佐匹克隆氧化物右佐匹

酒石酸唑吡坦和右佐匹克隆互相干扰吗

[color=#444444]要求摸出佐匹克隆HPLC色谱条件，C18柱，乙腈和水相（磷酸盐缓冲液）=40:60，PH=3.5时峰形很差 ，理论塔板数很低，峰拖尾很严重，由于该药可能是手性药物，峰形的裂分会不会是对映异构体的拆分？怎样解决？[/color]

经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。一、有限稀释法1．材料① 微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔2万～4万。② HT培养基2．操作方法① 取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。② 用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。③ 用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。④ 5％CO2饱和湿度，37℃培养。⑤ 每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。⑥ 克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，测培养液抗体。⑦ 抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传2～4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。二、软琼脂克隆化借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下：1．配2.5％的琼脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。2．将117ml完全DMEM液和3ml 10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。3．将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5％琼脂糖的完全DMEM液，并加75×108 脾细胞。4．每块平皿加10ml，于室温中凝固。5．DMEM中的细胞与DMEM―琼脂1:1混合，将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上，使其全部覆盖。6．放入CO2箱饱和湿度，37℃培养10天。7．用PBS配制0.6％琼脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保温情况下取一试管，迅速加入0.1ml 25％羊红血球，0.2ml豚鼠补体，2.7ml 0.6％琼脂糖。8．用3ml琼脂糖―羊红血球混合液覆盖克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围，可筛选抗羊红血球Ig。三、显微镜操作法在直径6cm培养皿中，加入1ml 1.0×108 细胞悬液放置5％CO2饱和湿度，37℃温箱中放置30min以上，倒置显微镜下，寻找那些与周围相距甚远的单个细胞，将毛细管口（一头有直角弯头毛细管，一头连接一尺长乳胶管，用口控制液体进入）水平置放于液面上，左右微动，直到看见管口，对准细胞，吸入毛细管，将管中细胞移到预先加有2.0×104~5.0×104 饲养细胞96孔板内，培养后，即可获得单个细胞形成的克隆。四、荧光激活分离法用一种荧光激活细胞分类器（Fluorescein Activafed Cell Sorter，FACS）。其基本原理是：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在莱塞光激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。

自从1996年世界上第一只体细胞克隆羊“多利”在英国诞生以来，克隆技术似乎变得越来越普及，各国很多科学家都掌握了这种技术，更有许多科学家雄心勃勃，朝着克隆动物产品产业化的目标进发。　　在中国，已经有数家科研机构有能力克隆动物，并让不少的克隆动物存活下来。中国科学院动物所首席研究员陈大元、2007年12月刚当选为中国工程院院士的中国农业大学李宁教授等，都已经成功培养出克隆牛，中国工程院院士、上海医学遗传研究所所长曾溢滔也在克隆牛和羊的工作上稳步前进。　　药物也好，牛排也好，克隆技术最终的目标，都是制造产品送进人的身体里，所以，“克隆离餐桌有多远”这个问题，永远吸引人们的关心。美国FDA认可了部分克隆动物食品的安全性以后，中国大众也开始讨论克隆食品能不能吃的问题。　　关于克隆食品的安全性，中国农业大学李宁教授介绍说，目前国内还没有相关的标准出台，有关部门领导碰面时会提及标准问题，但距离正式的探讨还有距离。“中国与美国的情况不同，美国的产业部门会向FDA提出制定克隆动物食品标准的要求。”李宁教授说，产业部门的呼吁已有五六年之久，FDA关于安全性的标准和认可姗姗来迟。为此，产业部门极为不满。他在国外参加学术会议时，常常听到国外专家的抱怨。但在国内，动物产品生产的各个环节分属不同部门管理，很难有部门主动“应战”。　　但李宁教授认为，目前中国克隆动物产品距离产业化还有“漫长的道路”，原因并不在于缺乏安全性审查的标准，因为安全性标准完全可以参照国外既有的标准。他认为，真正的距离在于技术。“个别的科研团体能够克隆，是不可能实现产业化的。”　　陈大元教授同样不够“乐观”。他自己带领的克隆牛研究，就还没有达到理想的“效率”。2002年陈大元的团队培养出第一批克隆牛，14头成功克隆的牛最后只存活下5头牛犊，第一头克隆牛在出生不久以后夭折。2003年在新疆成功的31头克隆牛，也只有12头存活。不久前，中科院一个研究小组培育的克隆牛，全部存活，这几乎是克隆实验中的“奇迹”，陈大元介绍说，这次“例外”的原因，科研人员正在研究当中。　　尽管有“例外”发生，克隆动物存活率低的问题，仍然是目前克隆技术产业化的瓶颈，如果没有新的方法解决，对产业化的期待，也许还为时尚早。不过，陈大元认为，最近日本和美国实现了“诱导多能干细胞”技术，如果尽快把这一技术应用到克隆中，那么产业化也许可以早点到来。“只要是健康存活下来的克隆动物，作为食物就跟传统动物没有两样，是安全的，问题在于我们的技术还没有能力批量地生产克隆动物产品。”陈大元说。　　“1980年初，外国哺乳动物克隆研究走得很快，中国科学界直到1990年才追上克隆技术的步伐。”陈大元说。不过，上世纪90年代以后，中国克隆技术的进步，立即进入加速度，兔、鼠、猪、牛、羊等等动物的克隆，都被中国的科学家实现。陈大元把这个时期形容为“登峰造极”。2000年以后，随着克隆技术的成熟，世界各地的科学家开始探索克隆产业化，中国的科研工作者也加入了实现产业化的努力当中。在很多国外研究者看来，中国人的智慧和勇气，常常能制造轰动性的成果，在克隆动物产品产业化的领域，中国的表现也值得期待。

我们做的是易氧化物，做TOC的多不多?我猜一是因为TOC需要另买仪器，再者TOC不易修改数据，所以用的不是很多。各位是怎么做的？

现用亚硝酸盐标准溶液做氮氧化物标准曲线，亚硝酸盐标准溶液在安剖瓶中，按相关要求在安剖瓶中取10ml亚硝酸盐标准溶液定容至100ml容量瓶中，再在定容后的100ml容量瓶中取15ml溶液定容至100ml容量瓶中，得到了标准溶液每ml含4.926ug；现用《环境空气氮氧化物（一氧化氮和二氧化氮）的测定盐酸萘乙二胺分光光度法》的步骤做标准曲线，该标准要求标准工作液要用2.5ug/ml的亚硝酸盐标准工作液，用安剖瓶定容后每ml含4.926ug标准溶液做标准曲线，而不用2.5ug/ml的亚硝酸盐标准工作液是否会对标准曲线有影响？做出的标准曲线是否正确？可以用不同的浓度做氮氧化物的标准曲线吗？

问题如标题！氮氧化物做标样计算时 用除以0.88系数吗？

拉曼做金属氧化物含量的下限是多少? 我有一几种氧化物的混合物，其中MoO3含量只有5%，XRD检测不到，拉曼可以吗？初次接触拉曼，请见谅！

大家好，我做有机过氧化物气质联用，但是得到的全是分解后的产物，有没有人也做这个，留个联系的一起讨论讨论，我才用GCMS没多久，见笑

请问hj479-2009中氮氧化物标准曲线的斜率0.180-0.195是怎么做出来的，用氮氧化物浓度做横坐标，是算加入显色液的体积10ml后的浓度还是只算加水后2ml的浓度，一般环境空气中测得的一氧化氮和二氧化氮浓度是多少啊·······

最近做一批铁氧化物的衍射，发觉难以找到吻合比较好的PDF卡片，请各位帮忙看看。原料为FeCl2，NH3，HF，在大气条件下、不同温度和不同时间下焙烧，结果为红色粉末。对此红色粉末进行X衍射，附件为其中几个比较明显的数据。[~89979~][~89980~][~89981~]

一直以来都想把自己在基因克隆方面的心得写出来，让更多的刚刚进入生命科学领域的人受益，因为自己刚开始做克隆时也遇到过各种问题，经过较长时间的总结和实践，我的题组现在的基因克隆都是一次到位的，基本不需要重复做。其实我只是一个只有几十万科研经费的小青椒，不过我对科研非常热爱，我喜欢买实验用的各种酶啊，好用的耗材之类的东东超过我对自己的衣服鞋子的热爱，所以我看起来穿的及其普通，可是我的实验花费有点奢华，呵呵，可能像我这样的人不多吧，哈哈，反正无所谓开心就好。下面言归正传（1）是酶切位点的选择。我的实验室有Takara、Promega以及NEB三种公司的常用的酶，这极大的丰富了我们的选择，所以在设计PCR产物的酶切位点之前首先要看看哪两个酶之间是可以进行同时酶切的。因为这三家公司的双酶切表的组合完全不同，最佳的方案是我们能够按照需要去选择合适的酶。有人说这得花很多钱吧，其实不然，Takara几乎每年9月都有一次促销活动，在他们七折的时候我一下买了三千块钱的酶，这一年来有用之不尽的感觉。Promega的酶也非常好用，而且长期五折，我也是常用的酶买了一批放在实验室里。至于NEB的实在是有一点贵的，我一般不批量买了，在NEB买的一般都是不常用的酶，比如FseI、AscI等等。酶的选择是实验成功的关键吆。（2）PCR引物的设计这一点我不想多说，虽然有很多的攻略里面讲到了PCR引物设计的原则等等，大家设计的时候要参考各种原则，我认为不然，因为做过实验的战友都清楚，有的时候很多PCR引物的选择是没有选择的，比如我要扩增一个完整的基因的ORF框，那么它的起始密码子，终止密码子部分都要克隆出来的，不能多也不能少一个碱基，即使起始部位或者终止部位的AT含量很高，高到你难以忍受，那怎么办呢，基本我们没有选择，如果实在是没办法的条件下，只能在PCR引物的5端加入人为设计的碱基而把引物的扩增部分后移或前移来避开难以扩增的部位，我不知道说清楚没有，如果引物序列OK，可以忽略上句话。所以大多数情况下引物我们是没得选择的，那么我们只能从PCR扩增条件上下功夫。（3）PCR扩增对于PCR扩增其实不同的基因可能策略不同，我来说几点相同的。首先很多新手会忽略引物的浓度问题，我在最开始做PCR的时候因为当时的基因非常容易扩增，所以其实我的条件并不是最佳的，但当时把基因扩出来了我也没有在意，直到有一天我需要在基因的5端加入3个HA标签，这样的PCR引物长度差异很大，一支引物100多bp，一支引物只有30bp，于是当我还有以前的条件时我扩不出任何的基因。当时扩了几次都不成功，各种温度都试过了也不成。于是我静下心来，把PCR的实验条件进行了全方位优化，在PCR反应体系中，把引物调整到各种浓度的，把模板调整到各种浓度的，有的加Mg2+，有的加BSA，还使用梯度PCR的条件，试了各种扩增温度的，结果让我很开心，最后我的基因被扩增出来了，而且好亮好亮的那种。记得当时自己高兴地跳了起来。也许这就是科研的魅力吧！在这次试验中我找到了最佳的PCR条件，这是三年前的事了，这个条件让我在三年中屡试不爽，几十个基因的扩增从未失手过。其实体系很简单，50ul体系中buffer 5ul、Mg2+ 1mM、dNTP 0.2mM、引物每支1ul（配成10umol/L浓度)、PCR酶一般是0.5ul、其余部分用水补平，混匀，离心一下，进行PCR扩增。其中引物从公司拿到干粉后我一般用水溶解至100umol/L浓度保存，吸取少量稀释十倍后用于PCR反应，这个浓度是最佳的。所以PCR体系中引物并不是越多越好，同样的模板的量也很关键，一般我都在10ng-100ng之间，太少或太多都会抑制PCR反应。当然，不同的基因其退火温度差异较大，建议第一次做直接做梯度PCR，设置的温度范围宽些，总会有扩出来的。反正把反应体系加好，把温度控制好应该就万事大吉了，如果这样仍然扩不出来，那就直接调整DNA模版的量吧，其他的因素应该不是原因（当然得保证引物，以及酶的质量得前提下）。（4）PCR产物的酶切，这是最简单的一步，一般我都是酶切过夜的。因为我认为PCR产物切得尽可能的充分对克隆很重要，毕竟保护性碱基只有几个。（5）质粒的酶切。虽然质粒的酶切很简单但是却很讲究，决定着克隆的成败。质粒提取我一般都用试剂盒，天根的很便宜了，现在好像一盒已经六折，一盒有200个，可以用很久。质粒提取完毕后我会用紫外分光光度法对质粒进行定量测定，根据A260的值计算出质粒的量，然后再进行酶切，一般酶切体系60ul，60ul体系中我只切总量1ug的质粒，一次切两管，酶切过夜后切胶回收或者不切胶直接回收，这取决于两个限制性内切酶之间的距离，十几bp以内我就直接回收了，如果偏大就要切胶回收。（6）连接 连接我采用的是Promega公司的T4 DNA连接酶，它的特点是22度连接三小时以上几款，这样我就可以在上午把质粒片段以及PCR片段回收后马上做连接，连接一个白天，到下午可以做转化了，涂板，过夜培养第二天早上看结果。然后挑克隆（一般我一个基因就挑四个克隆足已）培养一白天，下午稍晚些提质粒，然后马上酶切鉴定，一般酶切鉴定体系中我都做20ul体系，酶用0.5微升就够了（呵呵，该省的就省点吧），酶切一个小时跑胶就可以知道克隆是否成功了。这样从PCR到克隆鉴定完毕，一共三天。不过从我带学生的经验来看，从一个懵懵懂懂的新手到成功掌握该技术快则半个月，多则一个月，引人而异。各位也试试看吧！以上为本人在基因克隆方面的一家之言，难免有疏漏或过于肯定之处，感谢各位战友多提宝贵意见，多多交流，以后我会陆续贴出各种技术的实验心得，欢迎大家相互交流！

所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。 一、试剂准备1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌20min。2．1.5%琼脂LB固体培养基: 称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100ml LB，15 lbf/in2 高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。3．IPTG、X-Gal4．0.1M MgCl2 ：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。5．0.1M CaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。6．限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶。二、目的DNA片段和载体的制备选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。在亚克隆时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配 ，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。（实验操作同前述） 三、利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接（一）连接要求和结果外源DNA片段末端性质 连接要求 连接结果 不对称粘性末端 两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。 对称性粘性末端 线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。 平端 要求高浓度的DNA和连接酶 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高 。 带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。（二）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O 至8μl。3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃水浴）连接8-14hr。四、连接产物的转化1.感受态细胞的制备⑴ 保存于-70℃的DH5α（或其他菌种）用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16 hr）。⑵ 挑取单菌落，接种于2.0ml LB液体培养基中，37℃恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。⑶ 取0.5ml 过夜培养液，接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2hr。（注：以下操作均应在冰浴中进行。）⑷ 将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10min，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30min。⑸ 4℃离心,4000g×10min，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮。⑹ 以100μl/管分装入1.5ml离心管中，-70℃冻存备用。注：此法制备感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5×106-2×107个菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要，制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响，一般三个月以内转化效率无多大改变。2. 连接产物的转化⑴ 取100μl贮存于-70℃钙化菌，冰浴化开；⑵ 加入适量连接产物（一般不超过10μl，轻轻混匀，冰浴20min；⑶ 于42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；⑷ 加入LB液体培养基200μl，于37℃缓摇孵育45min；⑸ 将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板（根据质粒性质添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12-16hr。

[b]什么是克隆食品？[/b]　　克隆是英文clone的音译，简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。 　科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术。克隆食品，简单地说，就是指克隆动物生产的肉和奶。 美国食品和药物管理局(FDA)于2008年宣布，经过克隆的牛、猪和山羊以及它们的后代均可以安全食用，克隆牛产的奶也可安全食用。 FDA称，科学家就克隆技术安全性问题在全球各地进行了数十次相关研究，研究结果显示，从生物角度来说，以上克隆动物以及它们的后代与按传统方式繁殖的同类没有什么不同，它们的肉和人们今天食用的肉也没什么两样。 据报道，随着美国批准克隆动物的奶制品和肉制品上市销售，我国在未来也许会允许克隆食品的销售。

请问用DSC做有机过氧化物的活化能、频率因子、分解速率常数并计算半衰期是不是要用专用的密封干锅呀比如过氧化甲乙酮、叔丁基过氧化-2-乙基碳酸脂。做成一氯代苯的稀溶液。加热到200℃左右。小弟没做过 如果有人懂的话指点我一下呀qq 57315240wangamada@163.com

我们买来高纯氧化物，不知道可不可以用来做ICP 标准液，测试金属或者要转换过，

氧化物的干扰是较常见的质谱干扰之一，大家是通过优化仪器的工作条件来满足测定要求呢，还是通过编辑干扰校正方程来扣除氧化物的干扰，编辑干扰校正方程有点麻烦，优化仪器的工作条件更简单些，对下面这句话：通过优化仪器的工作参数，使CeO/Ce＜1.2%，可消除氧化物干扰对稀土元素的测定（如135Ba16O对151Eu，141Pr16O对157Gd的干扰）为什么“通过优化仪器的工作参数，使CeO/Ce＜1.2%，可消除氧化物干扰”感觉有点笼统

近日，新型食品及其加工咨询委员会（ACNFP）在一次公开会议上，评价了由克隆牛及其后代加工成的肉乳制品的安全性，并在《新型食品法规》基础上决定是否批准克隆肉乳制品。 新型食品及其加工咨询委员会（ACNFP）指出： 克隆肉乳制品同普通的肉乳制品在成分上是一致的，因此克隆肉乳制品不可能导致食品安全风险。 有关肉乳制品在成分上的证据较为有限，进一步表明肉乳产品受动物喂养环境的影响证据是必需的。 消费者可能希望由克隆动物及其后代加工成的产品具有明确的标识。 针对以上观点，食品标准局首席科学家安德鲁。维奇（Andrew Wadge）表示，由克隆牛及其后代加工成的肉乳制品同普通的肉乳制品没有本质的区别，因此克隆肉乳产品不可能导致食品安全风险。 食品标准局委员会将在12月的会议继续讨论克隆肉乳制品的安全性，该委员会将认真考虑ACNFP的观点、欧洲委员会对克隆肉乳产品的禁令以及其它的意见，最终将其建议提供给部长。

各位同行，最近刚刚去现场做环境中氮氧化物采样，发现氮氧化物的接高锰酸钾的下一级一氧化氮吸收液颜色变的厉害，呈现出深红色，空白值为0.015，扣除空白后二氧化氮吸光度一般只有0.04，但一氧化氮吸光度甚至有超过2的。现场没有氮氧化物源头，很明显颜色被污染了，我怀疑是高锰酸钾的紫红色溶液混入了下一级吸收液。各位有没有遇到过？你们是怎么解决的？

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-production][b]单克隆抗体[/b][/url]（[/font][font=Calibri]mAb[/font][font=宋体]）源于单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆，具有高度的均一性和特异性，仅针对某一特定抗原表位。在生物医学研究、疾病诊断以及某些疾病治疗（如传染病和癌症）中单克隆抗体发挥着至关重要的作用。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前，制备单克隆抗体的主流技术包括[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]、[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/phage-display-antibody][b]噬菌体抗体库技术[/b][/url]和[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology][b]单个[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology][b]B[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology][b]细胞技术[/b][/url]。杂交瘤技术通过融合免疫小鼠的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞，筛选出能够特异性分泌抗体的杂交瘤细胞，进而生产并纯化得到单克隆抗体。噬菌体抗体库技术则利用基因工程技术，将抗体基因与噬菌体基因相连接，使抗体以融合蛋白的形式呈现在噬菌体表面，通过与靶蛋白的结合，筛选出具有特定亲和力的噬菌体展示抗体。而单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术则基于每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞仅含有一对功能性的重链和轻链，每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞仅产生一种特异性抗体的特性，直接从单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增抗体基因，从而获得单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]制备单克隆抗体的基本流程：[/font][/b][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）抗原制备[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一般来说，抗原可以是蛋白（天然蛋白或重组蛋白）、多肽、小分子等。依据需求选择和制备合适的免疫原对于抗体开发至关重要。义翘神州在蛋白抗原、多肽抗原制备积累了丰富的经验，可提供专业的抗原制备服务。另外，义翘神州还成功制备出[/font][font=Calibri]6000[/font][font=宋体]多种重组蛋白产品，可作为抗原用于动物免疫和抗体筛选，欢迎订购。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）动物免疫[/font][/font][font=宋体][font=宋体]通常选用[/font][font=Calibri]Balb/c[/font][font=宋体]小鼠作为免疫动物，根据抗原的特性制定免疫方案，包括免疫抗原纯度、抗原量、免疫方法和途径等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]免疫方法一般有常规免疫法、脾内一次性免疫法、短程免疫法和体外免疫法等，免疫途径主要有皮下注射、腹腔注射和静脉注射。脾内一次性免疫法具有用量少、免疫程序短、不加佐剂且所得单克隆抗体的特异性较高等特点。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]常规免疫周期如下：第一次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]弗氏完全佐剂，皮下注射）、第二次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]弗氏不完全佐剂，皮下注射）、第三次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]不加佐剂，皮下或静脉注射）、第四次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]不加佐剂，静脉注射）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）细胞融合[/font][/font][font=宋体]细胞融合前准备：[/font][font=宋体][font=宋体]脾淋巴细胞制备：取已经免疫的[/font][font=Calibri]Balb/c[/font][font=宋体]小鼠的脾脏，制备淋巴细胞，通常每只小鼠可得[/font][font=Calibri]1x10^8-2.5x10^8[/font][font=宋体]个脾细胞；同时摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]骨髓瘤细胞制备：骨髓瘤细胞应该和免疫动物属于同一品系，便于细胞融合以及产生大量[/font][font=Calibri]Ab[/font][font=宋体]。融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功得到杂交瘤非常重要。目的是使骨髓瘤细胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前不能少于[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]周；冻存的细胞在复苏后要生长[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]周才能处于适合于融合的状态。[/font][/font][font=宋体]饲养细胞：常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。饲养细胞促进杂交瘤细胞增殖的机制可能是释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；也可能是满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞融合：细胞融合方法有病毒介导的细胞融合、聚乙二醇（[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]）介导细胞融合、电融合。[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]融合相邻骨髓瘤和[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]或抗体分泌细胞的质膜，形成具有两个或更多核的单细胞。异核体保留这些核，直到核膜在有丝分裂前溶解。电融合通过施加脉冲电场连接相邻细胞的膜。电融合比[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]更加有效，结果具有重现性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）杂交瘤筛选以及单克隆鉴定[/font][/font][font=宋体][font=宋体]骨髓瘤细胞和脾细胞融合之后，由于细胞融合是随机的，因此要利用[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基筛选杂交瘤细胞。骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]），对氨蝶呤钠敏感，在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]选择培养液中不能生长；免疫脾细胞虽然有[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]，但不能在体外无限繁殖。因此只有融合的杂交瘤细胞，才能在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]选择培养液中无限繁殖。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]得到融合的杂交瘤细胞后，需要进一步筛选特异性抗体。将融合的细胞进行充分有限稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]至数个细胞之间（[/font][font=Calibri]30%[/font][font=宋体]的孔为[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]才能保证每个孔中是单个细胞），培养后取上清液用[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]法选出抗体高分泌性的细胞，这一过程常被称作克隆化。将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹水培养。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]）单克隆抗体大量制备[/font][/font][font=宋体]利用杂交瘤细胞大规模制备单克隆抗体主要有两种方式：体外培养法和腹水制备法。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]体外培养可以采用单层细胞培养的形式，也可以采用悬浮培养的形式。单层细胞培养法是各个实验室最常用的，是将杂交瘤细胞加入培养瓶中，用完全培养基培养，细胞浓度以[/font][font=Calibri]1.0X10^6~2.0X10^6[/font][font=宋体]个[/font][font=Calibri]/mL[/font][font=宋体]为宜，然后收集培养上清液。如果想在体外高效率地大量制备单克隆抗体，就必须高密度培养杂交瘤细胞，充分利用培养基的立体空间。单位体积内细胞数量越多，产生的单克隆抗体就越多，浓度就越高，产量就越大。义翘神州提供杂交瘤体外培养抗体生产服务，成功率[/font][font=Calibri]99%[/font][font=宋体]，可采用低血清或无血清培养基进行高密度悬浮培养，生产规模从毫克级到克级不等，满足客户的不同需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]腹水制备法是通过将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，并产生腹水，可得到大量的腹水单抗。这种方式能够在相对短的时间内获得大量高浓度的抗体，而且成本低、操作相对简单以及不需要复杂的培养条件。然而，这种方法也有一些限制，比如腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括[/font][font=Calibri]Ig[/font][font=宋体]），因此在很多情况下要提纯后才能使用，而且还有污染动物病毒的危险。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体技术：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

氮氧化物指的是只由氮、氧两种元素组成的化合物。常见的氮氧化物有一氧化氮（NO，无色）、二氧化氮（NO2，红棕色）、笑气（N2O）、五氧化二氮（N2O5）等，其中除五氧化二氮常态下呈固体外，其他氮氧化物常态下都呈气态。作为空气污染物的氮氧化物（NOx）常指NO和NO2。 氮氧化物(NOX)种类很多，包括一氧化二氮(N2O)、一氧化氮(NO)、二氧化氮 (NO2)、三氧化二氮(N2O3)、四氧化二氮(N2O4)和五氧化二氮(N2O5)等多种化合物，但主要是NO和NO2，它们是常见的大气污染物。天然排放的NOX,主要来自土壤和海洋中有机物的分解，属于自然界的氮循环过程。 人为活动排放的NO，大部分来自化石燃料的燃烧过程，如汽车、飞机、内燃机及工业窑炉的燃烧过程；也来自生产、使用硝酸的过程，如氮肥厂、有机中间体厂、有色及黑色金属冶炼厂等。据80年代初估计，全世界每年由于人类活动向大气排放的NOX约5300万吨。NOX对环境的损害作用极大，它既是形成酸雨的主要物质之一，也是形成大气中光化学烟雾的重要物质和消耗O3的一个重要因子。 在高温燃烧条件下，NOX主要以NO的形式存在，最初排放的NOX中NO约占95%。 但是，NO在大气中极易与空气中的氧发生反应，生成NO2，故大气中NOX普遍以NO2的形式存在。空气中的NO和NO2通过光化学反应，相互转化而达到平衡。在温度较大或有云雾存在时，NO2进一步与水分子作用形成酸雨中的第二重要酸分——硝酸(HNO3）。在有催化剂存在时，如加上合适的气象条件，N02转变成硝酸的速度加快。特别是当NO2与SO2同时存在时，可以相互催化，形成硝酸的速度更快。 此外，NOX还可以因飞行器在平流层中排放废气，逐渐积累，而使其浓度增大。NOX再与平流层内的O3发生反应生成NO与O2，N0与O进一步反应生成NO2和O2，从而打破O3平衡，使O3浓度降低，导致O3层的耗损。【求助】新标准环境空气氮氧化物标准曲线的制作 【求助】氮氧化物检测中对氨基苯磺酸溶液的配制 【求助】环境空气 氮氧化物 盲样考核 【求助】氮氧化物标准曲线为什么斜率难达到现在标准方法的要求 【求助】急问，专家请进：关于氮氧化物的测定【求助】分光法氮氧化物的测定讨论 【求助】环境空气监测中二氧化氮和氮氧化物计算公式有什么区别 【求助】NOx做曲线的疑惑【分享】HJ 479-2009 环境空气 氮氧化物的测定 盐酸萘乙二胺分光光度法

氮氧化物能力验证做出来质控都在范围，但结果偏小是为什么啊，能用做亚硝酸盐氮的国标的方法做吗？

[url=http://www.f-lab.cn/electroporation/pipectrode.html][b]克隆枪电穿孔室[/b][/url]是[b]电穿孔仪[/b]器的一项重大的技术进步，具有最高转化效率,有效降低[b]电穿孔过程[/b]中样品的低毒性，温度控制，及[b]电穿孔[/b]后样品的迅速恢复。[img=克隆枪电穿孔室]http://www.f-lab.cn/Upload/CG-PP-1.jpg[/img][url=http://www.f-lab.cn/electroporation/pipectrode.html]克隆枪电穿孔室[/url]在电穿孔过程中，由水冰温度稳定剂支持的薄外科不锈钢电极为细胞的提供优越环境。我们利用水融合的潜热（融化1克冰或加热1克水到80℃，需要相同的热量！），保持样本的低温是非常重要的，这样可以避免电弧。由于Pipectrode是一个试管，可以喷射出您的样品并立即放入回收缓冲区。更多电穿孔系统请浏览官网：[url]http://www.f-lab.cn/electroporation.html[/url]

[align=center]抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展[/align][align=center] [/align][align=center]摘　　要[/align][align=center] [/align]　通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物,已经成为生物制药领域的一个重要方面,特别是对抗肿瘤单克隆抗体药物的研究已获得了重要进展。多年来,许多研究证实了抗肿瘤单克隆抗体药物的作用,为其应用于肿瘤治疗提供了重要依据。这类药物的特异性强，疗效显著。本文主要就近年来抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展进行了综述，并对抗肿瘤单克隆抗体药物的发展前景进行了展望。[align=left] [/align][align=left]关键词：抗肿瘤；单克隆抗体；研究进展[/align][align=center] [/align][align=center] [/align][b]一 引言[/b]抗肿瘤单抗药物因与烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、铂类配合物、植物药等抗肿瘤药物相比,具有高效价、高特异性、血清交叉反应少等特点与优点,在肿瘤治疗中起着不可替代的作用。单抗药物是当前生物技术药物领域甚为活跃的部分。针对特定的分子靶点(抗原),单抗有高度特异性。针对各种不同的抗原,可以制备为数众多的、各不相同的单抗；因此,作为药物来源,单抗又具有高度多样性。由于其特异性和多样性,研制单抗药物有巨大的潜力。单克隆抗体药物治疗恶性瘤主要机制有两种[sup][/sup]:一是利用单克隆抗体本身来阻断癌细胞生长的信号,单克隆抗体在癌细胞膜外与生长因子竞争结合受体,阻断信号传递过程,从而阻止癌细胞的生长和扩散,诱导细胞凋亡或者间接激活宿主的抗肿瘤免疫反应；二是利用单克隆抗体作为药物载体的靶向治疗,如将有细胞毒性的药物或有放射性的药物靶向性的运送到肿瘤细胞,从而杀伤肿瘤细胞。目前,国际上与肿瘤治疗相关的抗体研究主要集中在将抗体与耦联物作用后直接杀伤肿瘤细胞,利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面。此外，研究表明静脉内注射抗肿瘤单抗,在肿瘤部位的浓度较高,显示特异性定位；单抗与药物的偶联物通常仍保留原来单抗的分布特征,在靶肿瘤的浓度较高[sup][/sup]。[align=center]二　　单克隆抗体药物作用靶点[/align]特定受体或特定的基因表达蛋白可能作为单抗药物的靶点。Rituxan是以B细胞的CD20分子作为靶点的人鼠嵌合抗体,对非霍奇金氏B细胞淋巴瘤有疗效,是第一个获美国FDA批准用于治疗恶性肿瘤的单抗。Herceptin是抗HER-2/neu癌基因编码蛋白的单抗,临床研究对乳腺癌有效,与化疗药物联合有更显著的疗效。Mylotarg是由抗CD33单抗与calicheamicin构成的偶联物,已获批准用于治疗急性复发性髓性白血病[sup][/sup]。表皮细胞生长因子受体(EGFr)在人的鳞癌、乳腺癌和脑胶质瘤等均有较高的表达。有报道,抗EGFr单抗与长春碱衍生物的偶联物在裸鼠体内试验,显示良好的抗癌效果。抗EGFr的人鼠嵌合抗体已进入临床研究。血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成中有重要作用。据报道,抗VEGF的中和性单抗具有广谱的抗肿瘤作用,对移植于裸鼠的人体癌瘤有显著疗效[sup][/sup]。[b]三 单抗诱发肿瘤细胞凋亡[/b][align=left] 3.1 通过免疫细胞表面抗原的交联作用而诱导恶性肿瘤细胞的凋亡[/align]用于治疗血液系统恶性肿瘤的单克隆抗体药物大多是通过免疫细胞表面抗原的交联作用诱导恶性肿瘤细胞凋亡而起作用的,如目前用的抗-CD20的单克隆抗体——美罗华。其单克隆抗体的作用机制是通过诱导CD20分子在B细胞膜上的脂筏区聚集,再在一系列激酶的作用下使脂筏信号传导区域的CD20分子亲和性增强,从而形成CD20交联形式；交联的CD20分子启动了细胞内凋亡信号的传导通路,使线粒体释放出细胞色素C,激活下游的caspase级联反应,最终导致细胞凋亡[sup][/sup]。3.2 作用于恶性肿瘤细胞膜上的生长因子及其受体而诱导细胞凋亡许多生长因子及其受体通过作用于细胞的存活途径、刺激细胞的有丝分裂、促进细胞的生长增殖来阻止细胞凋亡。与正常细胞中生长因子信号传导的严格调控相比,肿瘤细胞中的失控则导致细胞的恶性增殖,从而使恶性细胞获得“永生”。单克隆抗体通过作用于恶性肿瘤细胞膜上的生长因子及其受体可阻断存活信号传导通路,从而导致其凋亡,同时还能对化疗和放疗有正协同作用。目前主要集中在对血管内皮生长因子(VEGF)及其受体、表皮生长因子受体(EGFR)等的研究。美国FDA于2006年批准了第一个用于治疗头颈部鳞状细胞癌的单克隆抗体药物——Cetuximab,它为一种IgG1单克隆抗体,主要通过干扰癌细胞表面EGFR的生长,从而减少癌细胞进入正常组织的概率,控制癌细胞的转移,达到抗癌目的[sup][/sup]。最初想到制备针对恶性肿瘤凋亡相关分子的单克隆抗体药物时,虽然从理论上来说无疑是给人们注入了一针兴奋剂,但在实际应用中则并不然,所以在通过单克隆抗体药物诱导恶性肿瘤细胞凋亡的研究和治疗中,还有待进一步开发新的、更经济、更有效地药物。[b]四　 单克隆抗体耦联物[/b]4.1 抗体与化疗药物耦联目前,国内外研究较多的与单克隆抗体耦联的化学药物有平阳霉素、柔红霉素、丝裂霉素、多柔比星(阿霉素)、顺铂以及长春碱类衍生物等。同时还可以通过脂质体靶向制剂作为化疗药靶向治疗肿瘤,利用脂质体制剂将药物导向靶标进行有选择性地杀伤癌细胞和抑制癌细胞的繁殖,以达到提高疗效和高度定向作用。目前已上市的脂质体有复方氟脲嘧多相脂质体、喜树碱多相脂质体、阿霉素脂质体和紫杉醇脂质体等。4.2 抗体导向酶耦联利用抗体与肿瘤细胞表面抗原的特异性结合,将前体药物的专一性活化酶与单抗耦联,导向输入到靶细胞部分,再注入前体药物,使其在酶的作用下转化为活性药物,进而杀伤肿瘤细胞[sup][/sup]。目前这种用作前体药物的抗癌药有苦杏仁苷、氮芥、鬼臼乙叉苷、阿霉素、丝裂霉素等。而作为活化前体药物的导向酶有碱性磷酸酶、青霉素V或G酰胺酶、羧基酶肽、胸腺嘧啶核苷酶、β葡萄苷酶等。临床研究表明，单抗耦联物对于抗药性肿瘤细胞仍显示较强的杀伤活性。对由于长期使用氨甲蝶呤而出现抗药性的成骨肉瘤细胞,单抗氨甲蝶呤耦联物仍显示较强的杀伤作用。对于具有多药抗药性(MDR)的肿瘤细胞,抗P-170糖蛋白单抗构成的免疫毒素可显示选择性杀伤作用[sup][/sup]。这说明,单抗药物有可能用于克服肿瘤细胞抗药性。[b]五　　单克隆抗体靶向药物[/b]单抗靶向药物是利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别,从而把药物直接导向肿瘤细胞,提高药物的疗效,降低药物对循环系统及其他部位的毒性。研究表明,单抗靶向药物具有很好的疗效,在免疫偶联物对移植于裸鼠的相应人体肿瘤生长有抑制作用。免疫偶联物与相应的游离物比较,具有更高更好的疗效和较低的细胞毒性[sup][/sup]。单克隆抗体体积小,能更有效地透入肿瘤；分子小、消除快、累积毒性小；所携带的弹头脱离后,可较快被清除 循环中免疫靶向结合物对靶细胞的竞争作用小；半衰期短；穿透性好；能穿过血脑屏障[sup][/sup],因而还可以作为新一代靶向载体。与化学药物、毒素、放射性核素、生物因子、基因、分化诱导剂、光敏剂、酶等物质构成单克隆抗体靶向药物,把杀伤肿瘤细胞的活性物质特异的输送到肿瘤部位,利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别,从而把药物直接导向肿瘤细胞,提高药物疗效,降低药物对循环系统及其他部位的毒性。近年来,随着医学、药学和生物工程学及技术的进步,临床对肿瘤的根治和对癌细胞的攻击锁定于表皮生长因子和血管内皮生长因子等靶位,使药物治疗的切入点由细胞水平提升到分子和抗体水平,从而提高了肿瘤综合治疗的效果。[align=center]六　　人源化单克隆抗体[/align]单克隆抗体是近年竞相开发的品种,自1997年第1个单克隆抗体rituximab通过食品与药物管理局(FDA)批准应用于临床以来,目前已经上市的单克隆抗体靶向药物的疗效令人瞩目,在抗肿瘤、类风湿性关节炎和自身免疫系统缺陷治疗领域得到了有力的推广,其以独特的作用优势,在肿瘤的治疗中不但能够选择性杀伤癌细胞,且在体内表现出特异的分布特性,具有高效、低毒的特点,从而在生物技术产品领域中占据了1/3的市场[sup][/sup]。目前用于治疗肿瘤的单克隆抗体药已有多个,包括伊珠单抗奥加米星、帕尼单抗、曲妥珠单抗等。伊珠单抗奥加米星又名CMC-544，是以人源化抗CD22的抗体伊珠单抗与 CalichDMH偶联形成的ADC药物，用来治疗复发性或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B cell-NHL）和急性淋巴细胞白血病（ALL），目前已经进入临床 III期试验[sup][/sup]。帕尼单抗是一种IgG2单克隆抗体完全人源化可以与EGFR高度特异性地结合，进而阻断配体诱导的信号激活，从而抑制肿瘤生长。有临床研究选择既往未治疗过的ⅢB或Ⅳ期非小细胞肺癌患者比较卡铂(AUC=6，每3周)，加紫杉醇(200mg/m21次/3周) 联合或不联合帕尼单抗(2.5 mg/m2，1次/周) 化疗的疗效及其安全性。研究结果显示，单纯化疗组与帕尼单抗联合化疗组之间在PFS(5.3个月对比4.2个月、P=0.55)和总生存( Overall survival，OS)(8.0个月对比8.5个月，P =0.81)上均无显著差异。结果提示帕尼单抗联合一线化疗方案可能对晚期非小细胞肺癌无明显疗效[sup][/sup]。曲妥珠单抗是一种抗Her2的单克隆抗体，他可以和肿瘤细胞的HER2/neu特异性地结合，从而阻断细胞内生长信号的转导，同时曲妥珠单抗还可以诱导体内巨噬细胞以及自然杀伤细胞攻击肿瘤细胞，以达到抑制和杀伤肿瘤细胞的目的。比较用或不用曲妥珠单抗联合一线化疗方案用以治疗ⅡB/Ⅲ期HER2/neu阳性的 NSCLC患者差异的两项大型的随机Ⅱ期临床试验，其结果显示两个试验结论相似，曲妥珠单抗不能提高化疗的疗效,但也不加重化疗的不良反应。试验中HER2/neu值为3+的患者对曲妥珠单抗治疗的反应性较好，提示曲妥珠单抗对这一较少见类型的NSCLC效果要更好[sup][/sup]。在临床治疗中使用鼠派生单抗的主要障碍之一是产生人抗鼠抗体(HAMA)反应,通过基因工程技术制备嵌合抗体的I-IPdVIA反应率较鼠源性单抗低,但完全的人源抗体才是单抗药物的发展目标。噬茵体抗体库技术和转基因小鼠技术是制备完全人源单抗的两种方法[sup][/sup]。因此,只有不断地完善单克隆抗体人源化的技术,才能更好地将完全人源化的单克隆抗体用于肿瘤分子靶向治疗中,从而使医学界迈向更高的台阶。[b]七　　问题与对策[/b]在限制单克隆抗体临床治疗效果的因素有:(l)循环免疫复合物导致的肝肾功能损害。(2)可溶性肿瘤抗原释放造成的体液中的封闭作用。(3)异种蛋白反应。(4)特异性还不够专一,引起了正常细胞的伤害。(5)天然免疫功能低下(如补体介异的细胞毒,网状内皮系统清除和ADCC作用等)。(6)主要的问题还在这种免疫疗法会导致靶细胞(肿瘤细胞)上抗原的转换。为了解决这些问题,今后的研究应着重:(1)制备对肿瘤抗原有高度特异性的单克隆抗体。(2)选择不易诱导抗原转换的单克隆抗体。(3)研究副作用较少,既安全疗效又高的偶联制剂。单抗（Mab）药物存在的一个最关键问题就是人抗鼠抗体反应（HAMA）。由于用于临床研究的Mab药物一般使用鼠源Mab,这不可避免地会引起HAMA反应,所以尽量避免HAMA反应这一副作用才是Mab药物能否真正适合治疗肿瘤性疾病的重点[sup][/sup]。近些年来,Mab药物的研究主要是向减轻宿主对外源抗体的排斥,促进抗体人源化,改变抗体的氨基酸序列而增加或降低该抗体的生物学效应,加抗体的亲和力,制备双特异性抗体,改造抗体重链恒定区以增强抗体功能,以及寻找新的分子靶点(相对特异的肿瘤抗原)等方向发展[sup][/sup]。Mab药物的不断更新,必将为全球的肿瘤患者带来更大的希望。[align=center]八　　总结与展望[/align]目前肿瘤治疗中使用最广泛的仍是化疗以及放射性疗法,其毒副作用较大。随着基因工程技术和DNA重组技术的兴起,利用单克隆抗体治疗肿瘤已经日渐取代副作用较大的传统疗法而成为新的发展趋向。所以,如何研制更多的单克隆抗体以及怎样更好的利用单克隆抗体治疗肿瘤,将成为肿瘤治疗研究中的又一艰巨任务。同时,生物技术以及抗肿瘤化学药物的发展也必将推动单抗药物的发展与进步,单克隆抗体药物将在各种肿瘤的治疗中发挥越来越重要的作用。在未来10年内,单克隆抗体药将成为国内、外生物药品发展的主旋律。此外，利用与肿瘤细胞相关抗原的特异结合力,相应的单克隆抗体可以用于肿瘤早期诊断和预后判定。例如用放射标记抗体能够确定肿瘤存在的位置,扩散的部位和范围,以便确定手术时机和化疗方案。通过测定抗体结合白血病细胞的增减,可以检查白血病的化疗效果[sup][/sup]。利用单克隆抗体检测某些癌的特异性产物,如前列腺癌产生的酸性磷酸酶,绒毛膜上皮癌产生的促性腺激素,结肠癌产生的癌胚抗原及肝癌产生的甲胎蛋白等,有助于癌肿的早期诊断[sup][/sup]。单克隆抗体在肿瘤的治疗中的作用功不可没，但同时也面临着巨大的挑战，例如如何选择优势人群、进一步提高疗效、降低不良反应的发生都是需要进一步解决的。如贝伐单抗的突出不良反应是出血，在NCCN指南中特别指出贝伐单抗仅适用非鳞癌的[sup][/sup]，既往无咯血史的患者，限制了贝伐单抗的临床应用。而其他大部分单克隆抗体均需与其他化疗药物联用，单独应用的疗效仍有限，选择合适的指标以及合适人群应用单克隆抗体仍任重而道远。[b]参考文献[/b] Adams GP, Weiner LM．Monoclonalantibody therapy of cancer ．Nat Biotechnol，2005，23（9）：1147~1148 甄永苏．抗肿瘤抗生素和单克隆抗体药物的研究进展．中国抗生素杂志，2002，27（1）：1~5 Sievers E L, Larson R A, Stadtmauer E A, [i]et al[/i]．Effica-cy and safety ofgemtuzumab ozogamicin in patients withCD33-positive acute myeloid leukemia infirst relapse ．Clin Oncol，2001，19（21）：3244~3246 Kamiya K, Konno H, Tanaka T, [i]et al[/i]．Antitumor effect on humangastric cancer and induction of apoptosis by vascular endothelial growth factorneutralizing antibody ．Jpn J Cancer Res，1999，4（21）：794~798 邹学，李俊，尹庆春．单克隆抗体药物诱发肿瘤细胞凋亡的研究进展．总装备部医学学报，2008，10（2）：115~117 Rao AV, Schmader K．Monoclonalantibodies as targeted therapy in hematologic malignancies in older adults ．Am J GeriatrPharmacother，2007，5（3）：247~250 杨海东，罗傲雪，范益军．单克隆抗体在治疗肿瘤中的研究进展．时珍国医国药，2007，18（11）：2685~2686 甄红英，薛玉川，甄永苏．抗肿瘤抗生素C1027抑制血管生成及其抗肿瘤转移作用．中华医学杂志，1997，77（21）：657~660 刘霆．抗肿瘤单克隆抗体靶向药物的研究进展．国外医学生理、病理科学与临床分册，2003，23（3）：254~257 Plw a JL，Britta E，Jayne L，[i]et al[/i]．Targeting rat anti-mouse transferrinreceptor monoclonal antibody through blood-brain barrier in mouse ．pharmacology andexperiment therapeu-ties，2000，4（21）：1048~1057 刘德忠，张石革．分子和抗体靶向抗肿瘤药的研究进展．中国药房，2007，18（26）：2067~2068 丰雪，龙亚一，廖翰．抗肿瘤抗体-药物偶联物的临床研究进展．现代生物医学进展，2013，16（21）：3164~3168 江山，杨小琼．晚期非小细胞肺癌单克隆抗体治疗的研究进展．吉林医学，2013，34（35）：7482~7483 SpicerJ，Harper P．Targetedtherapies for non-small cell lung cancer ．In t J C l in Pract，2005，59（9）：1055~1057 彭建柳，杨丽华．人源化单克隆抗体用于肿瘤分子靶向治疗的研究进展．现代医院，2009，9（5）：8~11 王飞，董军，黄强等．转基因完全人抗体的制备及其抗肿瘤作用研究．中华神经外科疾病研究杂志，2002，1（1）：90~91 Kim J A．Targeted therapies for thetreatment of cancer ．Am J Surg，2003，186（9）：264~269 侯盛，郭亚军．单克隆抗体在肿瘤治疗中的应用．中国处方药，2007，4（61）：53~56 清水惠司．抗肿瘤用药的应用及进展．临床免疫，2009，13（11）：912~915 沈倍奋．抗体药物研究进展．第二军医大学学报，2002，23（10）：1047~1049

按照HJ 479-2009和HJ 482-2009做氮氧化物和二氧化硫，该方法都对斜率与截距有要求，，我自己做的斜率都是偏大的，不知道原因？，，还有在配制氮氧化物的吸收液时，吸光度也偏高，方法要求吸光度小于0.005，我做的0.011，完全按照方法操作，不知道原因？

[font='calibri'][size=13px]单克隆抗体的制备过程及原理是什么？[/size][/font][font='宋体'][size=13px]义翘神州是一家抗体试剂和定制抗体的领先供应商，目前已成功交付了数以万计的抗体项目，客户涵盖科研院校、生物制药公司、诊断公司和其他生物技术公司等。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]针对定制单克隆抗体，义翘神州提供了一套全面的解决方案。我们将与您通力合作，完成从抗原设计、纯化和抗体验证的完整过程。义翘神州拥有包括杂交瘤、噬菌体抗体库和单B细胞在内的抗体发现平台， 我们可根据您感兴趣的靶点、抗体应用和时间表等，来选择最合适的技术平台。 此外，义翘神州还提供ELISA、WB、流式细胞术、IHC、基于细胞的筛选、亲和力检测等多种表征和筛选技术，确保最终鉴定到最佳的抗体，以满足研究、诊断和治疗领域等应用。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]单克隆抗体的制备原理：[/size][/font][font='宋体'][size=13px]单克隆抗体(MAb)是针专一的抗原决定簇产生的抗体，单克隆技术又名杂交瘤技术起源于1975年，由G.K?hler和Milstein创立。主要原理是利用产生抗体的B细胞与肿瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]单克隆抗体的制备过程：[/size][/font][font='宋体'][size=13px]1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]2、细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。[/size][/font][font='宋体'][size=13px][url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services][b]单克隆抗体定制服务[/b][/url]推荐：https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/size][/font]

我做的氮氧化物曲线还不错，但样品值有点偏低，是怎么回事？

[font=宋体][font=Calibri]wb[/font][font=宋体]抗体选择单克隆还是多克隆抗体呢？首先要看你做的是什么物种，根据物种特异与否选择单抗或者多抗。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一般小鼠、大鼠等常用模式动物可以选择鼠源单克隆抗体，其特异性较好，如果是不常见动物模型，建议选择多克隆抗体。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]当然，单抗或者多抗也不是一定的，需要去查询抗原决定簇的归属，一般是找到抗体所对应的特异氨基酸序列，到数据库与你要做的物种进行比对，如果匹配度较高（[/font][font=Calibri]85%[/font][font=宋体]以上），则建议购买尝试。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二抗的选择相对就简单了，根据一抗的种属特异性进行二抗选择即可。[/font][font=宋体][font=宋体]如一抗选用鼠源（[/font][font=Calibri]Mouse[/font][font=宋体]）抗体，则二抗选用抗小鼠抗体即可（[/font][font=Calibri]e.g. Goat Anti-Mouse[/font][font=宋体]），注意二抗的反应特性（荧光、生物素或[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]偶联等）[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]其次就是多查阅文献，查看和[/font] [font=Calibri]Western Blot [/font][font=宋体]实验相关的 [/font][font=Calibri]SCI [/font][font=宋体]文献，查看要做的种属和指标关联度高的文献。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]Western Blot [/font][font=宋体]实验应该如何选择一抗和二抗[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为[/font] [font=Calibri]IgM[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgA[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgD[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgE [/font][font=宋体]五类，它们的重链分别为 [/font][font=Calibri]mu, gamma, alpha, delta, epsilon [/font][font=宋体]链。在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的 [/font][font=Calibri]IgG [/font][font=宋体]可分为 [/font][font=Calibri]IgG1[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG2[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG3[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG4 [/font][font=宋体]四个亚类。 轻链分为两种类型，[/font][font=Calibri]kappa[/font][font=宋体]链和[/font][font=Calibri]lambda[/font][font=宋体]链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。 [/font][/font][font=宋体][font=宋体]二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如[/font] [font=Calibri]western blot[/font][font=宋体]（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]如何选择二抗[/font][font=宋体]——根据一抗种属及类型选择合适的二抗[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]广义上是指专门和进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，上海信帆生物科技有限公司为您的科研工作提供适合和全面的二抗产品。检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗 [/font][font=Calibri]IgG [/font][font=宋体]抗体。其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠 [/font][font=Calibri]IgM[/font][font=宋体]，那么相应的二抗就应当是抗小鼠 [/font][font=Calibri]IgM[/font][font=宋体]。如果单克隆一抗是小鼠 [/font][font=Calibri]IgG [/font][font=宋体]的某一亚类（[/font][font=Calibri]IgG1[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG2a[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG2b[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG3[/font][font=宋体]），那么几乎所有的抗小鼠 [/font][font=Calibri]IgG [/font][font=宋体]都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠 [/font][font=Calibri]IgG1[/font][font=宋体]，那么你可以选择抗[/font][font=Calibri]IgG1 [/font][font=宋体]的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。在不清楚一抗为何种类[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]亚类的情况下，可以选用抗相应物种 [/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。有相应的驴来源的二抗，非常适合做类似双标的免疫实验。【二抗的耦联标记】[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶[/font] [font=Calibri]HRP [/font][font=宋体]和碱性磷酸酶 [/font][font=Calibri]AP [/font][font=宋体]或其衍生物，[/font][font=Calibri]PAP[/font][font=宋体]），荧光基团（[/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体]、 [/font][font=Calibri]Rhodamine[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Texas Red[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]PE[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Rhodamine[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Dylight [/font][font=宋体]等）、生物素、金颗粒。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于 [/font][font=Calibri]Western Blot [/font][font=宋体]和 [/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]，常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用 [/font][font=Calibri]Biotin/Avidin[/font][font=宋体]检测系统。在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记；而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供单抗和多抗制备服务，同时有[/font][font=Calibri]Western Blot[/font][font=宋体]检测服务，详情可以关注[/font][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/polyclonal-antibody-production-services][b]多克隆抗体制备服务[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/polyclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services][b]单克隆抗体定制服务[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=宋体][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]Western Blot[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]检测服务[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service[/font][/font][font=Calibri] [/font]

[size=16px]克隆形成实验[/size][size=16px]及划痕实验[/size][size=16px]、[/size][size=16px]流式细胞术[/size][size=16px]操作步骤[/size]软琼脂克隆形成实验检测单细胞克隆形成能力软琼脂克隆形成实验适用于悬浮生长的细胞。1. 配胶液：用蒸馏水和琼脂糖粉配制浓度为 0.3% 的琼脂糖液，高压灭菌，置于42℃ 水浴锅中，目的是为了使其保持融化状态。2. 配制含 20% FBS 的 2×1640 培养基，用 0.22 ?m 的滤器过滤除菌。3. 铺下层胶：将 0.6% 的琼脂糖胶液与 2×1640 培养基等体积混合，以每孔 1.5mL 加至 6 孔板中，室温等其凝固。4. 细胞计数：将细胞用 PBS 洗一遍，离心，加入新的培养基混匀稀释，计数。H69-NC、H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-NC、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-NC、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2 均以 1×104/孔铺入 6 孔板。5. 铺上层胶：将 0.3% 的琼脂糖胶液与 2× 培养基 1：1 混合，加入 100 μL 细胞悬液，混匀后，每孔加入 1.5 mL 混合液。6. 放入 37℃，5%CO2 培养箱培养，约 2-3 周后终止培养。7. 比较细胞克隆形成能力的差异，利用 Graphpad prism5 作图计算两种细胞克隆形成能力的差异。平板克隆形成实验检测单细胞克隆形成能力平板克隆形成实验适用于贴壁生长的细胞。1. 细胞处理：将 SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞，用 PBS洗一遍，用胰酶消化并计数。2. 接种细胞： 将细胞接种于 6 孔板中， SW1271-NC 、SW1271-shMSI1-1 、SW1271-shMSI1-2 接种密度为 3×103/孔，注意一定让细胞均匀分布。于 37℃，隔离CO2 静置培养 2-3 周（终止培养时间以不小于 2 周且克隆之间不发生融合为标准）。3. 出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去旧培养基， 用 PBS 清洗 2 次，用 4% 多聚甲醛固定液固定 20 min，吸除固定液，用蒸馏水清洗 2 次后加适量结晶紫染色15-20 min，用蒸馏水洗去结晶紫，自然风干，用扫描仪扫描成图片。4. 在低倍镜下计数大于 50 个细胞的克隆数。5. 计算克隆形成率。细胞划痕实验1. 用记号笔在 12 孔板底部划两条平行线做为标记。2. 将 SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞接种至 6 孔板。3. 待细胞汇合度为 90% 左右时，用 10μL 枪头垂直于两条平行标记线进行划痕。4. 吸除培养基，1xPBS 漂洗 2 次，并换用无血清培养基培养。5. 分别在划痕后培养 0h，12h，24h，48h，72h 观察细胞迁移情况并拍照。流式细胞术1. 收集 H69、H82、H526、SW1271 的对照组和实验组细胞(包括培养上清中的细胞)，收集 1 - 10 ×105 个细胞，用预冷 PBS 离心洗涤。用双蒸水稀释 5 ×Binding Buffer为 1 × 工作液，取 500 μl 1 × Binding Buffer 重悬细胞。2. 每管加入 5 μl Annexin V-APC 和 10 μl 7-AAD。3. 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育 5 分钟。4. 上机进行分析。

鉴于本人还是零蛋一个,特发此贴,虽然得分不是最主要目的,但零分确实很让人难受啊!单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。二、杂交瘤技术（一） 杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。（二） 基本程序和方法杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。1、动物免疫(1) 抗原制备 制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。(2) 免疫动物的选择 根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。(3) 免疫程序的确定 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。