试验结果可知：水提实验中，各因素对毛蕊异黄酮苷转移率的影响大小顺序为：A（用水量）C(提取次数)B(提取时间)；每个因素3水平之间的趋势为A[sub]2[/sub]A[sub]1[/sub]A[sub]3[/sub]，B[sub]1[/sub]B[sub]3[/sub]B[sub]2[/sub]，C[sub]2[/sub]C[sub]3[/sub]C[sub]1[/sub]，直观分析得提取工艺为A[sub]2[/sub]B[sub]1[/sub]C[sub]2[/sub]，即加水8倍量，提取2次，每次1h。表4-5的方差分析结果表明： A、B、C三因素的对毛蕊异黄酮的转移率影响都无统计学差异(PC(提取次数)B(提取时间)；每个因素3水平之间的趋势为A[sub]2[/sub]A[sub]3[/sub]A[sub]1[/sub]，B[sub]1[/sub]B[sub]3[/sub]B[sub]2[/sub]，C[sub]2[/sub]C[sub]3[/sub]C[sub]1[/sub]，直观分析得提取工艺为A[sub]2[/sub]B[sub]1[/sub]C2，即加水8倍量，提取2次，每次1h。表4-7的方差分析结果表明：A、B、C三因素对综合评分的影响都无统计学差异(P0.05)。[b]4 讨论[/b]本章实验借鉴药典中测定黄芪药材中毛蕊异黄酮苷含量的方法，利用紫外-可见光检测器的高效液相色谱仪测定黄芪水提物中毛蕊异黄酮苷的含量。与药典中方法测得的结果相比，本实验测得的结果除色谱峰分离度稍差外，其他方法学考察指标显示良好。从毛蕊异黄酮苷转移率测定正交试验结果来看，第4组实验毛蕊异黄酮苷转移率最高，这也是正交结果分析中最佳提取工艺，即加水8倍量，提取2次，每次1小时。本结果与上一章实验中第四组黄芪水提物中黄芪甲苷的转移率最高结果一致，但其他组别毛蕊异黄酮苷的转移率高低顺序与上一章黄芪甲苷的转移率高低顺序并不一致，这说明毛蕊异黄酮苷和黄芪甲苷对提取工艺的要求并不完全一致。同一种原药材，加工成不同功效的药物，那么发挥药效的物质也有可能不同，因此相应的提取工艺也是需要根据药效物质适时调整的。另外，用水量在设置的三个因素中对毛蕊异黄酮苷的转移率影响最大，但仍无统计学差异(P0.05)，说明用水量、提取次数、提取时间三种工艺的改变对黄芪水提物中毛蕊异黄酮苷的含量无显著性影响。从综合评分计算正交试验结果来看，第4组实验综合评分最高，这也是正交结果分析中最佳提取工艺，即加水8倍量，提取2次，每次1小时。用水量在设置的三个因素中对综合评分影响最大，但仍无统计学差异(P0.05)，说明用水量、提取次数、提取时间三种工艺的改变对黄芪水提工艺的综合评分无显著性影响。综合出膏率、黄芪甲苷和毛蕊异黄酮苷的含量得出综合评分来优选黄芪水提的最佳提取工艺，能够从化学成分的角度来客观全面地评价和研究黄芪水提的关键环节，这也为芪龙胶囊和黄芪配方颗粒水提环节工艺的优化提供借鉴和指导。[align=center] [/align][align=center]参考文献[/align] 陈建真,吕圭源, 叶磊, 等.黄芪黄酮的化学成分与药理作用研究进展. 医药导报, 2009, 28(10): 1314-1316. 赵四清,周日宝, 陈胜璜, 等.不同的产地加工方法对中药材金樱子质量的影响. 湖南中医学院学报, 2005, 25(3): 21-22.

本实验分别提取两年生、三年生无腺毛甘草主根、侧根、水平根及茎中的黄酮，并测定其含量，初步找出消长规律。以甲醇为提取溶剂，索氏提取法提取黄酮，分光光度法测定总黄酮含量。结果表明两年生无腺毛中主根、侧根、水平根及茎中的黄酮含量分别为1.28%、1.28%、1.56%、0.73%；三年生无腺毛中主根、侧根、水平根及茎中的黄酮含量分别为1.75%、1.46%、1.81%、0.41%。随着年限的增大，无腺毛甘草中根部的黄酮含量逐渐增大。同龄期无腺毛甘草中黄酮含量：水平根最高，主根和侧根次之，茎最小。 无腺毛甘草 黄酮 含量测定 消长规律1.前 言无腺毛甘草（Glycyrrhiza eglandulosa X.Y.Li）是石河子大学李学禹教授在新疆发现、1993年命名的新种，也是我国的特有种。它生长的环境条件比乌拉尔甘草（G. uralensis）更恶劣，因而更加耐干旱、耐盐碱，而且是很适合于低产地、弃耕地等恶劣环境条件下生长的抗逆性极强的甘草物种。这个种在形态分类系统学、细胞学、生态学都有研究，根据细胞染色体组型分析与形态数值分析，都证实它与乌拉尔甘草、光果甘草亲缘关系较近，但在化学成分方面未进行系统研究。根据资料报导，产于新疆的胀果甘草(G.inflata)、黄甘草(G.eurycarpa)及云南的云南甘草(G.yunnanensis)都发现过大量的具有生理活性的新的化学成分。由此可知：一个形态性状特异、分布于逆境条件下能正常生长的新物种，肯定具有抗逆性较强的基因所决定的代谢产物，肯定有特殊性。为此，我们拟从应用开发的角度，提取无腺毛甘草中黄酮类化合物，对其进行含量测定，并进一步研究其在不同龄期、不同部位黄酮类化合物的消长规律，为进一步研究其化学组成和结构打下基础，并且为退耕还草大面积栽培无腺毛甘草提供科学依据。2.实验部分2.1实验仪器、样品与试剂2.1.1实验仪器：紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司），索氏提取器（自治区化玻站提供），烘干箱（湖北省黄石医疗器材厂），电光分析天平（上海棱光技术有限公司），精密PH计(上海雷磁仪器厂)。2.1.2实验样品：两年生、三年生的无腺毛甘草（石河子大学甘草栽培基地李学禹教授提供）。2.1.3实验试剂：柚皮苷对照品（中国药品生物制品检定所），10%的氢氧化钾溶液，甲醇(AR)。2.2黄酮类化合物的提取分别称取3份两年生无腺毛甘草的主根粉碎后放入索氏提取器中，加入甲醇回流2h,冷却后分别将回流液转移至容量瓶中，提取两次，提取液合并，用甲醇定容。用同样的方法分别提取两年生无腺毛甘草的水平根、侧根和茎以及三年生无腺毛甘草中主根、侧根、水平根、茎中的黄酮。2.3黄酮类化合物的含量测定2.3.1对照品溶液的制备准确称取柚皮苷对照品适量，用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，制得浓度约为1.0mg.mL-1的对照品溶液。2.3.2最大吸收峰的确定精确吸取柚皮苷对照品溶液0.5ml，加入5ml甲醇，再加入10%KOH溶液2.5ml，室温放置5min，用甲醇稀释至50ml[

【作者】 王晓辉； 刘涛； 李清； 陈晓辉； 毕开顺；【Author】 WANG Xiaohui,LIU Tao,LI Qing,CHEN Xiaohui,BI Kaishun(School of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016,China)【机构】 沈阳药科大学药学院； 沈阳药科大学药学院 辽宁沈阳110016； 辽宁沈阳110016；【摘要】 对蒙古黄芪中5种异黄酮类成分的含量进行了反相高效液相色谱法测定。色谱柱为D iam ons il C18柱,流动相为乙腈-水系统,梯度洗脱,检测波长230nm,柱温35℃。毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷在20.12~201.2m g/L、芒丙花素-7-O-β-D-葡萄糖苷在4.62~46.2m g/L、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷在4.86~48.6m g/L、毛蕊异黄酮在9.24~92.4m g/L、芒丙花素在6.92~69.2m g/L时峰面积与浓度呈良好的线性关系,相关系数分别为0.999 2,0.999 7,0.999 7,0.999 5和0.999 5。5种成分的加样回收率均高于94%,相对标准偏差(RSD)小于3.2%(n=9)。该法简便快速,重复性良好,结果准确可靠,可用于黄芪药材中5种主要异黄酮类成分的含量测定。 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/07/201207301613_380608_2379123_3.jpg

寒冷的冬天，整个人都是懒洋洋的，尽管有很多试验经历、色谱柱使用体会、很多的原创素材，都懒的起笔。2013年马上来临，趁着2012年的第五届原创大赛，赶快记录一篇原创，分享自己更多的使用体会与试验经历给大家探讨。这次检测的是大豆异黄酮，说起这个，估计很少人接触，而我已经跟它已经认识了好几年。异黄酮是一类物质，有苷和苷元之分，可是接触了很久都不知道苷和苷元有什么区别，为什么这个叫苷，另外一个就叫苷元。而且保健品中有很多叫甙，我也搞不清楚甙和苷有什么区别。大豆异黄酮的测定，目前存在的标准方法：GB/T 23788-2009保健食品中大豆异黄酮的测定方法 高效液相色谱法NY/T 1252-2006大豆异黄酮http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/12/201212281607_416709_1608710_3.jpg实验过程：色谱柱：Topsil 液相色谱柱（C18，5um，4.6*250mm）检测波长：260nm流动相：乙腈+0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱流速：1.0mL/min进样量：20ul先晒晒标准上的图谱http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/12/201212281611_416712_1608710_3.jpg以下是我测定的色谱图，根据出峰顺序依次是大豆苷、染料木苷、大豆素、染料木素。标准色谱图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/12/201212281614_416716_1608710_3.jpg保健食品样品色谱图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/12/201212281615_416718_1608710_3.jpg总结：1、总体来说，4个组分的保留时间和色谱峰都能与标准对应重现2、色谱峰的理论塔板数都很好，这根柱子已经用了一段时间，具体测了多少样品就不清楚了3、以前检测测的是大豆素和染料木素，同时测定4个还是第一次，效果还算满意你测试过大豆异黄酮吗？有经验赶快讨论吧

大豆异黄酮是从植物中提取，与雌激素有相似结构，因此又称植物雌激素，大豆异黄酮的雌激素作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性，是天然的癌症化学预防剂。主要成分：大豆甙(Daidzin)，大豆甙元(Daidzein)，染料木甙(Genistin)，染料木素(Genistein)，黄豆甙(Glycitin)，黄豆甙元(Glycitein)。迪马科技用户采用Endeavorsil C18超高效液相色谱柱成功实现8分钟内6种大豆异黄酮的良好分离，对于大豆异黄酮的分离和检测具有实际意义。UPLC色谱分析条件*：色谱柱：Endeavorsil C18 50 × 2.1 mm, 1.8 μm（Cat.#.：87002）流动相：A：0.2%的磷酸水溶液，B：乙腈时间（min）02467A（%）9085706090B（%）[align=cente

[align=center][b]超高效液相色谱-串联质谱法测定大豆中大豆异黄酮的含量[/b][/align][align=center]户江涛[/align][align=center]（农业农村部豆类产品质量安全风险评估实验室（佳木斯），黑龙江省农垦科学院测试化验中心，黑龙江佳木斯 154007 ）[/align]摘要：采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了检测大豆中大豆异黄酮含量的分析方法。试样经90%甲醇水提取后，6种大豆异黄酮在C[sub]18[/sub]色谱柱上以0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相，进行液相色谱分离；质谱检测采用电喷雾正离子化模式和多反应监测模式（MRM）。结果表明，6种大豆异黄酮分别在0.01~0.5 mg/L（D、GL、G）和0.002~0.1 mg/L（De、GLe、Ge）范围内线性关系良好，相关系数（R）为0.9993~0.9998，定量限（LOQ）为0.0001 g/kg。在大豆空白样品添加浓度分别为0.01、0.05、0.2 g/kg（De、GLe、Ge）和0.2、1、2 g/kg（D、GL、G），6种大豆异黄酮的平均回收率为86.6%~96.2%，相对标准偏差（RSD）为1.07%~5.93%（n=6）。本方法简便、灵敏、抗干扰，适用于大豆中大豆异黄酮含量检测。关键词：超高效液相色谱-串联质谱；大豆；大豆异黄酮[align=center]Determination of soybeanisoflavone in soybean by ultra performance liquid chromatography-tandem massspectrometry[/align][align=center]HU Jiangtao[/align][align=center]([i]Laboratory of Qualityand Safety Risk Assessment for Soybean products, Ministry of Agriculture andRural Affairs, Testing and Analysis Center of Heilongjiang Academy of LandReclamation Sciences, Jiamusi 154007,China[/i])[/align][b]Abstract：[/b]A methodwasdeveloped for the determination of soybeanisoflavone in soybean by ultra performance liquid chromatography-tandem massspectrometry(UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS). The samples were extracted by 90% methanol-water, then 6 soybean isoflavones were separated on aWaters BEH C[sub]18[/sub] column with gradient elution with the mobile phase of0.1% formic acid and acetonitrile, and finally detected by positive eletrosprayionization-mass spectrometry(ESI[sup]+[/sup]-MS/MS) in multiple reactionmonitoring(MRM) mode. The results showed the linearities of 6 soybean isoflavones were good in the concentrationrange of 0.01~0.5 mg/L（D、GL、G）and 0.002~0.1 mg/L（De、GLe、Ge）, the correlation coefficients were 0.9993~0.9998. The limitof quantification(LOQ) of soybean isoflavone was 0.0001 g/kg. At the spiked levels of 0.01、0.05、0.2 g/kg（De、GLe、Ge）and 0.2、1、2 g/kg（D、GL、G） in the blank soybean samples, the mean recovery of soybeanisoflavone was 86.6%~96.2%, andthe relative standard deviation(RSD) was 1.07%~5.93%（n=6）.This method is simple,sensitive, anti-jamming and suitable for simultaneous determination of soybean isoflavone in soybean.[b]Key words: [/b]ultra performance liquid chromatography-tandem massspectrometry (UPLC-MS/MS) soybean soybean isoflavone大豆异黄酮（soybean isoflavone）是一族化合物的统称，是大豆植物体内的一种次生代谢产物，是大豆主要活性成分之一，其母核为3-苯并吡喃酮，主要包括大豆苷、大豆黄苷、染料木苷及其相应苷元[sup][/sup]。研究表明，大豆异黄酮除具有天然抗氧化作用外[sup][/sup]，还具有降低胆固醇含量、预防多种癌症及改善妇女更年期综合征等多方面生物功效[sup][/sup]。大豆异黄酮主要存在于大豆籽实中，其总含量约为0.4~5 g/kg，其中大豆苷、大豆黄苷和染料木苷这三种含量约占总量的97%~98%，而其对应的苷元含量仅占2%~3%左右[sup][/sup]。目前，大豆异黄酮的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）[sup][/sup]、[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]法[sup][/sup]、紫外分光光度法[sup] [/sup]、质谱法（HP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS[sup][/sup]）等。紫外分光光度法[sup] [/sup]只能测定大豆异黄酮总量，且灵敏度不高；[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]法[sup][/sup]需要对异黄酮进行衍生，前处理复杂；目前，大豆异黄酮检测现有的国家标准GB/T 26625-2011[sup] [/sup]采用的是高效液相色谱法（HPLC），在实际检测过程中发现，由于紫外检测器灵敏度不高，存在个别样品中异黄酮相应苷元检测不到的情况；同时大豆提取液中含有蛋白、脂肪等杂质影响色谱柱柱效，以至于不能满足分离度要求，严重干扰低含量组分峰面积积分定量。而[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS法质谱检测器灵敏度高，通过选定大豆异黄酮的特征离子，能有效去除上述杂质干扰，定量更加准确可靠。目前，国内外采用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS法检测大豆中大豆异黄酮含量的文献很少[sup][/sup]。本文对大豆中大豆异黄酮检测的前处理方法借鉴GB/T 26625-2011[sup][/sup]，提取液改用UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS测定。该方法前处理过程简便、灵敏度高、分析时间短、抗干扰能力强，适用于大批量大豆样品中大豆异黄酮含量的检测。[b]1 实验部分[/b]1.1 材料与试剂大豆苷（daidzin,记为D，以下同）、大豆黄苷（glycitin,GL）、染料木苷（genistin, G）、大豆素（daidzein,De）、大豆黄素（glycitein, GLe）、染料木素（genistein,Ge）（纯度≥99%，Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，Fisher公司）；实验用水为Millipore纯水仪制备。1.2 仪器与设备Acquity UPLC型超高效液相色谱仪（Waters公司）；XEVO TQ-S三重四级杆质谱仪（Waters公司）；KQ-500DE型超声波仪（昆山市超声仪器有限公司）；涡旋混合器（IKA公司）；CR21GⅢ型高速离心机（HITACHI公司）。1.3 大豆异黄酮标准储备液的配置分别称取适量的D、GL、G、De、GLe、Ge标准品，用甲醇配置成质量浓度为1mg/mL标准储备液，于-18℃冰箱保存（有效期6个月），待用；使用时用10%甲醇水逐级稀释成所需浓度的混合标准工作液，现用现配。1.4 样品前处理提取：称取粉碎均与后的试样1.0g（精确到0.01g）于50mL聚乙烯离心管中，加入10.0 mL90%甲醇水，涡旋混合30 s后置于60℃超声波清洗器中提取30 min，在离心机中以15000 r/min离心5 min，将上清液转移至100 mL容量瓶中，残渣再加入10.0 mL90%甲醇水溶液按上述步骤提取后，合并两次上清液于100 mL容量瓶中，用10%甲醇水溶液定容至刻度，摇匀。a）De、GLe、Ge的测定：取1 mL过0.22ｕm有机系微孔滤膜，供UPLC/MS/MS分析测定；b）D、GL、G的测定：由于D、GL、G含量较高，需要将a）中过完滤膜的待测液用10%甲醇水稀释50倍后，供UPLC/MS/MS分析测定。1.5 液相色谱及质谱条件液相色谱：色谱柱:Waters BEH C[sub]18[/sub]（1.7 μm，50mm×2.1mm）；柱温：30℃；流速：0.5 mL/min；进样量：1μL；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%的甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0~0.5min，10% A；0.5~3. 0 min，10%~100% A；3. 0 ~4. 0 min，100%A，4 ~4.1.1min，100% A~10% A，4.1 ~5.0min 10% A。质谱：离子源：电喷雾离子源( ESI [sup]+[/sup] ) ；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测( MRM)；毛细管电压：3.2 kv；离子源温度：150℃；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流量：1000 L /h；定性、定量离子对及碰撞能量见表1。[align=center]表1大豆异黄酮的质谱参数[/align][align=center]Table 1 MRM parameters of soybean isoflavone[/align] [table][tr][td] [align=center]Analyte[/align] [/td][td] [align=center]Cone/V[/align] [/td][td] [align=center]Parent ion/(m/z)[/align] [/td][td] [align=center]Daughter ion/(m/z)[/align] [/td][td] [align=center]Collision energy/V[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]D[/align] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]30[/align] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]417[/align] [align=center][sup] [/sup][/align] [/td][td] [align=center]255﹡[/align] 137[/td][td] [align=center]27[/align] [align=center]18[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]G[/align] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]30[/align] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]433[/align] [align=center][sup] [/sup][/align] [/td][td] [align=center]271﹡[/align] 153[/td][td] [align=center]21[/align] [align=center]50[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]GL[/align] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]30[/align] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]447[/align] [align=center][sup] [/sup][/align] [/td][td] [align=center]285﹡[/align] 270[/td][td] [align=center]25[/align] [align=center]46[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]De[/align] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]25[/align] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]255[/align] [align=center][sup] [/sup][/align] [/td][td] [align=center]137﹡[/align] 181[/td][td] [align=center]30[/align] [align=center]26[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]Ge[/align] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]25[/align] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]271[/align] [align=center][sup] [/sup][/align] [/td][td] [align=center]153﹡[/align] 215[/td][td] [align=center]30[/align] [align=center]25[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]GLe[/align] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]25[/align] [align=center] [/align] [/td][td] [align=center]285[/align] [align=center][sup] [/sup][/align] [/td][td] [align=center]242﹡[/align] 168[/td][td] [align=center]27[/align] [align=center]35[/align] [/td][/tr][/table]﹡quantitativeion[b]2 结果与讨论[/b]2.1 色谱及质谱条件的优化流动相的选择：对比了酸性体系（0.1%甲酸水溶液）与非酸性体系（纯水、乙酸铵溶液）分别与甲醇、乙腈的流动相体系组合，结果发现目标物在酸性体系中比非酸性体系响应更高、峰形更好；同时大豆提取液中含有蛋白、脂肪等杂质可能会残留在色谱柱上，影响色谱柱的使用寿命，而乙腈比甲醇体系洗脱能力更强，可以有效去这些杂质。综合考虑目标物信号强度、色谱分离效果以及除杂等因素，本研究采用0.1%甲酸水溶液+乙腈流动相体系。质谱的选择：根据6种大豆异黄酮的分子量，用10%甲醇水配置1.0 mg/L 大豆异黄酮标准溶液直接注射到质谱中，在正离子模式下分别对各种组分进行母离子及对应子离子全扫描，最终确定的质谱条件见表1。2.2 质谱法（UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS）与色谱法（HPLC）的比较国家标准《GB/T 26625-2011粮油检验大豆异黄酮含量测定高效液相色谱法》[sup][/sup]中规定的大豆异黄酮检测方法为HPLC法。对同一大豆样品分别采用本文UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS法（MRM色谱图见图1、2）和GB/T 26625 HPLC法检测，结果表明这两种方法测定的大豆异黄酮总含量值基本一致。由于De、GLe、Ge这三种苷元在大豆中含量很低，用HPLC法检测时，紫外检测器灵敏度不高，存在个别样品中上述三种组分检测缺失的情况；同时在实际大批量样品检测中发现，随着进样次数的增加，色谱柱柱效下降，大豆提取液中存在的蛋白、脂肪等杂质对含量低的目标物峰干扰越来越大，定量困难。研究发现，同浓度的大豆异黄酮在质谱检测器上的响应值要远远超过紫外检测器，同时质谱法可以通过选定大豆异黄酮的特征离子，有效地去除杂质的干扰，其目标物分离度不受色谱柱进样次数增加的影响，定量更加准确可靠。[align=center][img=,690,651]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908050912587968_4111_3299836_3.jpg!w690x651.jpg[/img][/align][align=center]图1 大豆异黄酮标准溶液（0.01mg/L）MRM色谱图[/align][align=center]Fig.1 MRM chromatograms of soybean isoflavone standard solution at 0.01 mg/L[/align][align=center][/align][align=center][img=,690,653]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908050913342201_5843_3299836_3.jpg!w690x653.jpg[/img][/align][align=center]图2 大豆样品中大豆异黄酮MRM色谱图[/align][align=center]Fig.2 MRM chromatograms of soybean isoflavone in soybean[/align]2.3线性范围和定量限吸取不同体积的大豆异黄酮标准储备液（1.3），用10%甲醇水分别配置0.002、0.005、0.01、0.05、0.1（De、GLe、Ge）和0.01、0.05、0.1、0.2、0.5（D、GL、G）的大豆异黄酮上机混合标准溶液，以各自定量离子的峰面积为Y对应质量浓度X（mg/L）做标准曲线，得到的线性方程和相关系数见表2。结果表明，大豆异黄酮标准溶液在各自浓度范围内线性良好，相关系数R为0.9993~0.9999。以10倍信噪比（S/N）计算，大豆异黄酮上机液最低定量浓度为0.001 mg/L，通过公式（1）计算得到大豆中大豆异黄酮含量，最终确定本方法大豆异黄酮的定量限（LOQ）为0.0001 g/kg。糠氨酸质量分数计算公式：[align=center][img=,207,87]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908050915166414_5621_3299836_3.jpg!w207x87.jpg[/img] ………………（1）[/align] 式中：X为试样中大豆异黄酮含量，以g/kg计；C为大豆异黄酮上机浓度（mg/L）；V为定容体积（V=100）。表2 大豆异黄酮标准溶液的线性方程和相关系数[align=center]Table 2 Linear equation and correlation of soybean isoflavone in 10% methanol-water standard solutions[/align] [table][tr][td] [align=center]Analyte[/align] [/td][td] [align=center]Linear range/(mg/L)[/align] [/td][td] [align=center]Linear equation[/align] [/td][td] [align=center]R[/align] [/td][td] [align=center] [/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]D[/align] [align=center]GL[/align] [align=center]G[/align] [align=center]De[/align] [align=center]GLe[/align] [align=center]Ge[/align] [/td][td] [align=center][sup]0.01~0.5[/sup][/align] [align=center][sup]0.01~0.5[/sup][/align] [align=center][sup]0.01~0.5[/sup][/align] [align=center][sup]0.002~0.1[/sup][/align] [align=center][sup]0.002~0.1[/sup][/align] [align=center][sup]0.002~0.1[/sup][/align] [/td][td] [align=center]Y=2393.6x+479.38[/align] Y=1885x+139.66 [align=center]Y=1470.9x+187.97[/align] [align=center]Y=4287.9x+442.79[/align] [align=center]Y=3521.7x-103.62[/align] [align=center]Y=1993x+122.79[/align] [/td][td] [align=center]0.9995[/align] [align=center]0.9999[/align] [align=center]0.9993[/align] [align=center]0.9998[/align] [align=center]0.9997[/align] [align=center]0.9998[/align] [/td][td] [/td][/tr][/table]2.4回收率和精密度大豆中De、GLe、Ge含量较低，而D、GL、G含量较高，故本方法准确度实验分为高低浓度梯度组进行加标。称取大豆试样1.00 g，分别添加0.01、0.05、0.2 g/kg（De、GLe、Ge）和0.2、1、2 g/kg（D、GL、G），每个水平重复6次，同时做该大豆的空白本底实验。按照1.4前处理方法处理后上机检测，计算回收率（扣除空白），结果表明：不同添加浓度下，De、GLe、Ge的平均回收率为91.7%~96.2%，相对标准偏差（RSD，n=6）为2.78%~5.93%；D、GL、G的平均回收率为86.6%~93.8%，相对标准偏差（RSD，n=6）为1.07%~3.77%。[b]3 结语[/b]本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS）测定大豆中大豆异黄酮含量的分析方法。该方法灵敏度高，线性范围宽，能同时覆盖大豆中多梯度浓度大豆异黄酮组分含量的测定。同时该方法具有较高的准确度和精密度，前处理步骤简单，分析速度快，可有效避免由于色谱柱柱效下降对最终检测结果的影响，特别适合大批量样品的检测。田娟娟, 宋宏哲, 张飞, 等. 水剂法纯化大豆异黄酮的研究. 大豆通报, 2005, 6:19-22. Hagen M K, Ludke A, Araujo A S, et al.Antioxidant characterization of soy derived products in vitro and the effect ofa soy diet on peripheral markers of oxidative stress in a heart disease model .Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, 2012,90(8):1095-1103. 徐春华, 张治广, 谢明杰, 等. 大豆异黄酮的抗氧化和抗肿瘤活性研究研究 . 大豆科学, 2010, 29(5): 870-873. 李俏俏, 王清路, 薛金艳, 等. 大豆异黄酮对绝经女性血清中脂类物质的影响的研究 . 大豆科学, 2009, 28(1):172-174. 胡润芳, 张玉梅, 陈宇华, 等. 大豆异黄酮含量的初步研究. 东南园艺, 2017, 6:9-11. 刘琴, 朱媛媛, 白兴梁. 不同种类大豆中大豆异黄酮含量及抗氧化性比较. 北京工商大学学报（自然科学版）, 2012, 30(6): 45-51. 袁凤杰, 姜莹, 董德坤, 等. 中国大豆核心种质异黄酮含量分析.中国粮油学报, 2011, 26(2):5-8. Tepavcevic V, Atanackovic M,Miladinovic J,et al. Isoflavone composition，total polyphenolic content，and antioxidant activity in soybeans of different origin. MedFood,2010,13(3):657-664 GB/T 26625-2011《粮油检验大豆异黄酮含量测定高效液相色谱法》. Liggins J,Bluck J C. Deidzein and genistein content of fruits and nuts. Journal ofNutritional Biochemistry,2000,11(6):326-331. 鞠兴荣, 袁建, 汪海峰. 三波长紫外分光光度法测定大豆异黄酮含量的研究. 食品科学, 2001, 22(5):46-48.

红花苜蓿总黄酮对亚硝酸的清除盐作用研究 亚硝酸盐具有一定的毒性，是食品添加剂中急性毒性最强的物质之一。一方面是大剂量的亚硝酸盐进人人体内会造成中毒，另一方面，部分亚硝酸盐在一定条件下会转化为亚硝胺，而亚硝胺是一种致癌物质。亚硝酸盐进人血液后与人体中的血红蛋白结合，使正常的血红蛋白变形，失去携氧能力，导致人体组织缺氧，还会对血管产生扩张作用。一般地，口服亚硝酸盐10min至3h后，可出现头晕、头痛、乏力、胸闷、气短、心悸、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状;严重者出现意识丧失、昏迷、呼吸衰竭，甚至死亡。另外亚硝酸盐能够透过胎盘进人胎儿体内，6个月以内的婴儿对亚硝酸盐特别敏感，对胎儿有致畸的作用。 红花苜蓿是一种在在欧洲和亚洲的草地中常见的多年生野生植物，现在已经被移植到北美来种植。在分枝的茎末端生长的红花被认为是其医疗价值的来源，通常会被晒干用作医疗使用。红花苜蓿是很多有价值的营养素的来源，包括钙、铬、镁、烟碱酸、磷、钾、硫胺素和维生素C。红花苜蓿还被认为是异黄酮（一种作用类似雌激素的水溶性化学成分，存在于很多植物中）的最丰富来源之一。 近年来,随着对自由基研究的深入,人体中的活性氧和自由基被认为是引发衰老、癌变和细胞损伤的重要原因。筛选新的能够清除自由基的抗氧化天然药物成为研究热点,因此,对异黄酮抗氧化作用的研究逐渐引起广大学者的重视。 本试验旨在探讨红花苜蓿总黄酮对亚硝酸的清除盐作用，,为防癌抗癌及充分利用这一天然资源提供有益的实验依据。材料与方法主要仪器：电热恒温水浴锅微量紫外分光光度循环水真空泵万分之一分析天平主要试剂： 葡萄糖，对氨基苯磺酸，亚硝酸钠，α-萘胺，pH=3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液，苯酚，浓硫酸，冰醋酸，以上均为分析纯。红花苜蓿蒸馏水2实验方法主要试剂的配制; 葡萄糖贮备液：精密称取葡萄糖对照品100.0mg，用蒸馏水溶解并定容至100mL。 0.4%对氨基苯磺酸：精密称取对氨基苯磺酸400.0mg溶于100mL 30%醋酸溶液中。 0.1%α-萘胺：精密称取250.1mgα-萘胺溶解于250mL30%醋酸溶液中。100mg/kg亚硝酸钠溶液：精密称取50.2mg亚硝酸钠溶于500mL水中。 pH=3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液：用适量的柠檬酸钠、盐酸、蒸馏水并用酸度计测pH值配溶液500mL。5%苯酚试剂:精密称取10.0000g,加蒸馏水190g溶解，置棕色瓶中密闭保存。红花苜蓿总黄酮的提取称取干燥的红花苜蓿用石油醚浸泡24h,以除去色素和脂溶性杂质，倾出石油醚，药渣中75%乙醇浸泡30分钟,超声提取30分钟，过滤，收集提取液，浓缩干燥得总黄酮。 2.3[font=

[align=center][b][img=,690,445]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709211013_01_676_3.png[/img][/b][/align][b]毛豆的营养价值[/b]1镁：毛豆中的镁含量为每百克70毫克，也远远高于其他鲜豆类(荷兰豆16毫克、四季豆27毫克、豌豆43毫克、芸豆16毫克、豇豆31毫克、龙豆46毫克)。镁可以维护骨骼生长和神经肌肉的兴奋性。2维生素C：毛豆中的维生素C含量为每百克27毫克，位居鲜豆类蔬菜之首。3食物纤维：毛豆含有丰富的食物纤维，每百克中达4.0克，不仅能改善便秘，还有利于血压和胆固醇的降低。4大豆异黄酮：毛豆中还含有微量的生物活性物质黄酮类化合物，特别是大豆异黄酮，被称为天然植物雌激素，在人体内具有雌激素作用，对维护女性健康、改善更年期不适非常重要。5卵磷脂：毛豆中的卵磷脂是大脑发育不可缺少的营养之一，可以改善大脑的记忆力和智力水平；6脂肪：毛豆中的脂肪含量高于其它种类的蔬菜，但其中多以不饱和脂肪酸为主，如人体必需的亚油酸和亚麻酸，它们可以改善脂肪代谢，降低人体中甘油三酯和胆固醇含量；7钾：毛豆中的钾含量很高，夏天食用可以帮助弥补因出汗过多而导致的钾流失，因而缓解由于钾的流失而引起的疲乏无力和食欲下降；8铁：毛豆不仅铁含量比较高，也容易吸收，是儿童、老人、妇女补充铁质，预防贫血非常好的食物来源。[align=center][img=,552,471]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709211013_02_676_3.png[/img][/align][b] 毛豆的功效与作用[/b] 毛豆味甘、性平，入脾、大肠经。具有健脾宽中，润燥消水、清热解毒、益气的功效。主治疳积泻痢、腹胀羸瘦、妊娠中毒、疮痈肿毒、外伤出血等。毛豆营养价值高，有改善人体的新陈代谢、促进胃肠蠕动、增进食欲、预防骨质疏松、美容减肥降血脂等功效，很适合大人小孩食用。1美容护肤：毛豆具养颜润肤、有效改善食欲不振与全身倦怠的功效。毛豆和豆腐、豆浆等豆制品含有大量的植物化合物异黄酮，对皮肤胶原具有保护作用。动物实验表明，通过饮食补充异黄酮能减少由于紫外线导致的皱纹，使皮肤更光滑。2减肥瘦身：毛豆营养丰富均衡，含有有益的活性成分，经常食用，对女性保持苗条身材作用显著；毛豆所包含的saponins不但可以预防肝脏机能的疾病，而且可以抑制体内脂肪的形成及吸收。还有可以促进脂肪的分解而达到保持理想体型的效果。有助于减肥这是因为很多人的肥胖是源于细胞间液多造成的水肿，或者细胞中脂肪含量多，而毛豆中含有丰富的氨基酸，可以有效减少人体水肿，促进新陈代谢，替换细胞中脂肪，从而让形体更健美匀称。3解倦怠：毛豆中含有丰富的钾，夏季可适当多吃，比如用盐水煮毛豆或用毛豆烧菜，不仅可以缓解倦怠，还能开胃，补充体力。4冶消瘦：据营养学家报导，毛豆是黄豆的嫩身豆，其中所含的卵磷脂成分很丰富，在科学家的实验中，曾以饲养小白鼠，结果得到体重增加，发育良好的成绩。毛豆所含的卵磷脂也相当优越。5高质素营养：毛豆是蔬菜中唯一所含的蛋白质，脂肪及碳水化合物和鱼及火腿所含的含量差不多。同时除了钙，铁，铅，铜等微量元素含量非常丰富之外，而且维生素a和b的含量比鱼还要多。还有由于帮助酒精新陈代谢的维生素b群含量也和肉类一样丰富，所以毛豆也被列入动物性食品的范围。它的丰富的钙质和植物纤维也可以被说成是浓缩蔬菜，而由于维生素c的含量和柑橘一样丰富，所以也可以被称为新鲜水果。6减低患心脏病的机会：毛豆所含的植物性蛋白质是由18种氨基酸所组成。除了有丰富的营养价值外，美国的实验证明，每日进食25mg的豆类蛋白质可以降低血中的胆固醇和坏胆固醇的水平。对肥胖、高血脂、动脉粥样硬化、冠心病等疾病有预防和辅助治疗的作用。1999年秋天美国的食品及药物管局（fda）已批准在毛豆商品标贴印上“可以减低患心脏病的机会”的字样。另外发现到在消化途中所产生的peptides有强力降血压的成份。而且peptides含有止痛，抑制神经兴奋及有催眠作用的元素。7增强脑力：毛豆中所含的lecithin是脑细胞膜的主要成份，可以将附在血管壁的胆固醇溶解而使细胞年轻化，因此使脑及神经系统变得活跃起来。8预防骨质疏松症：由于日本的女性有进食毛豆的习惯，骨折比率是只进食动物性蛋白质的美国女性的一半。美国的实验证明，如果每日所需要的蛋白质不是由肉类或乳制品而是由毛豆或其他豆类摄取，则可以摄取更多的钙质，因而使骨质的密度上升。9防止老化：由于毛豆所含的isoflavones会消除活性酸，对防癌，防老化的作用正在研究中。还有抑制艾滋病毒及抑制引起癌症的病毒的实验结果，也有了报告。估计医学界今后将会有更多的发现。10预防癌症：毛豆所含的蛋白酶抑制剂 phytic acids、植物胆固醇、saponins, isoflavones等的综合效果可以增进防癌的免疫系统，对乳癌、皮肤癌、结肠癌等有预防作用。11预防更年期的疾病：毛豆含有isoflvanoes，女性进食毛豆被认为可以增加荷尔蒙。美国的研究报告指出可以减轻更年期的发热，发汗等症状。一杯的毛豆约等于一粒的premarin。

黄酮类化合物在自然界分布非常广泛，是一类非常重要的天然有机化合物。传统意义上黄酮类化合物主要是指基本母核为2-苯基色原酮类化合物，现在泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物。根据黄酮类化合物结构特点，可分为黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷醇、查耳酮、异黄酮、双黄酮、花色素等种类。黄酮类化合物具有多方面的生物活性，如葛根总黄酮及葛根素(puerarin)、银杏叶总黄酮等具有扩张冠状血管作用，临床用于治疗冠心病；水飞蓟素(silymarin)、异水飞蓟素( silydianin)及次水飞蓟素(slychristin)等有肝脏保护作用，临床上用于治疗急、慢性肝炎、肝硬化及多种中毒性肝损伤等；木犀草素(luteolin)、黄芩苷( baicalin)、黄芩素(baicalein)以及槲皮素等具有抗菌、抗病毒作用；牡荆素( vitexin)、桑色素、儿茶素等具有抗肿瘤作用等。游离黄酮类化合物一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙酸乙酯、氯仿、乙醚等有机溶剂及稀碱水溶液中。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中。花色苷及其苷元以离子形式存在具有盐的通性，亲水性较强，水溶度较大。黄酮化合物单体的分离主要依靠各种色谱方法来实现，除经典的柱色谱法和薄层色谱法、HPLC外，近年来HSCCC已经得到广泛的应用。对于多数极性较弱的黄酮苷元，在进行HSCCC分离实验时，通常可以选用氯仿-甲醇-水的溶剂系统，而氯仿-甲醇-水(4:3:2或5:3:2)则是最常用的溶剂系统。根据被分离样品的具体情况，在上述溶剂系统的基础上，对组成诸元的比例进行适当的调整，就能获得良好的分离效果。还有些苷元也可采用正己烷（石油醚）-乙酸乙酯-甲醇-水的溶剂系统，通过调整溶剂的组成比例来实现有效分离。对于极性较强的黄酮糖苷类成分的HSCCC分离，通常使用的是乙酸乙酯–水为基本结构的溶剂系统，可以通过添加正丁醇、甲醇、乙醇、乙酸来调节溶剂系统的极性。分离这类化合物的典型性溶剂系统有：氯仿-[color