甲基化的神经氨酸甲基

近日，中国科学院大连化学物理研究所生物分离分析新材料与新技术研究组研究员叶明亮团队和上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心研究员刘聪团队合作，将硼酸化学引入到甲基化蛋白质组分析方法中，并巧妙利用精氨酸残基上不同修饰基团的位阻差异，实现高效的精氨酸二甲基化肽段富集，显著提高了蛋白质甲基化的分析能力；利用此新方法，系统分析了蛋白质分相过程中精氨酸二甲基化的变化，揭示了此类修饰的发生会降低蛋白质的分相能力。　　蛋白质精氨酸甲基化是一种调控蛋白质功能的重要翻译后修饰，与较多疾病的发生发展相关。研究表明，精氨酸二甲基化会影响一些神经退行性疾病相关蛋白的液-液相分离，以及相分离所驱动的无膜细胞器的产生。然而，受限于目前精氨酸二甲基化蛋白质组分析技术覆盖率不足，这类研究仅聚焦于少数几个蛋白，尚未系统性探究精氨酸甲基化对蛋白质相分离的影响。　　本研究发现，不同甲基化修饰的精氨酸残基在与邻二酮类化合物反应时，由于位阻不同，反应活性差异巨大。合作团队据此设计了一种精氨酸二甲基化肽段的富集方法：先利用环己二酮选择性的封闭无修饰精氨酸残基，随后利用丙酮醛选择性的在二甲基化精氨酸残基上修饰顺式邻二羟基，从而使得硼酸材料可以选择性的富集精氨酸二甲基化肽段。相比传统的免疫亲和富集方法，该方法拥有较强的精氨酸二甲基化肽段富集能力，特别是在鉴定RG/RGG序列上的精氨酸二甲基化位点方面有更高的灵敏度。合作团队将该方法应用于分析蛋白质相分离过程中精氨酸甲基化的变化，发现包括G3BP1，FUS，hnRNPA1、KHDRBS1在内的一些与无膜细胞器或神经退行性疾病相关的蛋白质上的精氨酸二甲基化程度发生了显著变化；系列实验验证发现，精氨酸甲基化会显著降低这些蛋白质的分相能力，且上述蛋白质组分析中鉴定到变化的甲基化位点是调控蛋白质相分离的关键因素。本工作开发了基于化学反应的精氨酸二甲基化蛋白质组分析方法，并利用这一方法揭示了精氨酸二甲基化对蛋白质液-液相分离具有重要的调控作用。　　叶明亮团队致力于蛋白质磷酸化、糖基化、甲基化等翻译后修饰分析新方法的研究，发展了基于可逆酶促化学标记的O-GlcNAc糖肽无痕富集方法，克服了标记基团对糖肽质谱检测的干扰，实现了O-GlcNAc糖基化的高灵敏分析（Angew. Chem. Int. Edit.）；利用不同糖肽的同一肽段骨架具有相似碎裂规律的特点，发展出基于“模式识别”的肽段序列鉴定新方法，实现了谱图拓展，显著提高了N-链接位点特异性糖型的鉴定灵敏度，并可发现未知的糖链及糖链修饰（Nat. Commun.）。　　相关研究成果以Global profiling of arginine dimethylation in regulating protein phase separation by a steric effect-based chemical-enrichment method为题，发表在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、大连化物所创新基金等的支持。

中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究员黄超兰受邀在蛋白质组学国际期刊Expert Review of Proteomics上发表综述文章。黄超兰与博士彭超(该文第一作者)撰述的The Story of Protein Arginine Methylation: Characterization, Regulation, and Function 于1月5日在线发表在此杂志上。该论文系统地介绍了鉴定不同类型的精氨酸甲基化的技术方法及其发展历程，并对精氨酸甲基化不同类型的writers和erasers的最新进展、生物学功能以及与疾病的紧密联系进行了系统性的总结和展望。　　精氨酸甲基化(Arginine methylation)是蛋白质后修饰中重要的一种，它参与了基因表达的调节、DNA的修复等重要的生命过程，与肿瘤、心血管疾病、病毒感染和自身免疫性疾病等多种疾病密切相关 甲基化水平异常的蛋白质可以作为潜在的生物标志物或药物研究靶点。该综述能使读者加深对精氨酸甲基化蛋白质、后修饰位点、表达水平以及其调控机制的了解，有利于人们进一步探索其在生命过程中的作用，特别是与疾病发生的关系，加快相关药物靶点的研究进程。　　黄超兰研究组一直致力于质谱和基于质谱的蛋白质组学应用于蛋白质研究的难题技术研发，相关技术已经帮助广大科学家解决了众多的科学难题，大力促进了科学研究的发展。该项工作得到了中科院引进杰出技术人才、关键技术人才和国家基金委自然科学基金青年项目等的资助。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，mNeuCode Empowers Targeted Proteome Analysis of Arginine Dimethylation1，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的李灵军教授和国家蛋白质科学中心的常乘、贾辰熙教授。　　蛋白质精氨酸甲基化是一种广泛存在于真核生物中且相对保守的翻译后修饰，参与包括RNA加工、DNA修复、染色体组织、蛋白质折叠和基因表达在内的多种生物学过程。蛋白质精氨酸二甲基化在生物过程和人类疾病中发挥着重要作用，但与此同时，精氨酸二甲基化的相对丰度和化学计量通常很低，并且表现出较宽的动态变化范围，这些问题都给分析带来了巨大的挑战。在这篇文章中，作者设计了一种用于二甲基精氨酸代谢标记的mNeuCode标签，并开发了一个名为NeuCodeFinder的软件工具，用于在MS全扫描中筛选NeuCode信号，从而能够在蛋白质组范围内对蛋白质二甲基化进行靶向LC-MS/MS分析。作者将该方法应用到HeLa细胞精氨酸二甲基化的全蛋白质组分析中，证实了该方法的有效性：在70种蛋白质上鉴定到176个精氨酸二甲基化位点，其中38%是新位点。　　图1 用于细胞培养代谢标记的mNeuCode的化学设计。含有由稳定同位素标记的甲硫氨酸和精氨酸的不同组合的mNeuCode-I(红色)和mNeuCode-II(蓝色)分别用于两组细胞培养。同位素标记的甲硫氨酸经过代谢转化为甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet ),随后由蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)催化转移到精氨酸侧链的甲基上。细胞裂解后，将两种样品混合并制备用于高分辨率LC-MS分析。含有二甲基精氨酸的肽的NeuCode同源物被解析后，将显示出43 mDa的质量差异并作为诊断峰。　　图2 基于mNeuCode的精氨酸二甲基化靶向蛋白质组分析。(A)NeuCodeFinder从高分辨率质谱数据中筛选NeuCode同位素峰对的工作流程。从原始数据文件中提取全扫描质谱。单峰被配对以形成NeuCode等值线簇。最终的NeuCode对列表与提取的离子色谱(XIC)值一起导出。(B)靶向LC-MS/MS分析的工作流程，包括样品制备、富集以及MS1和MS2分析。　　在mNeuCode-I标记组中，使用含有正常L-精氨酸和同位素标记L-蛋氨酸[D3]的培养基 在mNeuCode-Ⅱ标记组中，则使用同位素标记的L-精氨酸[15N4]和L-甲硫氨酸[13C]进行培养(图1)。收集两组全细胞蛋白提取物并等量混合，蛋白经还原烷基化与酶切后，得到的肽段通过StageTip分级分离和HILIC tip富集，以提高样品肽段的识别率。处理的样品先进行LC-MS全扫描，通过作者的自制软件NeuCodeFinder生成包含列表，此包含列表用于辅助进一步的平行反应监测(PRM)模式分析(图2)。　　　　图3 已鉴定的精氨酸甲基化位点的生物信息学分析。(A)鉴定的精氨酸二甲基化位点和(B)精氨酸二甲基化蛋白质。橙色柱表示未报道的精氨酸二甲基化位点或蛋白质。绿色柱表示只有单甲基化是已知的，但是二甲基化还没有报道。(C)韦恩图显示，通过使用胰蛋白酶和镜像胰蛋白酶作为消化试剂，从两组实验中鉴定的精氨酸二甲基化位点。(D)蛋白质上位点数目的分布。每个蛋白质上精氨酸二甲基化位点的数量显示在饼图周围，蛋白质的数量列在饼图中。鉴定的精氨酸-二甲基化蛋白质的(E) GO富集和(F)KEGG途径分析。(G)使用STRING数据库将二甲基化蛋白质映射到蛋白质相互作用网络上。综合得分 0.4。(H)已鉴定的精氨酸二甲基化位点中-6和+6氨基酸残基的序列标志。　　通过对数据结果的分析，最终共鉴定到70种蛋白质上的176个精氨酸二甲基化位点，其中37-38%的精氨酸二甲基化位点是新的修饰位点，29%的精氨酸二甲基化蛋白没有被报道过，这证明了mNeuCode方法的有效性。与常规的鸟枪法蛋白质组学策略所获得的数据相比，mNeuCode方法在鉴定低丰度精氨酸二甲基化肽方面具有独特的优势，并且能够补充许多传统鸟枪法蛋白质组学所无法鉴定到的精氨酸二甲基化位点。对mNeuCode方法鉴定到的精氨酸二甲基化蛋白进行生物信息学分析后，发现这些蛋白质主要与RNA的加工、剪接和稳定性相关，参与了RNA的代谢过程。　　图4 FAM98A上精氨酸二甲基化位点的突变抑制了细胞迁移。(A)通过蛋白质印迹检测FAM98A在HeLa细胞中敲除和重建的效果。用siFAM98A-1和siFAM98-2沉默HeLa细胞，然后用Flag标记的WT或突变的FAM98A质粒重建。Anti-FAM98A显示内源性FAM98A的干扰。Anti-Flag显示外源FAM98A的重建。(B)图像和(C)柱状图显示了HeLa细胞的细胞迁移。　　FAM98A是一种微管相关蛋白，与结直肠癌和非小细胞肺癌的增殖有关。有研究者发现FAM98A是PRMT1的底物，但未能确定确切的甲基化位点。而在作者的研究结果中，成功鉴定到FAM98A上五个新的精氨酸二甲基化位点。为了验证这些二甲基化位点是否参与细胞迁移的调节，作者使用FAM98A敲除和FAM98A WT或突变重建细胞系进行了伤口愈合试验。将HeLa细胞的FAM98A基因敲除后，分别用WT或突变的flag-FAM98A重建FAM98A沉默细胞，其中突变的flag-FAM98A将二甲基化位点R351、R360、R363、R371和R375突变为赖氨酸以抑制甲基化。实验结果显示，当FAM98A基因被敲除时，细胞的迁移能力受到抑制，WT FAM98A的重建挽救了FAM98A敲除导致的细胞迁移缺陷，但是突变型FAM98A的重建却不能挽救。该结果证实了FAM98A上的二甲基化位点在细胞迁移中起到的作用。　　总之，在这篇文章中作者发明了一种mNeuCode方法，并开发了NeuCodeFinder软件，使得能够以全蛋白质组的方式进行精氨酸二甲基化的靶向MS/MS分析。实验结果证明了mNeuCode技术对于精氨酸二甲基化的靶向蛋白质组分析的能力和有效性，并证实HeLa细胞FAM98A上新的精氨酸二甲基化位点在细胞迁移调节中的功能，有助于更好地理解癌症发展的潜在机制，为蛋白质组分析的方法学提供了新的思路。　　撰稿：梁梓欣　　编辑：李惠琳　　文章引用：mNeuCode Empowers Targeted Proteome Analysis of Arginine Dimethylation　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　Wang, Q., Yan, X., Fu, B., Xu, Y., Li, L., Chang, C., & Jia, C. (2023). mNeuCode Empowers Targeted Proteome Analysis of Arginine Dimethylation. Analytical chemistry

蛋白质精氨酸甲基化修饰是一类由精氨酸甲基转移酶（Arginine methyltransferases, PRMTs）介导的翻译后修饰作用。PRMTs不仅能够通过甲基化修饰组蛋白上特定位点的精氨酸来调控下游靶基因的转录活性，还参与修饰了多种非组蛋白类作用底物，以此来影响RNA剪接、蛋白质翻译、细胞周期等一系列细胞生物学行为。近年来，越来越多的证据表明蛋白质精氨酸甲基化水平的失调与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。因此，PRMTs作为潜在的肿瘤治疗靶点，逐渐引起了全球科学家的关注。2021年11月19日，威斯康星大学麦迪逊分校医学院许伟教授团队在Nucleic Acid Research上发表题为BAF155 methylation drives metastasis by hijacking super-enhancers and subverting anti-tumor immunity的研究成果。该研究发现，精氨酸甲基化修饰的BAF155蛋白可以通过操纵增强子、破坏机体的抗肿瘤免疫能力，从而促进恶性肿瘤的转移 。BAF155是染色质重组复合物SWI/SNF的重要亚单位之一。2014年，许伟课题组在Cancer Cell发文，首次证实了PRMT4（又称CARM1）能够通过甲基化修饰BAF155蛋白第1064位精氨酸，起到促进三阴性乳腺癌转移的作用【1】。近日，该课题组以基因编辑的乳腺癌细胞系与小鼠模型为基础，结合多组学技术揭示了me-BAF155促进乳腺癌转移的内在分子机制。超级增强子（Super-enhancers, SEs）是基因组中大量增强子富集的转录调控区域。在转录过程中，通过富集多种转录因子和辅因子（BRD4等）来大幅度激活下游靶基因的转录活性。本研究中，作者采用ChIP-seq技术对me-BAF155的基因组结合位点进行全局定位分析，发现me-BAF155和BRD4在SEs处共定位，以此调节关键癌基因的表达水平。CARM1抑制剂（CARM1i）的处理，能够使得me-BAF155和BRD4从SE上解离，减少SE数量，激活干扰素α/γ通路，增强宿主免疫反应，起到抑制肿瘤生长和转移的治疗效果。最后，作者采用VERSA技术分离循环肿瘤细胞，证实me-BAF155在高转移特性的三阴性乳腺癌患者的循环肿瘤细胞中呈稳定、持续的强阳性表达（图1）。该研究首次揭示了me-BAF155在促进恶性肿瘤转移中具有双重作用：通过招募BRD4激活增强子依赖的癌基因转录活性；通过抑制干扰素α/γ通路以削弱宿主免疫反应。尽管CARM1抑制剂具有较低的细胞毒性，但是在体外依然能够显著抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移，在体内显著抑制肿瘤生长和转移。因此，作者提出CARM1抑制剂有望被开发成为单独使用的抗癌药物，或与其他治疗药物（如免疫治疗）联合使用，用于治疗转移性恶性肿瘤。另外，相较于现有的CARM1抑制剂，开发me-BAF155（R1064）靶点特异性的小分子抑制剂，有望产生抑癌效果更好、副作用更少的新型抗肿瘤药物。

DNA甲基化是哺乳动物基因组中最常见的表观遗传事件之一，即DNA中核苷酸与甲基基团的共价修饰[2]。DNA甲基化与人的生命进程有着密不可分的关系。细胞的增殖与分化、染色体完整性的维护或者X染色体的活性等等都离不开DNA甲基化的控制，DNA甲基化流程在胚胎发育中是无处不在的[1]。如果DNA甲基化进程出现异常，会导致生物体出现各种各样的疾病以及身体的生长缺陷或生理紊乱。DNA与蛋白质之间的相互作用如果出现异常，会影响基因的表达，从而引起人体内肿瘤的发生或者肿瘤的转移，这一切的源头都是DNA甲基化进程出现异常的结果[3]。DNA甲基化酶是肿瘤治疗靶点DNA甲基化酶是一种修饰酶，经常与限制性内切酶一同出现。在真核生物基因组以及原核生物基因组中，普遍存在DNA甲基化酶维持以及催化DNA甲基化过程的现象。DNA甲基化酶被广泛认为是一种治疗靶点以及预测生物甲基化过程的标志物，在单细胞水平上准确灵敏地检测DNA甲基化酶对于肿瘤医学上的临床诊断以及临床治疗甚至是生物学研究有着至关重要的作用。根据甲基化的核苷酸和位置被分为三组，即腺嘌呤的甲基化、胞嘧啶的4-N甲基化和胞嘧啶的5-C甲基化。所有已知的DNA甲基化酶在其甲基化过程中以s-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体。最常见的DNA甲基化不仅发生在胞嘧啶嘧啶环5-C位置的CpG位点上，还发生在对称四核苷酸5’-G-A-T-C-3’ 中腺嘌呤环的6-N位置[4,5]。传统DNA甲基化酶检测方法有局限 DNA甲基化酶活性的高灵敏度检测在基因调控、表观遗传修饰、临床诊断和治疗等方面具有重要意义。传统用于检测DNA甲基化酶活性的方法包括高效液相色谱法(HPLC)[6], 聚合酶链反应(PCR)[7]，凝胶电泳[8]，高效毛细管电泳(HPCE)[9]，以及使用同位素标记的s-腺苷甲硫氨酸甲基化检测[10,11]。尽管这些技术在实验室实践中被证明是有用的，但它们具有局限性。例如，大多数技术不仅使用笨重昂贵的设备，而且需要复杂的样品制备和数据分析所需的大量时间。同位素标记等技术是有效的，但它们往往需要费力的样品制备、同位素标记、复杂的设备和大量的DNA，使得它们不适合在医护点使用。所以，DNA甲基化酶活性检测迫切需要简单、便携、高灵敏度和低成本的检测方法。在最近的技术进步中，许多替代的DNA甲基化酶活性测定方法，如放射法、比色法、荧光法、电化学法等已被提出。此外，其中许多与纳米材料或酶结合，以显著提高它们的敏感性。放射法、蛋白质纳米孔等新型检测技术兴起 放射法：同位素标记作为最早检测DNA甲基化酶活性的方法之一，早期广泛应用于检测DNA甲基化酶和DNA甲基化的活性[12,13]。在由DNA甲基化酶催化的甲基化过程中，同位素标记的甲基部分转移到DNA上，从而赋予甲基化的DNA放射性。这种放射性可以很方便地用闪烁计数器或放射自显像仪来检测。可惜的是，放射性试剂的介入是限制这种试验在中央实验室进行的最大缺点。对无辐射DNA甲基化酶活性检测的研究导致了甲基化特异性PCR[14]、HPCE[9]和HPLC等替代品的发展[7,14]，而甲基化特异性PCR被认为是较好的方法。尽管非放射性，上述DNA甲基化酶活性检测需要庞大且通常昂贵的设备，冗长且耗时的样品制备和数据分析，以及繁琐的检测方案，这在临床实践中也比较难以实现全覆盖。比色法：比色法用于DNA甲基化酶活性检测依赖于颜色变化的目视观察或与DNA甲基化酶相关的吸收光谱的光谱测量。它们具有成本低、简单、可移植性和在某些情况下无需仪器的优点。虽然紫外-可见光谱法可以量化DNA，但甲基化和未甲基化DNA在紫外-可见吸收特性上的低灵敏度和不显著差异基本否定了紫外-可见光谱法直接检测DNA甲基化酶活性[15~17]。金纳米粒子：金纳米粒子(AuNPs)由于其表面的等离子体共振吸收的高消光系数且强依赖于粒子间距离，在DNA甲基化酶活性检测的比色法研究中引起了广泛关注。如图1 所示，金纳米粒子表面包覆有双链DNA (ds-DNA)，其中一条链包含DNA甲基化酶识别序列和5’-硫醇末端。在DNA甲基化酶存在的情况下，如图1 B 所示，DNA甲基化酶被共价标记在ds-DNA中碱基环的6-C位置，因为在5-N位置缺乏一个质子阻止了β-消除，甲基化的DNA不能被核酸外切酶 ExoⅠ剪切，因此金纳米粒子仍然均匀地分散在溶液中 [18]。从而实现DNA甲基化酶活性的检测。结果表明，在526 nm处，金纳米粒子聚集物的吸光度与DNA甲基化酶的活性呈2 ~ 32 U / mL的线性关系，检出限为0.5 U/ mL。图1. (A)基于ABP的比色生物传感器的示意图(B) DNA甲基化酶的检测机制 荧光法：荧光指吸收激发荧光团的光，以促进电子从基态到激发态，电子迅速地回到激发态的最低能级，然后当电子最终返回基态时，发出波长较长的光。与其他DNA甲基化酶活性测定法相比，荧光法检测DNA甲基化酶活性的优点是检测过程简单，灵敏度高，但其复杂的光学性能限制了其在集中实验室的应用[19~20]。图2. 基于外切酶的靶循环的DNA甲基化酶活性检测原理图电化学法：电化学生物分析技术的发展一直是现代分析化学研究的热点之一。电化学法用于DNA甲基化酶分析包括测量电流、电压、电荷和电阻等电量，以反映DNA甲基化酶的活性。与许多其他类型的DNA甲基化酶活性的检测相比，它们具有低成本、高灵敏度、执行现场监测的能力以及非常适合微型化和集成微制造技术的优点[22~23]。Zhi-Qiang Gao等人在2014年报道了一种简单、高灵敏度的DNA甲基化酶电化学活性测定方法。该方法采用电催化氧化抗坏血酸(AA)的信号放大手段，通过一个螺纹插层N,N -2(3-丙基咪唑)-1,4,5,8-萘二酰亚胺(PIND)电催化氧化还原Os(bpy)2Cl+ (PIND-Os)，包含5’-CCGG-3’ 对称序列的ds-DNA首先固定在金电极上。然后用DNA甲基化酶孵育电极，经过酶催化特定CpG二核苷酸的甲基化，然后用识别5’-CCGG-3’ 序列的限制性内切酶 Hpa II 剪切酶处理电极，从而实现DNA甲基化酶活性检测的目的[24]。图3. DNA甲基化酶活性的检测原理示意图蛋白质纳米孔：蛋白质纳米孔检测技术是在单分子水平上以低成本、无标签和高通量的方式研究生物分子的检测技术。近年来，纳米孔技术正从生物传感的角度进行研究[25]。应用于核酸特征鉴定、化学反应过程的测量、蛋白质分析、疾病相关蛋白状态的检测以及酶动力学的研究等[26]。α-溶血7素是一种蛋白质纳米孔，它自发地插入到脂质双层膜中，形成一个纳米孔[27]。当一个带电分子在外加电势下通过蛋白质纳米孔时，它会引起离子电流的瞬态变化，电流变化事件被记录下来。被分析物可以通过当前电流发生的频率进行量化，特征电流信号则可以揭示被分析物的各种特征[28~30]。该检测方法不需要对DNA探针进行任何化学修饰，既方便又节约成本，减少了样品消耗。 图4. 用于分析DNA甲基化酶活性的纳米孔试验的示意图 在过去的十几年中，DNA甲基化酶活性的检测取得了重大进展。有几种方法有希望可在临床检测，使得该方法在用于癌症诊断、预后和治疗方面显示出了希望。比色法依赖于颜色变化的目视观察或与DNA甲基化酶相关的吸收光谱的光谱测量，具有成本低、简单、可移植性和在某些情况下无需仪器的优点，但是检出限相对较高。荧光法检测DNA甲基化酶活性的检测过程简单，检出限相对理想，但其复杂的光学性能以及昂贵的仪器设备限制了其在生活中的应用。电化学法由于需要构建较复杂的反应电极材料而使得其在临床上受到了一定的限制。蛋白质纳米孔的检测方法不需要对DNA探针进行任何化学修饰，既方便又节约成本，减少了样品消耗，检出限相对较为理想，并且已经成功应用于人类血清样本。这类检测可能最终为常规DNA甲基化酶活性的检测和分子诊断打开大门，为疾病的管理和诊断带来新的前景。 作者：王家海、骆 乐 作者简介：王家海，博士，教授，硕士生导师/博士生导师，广州大学化学化工学院；分析化学专业；主要研究领域为“基于核算纳米结构为信号传导载体的纳米孔传感器”；在核酸探针和仿生纳米孔两方面开展了一系列分子识别的工作，也为将来进一步开展分析化学研究打下了坚实的基础，期间积累了多种前沿分析方法和技术：仿生纳米孔制备和检测；微纳米加工技术；核酸探针人工合成技术。参 考 文 献 [1] 陈晓娟,闫少春,邵国,等.人DNA甲基化转移酶的分类及其功能[J].包头医学院学报,2014,30(04):136-138.[2] Das PM, et al. DNA methylation and cancer[J]. Clin. Oncol. 2004 22: 4632-4642.[3] Jurkowska RZ, et al. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases[J]. ChemBioChem 2011 12: 206-222.[4] Lee GE, et al. DNA methyltransferase 1-associated protein (dmap1) is a co-repressor that stimulates DNA methylation globally and locally at sites of double strand break repair[J]. Biol. Chem. 2010 285: 37630-37640.[5] Liu SN, et al. Assay Methods of DNA Methylation and Their Applications in Cancer Diagnosis and Therapy[J]. Chinese J.Anal. Chem. 2011 39: 1451-1458.[6] Boye E, et al. Quantification of dam methyltransferase in Escherichia coli[J]. Bacteriol. 1992 174: 1682-1685.[7] Eads CA, et al. CpG island hypermethylation in human colorectal tumors is not associated with DNA methyltransferase overexpression[J]. Cancer Res. 1999 59: 2302-2306.[8] Bergerat A, et al. Allosteric and catalytic binding of s-adenosylmethionine to escherichia coli DNA adenine methyltransferase monitored by 3H NMR[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991 88: 6394-6397.[9] Fraga MF, et al. Rapid quantification of DNA methylation by high performance capillary electrophoresis[J]. Electrophoresis 2000 21: 2990-2994.[10] Yokochi T, et al. DMB (dnmt-magnetic beads) assay: measuring DNA methyltransferase activity in vitro[J]. Methods Mol. Biol. 2004 287: 285-296.[11] Adams RLP, et al. Microassay for DNA methyltransferase[J]. Biochem. Bioph. Methods 1991 22: 19-22.[12] Jurkowska RZ, et al. DNA methyltransferase assays[J]. Methods Mol. Biol. 2011 791: 157-177.[13] Pradhan S, et al. Recombinant human DNA (cytosine-5) methyltransferase [J]. Biol. Chem. 1999 274: 33002-33010.[14] Herman JG, et al. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996 93: 9821-9826.[15] Kattenhorn, L. M. Korbel, G. A. Kessler, B. M. Spooner, E. Ploegh, H. L. Mol. Cell 2005, 19, 547−557.[16] Mosammaparast, N. Shi, Y. Annu. Rev. Biochem. 2010, 79, 155−179.[17] Barglow, K. T. Cravatt, B. F. Angew. Chem., Int. Ed. 2006, 45, 7408−7411.[18] Wu Z, et al. Activity-based DNA-gold nanoparticle probe as colorimetric biosensor for DNA methyltransferase/glycosylase assay[J]. Anal. Chem. 2013 85: 4376-4383.[19] Zhu, C. Wen, Y. Peng, H. Long, Y. He, Y. Huang, Q. Li, D. Fan, C. Anal. Bioanal. Chem. 2011, 399, 3459−3464.[20] Chen, F. Zhao, Y. Analyst 2013, 138, 284−289.[21] Xing XW, et al. Sensitive detection of DNA methyltransferase activity based on exonuclease-mediated target recycling[J]. Anal. Chem. 2014 86: 11269-11274.[22] Wu, H. Liu, S. Jiang, J. Shen, G. Yu, R. Chem. Commun. 2012, 48, 6280−6282[23] Wang, M. Xu, Z. Chen, L. Yin, H. Ai, S. Anal. Chem. 2012, 84, 9072−9078[24] Deng H, et al. Highly sensitive electrochemical methyltransferase activity assay[J]. Anal. Chem. 2014 86: 2117-2123.[25] Howorka, S. Siwy, Z. Nanopore Analytics: Sensing of Single Molecules. Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 2360−2384.[26] Song, L. Hobaugh, M. R. Shustak, C. Cheley, S. Bayley, H. Gouaux, J. E. Structure of Staphylococcal α-Hemolysin, a Heptameric Transmembrane Pore. Science 1996, 274, 1859−1865.[27] Lin, L. Yan, J. Li, J. Small-Molecule Triggered Cascade Enzymatic Catalysis in Hour-Glass Shaped Nanochannel Reactor for Glucose Monitoring. Anal. Chem. 2014, 86, 10546−10551.[28] Li, J. Yan, H. Wang, K. Tan, W. Zhou, X. Anal. Chem. 2007, 79, 1050−1056.[29] Wood, R. J. Maynard-Smith, M. D. Robinson, V. L. Oyston, P. C. F. Titball, R. W. Roach, P. L. PLoS One 2007, 2, e801−e801.[30] Wood, R. J. McKelvie, J. C. Maynard-Smith, M. D. Roach, P. L. Nucleic Acids Res. 2010, 38, e107−e107.[31] Jinghong Li, et al. Nanopore-based, label-free, and real-time monitoring assay for DNA methyltransferase activity and inhibition[J]. Anal. Chem. 2017 89: 13252−13260.

8月8日，国家药监局官网发布医疗器械批准证明文件（准产）待领取信息，文件显示，上海捷诺生物科技有限公司的人ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、S0X17、ZNF671基因甲基化检测试剂盒（荧光PCR法）于8月4日获得批准，注册证编号为20223401036。上海捷诺生物科技有限公司（以下简称“捷诺生物”）隶属于中国医药集团有限公司（以下简称“国药集团”）中国生物技术股份有限公司（以下简称“中国生物”），是中国生物旗下专业研发、生产、销售国内外医疗器械和体外诊断试剂的企业。捷诺生物的医学诊断是中国生物规划发展的重点板块之一，也是领衔中国生物混合所有制改革的第一家，旨在以体制机制创新来促进诊断业务的迅速发展。2019年，捷诺生物完成了国药集团内第一个对国外公司股权收并购项目，启动了海外研发中心建设，进一步加快引进国际先进技术，拓宽国际化布局的进程。捷诺生物定位于IVD领域全球领先技术产业化转化平台，产品集中于传染病病原体的多重检测和肿瘤的分子诊断，主要有宫颈癌甲基化检测试剂盒，呼吸道、脑炎/脑膜炎、肠道、中枢神经系统、优生优育生殖道感染单管多重病原体核酸检测试剂盒等，服务于各大临床医院、疾病预防控制中心、检验检疫局等。2020年捷诺生物针对新冠疫情快速响应，迅速投入研究开发，经过设计、优化和试验，成功研制出新型冠状病毒核酸检测试剂盒，第一批取得了国家药品监督管理局颁发的医疗器械注册证，并通过了欧盟CE认证，被列入世界卫生组织（WHO）应急使用采购清单。同时，捷诺与英国牛津大学合作，共同开发的新冠快速核酸检测试剂盒，已获批进入商务部防疫物资出口白名单。

导读 ：基因调控区的DNA甲基化状态的改变可导致多种癌症的发生。这种表观遗传学改变在生物学上是稳定的，并存在于循环肿瘤DNA（ctDNA）中，使其适合于早期检测和无创动态监测肿瘤负荷。数字PCR技术凭借其较高的灵敏度、精度、准确度以及对抑制剂的耐受度，针对低浓度样本检测时优势显著。文献解读： 法国贝桑松大学医院肿瘤生物学系的研究者在BMC Cancer（IF：3.8）发表了题为The detection of specific hypermethylated WIF1 and NPY genes in circulating DNA by crystal digital PCR&trade is a powerful new tool for colorectal cancer diagnosis and screening的文章。在转移性和II/III期结直肠癌（CRC）患者中，WNT inhibitor因子1（WIF1）和神经肽T（NPY）的甲基化程度较高，作者评估是否可以使用WIF1和NPY的甲基化程度作为一种结直肠癌标志物，该研究建立了一种将亚硫酸氢盐法（bisulfite-将未甲基胞嘧啶转化为尿嘧啶）与数字PCR相结合的方法。 文章相关结果： ▲Bisulfite方法检测甲基化的原理 A、Naica Crystal Miner分析软件给出的 3D点图，用于检测超甲基化WIF1和NPY和参考基因ALB。 B、通过测量在未甲基化DNA的背景下甲基化DNA的系列稀释液获得的标准曲线。为了确定观察到的突变体数量是否显著高于LOB，使用了基于假阳性概率的贝叶斯方法。对于每个结果，通过减去最终的假阳性分区（通过其概率分布加权）来校正阳性分区的数量。当校正后的95％置信区间的下限包括零时，该样本被视为阴性。 3色Naica Crystal Digital PCR检测WIF1和NPY 分别检测了10个来自III期或IV期CRC患者和5个健康个体的血浆样品。来自CRC患者的所有血浆DNA样本的高甲基化WIF1和NPY得分均为阳性，而在健康个体中未检测到高甲基化的WIF1和NPY。通过将WIF1和NPY浓度与ALB参考浓度对比评估，血浆DNA中的高甲基化WIF1比例范围为8％至93％，而高甲基化NPY的比例范围为0.1％至78％。血浆样品中检测到的检测限甲基化WIF1和NPY量分别为5.1和1.2cp/μL。 ※ Concentration of ALB (white bars), hypermethylated WIF1 (black bars) and hypermethylated NPY (hashed bars) in plasma of CRC patients and healthy individuals. 通过上述方法，即经亚硫酸氢盐转化后再进行3色数字PCR方法，能够在每25μL体系中可靠的检测低至25和5个拷贝的高甲基化WIF1和NPY，并且该检测结果可以用作通用的结直肠癌标志物和肿瘤特异性突变的替代物。使用3色Naica Crystal Digital PCR检测WIF1和NPY，结果和理论值一致，未出假阴性和假阳性结果。 该研究的结论是使用naica系统检测结直肠癌（CRC）中特定超甲基化的WIF1和NPY基因可以作为CRC诊断和筛查的强大新工具。研究发现，与邻近非肿瘤组织相比，肿瘤组织中的NPY和WIF1基因显著超甲基化（WIF1的p值0.001 NPY的p值0.001）。此外，研究发现NPY或WIF1在液体活检中的超甲基化具有95.5%的敏感性[95%CI 77–100%]和100%的特异性[95%CI 69–100%]。研究结果表明，NPY和WIF1的超甲基化是CRC的恒定特异性生物标志物，与它们在致癌过程中的潜在作用无关。 ｜欢迎来电垂询｜ naica️ ® 全自动微滴芯片数字PCR系统申请试用，大家可以拨打电话010-57256059或者官微申请，诚挚邀请您到Stilla数字PCR中国技术示范与服务中心参观，期待与您相见。 艾普拜生物提供多种靶点的数字PCR检测试剂盒和检测assay，欢迎订购和咨询。 个性化定制服务 艾普拜生物数字PCR个性化定制服务覆盖多种检测试剂需求 ( 如鉴定、易位、突变检测、多重突变、高阶多重等 )，更多信息请联系您身边艾普拜生物工作人员或电话联系我们。

DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5' 碳位共价键结合一个甲基基团。为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。Nature上一项新的研究揭示了一种跨染色质调节途径，即NSD1（一种组蛋白甲基转移酶）介导的H3K36me2是在基因间区域招募DNMT3A和维持DNA甲基化所必需的，并将异常的基因间CpG甲基化与人类肿瘤生长和过度发育相关联在一起。作者发现了一个有趣的现象：塔顿布朗拉赫曼综合征(Tatton–Brown–Rahman syndrome, TBRS)是一种儿童过度生长障碍，是由生殖系统DNMT3A（DNA甲基转移酶3A）突变导致的。儿童期巨脑畸形综合征(Sotos syndrome)是由NSD1（组蛋白甲基转移酶）的单倍剂量不足引起的。这两种疾病具有相同的临床特征，这就非常有意思了：这预示着组蛋白修饰和DNA甲基化修饰可能存在机制上的关联性。首先，研究人员通过全基因组分析和ChIP-seq分析方法发现，组蛋白甲基化修饰H3K36me2和H3K36me3的富集区域非常类似，且明显区别于其他组蛋白甲基化修饰如H3K9me3和H3K27me3所划分的区域。而且H3K36me2和H3K36me3水平与CpG甲基化呈正相关，这与之前报道的H3K36me3介导靶向DNMT3B的活性一致。然而，由于这种相互作用仅限于基因小体，染色质水平上的调控机制并不清楚。在进一步的检测和比较全基因组分析，发现H3K36me3在基因体中表现出特征性的富集，而H3K36me2则表现出更为弥散的分布，包括基因区和基因间区。与H3K36me3相比，DNMT3A选择性富集在H3K36me2高水平区域。接下来，就是我们的独家法宝Alpha技术大显身手的时候了。研究人员采用体外高灵敏度、匀相免疫AlphaLISA技术来阐明H3K36me2介导的DNMT3A募集特异性背后的机制。首先GST标记DNMT3A，纯化后将GST-DNMT3A与生物素化的核小体（不同甲基化的H3K36）置于384孔板。依次加入谷胱甘肽受体微珠，链霉亲和素供体微珠。避光反应60min后置于Envision多模式读板仪中对信号进行检测。通过亲和曲线分析可得知，DNMT3A与H3K36me2修饰的核小体的亲和力最高，其次是H3K36me3，但不与其他价态结合。这些结果表明DNMT3A可以识别H3K36两种甲基化状态，但对H3K36me2的亲和力更强。同时，作者也在体外NSD1突变细胞和临床Sotos综合症病人的血样本中验证组蛋白H3K36甲基化与DNA甲基化修饰的相关性，揭示DNMT3A优先选择H3K36二甲基化区域，促进基因间区的DNA甲基化。这一机制在疾病发生过程中有潜在的生物学意义。珀金埃尔默公司一如既往的为用户提供客制化Alpha Assay检测试剂和高品质的检测设备：EnVision多标记微孔板读板仪EnSight多标记微孔板读板仪Victor Nivo多标记微孔板读板仪参考文献Weinberg D N, Papillon-Cavanagh S, Chen H, et al. The histone mark H3K36me2 recruits DNMT3A and shapes the intergenic DNA methylation landscape[J]. Nature, 2019, 573(7773): 281-286.Dor Y, Cedar H. Principles of DNA methylation and their implications for biology and medicine[J]. Lancet. 2018

近日,国家卫生健康委临床检验中心 (NCCL) 公布了《2023年全国SDC2基因甲基化检测室间质量评价预研活动结果报告》,华大基因旗下深圳、武汉、天津3地医学检验所均以满分成绩通过。这是5月华大基因深圳、天津医学检验所满分通过全国肿瘤游离DNAEGFR基因突变检测室间质评以来的再次满分认证通过,多次获得国家权威机构组织的充分肯定,证明了华大基因在肿瘤防控领域的专业检测能力。华大基因多家医学检验所满分通过室间质评华大基因十分注重医学检验所的质量管理。从2020年参与室间质评以来,多次以满分高分通过国家级室间质评。此次室间质评是国家卫健委临床检验中心首次针对SDC2基因甲基化检测面向全国医疗机构/临床实验室开展的室间质量评价,通过SDC2基因甲基化检测的定性检测,对临床实验室进行质量评价。华大基因三家医学实验室采用华大基因自主研发的粪便DNA甲基化检测试剂参加本次室间质评,阳性符合率和阴性符合率均为100%,满分通过该项能力验证,这也充分证明了华大基因粪便DNA甲基化检测技术的稳定性与高质量水平。在加速技术创新及完善实验室质量管理体系的同时,华大基因基于粪便DNA甲基化检测技术推出多款基因检测方案,其中,采用荧光定量PCR技术的华常康[gf]ae[/gf]粪便DNA甲基化检测,能够通过检测粪便携带的肠道脱落细胞中的3个肠癌相关基因 (SDC2、ADHFE1、PPP2R5C) 的甲基化水平,从而评估受检者罹患肠癌的风险。此外,华大基因为检测试剂提供配套处理系统,实现低中高通量的结直肠癌防控一站式自动化整体解决方案,为合作伙伴打造疾病检测和肿瘤防控“平急两用”通用型平台。近年来,华大基因始终坚持“防大于治、人人可及”的公共卫生普惠精准防控理念,不断创新技术,推动普惠民生项目。未来,华大基因仍将积极探索新模式、新思路、新技术与新场景,将基因科技赋能精准医学, 为加快实现‘健康中国2030’贡献科技力量。

11月10日，《分子细胞》(Molecular Cell)杂志在线发表了题为Cooperative Action between SALL4A and TET Proteins in Stepwise Oxidation of 5-Methylcytosine 的研究文章，报道了在小鼠胚胎干细胞中，SALL4A蛋白与TET家族双加氧酶共同调节增强子上5-甲基胞嘧啶(5mC)的氧化过程。　　哺乳动物DNA的胞嘧啶甲基化修饰被认为是最稳定的表观遗传修饰，在维持性DNA甲基转移酶的作用下，亲代细胞基因组的DNA甲基化信息经过有丝分裂以半保留复制的方式传递给子代细胞。近年来的研究发现，TET家族蛋白能够将5mC逐步氧化成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)，并走向最终的去甲基化。这种动态变化拓展了DNA甲基化所承载的表观遗传信息的可塑性。在基因组上，5mC的氧化受到严格地控制，在某些基因组区域，5hmC会稳定存在，而在别的基因组区域5hmC只是进一步氧化和去甲基化的中间体。这一选择性事件的分子基础尚不明朗。　　该研究利用稳定同位素标记的细胞培养(SILAC)联合亲和纯化与蛋白质定量质谱技术，发现锌指结构域蛋白SALL4A倾向于结合含有5hmC修饰的DNA。SALL4是早期胚胎发育过程中的一个重要基因，它的突变会导致常染色体显性遗传的Duane-radial ray综合症。Sall4基因敲除的小鼠胚胎在围着床期即停止发育，并很快死亡。该研究发现，在小鼠胚胎干细胞中，SALL4A蛋白主要定位于增强子，其与染色质的结合在很大程度上依赖于TET1蛋白。进一步分析基因组上SALL4A结合位点的胞嘧啶修饰状态发现，这些位点上缺乏稳定的5hmC，却富集了进一步氧化的产物5fC和5caC，提示SALL4A可能促进5hmC的进一步氧化。果然，敲除Sall4导致在原先的SALL4A结合位点上积累较高水平的5hmC，因为敲除Sall4降低了TET2的稳定结合，不利于5hmC的进一步氧化。　　这一工作丰富了对TET家族蛋白调控的DNA氧化和去甲基化过程的理解，并提出了5mC的协同性递进氧化概念。促进了对DNA甲基化的动态性及其在胚胎干细胞功能及重编程中作用的理解。　　中国科学院生物物理研究所研究员朱冰和副研究员张珠强为本文的共同通讯作者。朱冰课题组熊俊和张珠强为本文的并列第一作者。同济大学教授高绍荣和博士陈嘉瑜，北京生命科学研究所研究员陈涉、丁小军和许雅丽，中科院生态环境研究中心研究员汪海林和博士黄华，中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究员徐国良，日本熊本大学教授Ryuichi Nishinakamura也参与了该项研究。该研究得到国家自然科学基金委、科技部、中科院战略性先导专项和美国霍华德?休斯医学研究所国际青年科学家项目的资助。图示：SALL4A促进由TET1和TET2介导的5mC氧化过程

导读在过去的几十年中，糖尿病的发病率在全球范围内显著增长。除了不健康的生活方式外，环境污染物被认为是糖尿病发生的危险因素。多环芳烃 (PAH)是一类含有2-7个芳环的有机化合物，由自然和人类活动产生并广泛存在的污染物。流行病学研究表明，PAHs水平与成人和儿童的肥胖和二型糖尿病相关。厦门大学生命科学学院细胞应激生物学国家重点实验室的研究人员在Ecotoxicology and Environmental Safety上发表了题为《Prenatal exposure to a mixture of PAHs causes the dysfunction of islet cells in adult male mice: Association with type 1 diabetes mellitus》的文章。文中应用naica® 微滴芯片数字PCR系统对胰岛素编码基因DNA甲基化水平进行量化，揭示了产前暴露于多环芳烃混合物对成年雄性小鼠胰岛细胞功能的不良影响。应用亮点：▶ 使用naica® 微滴芯片数字PCR系统对胰岛素编码基因启动子甲基化水平进行量化。▶ 在产前暴露于500µg/kg PAHs的小鼠中，胰岛素编码基因启动子的甲基化水平显著升高。▶ 产前暴露于PAHs可能促进I型糖尿病的发病。作者使用8种PAHs的混合物进行了实验，以研究产前PAHs对成年期胰岛细胞功能和质量的影响，同时试图阐明 I型糖尿病发病的环境原因。他们分离了成年雄性小鼠的胰岛，对胰岛素编码基因的启动子DNA甲基化水平进行分析。研究成果：▲图1. 产前暴露于多环芳烃对成年雄性小鼠胰岛素编码基因甲基化水平的影响。(A) 数字PCR结果代表性一维图。(B)胰岛素编码基因启动子甲基化水平。(每个处理三只母鼠, 每只母鼠取一个雄性后代) 。在本研究中，子宫内暴露于500µg/kg PAHs的小鼠胰岛中胰岛素编码基因启动子中的DNA甲基化水平显著增加，同时胰岛素编码基因转录显著下调。▲图2. 不同PAHs浓度对胰岛素编码基因转录水平的影响原文链接如下：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651322005358期刊介绍：Ecotoxicology and Environmental Safety 1977创刊，隶属于爱思唯尔出版集团。是一份多学科交叉期刊，主要研究环境污染对包括人类健康在内的生物体的暴露和影响。最新影响因子为7.129。naica® 六通道数字PCR系统法国Stilla Technologies公司naica® 六通道数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

8月7日，国家药品监督管理局（NMPA）官网公示，由博尔诚（北京）科技有限公司（下称“博尔诚”）自主研发的思博士® MT-1A、Epo及Septin9基因甲基化检测试剂盒（PCR荧光探针法）获批上市。该试剂盒是NMPA批准上市的首款食管癌血液基因甲基化检测产品。博尔诚研发中心负责人周光朋博士介绍，在思博士® 开发之前，全球范围内，尚无有效的、经过临床验证的针对食管癌的基因甲基化标志物。博尔诚研发团队通过大量的全基因组甲基化测序以及生物信息学分析和实验验证等，首次从全基因组里挖掘出三个与食管癌密切相关、检测性能好、中国人群特异的标志物，填补了国内国际空白。

近日，化学化工学院王家海教授团队开发了基于纳米孔计数器检测甲基化基因的方法，成果以“Nanopore counter for highly sensitive evaluation of DNA methylation and application for in vitro diagnostics”为题发表在国际知名学术期刊Analyst上。1、研究背景 DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，在维持正常细胞功能、染色体结构、胚胎发育和衰老方面发挥着重要作用。因此，DNA异常的甲基化水平被认为是重要的恶性肿瘤生物标记物之一，开发一种简单而灵敏的DNA甲基化水平检测方法是必要的。固态纳米孔是纳米孔技术中重要的组成部分，其对双链DNA（dsDNA）的检测具有无标记和超高灵敏度的特性。将DNA甲基化程度通过合适的转换机制，变换成特定长度双链DNA的浓度，有助于开发信号读出良好，灵敏度高的甲基化传感器。2、研究内容受此思路启发，王家海教授团队提出了一种过程简单，条件温和的甲基化监测方案——即通过纳米孔计数器对双链的读出能力，结合双限制性内切酶（BstUI/HhaI）消化策略和聚合酶链式反应（PCR）扩增将DNA甲基化转换为PCR扩增物的数量来评估DNA甲基化的程度。相比于传统亚硫酸氢盐转化方法，基于双甲基化敏感内切酶的消化策略结合纳米孔是更好的选择。首先，基于甲基化敏感的核酸内切酶的消化策略可以在更加温和的条件下特异性地消化未甲基化的DNA，这对于开发简单、通用的甲基化检测方法至关重要；此外，基于甲基化敏感的核酸内切酶消化策略的可以将非甲基化的DNA切碎，这可以大大减少背景信号，从而显著简化纳米孔传感器的数据分析，使得信号更加规整、好读。而加入PCR策略，是将信号灵敏度和选择性进一步提升，使其达到临床所需。图1 技术原理图：（a） 双内切酶系统可以消化未甲基化的DNA，但保留甲基化的完整DNA，完整的甲基化DNA可以通过PCR反应扩增并产生大量固定长度的双链DNA扩增子。（b） 通过玻璃纳米孔计数器直接检测PCR扩增子。由于PCR扩增子的规律性，信号是非常均匀、好读出的。3、工作亮点在本工作中，我们根据PCR扩增的效率以及产生信号的信号比优化了PCR产物的长度，使得传感器兼顾灵敏度以及读出信号的方便性。结合PCR技术产生固定长度扩增子后，该传感技术对DNA甲基化的检测达到了1aM以下的检测限，并且具有1aM~100pM之间（109倍）的超宽传感器线性区间：图2 PCR扩增子长度的优化。（a）扩增子的引物的位置。（b）凝胶电泳图，说明经过反应后，只有甲基化SEPT7基因可以保持完整，并成功产生不同长度的产物条带。（c）三种长度的PCR扩增子的易位信号，可以看出随着扩增子长度的增加，信噪比提升。（d） 317、406和806bp扩增子的信号幅度分布直方图，可以看到扩增子越长，信号率下降，传感器灵敏度下降。图3 纳米孔传感器对甲基化DNA的定量测试。（a）甲基化PUC57-SEPT9浓度范围为1 aM至100 pM时的校准曲线。（b）传感器的对数校准曲线。对数校准曲线的分段线性范围为1 aM至100 aM（c）和100 aM至100pM（d）。（e） 传感器在5秒内对不同浓度的甲基化PUC57-SEPT9的易位信号。此外，传感器具备优秀的选择性，能在大量非甲基化的基因中检测出仅有0.01%的甲基化基因。与其他现存技术相比，我们的技术在检测限及监测范围中有足够的优势。图4 传感器对DNA甲基化水平的测试。（a）用不同甲基化水平的DNA测试时的事件率。（b）测量的甲基化水平与实际输入甲基化水平之间的关系。结果显示即使在低至0.01%的浓度水平下也具有良好的一致性。表1 本文结果与其他甲基化检测方法的性能比较方法扩增手段检测范围检测下限fluorescenceOxidation damage base-based amplification100 fM-100 nM34.58fMelectrochemistryElectrochemical strategies for tetrahedral RCA amplification1 fM-1 nM100 aMchemiluminescenceSynergistic in situ assemblies of G-quadruplex DNAzyme nanowires1 aM-100 pM0.565 aMfluorescenceDual endonucleases digestion coupled with RPA-based CRISPR/Cas13a200 aM-20 pM86.4 aMfluorescenceFluorescence nanosensor based on Fe3O4/Au core/shell nanoparticles3.2 fM-800 fM310 aMNanopore（this work）Dual endonucleases digestion combined with PCR-based nanopore1 aM-100 pM0.61 aM4、研究相关 王家海教授为论文第一作者，团队成员陈达奇（广州大学讲师）为论文通讯作者，广州大学为第一通讯单位。文章链接： https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/an/d3an00035d

安捷伦科技公司推出首款针适用于疾病研究的DNA甲基化靶向序列捕获产品 2012 年 2 月 14 日，佛罗里达州马科岛（基因组生物学和技术，AGBT）- 安捷伦科技公司（纽约证交所：A）推出其靶向序列捕获平台的新成员，SureSelect XT 人甲基化测序系统，适用于表观遗传学研究中 DNA 甲基化位点检测。这是市场上第一款采用靶向序列捕获技术的全面 DNA 甲基化发现系统。安捷伦将于明日在基因组生物学技术进展年会上揭晓该产品的技术细节。 Agilent SureSelect XT 甲基化测序系统基于液相杂交，是可以分析人类基因组中低甲基化与过度甲基化的胞嘧啶位点的独特研究工具。亚硫酸盐测序技术是 DNA 甲基化研究的黄金标准，也是第一种可以全面研究DNA 甲基化的发现系统。Agilent SureSelect XT 甲基化测序系统将市场领先的靶向序列捕获平台 SureSelect 与亚硫酸盐测序结合在一起，挑选了与表观遗传学研究最相关的基因组序列，包含了与多种疾病（例如，癌症、基因组印记疾病、行为和精神障碍等等）相关的区域，实现了前所未有的序列覆盖范围。 &ldquo DNA 甲基化是重要的表观遗传学特征之一。&rdquo 华盛顿大学西北参考表观基因组图谱中心主任 John Stamatoyannopoulos 说，&ldquo 如果拥有一种经济实惠的可以在亚硫酸盐测序过程中智能地检测数百万 CpG 的平台，那么将大大降低成本并大幅扩展基因组规模 DNA 甲基化分析的范围和适用性。&rdquo &ldquo Agilent SureSelect XT 甲基化测序系统涵盖了所有基因组中癌症研究领域关注的甲基化胞嘧啶位点，投入产出比相当好。&rdquo 马克斯普朗克分子遗传学研究所 Michal-Ruth Schweider 医学博士说道。 &ldquo 我们很高兴能为用户提供这种新工具来满足医学界日益增加的需求。&rdquo 安捷伦副总裁基因组学总经理 Robert Schueren 说道。&ldquo 由于异常甲基化是可逆的，因此这种分析方法非常有利于开发新的治疗方法。&rdquo Agilent SureSelect XT 甲基化测序系统使研究人员能够分析超过 370 万个CpG 核苷酸序列位点，研究它们的甲基化状态。该系统针对启动子、经典 的CpG 岛以及最近被关注的位于CpG 岛上下游 2kb范围内的&ldquo shores&rdquo 和&ldquo shelves&rdquo 区域设计。研究表明，许多甲基化变化并不发生在启动子或 CpG 岛，而是发生在 CpG 岛上下游2kb 范围内，也就是 CpG 岛shores区域。除上述区域外，Agilent SureSelect XT 甲基化测序系统的设计还包含了已知的差异性甲基化区域。 与全基因组亚硫酸盐测序相比，Agilent SureSelect XT 甲基化测序系统具有更高的通量和更低的成本。它可以识别限制性内切酶或免疫沉淀法不能检测的区域。因为该产品也属于SureSelect XT 产品系列，安捷伦为用户提供全套工作流程解决方案。并配有适用于文库构建和靶序列捕获的所有必备试剂。 要了解更多信息，请访问 www.agilent.com/genomics/ngs。 关于安捷伦科技 安捷伦科技公司（纽约证交所：A）是全球领先的测量公司，同时也是化学分析、生命科学、电子和通信领域的技术领导者。公司的 18,700 名员工为 100 多个国家的客户提供服务。在 2011 财政年度，安捷伦的业务净收入为 66 亿美元。要了解安捷伦科技的信息，请访问：www.agilent.com.cn

p 　　近期，中科普瑞整合IsoTex-BD China单细胞研究联合实验室经过近一年的研发测试和应用，正式投入科研服务应用。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/92a657b0-670f-473c-bf67-1ada9534cb59.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" width=" 469" height=" 310" style=" width: 469px height: 310px " / /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " BD(China)—Sinotech Genomics(中科普瑞)单细胞研究联合实验室 /span /strong /p p 　　中科普瑞自2018年3月BD(中国)-云泰生物单细胞研究联合实验室成立以来，联合实验室完成了多项技术研发测试，已获得了数百例肿瘤组织的单细胞全转录组测序数据，并针对性设计靶向panel进行验证，完成合作研发项目五十余项。 /p p 　　单细胞测序技术在2018年继续飞速发展，各类相关技术和应用纷纷上线，与此同时， strong 单细胞水平转录组与蛋白质组的检测，也逐渐广泛应用于免疫、癌症和干细胞等研究领域。 /strong BD公司旗下的单细胞平台—BD Rhapsody作为单细胞研究应用领域的利器，既可通过单细胞全转录组和靶向转录组测序的整合策略，在单细胞水平构建从新靶标发现到多样本验证的完整研究体系，又可利用其最新的BD& reg AbSeq assay检测单细胞水平的蛋白表达，实现特异高效的转录组和蛋白组的多组学研究方案。 /p p 　　 strong 为了更好地聚焦单细胞肿瘤临床研究应用，中科普瑞携其下属科研服务子公司—上海鲸舟基因推出单细胞研究系统解决方案。 /strong 立足于BD Rhapsody 单细胞研究平台开展单细胞全转录组和靶向转录组测序服务，并以单细胞肿瘤临床研究为中心，着力进行单细胞甲基化检测等技术研发和应用，进而建立涵盖单细胞甲基化研究、单细胞转录组研究以及单细胞蛋白组研究的立体式系统解决方案，为单细胞研究提供新的解决方案和思路。 /p p 　　 span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 聚焦单细胞肿瘤临床研究 /strong /span /p p 　　肿瘤研究的逐步深入和高通量测序技术的不断精进促使了精准医疗策略的提出。而解析肿瘤组织内细胞的高度异质性，是实现更精确的癌症分型，选择更合理的个体化治疗策略的迫切需求。针对肿瘤组织及其免疫微环境的单细胞转录组测序可以帮助科学家绘制肿瘤组织内细胞的异质性转录组图谱，通过鉴别肿瘤细胞、基质细胞与浸润淋巴细胞的不同细胞亚群，来解析不同细胞亚群生物学功能异同，最终构建肿瘤细胞及免疫微环境的互作网络，并探究肿瘤细胞产生耐药或免疫逃逸等机制。 /p p 　　中科普瑞单细胞测序平台可利用高通量单细胞转录组测序技术，通过揭示肿瘤发生发展进程中各种细胞亚群转录组的变化与差异，助力科学家开展肿瘤的早期诊断、病情监测及预后判断等方面的研究。 strong 中科普瑞还与国家大数据中心进行战略合作，结合大数据共享和应用分析，通过单细胞转录组研究整合多组学和临床数据，构建健康与疾病的信息网络数据库，以期为不同遗传背景的患者提供个体化诊断及精准治疗。 /strong /p p 　　同时，中科普瑞还将利用BD& reg AbSeq assay这一单细胞蛋白组分析利器，大幅提高客户对其感兴趣的稀有或未知细胞的检测能力，以促进药物治疗反应、细胞治疗等肿瘤免疫学应用研究的进展。 /p p 　　 span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 聚焦单细胞甲基化研究 /strong /span /p p 　　近年来，基于血浆ctDNA甲基化的肿瘤早期诊断、溯源及预后的技术突破，为肿瘤风险筛查和防治提供了新的曙光。DNA甲基化还可用于疾病分型、预后以及用药指导等临床领域。单细胞甲基化检测技术在未来的疾病研究与临床应用中有着光明前景和无限可能，既可从单细胞水平研究DNA甲基化修饰在组织分化、发育过程中的特异性，帮助医生判断转移癌组织的原发病灶，进而明确诊断疾病 还可针对特定肿瘤组织DNA甲基化修饰的异常，进行对应的诊疗指导或药物开发。 /p p 　　2018年3月以来，中科普瑞作为中国十万人甲基化组计划(表观星图计划)的项目实施方，通过与国内外基因组队列计划联动，建立中国人甲基化基准数据库，为表观遗传领域研究、应用和临床检测等建立基础数据库。表观星图计划除利用甲基化芯片进行甲基化基准数据库的建立外，还将利用BD(China) — Sinotech Genomics(中科普瑞)单细胞研究联合实验室在单细胞研究方面的技术优势，聚焦单细胞甲基化研究，以期为肿瘤的风险筛查和预防提供新的手段。 /p

近日，南京腾辰生物宣布完成数千万元A轮融资，本轮融资由树兰俊杰资本领投，知名个人投资人跟投，探针资本担任独家财务顾问。本轮融资主要用于biomarker专利库和临床样本的进一步积累，加速后续产品管线的研发，着重推进肺结节良恶性判别IVD产品的注册检及后续的医疗器械证申报，以及LDT产品的商业化落地。腾辰生物成立于2018年，专注于针对恶性肿瘤的核酸质谱早筛早诊产品研发。从公司成立之初开始，就着手与国内顶尖医院合作，建立全球高水平的早期癌症样本库。截至目前已经积累了两万余例临床样本，并基于真实世界的临床样本开发原研靶点阵列，布局了一系列分子标志物专利，建立专利护城河。同时，围绕核酸质谱平台优化工艺流程，自研自产基础试剂盒，在提高产品壁垒的同时大大降低检测成本，提升临床可及性及数据稳定性。肿瘤早筛早诊市场规模达千亿，其中分子诊断市场近几年增长迅速。DNA甲基化被认为是极佳的肿瘤体外早诊分子标志物，可以针对包括肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、结直肠癌、宫颈癌等一系列恶性肿瘤进行早期检测。尽管目前针对DNA甲基化已经有多款产品上市（适应症包括结直肠癌、宫颈癌等），但大部分的产品所检测的疾病范围尚集中在能够获取肿瘤附近组织样本的类型。而恶性肿瘤早期体外诊断最佳的介质是血液，因为其采样简单且几乎适用于所有癌种，但早期恶性肿瘤患者血液中甲基化信号弱、背景噪音强，想要精准捕捉相应信号的难度极大。目前，针对甲基化的检测主要有三种方式，分别为qPCR、二代测序及定量核酸质谱。其中，qPCR检测相对简单、生信分析要求较低，且相应的仪器在临床端较为普遍，IVD报证先例较多。然而qPCR只适用于检测位点相对较少的产品（1-5个位点最佳），且检测的精密度相对较低，因此不适用于血液样本的检测。而基于NGS做甲基化检测的精密度相对较高，可同时检测成千上万个DNA位点，但其操作相对复杂，生信要求和成本均较高，更适用于位点的筛选。而定量核酸质谱操作相对简单，生信要求低，数据稳定性高，适用于10-100个DNA位点的检测范围，符合血液样本临床检测的应用场景。然而，在应用核酸质谱检测过程中几乎所有步骤的试剂盒均需进口，如何降低检测成本、优化检测流程，且如何选取合适的分子标志物阵列，均为应用该技术平台需要解决的难题。目前，围绕核酸质谱检测平台，腾辰生物共布局了近10条产品管线，覆盖包括肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤。其中，肺癌早诊产品已经完成了4000余例临床验证（其中I期肺癌比例大于90%），对于2cm以下的极早期肺癌的灵敏度与特异性均＞80%。与竞品相比，腾辰生物的肺癌早诊产品”菲捷明“拥有采血量低、对样本要求低、成本及终端价格低等优势，目前正在推进商业化落地和准备启动IVD报证工作。随着公司产品研发进度的加快和资源的不断注入、公司管线日益丰富，腾辰生物吸引了一批优秀的人才加入，组建了一支能力卓越、经验丰富的研发、生产及销售团队。腾辰生物创始人，CEO杨蓉西博士表示：我们很高兴连续获得知名专业基金和投资人的认可和支持。腾辰生物拥有十余年的技术积累，具有国际领先的持续原研能力，致力于开发高效稳定低成本的癌症早筛早诊的分子标志物，以及相关的底层技术和检测体系。经过四年的成长，公司团队逐渐完善，临床数据快速积累，市场销售开始布局。未来我们将与合作方携手共进，持续推进研发和注册申报，为临床医生和患者提供优质的肿瘤早筛早诊服务和产品。树兰俊杰资本创始合伙人许迪龙表示：我们很高兴作为领投方参与腾辰生物的A轮融资。树兰俊杰医疗资本扎根产业，深耕医疗领域投资，近年来一直以务实的眼光关注肿瘤早筛早诊赛道，寻找有创业精神，有持续原研能力且最终能落地的项目。腾辰生物坚持原研十余年，积累了30余项发明专利、数千例临床数据和自有的工艺流程，从而建立了很高的技术壁垒。核酸质谱平台的应用在大幅提高数据的精密度和稳定性的同时也大大降低了成本和提高了工作效率。我们对腾辰生物的后续发展充满了期待。探针资本合伙人杨丹宁表示：腾辰生物拥有一流的IVD产品研发和落地能力，围绕核酸质谱快速布局多条产品管线，并建立自己的分子标志物阵列及自研试剂专利壁垒，在研发具有高度差异化、高精准度及特异性的IVD产品同时进一步降低检测成本、增加检测结果稳定性，更加贴近疾病早筛早诊应用场景。公司自创立起，便与国内多家知名医院展开合作，共同推进项目落地，相信未来一定会实现爆发增长。我们非常荣幸参与到腾辰生物此次的融资工作中，并期待公司在CEO的带领下进一步建立研发壁垒、完善产品管线，助力行业更好地发展。关于腾辰生物南京腾辰生物科技有限公司座落于南京市江北新区“南京生物医药谷”，是一家由留德海归博士创办、致力于开发新一代肿瘤及心脑血管等重大疾病体外早诊技术及产品的高科技生物企业。公司在疾病早诊、预后评估、疗效评估和复发监控等方面拥有领先的自主技术，并已获得多家国内一线风投机构的投资。公司已与国内多家三甲医院建立合作，积极筹建肿瘤体外诊断研发基地，进一步提升研发创新能力、丰富大数据积累和完善知识产权布局。公司创始人曾担任德国国家癌症研究中心和德国排名第一的海德堡大学医学院研究员，其研究成果于2016年获得了欧洲知名的Claudia von schilling基金会颁发的乳腺癌研究贡献奖，并在德国有丰富的创业经验并多次获奖，其创立的肿瘤体外诊断体系先后获得了德国国家经济部高科技转化大奖及欧盟创业大赛生物技术类一等奖。关于树兰俊杰资本树兰俊杰资本由树兰医疗集团早期投资人和创始团队共同发起组建，在全球范围内以临床资源服务于医学科技产业转化，通过建设科技投资基金、SATOL生命科技加速器、SATOL全球医学创新创业中心，承办世界生命科技大会、全球医学创新创业大赛，以社群服务、基金投资、科研孵化三项核心业务来推动医学临床、科研、产业一体化发展，助力医学科技人才创新创业，在数字诊疗、生物技术、创新疗法等领域投资了一批优秀的科技企业。关于探针资本探针资本成立于2017年，是一家专注医疗健康与生命科技的精品投行，旗下业务包括财务顾问、直接投资、产业咨询和创新孵化。创始团队来自业内一线私募股权投资机构、财务顾问机构、管理咨询公司和医疗垂直媒体。自成立以来，探针资本每年均完成两位数的私募融资与并购交易，累计交易金额近百亿元人民币。在企业增值服务方面，探针资本团队拥有成熟的产业经验。2020年探针新医疗基金成立，截止目前已投资十余家业内头部公司。

导读自青霉素发现以来，抗生素已经成为人类对抗细菌的最有效武器，挽救了无数人的生命，但随着抗生素使用上的无节制，抗生素耐药性已成为一个重大的全球问题。因此了解微生物对抗生素适应的分子机制成为抗击抗生素耐药性（AMR）的一个重要途径。近日，法国巴斯德研究所的科学家运用转录组测序、naica® 微滴芯片数字PCR等技术证实VchM（霍乱弧菌特有甲基转移酶）参与应对氨基糖苷类抗生素的应激反应，这表明，DNA甲基化在氨基糖苷类抗生素的耐药机制中也发挥着重要作用，该文章刊载于《PLOS GENETICS》。应用亮点：▶ 运用naica® 微滴芯片数字PCR系统分析霍乱弧菌操纵子表达情况。▶ VchM缺失会导致生长缺陷，但却可以使霍乱弧菌对氨基糖苷产生应激。▶ VchM直接调节groES-2（伴侣蛋白编码基因）的胞嘧啶甲基化，从而改变其表达情况，影响霍乱弧菌耐药性。氨基糖苷（AGs，如：妥布霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素和新霉素）是一类针对细菌核糖体小亚基的抗生素，其破坏翻译保真度，增加细胞中错误折叠蛋白质的水平。而本文的研究主要针对霍乱弧菌对其的耐药性机理。科学家们在之前的研究中发现，特定DNA甲基转移酶基因突变（VchM）的霍乱弧菌相比WT具有更强的耐药性，这表明DNA甲基化可能在霍乱弧菌适应AGs中发挥作用。VchM编码一种Orphan m5C DNA甲基转移酶，导致5‘-RCCGGY-3’基序的胞嘧啶甲基化，虽然VchM的缺失会导致生长缺陷，但霍乱弧菌细胞可以在亚致死浓度和致死浓度的抗生素下对氨基糖苷应激。▲图1：霍乱弧菌ΔVchM对亚致死浓度氨基糖苷的敏感性较低。GAs类，TOB（妥布霉素），0.6 μg/ml、GEN（庆大霉素），0.5 μg/ml、NEO（新霉素），2.0 μg/ml；非Gas类，CAM（氯霉素），0.4 μg/ml和CARB（β -内酰胺类西林），2.5 μg/ml对于ΔVchM霍乱弧菌的转录组测序和遗传分析发现，ΔVchM菌株中有4个直接参与蛋白质折叠的基因被上调。包括groEL-1，groEL-2，groES-1，groES-2。通过naica® 微滴芯片数字PCR系统对基因表达进行验证分析发现，ΔVchM霍乱弧菌中groES-2的表达在不同时期均有较大上调。进一步通过缺失验证表明了groESL-2对ΔVchM的抗生素高耐受性的作用。▲图2：ΔVchM菌株中groESL-2操纵子上调(对数生长期，Exp, OD600 ≈ 0.3；指数生长期，Stat, OD600 ≈ 1.8–2.0)在groESL-2区域观察存在四个VchM甲基化基序存在。进一步对基序分析发现，破坏这些基序会导致groESL-2基因表达增加（如图3）。且基序破环越多，则导致的表达上调更加明显。同时，ΔVchM中的groESL-2基因表达一直高于基序突变，表明还存在其他因素与甲基化协同控制groESL-2表达。这些结果表明，在霍乱杆菌中，一组特定的伴侣蛋白编码基因受DNA胞嘧啶甲基化的控制，将DNA甲基化与伴侣蛋白表达的调节和对抗生素的耐受联系起来。▲图3：在WT中，groESL-2区域的VchM位点突变导致基因表达增加法国巴斯德研究所是世界上最著名的研究所之一，成立130余年来一直走在世界科技前沿，是微生物学、免疫学、传染病学等学科的起源地，曾开发出狂犬病疫苗、天花疫苗、流感疫苗、黄热病疫苗等多个造福人类的疫苗产品，并培养了10名诺贝尔奖生理学或医学奖获得者，实现研究、教育、健康、创新“四位一体”的研究机构。

瓜氨酸化是影响蛋白质结构和功能的关键的翻译后修饰。尽管它与各种生物过程和疾病发病紧密相关，但由于缺乏有效的方法来富集、检测和定位该翻译后修饰，其潜在机制仍然知之甚少。近期，威斯康星大学麦迪逊分校李灵军教授课题组报道了生物素硫醇标签的设计和开发，该标签能够通过质谱法对瓜氨酸化进行衍生化、富集来实现可靠的鉴定。作者对小鼠组织的瓜氨酸化蛋白质组进行了全局分析并且从432种瓜氨酸化蛋白质中识别出691个修饰位点，这是迄今为止最大的瓜氨酸化数据集。作者发现并阐述了这个翻译后修饰的新的分布和功能并且表示该方法有希望为进一步破译瓜氨酸化的生理和病理作用奠定基础。这项工作以“Enabling Global Analysis Of Protein Citrullination Via Biotin Thiol Tag-Assisted Mass Spectrometry”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上 (https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c03844)，文章作者为Yatao Shi#, Zihui Li#, Bin Wang#，Xudong Shi , Hui Ye, Daniel G. Delafield, Langlang Lv, Zhengqing Ye, Zhengwei Chen, Fengfei Ma，Lingjun Li*。此外，李灵军教授课题组进一步拓展了此方法的实用性。作者通过应用二甲基化亮氨酸(DiLeu)等重标记策略第一次实现了瓜氨酸化的高通量定量研究，并利用这一方法揭示了瓜氨酸化在人体细胞DNA损伤及修复过程中的重要作用。相关成果以“12-Plex DiLeu Isobaric Labeling Enabled High-Throughput Investigation of Citrullination Alterations in the DNA Damage Response”为题同样发表在Analytical Chemistry上(https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c04073)，文章作者为Zihui Li, Bin Wang, Qinying Yu, Yatao Shi, Lingjun Li*。　　研究的主要内容　　作者设计了一种生物素硫醇标签，它可以很容易的以低成本合成并且可以与瓜氨酸残基和2,3-丁二酮发生特异性反应(图 1a)。这种衍生化不仅增加了质量转移以允许更可靠的鉴定，而且还引入了生物素部分，使修饰分子的后续富集成为可能。该生物素硫醇标签设计具有紧凑的结构，在高能碰撞解离 (HCD) 期间仅产生两个碎片/诊断离子(图 1b)。 因此，肽主链可以保持良好的裂解效率，并在 HCD 或电子转移解离 (ETD) 期间分别产生丰富的b/y或c/z离子系列。在 HCD(图 1c)、ETD或电子转移/高能碰撞解离(EThcD)碎裂下，衍生化肽标准品的序列收集质谱图几乎完全覆盖相应的肽序列。实验结果表明生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸化肽可以产生用于解析及标注的高质量的串联质谱图，并且与各种裂解技术相结合时可以提高瓜氨酸化位点的识别可信度。　　图1|用于瓜氨酸化分析的生物素硫醇标签设计。a，使用生物素硫醇标签和 2,3-丁二酮对瓜氨酸肽进行衍生化。 b，HCD、ETD 或 EThcD 片段化后生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸化肽的片段化位点。c，HCD裂解后生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸肽标准品 SAVRACitSSVPGVR 的串联质谱图。　　在接下来的实验中作者使用该生物素硫醇标签和基于质谱的自下而上的蛋白质组学方法对瓜氨酸化进行分析(图2a)。作者在体外利用 PAD(一种可以催化瓜氨酸化的酶)催化的人组蛋白 H3 蛋白来验证这个过程。作为未被PAD催化的阴性对照，未发现组蛋白的肽段被鉴定为瓜氨酸化，证明了生物素标签反应的高特异性(图 2b)。在体外 PAD 处理后，作者 发现许多精氨酸残基被催化为瓜氨酸，并且大量的位点被高可信度的鉴定为瓜氨酸化位点(图 2c)，进一步表明该方法的高效性。在 HCD 碎裂后，其产生了一系列丰富的 b/y 离子，可以帮助准确的表征在同一肽段上单个(图 2d)以及多个(图 2e)瓜氨酸化位点。　　图2|使用生物素硫醇标签进行体外瓜氨酸化分析。a，使用生物素硫醇标签进行蛋白质瓜氨酸化分析的实验工作流程。b、c，在体外 PAD 处理之前 (b) 和之后 (c) 组蛋白 H3 蛋白的瓜氨酸化分析。 已识别的瓜氨酸化位点在序列中以蓝色字母突出显示。 序列下方的红色矩形表示鉴定的瓜氨酸化肽，而瓜氨酸化位点以蓝色显示。 d，PAD处理的组蛋白 H3 (R64Cit) 的已鉴定瓜氨酸化肽的串联质谱图示例。 e，PAD 处理的组蛋白 H3 的同一肽上鉴定的两个瓜氨酸化位点(R70Cit 和 R73Cit)的串联质谱图示例。　　接下来，作者们尝试利用所开发的方法对复杂的生物样本中的瓜氨酸化进行全局分析，并希望能够以此提供阐明生物体中瓜氨酸化调节机制的依据。首先，作者对小鼠的六个身体器官和五个大脑区域进行了深入的瓜氨酸组分析，生成了第一个小鼠瓜氨酸组组织特异性数据库。作者从432种瓜氨酸化蛋白质中以高置信度的方式鉴定了691个瓜氨酸化位点(图 3a)。更重要的是，这些蛋白质中约有 60% 未曾在UniProt 数据库检索并被报道，这一结果极大地扩展了对瓜氨酸化以及这些底物蛋白质如何受到瓜氨酸化影响的理解。作者发现结果中与 UniProt 数据库的已知的瓜氨酸位点重叠部分较少(图 3b)，这可能是因为 UniProt 中描述的近 40% 的瓜氨酸化位点是基于相似性外推理论而没有实际的实验证据。此外，许多报道的位点位于组蛋白上，尤其是蛋白质末端，可能会逃过自下而上质谱策略的检测(图 3b)。图 3c 展示了单位点瓜氨酸化和多位点瓜氨酸化蛋白质分布情况，其中 70% 的已鉴定蛋白质仅有一个瓜氨酸化位点被检测到。　　这个新发现的瓜氨酸化蛋白质组为推测瓜氨酸化的调控机制提供了宝贵的资源。例如，作者在髓鞘碱性蛋白(MBP)上鉴定到了九个瓜氨酸化位点，而在 UniProt 数据库中只有四个(图3d)。作者的结果提供了高质量的串联质谱图，不仅证实了已知修饰位点的存在(图3e)，而且还高可信度的识别了未知的位点(图 3f)。然后作者进行了瓜氨酸化肽段的序列分析，发现在鉴定的瓜氨酸化位点两侧并没有高度保守的氨基酸序列模式(图3g)，但是谷氨酸残基更频繁地出现在瓜氨酸的N末端侧附近。这与Fert-Bober 等人报道的小鼠瓜氨酸组分析结论一致。另一方面，Tanikawa 等人发现在人体组织和血浆中大约五分之一的 PAD4 底物含有 RG/RGG 基序。同样，Lee 等人及相关研究人员观察到天冬氨酸和甘氨酸残基在瓜氨酸化位点出现频率偏高。值得注意的是，这些研究使用了不同的人源细胞系或组织，因此作者的结果可能表明在不同物种之间瓜氨酸化位点周围的序列模式是不同的。为了更好地辨别瓜氨酸化蛋白质所涉及的功能，作者展示了基因本体论(GO)富集分析的热图，其显示了二十个最显著富集的细胞成分(图3h)以及KEGG途径(图3i)。作者发现小鼠大脑组织和身体器官之间存在明显差异，而瓜氨酸蛋白更多地参与大脑功能。具体来说瓜氨酸化蛋白质集中在轴突、髓鞘、核周体和突触中，因此在中枢神经系统中可能发挥着重要的作用。　　图3|不同小鼠组织的大规模瓜氨酸组分析。a，不同小鼠组织中已鉴定的瓜氨酸化蛋白和瓜氨酸化位点的数量。 b，本研究中鉴定的瓜氨酸化位点与 UniProt 数据库中报告的位点比较。 c，每个鉴定的瓜氨酸化蛋白质的瓜氨酸化位点数量分布。d，本研究中确定的瓜氨酸化位点与 UniProt 数据库中关于髓鞘碱性蛋白的瓜氨酸化位点的比较。e、f，在髓磷脂碱性蛋白 R157Cit (e) 和 R228Cit (f) 上鉴定的两个瓜氨酸化位点的示例串联质谱图。g，鉴定的瓜氨酸化肽的序列。瓜氨酸化位点位于中间的“0”位置。字母的高度表示每个氨基酸在特定位置的相对频率。 h,i，使用 Metascape 生成的热图显示不同小鼠组织中显着丰富的(p 值 0.01)细胞成分 (h) (KEGG) 通路 (i)。　　为了进一步拓展该方法的实用性，作者应用了二甲基化亮氨酸(DiLeu)等重标记策略，第一次实现了对瓜氨酸化进行高通量的定量研究。作者首先使用瓜氨酸化标准肽段进行测试，证明在优化反应条件下DiLeu标记和生物素硫醇标记反应可以分步进行而不互相干扰(图 4B，4C)。同时，将标准肽段按照已知比例进行4-plex DiLeu标记并混合，再进行生物素硫醇标记和瓜氨酸化分析，结果显示了非常好的定量准确性(图5)。作者进一步优化了运用该方法在复杂生物样品中进行定量分析的实验方法，并且证明此方法依然可以实现极佳的定量准确度和精确度(图6)。　　图4|瓜氨酸化标准肽段测试DiLeu标记和生物素硫醇标记分步反应的特异性和效率　　图5|瓜氨酸化标准肽段测试DiLeu标记和生物素硫醇标记定量分析的准确性　　图6|复杂生物样品测试DiLeu标记和生物素硫醇标记定量分析的准确度和精确度　　作者接下来应用该方法对DNA损伤中瓜氨酸化的作用进行了研究。作者在MCF7细胞中用三种方法造成了DNA损伤，并定量分析了蛋白质瓜氨酸化的变化。作者一共鉴定到63种瓜氨酸化蛋白以及其包含的78个瓜氨酸化位点，并发现三个实验组中的瓜氨酸化表达相比于对照组呈现出非常不同的趋势(图7A)，这一结果表明瓜氨酸化在不同类型的DNA损伤模型中具有差异性的作用。通过对实验组中显著变化的瓜氨酸化蛋白进行生物过程网络分析，作者发现瓜氨酸化主要对DNA代谢，蛋白结构变化，翻译以及DNA修复等过程进行调控(图 7B，7C)。该实验结果表明蛋白瓜氨酸化对DNA损伤以及相关发病机理具有非常重要的作用。　　图7|高通量定量分析研究瓜氨酸化在DNA损伤中的变化及作用(来源：Anal. Chem.)　　小结　　本文章介绍了一种生物素硫醇标签的设计和开发，该标签可与瓜氨酸化肽段发生特异性反应并极大地提高了瓜氨酸化的富集和检测效率。在使用标准肽和重组蛋白证明该方法的有效性后，作者进一步优化了从复杂生物样品中检测瓜氨酸化的实验过程。通过此方法对小鼠五个大脑区域和六个身体器官的蛋白质瓜氨酸化进行分析，作者鉴定出432个瓜氨酸化蛋白以及691个瓜氨酸化位点，这是迄今为止最大的数据集。该研究揭示了这种翻译后修饰可能在神经系统中发挥的关键作用，并表明它们在包括呼吸和糖酵解在内的许多代谢过程中也可能发挥着重要作用。总的来说，实验结果表明蛋白质瓜氨酸化在不同组织中具有广泛分布并参与各种生物过程，这扩展了目前对蛋白质瓜氨酸化生理作用的认知和理解。此外，作者进一步拓展了此方法的实用性，通过应用DiLeu等重标记策略第一次实现了瓜氨酸化的高通量定量研究，并利用这一方法揭示了瓜氨酸化在人体细胞DNA损伤及修复过程中的重要作用。更重要的是，该方法可以提供一种普适、简单而强大的检测方法来明确鉴定蛋白质瓜氨酸化，这也将启发和有益于未来对这种翻译后修饰在生理和病理条件下的功能作用的研究。　　相关研究成果近期发表在Analytical Chemistry上的两篇文章中, 通过生物素硫醇标签辅助质谱法对蛋白质瓜氨酸化进行全局分析文章的共同第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生石亚涛，李子辉，王斌，并与中国药科大学叶慧教授课题组合作 应用二甲基化亮氨酸等重标记策略进行蛋白质瓜氨酸化高通量定量研究文章的第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生李子辉，两篇文章通讯作者为李灵军教授。更多关于李灵军教授研究团队的最新研究进展欢迎登陆课题组网站：https://www.lilabs.org/

中国医学科学院北京协和医学院药物研究所贺玖明研究员团队以封底文章在《药学学报》英文刊（APSB）2022年第8期（IF：14.903）发表了题为“A temporo-spatial pharmacometabolomics method to characterize pharmacokinetics and pharmacodynamics in the brain microregions by using ambient mass spectrometry imaging”的研究论文，建立了一种时空分辨的代谢组学方法（基于AFADESI-MSI的时空药物代谢组学），可全景式描绘脑中药物代谢和效应的时空特征，为中枢神经系统作用新药研发提供了一种有力的可视化工具和新的视角。　　封底图 | 表征鼠脑中中枢神经药物的微区域药代动力学和药效学的时空代谢组学方法策略和工作流程　　研究背景　　中枢神经系统（CNS）具有复杂而脆弱的结构，在大脑的许多微区域之间具有高度的互连性和相互作用。大脑是人体复杂的器官，可以细分为许多微区域。脑中多种内源性功能代谢物在不同的微区分布不均匀。脑微区的代谢酶、受体、配体、蛋白和血流的功能差异也会导致药物的空间分布和疗效差异。大脑是中枢神经系统疾病的靶点，大多数中枢神经系统药品只有在进入大脑后才会发挥作用。因此了解药物及相关内源代谢物在大脑中的原位分布的信息对于评估药物疗效、毒理学和药代动力学具有重要意义。　　目前研究大脑的常用功能性脑成像技术（包括组织化学标记、免疫荧光、MRI、PET、全身放射自显影等），仅提供脑组织结构的图像，不能在分子水平上进行分析，可监测的物质种类也有限。另一方面，脑内药物分析通常使用的基于组织匀浆或微透析采样的高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）技术获得的结果仅能反映采样微区的平均代谢水平，而缺乏分子在整个大脑中的空间分布的信息。质谱成像技术（MSI）不需要复杂的预处理和特殊的化学标记，具有高通量、高灵敏度和高分辨率的特点，可检测已知或未知小分子代谢物的定性、定量和空间分布信息。　　本研究使用AFADESI-MSI空间代谢组学研究表征了临床中枢神经系统药物奥氮平（OLZ）和大鼠脑内内源性代谢物，并进行了给药期间的时空变化以及脑微区药物动力学和药效学研究，成功地展示了OLZ及其作用相关代谢物的时空特征，并为中枢神经系统药物作用的分子机制提供了新的见解。　　研究思路　　研究方法　　1. 实验分组/研究材料：饲养一周的雄性 Sprague-Dawley 大鼠　　（1） 实验组：4组（3只/组），口服OLZ溶液（50mg/mL）后 20 分钟、50 分钟、3 小时和 12 小时用高浓度乙醚。　　（2） 对照组：1组，3只/组　　2.技术路线　　2.1. 鼠脑的微区划分：15个微区，包括尾状壳核（CP）、大脑皮质（CTX）、海马（HP）、下丘脑（HY）、丘脑（TH）、小脑皮质（CBC）、小脑髓质(CM)、髓质 (MD)、脑桥 (PN)、大脑导水管 (CA)、中脑 (MB)、穹窿 (FN)、梨状皮质 (PC)、嗅球 (OB) 和胼胝体 (CC)。　　2.2 质谱成像：AFADESI-MSI分析（全扫描及MS2扫描）　　2.3代谢物定性：人类代谢组数据库 (www.hmdb.ca)、Metlin、MassBank和LIPID MAPS　　研究结果　　1.通过AFADESI-MSI绘制大鼠大脑中的内源性代谢物和药物图谱　　无论是正离子模式还是负离子模式，使用AFADESI-MSI空间代谢组学均可从治疗组和对照组脑组织切片中获得内源性代谢物信息。在100-500 Da的低质量范围内，可以检测到氨基酸、核苷、核苷酸、有机酸、脂肪酸等极性小分子代谢物和γ-氨基丁酸 (GABA)、肌酸、肉碱、乙酰肉碱和磷脂酰胆碱等神经递质类代谢物；在500-1000 Da的高质量范围内，可以检测到一些脂质，包括鞘磷脂（SM）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）、溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）和磷脂酰肌醇 (PI) 等。原型药物 OLZ 及其代谢物 2-羟甲基 OLZ 在正离子模式下被检测，结果如图1C1和D1所示。这些结果表明，非靶向质谱成像的方法可以在一次实验中同时绘制外源性药物和内源性代谢物的图谱，并可以获得它们的空间分布特征和微区域丰度变化。　　图1 | 使用 AFADESI-MSI 从脑组织切片获得的外源性药物和内源性代谢物的质谱成像结果　　2.鼠脑中奥氮平（OLZ）及其代谢物的时空变化　　OLZ是一种用治疗精神分裂症的药物，大脑是其主要靶器官。本实验为探究给药时间药物在大脑各功能微区的分布情况，分别在给药后20 min、50 min、3 h和12 h收集治疗组和对照组大鼠脑组织进行MSI分析。OLZ 及其代谢物 2-羟甲基 OLZ 的在鼠脑分布结果如图2A所示。　　这些结果表明，OLZ 可以很容易地穿透脑血屏障，主要分散在脑室和脑实质组织中，但并不是均匀分布在大脑的所有微区域中。给药后20分钟发现OLZ主要分布在大脑皮质中。50分钟后，OLZ的水平显著增加。随着时间的推移，大脑中的药物信号迅速下降到成像检测限以下。同时作者发现，2-羟甲基OLZ主要分布在穹窿中，其在各个微区的分布格局与OLZ不同。　　这些结果表明，OLZ药物的吸收、分布和代谢的速率在大脑的不同微区不同，表明微区对药代动力学有影响。它还证明了所提出的基于AFADESI-MSI 的时空药物代谢组学方法能够同时说明药物及其代谢物在大脑复杂微区域中的水平和空间分布的变化。　　图2 | 脑微区OLZ和其代谢产物2-羟甲基OLZ的时空变化　　3.OLZ 对神经递质类代谢物的的微区调控　　OLZ药物治疗精神分裂的作用机制是阻断多巴胺 D2 受体或血清素 2A 受体调节神经递质类代谢物（NTs）。然而OLZ的微区效应和分子作用机制仍不清楚。因此作者分析了与OLZ生理活动密切相关的NTs的时空变化，包括GABA、Glu、谷氨酰胺 (Gln) 和腺苷。NTs的AUC变化率如图3B1-B7所示。　　GABA（γ-氨基丁酸）是中枢神经中的一种神经递质，可抑制神经中枢。空间代谢组检测结果显示GABA（m/z 104.0706）主要分布在下丘脑中，药物干预后下丘脑的 GABA 受到轻微调节。但同时在梨状皮质和嗅球中观察到药物干预后GABA显著上调。Glu 是中枢神经中的一种主要神经递质，对神经细胞具有兴奋作用。在药物干预后，Glu及其代谢物Gln的时空动态模式在脑部微区中呈现出相对一致的变化趋势。腺苷广泛分布在中枢神经系统中，是大脑中的一种兴奋性和抑制性神经递质，并在脑中不均匀分布。并且在给药3小时后海马和下丘脑中的高水平腺苷显著增加，表明当药物积累时腺苷的上调会更加明显。组胺、乙酰胆碱（Ach）、牛磺酸等神经递质类物质都有各自特征的微区分布，以及在给药后具有上调的趋势。　　上述神经递质类物质的靶向成像分析结果表明，该方法可以检测到与中枢神经药物作用机制相关的大量原型药物及其代谢物和内源性代谢物的空间分布和变化。这对于阐明中枢神经系统药物的作用机制和了解精神分裂症及相关疾病具有重要意义。　　　图3 | 药物对脑内NTs分布和AUC变化率的影响　　4. OLZ 药物干预的微区代谢调控　　组织和器官的内源性代谢变化可以反映药物刺激的效果。为探索药物干预后的微区代谢效应，通过药物代谢组学测试研究了内源性代谢物的分子谱及其动态变化的分布信息。分别在OLZ和生理盐水给药后 50分钟采集每组治疗和对照大鼠的三个脑组织样本进行微区域分析。　　OPLS-DA结果表明，基于正离子模式和负离子模式下脑微区的定量分析，对照组和治疗组分别明显分开。总共筛选和鉴定了 90 种差异内源性代谢物，作为药物作用相关效应物,它们在大脑微区域中发挥了巨大作用。其中81种被MS2鉴定，9 种被同位素模式鉴定。差异代谢物包含了很多种类型的代谢物，包括氨基酸、脂肪酸、甘油磷脂、有机酸、多胺和酰基肉碱。　　经过分析确定了治疗组和对照组之间显著差异的七种代谢途径，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、甘油磷脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸生物合成、嘌呤代谢和柠檬酸循环（TCA循环）。下面对影响较大的丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和甘油磷脂代谢的异常代谢途径进行重点分析。　　图4 | 对照组和治疗组中鉴定的差异代谢物的层次聚类分析 (HCA)　　4.1 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢紊乱　　异常的Glu-Gln循环在精神分裂症的病理生理过程中起重要作用。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径代谢物在老鼠脑的时空分布如图5所示。柠檬酸在大脑大部分微区分布均匀；与对照组相比，表达显著提高，结果提示药物干预加速了TCA循环的代谢，为机体提供了更多能量。Glu也均匀分布在各个微区，药物干预后呈下调趋势。它的代谢物Gln 和 GABA，主要在下丘脑和的多个微区中上调。　　根据通路分析和代谢谷氨酸脱羧酶（GAD）酶反应，推测OLZ直接激活GAD促进GABA合成。GABA可增加糖酵解中己糖激酶的活性，从而加速葡萄糖的代谢。空间分布结果表明葡萄糖分布在大脑的所有微区，但给药后主要分布在梨状皮质和嗅球中，给药后20分钟血糖水平显著升高。　　图5 | 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径代谢物的时空分布　　4.2.甘油磷脂代谢途径的紊乱　　甘油磷脂有助于控制肝脏脂质代谢，促进记忆力，增强免疫力，延缓衰老。甘油磷脂代谢途径代谢物的时空分布如图6。这项研究的结果表明，在给药后，大多数脂质在大多数微区域中显示出上调。OLZ在临床应用中具有代谢副作用，如体重增加、血脂异常、高甘油三酯血症和胰岛素抵抗。实验结果证明，脂质代谢的上调可能导致OLZ治疗期间的副作用。　　图6 | 甘油磷脂代谢途径代谢物的时空分布　　相关讨论　　作者开发的时空药物代谢组学方法，使用质谱成像技术MSI来表征大脑中枢神经药物的药代动力学和药效学。结果表明，该方法可有效识别与药物作用相关的内源性分子效应物。评估OLZ药物对脑组织的微区域效应，并证明其穿过血脑屏障后的微区域药代动力学和药效学方面的有效性。该方法清楚地展示了原型药物及其代谢物 2-羟甲基OLZ在大鼠大脑不同微区的药代动力学。也在脑部微区现一些神经递质类物质和其它小分子极性代谢物，并显示出与药物干预相关的多种代谢途径。发现天冬氨酸、谷氨酸和甘油磷脂代谢途径的调节可能与 OLZ 临床使用观察到的治疗和不良反应有关，为了解其作用的分子机制提供了关键信息。　　小鹿　　与基于LC-MS的常规药物代谢组学分析手段相比，基于AFADESI-MSI的时空药物代谢组学技术具有同时检测内源性和外源性物质的静态水平变化，并提供大脑不同微区的动态时间依赖性趋势和空间分布信息的优势，能够非常准确地呈现原位和微区域分子变化规律。在此基础上将药代动力学和药效学与代谢途径相关联，有利于获得关键信息，从而更深入地了解药物作用的分子机制。基于AFADESI-MSI 的时空药物代谢组学技术不仅是阐述中枢神经系统药物的原位药代动力学和药效学全面有效的工具，也可为脑组织内源性代谢物的变化以及其它动物组织的原位代谢研究提供重要信息。　　该研究工作，药物所2017级硕士研究生刘丹为作者，贺玖明研究员为独立通讯作者。工作得到国家自然科学基金和医科院创新工程项目的资金资助。

DNA中的5-甲基胞嘧啶（5mC）是生物学领域基本的表观遗传标记，对调节基因表达至关重要。5mC不仅是多个生物学领域的研究重点，而且在临床上，5mC的异常甲基化模式与包括癌症在内的多种疾病的发生发展密切相关，为疾病的早期诊断和监测提供了有效的生物标志物。对5mC位点的精准检测对基础研究和疾病检测的准确性至关重要。尽管亚硫酸氢盐测序（BS-seq）技术在基础研究和临床上应用广泛，但目前用于5mC检测的常规BS-seq方法有明显缺陷：1）反应时间长，限制了其在临床上的快速检测。2）在高GC DNA区域或高度结构化的DNA（例如线粒体DNA），C到U的转化不完全，导致高背景和假阳性。3）DNA降解严重，对微量的样品如cell-free DNA（cfDNA）的检测带来挑战。4）常规BS处理造成非甲基化的区域优先降解，使得甲基化水平被高估。在临床上能用小量样品进行快速而准确地检测5mC一直是DNA表观遗传领域的一项挑战。而用于RNA m5C 检测的BS-seq同样困难重重。RNA的降解问题尤其严重。RNA的二级结构或稳定的RNA（比如tRNA）导致严重的高背景和假阳性。目前还缺乏准确有效的检测m5C的方法。2024年1月2日，芝加哥大学何川团队在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Ultrafast bisulfite sequencing detection of 5-methylcytosine in DNA and RNA 的研究论文。该研究开发出了对微量DNA和RNA上的5-甲基胞嘧啶修饰进行快速，准确检测的测序方法——Ultrafast Bisulfite Sequencing（简称为UBS-seq）。何川课题组的戴庆博士根据BS-seq的机理以及由于BS反应而造成的DNA降解机制，发现用亚硫酸氢铵盐代替钠盐可以大大提高BS的效率，C能够在几分钟内完全转化为U而5mC保持不变（图1a），并且由于反应的时间大为缩短，DNA的降解也显著降低（图1b）。UBS-seq测序背景噪音比常规BS-seq降低10倍以上，并且UBS-seq整体转化效率更加一致（图1d）。图1：UBS-seq在DNA样品上的的转化效率UBS-seq不仅可以用于微量mESC基因组的测序，还可用于极少量细胞样品，甚至单细胞，在背景噪音和假阳性等方面要比常规BS-seq低得多。研究团队进一步应用UBS-seq来比对早期结直肠癌病人组和对照组的血液中提取的cfDNA 样品，发现明显的甲基化区别。这些结果显示UBS-seq在寻找5mC作为疾病的早期诊断的指标方面具有广泛的应用前景。另外，由于具有快速且能减少DNA的降解而特别适用于小量样品的特点，UBS-seq在从少量样品中检测已知的5mC疾病指标，以及在临床快速诊断和手术中的实时决策方面，具有独特的优势和应用前景。除了快速准确检测DNA中的5mC外，UBS-seq也可以用于快速准确检测RNA中的m5C。m5C广泛存在于多种类型的RNA中，影响细胞功能，并在多种癌症中发挥重要作用。然而，由于缺乏灵敏、准确的定量测序方法，m5C在不同RNA类型上的位置及化学计量一直有争论。与DNA中的5mC相比，mRNA中m5C的修饰位点以及修饰水平要低得多，因此如何避免常规 BS-seq中所产生的假阳性，降低RNA降解从而精准地检测到m5C位点并定量其修饰比例，一直是 RNA BS-seq 的主要挑战。研究人员进一步优化了UBS-seq 的配方，发现在98度下加热9分钟后，rRNA上所有的C位点的未转化率（背景噪音）仅有1%，而两个已知的m5C位点的未转化率（阳性信号）高达95%（图2a）。UBS-seq在rRNA样品上的准确性大大优于几种已发表的m5C BS-seq 方法（图2b）。随后研究团队将UBS-seq应用于具有复杂二级结构的tRNA，检测并且观察到NSUN2修饰位点的修饰比例能响应NSUN2基因的敲除（图2c），进一步验证了BS-seq的有效性和准确性。研究人员用UBS-seq对HeLa和HEK293T的mRNA进行了测序，发现了近两千多具有保守序列模式的位点（图2d）。随着NSUN2基因敲除，绝大多数m5C位点的修饰比例下降（图2e）。当把NSUN2的基因再转入敲除的细胞后，m5C位点的修饰比例又回升了（图2f）。这些结果证明了m5C UBS-seq 方法不仅非常灵敏高效，而且非常准确。为研究m5C的生物功能提供了有力的工具。图2：UBS-seq在RNA样品上的的转化效率，以及不同类型RNA上m5C位点的检测何川教授的团队近年来相继开发出了SAC-seq用于定量检测m6A，BID-seq用于定量检测等测序新方法，极大的促进了表观转录学领域的发展。随着UBS-seq的发表，将会进一步促进m5C的生物功能的研究，并和SAC-seq，BID-seq一起引领RNA表观转录组领域步入新的阶段。

汞及其化合物是一种具有慢性剧毒的环境污染物，其存在的形态不同毒性有所区别，有机汞的毒性比无机汞强，尤其甲基汞毒性更是无机汞的几百倍。环境中，特别是土壤中的无机汞容易在微生物和化学作用下甲基化转化成有机汞。转化成的有机汞难以降解分离，容易迁移至土壤种植的农作物中，并通过食物链富集进入到人体而对人类健康构成威胁。因此，土壤污染状况详查除了需要测定总汞的含量之外，不同形态汞的准确定量分析也有极其重要的意义，更能正确评估土壤的重金属污染程度和潜在风险。 HPLC-ICP-MS 联用技术具有较高的分离能力和灵敏度，是形态汞分析的主要技术，本文建立了使用岛津高效液相色谱 LC-20Ai 和电感耦合等离子体质谱 ICPMS-2030 联用测定农田土壤中甲基汞和乙基汞含量的方法。方法以0.5 mol/L的硝酸溶液为浸提剂，前处理简单快速，检出限低，甲基汞和乙基汞的检出限分别为0.16 μg/L和0.21 μg/L，定量准确，可满足农田土壤中甲基汞和乙基汞含量的同时分析。 岛津电感耦合等离子体质谱 ICPMS-2030 了解详情，敬请点击《酸浸提-HPLC-ICP-MS 法测定农田土壤中的甲基汞和乙基汞》关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司，在中国全境拥有13个分公司，事业规模不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心，并拥有覆盖全国30个省的销售代理商网络以及60多个技术服务站，已构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。本公司以“为了人类和地球的健康”为经营理念，始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务，为中国社会的进步贡献力量。

葡萄酒，味香色美，很多人的最爱！那葡萄酒是不是越陈越好呢？理论上，葡萄酒是一种有生命的东西，装瓶后仍然会继续成熟和变化。在良好的储藏条件下，葡萄酒会在岁月的历练中使得单宁酸逐渐柔顺圆润，酒香更加富有深度，口感也更为均衡协调。 事实上，大部分（99%）葡萄酒不具有陈年能力，最佳饮用期一般在2—10年之间。只有少部分特别好的葡萄酒才具有陈年能力。不具陈年能力的葡萄酒在不适宜的环境中长期存储不仅口感不会变好，而且还有可能产生5-羟甲基糠醛（5-HMF）。 5-羟甲基糠醛是一种黑色的具有难闻气温的有毒物质，对人体横纹肌及内脏有损害，且具有神经毒性，能与人体蛋白质结合产生蓄积中毒。葡萄酒在生产及不合适的储存条件下不可避免会发生热降解反应，从而导致5-羟甲基糠醛的产生或含量增加。2017年7月1日SN/T 4675.8-2016《出口葡萄酒中5-羟甲基糠醛的测定 液相色谱法》开始实施，葡萄酒中5-羟甲基糠醛的含量成为国际贸易中判断葡萄酒优劣的重要指标。 大连依利特分析仪器有限公司，参考SN/T 4675.8-2016《出口葡萄酒中5-羟甲基糠醛的测定 液相色谱法》，对5-羟甲基糠醛进行了检测。仪器配置色谱条件流动相：甲醇:水=10:90色谱柱：依利特C18色谱柱流量：1.0mL/min检测波长：285nm进样体积：10μL柱温：30℃实验结果

近日，中科院高能所李玉锋研究员团队，以硒超富集植物-堇叶碎米荠（Cardamine violifolia）单粒种子为研究对象，借助北京同步辐射装置X射线荧光微分析实验站硬件和软件功能升级契机，发展了基于同步辐射X射线荧光二维/三维成像技术（SRXRF）、X射线吸收谱技术、二维质谱成像技术（MALDI-MSI）及微区计算机断层扫描（micro-CT）等技术的空间金属组学（spatial metallomics）研究框架，实现了堇叶碎米荠单粒种子中有机硒和无机硒的原位二维/三维研究，首次发现堇叶碎米荠种皮中存在甲基硒代化合物，加深了对堇叶碎米荠富硒机制的理解，并以Spatial metallomics reveals preferable accumulation of methylated selenium in a single seed of the hyperaccumulator Cardamine violifolia为题发表于 Journal of Agricultural and Food Chemistry（影响因子/JCR分区：5.895/Q1）。该研究工作得到岛津中国创新中心的实验支持。图1 Journal of Agricultural and Food Chemistry原文背景介绍硒(Se)是动物和人类必需的元素。它是硒蛋白和硒酶的重要组成部分，硒缺乏会增加各种神经、内分泌和癌症风险，更严重的是，会导致器官衰竭和死亡。世界卫生组织(WHO)和美国农业部建议成人每日膳食硒摄入量为55 ~ 200 μg。然而，在一些地区，人们的日摄入量明显低于推荐剂量(仅26 μg/天)，因此，探索富硒膳食补充剂来改善人们日常硒的摄入是很有必要的。图2 堇叶碎米荠硒在植物生长周期内无法被消耗，一些百合科、十字花科和豆科植物可累积高达几千毫克/公斤的硒元素。原产于中国湖北省恩施市的堇叶碎米荠（Cardamine violifolia）已被证明是硒的超富集植物，已用作膳食补硒剂原料。&bull 单粒种子中硒的原位空间分布和形态分布堇叶碎米荠对于硒元素的耐受性和超积累的机制主要包括:(1)钙蛋白和富半胱氨酸激酶的表达下调和硒结合蛋白的表达上调 (2)体内解毒硒的泛素基因或蛋白的表达 (3) 堇叶碎米荠硒的特定代谢途径。研究发现堇叶碎米荠可以通过硫酸盐转运体和各种S/Se代谢酶来积累硒元素。而堇叶碎米荠中硒元素的主要存在形态为硒代半胱氨酸（SeCys），硒代蛋氨酸（SeMet），硒代羊毛硫氨酸，甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys），甲基硒代蛋氨酸（MeSeMet），二甲基硒醚（DMSe）和二甲基二硒醚（DMDSe）等。图3 通过SRXRF和MALDI-MSI研究硒在单粒种子中的原位空间分布和形态研究结果表明，一方面SRXRF结果显示硒元素在整个种子中都有分布，子叶中硒含量相对高于外胚层/种皮；另一方面MALDI-MSI结果显示DMSe (m/z 107.970)、MeSeCys (m/z 184.019)和MeSeMet (m/z 212.983)主要存在于种子外胚层。硒植物毒性的一个突出原因被认为是硒氨基酸(如SeCys)错掺入蛋白质。已有研究表明，甲基化SeCys形成MeSeCys是Se超富集物的一个关键耐受机制之一， 这大大减少了非特异性取代蛋白质中的Cys的SeCys的数量。本研究中MeSeCys的发现证实了这也是堇叶碎米荠的Se耐受的重要机制之一。质谱成像MALDI-MSI方法本研究中的质谱成像部分使用岛津iMScope QT (Shimadzu, Kyoto, Japan)进行。MALDI-MSI在光学显微镜的帮助下确定所需的采集区域，用激光二极管激发的掺钕钇铝石榴石(Nd/YAG)激光(355 nm)照射种子组织切片。激光直径为40 μm，扫描步长为80 μm。对每个像素进行100次激光照射(1000 Hz重复频率)。所有数据均在正负模式下分别采集，采集范围分别为m/z 100 ~ 500和m/z 500 ~ 1000。利用IMAGEREVEAL MS分析软件对所采集的数据进行图像分析，最终得到显示多种形态硒的具体分布。图4 岛津新一代成像质谱显微镜——iMScope QT本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

沃特世ACQUITY UPLC H-CLASS-PDA系统和ACQUITY UPLC/Xevo TQ MS系统分析饮料中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量 赵嘉胤.蔡麒.孙庆龙 引言 焦糖色素是一种允许使用的着色剂，我国对焦糖色使用量的规定除个别产品外均为按生产需要适量使用，其中规定仅有亚硫酸铵法生产地焦糖色允许使用在碳酸饮料中。而以加氨或其铵盐制成的焦糖（Ⅲ类氨法焦糖和Ⅳ类亚硫酸铵法焦糖）会产生4-甲基咪唑，并且4-甲基咪唑是一种能够诱发肿瘤的高水平的化学物质。 焦糖色素被广泛用于食品以及饮料中，所以4-甲基咪唑的含量监控也是必须被重视的，由于4-甲基咪唑分子极性很大，含量很低，所以如何快速、准确地检测出其含量，就成为人们现阶段研究的重点。目前我国国家标准中只有《焦糖色中的4-甲基咪唑的测定-高效液相色谱法》，而对于饮料中的4-甲基咪唑则没有相关检测方法。 沃特世（Waters® ）公司所提供的整体解决方案，同时来监控饮料中的4-甲基咪唑以及2-甲基咪唑。使用沃特世SPE的固相萃取策略来对于复杂的样品基质进行净化，完成对于4-甲基咪唑以及2-甲基咪唑的提取浓缩，而沃特世HILIC模式的色谱保留，对于极性分子的色谱分离提供完美的效果，最后通过UPLC® H-CLASS PDA以及UPLC/Xevo® TQ MS的分析，完成出色的定性定量工作。 实验条件 样品前处理方案 固相萃取SPE解决方案&mdash &mdash Oasis® MCX (3cc/60mg) 小柱净化取3g饮料样品，超声5分钟,后待净化。 ACQUITY UPLC H-CLASS PDA超高效液相色谱分离条件： 色谱柱： ACQUITY UPLC® BEH HILIC Column 2.1x100 mm,1.7&mu m 流动相 A： 乙腈 流动相 B： 5mM甲酸铵 柱温： 35˚ C 检测波长： 215nm 进样量： 5&mu L 运行时间： 3min 梯度表： Time (min) Flow (mL/min) %A Curve 0.00 0.5 80 6 3.00 0.5 80 6 ACQUITY UPLC Xevo TQ MS超高效液相色谱-串联质谱分析条件： 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH HILIC Column 2.1x100 mm,1.7&mu m 流动相 A： 乙腈 流动相 B： 5mM 甲酸铵 柱温： 35˚ C 进样量： 2&mu L 运行时间： 3min 梯度表： Time (min) Flow (mL/min) %A Curve 0.00 0.5 80 6 3.00 0.5 80 6 实验结果及讨论 1、ACQUITY UPLC H-CLASS PDA分析 混合标准品色谱图 饮料空白样品图 基质添加回收色谱图 2、ACQUITY UPLC/Xevo TQ MS分析 混合标准品TIC 3.2.3 茶饮料样品加标与空白对比分析 3.2.4 可乐样品加标与空白对比分析 通过分析结果可以看出，4-甲基咪唑和2-甲基咪唑分子极性很大，一般反相很难保留，多用离子对试剂来增加保留，但由于离子对色谱方式平衡时间很长，增加整体分析周期，同时对于色谱柱以及仪器的损耗很大，最关键是无法进行有效的质谱方法分析。而沃特世公司HILIC模式的极性分析方案可以非常好的进行极性分子的保留，流动相简单，优异兼容质谱条件，使4-甲基咪唑和2-甲基咪唑有非常好的分离效果以及灵敏度。 同时由于目标化合物极性很大，对于前处理的要求非常高，分离提取是个难点，而沃特世公司的固相萃取方案能使样品达到非常好的净化效果，通过Oasis MCX进行保留分离，同时能够减少样品杂质对于色谱柱以及整个仪器系统的损害。由沃特世ACQUITY UPLC H-CLASS-PDA和ACQUITY UPLC / Xevo TQ MS所提供的超高效性能以及灵敏度，使得4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的分析达到理想效果。 结论 1.采用ACQUITY UPLC H-CLASS-PDA和ACQUITY UPLC / Xevo TQ MS可以快速高效地对4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的含量进行测定，ACQUITY UPLC H-CLASS-PDA灵敏度可以达到1mg/kg，ACQUITY UPLC / Xevo TQ MS灵敏度可以达到1&mu g/kg。 2.应用沃特世固相萃取SPE解决方案配合HILIC模式色谱保留，对于大极性的小分子有很好的保留以及分离提取的作用，达到理想净化效果以及色谱分离效果。 3.从样品前处理到样品色谱质谱分析的整体解决方案，给客户提供一体化的服务解决样品分析过程中可能遇到的所有问题，帮助客户成功！ 关于沃特世公司 (www.waters.com) 50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。 作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。 2011年沃特世公司拥有18.5亿美元的收入，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。 联系方式： 叶晓晨 沃特世科技（上海）有限公司 市场服务部 xiao_chen_ye@waters.com 周瑞琳(GraceChow) 泰信策略(PMC) 020-83569288 13602845427 grace.chow@pmc.com.cn

中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所“天然药物活性物质与功能”国家重点实验室再帕尔•阿不力孜研究员团队，在《药学学报》英文刊（Acta Pharmaceutica Sinica B）发表了题为“时空分辨代谢组学与同位素示踪方法揭示中枢神经系统药物靶标”的研究论文。由于大脑结构与功能的复杂性，中枢神经系统（CNS）药物的作用机制研究及其靶标的发现与解析是具有挑战性的科学问题。围绕天然来源药物多靶标解析及其CNS药物的作用机制研究，该研究团队采用自主研制的敞开式空气动力辅助离子化质谱成像（AFADESI-MSI）技术，提出将空间分辨代谢组学与同位素示踪分析方法进行整合的研究策略，采用建立的质谱成像可视化分析方法开展了镇静催眠候选新药YZG-331的药物作用机制与多靶标解析研究。研究基于高灵敏、高覆盖的AFADESI-MSI分析方法，系统考察了YZG-331干预下内源性代谢物在大鼠脑微区中的时空动态分布特征，结合原位代谢组学数据处理方法，发现与YZG-331药物作用相关的功能代谢物，并由此定位至两条代谢通路。其中，“谷氨酰胺-谷氨酸-GABA”代谢通路分析与同位素葡萄糖示踪分析二者结果同时显示，GABA/谷氨酸比值在下丘脑区明显升高，则表明给予YZG-331后下丘脑中谷氨酸脱羧酶（GAD）活性可能增强。而“组氨酸-组胺-1-甲基组胺”代谢通路分析与同位素组胺示踪分析二者结果共同表明，给药后松果体区大量增加的组胺主要来源于外周组胺的升高及其对松果体的渗透。此外，给药后1-甲基组胺在丘脑和下丘脑区显著增加。结合体外方法和模型的验证，发现YZG-331可激动GAD酶活性增加GABA含量，并通过激动有机阳离子转运体3（OCT3）和氨基酸转运体1（LAT1）在外周释放组胺，同时可能通过激动OCT3转运体以及利用大鼠脑内HNMT酶自身的高活性，加速组胺代谢为1-甲基组胺。研究手段与策略有助于阐释CNS候选新药的药效作用机制和发现潜在的多靶标，为CNS药物研发及有效性、安全性评价等提供新的视角和可视化分析手段。博士生金波和逄雪超博士为共同第一作者；贺玖明研究员和再帕尔•阿不力孜教授为该论文的共同通讯作者。研究工作得到了国家自然科学基金、中国医学科学院医学与健康科技创新工程等项目的资助。Spatiotemporally resolved metabolomics and isotope tracing reveal CNS drug targetsBo Jin, Xuechao Pang, Qingce Zang, Man Ga, Jing Xu, Zhigang Luo, Ruiping Zhang, Jiangong Shi, Jiuming He*, Zeper Abliz*Acta Pharm Sin B 2022. https://doi.org/10.1016/j.apsb.2022.11.011作者简介再帕尔阿不力孜，博士生导师，二级教授，《药学学报》英文刊编委。中国医学科学院药物研究所研究员、北京协和医学院特聘教授，“天然药物活性物质与功能国家重点实验室”副主任、药物分析学系主任、药物分析研究室主任。中央民族大学药学院教授、“质谱成像与代谢组学”国家民委重点实验室主任。新世纪百千万人才工程国家级人选，享受国务院特殊津贴专家，国家民委领军人才。国务院学位委员会第七届药学学科评议组成员，教育部第七届科学技术委员会委员和第八届科技委药学与中医药学部委员，中国分析测试协会副理事长，中国化学会质谱分析专业委员会副主任委员等。先后担任“863”计划项目首席专家、国家重点研发计划项目负责人。长期从事质谱分析新方法与技术及其应用研究，在PNAS、Adv Sci、Anal Chem、Acta Pharm Sin B等学术期刊上发表论文120余篇；这些年在代谢组学、质谱成像新技术、空间分辨代谢组学与应用等方面取得一批创新成果。贺玖明，博士生导师，药物分析专业；中国医学科学院北京协和医学院药物研究所研究员，主要研究方向：质谱成像空间分辨代谢组学新技术新方法及其生物医药应用研究。开发出空气动力辅助离子化及质谱成像新技术和空间分辨代谢组学新方法，建立了以空间分辨代谢组学技术为特色的新药代谢研究平台。国家药品监督管理局创新药物安全与评价重点实验室学委委员；担任《药学学报》、Acta Pharm Sin B、J Pharm Anal青年编委，Molecules、TMR Modern Herbal Medicine和《药学研究》编委；中国医药生物技术协会药物分析技术分会常务委员，中国质谱学会常务委员。å

生态环境部办公厅2020年12月31日发布《土壤和沉积物 甲基汞和乙基汞的测定 吹扫捕集/气相色谱-冷原子荧光光谱法（征求意见稿）》 (环办标征函〔2020〕62号) ，我国国内第一个土壤和沉积物中甲基汞和乙基汞的测定方法标准公开征求意见。 该标准的主要起草单位是由中国环境监测总站和江苏省环境监测中心，验证单位包括：山东省生态环境监测中心、广西壮族自治区生态环境监测中心、四川省生态环境监测总站、湖南省长沙生态环境监测中心、贵阳市环境监测中心站和合肥市环境监测中心站等七家单位。为什么需要对土壤和沉积物中的甲基汞和乙基汞进行测定呢？土壤中的汞主要包括金属汞、无机化合态汞和有机化合态汞。有机化合态汞以有机汞（烷基汞）和有机络合汞普遍存在。其中烷基汞主要包括甲基汞和乙基汞；甲基汞是有机汞中毒性最大的一种形态，甲基汞很容易穿过血脑屏障，对人神经系统进行侵害，尤其对妇女和儿童有很大的影响；土壤中的甲基汞易被植物吸收，通过食物链在生物体内富集，从而暴露给人体；而土壤中的腐殖质与汞结合形成的络合物不易被植物吸收。另外，乙基汞也属于亲脂性化合物，中毒后可引起急性肠胃炎以及造成严重的肾脏损伤等。土壤和沉积物中的甲基汞和乙基汞国内是否有相关限值控制标准？ 2018年6月，生态环境部与国家市场监督管理总局联合发布了《土壤环境质量 建设用地土壤污染风险管控标准(试行)》（GB36600—2018）国家环境质量标准，该标准于2018年8月1日正式实施，标准中明确了不同类型建设用地中甲基汞的筛选值和管制值，其中甲基汞在第一类用地的筛选值为5mg/kg。 目前国内暂无涉及土壤和沉积物中乙基汞的限值控制标准。《土壤和沉积物 甲基汞和乙基汞的测定 吹扫捕集/气相色谱-冷原子荧光光谱法（征求意见稿）》内容简介原理：土壤或沉积物样品经碱液提取后，提取液中的甲基汞和乙基汞经四丙基硼化钠衍生，生成挥发性的甲基丙基汞和乙基丙基汞，经吹扫捕集、热脱附和气相色谱分离后，再高温裂解为汞蒸气，用冷原子荧光光谱仪检测。根据保留时间定性，外标法定量。 方法检出限和定量下限：当取样量为0.5 g 时，甲基汞和乙基汞的方法检出限均为0.2 μg/kg，测定下限均为0.8 μg/kg 前处理过程：分析过程：标准曲线：8 个40 ml 棕色进样瓶，分别加入实验用水约35 ml，再分别加入0 pg，2.00 pg，5.00 pg，10 pg，50 pg，100 pg，500 pg，1500 pg的甲基汞和乙基汞混合标准溶液，，然后加入300 μl 乙酸-乙酸钠缓冲溶液及50 μl 四丙基硼化钠溶液（如果只进行甲基汞的分析，可加入四乙基硼酸钠溶液进行衍生化反应），迅速加入实验用水至瓶满，不留空隙，盖紧盖子静置10 min ～15 min。实际样品：40 ml 进样瓶中加入实验用水约35 ml 至瓶颈处，取试样150 μl 至进样瓶中，依次加入300 μl 乙酸-乙酸钠缓冲溶液及50 μl 四丙基硼化钠溶液（如果只进行甲基汞的分析，可加入四乙基硼酸钠溶液进行衍生化反应），最后迅速加入实验用水至瓶满，盖紧盖子静置10 min ～15 min 上机分析：标准内部验证和外部验证均采用美国知名仪器厂家Brooks Rand公司生产的MERX全自动烷基汞分析系统：MERX全自动烷基汞分析系统异位吹扫捕集，样品满瓶式进样，衍生化效率和烷基汞分析结果不受环境空气的影响三通道Tenax 捕集阱交替捕集，效率高液体传感器，水汽进入捕集阱会报警精密流量控制，气流波动小，避免因吹扫气流量过大造成大量水汽进入吸附阱或因流量过小造成的吸附不完全甲基汞检出限可达0.002ng/L；乙基汞检出限可达0.005ng/L宽线性范围：甲基汞0.0125-50ng/L，乙基汞0.025-50ng/L残留低：高浓度样品运行后仪器残留低于2‰重复性好，数据结果可靠国内销售数量超过300家，用户的普遍选择MERX全自动烷基汞分析系统同时还是《水质烷基汞的测定吹扫捕集/气相色谱-冷原子荧光光谱法》（HJ 977-2018）的验证仪器。该仪器数据质量稳定可靠，在国内饱受好评。谱图：质量控制：空白试验：每20 个样品或每批次样品（＜20 个/批）应至少做一个空白试样，空白试样的测定值应低于方法检出限(甲基汞和乙基汞的方法检出限均为0.2 μg/kg)校准：建议每次分析前均应建立工作曲线，若采用线性回归法，相关系数≥0.995；若采用响应因子法，校准系数RSD≤15%（工作曲线绘制后，每批样品测定时需要测定工作曲线中间浓度点的标准溶液，其相对误差值应该控制在±20%以内。否则，需重新绘制工作曲线）平行样：每20 个或每批次样品（＜20 个/批）应至少测定一个平行双样，测定结果的相对偏差应≤30%基体加标：每20 个样品或每批次样品（＜20 个/批）应至少测定一个基体加标样品或一个土壤或沉积物的有证标准物质。甲基汞加标回收率控制在75%～130%之间；乙基汞加标回收率控制在70%～120%之间标准物质测定：测定甲基汞有证标准物质的允许相对误差在﹣40%～+10%之间展望：本标准的检出限、精密度等性能指标能满足《土壤环境质量 建设用地土壤污染风险管控标准(试行)》（GB 36600-2018）的相应要求，相信该标准正式出台后，会使涉及土壤和沉积物中甲基汞和乙基汞分析检测的单位有据可依，并为相关分析检测人员提供新的思路和手段。 参考文献：1. 关于征求《土壤和沉积物 甲基汞和乙基汞的测定吹扫捕集/气相色谱-冷原子荧光光谱法》国家环境保护标准意见的通知 （链接：http://www.mee.gov.cn/xxgk2018/xxgk/xxgk06/202012/t20201231_815730.html）；2. 《土壤和沉积物 甲基汞和乙基汞的测定 吹扫捕集/气相色谱-冷原子荧光光谱法（征求意见稿）》及编制说明；3. 《土壤环境质量 建设用地土壤污染风险管控标准(试行)》（GB36600—2018）。

生态环境部办公厅2023年1月29日正式发布《土壤和沉积物 甲基汞和乙基汞的测定 吹扫捕集/气相色谱-冷原子荧光光谱法》（HJ 1269—2022），该标准为我国国内第一个土壤和沉积物中甲基汞和乙基汞的测定方法标准，标准将于2023年6月16日正式实施。 该标准的主要起草单位是由中国环境监测总站和江苏省环境监测中心，验证单位包括：山东省生态环境监测中心、广西壮族自治区生态环境监测中心、四川省生态环境监测总站、湖南省长沙生态环境监测中心、贵阳市环境监测中心站和合肥市环境监测为什么需要对土壤和沉积物中的甲基汞和乙基汞进行测定呢？土壤中的汞主要包括金属汞、无机化合态汞和有机化合态汞。有机化合态汞以有机汞（烷基汞）和有机络合汞普遍存在。其中烷基汞主要包括甲基汞和乙基汞；甲基汞是有机汞中毒性最大的一种形态，甲基汞很容易穿过血脑屏障，对人神经系统进行侵害，尤其对妇女和儿童有很大的影响；土壤中的甲基汞易被植物吸收，通过食物链在生物体内富集，从而暴露给人体；而土壤中的腐殖质与汞结合形成的络合物不易被植物吸收。另外，乙基汞也属于亲脂性化合物，中毒后可引起急性肠胃炎以及造成严重的肾脏损伤等。土壤和沉积物中的甲基汞和乙基汞国内是否有相关限值控制标准？ 2018年6月，生态环境部与国家市场监督管理总局联合发布了《土壤环境质量 建设用地土壤污染风险管控标准(试行)》（GB36600—2018）国家环境质量标准，该标准于2018年8月1日正式实施，标准中明确了不同类型建设用地中甲基汞的筛选值和管制值，其中甲基汞在第一类用地的筛选值为5mg/kg。目前国内暂无涉及土壤和沉积物中乙基汞的限值控制标准。《土壤和沉积物 甲基汞和乙基汞的测定 吹扫捕集/气相色谱-冷原子荧光光谱法》（HJ 1269—2022）内容简介原理：土壤或沉积物样品经碱液提取后，提取液中的甲基汞和乙基汞与四丙基硼化钠发生衍生化反应，生成挥发性的甲基丙基汞和乙基丙基汞，经吹扫捕集、热脱附和气相色谱分离后，再高温裂解为汞蒸气，用冷原子荧光光谱法测定。根据保留时间定性，外标法定量。 方法检出限和定量下限：当取样量为0.5 g 时，提取液体积为 30 ml 时，甲基汞和乙基汞的方法检出限均为0.2 μg/kg，测定下限均为0.8 μg/kg 前处理过程：分析过程：标准曲线：8 个40 ml 棕色进样瓶，分别加入实验用水约35 ml，再分别加入0 pg，2.00 pg，5.00 pg，10 pg，50 pg，100 pg，500 pg，1000 pg的甲基汞和乙基汞混合标准溶液，，然后加入300 μl 乙酸-乙酸钠缓冲溶液及50 μl 四丙基硼化钠溶液，迅速加入实验用水至瓶满，不留空隙，盖紧盖子静置20 min实际样品：40 ml 进样瓶中加入实验用水约35 ml 至瓶颈处，取试样150 μl 至进样瓶中，依次加入300 μl 乙酸-乙酸钠缓冲溶液及50 μl 四丙基硼化钠溶液，最后迅速加入实验用水至瓶满，盖紧盖子静置20 min 上机分析：标准内部验证和外部验证均采用美国知名仪器厂家Brooks Rand公司生产的MERX全自动烷基汞分析系统：异位吹扫捕集，样品满瓶式进样，衍生化效率和烷基汞分析结果不受环境空气的影响三通道Tenax 捕集阱交替捕集，效率高液体传感器，水汽进入捕集阱会报警精密流量控制，气流波动小，避免因吹扫气流量过大造成大量水汽进入吸附阱或因流量过小造成的吸附不完全甲基汞检出限可达0.002ng/L；乙基汞检出限可达0.002ng/L宽线性范围：甲基汞0.0125-50ng/L，乙基汞0.025-50ng/L残留低：高浓度样品运行后仪器残留低于2‰重复性好，数据结果可靠国内销售数量超过350家，用户的普遍选择来源：《土壤和沉积物 甲基汞和乙基汞的测定 吹扫捕集/气相色谱-冷原子荧光光谱法（征求意见稿）》编制说明第65页MERX全自动烷基汞分析系统同时还是《水质烷基汞的测定吹扫捕集/气相色谱-冷原子荧光光谱法》（HJ 977-2018）的验证仪器。该仪器数据质量稳定可靠，在国内饱受好评。 谱图：质量控制：空白试验：每20 个样品或每批次样品（＜20 个/批）应至少做一个空白试样，空白试样的测定值应低于方法检出限(甲基汞和乙基汞的方法检出限均为0.2 μg/kg)校准：每次分析样品前均应建立不少于 6 个点的校准曲线，采用线性回归法计算结果，曲线的相关系数≥0.995；采用校准系数法计算结果，校准系数 CFi的相对标准偏差≤15%。每20 个样品测定一个校准曲线中间浓度点的标准溶液，其相对误差值应该控制在±20%以内，否则应重新建立校准曲线平行样：每 20 个或每批次样品（少于 20 个样品）应至少测定 1 个平行双样，平行双样测定结果的相对偏差应在±30%以内基体加标：每 20 个样品或每批次样品（少于 20 个样品）应至少测定 1 个基体加标样品或1 个有证标准物质。甲基汞加标回收率控制在 75%～130%之间；乙基汞加标回收率控制在 65%～120%之间 展望：本标准的检出限、精密度等性能指标能满足《土壤环境质量 建设用地土壤污染风险管控标准(试行)》（GB 36600-2018）的相应要求，该标准会使涉及土壤和沉积物中甲基汞和乙基汞分析检测的单位有据可依，并为相关分析检测人员提供新的手段。 参考文献：1. 土壤和沉积物 甲基汞和乙基汞的测定 吹扫捕集/气相色谱-冷原子荧光光谱法 （HJ 1269—2022）（链接：https://www.mee.gov.cn/ywgz/fgbz/bz/bzwb/jcffbz/202301/t20230128_1014026.shtml）；2. 土壤和沉积物 甲基汞和乙基汞的测定 吹扫捕集/气相色谱-冷原子荧光光谱法（征求意见稿）及编制说明（链接：http://www.mee.gov.cn/xxgk2018/xxgk/xxgk06/202012/t20201231_815730.html）；3. 土壤环境质量 建设用地土壤污染风险管控标准(试行)（GB36600—2018）。

炎症是机体对抗感染及组织损伤反应的一个重要组成部分，但失控的炎症可导致各种疾病发生，并促进癌症形成。　　报道：炎症是机体对抗感染及组织损伤反应的一个重要组成部分，但失控的炎症可导致各种疾病发生，并促进癌症形成。由德克萨斯大学MD安德森癌症中心领导的一项新研究，有可能会让罹患多发性硬化症（MS）和其他炎症性疾病的患者受益。这项研究描述了一个叫做Trabid的蛋白质调控因子，是导致多发性硬化症患者中枢神经系统自身免疫性炎症这一谜团中一个重要的部分。研究结果发表在Nature Immunology杂志上。 文章作者，德克萨斯大学MD安德森癌症中心免疫学教授Shao-Cong Sun表示，“我们的研究结果阐明了调控细胞因子基因IL-12和IL-23的一个表观遗传机制，确定了Trabid是炎症性T细胞反应的一个免疫调控因子。Trabid似乎通过控制组蛋白去甲基化酶Jmjd2d的命运调控了组蛋白修饰。”细胞因子是一些对细胞信号传导极为重要的小蛋白，IL-12和IL-23是炎症介质，与一些炎症性疾病有关联。孙少聪认为，Trabid和Jmjd2d有可能是治疗多发性硬化症一类炎症性疾病的潜在治疗靶点。“由于慢性炎症是一个重要的癌症风险因子，未来的研究将会探究Trabid和Jmjd2d是否也在癌症形成中起作用。”研究人员说，IL-12和IL-23一类的促炎症细胞因子连接了一些先天反应和免疫反应，与一些自身免疫性疾病和炎症性疾病相关。先天免疫系统，也称作非特异性免疫系统，其包括一系列的细胞及相关机制，可以非特异性方式保护宿主抵御其他生物的感染。“包括树突状细胞和巨噬细胞在内先天免疫系统细胞，对适应性免疫反应的性质和强度起重要的调控作用。它们能够识别微生物组件，包括各种受体，这些受体可触发细胞内信号传导事件影响这些细胞的功能。先天免疫系统细胞异常生成促炎症细胞因子也可以导致一些自身免疫和炎症性疾病。”这一研究发现，删除树突状细胞中Trabid的蛋白质编码基因Zranb1，可抑制IL-12和IL-23表达，破坏炎症性T细胞分化。这一过程保护了研究小鼠免于自身免疫炎症。

羟丙基甲基纤维素（hydroxypropyl methyl cellulose），亦有简化作羟丙甲纤维素（缩写作HPMC），是属于非离子型纤维素混合醚中的一个品种。它是一种半合成的、不活跃的、黏弹性的聚合物，常于工业助剂、眼科学用润滑剂，又或在口服药物中充当辅料或赋型剂。在工业领域中，羟丙甲基纤维素的主要用途是为聚氯乙烯生产中做分散剂，系悬浮聚合制备PVC的主要助剂。另外，在其他石油化工、涂料、建材、除漆剂、化妆品等产品生产中，羟丙甲基纤维素也可作增稠剂、稳定剂、保水剂、成膜剂等。在合成树脂领域，添加羟丙甲基纤维素可使获得的产品具有颗粒规整、疏松、视比重适宜，加工性能优良等特点。羟丙甲基纤维素在生产和研发中关键的指标是分子量，根据分子量不同，羟丙甲基纤维素制品可用于不同的用途，低分子量级别（分子量）的羟丙甲基纤维素用于片剂包衣材料，高分子量（分子量100000）的羟丙甲基纤维素可用作片剂骨架的阻滞剂、有延缓药物释放的作用。目前羟丙甲基纤维素分子量常用的测试方式是乌氏毛细管法，乌氏毛细管法实验操作简单，数据重复性好，在大多数高分子材料研发及相关质量控制中都起到关键作用，尤其是ZVISCO自动乌氏黏度仪因其自动化程度高，节省人力的同时进一步提高了实验数据的可靠性。以IV2000系列自动乌氏黏度仪、MSB系列多位溶样块、ZPQ智能配液器一整套黏度测试设备为例： 实验流程：1. 智能配液过程使用ZPQ智能配液器进行配液，点击配液功能后，直接输入浓度和质量（可通过连接天平直接获取），可直接计算出所需要的目标体积进行移液并且精度可达0.1%。可避免因手动配液方法导致的精度差、效率低及数据误差等问题。ZPQ智能配液器还具有密度计算功能，移取液体体积后，输入质量（可与天平通讯，直接获取），即可自动计算出密度值。2. 溶样过程MSB系列多位溶样块，采用金属浴的方式进行加热溶样并具有自动搅拌功能，同时可容纳15个样品。溶样效率快、转速可调、溶样时间可调、溶样温度可调、溶样温度可达180℃。3. 测试过程IV2000系列自动乌氏黏度仪可实现自动连续测量，全程无需人员看管。并且采用的智能红外光电传感器，保证测量时间可达到毫秒级，可有效确保实验数据的精度，避免人工实验导致误差。4. 测试结果：IV2000系列自动乌氏黏度仪连接电脑端，得出结果可在计算机上直接显示，并有数据储存、多样化粘度分析报表等多种功能。

羟丙基甲基纤维素（hydroxypropyl methyl cellulose），亦有简化作羟丙甲纤维素（缩写作HPMC），是属于非离子型纤维素混合醚中的一个品种。它是一种半合成的、不活跃的、黏弹性的聚合物，常于工业助剂、眼科学用润滑剂，又或在口服药物中充当辅料或赋型剂。在工业领域中，羟丙甲基纤维素的主要用途是为聚氯乙烯生产中做分散剂，系悬浮聚合制备PVC的主要助剂。另外，在其他石油化工、涂料、建材、除漆剂、化妆品等产品生产中，羟丙甲基纤维素也可作增稠剂、稳定剂、保水剂、成膜剂等。在合成树脂领域，添加羟丙甲基纤维素可使获得的产品具有颗粒规整、疏松、视比重适宜，加工性能优良等特点。羟丙甲基纤维素在生产和研发中关键的指标是分子量，根据分子量不同，羟丙甲基纤维素制品可用于不同的用途，低分子量级别（分子量100000）的羟丙甲基纤维素可用作片剂骨架的阻滞剂、有延缓药物释放的作用。目前羟丙甲基纤维素分子量常用的测试方式是乌氏毛细管法，乌氏毛细管法实验操作简单，数据重复性好，在大多数高分子材料研发及相关质量控制中都起到关键作用，尤其是ZVISCO自动乌氏黏度仪因其自动化程度高，节省人力的同时进一步提高了实验数据的可靠性。以IV2000系列自动乌氏黏度仪、MSB系列多位溶样块、ZPQ智能配液器一整套黏度测试设备为例： 实验流程：1. 智能配液过程使用ZPQ智能配液器进行配液，点击配液功能后，直接输入浓度和质量（可通过连接天平直接获取），可直接计算出所需要的目标体积进行移液并且精度可达0.1%。可避免因手动配液方法导致的精度差、效率低及数据误差等问题。ZPQ智能配液器还具有密度计算功能，移取液体体积后，输入质量（可与天平通讯，直接获取），即可自动计算出密度值。2. 溶样过程MSB系列多位溶样块，采用金属浴的方式进行加热溶样并具有自动搅拌功能，同时可容纳15个样品。溶样效率快、转速可调、溶样时间可调、溶样温度可调、溶样温度可达180℃。3. 测试过程IV2000系列自动乌氏黏度仪可实现自动连续测量，全程无需人员看管。并且采用的智能红外光电传感器，保证测量时间可达到毫秒级，可有效确保实验数据的精度，避免人工实验导致误差。4. 测试结果：IV2000系列自动乌氏黏度仪连接电脑端，得出结果可在计算机上直接显示，并有数据储存、多样化粘度分析报表等多种功能。