细叶远志皂苷对照品

大家都用那些容积配置过黄芩苷对照品啊？怎么我们用稀乙醇溶液溶解的时候不易溶解啊，超声半小时还会有很多不容物？

[size=16px][font=Arial, &][color=#333333]目的[/color][/font][font=Arial, &][color=#333333] 本研究采用超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-四极杆飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)和分子网络技术,结合高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url](HPLC)技术对远志木心进行定性、定量分析。 [/color][/font][font=Arial, &][color=#333333]方法[/color][/font][font=Arial, &][color=#333333] 参照2020年版《中国药典》对细叶远志皂苷、远志??酮Ⅲ和3,6'-二芥子酰基蔗糖的含量进行测定。根据MS/MS碎片结合SCIEX中药数据库、Lipidomics数据库、对照品、文献数据对木心中的化学成分进行鉴定 并结合MS/MS碎片的相似性创建分子网络。 [/color][/font][font=Arial, &][color=#333333]结果[/color][/font][font=Arial, &][color=#333333] 不同产地远志木心中的细叶远志皂苷、远志??酮Ⅲ和3,6'-二芥子酰基蔗糖含量均不符合2020年版《中国药典》规定。在远志木心中共鉴定出化合物188个,其中包括三萜皂苷类26个、??酮类12个、糖酯类69个,黄酮类12个,脂质类37个,糖类3个,核苷(酸)类3个,有机酸类8个,氨基酸类11个,其他类化合物7个。 [/color][/font][font=Arial, &][color=#333333]结论[/color][/font][font=Arial, &][color=#333333] 阐明了远志木心中的化学成分,该结果为远志木心资源的综合开发以及进一步解析远志木心“致闷”的物质基础提供依据。[/color][/font][/size]

[color=#444444]HPLC测定人参皂苷Ra1对照品含量以色谱纯乙腈-水为流动相，为什么所得结果只有前五分钟的溶剂峰，却没有想要的保留时间为16分钟左右的峰呢？[/color]

[font=宋体]中药远志为远志科植物远志或卵叶远志的干燥根。春、秋二季采挖，除去须根和泥沙，晒干，生用或炙用。远志味苦、辛，性温，归心、肾、肺经，有安神益智，交通心肾，祛痰开窍，消散痈肿的功效。[/font][b][font=宋体]安神益智、交通心肾[/font][/b][font=宋体][/font][font=宋体]《药性论》云远志：“治心神健忘，安魂魄，令人不迷，坚壮阳道，主梦邪。”远志苦辛性温，善于宣泄通达，既能开心气而宁心安神、又能通肾气而强志不忘，为交通心肾、安定神志、益智强识之佳品。《三因极一病证方论》“远志丸”以远志配伍茯神、龙齿、山药等治疗心肾不交引起的心神不宁，失眠多梦，健忘惊悸，神志恍惚；《备急千金要方》“开心散”以远志与人参、茯苓、石菖蒲同用治疗健忘证，若方中再加茯神，即《证治准绳》“不忘散”。[/font][b][font=宋体]祛痰开窍[/font][/b][font=宋体]《本草再新》说远志：“行气散郁，并善豁痰。”远志苦温性燥，入肺经，能祛痰止咳，常与苦杏仁、川贝母、桔梗等化痰止咳平喘药同用治疗痰多粘稠、咳吐不爽。[/font][b][font=宋体]消散痈肿[/font][/b][font=宋体][/font][font=宋体]《本草纲目》言远志：“治一切痈疽。”远志辛行苦泄温通，可疏通气血之壅滞而消散痈肿，常用于治疗疮疡肿毒，乳房肿痛，内服、外用均有疗效，内服可单用为末，黄酒送服；外用可隔水蒸软，加少量黄酒捣烂敷患处。[/font][b][font=宋体]治癫痫惊狂[/font][/b][font=宋体]远志味辛通利，能利心窍、逐痰涎，可用治痰阻心窍之癫痫抽搐，惊风发狂。《药品化义》：“远志，味辛重大雄，入心开窍，宣散之药。凡痰涎伏心，壅塞心窍，致心气实热，为昏聩神呆、语言謇涩，为睡卧不宁，为恍惚惊怖，为健忘，为梦魇，为小儿客忤，暂以豁痰利窍，使心气开通，则神魂自宁也。”[/font][font=宋体]综上，远志为安神与开窍双向调节心神之妙品，功用奇特，既能“安魂魄”，又能“利九窍”，而先贤也是认识到失眠与嗜睡两种心神紊乱常相伴出现。《得配本草》：“唯心气郁结，痰涎壅塞心窍，致有神呆健忘，寤寐不宁等症。”其中“寤寐不宁”即属于痰涎壅塞所致的“醒不了又睡不安”的睡眠紊乱病证。远志心神双调，可达到“安神不闭窍，开窍不动神”的疗效。[/font][font=宋体]凡实热或痰火内盛者，以及有胃溃疡或胃炎者慎用。[/font]

配制两个黄芩苷对照品溶液第一个是用50%的甲醇溶解，我感觉这个好难溶，超声了也不见得全部溶解，如果全部溶解配制出来的应该是澄清的吧？该如何处理好呢？？第二个要用减压干燥器60度干燥4小时再配制，我觉得涂了凡士林在60度会溶了吧，就不能减压了，我可以直接打开对照品瓶盖直接在烘箱里烘4小时不？这样做会有很大的影响吗？

小弟在测甾体皂苷，用的是已腈-磷酸水（酸万分之一），梯度洗脱，DAD检测。待测样品用普通分析纯的甲醇溶解，微孔滤膜过滤，进样分析。做了好几次，发现皂苷的峰不明显，并且更要人命的是，谱图中有很多溶剂峰，强度很大很高，现在才意识到，以前都当成皂苷的吸收峰，因为不像溶剂峰，都是末端吸收，没办法区分。今天，在进对照品时，发现对照品进入液相后，有好几个末端吸收峰，发现问题比较严重，对照品纯度没问题的。我怀疑：1、普通分析甲醇溶解对照品和样品后，才导致出现谱图中不同位置出现大小不一样的溶剂峰。我马上做了空白对照，确实甲醇单独进入液相分析，有很多溶剂峰，末端吸收，真是无语。2、考虑到溶剂问题，我又做了已腈空白对照，发现还是有溶剂峰，只不过少了很多，只有两个看起来比较高的峰。一个出峰在10分钟，一个在很靠后。接下来，我想做下面尝试：1、用流动相来溶解样品，就是已腈-磷酸水，同时，先做溶剂空白。2、考虑用已腈溶解样品紫外检测，感觉皂苷的峰不灵敏，但是比较实用，所以还是选择用紫外检测。对以上问题，请各位朋友多多指导。十分感谢！！！[em09508]

远志系陕西道地药材，是“秦药”大宗道地药材品种之一[1]。《中国药典》2020年版所收载的远志为远志科（Polygalaceae）植物远志Polygala tenuifolia Willd.或卵叶远志P. sbirica L.的干燥根[2]，具有镇静安神、祛痰开窍、解毒消肿等功效[3]。现代研究表明，远志的主要活性成分有皂苷类、寡糖酯类、酮类等，具有抗记忆障碍、保护中枢神经系统、抗抑郁、抗心肌缺血和抗肿瘤等作用[4]。目前，关于远志的研究多集中于含量研究[5]、活性测定[6]、遗传多样性分析等[7]。随着分子生药学的发展，对药用植物相关活性成分生物合成途径相关调控基因、转录因子的挖掘已成为研究热点，基因组学、转录组学等技术在远志上的成功应用，也为远志基因家族的筛选、鉴定与分析提供了技术支撑和数据基础[8]。 碱性亮氨酸拉链（bZIP）基因家族作为真核生物中转录网络的重要开关，是植物中最大的转录因子家族之一。bZIP结构域由两个区域组成，即DNA结合基本区和亮氨酸拉链区[9]。bZIP基因家族成员通过差异基因网络或生物过程，在调节植物发育、生长以及盐胁迫响应等方面发挥着重要作用[10]。研究表明，拟南芥Arabidopsis thaliana L.、番茄Solanum lycopersicum L.、黄瓜Cucumis sativus L.、李子Prunus salicina L.和蓖麻Ricinus communisL.等多种植物中的bZIP参与调控组织分化、细胞生长、糖代谢、生物和非生物胁迫等多个生物学过程[11-12]。bZIP基因家族成员还参与多种药用植物次生代谢产物合成调控，如丹参Salvia miltiorrhiza Bunge.的SmbZIP1基因可抑制丹参酮的积累，大豆Glycine max (Linn.) Merr.的GmbZIP123基因则参与大豆种子脂质积累的调控[13]。同时，bZIP表达受外源激素和胁迫诱导，壳聚糖处理葡萄Vitis vinifera L.12 h下，其VvLysM8和VvLysM9基因表达量显著提高[14]，糜子Panicum miliaceum L.中的PmbZIP97不仅受到脱落酸（abscisic acid，ABA）、盐和干旱胁迫强烈诱导且参与调控萌发后的根系生长[15]。 本实验利用远志三代转录组数据，以bZIP基因家族为研究对象，对其基因家族进行成员鉴定和生物信息学分析，并确定其在远志中的结构特点与进化特征，进一步通过实时荧光定量分析其在不同组织、不同处理条件下的表达模式，为后续深入研究bZIP的生物学功能奠定基础，同时为bZIP家族可能参与远志次生代谢成分生物合成途径研究提供思路。 1 材料及仪器1.1 材料2021年10月于陕西中医药大学药用植物园（陕西咸阳）采集3年生远志Polygala tenuifolia Willd.及其成熟种子，经陕西中医药大学杨新杰副教授鉴定。选取5株三年生长势均匀的远志植株，将根、茎、叶等量混合后进行全长转录组测序分析。1.2 试剂及仪器ABA、壳聚糖（chitosan，CHT）均购自上海源叶生物科技有限公司，Trizol总RNA提取试剂盒、dd H2O均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，TB Green® Premix ExTaqTM Ⅱ （TliRNaseH Plus）、PrimeScriptTM Ⅱ 1st strand cDNA Synthesis Kit购自TaKaRa公司（日本），所用引物由武汉金开瑞生物公司合成。StepOnePlusTM Real-Time PCR（qPCR）仪（美国Applied Biosystems公司），NanoDropTM 2000分光光度计（美国Thermo-fisher公司），K5800自动检测超微量分光光度计（凯奥公司），?80 ℃超低温冰箱（中科美菱公司）。 2 方法2.1 样品的处理选择大小均一，颗粒饱满的远志种子，用自来水冲洗1 d，10%双氧水消毒，播种于装有泥炭土的花盆中，在光周期16/8 h，光照强度9 000 Lx条件培养[16]。选取长势均一的2月幼苗，喷200 μmol/L ABA、200 μmol/L CTS，干旱（10% PEG 6000）、盐（100 mmol/L NaCl）20 mL，以无菌水作为对照组；以0 h为空白对照，重复3次，6、12、24和48 h取样处理（3株），于?80 ℃冰箱储存，采用PacBio Seque Ⅲ进行上机测序，获得远志全长转录组学文库[17]。2.2 远志bZIP家族基因鉴定及理化性质分析基于远志转录组数据库，筛选出注释结果为bZIP的序列，将序列gene id对应的fasta结果输入editseq软件，进一步获得具有完整开放阅读框（open reading frame，ORF）的基因，通过NCBI中的BlastX进行比对与鉴定。Protparam分析目标蛋白的理化性质，ProtScale预测不同氨基酸中的蛋白亲疏水性[18]。2.3 远志bZIP家族基因二级结构、信号肽、跨膜结构及亚细胞定位分析用ExPASy分析基因编码蛋白质的结构域，CDD验证；ProtParam和SOPMA分析远志bZIP转录因子的二级结构；SignalP-5.0和TMHMM预测信号肽和跨膜区域；WoLF PSORT预测亚细胞定位[19]。2.4 远志bZIP家族基因进化树构建从Tair网站下载拟南芥蛋白序列，通过MEGA软件对远志、拟南芥bZIP氨基酸序列进行多序列比对，利用MEGA的最大自然法构建系统发育树，重复次数设置为1 000次[20]。2.5 远志bZIP家族基因密码子偏好性分析及蛋白互作预测分析采用CodonW、CUSP和Chips分析密码子偏好性。蛋白互作预测分析利用STRING进行，并以拟南芥筛选其同源基因后，通过Cytoscape 3.9.0软件作图。2.6 远志bZIP家族基因蛋白特征、保守基序分析及不同组织表达量热图通过chiplot分析bZIP蛋白的结构域，MEME获得bZIP蛋白的保守氨基酸基序，并用TBtools进行可视化，Weblogo分析蛋白序列位点。利用诺禾云平台将转录组数据库中27个PtbZIP基因在远志根、茎、叶3个部位的差异表达数据进行层级聚类分析。2.7 远志bZIP家族基因表达模式验证与分析Trizol法提取各样品总RNA，凝胶电泳检测后测定总RNA浓度。使用Prime Script TM II 1st strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，检测浓度后于?20 ℃保存备用。设计荧光定量引物，并送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（F：5’-ACAGCAACGTGCTTCTCACC-3’，R：5’-CCCTTCATCCACCACCGACTA-3’）为内参基因，验证PtbZIP26（F：5’-GCACTGATGG- GAAGGCTGAA-3’，R：5’-GATTGCCCAACAC- TTGAGGG-3’）、PtbZIP27（F：5’-GTCGGATGGT- AGTGAACGGG-3’，R：5’-CACCATTTCCCGAAC- CCTGA-3’）在不同部位样本中的表达量。选择表达量较高的PtbZIP26进行不同激素、胁迫处理下的表达量分析。qRT-PCR反应体系为TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）5.0 μL；上下游引物各0.4 μL；50×ROX Reference Dye 0.2 μL，cDNA 1.0 μL；ddH2O 3.0 μL。PCR反应程序参照TB Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂说明书进行，每个反应重复3次。基因相对表达量采用2?ΔΔCt法计算，SPSS 27.0统计分析。 3 结果与分析3.1 远志bZIP基因家族成员的鉴定和蛋白理化性质分析基于远志全长转录组数据库，共筛选得到63个注释为bZIP基因的序列ID，进一步分析后获得39个包含完整ORF的序列。整理ORF差异位点并合并重复，最终得到27个全长bZIP转录因子，编号PtbZIP1～PtbZIP27（表1）。该转录因子的氨基酸个数143～846，相对分子质量介于16 201.52～92 932.3，等电点4.59～9.69。除PtbZIP1和PtbZIP22的不稳定指数小于40，系稳定蛋白质外，其余PtbZIP均为不稳定蛋白。bZIP基因家族脂肪系数介于48.31～92.66，所有bZIP蛋白的平均亲水性数值是负值，为亲水性蛋白。图片3.2 远志bZIP基因家族成员的二级结构、信号肽、跨膜结构及亚细胞定位分析二级结构分析结果（表2）表明，远志bZIP家族蛋白均具有α螺旋、延伸链、β转角和无规卷曲，主要由α螺旋和无规卷曲构成，延伸链和β-折叠所占比例较小，散布于整个蛋白中。SignalP-5.0和TMHMM在线分析结果一致，所有远志bZIP蛋白信号肽分值都低于0.5，说明其均无信号肽，不属于分泌蛋白。跨膜结构域分析则显示，仅PtbZIP9和PtbZIP13有跨膜结构域。亚细胞定位结果表明，远志bZIP家族成员主要定位在细胞核。图片3.3 远志bZIP基因家族成员系统进化分析利用MEGA7.0构建远志与拟南芥bZIP转录因子家族系统进化树。结果表明，27个PtbZIP蛋白分为A、B、C、D、F、G、I、S 8个组，没有bZIP蛋白分到E和K组中。其中G是最大的1个亚组，含有PtbZIP家族成员共8个，占总数的29.63%；A、F、I和S组均含3个PtbZIP家族成员，B组含2个PtbZIP家族成员，C组含1个PtbZIP家族成员，D组含4个PtbZIP家族成员（图1）。图片3.4 远志bZIP基因家族成员蛋白结构域分析BRLZ、MFMR和DOG1为bZIP蛋白中的常见结构域，BRLZ参与调控果生炭疽菌的营养生长，MFMR涉及蛋白与蛋白之间的相互作用，DOG1则与种子休眠相关[21-22]。远志bZIP的结构域分析结果表明：10个蛋白存在BRLZ结构域，9个蛋白存在MFMR结构，6个蛋白存在DOG1结构域（图2）。PtbZIP3和PtbZIP13含有大小相近的CCDC 158 superfamily，PtbZIP26、PtbZIP21和PtbZIP5则均含有BRLZ、MFMR及homeobox结构，结合进化树结果可知PtbZIP3和PtbZIP13聚在一起，PtbZIP26、PtbZIP21和PtbZIP5三者亲缘关系较近。图片3.5 远志bZIP基因家族成员保守基序分析利用MEME对远志27个bZIP蛋白序列进行保守基序分析的结果显示，不同bZIP转录因子基因包含的保守元件数量及种类存在差异，其中bZIP14基因包含的保守元件数量最少（2个），bZIP18/25基因包含的保守元件数量最多（11个），说明bZIP成员具有功能冗余现象，也具有功能差异性（图3）。图片bZIP蛋白结合位点序列分析结果表明，bZIP转录因子的每个重复结构域约为65 aa，均含有1个保守的bZIP结构域，其中N端一般具有高度保守的N-X7-R蛋白基序和碱性亮氨酸区域（图4）。图片3.6 远志bZIP基因家族成员密码子偏好性分析密码子可用来推断基因组内部或基因组之间的进化关系，而不同种类或同一种类的基因对密码子使用有不同的偏好模式[23]。由bZIP基因家族中的27条核苷酸序列中密码子GC的总含量（GC）以及同义密码子第1位（GC1s）、第2位（GC2s）、第3位的（GC3s）的GC含量分析结果可知：27条PtbZIP基因序列的GC1s、GC2s和GC3s的均值分别为52.24%、44.90%和40.93%，不同位置的GC含量存在差异；它们的GC平均值为46.11%，小于50%，表明其更偏向于A或U结尾的密码子[24]（表3）。图片有效密码子（effective number of codon，ENC）反映了密码子偏离随机选择的结果，它是对同义密码子非均衡使用偏好程度的一个重要指标[25]，ENC数值一般在20～61范围内，当ENC＞35则表示密码子偏好性较弱。密码子适应指数（codon adaption index，CAI）是指编码该蛋白的所有密码子相对于这条基因都使用最优密码子的情况下的适应系数[24]。由表3可知，远志bZIP家族成员的ENC数值为43.088～57.195个，平均值为51.13个，密码子偏好性较弱。CBI值较低说明其外源基因在目的宿主中表达较弱。CAI值较低，则说明其适应性较弱。3.7 远志bZIP基因家族成员蛋白互作网络分析为深入了解远志bZIP蛋白的潜在功能和家族成员之间的相互作用，利用STRING软件，基于拟南芥数据库，对远志的27个bZIPs蛋白进行了互作网络分析。由图5可知，调控网络中共有27个节点（代表bZIPs蛋白），104条边（代表蛋白质之间的相互作用），表明远志的bZIPs蛋白存在多种互作现象，且26个bZIPs成员之间存在潜在的互作关系，为进一步验证远志bZIP的功能提供了重要依据。图片3.8 远志bZIP基因家族成员不同组织表达量热图和验证根据远志转录组数据，对27个PtbZIP基因在远志根、茎、叶中的FPKM差异表达数据进行了双向聚类分析。通过表达量热图分析可知，绝大部分基因的表达不恒定，在不同组织具有相对较高的表达量，根、茎和叶中表达量较高的基因数分别为23、2和2。PtbZIP4/15在叶中的表达量最高，茎和根次之；PtbZIP8/24在茎中的表达量最高，叶和根次之；剩下23个除PtbZIP1/17的表达量为根＞叶＞茎，其余表达模式为根＞茎＞叶（图6-A）。基于RT-qPCR验证转录组数据结果显示，PtbZIP26、PtbZIP27在根中的表达量最高，茎、叶次之，与转录组结果一致（图6-B）。图片3.9 PtbZIP26不同处理下的表达模式为了探究bZIP家族基因在远志不同处理条件下的表达模式，以PtbZIP26为代表，对其进行了激素和干旱、盐胁迫处理条件下的表达模式分析。结果发现，以0 h为空白对照（CK），PtbZIP26的表达量在ABA处理6 h内迅速上升，在24 h达到峰值；CTS处理分别持续上调至峰值为CK的5.3倍（24 h）后逐渐下调（图7-A）。PEG处理6 h迅速下降后又随着处理时间增加缓慢恢复上调，NaCl处理6 h后上调明显（图7-B）。 图片4 讨论bZIP基因家族在植物中广泛分布，参与植物的多个生长过程，如生长发育、应激反应以及次生代谢物的生物合成[26]。现阶段，bZIP基因家族已在多个物种有过相关的鉴定和研究，使得对bZIP的生物功能了解更透彻。本实验基于远志三代全长转录组数据库，找到39个bZIP isoforms，通过完整开放阅读框与BlastX分析找出具有完整ORF的基因，去除重复的isoforms，筛选并鉴定得到27个PtbZIP基因家族成员。理化性质分析显示，27个成员均为亲水性蛋白，且除PtbZIP1和PtbZIP22外均为不稳定蛋白；理论等电点小于7的蛋白有16个，属酸性蛋白，其余均为碱性蛋白。PtbZIP蛋白信号肽分值都低于0.5，说明其均无信号肽，信号肽是分泌蛋白的决定因子，推测PtbZIP蛋白不属于分泌蛋白。亚细胞定位结果显示，远志bZIP蛋白主要定位于细胞核，这与转录因子主要在细胞核中发挥作用一致。PtbZIP家族成员的蛋白二级结构也有明显的特点，主要有α-螺旋、无规卷曲。系统进化分析显示，27个PtbZIP蛋白分为A、B、C、D、F、G、I、S 8个组，其中含有8个PtbZIP家族成员的G亚组系最大亚组。PtbZIP11/18/25与拟南芥At1g32150.1、At2g35530.1高度同源，且包含的保守元件数量最多，推测PtbZIP11/18/25可能在远志干旱应答的分子机制中起重要作用[27]。研究表明，A类别的大多数功能信息提示在ABA或应激信号中的作用，PtbZIP6/12/16被分在A组，推测该基因可能参与到远志ABA信号转导途径[28]。S类别是拟南芥最大的bZIP类别之一，在胁迫处理后也被转录激活或在花的特定部分特异表达。研究证实，拟南芥bZIP家族中的S类别的基因在响应干旱有重要作用，本研究中共有3个PtbZIP基因被分到S类别下，其中PtbZIP15在叶中表达量高，PtbZIP24在茎中表达量高，可能参与调控远志对干旱的响应。同时，27个PtbZIP基因家族成员的蛋白二级结构预测结果十分相似，但序列间同源性相对较低，表明PtbZIP基因可能在远志生长发育方面发挥广泛的生物功能。表达模式分析发现，大部分PtbZIP在根中表达最高，qPCR结果验证与转录组数据一致，推测它们主要在远志地下部分发挥作用。植物中转录因子的表达与激素密切相关，研究发现葡萄VvLysM8和VvLysM9在壳聚糖处理12 h、脱落酸处理3 h时相对表达量最高[14]。马铃薯StHXK家族基因在ABA诱导下表达均显著上调，且在10%PEG胁迫处理下也呈不同程度的上调表达[29]。陆地棉GhKIN基因家族的鉴定和分析发现，干旱和盐胁迫处理后GhKIN14和GhKIN27表达出现下调，而GhKIN18等在一定时间点表现为表达上调[30]。本研究选择一个在根中高表达的PtbZIP26基因，通过不同激素、胁迫处理探讨了其是否受到相关激素和胁迫调控，结表明激素处理（ABA和CTS）远志幼苗后，PtbZIP26表达水平显著提高；同时，盐胁迫和干旱胁迫处理也可诱导PtbZIP26基因的表达发生改变且随胁迫时间的变化呈现出差异性，说明PtbZIP26可能通过不同信号通路参与远志应对逆境胁迫的表达，具体作用机制有待深入研究。本实验基于远志三代转录组数据，以远志bZIP基因家族为研究对象，对其家族成员进行鉴定和生物信息学预测分析，明确了相关结构特点与进化特征，进一步通过qPCR分析其在不同组织、不同处理下的表达模式，为探究PtbZIP参与生长发育、代谢过程及非生物胁迫的调控机制提供参考依据，为后期的基因功能研究奠定了基础。

目的：建立麝香接骨胶囊的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱：Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18 4.6×250mm, 5μm，流动相：乙腈-水（21：79 V/V），流速：1.0mlmin-1，检测波长：203nm，柱温：30℃。结果：三七皂苷R1在0.005～0.25mgml-1范围内线性关系良好（r=0.9998）；平均加样回收率为97.6%， RSD=1.0%（n=6）。结论：该方法简便易行，结果准确可靠，可适用于麝香接骨胶囊的质量控制。 【关键词】高效液相色谱法 麝香接骨胶囊 三七皂苷R1 含量测定　　Determination of Forsythin content in Shexiang Jiegu Jiaonang by HPLC　　【Abstract】 OBJECTIVE:To set up a method for quality control of Shexiang Jiegu Jiaonang METHOD HPLC method was developed to quantitative determination. COLUMN Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18 4.6×250mm, 5μm.The mobilic phase was acetonifrile-water (21:79V/V).The column temperature was 30℃,the wavelength for detection was 203nm,flow rate was 1.0mlmin-1. RESULTS The paeonol average of recovery rate was 97.6%, and RSD was 1.0%(n=6). CONCLUSION The method is simple, accurate and suitable for its assaying.　　【Key word】 HPLC Shexiang Jiegu Jiaonang Notoginsenoside R1 determination　　麝香接骨胶囊为《卫生部药品标准》第五册（中药成方制剂）收载的品种，由赤芍、三七、当归、续断、苏木、麝香等22味中药组成，具有散瘀止痛，续筋接骨之功效。临床用于跌打损伤，筋伤骨折，瘀血凝结，闪腰岔气[1]。处方中三七为主药之一，三七皂苷R1为其主要有效成分，原标准中无含量测定方法。为了更好地控制制剂的内在质量，本文采用高效液相色谱法测定麝香接骨胶囊中三七皂苷R1的含量，以期为该制剂的质量提供快速、准确的测定方法，现报告如下。　　1 仪器与试药　　LC－2010A 高效液相色谱仪，CLASS－VP 色谱工作站，紫外检测器；三七皂苷R1对照品（批号：110745-200312），由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用；麝香接骨胶囊为市售样品（辽源市亚东中药有限责任公司，规格0.3g粒-1，批号：060801，061102，060912）。乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。　　2 方法与结果　　2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18 4.6×250mm, 5μm；流动相：乙腈-水（21：79， V/V）；检测波长：203nm；流速：1.0mlmin-1；柱温：30℃。理论板数按三七皂苷R1峰计应不低于4000。　　2.2 溶液制备　　2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥12小时以上的三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成0.25 mgml-1的对照品贮备液；再精密量取对照品贮备液适量，加甲醇制成0.05mgml-1的对照品溶液，即得。　　2.2.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的麝香接骨胶囊内容物，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率50 kHz）1小时，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水饱和的正丁醇30ml使溶解，加氨试液振摇提取3次，每次15ml，合并氨试液提取液，再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15ml，与上述正丁醇液合并，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移置10ml量瓶中，加甲醇稀释置刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.22μm）滤过，取续滤液，即得[2]。　　2.2.3 阴性对照溶液的制备　　取除三七皂苷R1以外的处方中其余药材的十分之一量，按法制成胶囊，再按供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。　　2.3 专属性试验　　分别精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图（图1）。由图1可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间（三七皂苷R110.971min）的色谱峰，阴性试验无干扰，证明本法可行。2.4 线性关系考察　　精密吸取三七皂苷R1对照品贮备液（浓度：0.25mg.ml-1）适量，加甲醇配成浓度分别为0.005、0.01、0.05、0.10、0.15、0.25mgml-1的溶液6份，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤。精密吸取续滤液各10μl，注入液相色谱仪，测得峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，其浓度（C）为横坐标，得三七皂苷R1的回归方程为：A=392250.2 C +8620.1，r =0.9998（n=6）。结果表明，三七皂苷R1在0.005～0.25mgml-1范围内峰面积与其浓度呈良好线性关系。　　2.5 精密度试验　　精密吸取三七皂苷R1对照品溶液（0.05mgml-1）10μl，在上述色谱条件下重复进样6次，求得三七皂苷R1溶液峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.3%（n=6），表明精密度较好。　　2.6 稳定性试验　　精密吸取三七皂苷R1对照品溶液（0.05mgml-1）10μl，在0、4、8、12、24、48h分别进行测定，结果表明三七皂苷R1对照品溶液在48h内稳定， RSD为0.4%（n=6）。　　2.7 重复性试验　　取供试品（批号061101），共6份，分别按“2.2.2供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，进行测定，求得三七皂苷R1含量的RSD为1.6%（n=6），表明重现性较好。　　2.8 加样回收率试验　　精密称取已知含量的样品（批号061101，三七皂苷R1含量0.93mgg-1，平均装量0.2996g粒-1）适量，共6份，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入三七皂苷R1对照品贮备液（0.25mgml-1）各3ml，按“2.2.2供试品溶液的制备”方法操作，得回收率试验溶液，依法测定，结果见表1。表1 三七皂苷R1加样回收率试验（略）　　2.9 样品含量测定　　分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定三批样品中三七皂苷R1峰面积，按外标法计算其含量（n=5），结果见表2。表2 3批样品含量测定结果（略） 　　3 讨论　　3.1 通过对3批样品中三七皂苷R1的测定，结果表明最高含量为0.31mg粒－1，最低为0.27mg粒－1，综合考虑确定限量每粒含三七皂苷R1不得低于0.20mg。　　3.2 流动相的选择 试验中采用不同的流动相甲醇-水（25︰75），乙腈-水-冰醋酸（25︰75︰0.5），结果表明采用流动相乙腈-水（21︰79）的色谱图基线较稳。　　3.3 本方法结果准确，方法简便，重现性及回收率均理想，可以作为该制剂的质量控制方法。

做一个甾体皂苷的含量测定，已经做第4次了，问题始终没解决，遂请教。具体要求如下：色谱条件要求：C8的柱子；流动相是乙腈-水（30:70）；检测波长210nm。样品处理：取一定量，加75%乙醇超声10分钟，放冷，补足减失重量，滤过，即可。 对照品也是用75%乙醇溶解。测试经过如下：有同一厂家同一品种不同批号两批样品，用C8的柱子做，计算了下，含量合格，但峰实在太难看。怕峰形太差影响结果的准确性，但只有一根这C8的柱子，只好换根C18的柱子，调整流动相试试；峰形很好，进了一针其中一批的样品，计算了也合格，就编个序列继续做下去了。第四天才发现另一批不合格，只好第五天返工。第二次，问题出现了。返工时，同样的仪器，色谱柱，色谱条件，用原来配的对照品溶液，重新处理样品，不合格的那一批还是不合格，结果比上次测的还低一点，合格的那批也不合格了。又另配了对照品溶液，与之前配的浓度相差不大，但峰面积小多了。但是之前配的对照品峰面积反而变大了，估计是因为流动相微调，把之前没分开的小峰分开了，不至于斜着积分的原因吧。怀疑过对照品峰面积小，是不是冷冻（对照品要求冷冻保存哈）后没放至室温，直接称，导致称不准。样品怀疑过的原因 A:是不是不合格那一批取样量大了，浓度高了，导致过饱和，未全溶 B：样品是不是未混匀，取样代表性不够 C：超声时间，功率是不是有问题，是不是超声发热导致样品降解（对照品要冷冻保存嘛）E：是不是第二次配的溶样溶剂有问题第三次做，更蹊跷了。之前怀疑的样品的原因都排除了。减少，增加取样量；混匀样品；超声不同时间，用不同超声设备（不同功率）；超声中换水，防止温度升高，水浴上回流处理样品；重配75%乙醇几次，用无水乙醇配也试了，还换用甲醇，样品溶液居然都没有目标峰。但之前两次配的对照品溶液峰高变化不大，高的还是高，低的还是低。第四次，就是今天。又重配了对照品溶液，换甲醇（色谱纯）溶解，居然对照品也没峰了，用75%乙醇溶解也是。之前配的对照品峰高还是老样子。将第一次配的对照品溶液跟这次提取的测不到目标峰的样品溶液混合，也能出目标峰。这根柱子换走另一个对照品测试，峰好得很。再换另一根柱，走样品和对照品，还是老样子，之前能出的还出，出不了的还是还是出不了。总结：一共配了三次对照品，浓度差异不大，但峰面积在变小，第三次就没了。样品也是，第一次合格的，第二次提取也不合格了，以后干脆目标峰也不出了。 分析：应该不是目标物不稳定的原因，因为第一次配的对照品，隔了一周，峰高依然变化不大，更何况新配的对照品溶液。 几次都是我操作，对照品溶液都超声助溶过，应该也是溶了的。而且用紫外扫过，稀释后吸收值会降低，虽然最大吸收波长在约205nm。其实用甲醇比用75%乙醇溶解要好些，几乎振摇就能溶，用75%乙醇必须稍超声一下。[/fo

请问一下各位：车前醚苷对照品哪里有卖呢？

[font=宋体]【[b]含量测定[/b]】　照高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法（通则0512）测定。[/font][b][font=宋体]色谱条件与系统适用性试验[/font][/b][font=宋体] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；乌药碱检测波长为227nm，木兰花碱、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷D为蒸发光散射检测器检测。理论板数按斯皮诺素和酸枣仁皂苷A峰计算均应不低于2000。[/font][table][tr][td=1,1,201][font=宋体]时间（分钟）[/font][/td][td=1,1,185][font=宋体]流动相A(%)[/font][/td][td=1,1,182][font=宋体]流动相B(%)[/font][/td][/tr][tr][td=1,1,201][font=宋体]0~25[/font][/td][td=1,1,185][font=宋体]10→20[/font][/td][td=1,1,182][font=宋体]90→80　[/font][/td][/tr][tr][td=1,1,201][font=宋体]25~30[/font][/td][td=1,1,185][font=宋体]20→23[/font][/td][td=1,1,182][font=宋体]80→77[/font][/td][/tr][tr][td=1,1,201][font=宋体]30~42[/font][/td][td=1,1,185][font=宋体]23→26[/font][/td][td=1,1,182][font=宋体]77→74[/font][/td][/tr][tr][td=1,1,201][font=宋体]42~45[/font][/td][td=1,1,185][font=宋体]26→37[/font][/td][td=1,1,182][font=宋体]74→63[/font][/td][/tr][tr][td=1,1,201][font=宋体]45~47[/font][/td][td=1,1,185][font=宋体]37[/font][/td][td=1,1,182][font=宋体]63[/font][/td][/tr][tr][td=1,1,201][font=宋体]47~54[/font][/td][td=1,1,185][font=宋体]37→39[/font][/td][td=1,1,182][font=宋体]63→61[/font][/td][/tr][tr][td=1,1,201][font=宋体]54~65[/font][/td][td=1,1,185][font=宋体]39→100[/font][/td][td=1,1,182][font=宋体]61→0　[/font][/td][/tr][/table][b][font=宋体]对照品溶液的制备[/font][/b][font=宋体] 取乌药碱对照品、木兰花碱对照品、酸枣仁皂苷A对照品、酸枣仁皂苷D对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含100 μg、2mg、100 μg和100 μg的混合溶液，即得。 [/font][b][font=宋体]供试品溶液的制备[/font][/b][font=宋体] 取本品粉末（过四号筛）约1g，精密称定，加石油醚（60~90℃）50ml，冷浸过夜，超声处理30分钟，弃去石油醚液，药渣挥去溶剂，转移至锥形瓶中，加入70%乙醇20ml，加热回流2小时，滤过，滤渣用70%乙醇5ml洗涤，合并洗液与滤液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 [/font][b][font=宋体]测定法[/font][/b][font=宋体]　分别精密吸取对照品溶液5μl、20μl，供试品溶液10μl，注入[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]，测定，用外标两点法对数方程计算木兰花碱、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷，用外标法测定乌药碱，即得。[/font][font=宋体]按干燥品计算，含酸枣仁皂苷A（C58H94O26）不得少于0.030%，乌药碱（C17H19NO3）不得少于0.008%，木兰花碱（C20H24NO4）不得低于0.20%，酸枣仁皂苷D（C58H94O26)）不得低于0.02%。[/font]

用药典方法测定柴胡药材中柴胡皂苷a、d的含量，刚开始预实验，对照品和样品的峰型都挺好，后来平衡好色谱柱，直接批量进针，问题就出现了，无论是对照还是样品，柴胡皂苷a的峰高变低，峰型变胖，保留时间也提前了4分钟，但是柴胡皂苷d没有什么变化，求助大家，问题在哪？而且每个样品进3针，第1针与第2、3针的柴胡皂苷a在保留时间上也有0.5分钟的差别...

[size=3]我是学中药分析的，对化学药的分析不怎么在行。今下午，一同事问我，在西药的含量测定中的K值是什么？我愣了，从来没听说过啊！问我同学，才知道，是为了防止在称取对照品时称量的误差而造成含量测定的误差加大，在称取对照品时，通常是称取两次对照品，配制两个浓度的对照品溶液。然后，计算出一个平均浓度。K值=对照品溶液的浓度/其峰面积以上说的对否？我在做中药分析过程中，从没遇到这种问题，但我觉得，为什么中药分析为什么不采用这种方法？同时，两个平行溶液间配制时，有无要求？如Rd值。[/size]

http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/09/201209272130_393425_2255248_3.gifHPLC测定木犀草苷对照品为什么峰前面有个小峰？？？？

目的:建立HPLC-ELSD 检测酸枣仁制剂中酸枣仁皂苷a的含量方法。方法:采用Diamonsil C18色谱柱以乙腈-水(25∶75) 为流动相;ELSD:流速1.0mL/min,ELSD漂移管温度110 ℃,载气(N2)流速2.8 L/min结果:酸枣仁皂苷A进样量在0.104～1.04μg范围内线性良好( r= 0.9998); 平均回收率为95.6%。结论:本法准确、灵敏、重复性好，为酸枣仁制剂的质量控制提供了依据。1.仪器与试药1.1仪器 安捷伦1100高效液相色谱色谱仪，Alltech 2000ES型蒸发光散射检测器，KQ250超声波清洗器（江苏昆山超声仪器厂），高速离心机（上海飞鸽）十万分之一分析天平（梅特勒公司）。1.2试药桔梗药材：由市场购买提供。经鉴定符合2010版中国药典规定。对照品：酸枣仁皂苷对照品（购自中国食品药品鉴定研究院，批号：111851-201003）乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱 (5um, 4.6*250mm)，流动相乙腈-水( 25：75) ，柱温30℃，流速1.0 mL·min － 1 ，进样量10μL[size=12pt

完全按照药典标准做的三七总皂苷，可是对照品和样品的Re均不出峰，其他几个峰都出得很好

高效液相色普法测定甘草酸苷含量，甘草酸苷对照品峰面积与之前相比较偏高，导致含量偏高，请问有可能是哪些原因？

大家经常做气相需要测对照品溶液，有时对照品溶液的出峰面积在不同时期可能差异较大，大家遇到过这样的问题吗？问题：取甲醇、乙酸乙酯、甲苯适量，精密称定，用DMF溶解稀释定容制成每1ml中约含甲醇60ug、乙酸乙酯100ug、甲苯20ug的混合溶液。那么我们实际称取的对照质量应该在什么范围内是可以接受的？因为称量的差异会导致对照品出峰面积的差异。问题：如何能用天平称准对照试剂的量？（有机溶剂甲醇、乙腈、二氯甲烷等）换算成体积量取还是直接称取？

人参皂苷C-K抑菌性能的研究[align=center]西安国联质量检测技术股份有限公司[/align][align=center]食品事业部：滑莹[/align][b]1引言[/b]此文主要研究人参皂苷C-K采用现行版直接法进行微生物技术法和控制菌的检查.本方案计划对该方法在QC实验室进行确认,此确认成功后,证明此方法适用于在实验室运行.[b]2材料与方法2.1 供试品与实验用菌[b]2.1.1供试品[/b][/b]人参皂苷C-K供试品制备:每次称取人参皂苷C-K供试品10g,加稀释剂至200ml溶液,制成供试品溶液1:20,混匀备用.稀释剂为含0.5%卵磷脂,4%吐温-20的大豆酪蛋白肉汤,配置如下:[table][tr][td]酪蛋白胨[/td][td]17.0g[/td][/tr][tr][td]大豆木瓜蛋白酶消化物[/td][td]3.0g[/td][/tr][tr][td]氯化钾[/td][td]5.0g[/td][/tr][tr][td]磷酸氢二钾[/td][td]2.5g[/td][/tr][tr][td]葡萄糖[/td][td]2.5g[/td][/tr][tr][td]纯化水[/td][td]1L[/td][/tr][/table][b]2.1.2 实验用菌[/b][table][tr][td]试验菌种名称及编号[/td][td]试验菌种批号[/td][/tr][tr][td]枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis ATCC6633）[/td][td]1(4)-150913[/td][/tr][tr][td]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus ATCC6538）铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa ATCC9027）白色念球菌（Candida Albicans ATCC10231）黑曲霉（Aspergillus Brasiliensis ATCC16404）大肠埃希菌（Escherichia Coli ATCC8739）[/td][td]1(4)-1510011(4)-1509271(4)-1510112(4)-1509121(4)-150910[/td][/tr][/table][b]2.1.3 菌液制备[/b]取经30-35℃培养18-24h的金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌的大豆酪蛋白肉汤培养物1ml加入9mlph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，10倍稀释至≤10000CFU/ml的菌液备用.取经30-35℃培养18-24h的大肠埃希菌的大豆酪蛋白肉汤培养物1ml加9mlph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，10倍稀释至≤100CFU/ml的菌液备用.取经20-25℃培养48h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖肉汤培养物，取此溶液1ml加入9mlph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，10倍稀释至≤10000CFU/ml的菌液备用.将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20-25℃培养7d，使大量的孢子形成.取此斜面培养物，加入含0.05%吐温80ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液4ml洗下孢子，吸出转移至无菌空试管作为原液，取此原液1ml，加入9ml含0.05%吐温80ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，每次以10倍稀释，稀释至≤10000CFU/ml的菌液备用.微生物的稀释度与接种量:见表1[align=center]表1 菌液制备[/align][table][tr][td][table][tr][td][table][tr][td]微生物名称及编号[/td][td]稀释度[/td][td]接种量[/td][/tr][tr][td]枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis ATCC6633）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus ATCC6538）铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa ATCC9027）白色念球菌（Candida Albicans ATCC10231）黑曲霉（Aspergillus Brasiliensis ATCC16404）大肠埃希菌（Escherichia Coli ATCC8739）[/td][td]10-410-410-510-310-210-7[/td][td]10μl10μl10μl10μl10μl10μl[/td][/tr][/table][/td][/tr][/table][/td][/tr][/table]对于大肠埃希菌检测,菌液见表2[align=center]表2 大肠埃希菌菌浓[/align][table][tr][td]微生物名称、编号及批号[/td][td]稀释度[/td][td]浓度[/td][td]接种量[/td][/tr][tr][td]大肠埃希菌ATCC8739 1(4)-151112[/td][td]10[sup]-7[/sup][/td][td]74,68[/td][td]1ml[/td][/tr][/table][b][b]2.2 主要培养基[/b][/b][table][tr][td]培养基名称[/td][td]干粉批号及生产厂商[/td][td]配制批号及有效期[/td][/tr][tr][td]Ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液[/td][td]上海盛思生化科技有限公司[/td][td]150922 2016.06.04[/td][/tr][tr][td]大豆酪蛋白琼脂(TSA)[/td][td]2235498,BD[/td][td]150817 2016.09.06[/td][/tr][tr][td]沙氏葡萄糖琼脂(SDA)[/td][td]3101376,BD[/td][td]150718 2016.08.07[/td][/tr][tr][td]沙氏葡萄糖肉汤[/td][td]1039403,BD[/td][td]150718 2016.08.07[/td][/tr][tr][td]大豆酪蛋白肉汤[/td][td]1320926,BD[/td][td]150817 2016.09.06[/td][/tr][tr][td]吐温-20(4%)[/td][td]20141225,国药集团[/td][td] 有效期: 2016.08.31[/td][/tr][tr][td]吐温-80(0.05%)[/td][td]20140412,国药集团[/td][td] 有效期: 2016.08.31[/td][/tr][tr][td]Ph7.0无菌氯化钠-蛋白(0.05%吐温-80)[/td][td]自配[/td][td]150113 2016.02.02[/td][/tr][tr][td]卵磷脂大豆酪蛋白肉汤(含0.5%卵磷脂,4%吐温-20) [/td][td]20150807, 国药集团自配[/td][td] 有效期: 2016.12.22150113 2016.02.02[/td][/tr][tr][td]麦康凯肉汤[/td][td]3134161,BD[/td][td]150114 2016.02.03[/td][/tr][tr][td]麦康凯琼脂[/td][td]2271364,BD[/td][td]150121 2016.02.10[/td][/tr][/table][b][b]2.3 主要实验设备[/b][/b][table][tr][td]设备[/td][td]型号和编号[/td][td]生产厂商[/td][/tr][tr][td]二级生物安全柜[/td][td]AC2-3S1[/td][td]ESCO[/td][/tr][tr][td]天平高压蒸汽灭菌器20-25℃培养箱30-35℃培养箱42-44℃培养箱[/td][td]BSA2202S/25#YXQ-LS-100A/2#SPX-250B-Z/09#10#SPX-150/01#06#SPX-150/02#[/td][td]赛多利斯科学仪器公司上海博讯事业有限公司上海博讯事业有限公司上海跃进医疗器械厂上海跃进医疗器械厂[/td][/tr][tr][td]水浴锅[/td][td]2850/11#[/td][td]Thermo[/td][/tr][/table][b]2.4 总需氧菌,霉菌及酵母菌数检测方法验证(直接法)[/b].用1批样品进行3次独立实验.[b]2.4.1 总需氧菌试验组[/b]分别取供试品溶液1ml置无菌平皿中,接种10μl各验证用菌液(枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念球菌、黑曲霉菌) ≤10000CFU/ml，平行做2个平皿，分别加入已加热融化并冷却至45℃的大豆酪蛋白琼脂(TSA)培养基约20ml，摇匀，水平放置，使凝固，加入枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的培养皿于30-35℃倒置培养3d，加入白色念球菌.黑曲霉菌的培养皿于30-35℃倒置培养5d，作为总需氧菌检测方法的供试组.[b]2.4.2 霉菌及酵母菌试验组[/b]取供试品溶液1ml置无菌平皿中，接种10μl各试验用菌液（白色念球菌、黑曲霉菌）≤10000CFU/ml，平行做2个平皿，分别加入已加热融化并冷却至45℃的沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基约20ml，摇匀，水平放置，使凝固，于20-25℃倒置培养5d，作为霉菌及酵母菌数的检测方法的供试组.[b]2.4.3 供试品对照组[/b]分别取供试品溶液1ml置无菌平皿中,平行作2个平皿,分别加入已加热融化并冷却至45℃的TSA培养基约20ml,摇匀,水平放置,使凝固,30-35℃倒置培养5d,作为总需氧菌检测方法供试品对照组.分别取供试品溶液1ml置无菌平皿中,平行作2个平皿,分别加入已加热融化并冷却至45℃的沙氏葡萄糖琼脂(SDA)培养基约20ml,摇匀,水平放置,使凝固,于20-25℃倒置培养5d,作为霉菌及酵母菌数的供试品对照组.[b]2.4.4 菌液组[/b]加入10μl各验证用菌液(枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念球菌、黑曲霉菌) ≤10000CFU/ml置无菌平皿中,平行做2个平皿，分别加入已加热融化并冷却至45℃的TSA培养基约20ml,摇匀,水平放置,使凝固,加入枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的培养皿于30-35℃倒置培养3d，加入白色念球菌、黑曲霉菌的培养皿于30-35℃倒置培养5d，作为总需氧菌检测方法的菌液组.加入10μl各验证用菌液(白色念球菌、黑曲霉菌) ≤10000CFU/ml置无菌平皿中, 平行做2个平皿，分别加入已加热融化并冷却至45℃的沙氏葡萄糖琼脂(SDA)培养基约20ml,摇匀,水平放置,使凝固,于20-25℃倒置培养5d. 作为总需氧菌检测方法的菌液组.[b]2.4.5 稀释剂对照组[/b]分别取稀释剂1ml加入10μl各验证用菌液(枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念球菌、黑曲霉菌) ≤10000CFU/ml置无菌平皿中，平行做2个平皿，分别加入已加热融化并冷却至45℃的TSA培养基约20ml,摇匀，水平放置，使凝固，加入枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的培养皿于30-35℃倒置培养3d，加入白色念球菌.黑曲霉菌的培养皿于30-35℃倒置培养5d，作为总需氧菌检测方法的菌液组.分别取稀释剂1ml加入10μl各验证用菌液(白色念球菌、黑曲霉菌) ≤10000CFU/ml置无菌平皿中，平行做2个平皿，分别加入已加热融化并冷却至45℃的沙氏葡萄糖琼脂(SDA)培养基约20ml,摇匀，水平放置，使凝固，于20-25℃倒置培养53d，作为霉菌及酵母菌数检测方法的菌液组.[b]2.4.6 稀释剂阴性对照组[/b]分别取供试品溶液1ml置无菌平皿中,平行作2个平皿,分别加入已加热融化并冷却至45℃的TSA培养基约20ml,摇匀,水平放置,使凝固,30-35℃倒置培养5d, 作为总需氧菌稀释剂阴性对照组.分别取供试品溶液1ml置无菌平皿中,平行作2个平皿,分别加入已加热融化并冷却至45℃的SDA培养基约20ml,摇匀,水平放置,使凝固,20-25℃倒置培养5d, 作为霉菌及酵母菌数的稀释剂阴性对照组.[b]2.4.7 培养[/b]倒置TSA平皿,在30-35℃培养,加枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的平皿不超过72h,加白色念球菌,黑曲霉的平皿不超过120h.倒置SDA平皿,在20-25℃培养,不超过120h.[b][b]2.5控制菌(大肠埃希菌)的方法验证[/b]2.5.1 供试液的制备[/b]每次取上述制备好的1:20供试液备用[b]2.5.2 器具和操作环境[/b]所有的检测操作都要在生物安全柜内进行.在整个操作过程中,操作人员必须穿无菌衣无菌操作.[b]2.5.3 试验组[/b]分别将制备的1:20供试液20ml接种至100ml大豆酪蛋白肉汤,接种1.0ml验证菌液大肠埃希菌≤100CFU,于30-35℃培养18-24h,摇匀,取1.0ml培养液接种至100ml麦康凯肉汤培养基中,于42-44℃培养24-48h.摇匀,其培养液再划线接种于麦康凯培养基上,于30-35℃培养24-72h.[b]2.5.4 供试品对照组[/b]分别将制备的1:20供试液20ml接种至100ml大豆酪蛋白肉汤, 于30-35℃培养18-24h.摇匀, 取1.0ml培养液接种至100ml麦康凯肉汤培养基中,于42-44℃培养24-48h.摇匀,其培养液再划线接种于麦康凯培养基上,于30-35℃培养24-72h.[b]2.5.5 阴性对照[/b]分别取含0.5%卵磷脂,4%吐温-20的大豆酪蛋白肉汤20ml接种至100ml大豆酪蛋白肉汤培养基中, 于30-35℃培养24h.摇匀, 取1.0ml培养液接种至100ml麦康凯肉汤培养基中,于42-44℃培养48h.摇匀,其培养液再划线接种于麦康凯培养基上,于30-35℃培养2h.[b]3结果与分析[b]3.1 总需氧菌、霉菌及酵母菌实验检测结果[/b][/b]各验证用微生物在TSA培养基上的生长结果记录在表3,各验证用微生物在SDA培养基的生长结果记录在表4.[align=center]表3 微生物在TSA培养基上的生长结果[/align][table][tr][td][align=center]实验菌[/align][/td][td][align=center]供试品试验组菌落数（CFU/g）[/align][/td][td][align=center]供试品对照组菌落数（CFU/g）[/align][/td][td][align=center]菌液组菌数（CFU/g）[/align][/td][td][align=center]稀释剂对照组菌落（CFU/g）[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]枯草芽孢杆菌[/align][/td][td][align=center]49[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]68[/align][/td][td][align=center]65[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]金黄色葡萄球菌[/align][/td][td][align=center]64[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]72[/align][/td][td][align=center]70[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]铜绿假单胞菌[/align][/td][td][align=center]67[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]78[/align][/td][td][align=center]76[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]白色念球菌[/align][/td][td][align=center]55[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]64[/align][/td][td][align=center]62[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]黑曲霉菌[/align][/td][td][align=center]41[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]52[/align][/td][td][align=center]50[/align][/td][/tr][/table][align=center]表4 微生物在SDA培养基上的生长结果[/align][table][tr][td]实验菌[/td][td][align=center]供试品试验组菌落数（CFU/g）[/align][/td][td][align=center]供试品对照组菌落[/align][align=center]数（CFU/g）[/align][/td][td][align=center]菌液组菌数（CFU/g）[/align][/td][td][align=center]稀释剂对照组菌落（CFU/g）[/align][/td][/tr][tr][td]白色念球菌[/td][td][align=center]58[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]60[/align][/td][td][align=center]59[/align][/td][/tr][tr][td]黑曲霉菌[/td][td][align=center]44[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]54[/align][/td][td][align=center]52[/align][/td][/tr][/table][b][b]3.2 大肠埃希菌检验结果[/b][/b]检验结果记录于表5.[align=center]表5 大肠埃希菌验证结果[/align][table][tr][td]批号[/td][td]项目[/td][td]培养温度[/td][td]试验组[/td][td]供试品对照组[/td][td]阴性对照[/td][/tr][tr][td=1,3]S151011-M[/td][td]大豆酪蛋白肉汤[/td][td]30-35℃[/td][td]+[/td][td]-[/td][td]-[/td][/tr][tr][td]麦康凯肉汤[/td][td]42-44℃[/td][td]+[/td][td]-[/td][td]-[/td][/tr][tr][td]麦康凯琼脂[/td][td]30-35℃[/td][td]+[/td][td]-[/td][td]-[/td][/tr][tr][td=1,3]S151011-M[/td][td]大豆酪蛋白肉汤[/td][td]30-35℃[/td][td]+[/td][td]-[/td][td]-[/td][/tr][tr][td]麦康凯肉汤[/td][td]42-44℃[/td][td]+[/td][td]-[/td][td]-[/td][/tr][tr][td]麦康凯琼脂[/td][td]30-35℃[/td][td]+[/td][td]-[/td][td]-[/td][/tr][tr][td=1,3]S151011-M[/td][td]大豆酪蛋白肉汤[/td][td]30-35℃[/td][td]+[/td][td]-[/td][td]-[/td][/tr][tr][td]麦康凯肉汤[/td][td]42-44℃[/td][td]+[/td][td]-[/td][td]-[/td][/tr][tr][td]麦康凯琼脂[/td][td]30-35℃[/td][td]+[/td][td]-[/td][td]-[/td][/tr][/table][b] [/b](阳性结果以“+”表示，阴性结果以“-”表示)[b]3.3 分析[/b]其中总需氧菌、霉菌及酵母菌数检测方法的合格标准：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的回收率（回收率=稀释剂对照组的菌落数*100%/菌液组的菌落数）在50%-200%.试验组的菌回收率（回收率=（试验组的菌落数-供试品对照组的菌落数的值）*100%菌液组菌落数）在50%-200%.大肠埃希菌检测方法验证的合格标准：阴性对照均可以检测出，样品及阴性对照均未检测出.阴性结果以“+”表示，阴性结果以“-”表示. 实验证明人参皂苷C-K采用现行版直接法进行微生物计数法和控制菌的检查在实验室可运行.微生物在TSA培养基上的生长结果的检测方法处理结果见表6. 微生物在SDA培养基上的生长结果见表7.[align=center]表6 微生物在TSA培养基上的生长结果[/align][table][tr][td][align=center]微生物名称及编号[/align][/td][td][align=center]稀释剂对照组菌回收率 （%）[/align][/td][td][align=center]试验组回收率（%）[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]枯草芽孢杆菌ATCC6633[/align][/td][td][align=center]95.6[/align][/td][td][align=center]59.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]金黄色葡萄球菌ATCC6538[/align][/td][td][align=center]97.2[/align][/td][td][align=center]83.3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]铜绿假单胞菌ATCC9027[/align][/td][td][align=center]97.4[/align][/td][td][align=center]90.6[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]白色念球菌 ATCC10231[/align][/td][td][align=center]96.9[/align][/td][td][align=center]94.8[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]黑曲霉菌ATCC16404[/align][/td][td][align=center]96.2[/align][/td][td][align=center]78.8[/align][/td][/tr][/table][align=center]表7 微生物在SDA培养基上的生长结果[/align][table][tr][td][align=center]微生物名称及编号[/align][/td][td][align=center]稀释剂对照组菌回收率 （%）[/align][/td][td][align=center]试验组回收率（%）[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]白色念球菌ATCC10231[/align][/td][td][align=center]98.3[/align][/td][td][align=center]95.6[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]黑曲霉菌ATCC16404[/align][/td][td][align=center]96.3[/align][/td][td][align=center]80.9[/align][/td][/tr][/table][b]3.2.1稀释剂对照组的菌回收率[/b]总需氧菌的稀释剂对照组中，5种挑战菌在TSA培养基上生长的回收率95.6%-97.4%.2种挑战菌在SDA培养基上生长的回收率在96.3%-98.3%,均符合50-200%的接受标准,说明稀释剂不存在毒性,不会影响菌的生长.[b]3.2.2试验组的菌回收率[/b]试验组(加样)实验平行三次,在人生皂苷C-K样品存在的情况下,铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌、黑曲霉5种挑战菌在TSA培养基上生长回收率为59.5%-94.8%，符合50-200%的接受标准.2种挑战菌在SDA培养基上生长的回收率在80.9%-95.6%,均符合50-200%的接受标准.[b]3.3大肠埃希菌检测方法验证的合格标准[/b]阴性对照均可以检测出，样品及阴性对照均未检测出.[b]3.4小结[/b]总需氧菌、霉菌及酵母菌数检测方法的合格标准,人参皂苷C-K总需氧菌，霉菌及酵母菌用直接法通过验证.总需氧菌及酵母菌计数结果乘以20倍，作为报告结果.

对照品甘草苷 后面出杂峰 是怎么回事[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808221432219383_6429_3461163_3.jpeg[/img]

我是做中药检验的，以前用的对照品溶液都经0.45滤膜过滤后使用，还做过某两种对照品溶液的测试，峰面积差异不大。但最近我使用黄芩苷对照品时发现检品含量总是很高，反复测试才找到原因，过滤后对照品的峰面积为：3249725.000，没过滤的对照品峰面积为：4933873.000，差异很大，不知道各位朋友使用对照品溶液时是否也经过0.45滤膜过滤？有没有文件规定对照品溶液能否过滤？