乳酸杆菌选择性琼脂

乳杆菌～乳酸杆菌～激活后，在血平板上培养～长成的形态是什么样？？？

绪言随着人民生活水平的不断提高，乳制产品的种类日益丰富和多样化，人体所需的乳酸菌如嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜热乳链球菌和保加利亚乳杆菌等通常被作为重要成分加入到各种乳产品当中。乳制品被人体摄入之后，其中包含的活性菌也同时进入到人体内部消化系统，它们能够帮助平衡肠胃功能健康，抑制对人体有害的各类细菌繁殖，能够显著提高人的身体健康水平。但不是随便摄入活性菌就能够起到这种效果，而是需要摄入人体内的活性菌达到一定的数量才能够有效发挥作用。科学表明，人体内部活性菌数量要达到 97cfu/ g (m L) 以上才能够具有明显效果。实际上，科学家在对市场上出售的各种乳制品的研究分析发现，大多产品中的包含的乳酸菌的活跃度与浓度都严重偏低，这一方面是由于生产企业不负责任所导致，另一方面也与当缺乏一种行之有效的活性乳酸菌检测工具有关，因此也不难理解当前市面上为什么存在那么多含超低乳酸菌的乳制品。为有效检测出乳制品中活性乳酸菌的活力和浓度，市场上和学术界都有必要尽快找到一种科学有效的计算方法。当前，对于嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等计数方法已有一些研究文献，但都不是在其纯度较低条件下的计数方法，笔者通过文献综述发现，关于其他菌类计数方面的研究也有学者尝试过，但并没有取得突破性进展。对此，本文在已有研究文献的基础上，总结了一种新的非纯度条件下对活性菌计数的方法，能够有效针对嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜热乳链球菌和保加利亚乳杆菌进行科学合理的定量分析，为提高软制品产品品质提供可靠度科学测量工具。1. 材料与方法1. 1 供试菌种嗜热乳链球菌( S t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s , S T ) 、保加利亚乳杆菌( L actobacil lus delbr ueckii ssp.bulgaricus,LB) 、嗜酸乳杆菌( Lactobacill u s a c i d o p h i l u s , L A) 、双歧杆菌( Bif idobacter ia, BB) 、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei , LC) 均由华中农业大学生物科技学院微生物实验室提供。1. 2 仪器与设备厌氧培养箱; 厌氧培养罐; 好氧培养箱。1. 3 待检样品( 1) 已知菌样品： 以脱脂乳为培养基,在所需培养条件下分别培养供试的5 种菌,即为已知菌待检样品。( 2) 乳品样品： 为市售酸乳或乳酸菌发酵乳饮料, 均含有活性乳酸菌。2. 结果与分析2. 1 嗜热乳链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌对糖的利用情况将M R S 琼脂培养基中的葡萄糖分别以柳醇、纤维二糖、果糖、甘露醇、山梨醇等糖类代替, 配制成系列不同的M R S 琼脂培养基, 并制成平板, 分别接种ST 、LB、LA和BB 菌株, 在所需条件下培养, 观测平板上菌落的生长情况, 结果如表2 所示。从表2可以看出： 仅LA 可以利用柳醇, 故MRS-柳醇琼脂培养基可用于L A 的选择计数。当柳醇质量浓度为0. 5% 时, LA 便可形成大小合适的菌落。另外, M R S- 纤维二糖琼脂、MRS- 甘露醇琼脂和MRS- 山梨醇琼脂也可用于LA 的计数。2. 2 不同培养基平板上ST、LB、LA、BB 和LC 形成的菌落数检测结果按照国内外文献介绍的最先进的方法制成十种各不相同的实验培养基, 并制成平板,分别接种ST、LB、LA、BB 和LC 的纯培养菌株, 观察检测菌落的形成和数量，并分别做好相关试验数据记录。检测结果表明：s T-琼脂和M17-琼脂适合嗜热乳链球菌的计数; L C- 琼脂适合干酪乳杆菌的计数;M R S- N N L P 琼脂适合双歧杆菌的计数;MRS- pH5. 2 琼脂适合保加利亚乳杆菌的计数。MRS- 柳醇琼脂、MRS- 山梨醇琼脂、MRS-核糖琼脂和MRS- 葡萄糖酸盐琼脂均可用于LA 和LC 的计数, 但因LC- 琼脂培养基能抑制LA 和BB的生长, 从而适宜于L C 的选择计数, 因此当产品中只有L A和LC 存在时, 可用LC- 琼脂测定LC 的菌落数, 再用MRS- 柳醇琼脂或MRS- 山梨醇琼脂或MRS- 核糖琼脂或MRS- 葡萄糖酸盐琼脂测其总数,两者之差即为L A 的数量。2. 3 对几种含LA 和BB 的市售乳品的检测结果通过使用上述培养基进行菌类培养成熟后，在对市面上出售的乳制品进行抽样检测， 从检测结果分析来看： 所选的培养基和培养条件适合对S T 、L B、L A 和B B的选择计数,对照样品的检测结果接近实际菌数, 同时还发现除了对照样品和加LA 与BB的酸乳中LA 和BB 的数量较高外, 其它市售酸乳中含的LA 和BB 菌数均较低。2. 4 对几种市售产品中LC 的选择计数检测结果以L C- 琼脂培养基分别检测9 种市售乳品中干酪乳杆菌的数量, 其结果如表5 所示, 可见在其它乳酸菌存在下LC- 琼脂适合对干酪乳杆菌的选择计数。在所测的9 种产品中, 只有3 种干酪乳杆菌活菌数在106cfu/g( mL) 以上, 其余数量均较低, 而对照样品中的干酪乳杆菌数最高, 与实际数接近。3. 结束语本文通过设计研究方案，对含活性乳酸菌乳制品中不同活性菌的计算方法进行尝试，并取得了不错的试验效果。本文发现：用R I-琼脂培养基来分离热乳链球菌能够收到显著效果; 可用K L-乳酸菌培养基来分离干酪乳杆菌;用NG V-MMWN氨基培养基分离双歧杆菌; N L H-p C7.1碳酸培养基分离和提取保加利亚乳杆菌; NUL-氧脂酸 分离和提取嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌; 如果只需要提取和分离嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌, 则可在计算其总数量之后，在用N L-碳酸基培养基分离干酪乳杆菌数, 剩余即为嗜酸乳杆菌数量。希望本文的研究能过为有关食品质量监督部门和生产企业提供一种科学可靠的活性菌检测工具，以提高市场上乳制产品的质量。

三糖铁琼脂培养基( l ）成分 蛋白胨 20g 硫酸亚铁 0.2g 牛肉浸出粉 5g 硫代硫酸钠 0.2g 乳糖 10g 002％酚磺酞指示液 12.5ml 蔗糖 10g 琼脂 12～15g 葡萄糖 1g 水 1000ml 氯化钠 5g ( 2 )制法 除乳糖、蔗糖、葡萄糖、指示液、琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解，调pH 值使灭菌后为7.3 士0.1 ，加入琼脂，加热溶胀后，再加入其余成分，摇匀，分装，121 ℃ 灭菌15 分钟，制成高底层（2 ～3cm ) 短斜面。( 3 )用途 用于初步鉴别肠杆菌科细菌对糖类的发酵反应和产生硫化氢试验。 方法和结果观察：取可疑菌落或斜面培养物，做高层穿刺和斜面划线接种，置35 ℃ 培养24～ 48 小时，观察结果。培养基底层变黄色为葡萄糖发酵阳性，斜面层变黄色为乳糖、蔗糖发酵阳性；底层或整个培养基呈黑色表示产生硫化氢。

枯草芽孢杆菌有没有什么选择性培养基，或显色培养基呢？ 在营养琼脂上培养呈褶皱菌斑，加上革兰氏镜检，是否能初步鉴定为枯草呢？ 有没有什么检测方法是被认可的，或有资料支持的呢？

鼠李糖乳杆菌培养不出来，琼脂培养基都没有菌长成，叶酸实验用的，容易在哪里出现问题？望老师不吝赐教

常用的有琼脂斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、沙土管保藏法、甘油冷冻管保藏法、低温冷冻保藏法等，方法很多。 我选用液体石蜡保存方法，该方法适用于不能分解液体石蜡的酵母菌、某些细菌（如芽孢杆菌属、乙酸杆菌属等）和某些丝状真菌（如：青霉属、曲霉属等），而某些细菌（如：固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌等）和一些真菌（如：卷霉菌、小克银汉霉、毛霉等）不宜采用此法进行保存。微生物检验常用以下菌种：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、铜绿假单胞菌、乙型副伤寒沙门菌、白色念珠菌药典也没有要求怎样保存，只说选用适宜的保存方法需要验证。但是肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、铜绿假单胞菌、乙型副伤寒沙门菌、白色念珠菌这些菌种用液体石蜡保存方法适合不？

文/李莎（华测检测） 鲜乳能够由液态转化为凝固态的发酵乳，并产生令人心怡的风味和丝滑的口感，这华丽的转变和其中的奥秘离不开微小的生命——乳酸菌。传统的酸奶就是由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌混合发酵而成的。[b]乳酸菌简介[/b] 乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。除极少数外，绝大部分都是人体内不可缺少的且具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人体的肠道中。乳酸菌具有调节肠道微生态、促进营养成分在肠道的消化吸收、降低血清中的胆固醇含量、缓解高血压以及抗肿瘤作用等诸多益生功能，其分泌的物质如细菌素、胞外多糖、胞外糖苷酶等更是对机体健康有益的。 乳酸菌已经在食品发酵、医药、饲料等领域中长期应用。特别是在食品发酵领域，乳酸菌的品质和性能直接决定发酵乳品质的好坏。不同性能的乳酸菌能够产生不同黏度、风味和生理功能的发酵乳。乳酸菌能够利用鲜乳中的蛋白质进行生产繁殖，并产酸、酯、游离脂肪酸、游离氨基酸，当鲜乳的pH降低至酪蛋白的等电点时，酪蛋白变性凝固。乳酸菌分泌出的胞外多糖，还能将乳酸菌细胞和酪蛋白链接在一起形成网络结构，使得发酵乳的凝胶结构更加稳定。 经研究发现，将优良乳酸菌菌株进行组合有利于提升发酵乳的整体性能，将一种保加利亚乳杆菌与两种以上嗜热链球菌进行组合可以使混合乳酸菌同时具备发酵速率快、产品黏度好、特征风味浓郁等优良性能。 目前，主要通过收集天然乳酸菌来获得性能优良的新型乳酸菌。天然乳酸菌经过筛选、培育和研究，确定其种属，以及产酸、产香、益生功能等特性。由于越来越多功能性乳酸菌的发现，酸奶中除了添加嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌外，还会添加一些功能性乳酸菌，增加发酵乳的益生功能，例如降低胆固醇、降血糖、抗菌消炎、提高人体免疫力。一方面，这些功能性乳酸菌能够在生长过程中会分泌出一些胞外多糖、细菌素、胞外糖苷酶等物质。另一方面，嗜热链球菌菌株和保加利亚乳杆菌菌株存在局限性，它们不耐胃酸和胆汁，在经过人体消化道时，这些常规的乳酸菌会失活，而发酵乳中添加的功能性乳酸菌能够在肠道内大量存活，发挥调节肠道菌群平衡，促进人体消化吸收等作用，被人们认为是新一代的益生菌。[b]可用于食品的乳酸菌菌种名单[/b] 2010年卫生部办公厅发布了《可用于食品的菌种名单》（卫办监督发〔2010〕65号），其中包含乳制品中常用的两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种（保加利亚乳杆菌）、嗜热链球菌等。该公告还规定，对于新菌种需要按照《新资源食品管理办法》执行。2011年卫生部又发布了《关于批准翅果油等2中新资源食品的公告（2011年 第1号）》，其中将乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种和乳酸乳球菌双乙酰亚种列入《可用于食品的菌种名单》，增加了可用于食品的乳酸菌种类。 此外，这几年我国卫生计生委也陆续发布了一些公告，增加了可用于食品的菌种名单，其中也包含有乳酸菌。[b]乳酸菌与人体的肠道健康[/b] 在人体肠道中，双歧杆菌和乳杆菌在肠道中普遍存在。婴儿时期，母乳喂养的婴儿肠道中双歧杆菌的数量占绝对优势，而人工牛乳喂养的婴儿肠道中最初普遍没有双歧杆菌，或者个别的双歧杆菌数量处于波动之中，而且常定植某些其它厌氧菌如拟杆菌和梭状芽孢打菌等。婴儿停止母乳或人工喂养后，由于食物的摄取，其肠道转变为类似成年人肠道。健康成年人肠道微生物可大致分为三类：第一类乳酸菌，包括双歧奸菌、乳杆菌和链球菌等，与宿主共生；第二类腐败菌，如拟杆菌、梭菌、消化球菌、大肠杆菌和葡萄球菌等；第三类包括真细菌、瘤胃球菌和巨型球菌等。该时期，双歧杆菌和乳杆菌数量较儿童期显著减少，有害菌滋生。老年人肠道中双歧杆菌和乳杆菌数量减少，拟杆菌、梭菌、肠杆菌和链球菌数量显著增加。 乳酸菌与人体的健康息息相关，特别是人体的胃肠道，其中最主要的两种乳酸菌是双歧杆菌和乳杆菌。双歧杆菌参与宿主的消化代谢、免疫及抗感染过程，它能通过细胞上的磷酸与肠黏膜上皮细胞特异性结合构成生物学屏障，也可产生具有分解肠黏膜上皮细胞内复杂多糖的细胞外糖苷酶，刺激肠道产生免疫抗体和病毒抗体，降低肠道pH及氧化还原电位，从而拮抗肠道需氧菌和条件致病菌的入侵，维持肠道微生态平衡。对于某些腐败菌和低温细菌，双歧杆菌通过产生有机酸对其产生抑制作用从而起到抗菌作用；由于机体吞唾细胞的吞噬活性可以在双歧杆菌的存在下激活，从而提高了机体的抗感染能力及免疫功能；双歧杆菌可以降低机体胆固醇水平，因其在发酵过程中产生一种影响胆固醇合成的物质；双歧杆菌还可以调节肠道正常细菌菌群平衡，起到防止便秘的作用；双歧杆菌的代谢活动还可以明显增加血液中超氧化物歧化酶的含量，从而起到抗衰老的作用。 乳杆菌对人体健康同样十分重要。由于其发酵碳水化合物的终产物是乳酸，可以帮助机体消化吸收；乳杆菌可以通过酸化肠内环境来阻止某些有害菌与肠上皮细胞的黏附，从而阻碍有害菌在肠道内的定植，进而优化胃肠功能，减少了疾病的发生率；乳杆菌还可以刺激免疫球蛋白的产生，从而增强机体的免疫力。 乳酸菌无处不在，与人类和动物的健康息息相关。随着人们对乳酸菌进一步深入地研究，相信越来越多的新型乳酸菌和其益生功能及机理会被人类发现，并造福于人类。

想知道乳酸菌在LBS琼脂培养基上的菌落形态是什么样子的？有木有人知道

[font=SimSun, STSong, &]的乳酸菌在MRS了百分之二的碳酸钙的琼脂平板上培养，第一代有很明显得溶菌圈，纯化第二代溶菌圈几乎没有，培养条件等，都是一样的，求大神回[/font]

随着微生态学研究的不断发展，乳酸菌功能的进一步开发，越来越多的实验证明乳酸菌对人体健康有重要的作用，如改善胃、肠道菌群结构、预防肠道疾病、抑制病原菌生长、降低血清中胆固醇含量、提高机体免疫力、治疗脚气病、消除致癌因子、防衰老及延年益寿等。因此，近年来，乳酸菌被广泛应用于发酵乳制品行业。如在改善酸奶的风味方面，可以在发酵过程中增加一些能够改善酸奶风味的有益菌种：如丁二酮乳链球菌、醋化醋杆菌、肠膜明串珠菌及乳酪链球菌等；在提高酸奶的功能性方面，可以添加生物源功能因子———益生菌群，如保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等。但是，如何鉴定乳制品中是否含有加入的这类乳酸菌，以及含有哪一种或几种乳酸菌，一直是人们关注的问题。目前，已有一些关于嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等分选计数的报道，但大多基于它们纯培养的基础上，没有得到充分研究。本文对酸乳中多肽物质进行测定、分析与比较，找出不同的乳酸菌发酵酸奶时产生的活性多肽的特异性，并对6种市售酸乳中所含乳酸菌进行测定。 1 试验材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试材料 酸乳：市售，不同厂家的6 种酸乳分别标号为1＃、2＃、3＃、4＃、5＃、6＃，并且均为原味凝固型，生产日期相同的合格产品，均添加有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。其中只有1＃ 酸奶中添加了1 种新菌种。 1.1.2 主要试剂与药品超低分子量SDS-PAGE电泳Marker，分子量分别为20100、14400、7823、5856 u 和3313 u；多肽标准品；丙稀酰胺(Acr)；甲叉双丙稀酰胺(Bis)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；十二烷基磺酸钠(SDS)；四甲基乙二胺(TEMED)；过硫酸铵(AP)；三羟甲基甘氨酸(Tricine)；甘油；考马斯亮蓝G-250；巯基乙醇；聚乙二醇6000等。 1.1.3 主要仪器与设备TGL-16M 高速台式冷冻离心机，分子量1000 u 透析袋，Hoefer mini VE电泳槽，电泳仪、显微摄影系统，50 μL 微量进样器，PHS-3C 酸度计，超净工作台，电子天平，电热恒温培养箱，显微镜，电热恒温水浴锅，电热鼓风干燥箱等。 1.2 试验方法及参数确定 1.2.1 市售酸乳中多肽物质的提取离心除杂：分别取刚打开包装的新鲜市售酸乳样品各50 mL，然后于8000 r/min、4 ℃条件下冷冻离心20 min，取上清液。透析：取上清液置分子量1000 u 透析袋中，用蒸馏水于4 ℃冰箱中透析48 h，其间每隔4 h 更换1 次透析液。浓缩：用聚乙二醇6000 浓缩至原体积的1/3，即得到待检测多肽样品。 1.2.2 酸乳中多肽物质的检测Tricine -SDS -PAGE 电泳法。适合小肽分析的方法有很多，例如毛细管电泳、高效液相色谱、质谱、离子交换色谱、SDS-PAGE 电泳等。由于SDS-PAGE 电泳法对样品纯度要求不是很高，以及实验室条件等各因素限制， 最终采用适用于小肽分析的SDS -PAGE-Tricine 系统对水溶性多肽进行种类和分子量分析。通过大量试验，最终确定的电泳参数为：上样量为10 μL；凝胶浓度分别为：浓缩胶浓度4%，分离胶浓度15%；电流选择：浓缩胶时18 mA，分离胶时25 mA。 1.2.3 电泳后多肽的染色考马斯亮蓝G－250 染色液。 2 结果讨论 http://www.hopebiol.com/asphtml/admin/kindeditor/attached/image/20150206/20150206163557695769.png图1 是市售酸乳中多肽的电泳图谱，虽然有一点条带畸形和拖尾现象，但仍然可以较为清晰地数出多肽条带数。从电泳图谱中可以看出，这6 种酸乳都含有分子量低于7823 u 的小分子量物质，并且6 种酸奶的活性多肽在保加利亚乳杆菌和嗜热乳链球菌的特征谱带处都有谱带，其中2＃ 还含有分子量在3313~5856 u 之间的4 种肽类，但条带颜色很浅，可知其含量很低，这很可能是因为其添加了不同菌种的缘故。从迁移率上看，虽然6 种产品所含肽类基本相同，但从颜色深浅来定性的分析，其肽类含量还是有差异的。 3 结论酸乳中肽类物质产生的种类和含量与发酵菌种有着直接的关系。同时由于不同厂家生产条件的差异导致含量上的轻微差别，这主要体现在相同迁移率谱带的颜色深浅上。本文对6 种市售酸乳中多肽物质进行测定、分析与比较，结果表明，6 种酸乳的活性多肽在保加利亚乳杆菌和嗜热乳链球菌的特征谱带处都有谱带，即该6 种市售酸乳中均含有保加利亚乳杆菌和嗜热乳链球菌，与其配料中所添加菌种一致。

食品工业上谈论的益生菌被定义为：益生菌是活的微生物，当摄入足够量时，对宿主起有益健康的作用。在谈论益生菌时必须满足三个条件：1） 活的微生物；2） 摄入足够的量；3） 对宿主健康有益。益生菌是从有益宿主健康出发给出的定义，目前研究较热的益生菌有：双歧杆菌、乳杆菌、芽孢杆菌、丁酸梭菌等，其中双歧杆菌、乳杆菌和芽孢杆菌都属于乳酸菌类，因此益生菌包括了部分乳酸菌，而乳酸菌不全是益生菌。 乳酸菌并不是一个严格的微生物分类规范，定义并不严谨，但目前已经得到大众的公认。因此食品工业上对乳酸菌的定义为：乳酸菌一般是指能发酵糖，主要生成乳酸的细菌的总称。在谈论乳酸菌时应该注意二个方面：1） 乳酸菌是一种细菌；2） 能发酵糖类生成乳酸。乳酸菌是从发酵糖产生乳酸的机理方面考虑给出的概念，对人类生活有益的乳酸菌有：双歧杆菌、乳杆菌、链球菌、明串珠菌等。并不是所有的乳酸菌都有益于人类健康，也有一些乳酸菌对人体是有害的，如有害的利斯特氏菌。目前市场上发酵奶制品中提到的乳酸菌传统意义上是指：1）保加利亚乳杆菌（Lactobacillus Bulgaricus）2）嗜热链球菌（Streptococcus Thermophilus）这两支菌是酸奶发酵过程中传统混合使用的乳酸菌。市场上发酵奶制品中提到的益生菌一般为：1）长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)2）青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)3）动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)4）干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)5）嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)6）鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)等等。它们也都是乳酸菌类，由于它们有的耐酸能经受住人体胃酸的考验，有的能在人体肠道中定植一段时间，总之能为人体肠道提供活的益生菌，因此现代微生态学研究中把它们定义为益生菌类。

1 目的要求（1）初步掌握乳酸菌活力测定的一般方法。（2）了解乳酸菌在乳发酵过程中所起的作用。2 基本原理乳酸菌的细胞形态为杆状或球状，一般没有运动性，革兰氏染色阳性，微需氧、厌氧或兼性厌氧，具有独特的营养需求和代谢方式，都能发酵糖类产酸，一般在固体培养基上与氧接触也能生长。酸乳风味的形成与乳酸菌发酵过程代谢的多种物质有关，而这些物质的产生与发酵速度等活力指标有密切关系。乳酸菌的活力可由多种参数确定，如细胞生长情况，细胞干重和光密度（OD值）等。由于乳液不透明，不能直接测OD值，可用NaOH和EDTA处理使其澄清后再测。较简便的活力测定包括凝乳时间，产酸和活菌数量等指标的检测。3 实验材料3．1样品 市售酸奶或乳酸菌饮料。3．2 培养基 MRS固体和液体培养基，复原脱脂乳培养基。3．3 实验用仪器设备 超净工作、恒温培养箱、鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、油镜显微镜、碱式滴定仪、天平、培养皿、移液管、试管、烧杯、量筒、温度计、酒精灯、接种针、载玻片等。4 实验方法与步骤4．1 菌种的分离（1）编号 取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2～10-5。（2）稀释 将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品25mL，移入含有225mL无菌水的三角瓶中，在漩涡混合器上充分振摇，使样品分散均匀，获得10-1的样品稀释液，然后根据对样品含菌量的估计，将样品稀释至适当稀释度。（3）倒平板 选用2～3个适宜浓度的稀释液，分别吸取1mL注入平皿内，然后倒入事先溶化并冷却至45℃左右的MRS固体培养基，迅速转动平皿使之混合均匀，待冷却凝固后倒置，于40℃培养48h。（4）分离 无菌操作，从培养好的固体平皿中分别挑取5个单菌落接种于液体MRS培养基中，置40℃培养箱中培养。（5）镜检 通过镜检，确定所分离的乳酸菌是乳杆菌还是链球菌。保加利亚乳杆菌呈杆状，单杆、双杆或长丝状；嗜热链球菌呈球状，成对、短链或长链状。4．2 接种按1%的接种量，将MRS液体培养物接种于已灭菌的复原脱脂乳中，另分别接种具有较高活力的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为对照。培养温度为保加利亚乳杆菌40℃， 嗜热链球菌45℃。4．3 观察与测定（1）观察： 观察并记录各试管的凝乳时间。（2）酸度测定：用NaOH滴定法，测定发酵乳液的滴定酸度。（3）计数：采用倾注平板法，测定活菌数量。

在做大肠杆菌时 ，为什么要将菌移种到营养琼脂斜面上，有什么作用？

①酸奶。鲜奶在乳糖发酵菌(乳酸链球菌 和产气杆菌族)作用下产生乳酸，引起乳汁凝集。在新鲜的酸奶中，乳酸乳球菌约占整个菌族的90％。在酵母膏奶琼脂、酵母葡萄糖肉汁琼脂或中性红白垩乳糖琼脂上划线，能分离到乳酸乳球菌。在制备平板时在培 养基中加人1:2000的乙酸铊能够有效抑制革兰氏阴性菌的生长，有利于该菌的分离。 ②产气或起泡奶牛奶表面产生气泡，有时渗透到乳脂中， 最常见的致变微生物是产气肠杆菌，尤其是产气肠杆菌和发酵乳 糖的酵母菌。紫红胆盐琼脂能用于分离肠杆菌科细菌，麦芽浸膏琼脂用(pH 3.5)干分离酵母菌。 ③甜块或甜性凝集块奶由于蛋白水解酶的作用， 当pH接近中性时，产生凝集。诱变微生物主要是芽孢杆茵这类奶质欠 佳常发生在经热处理的奶中,原因是竞争性细菌的消除或芽孢被热激活。 ④黏稠或发黏奶用接种环能将奶拉成细丝。主要是由带荚 膜的微生物生长所引起的，常发生在冰箱冷藏奶中，诱变微生物主要有产气肠杆菌中的荚 膜_(如产气克雷伯氏菌），黏乳产碱杆菌，微球菌和枯草芽孢杆歯的荚膜菌。这些菌的菌落也显示出 黏性。 “碎”乳脂奶这种奶表面的乳脂分裂成碎片并不 会重新乳化。当将这种奶倒入热茶或热咖啡中时,这种现象就更明显。这种品质欠佳奶 是由蜡状芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌霉菌变种产生的卵磷脂酶造成的。用卵黄琼脂或MKPP琼脂可从加热或未加热的奶中分离到这些细 菌。若样品中菌体数记较少，可采用多管技术法进行计数，参照石蕊牛奶法的操作方法和 数量稀释溶液，25℃培养，然后从每个试管取一环培养物划线于卵黄琼脂，检测卵磷脂酶 的产生 牛奶变质应特别强调的是将奶稍加热，便能辨别牛奶是否变质。这是一种最 为简单的判断方法。繁殖测试可用来确定变质是否是由微生物所造成的。 将约5mL变质的牛奶加人50mL无菌的全脂奶溶液中（预先装在个带玻璃塞的瓶 中〉，15~25℃或其他适当的温度下培养，每天检查2次，观察奶是否变质：只有当样品中 的变质是由微生物引起的时，才会引起全脂奶溶液的变质的发生(如繁殖）。 ①麦芽或焦糖变质。其诱变微生物是乳酸乳球菌变种,这个变种菌不同于乳酸乳球菌这种非麦芽菌株，它能分解酪蛋白中的亮氨酸产生 3-甲基丁醇。 ②酚或酚类物变质，常发生在商业无菌的瓶装奶中，是由 产酚的环状芽孢杆菌所引起的，这种菌的芽孢在受热后能够生存。

这段时间我们配制的伊红美兰琼脂在灭菌冷却后发生变质分层的问题～～　那位ＤＸ碰到过这样的问题，怎么解决哈～～　表现为：配制过程无异常，不灭菌冷却，没问题～～ 灭菌冷却后发生变质分层，再煮沸溶解后倒至平皿不能凝固～～　　那位ＤＸ来救命哈～～

一．乳酸孢子简介1．孢子是一种与生殖有关的细胞（通常是单细胞），可以形成新生命的个体，普遍存在植物界的生殖循环中，会产生孢子的物种包括厥类苔藓等植物，还有真菌 （例如酵母菌、）等等。 对某些细菌来说，也有一种叫做「孢子」的特殊构造，是细菌在环境不适宜时，由整个细菌体浓缩形成的一种休眠孢子，可用以抵抗不良的环境，等到环境适合再萌芽。细菌孢子是细菌在恶劣环境时的变身，可协助细菌度过不适宜的环境。2．乳酸菌 乳酸菌是相当庞杂的菌群,为能利用碳水化合物进行发酵产生乳酸的一群细菌的总称。分类上，属革兰氏染色阳性菌，有些能有孢子产生。生存于人体内的乳酸菌有双叉菌、嗜酸乳杆菌及一种肠球菌，这些都是具有积极作用的好菌。乳酸菌用糖生产乳酸的过程叫做「乳酸发酵」. 所谓乳酸孢子，就是有孢子的乳酸菌。也叫孢子型乳酸菌、芽孢乳酸菌。孢子型乳酸菌就是一种在到达肠道之前呈休眠状态的有益菌。二．孢子型乳酸菌作用①使细胞活化：活化细胞、强化细胞机能.②净化肠道环境：调整肠道菌丛生态、改善肠道机能、抑制坏菌生长、减少肠道坏菌异常发酵、使肠道益菌增加。③净化血液：孢子型乳酸菌除了可以代谢产生蛋白质分解酵素及糖类分解酵素外尚可产生脂肪分解酵素，达到净化血液之效果。④增加免疫机能：乳酸孢子能刺激体内的各种防御因子，使其活化。⑤改善女性阴道感染。三．孢子型乳酸菌的优点与现有乳酸菌相比，它具有更好的耐热性、耐酸性、耐糖性、耐干燥，稳定性和保存性均好，还具有高乳酸的生成能力，在肠内也有高增殖力，孢子乳酸菌为真正可以达肠道后苏醒，开始萌芽、生长的独特乳酸菌。四．乳酸孢子的种类 乳酸孢子是能产生孢子的乳酸菌的总称。目前主要应用的是芽孢杆菌（即包括：地衣杆菌、枯草杆菌、蜡样穿孢杆菌、东洋杆菌等的孢子），在使用时多制成该菌休眠状态的活菌制剂，或与乳酸菌混合使用。五．孢子型乳酸菌的用途孢子型乳酸菌作为添加剂可用于营养食品，动物饲料以及农业中。在我国目前，乳酸孢子多作为益生素的成分之一用于饲料中。六．乳酸型孢子市场情况简介在国外，目前乳酸孢子已经用于保健品（如奶粉，酸奶等）行业。从网上报道的乳酸孢子生产厂家来看，台湾企业的乳酸孢子保健品市场很好，且他们的乳酸孢子原料来源多为从日本进口。在我国，乳酸孢子作为保健品暂时并不普遍，主要是乳酸孢子多作为益生素的成分之一用于饲料中。而且随着益生素部分代替抗生素在动物饲料中应用，前景看好。目前我国对于益生素年使用量在1000吨左右。

保健食品中仅含有乳杆菌和双歧杆菌两种有益菌。根据GB 4789.35-2016标准，乳杆菌数量等于乳酸菌总数（MRS平板计数结果）减去双歧杆菌数量（改良MRS平板计数结果）？会出现减成负数的结果吗？

2014年食源性致病菌蜡样芽孢杆菌风险监测分析 人类对蜡样芽孢杆菌致病性的认识过程进展缓慢，但是大量证据证明，从1898年起，就有蜡样芽孢杆菌造成泌尿系统感染及胃肠炎的记载，有些感染的病例很严重，甚至造成死亡，蜡样芽孢杆菌也可以引起牛的口蹄炎。Lubenau 1906年描述了发生在一家医院的严重的食物中毒事件，300名医务人员及病人用餐后出现急性胃肠炎，对剩余的食物进行检验，发现含有大量的好氧芽孢杆菌，尽管从原文中的描述分析，该污染菌应为蜡样芽孢杆菌，但原作者将其定名为B.peptonificans。Seitz 1913年从一例患肠炎和腹泻的病人中分离出蜡样芽孢杆菌。按照当今的流行病学标准来衡量，有关芽孢杆菌引起食物中毒的早起报道很粗略。很少有人对食物等病检标本的污染菌做过计数，对污染菌的鉴定、命名也不确切，从而造成了不少混乱。正是由于分类学的进展，Hauge经过对4起食物中毒事件的认真调查，于1955年首次确认蜡样芽孢杆菌是一种可引起食物中毒的致病菌。因为蜡样芽孢杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、空气、水和尘埃中，所以不可避免地会进入到食品中。现将2014年本地蜡样芽孢杆菌的检测情况作如下总结。1 材料与方法1.1试剂和仪器 使用的培养基有磷酸盐缓冲液（PBS）、甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂、胰酪胨大豆多粘菌素肉汤、营养琼脂购买于北京路桥公司。主要仪器包括均质器，电子天平:感量0.1g，VITEK-2 Compact 全自动微生物鉴定系统。1.2依据和方法 根据国家食品安全风险评估中心制定的“食源性致病菌监测工作手册”要求进行增菌、分离、鉴定、菌种保存及送上级实验室复核。试验程序见图2。

乳酸菌广告效果乃商家随意而为 专家:酸奶更为有益中广网北京11月22日消息（记者吴善阳 实习记者陈彬）据中国之声《央广新闻》报道，近年来，乳酸菌饮品花样百出，商家打出的"乳酸菌"概念广告也是五花八门。但乳酸菌饮品真的"能够帮助肠胃做运动",其功能真如商家宣传的那么玄乎吗？专家指出，乳酸菌广告往往是商家随意而为，并没有统一的规范标准。要使行业健康有序发展，就必须尽早出台行业标准。 每天中午，记者发现多数在写字楼上班的白领都会饭后买一瓶乳酸菌饮品，仿佛真能让它"帮助肠胃做运动".食用乳酸菌饮品实质上是为我们补充乳酸菌，使人体菌群达到平衡，从而有益健康。上海交通大学病原生物学教研室主任、上海市食品学会乳酸菌专业委员会副主任委员郭晓奎表示广告效果都是厂家随意而为，没有机构认证。 郭晓奎：那些厂家在做广告上都是自己随意而为的，并没有哪个权威机关或者学术机构来验定，咱们国家从来就没有一个机构出这个认证。 继味全、达能之后，光明、伊利、蒙牛先后推出了自己的乳酸菌产品。商家各出奇招，时而请美女明星代言，时而请某医学博士，貌似权威。此外，商家总喜欢用一些不为人知的专业菌名做噱头，A+B益生菌、B益畅TM菌等。有的商家还推出"植物乳杆菌",用"自然"的名义抬高价格。其实，"植物乳杆菌"只是因为最初是在植物上发现的而得名，并不是在植物上独有的。 专家建议，传统固性酸奶更为有益。乳酸菌饮品主要配料为水，脱脂奶粉和食用香料，其含奶量甚少，千万不能将乳酸菌与酸奶等同看待。同济大学医学院营养与保健食品专家张欣文教授表示还是酸奶营养价值高。 张欣文：乳酸菌饮料里面放了比较多样的食品添加剂，所以它的营养价值来说就没有酸奶那么高。 记者发现，在国家食品药品监督管理局的数据中，只有6种乳酸菌饮品获得了国家批准文号。其中，杭州顶津食品有限公司是用"味全R活性乳酸菌饮品"的名字申请批准文号，并属于国产保健食品类，而市场上销售的"味全活性乳酸菌饮品"中，却将R去掉，以普通食品出售。其他诸如光明、伊利、蒙牛等品牌虽大推活性乳酸菌的保健功能，但并不属于国家批准的保健食品行列。郭晓奎表示大多企业所用菌种都是未经严格实验的。 郭晓奎：咱们国内大多数企业用的菌种都是没有经过严格的随机、对照、多中心等多种测试的。它可能委托两家企业做一下或者两家医院做一下实验，但是这个实验从严格意义上来说恐怕都存在一些问题。这是一个很乱的，但有前景的，管理上跟不上或者说学术支持也跟不上的一个行业。

做乳酸菌总数的时候，一般我都做乳杆菌和嗜热，突然要多做双歧，但是我不知道最后的计算结果的时候，双歧要不要一起计算进去？求助各位大佬们了！

老师们，我看国标里MRS好像更适用于测乳杆菌，想知道未改良的MRS培养基对于嗜热链球菌和双歧杆菌也可以有检测效果吗？实验室如果要检测乳酸菌活菌数的话是否需要另外购买莫匹罗星锂盐、半胱氨酸盐酸盐以及MC培养基呢？有没有这方面有经验的老师可以解答一下

1.原理分析 本培养基适合于肠杆菌科的鉴定。用于观察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。 该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌(e.coli)，则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如培养基接种后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。2.试验方法 以接种针挑取待试菌可疑菌落或者纯造就物穿刺接种并涂布于斜面置36±1℃造就18-24h观察结果3.化学性质 　　粉红色粉末，一种鉴别培养基，由牛肉膏、酵母菌膏、卵白胨、 胨、葡萄糖、乳糖、蔗糖、硫酸亚铁、氯化钠、硫代硫酸钠、酚红、琼脂等配合制造而成。易吸湿，加水煮沸熔解后成橘红色半透明液体，pH约7.5，冷至45℃开始凝固。

益生菌被正式定义为：口服益生菌是指通过一定数量的消化可以发挥超出基础固有营养素的有益健康功效的活的微生物。更普遍的定义为：益生菌为通过改善肠菌落平衡而对寄主产生有益作用作为添加补充剂的活的微生物。 益生菌的名字来源于希腊文字“生命前”在过去的十年中被以很多不同方式命。但总的来说他被指定为对寄主健康有益的细菌类产品。用于定义三个主要方面 :活微生物（依然有生命） 细菌为口服 为了能够作用于肠菌落平衡，细菌必须有能力存活到抵达肠系统。这就意味着，这些益生菌必须可以抵抗酸（胃），胆汁，在厌氧环境下生长和无毒性。这些标准限制了一下这些细菌的株类和种类：乳酸杆菌，链球菌和双歧杆菌。尽管一些其他菌种可以在有些情况下被使用（如动物营养中的酵母与杆菌属）。上述三种菌都属于乳酸菌的一部分，它们自然的存在与动物肠组织和发酵的乳制品中。术语益生菌为株决定性，但并不为种决定性。株为细菌种的一类，如以下例子：菌群 = 德国汽车 = 乳酸菌菌属 = 大众汽车 = 乳酸杆菌菌种 = 高尔夫大众汽车 = 嗜酸性乳酸杆菌菌株 = 高尔夫大众 1.4D = 嗜酸性乳酸杆菌 LC1

培养结核杆菌的培养基，从性状上分主要有固体培养基、液体培养基、半流体培养基、固液双相培养基等类型，这些培养基各有特点。　　1.1 固体培养基 最常用的是罗氏（Lownstein-Jenson，L-J）培养基，也是最具代表性的一种，其他的还有小川辰次（Tatsujiogawa）鸡蛋培养基和Middle brook 7H10、7H11等琼脂培养基等。在固体培养基中，由于可以直接观察菌落的形态并可做鉴别用，因此常用于临床标本的分离培养、鉴别、保存菌种及对抗结核药物的敏感性测定等方面，缺点是结核菌生长缓慢。　　1.2 液体培养基 常用的有苏通（Sauton）培养基、Middle brook 7H9等液体培养基。结核杆菌在液体培养基中能够更广泛的接触营养成分，因此在液体中生长相对较快,主要在液体表面生长，搅动时下沉至管底，可获得大量的结核杆菌。主要缺点是：在对临床标本的收集、采样、运输方面有不利的一面；不能根据肉眼观察菌落形态；培养基污染机会多，影响结核杆菌的生长，污染时不易与结核杆菌鉴别，需涂片染色镜检判断结核杆菌是否生长。　　1.3 半流体培养基 改良苏通半流体琼脂培养基是一种人工综合培养基，基质透明，呈半流体状态，生长的结核杆菌形成白色颗粒状菌落悬浮于培养基中段，便于观察。　　1.4 固液双向培养基 Septi-Check AFB双相培养基是国外应用较早的一种培养基，采用BD专利式封闭式固液双相一体化培养基设计。液相为Middle brook 7H9分枝杆菌专用增菌培养基，可迅速繁殖分枝杆菌，固相为3种固体培养基平面：Middle brook 7H11和改良的L-J培养基用于及时将增菌肉汤内分枝杆菌进行分离纯化以获得单个菌落，巧克力琼脂用于早期发现污染菌，避免时间浪费。由于有液相作为基础，因此结核杆菌生长较快，也是一种非常有效的培养基。国内有用平菇制备的平菇双相培养基是利用平菇浸出液为基础，加小牛血清、琼脂等成分而配制的一种培养基，根据琼脂的量不同制成液相、固相培养基。在国内应用较少，主要特点是成本低，制备简单，适合于基层使用，有一定的研究价值。

菌落培养平板计数琼脂灭菌后，为什么是深红色，跟以前不一样颜色？琼脂也没有过期，灭菌是121℃，20分钟。问题出在哪里，这样的琼脂还能用吗？

培养基及成分 1. Acetobacter Medium (醋酸菌培养基) Glucose (葡萄糖) 100g Yeasst extract (酵母膏) 10g CaCO3 20g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) 1000ml Adjust (调) pH to 6.8 适用范围：恶臭醋酸杆菌混浊变种 2. Nutrient Agar (营养肉汁琼脂) Pepton (蛋白胨) 5g Beef extract (牛肉膏) 30g NaCl 5g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) Adjust (调) pH to 7.0-7.2 [Note]：When cultivation of Bacillus，5mg of to MnSO4.H2O may be added . It is favorable to promote spore formation . 适用范围：产气气杆菌、粪产碱杆菌、蜡状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌蕈状变种、地衣形芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、尘埃芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌深黑变种、苏云金芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种（青虫菌）、苏云金芽孢杆菌戈尔斯德变种、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种、产氨短杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒状杆菌、北京棒杆菌、大肠埃希氏菌（大肠杆菌）、铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）、凸形假单胞杆菌、荧光假单胞菌、弯曲假单胞菌、恶臭假单胞菌、假单胞杆菌、藤黄八叠球菌、亚黄八叠球菌、尿素八叠球菌、金黄色葡萄球菌、运动发酵单孢菌 4. Corn Meal Medium (玉米粉培养基) Maize flour (玉米粉) 5g Peptone (蛋白胨) 0.1g Glucose (葡萄糖) 1g Tap water (自来水) 1000ml [Note]:Boil the mixture in autoclave at 121℃ for 1 hr. distribute the medium into 18ⅹ18 mm tubes , each contains 10 ml of the liquid , then autoclave at 121℃ for 1 hr . again (15磅蒸煮1小时,分装入18ⅹ18毫米试管,每管深度达6厘米。15磅再次灭菌15小时。) 5. Lactic-bacteria Medium I (乳酸菌培养基 I ) Yeast extract (酵母膏) 7.5g Peptone (蛋白胨) 7.5g Glucose (葡萄糖) 10g KH2PO4 2g Tomato juice (西红柿汁) 100ml Tween (吐温) 80 0.5ml Distilled water (蒸馏水) 900ml pH 7.0 适用范围：植物乳杆菌（胚芽乳杆菌）、嗜热乳酸链球菌 6. Lactic-bacteria Midium Ⅱ (乳酸菌培养基 Ⅱ) Lacto-casein peptone (乳酪蛋白胨) 10g Beef extract (蛋白胨) 10g Yeast extract (酵母膏) 5g Glucose (葡萄糖) 5g Tween (吐温) 80 1g K2HPO4 2g Na-acetate (醋酸钠) 5g Diamine citrate (柠檬酸二胺) 2g MgSO4.7H2O 0.2g MnSO4.H2O 0.05g Distilled water (蒸馏水) 1000m pH 6.5-6.8 适用范围：植物乳杆菌（胚芽乳杆菌） 7. Peotone Glucose Yeast extract Medium PGY （蛋白胨、酵母膏、葡萄糖培养基） Peptone（蛋白胨） 10g Yeast extract （酵母膏） 5g Glucose （葡萄糖） 1g Distilled water （蒸馏水） 1L 8. Glycerol Agar （甘油琼脂） Peptone （蛋白胨） 5g Beef extract （酵母膏） 3g Glycerol （甘油） 20g Top water （自来水） 1000ml Agar （琼脂） 15g pH 7.0-7.2 9. Rhizobium medium （根瘤菌培养基）AS 9 Yeast eztract （酵母膏） 1g Soil eztract （土壤浸提液） 200ml Mannitol （甘露醇） 10g Agar （琼脂） 15g Distilled water （蒸馏水） 800ml pH 7.2 [Note]：Soil extract：Suspend 50g finely and dried gardon soil in 200ml of tap water. Autoclave at 121℃ for 1 hr. Decant through cotton-cloth, filler though paper, make up volume to 200ml. Resterilize for 20 minutes at 121℃ , then mixed with othringredients and distributed. (土壤浸提液的制法：取土壤50克，加水200毫升，15磅蒸煮1小时，经滤纸过滤后加水补足到200毫升。) 适用范围：大豆根瘤菌（慢生型）、豇豆慢生根瘤菌、花生根瘤菌、紫云英根瘤菌、 大豆根瘤菌（快生型）、大豆根瘤菌、豌豆根瘤菌、苜蓿根瘤菌、田菁根瘤菌 10. Mannitol Agar (甘露醇琼脂) Yeast extract (酵母膏) 5g Peptone (蛋白胨) 3g Mannitol (甘露醇) 25g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) 1000ml