宝藿苷淫羊藿次苷对照

以薄层扫描法测定淫羊藿苷含量时，常用的薄层展开剂为醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水系统。如：胡润淮等建立薄层扫描法测定复方仙灵脾注射液中淫羊藿苷含量的方法。采用CS-9301 型双波长薄层扫描仪(岛津)。薄层层析条件：硅胶GF254板；展开剂：醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)。薄层扫描条件：采用反射法单波长锯齿扫描法，狭缝为1.2mm×1.2mm，线性参数SX =7，扫描宽度为14mm，测定波长为λs=272nm。供试品溶液的制备：用移液管吸取复方仙灵脾注射液5ml，置分液漏斗中，先用0.1mol/LNaOH饱和过的正丁醇萃取3次(10,15,20ml)，弃去碱液，合并正丁醇层，再用正丁醇饱和过的0.1mol/LNaOH溶液洗涤3 次(15,20,20ml)，弃去碱液，合并正丁醇层,置水浴上蒸干，残渣以水7ml 溶解，置于已处理好的大孔吸附树脂层析柱(1cm ×10cm) 上，依次用蒸馏水、20%乙醇、70%乙醇进行洗脱,洗脱液体积均为100ml ，流速为5ml/min。收集70%乙醇洗脱液，回收乙醇后，置于浴上蒸干，残渣用少量甲醇溶解，移至5ml 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

【作者中文名】谢香菊; 杨清林; 王贤英; 赵健权;【文献出处】重庆中草药研究, 【摘要】中国中药杂志2009,34(15):1984-1985目的:建立HPLC测定参仙片中淫羊藿苷的含量。方法:采用Diamonsil C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相乙腈-水(35:65),流速1.0mL.min-1,检测波长270nm

中国药典方法测淫羊藿含量，对照品出峰，但是供试品没有峰，供试品处理了几个样都没有峰，是为什么？

性状及微性状鉴别 对同一品种不同产地的淫羊藿干燥叶分别进行３次取样并观察。将样品表面清理干净，选取所需部位备用，在叶片基部徒手制作主脉的横剖面。将叶片与主脉横剖面分别放置于拍摄台上，使用单反相机和微距镜头，并结合景深扩展技术，收集实验样品同一位置、不同景深影像数据（每个位置３０～５０张图片），再使用Ｈｅｌｉｃｏｎ Ｆｏｃｕｓ Ｐｒｏ７.７.０专业版聚焦堆叠软件得到高清全息彩色图像数据。 显微鉴别 表皮制片　取完整叶片参照２０２０年版《中国药典》四部通则２００１显微鉴别法，采取定位取材、徒手切片法获取观察切片，于显微镜下观察，并用相机收集图像数据。 横切面制片　分别选取淫羊藿叶片的上、中、下３部分，用剪刀分割成小块，于酒精乙酸福尔马林混合液（ＦＡＡ）固定液中固定４８ｈ后漂洗，体积分数１％番红（体积分数５０％乙醇配制）染色，乙醇和二甲苯进行脱水透化，经二甲苯溶液透明后浸蜡包埋；蜡块用纯水浸泡后切片，郝氏粘贴剂贴片，５０℃下保存２ｄ，用二甲苯进行脱蜡处理；体积分数０.５％固绿染液（体积分数９５％乙醇配制）染色，中性树胶封片。分别置于显微镜下，采用正常光明场和偏振光暗场对比观察法，并收集图像数据。 粉末制片　样品粉碎过筛，参照２０２０年版《中国药典》四部通则２００１显微鉴别法制片，于显微镜下观察，并收集显微图像数据。 样品测量　将样品置于显微物镜下，用相机收集清晰的完整叶片图像，利用ＩｍａｇｅＪ的角度测量工具测量叶边缘刺的角度；选取叶上表皮细胞制片，用目镜测微尺测量叶上表皮细胞波状深度占比（上表皮细胞边缘两波峰中间点至波谷的距离，除以两波峰中间点经过波谷延伸至另一边细胞边缘的距离）；选取有乳突的淫羊藿叶下表皮制片，用相机收集清晰的显微图片，利用Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ截取像素大小相同的区域，将图片导入ＩｍａｇｅＪ，调整阈值，去除背景后，利用Ａｎａｌｙｚｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ插件自动分析，得到乳突密度（淫羊藿叶下表皮单位面积内乳突面积／淫羊藿叶下表皮单位面积×１００％）；以上数据，不同品种均随机选取测量２０次。

目前，[b]我国是植物提取物的第一原料供应大国，也是植物提取物应用大国[/b]，据中国海关数据显示，2019年，我国植物提取物行业出口额达23.72亿美元（美国是最大的进口市场），进口额达8.49亿美元（美国、印尼和印度是前三进口市场）。在全球“禁抗、限抗”大背景下，国内外对可饲用植物提取物的需求日益增长，对于其产品和相应检测标准的需求也日益强烈。因为[b]没有统一的相关标准[/b]，这就严重影响了其生产效率以及资源浪费，对从事可饲用植物提取物的生产、加工以及进出口贸易的相关企业造成了极大的困扰。因此必须尽快制定颁布并实施可饲用植物提取物的相关标准并实现标准的国际化，确保在国际贸易中有据可依，提高我国可饲用天然植物提取物在国际上的竞争力。[b]2024年3月15日，国家标准《饲料添加剂淫羊藿提取物中黄酮醇苷的测定 高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法》 正式发布[/b]。该标准由TC76（全国饲料工业标准化技术委员会）归口 ，主管部门为国家标准化管理委员会。主要起草单位为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 、中国医学科学院药用植物研究所 、天津博菲德科技有限公司 、湖南农业大学 、北京爱绿生物科技有限公司 、中国农业科学院饲料研究所。[来源：仪器信息网] 未经授权不得转载[align=right][/align]

[size=15px][color=#595959]研究[b]淫羊藿苷（ICA）[/b]对[b]白细胞介素-1β（IL-1β）[/b]诱导的[b]骨关节炎（OA）[/b]的影响及其可能的作用机制。[/color][/size] [size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][size=16px][/size][/color][/size][size=15px][color=#595959]用ICA预处理SW1353[b]软骨细胞[/b]2h，然后用IL-1β。使用实时[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]和Western blot分析测定基质金属蛋白酶（MMP-3）和II型胶原的表达水平。通过Western blot分析，根据ULK1、Beclin-1、LC3-II/I和p62的表达水平确定[b]自噬[/b]激活（通过ICA）或抑制（通过shRNA）。使用Western blot分析检测PI3K、Akt、mTOR和ULK1的磷酸化水平。[/color][/size][size=15px][color=#595959][size=16px][/size][/color][/size] [align=center] [/align] [size=15px][color=#595959]IL-1β增加MMP-3的过度生成，诱导II型胶原降解，并降低自噬相关蛋白的水平，包括ULK1、Beclin-1和LC3-II/I。与之相反，ICA预处理减弱了IL-1β诱导的MMP-3过度生成，增加了II型胶原的表达，并诱导了自噬相关蛋白的表达。ICA还降低PI3K、Akt和mTOR磷酸化，增加ULK1的生成，并诱导自噬。shRNA介导的ULK1敲除导致PI3K/Akt/mTOR通路的激活，从而逆转ICA的保护作用。[/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size] [b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][/b][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][/color][/size][size=15px][color=#595959][size=16px][/size][/color][/size][b][size=15px][color=#595959]ICA可通过调节PI3K/AKT/mTOR/ULK1信号通路诱导自噬。这项研究表明ICA可能对治疗OA有效[/color][/size][/b][size=15px][color=#595959]。[/color][/size]

样品萃取：称取均匀粉碎的样品约0．5g，加入1 mL水，1 mL丙酮，在快速混匀器上混匀1 min，超声波萃取2min，离心，吸取上清液于10 mL试管中，重复提取两次，合并上清液，40℃浓缩至少于1 mL。固相萃取净化：ASPEC XL全自动固相萃取仪，C18非极性柱。柱预处理：3 mL 40％(体积分数)甲醇。样品过柱：1 mL上述浓缩样品过柱，收集过柱液体。目标物洗脱：2 mL40％(体积分数)甲醇，2 mL丙酮／正己烷(1：9，体积比)，收集过柱液体。浓缩定容：合并收集液体，4℃浓缩至近干，正己烷定容至1mL。GC-ECD分析：HP 5.0弹性石英毛细管柱，高纯氮气为载气，流速1．5mL／min，高纯氮气40 mL／min尾吹，进样口温度250，检测器温度300℃，不分流方式，进样量1μL，外标法定量。柱升温程序：初始温度100℃，以20℃／min升至160℃后，保持2 min，以10℃／min升至250℃，保持6 min。该方法对添加六六六及滴滴涕异构体的淫羊藿进行萃取，3次平均回收率在92．16％～100．59％，RSD0.5％～3．7％。该方法被用于淫羊藿等6种药用植物的实际检测，杞中拟除虫菊酯类农药残留的基质固相分散萃取。取干燥枸杞，粉碎，过60目筛。称取0．50 g于研钵中，加入1.00 g弗罗里石睾土，研磨30 min。层析柱白下而上依次填入少量脱脂棉、2．00 g无水硫酸钠、枸杞一弗罗里硅土混合物、3．00 g无水硫酸钠，轻轻敲实。用30 mL 20％醋酸乙酯一石油醚混合溶剂淋洗层析柱，收集淋洗液，浓缩至近干，用正己烷定容到1mL，过0．45μm滤膜，待气相色谱测定。对添加甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯的样品进行萃取，回收率达80％以上。来源：中国标准物质网

我是新手,今天做淫羊藿甙,从别的地方借的标准品,用甲醇溶解并稀释.在270nm甲醇：水(24:76)为流动相的条件下，走了半小时都没有色谱峰出现，是不是我的标准品出了问题？？还是其他原因？？请求帮助

淫羊藿为小檗科植物，主要功效为补肾阳，强筋骨，祛风湿。因此，淫羊藿甙在补肾壮阳的保健食品中常是主要的功能因子。关于淫羊藿甙的测定，保健食品方面尚无检验方法，药典对其甙类的检测是薄层色谱法，需铺板，试样萃取，减压蒸馏浓缩，最后用分光光度法测定，既繁琐误差又大。所以本文利用高效液相色谱法对保健食品中淫羊藿甙的测定进行了研究。1　材料与方法1.1　仪器：　Shimadzu LC-6A高效液相色谱系统；SPD-6AV紫外检测器；C-R2A数据处理系统；C18柱（4.6 mm×200 nm, 5u），CSF-3A超声波发生器。1.2　试剂：　 标准溶液：精密称取淫羊藿甙标准品5.0 mg，用甲醇(优级纯)溶解并定容为10.0 mL，此溶液浓度为0.5 mg/mL。该溶液用甲醇稀释5倍，即为0.1 mg/mL的标准使用液。2　仪器条件 流动相：甲醇+水（55+45）；流速0.8 mL/min；检测波长270 nm,0.02AUFS。柱温40℃，流动相过0.45 nm滤膜。3　测定方法3.1　试样处理［6］：取粉碎的固体试样4.0 g，加入70%乙醇40 mL，超声30 min后过滤。用少量70%乙醇洗涤残渣，收集滤液，定容至50 mL，为试样处理液。3.2　测定：取上述试样处理液1 mL，用70%乙醇稀释至5 mL，过0.45μm滤膜，进样5μL，在上述仪器条件下分析，测定峰面积。　　取标准使用液5μL，在同一色谱条件下分析，以相对保留时间定性，峰面积定量。3.3　计算x=(h1×C×V×5×100)/(h2×m)　　x试样中淫羊藿甙的含量，mg/100 g；h1试样峰高或峰面积；C标准溶液浓度，mg/mL；V试样定容体积，mL；h2标准溶液峰高或峰面积；m试样量，g。

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[font=宋体][size=15px]淫羊藿苷[/size][/font][size=15px][font=宋体]（[/font][font=&]Icariin[/font][font=宋体]，[/font][font=&]ICA[/font][font=宋体]）[/font][font=宋体]是传统中药淫羊藿的主要活性成分，在体内会被代谢为淫羊藿素（[/font][font=&]Icaritin[/font][font=宋体]，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]）发挥作用。[/font][font=&]2022[/font][font=宋体]年，以[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]为主要成分的[/font][font=&]Icaritin[/font][font=宋体]胶囊获得[/font][font=&]NMPA[/font][font=宋体]批准用于晚期无法手术的肝细胞癌的一线治疗。[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]不仅通过诱导细胞凋亡和自噬直接作用杀死肿瘤，而且调节肿瘤免疫微环境，促进抗肿瘤免疫应答。然而，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]调节[/font][font=&]TME[i][/i][/font][font=宋体]的具体机制，特别是在尿路上皮癌中，尚不完全清楚。[/font][font=&][/font][/size] [size=15px][font=宋体]淫羊藿素（[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]）通过减少肿瘤微环境中[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]（中性粒细胞胞外诱捕网）的形成和中性粒细胞浸润来预防尿路上皮癌转移。[/font][b][font=宋体]机制上，在中性粒细胞中，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]结合并抑制[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化。此外，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制[/font][font=&]ROS[/font][font=宋体]的产生，抑制[/font][font=&]MAPK[/font][font=宋体]信号通路，抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]诱导的肿瘤转移。同时，在肿瘤细胞中，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制肿瘤[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]诱导的组蛋白瓜氨酸化，从而降低[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]转录，[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]表达的下调通过[/font][font=&] JAK2/STAT3/IL-6 [/font][font=宋体]轴形成调节反馈回路并限制中性粒细胞募集。[/font][/b][font=&][/font][/size] [size=15px][b][font=&]1[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]在体外抑制尿路上皮癌细胞的恶性生物学行为[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]为阐明[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]对肿瘤的调控机制，[/font][b][font=宋体]作者通过体外实验（[/font][font=&]CCK8[/font][font=宋体]、集落形成、流式细胞术、划痕和[/font][font=&]Transwel[/font][font=宋体]等）评估了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]对恶性生物学特性的抑制作用[/font][/b][font=宋体]。结果显示[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]显著抑制多种尿路上皮癌细胞系的细胞活力，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，诱导细胞周期停滞。这些体外研究结果证明了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]作为抗肿瘤药物的潜力[/font][/size] [align=center][img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img][/align][align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]2[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制体内中性粒细胞浸润来抑制肿瘤转移[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]进一步作者研究了[/font][b][font=&]ICT[/font][font=宋体]对尿路上皮癌的体内抗肿瘤功效[/font][/b][font=宋体]。通过皮下肿瘤模型发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制肿瘤增长，增强细胞毒性[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞和[/font][font=&]M1[/font][font=宋体]型巨噬细胞的浸润，促进抗肿瘤免疫效应分子的分泌，显著抑制中性粒细胞浸润。尾静脉肺转移试验显示，[/font][b][font=&]ICT[/font][font=宋体]在体内显著抑制肿瘤转移，而在中性粒细胞耗竭后，这种对转移的抑制作用减弱。[/font][/b][font=宋体]此外，在[/font][font=&]CD4[/font][font=宋体]或[/font][font=&]CD8 T[/font][font=宋体]细胞单独耗竭后，对肿瘤转移的抑制仍然存在。结果表明[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]调节肿瘤免疫微环境中的中性粒细胞，从而通过抑制中性粒细胞浸润来增强抗肿瘤免疫。[/font][font=&][/font][/size] [align=center][img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' 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I[/font][font=宋体]（一种[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]降解剂）与[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]表现出协同作用。体内实验进一步证实了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]对[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成的抑制作用。接着作者检查了共培养后肿瘤的[/font][font=&]EMT[/font][font=宋体]表型，发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]不仅能抑制中性粒细胞浸润，还能有效抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成，从而抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]介导的肿瘤[/font][font=&]EMT[/font][font=宋体]和干性。[/font][font=&][/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]4[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT [/font][font=宋体]通过靶向[/font][font=&] PADI2 [/font][font=宋体]和抑制自杀性[/font][font=&] NETosis [/font][font=宋体]来抑制[/font][font=&] NET [/font][font=宋体]的形成[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][b][font=宋体]为了研究[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成的机制，作者分离[/font][font=&]CD45CD11b[/font][font=宋体]中性粒细胞，用[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]处理，并进行[/font][font=&]RNA-seq[/font][font=宋体]分析。功能富集分析表明，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]调节了与[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成和趋化因子信号传导相关的通路，差异基因表达分析显示[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达显著降低[/font][/b][font=宋体]，[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]是一种与组蛋白瓜氨酸化和[/font][font=&] NET[/font][font=宋体]形成相关的基因。分子对接实验表明，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]可以在六个潜在位点与[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]结合。相关性分析表明[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达与中性粒细胞浸润有关。[/font][font=&]GSVA[/font][font=宋体]分析揭示[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达与[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]相关基因表达之间的相关性，从而得出了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]介导的[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成调控可能与[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]相关的假设，并通过一系列实验证实[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]通过抑制自杀性[/font][font=&]NETosis[/font][font=宋体]和[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化来抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]的形成。[/font][font=&][/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]5[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化和[/font][font=&]IL-6/JAK2/STAT3[/font][font=宋体]信号传导的正反馈回路来抑制中性粒细胞浸润[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]先前的研究表明，[/font][b][font=&]ICT[/font][font=宋体]不仅可以抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]的形成，还可以抑制中性粒细胞浸润。作者进一步剖析[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制中性粒细胞浸润的机制，发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]处理后与中性粒细胞募集相关的几种细胞因子下调，功能富集分析表明这种抑制可能与[/font][font=&]JAK/STAT[/font][font=宋体]信号通路有关。[/font][/b][font=宋体]体外中性粒细胞[/font][font=&]-[/font][font=宋体]肿瘤共培养系统发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]处理后招募到下腔室的中性粒细胞数量减少，[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]和[/font][font=&]IL-8[/font][font=宋体]的转录在不同肿瘤细胞系中受到抑制。鉴于[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化可以增强[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]的转录，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]与[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]抑制剂[/font][font=&]AFM32a[/font][font=宋体]的组合用于进一步的机制探索，发现[/font][font=&]ICT [/font][font=宋体]同样抑制肿瘤内[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]的表达，并且抑制[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达导致肿瘤细胞内组蛋白瓜氨酸化减少，导致[/font][font=&] IL-6 [/font][font=宋体]转录的下游减少并阻碍中性粒细胞募集。[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]水平降低可进一步抑制[/font][font=&]JAK2/STAT3[/font][font=宋体]信号通路，从而破坏[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]的正转录反馈回路。[/font][font=&][/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]6[/font][font=宋体]、[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的[/font][font=&]NETs[i][/i][/font][font=宋体]对尿路上皮癌具有预后价值[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][b][font=宋体]为了验证[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]是尿路上皮癌的预后生物标志物，作者收集了尿路上皮癌患者的组织和血液样本进行相关性分析。[/font][/b][font=宋体]结果显示[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]标志物[/font][font=&]CD66b[/font][font=宋体]和[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]标志物[/font][font=&]H3CIT[/font][font=宋体]的联合分析显示，两种标志物高表达的患者预后最差，且中性粒细胞浸润与化疗耐药性相关。肌层浸润性膀胱癌[/font][font=宋体]患者的[/font][font=&]MPO-DNA[/font][font=宋体]水平高于非肌层浸润性膀胱癌患者[/font][font=宋体]，且手术后血浆[/font][font=&] MPO-DNA [/font][font=宋体]升高的患者往往会复发。这些结果强调了中性粒细胞[/font][font=&]NE[/font][font=宋体]相关成分在预测尿路上皮癌复发和进展方面的潜力。[/font][font=&][/font][/size] [align=center][img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img][/align] [size=15px][b][font=&]7[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]与抗[/font][font=&]PD-1[/font][font=宋体]免疫疗法协同作用，以抵消[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]诱导的[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞耗竭[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]既往研究证实，[/font][b][font=宋体]中性粒细胞和[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]可以抑制肿瘤微环境中[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞的抗肿瘤功能，诱导[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞耗竭，导致免疫逃逸。[/font][/b][font=宋体]因此，作者分析了肿瘤中中性粒细胞、[/font][font=&]NETs[/font][font=宋体]和[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞耗竭之间的关系。相关性分析显示，肿瘤中中性粒细胞浸润和[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]与[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞浸润增加有关。然而，

[size=14px] [/size] [size=14px]黑色素合成是一个复杂过程，由三种主要的色素合成酶催化：酪氨酸酶（TYR）、TYR相关蛋白1（TYRP1）和多巴胺互变异构酶（DCT）。TYR、TYRP1和DCT属于TYR蛋白家族（TYRs）。成熟的TYRs在胞内被转运定位于黑色素体中，进而促进合成黑色素。虽然这三种酶都参与黑色素合成，但只有TYR是黑色素生成所必需的。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]淫羊藿中一种含量高、低性毒的黄酮类成分——朝藿定B（EB），并初步证明了EB是一种黑色素生成强诱导剂和TYRs激活剂。然而，尚不清楚EB促进黑色素合成的具体机制。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]1）首次对EB在色素合成药理活性进行了探究；[/size] [size=14px]2）通过体内外多种色素脱失模型上评估EB色素合成作用；[/size] [size=14px]3）EB从表达、活性和稳定性三方面靶向TYRs，从而发挥色素合成作用。[/size] [size=14px]1、EB促进黑色素产生[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]作者首先使用高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]（HPLC）对淫羊藿提取物进行鉴定，朝藿定B（EB）是主要生物活性成分，对黑素生成和TYR激活表现出最高的效果。随后通过不同浓度（25、50和100μM）的EB处理两种黑色素瘤细胞系并检测黑色素含量，IBMX为阳参，发现EB以剂量依赖性方式显著增加细胞内黑色素含量（图1）。[/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px]图1 EB以浓度依赖方式促进黑色素产生[/size] [size=14px]进一步在不同时间点（0、12、24、48和72小时）检查黑色素含量，发现EB以时间依赖性方式诱导的黑色素生成（图2）。[/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px]图2 EB以时间依赖方式促进黑色素产生[/size] [size=14px]2、EB促进黑素体生物合成[/size] [size=14px]接着收集并检查了人体皮肤组织样本进一步验证 EB的促黑色素生成作用，发现EB在原代黑素细胞、人类皮肤器官培养物中诱导显著的黑色素生成作用。黑色素在黑素体中合成并储存，然后分布到周围的角质形成细胞，黑素体的数量、大小和成熟阶段反映了黑素细胞的黑色素生成能力。作者发现EB 治疗组中存在比对照组更多的黑素体，此外EB通过增加黑素体数量并促进黑素体成熟来刺激黑色素生物合成。接着对EB处理和未处理的人类原代黑素细胞进行了转录组分析，差异基因显著富集在“黑色素生物合成过程”、“黑素体/黑素体膜”等，这些数据证实了 EB 在黑色素生物合成和黑素体形成中的调节作用（图3）。[/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px]图3 EB增加黑色素体的数量和成熟促进黑色素合成[/size] [size=14px]3、EB增加TYR表达[/size] [size=14px]为了阐明EB诱导黑素生成的机制，作者研究了TYR的参与，发现EB诱导的TYR在mRNA和蛋白质水平上的双重正向调节。MITF是众所周知的TYR关键调节因子，也是黑素生成的主要调节因子。作者发现EB刺激后MITF的mRNA和蛋白表达水平显著上调，表明EB通过经典的 MITF 依赖性机制上调黑素生成中TYR的表达。此外，EB可以影响转运相关基因的mRNA表达，特别是OCA2和SLC45A2，表明EB在黑素体生物发生和成熟中调节复杂的过程，这可能解释黑素体增加的变化黑素体中黑色素的数量和含量（图4）。[/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px]图4 EB增加TYR表达[/size] [size=14px]黑色素的产生是由多种信号系统启动和调节的，作者接着研究了EB对黑素生成的上游信号通路的影响，发现cAMP水平和PKA表达不受EB影响，表明经典的cAMP-PKA-MITF色素沉着途径不参与EB诱导的黑素生成。相比之下，PI3K/AKT 信号通路的级联，以及MAPK途径受到影响。这些数据证明EB 控制多种色素途径来影响黑色素的产生（图5）。[/size] [size=14px]图片[/size][size=14px]图5 EB影响多条信号通路[/size] [size=14px]4、EB促进TYR活性[/size] [size=14px]在黑色素合成中，TYR是催化限速步骤（L-酪氨酸羟基化为L-多巴）的关键酶。作者接着研究了EB对TYR催化活性的影响，发现EB体外可以加速TYR与底物左旋多巴的反应速率，在细胞内以剂量依赖性方式显著增强TYR活性。进一步在斑马鱼和小鼠中开发了两种使用TYR抑制剂的脱色模型，确定了EB可以作为TYR激活剂并在体内发挥重新色素沉着作用。此外，在HQ引起的色素脱失模型中， EB有效地重新激活了皮肤TYR活性。数据表明EB通过在体外和体内促进TYR活性来发挥色素沉着作用（图6）。[/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px]图6 EB促进TYR活性来发挥色素沉着作用[/size] [size=14px]5、EB对抗莫诺苯宗诱导的色素脱失[/size] [size=14px]莫诺苯宗是一种临床局部脱色剂，可以通过TYR和黑素体降解机制诱导白癜风样色素脱失。因此，作者使用单苯宗来研究EB是否发挥再色素作用并影响TYR和黑素体异常降解，发现EB 显著改善了两种黑色素瘤细胞和人类原代黑素细胞中单苯宗诱导的黑色素生成功能障碍，EB治疗可有效防止培养皮肤组织中单苯宗诱导的TYR和黑素体减少。此外，经单苯宗处理后，TYR、TYRP1、DCT和Melan-A的蛋白表达降低，而在用单苯宗和EB共同处理期间，TYR和Melan-A的表达显著上调。值得注意的是，单苯酮诱导的黑素生成抑制和TYR表达减少并不依赖于TYR活性抑制或MITF、TYR、TYRP1和DCT mRNA 表达水平的下降（图7）。[/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px]图7 EB对抗莫诺苯宗诱导的色素脱失[/size] [size=14px]6、EB提高TYR和TYRP1稳定性[/size] [size=14px]莫诺苯宗会导致TYR降解，但不影响TYR转录水平。为了研究EB是否对TYR稳定性有影响，作者使用CHX抑制蛋白质合成，以排除EB本身，诱导新的合成TYR。WB发现莫诺苯宗显著降低了TYRs的稳定性，而EB处理可以有效防止这种情况，这表明EB改善了莫诺苯宗诱导的TYRs稳定性。进一步机制研究发现EB通过防止莫诺苯宗诱导的异常 TYR、TYRP1 形成、在内质网中的保留以及泛素-蛋白酶体降解系统的增强来提高 TYR、TYRP1 稳定性（图8）。[/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px]图8 EB提高TYR和TYRP1稳定性[/size] [size=14px]7、EB 改善小鼠单苯酮诱导的色素脱失[/size] [size=14px]最后，作者建立了40%莫诺苯宗诱导的色素脱失模型，并同时用EB处理小鼠，探讨EB是否对单苯酮处理的小鼠体内具有再色素沉着功能，结果发现用单苯酮和EB共同治疗的小鼠在不同程度上明显改善了脱色的背毛形成，此外，单苯宗对皮肤TYR活性具有抑制作用，而与EB联合治疗可以促进皮肤TYR活性，此外，TYR、TYRP1、DCT和PMEL的mRNA水平被证实不受单苯宗影响，强调单苯宗诱导的脱色与转录调控无关。同时，EB增加了皮肤TYR、TYRP1、DCT和PMEL的mRNA表达。因此，EB可以改善经单苯酮处理的C57BL/6小鼠的TYR降解和色素脱失（图9）。[/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px]图9 EB改善小鼠单苯酮诱导的色素脱失[/size] [size=14px]总结[/size] [size=14px]研究发现EB在体内外表现出良好的色素合成效果，其机制研究为：1）EB通过调节GSK3β/β-catenin、p-p70S6激酶、MAPK等信号通路增加TYR的表达，并增加黑素体数量和促进黑素体成熟；2）EB促进TYR的活性；3）EB抑制泛素-蛋白酶体途径增强TYR和TYRP1的稳定性。这表明EB可靶向TYRs发挥色素合成作用（图10）。[/size]

[size=14px] [/size] [size=14px]肝纤维化（LF）在慢性肝病发展为肝硬化的过程中发挥着至关重要的作用，抑制肝星状细胞（HSC）活化被认为是预防LF的有效途径。七叶甙是一种羟基香豆素，它通常存在于许多药用植物中，包括七叶树、菊苣、白蜡树的树皮中，具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗菌特性。已有研究报道七叶苷在肝脏疾病治疗中的潜力。然而，目前尚无关于使用七叶苷治疗肝纤维化的研究。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]1、七叶苷改善CCl4所致小鼠肝损伤[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]采用腹腔注射CCl4诱导C57BL/6J小鼠LF模型，发现与对照小鼠相比，CCL4诱导的小鼠体重明显减轻，而经Esculin和SMT（水飞蓟宾葡甲胺片，阳性对照）处理的小鼠体重减轻明显改善，且小鼠的肝脏沉积和肝脏系数明显降低。此外，Esculin干预后均表现出剂量依赖性改善血清AST、ALT等血清标志物，说明Esculin可以改善CCL4诱导小鼠肝损伤。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]2、七叶苷改善CCl4所致小鼠肝纤维化[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]接着作者评估了七叶苷对CCl4所致小鼠肝纤维化的影响，发现用Esculin治疗后纤维化标志物（血清HA，PC III和LN）水平呈剂量依赖性下降。此外，肝组织病理分析显示七叶苷治疗可改善肝组织炎症和脂质空泡化，减少胶原和纤维沉积，降低α-SMA和胶原I的表达。这些研究结果表明，七叶苷可以改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]3、七叶苷对 CCl4 处理小鼠炎症和氧化应激诱导的铁死亡的影响[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]研究表明，氧化应激和炎症因子是肝损伤发展的主要致病机制，且肝纤维化与铁代谢紊乱和脂质过氧化物积累密切相关。作者发现Esculin治疗显著降低炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的水平并改善MDA和SOD的水平。此外，模型组在造模后肝脏中Fe2+水平显著升高，而Esculin处理后下降。免疫荧光显示CCl4诱导后肝组织中Nrf2和GPX4的表达显著降低，而七叶苷治疗增加了肝细胞中Nrf2和GPX4的表达。结果表明Esculin通过激活Nrf2/GPX4信号通路，抑制肝脏铁死亡，发挥抗氧化和抗炎作用。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]4、七叶苷抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞活化[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]为了研究Esculin对HSC活化的影响，使用TGF-β1诱导LX-2细胞活化，并用不同浓度的Esculin处理。发现Esculin干预后，LX-2细胞形态恢复到更正常的状态，细胞增殖速率下降。此外，免疫荧光染色、WB、[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]显示Esculin处理导致α-SMA和胶原蛋白I的表达呈剂量依赖性降低，结果表明Esculin具有抑制HSC活化的能力。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图4 七叶苷抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞活化[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]5、七叶苷通过激活Nrf2-GPX4通路抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞铁死亡[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]GPX4是参与铁死亡的重要靶基因，受Nrf2信号通路调控，在肝脏疾病的发生发展中起重要作用。作者发现Esculin处理后，Nrf2、HO-1、NQO-1和GPX4的水平呈剂量依赖性增加，免疫荧光染色结果显示Esculin促进Nrf2易位进入细胞核，激活Nrf2/GPX4通路，导致GPX4表达增强，抑制铁死亡。结果表明Esculin激活LX-2细胞中的Nrf2/GPX4信号通路。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图5 七叶苷通过激活Nrf2-GPX4通路抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞铁死亡[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]6、七叶苷抑制 LX-2 细胞活化的作用取决于Nrf2介导的铁死亡[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]为了验证Nrf2/GPX4信号通路是否是Esculin抑制HSCs活化的关键通路，作者使用Nrf2抑制剂（ML385）抑制LX-2细胞中Nrf2的转录，发现加入ML385后，Esculin组的LX-2细胞迅速扩增和增殖，添加七叶苷组的α-SMA和胶原蛋白I在添加ML385后显著升高，表明ML385可以减弱Esculin对HSC活化的抑制作用。此外，添加ML385后，Nrf2和GPX4在LX-2细胞中的表达水平显著降低，最后，分子对接、DARTS、CETSA结果显示Esculin与Nrf2之稳定结合。结果表明Esculin可以靶向Nrf2/GPX4信号通路，抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞活化。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]图6 七叶苷抑制 LX-2 细胞活化的作用取决于 Nrf2 介导的铁死亡[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]总结[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]该研究利用CCl 4诱导的肝纤维化小鼠模型和TGF-β1诱导的LX-2细胞模型，证明七叶苷是一种潜在的治疗肝纤维化的天然活性成分，可以抑制肝星状细胞（HSC）的活化，改善肝纤维化，机制实验证明七叶苷的治疗作用是由于其能够激活Nrf2/GPX4信号通路，抑制肝铁死亡。[/size]

肝癌是全球第3大癌症死亡原因，其中肝细胞癌约占所有肝癌类型的80%[1]。据世界卫生组织统计，每年因肝细胞癌死亡的人数高达83万例，且其发病率和死亡率仍呈现上升趋势，严重损害人类生命健康[2]。在慢性肝病的基础上，基因突变、表观遗传变化、信号通路失调和血管生成异常等分子机制相互作用，共同推动慢性肝病向肝细胞癌过程的发展[3]。目前肝细胞癌治疗的一线药物主要是索拉菲尼、仑伐替尼等靶向药及阿替利珠单抗、贝伐珠单抗等免疫治疗药物[4]。然而，靶向药及免疫治疗药的耐药性和不良反应导致肝细胞癌的5年生存率仍然不高。因此，亟需寻找安全性高、不良反应少的治疗药物，为肝细胞癌患者提供更有效、安全的治疗选择。 近年来，随着对肝细胞癌研究的不断深入，自噬在肝细胞癌中的作用逐渐被关注。在肝细胞癌的发展过程中，自噬一方面通过维持细胞内稳态来抑制肿瘤起始，另一方面通过影响信号通路的效应因子来抑制早期肝细胞癌的进程[5]。自噬受到多种机制的严格调控和影响，涉及自噬的几条重要信号通路有Wnt/β-catenin、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p53通路等[6]，这些通路在肝细胞癌中异常激活，参与肝癌细胞的增殖、凋亡和自噬等生物学行为。研究表明，mTOR通路在自噬调控机制中发挥至关重要的作用[7]，mTOR是自噬的负性调控因子，可以与UNC-51样激酶1（Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1）的丝氨酸结合抑制自噬的启动过程，也可以通过磷酸化使自噬调节复合物失活影响自噬小体的发生，磷酸化自噬相关蛋白14（autophagy-related protein 14，Atg14）、自噬和Beclin-1调节器1（activating molecule in beclin-1 regulated autophagy protein 1，AMBRA1）和核受体结合因子2（nuclear receptor binding factor 2，NRBF2）直接调节自噬的成核步骤[8]。因此，针对自噬及其机制开展治疗可能是肝细胞癌的有效对抗策略。 地榆为蔷薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.的干燥根，具有凉血止血、解毒敛疮的功效。地榆皂苷II是从地榆中提取的一种三萜皂苷类化合物，现代药理学研究发现，地榆皂苷II不仅具有抗炎、抗氧化、免疫调节的药理作用，同时具有广泛的抗肿瘤活性[9-11]，能通过多种途径抑制多种癌症的发生和发展，其机制可能与阻滞细胞周期、促进细胞凋亡和细胞自噬有关[12-15]。课题组前期研究发现，地榆皂苷II能够抑制小鼠肝细胞癌的发展[15]。然而，地榆皂苷II是否能通过影响Akt/mTOR通路诱导凋亡和自噬抑制肝细胞癌尚不明确。本研究中选择人肝癌HepG2细胞和小鼠肝癌Hepa1-6细胞作为研究对象，探究地榆皂苷II对肝癌细胞增殖、自噬和凋亡的影响，探讨地榆皂苷II在抗肝细胞癌方面的潜在作用机制，为将来用于临床治疗提供数据支持。 1 材料 1.1 细胞 HepG2细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所，Hepa1-6细胞购自上海富衡生物科技有限公司。 1.2 药品与试剂 地榆皂苷II（批号MUST-11051204，质量分数≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；PVDF膜（批号IPVH00010）购自美国Sigma公司；青霉素-链霉素（批号S11JV）购自上海源培生物科技股份有限公司；DMEM培养基（批号C11995500BT）、胎牛血清（批号A3160801）购自美国Gibco公司；PBS（批号WHB823K091）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；0.25%胰酶消化液（批号C0203）、RIPA组织/细胞裂解液（批号P0013C）、蛋白酶抑制剂混合物（批号P1050-1）、磷酸酶抑制剂混合物（批号P1050-2）、EdU-555细胞增殖检测试剂盒（批号C0075S）购自上海碧云天生物技术有限公司；CCK-8试剂盒（批号A311-02）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号E112-01）、高敏型ECL化学发光检测试剂盒（批号E412-01）、相对分子质量为1.8×105的蛋白marker（批号MP-102AA）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；一抗稀释液（批号G2025）、二抗稀释液（批号G2009）、高相对分子质量marker（批号26625）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；7.5% PAGE凝胶快速制备试剂盒（批号PG111）、10% PAGE凝胶快速制备试剂盒（批号PG112）、12.5% PAGE凝胶快速制备试剂盒（批号PG113）购自上海雅酶生物医药科技有限公司；β-actin、Beclin1抗体（批号分别为20536-1-AP、11306-1-AP）购自美国Proteintech公司；B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、p62抗体（批号分别为ab196495、ab56416）购自英国Abcam公司；Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、Caspase-8、cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR抗体（批号分别为5023T、9662S、4790T、9664T、4685S、4060T、2972S、5536T）购自美国CST公司；甲醇（批号10014118）购自国药集团化学试剂有限公司；山羊抗兔二抗（批号RS0002）购自美国ImmunoWay公司；Annexin V-FITC染色液（批号E-CK-A211）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。 1.3 仪器 AL104型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；HH-S型恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；CKX53型倒置生物显微镜、IX73倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；3111型CO2培养箱、Multiskan Go-1510型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Centrifuge 5424R型微量离心机（德国Eppendorf公司）；SDS PAGE凝胶电泳及转膜电泳仪（美国Bio-Rad公司）；BETS-M5型转移微型翘板摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；XH-C型涡旋混合器（金坛市医疗仪器厂）；MINI-4K型微型离心机（杭州米欧仪器有限公司）；5200型全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）；CytoFLEX流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）；ThermoCell恒温金属浴（杭州博日科技股份有限公司）。 2 方法 2.1 CCK-8实验 将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于96孔板中，贴壁生长24 h，设置对照组、不同剂量地榆皂苷II组，对照组仅加入培养基，其余各组分别加入5、10、15、20、30、40、60、80、100 μmol/L相应药物，继续培养24 h，用CCK-8试剂盒测定各组吸光度（A）值，计算细胞存活率。 细胞存活率＝(A实验－A空白)/(A对照－A空白) 2.2 EdU实验 将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于96孔板中，贴壁生长24 h，设置对照组和地榆皂苷II（10、20、40 μmol/L）组，给药组给予相应药物，对照组仅加入培养基，继续培养24 h。将EdU稀释到2×EdU工作液（20 μmol/L），预热后等体积加入96孔板中，孵育细胞2 h后去除培养液，加入100 μL固定液（4%多聚甲醛），孵育10 min后去除固定液，用100 μL洗涤液洗涤细胞3次后每孔加入100 μL通透液（含0.3% Triton X-100的PBS），室温孵育15 min。去除通透液，每孔用1 mL洗涤液洗涤细胞2次，每次5 min。参考说明书配制Click反应液。每孔加入50 μL Click反应液，轻轻摇晃培养板后室温避光孵育30 min。洗涤液洗涤3次，吸除洗涤液后，每孔加Hoechst 33342溶液100 μL，室温避光孵育10 min。用洗涤液洗涤3次，每次3～5 min，随后进行荧光检测。 2.3 细胞凋亡检测 将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于6孔板中，贴壁生长24 h，设置对照组和地榆皂苷II（10、20、40 μmol/L）组，给药组给予相应药物，对照组仅加入培养基，继续培养24 h。用胰酶消化细胞，300×g离心5 min，弃上清，收集细胞，PBS洗涤，轻轻重悬细胞，300×g离心5 min，弃上清。用PBS洗涤细胞，离心后弃上清，加入Annexin V Binding Buffer重悬细胞。细胞悬液中加入Annexin V-FITC Reagent和5 μL的碘化丙啶（PI），轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15～20 min，立即上机检测。 2.4 Western blotting检测相关蛋白表达 将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于6孔板中，贴壁生长24 h，设置对照组和地榆皂苷II（10、20、40 μmol/L）组，给药组给予相应药物，对照组仅加入培养基，继续培养24 h。加入RIPA中强度缓冲液裂解后收集细胞，使用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。蛋白样品经凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂奶粉，封闭1.5 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜；洗膜3次后加入二抗，4 ℃孵育1.5 h；最后使用ECL化学发光检测试剂盒，用化学发光图像分析系统显影。 2.5 统计学分析 采用GraphPad Prism 9统计软件对实验数据进统计学分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。 3 结果 3.1 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞增殖的影响 如图1所示，与对照组比较，随着地榆皂苷II浓度的升高，HepG2和Hepa1-6肝癌细胞的存活率明显降低，且呈剂量相关性。经GraphPad Prism 9软件分析，地榆皂苷II对HepG2、Hepa1-6细胞的IC50值分别为26.94、26.18 μmol/L，因此以10、20、40 μmol/L作为后续地榆皂苷II的给药剂量。 图片 3.2 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞增殖的影响 EdU-555阳性表示细胞正处于增殖状态，Hoechst33342阳性指示细胞为活细胞，EdU-555/Hoechst33342表示细胞的增殖率。如图2所示，与对照组比较，地榆皂苷II给药后HepG2和Hepa1-6细胞的EdU-555/Hoechst33342值明显降低（P＜0.05、0.001），表明地榆皂苷II能够抑制肝癌细胞的增殖。 图片 3.3 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞凋亡的影响 如图3所示，与对照组比较，地榆皂苷II给药组HepG2和Hepa1-6细胞凋亡率显著升高（P＜0.01、0.001）。凋亡蛋白（包括调控凋亡的激活因子和执行凋亡的效应因子）参与细胞凋亡的过程。采用Western blotting检测地榆皂苷II对HepG2细胞和Hepa1-6细胞凋亡相关蛋白表达的影响，如图4所示，与对照组比较，地榆皂苷II给药组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2蛋白表达量显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达量显著升高（P＜0.05、0.01）。以上结果说明地榆皂苷II促进HepG2和Hepa1-6细胞的凋亡。 图片 图片 3.4 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞自噬的影响 采用Western blotting检测细胞中代表自噬的核心蛋白LC3II、LC3Ⅰ、Beclin1、p62表达量，如图5所示，与对照组比较，地榆皂苷II给药组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值明显升高（P＜0.05、0.01、0.001），Beclin1蛋白表达量上升（P＜0.05、0.01），p62蛋白表达量明显下降（P＜0.05、0.01），表明地榆皂苷II促进HepG2和Hepa1-6肝癌细胞的自噬。 图片 3.5 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6细胞中Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响 采用Western blotting检测地榆皂苷II给药后Akt/mTOR信号通路蛋白表达量，如图6所示，与对照组比较，地榆皂苷II给药组p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR值明显下降（P＜0.05、0.01、0.001），表明地榆皂苷II能够抑制Akt/mTOR信号通路。 图片 4 讨论 肝细胞癌具有高发病率、高病死率的特点，虽然目前肝细胞癌研究备受关注，但其5年生存率仍为14.1%[16]。因此，迫切需要发现新的治疗策略和候选药物。近年来，地榆皂苷II在抗肿瘤方面的研究不断深入，研究发现地榆皂苷II抑制肿瘤与细胞自噬和凋亡存在紧密的关联，地榆皂苷II可通过诱导细胞凋亡来显著抑制乳腺癌MDA-MB-435细胞和胃癌BGC-823细胞的增殖[14-15]，诱导自噬显著抑制结直肠癌细胞增殖[17]。课题组既往研究证明，地榆皂苷II可在体内抑制肝细胞癌，其机制可能与抑制表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号通路有关[15]。然而，目前关于地榆皂苷II是否通过自噬和凋亡抑制肝细胞癌及其机制尚不明确。因此，本研究利用体外实验对地榆皂苷II刺激后肝癌细胞的增殖、自噬、凋亡及相关机制进行探究，结果表明，地榆皂苷II能抑制肝癌细胞的增殖，促进肝癌细胞的凋亡和自噬，其机制与抑制Akt/mTOR通路有关。 自噬又被称为II型程序性死亡，负责真核生物细胞质中细胞器、蛋白质和大分子的降解和回收。细胞中降解和回收的底物被吞噬后形成自噬体，自噬体与溶酶体结合形成自噬酶体最后降解。本研究检测了自噬中具有代表性的LC3、p62和Beclin1蛋白。Beclin1蛋白是一种自噬启动子，帮助自噬过程中囊泡的形成[18]，地榆皂苷II作用于肝癌细胞后，Beclin1蛋白表达量上升，促进自噬启动，囊泡形成增多，从而自噬水平升高。在自噬形成时，LC3I通过泛素激活酶E1和泛素结合酶E2与磷脂酰乙醇胺偶联，生成LC3II，LC3II存在于自噬体的表面，负责膜的融合和选择性降解过程[19]，p62在自噬体表面与LC3II相互作用后包裹进自噬体降解，与LC3II共同调节选择性降解过程[20]。地榆皂苷II给药后LC3II/LC3I值增高，p62蛋白表达量下降，促进自噬过程中自噬囊泡的融合和降解，进而促进自噬。Beclin1是自噬过程中的核心因子，已有研究证明Beclin1可以与抗凋亡因子Bcl-2相互作用，从而对凋亡过程产生影响[21]。细胞凋亡是一种生理性或病理性的程序性的死亡过程，近年来通过诱导促进癌细胞的凋亡来控制癌症一直是抗肿瘤的热点。Caspase级联反应是细胞凋亡过程的关键步骤，其启动受到抗凋亡因子和促凋亡因子Bcl-2和Bax的调节。在Caspase级联反应中，启动性Caspase包括Caspase-8、Caspase-9被激活后调控下游执行性Caspase如Caspase-3进而引起凋亡反应[22-24]。地榆皂苷II作用于肝癌细胞后，细胞中的Bcl-2蛋白表达量减少，Bax蛋白表达量增多，Bax蛋白在线粒体表面形成孔道，释放细胞色素C，引发Caspase级联反应，Caspase-8、Caspase-9激活进而诱导下游的Caspase-3活化为cleaved Caspase-3，切割下游多种底物，促进细胞凋亡典型形态变化。 Akt/mTOR信号通路在正常细胞生理过程中发挥关键作用，同时在多种癌症中，该通路的异常激活对自噬、细胞凋亡、化疗耐药性及转移过程产生重要影响[25]。诸多研究证据表明，Akt/mTOR途径是调控癌症细胞自噬反应的核心通路[26-28]。地榆皂苷II作用于肝癌细胞后，Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平显著下降，Akt/mTOR信号通路被抑制，激活肝癌细胞凋亡和自噬，抑制肝癌细胞的增殖（图7，由Figdraw绘制）。 图片 上述体外研究结果初步解析了地榆皂苷II抑制肝细胞癌的机制，即地榆皂苷II通过抑制Akt/mTOR信号通路诱导肝癌细胞的凋亡和自噬，抑制肝癌细胞增殖，为地榆皂苷II在肝细胞癌治疗的药物研究开发中提供了药理学证据。

这两天做淫羊藿药材的含量测定，新配的对照品连续进样的一二针峰面积相差一倍多，第三针和第二针又差不多，上午也是这样的情况，经过柱子的冲洗后下午进样依然是这样的规律，并且上下午的第二针峰面积都差不多，实在不明白是怎么回事，请教各位了

[size=15px][font=宋体]结直肠癌（[/font][font=&]Colorectal Cancer[/font][font=宋体]，[/font][font=&]CRC[/font][font=宋体]）是全球常见的恶性肿瘤，术后复发转移已成为结直肠癌患者死亡的主要原因，特别是结直肠癌肝转移（[/font][font=Georgia, &][color=#333333]CRLM[/color][/font][font=宋体]）。因此，迫切需要深入研究[/font][font=Georgia, &][color=#333333]CRLM[/color][/font][font=宋体]的病理和分子机制。原发性肿瘤细胞与远端器官中的免疫细胞或基质细胞之间的信息传递是转移前微环境（[/font][font=&]PMN[/font][font=宋体]）形成的关键因素，了解这一机制对于制定有效的肿瘤转移治疗策略至关重要。[/font][font=&][/font][/size][size=15px][font=宋体]细胞外囊泡（[/font][font=&]EV[/font][font=宋体]）作为各种细胞分泌的功能实体，富含蛋白质、核酸、脂质和其他分子，促进肿瘤细胞和基质细胞之间的重要通讯。越来越多的报道表明，肿瘤衍生的[/font][font=&]EV[/font][font=宋体]（[/font][font=&]TEV[/font][font=宋体]）有助于[/font][font=&]PMN[/font][color=#333333]和[/color][font=Georgia, &][color=#333333]CRLM[/color][/font][font=宋体]的形成，为转移器官中循环肿瘤细胞的增殖提供必需肿瘤微环境（[/font][font=&]TME[/font][font=宋体]）。作者推测[/font][font=&]circRNA[/font][font=宋体]富集的[/font][font=&]TEVs[/font][font=宋体]介导[/font][font=&]PMN[/font][font=宋体]的形成，并且靶向[/font][font=&]circRNA[/font][font=宋体]富集的[/font][font=&]TEVs[/font][font=宋体]可能是针对[/font][font=&]PMN[/font][font=宋体]形成和[/font][font=&]CRLM [/font][font=宋体]的有效治疗策略。[/font][/size][size=15px][font=宋体]肿瘤细胞分泌的富含[/font][font=&]circ-0034880[/font][font=宋体]的细胞外囊泡通过增强[/font][font=&] SPP1[sup]high[/sup]CD206[sup] +[/sup][/font][font=宋体]促肿瘤巨噬细胞的活化来促进结直肠癌肝转移。重要的是，研究确定人参皂苷[/font][font=&]Rb1[/font][font=宋体]是一种潜在的治疗剂，通过直接靶向[/font][font=&]QKI [/font][font=宋体]蛋白，从而减少[/font][font=&]circ-0034880[/font][font=宋体]的生物合成并抑制[/font][font=&]SPP1[sup]high[/sup]CD206[sup] +[/sup][/font][font=宋体]促肿瘤巨噬细胞的活化，最终抑制结直肠癌肝转移。研究从调控[/font][font=&]TME[/font][font=宋体]的角度，特别是抑制[/font][font=&]circ-0034880[/font][font=宋体]的生物合成和细胞外囊泡的生成，首次揭示了人参皂苷[/font][font=&]Rb1[/font][font=宋体]在肿瘤防治领域的特殊作用，为今后的临床药物转化奠定了坚实的基础。 [size=15px][b]1、富含Circ-0034880的血浆EV与CRLM相关[/b][/size][font=宋体]基于细胞外囊泡在肿瘤转移中的重要作用，作[/font][font=宋体]者首先人类血液外泌体数据库、GSE159669数据集，以及临床血浆细胞外囊泡样本发现[/font][size=15px]一个环状RNA circ-0034880在结直肠癌肝转移患者中具有更高的表达水平，表明该环状RNA与结直肠癌的肝转移密切相关[/size] [size=15px][b]2、富含Circ-0034880的TEV在体内促进CRLM[/b][/size][size=15px]为了进一步研究circ-0034880富集的TEVs对CRC肝转移的体内影响，作者通过体内示踪实验发现了肿瘤细胞MC38来源的EVs在肝中高度积累。体内注射肿瘤细胞MC38来源的EVs可以促进肝转移，而缺失circ-0034880的EVs却丧失其促肝转移的作用，结果表明EVs依赖于其携带的circ-0034880发挥作用[/size] [size=15px][b]3、Circ-0034880富集的TEV激活肝脏转移前微环境中的CD206+促肿瘤巨噬细胞[/b][/size][size=15px]为了全面评估circ-0034880富集的TEV对肝脏转移前微环境的影响，研究人员对小鼠持续进行TEV注射和肿瘤细胞注射，建立了一个肝转移小鼠模型，多重免疫荧光分析显示TEV处理促进CD206 +促肿瘤巨噬细胞在转移前肝脏中的显著浸润，且circ-0034880表达水平与CD206 +促肿瘤TAM浸润之间存在正相关性 [/size][size=15px][/size][size=15px][b]4、Circ-0034880富集的TEV通过激活CD206 +促肿瘤巨噬细胞促进CRC细胞迁移[/b][/size][size=15px]由于有多项报道显示活化的巨噬细胞对CRC细胞迁移有促进作用，作者进一步研究利用示踪实验发现TEV可以携带circ-0034880被巨噬细胞所吸收。此外，功能实验表明富含circ-0034880 的TEV可以促进CD206+促肿瘤巨噬细胞的活化，并且携带circ-0034880的TEV的巨噬细胞上清会显著促进肿瘤细胞的迁移 [/size][size=15px][b]5、Circ-0034880富集的TEV促进SPP1[sup]high[/sup]CD206 +促肿瘤巨噬细胞的激活[/b][/size][size=15px]为了探究携带circ-0034880的TEV对CD206+促肿瘤巨噬细胞的激活机制，研究人员对TEV处理的巨噬细胞进行了转录组数据分析，进一步通过体外基因和蛋白检测和体内IF实验验证了巨噬细胞中SPP1是其调控的靶点，这些发现表明circ-0034880富集的TEV促进了SPP1[sup]high[/sup] CD206 +促肿瘤巨噬细胞的激活。鉴于已知circRNA可作为miRNA海绵发挥作用，作者分析了circ-0034880靶向的miRNA和SPP1结合的miRNA，发现了有2个miRNA重叠：miR-200a-3p和miR-141-3p。结合实验证明这两个miRNA可结合circ-0034880和SPP1，表明 circ-0034880和SPP1竞争结合miRNA，使SPP1不被miRNA所抑制。SPP1是巨噬细胞活化的关键蛋白，因此，研究结果表明TEV释放的circ-0034880通过保护SPP1免受miR-200a-3p和miR-141-3p介导的降解来提高巨噬细胞中SPP1的表达，促进SPP1[sup]high[/sup]巨噬细胞亚群增加 [/size][size=15px][b]6、人参皂苷Rb1给药可通过阻止富含circ-0034880的TEVs介导SPP1[sup]high[/sup]CD206+促肿瘤巨噬细胞的激活来阻止CRC细胞迁移[/b][/size][size=15px]鉴于circ-0034880的重要作用，下调其表达可以作为抑制癌症肝转移的策略，于是作者对103种天然药物进行了筛选，发现4种天然产物（人参皂苷Rb1、异鼠李素、山奈酚和槲皮素）对该circ-0034880的抑制作用最强，其中人参皂苷Rb1具有更强抑制作用。同样人参皂苷Rb1预处理的肿瘤细胞来源的TEV，其作用于巨噬细胞后下游的SPP1的蛋白表达造成下调作用，后续对结直肠癌细胞迁移能力下降，效果类似于沉默circ-0034880。总之，研究结果表明人参皂苷Rb1给药可通过抑制富含circ-0034880的TEV介导的SPP1[sup]high[/sup] CD206+促肿瘤巨噬细胞的激活来阻止CRC细胞迁移 [/size][size=15px][b]7、人参皂苷Rb1直接与QKI蛋白结合，抑制circ-0034880的生物合成[/b][/size][size=15px]为了确定影响circ-0034880表达的Rb1的直接靶点，作者进行了DARTS实验筛选出151种差异表达蛋白，其中一个蛋白QKI被报道与调控前mRNA剪接和促进circRNA生物合成。研究者接下来采用CETSA分析来验证了QKI和Rb1的结合，证实了Rb1能够显著增加QKI的热稳定性。进一步采用SPR分析验证了Rb1与QKI之间的很强的结合亲和力，通过分子对接预测了结合模式。此外，敲低QKI能够显著抑制该circRNA的表达。研究结果表明Rb1直接与QKI蛋白结合，抑制circ-0034880的生物合成[/size] [size=15px][/size][size=15px][b]8、[/b][/size][size=15px][b]人参皂苷[/b][/size][size=15px][b]Rb1给药通过阻止circ-0034880富集的TEV介导SPP1[sup]high[/sup]CD206+促肿瘤TAM的激活来抑制CRLM[/b][/size][size=15px]最后，作者验证了Rb1 给药的[i]体内[/i]效果，发现与单独使用TEV相比，使用Rb1预处理的TEV给药组的肝转移显著减少，与直接沉默circ-0034880的效果非常相似。然而，在沉默circ-0034880的情况下，使用Rb1预处理的TEV给药对肝转移的影响很小。接下来，作者探讨了Rb1对肝转移中CD206+促肿瘤TAM浸润的影响，发现在Rb1预处理的TEVs给药组中，SPP1表达显著下调，类似于直接沉默circ-0034880的效果。然而，在沉默circ-0034880的前提下，相应肝转移中的SPP1表达受到Rb1预处理的TEVs给药的影响最小。总之，体内功能实验证明Rb1预处理的肿瘤细胞来源的TEV失去了促进癌症肝转移的作用[/size][/font][/size]