细胞线粒体分离试剂盒

现如今市场上的ELISA试剂盒种类繁多，但是要如何找到适合你的那款呢？一款合适的细胞分离试剂盒可以说是实验成功的保障，因为只有获得正确的细胞，下游的分析结果才可能准确。目前，市面上有多种多样的分离试剂盒可供选择，它们的主要区别在于分离方法和筛选标志。正向选择VS负向选择细胞分离试剂盒的工作原理主要有两种，正向选择和负向选择。正向选择的试剂盒，使用与目标细胞直接结合的抗体来进行捕获。这种抗体通常与磁珠相连，可以利用磁铁将悬液中的抗体-磁珠-细胞复合物提取出来，再通过二抗将磁珠与目标细胞分开。负向选择的试剂盒也采用类似的抗体包被磁珠，不过这种试剂盒是通过去除样品中的非目的细胞，来间接捕获目的细胞。这两种细胞分离试剂盒如何取舍，主要取决于目标细胞的表面是否具有特异性强的筛选标志。这样的筛选标志能够实现特异性的捕获，避免所获得的细胞被非目标细胞污染。如果你的目标细胞刚好具有这样的筛选标志，那么正向选择的细胞分离试剂盒就是最佳选择。但如果目标细胞并不具有特异性强的筛选标志，那我们最好还是选用负向选择的细胞分离试剂盒。

WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT、WST-1或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点，成为细胞增殖与活性测定新选择。国际知名生化试剂供应商Cayman Chemical提供的WST-8 Cell Proliferation Assay Kit（WST-8细胞增殖分析试剂盒）及WST-8，因其超高性价比，受到国内外科研工作者的追捧！ WST-8是一种水溶性四唑盐，常用于评估细胞的代谢活性。在中性pH值及中间电子受体存在的情况下，被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的蓝/紫色甲臜产物（formazan）。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。http://www.bio-review.com/wp-content/uploads/2016/04/WST.jpg图1：WST-8作用原理以前，客户习惯用MTT、WST-1法测定细胞增殖，WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点：WST-8溶液对细胞的毒性非常低，细胞在WST-8法检测后仍然可以正常生长MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。WST-8比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比线性范围更宽，灵敏度更高。WST-8和WST-1相比，检测灵敏度更高，更易溶解，并且更加稳定。WST-8 Cell Proliferation Assay Kit（WST-8细胞增殖分析试剂盒，货号：10010199）及WST-8（货号：18721）。http://www.bio-review.com/wp-content/uploads/2010/06/ads1-earthox.gif产品名称及描述品牌货号产品说明WST-8 Cell Proliferation Assay KitCayman10010199 WST-8 Cell Proliferation Assay Kit特点：比色法、无放射性测定细胞活性及增殖可定量的细胞密度高达5×106cells/ml，每孔可定量2,000-500,000的细胞快速分析，2-4h得结果操作简便、灵敏度高、数据可靠、重现性好这么无敌的试剂盒，价格还便宜！该试剂盒含两种Cayman Chemical专利组分：WST-8 Developer Reagent及Electron Mediator Solution。简便的试剂盒操作步骤如下：将WST-8 Developer Reagent和Electron Mediator Solution等比混合，制成混合物将混合物加入细胞（如果需要测细胞毒性，此过程中加待测药物），共孵育450nm，读取吸光值。http://www.bio-review.com/wp-content/uploads/2016/04/result-1.png图2：白血病细胞活性测定结果建议参考文献：Li, Li, et al. "Protective effects of decursin and decursinol angelate against amyloid β-protein-induced oxidative stress in the PC12 cell line: the role of Nrf2 and antioxidant enzymes." Bioscience, biotechnology, and biochemistry 75.3 (2011): 434-442.Lin, Tzu-yin, et al. "Targeting canine bladder transitional cell carcinoma with a human bladder cancer-specific ligand." Molecular cancer 10.1 (2011): 1.Li, Li, et al. "Decursin Isolated from Angelica gigas Nakai Rescues PC12 Cells from Amyloid-Protein-Induced Neurotoxicity through Nrf2-Mediated Upregulation of Heme Oxygenase-1: Potential Roles of MAPK." Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2013 (2013).Martinesi, M., et al. "Biocompatibility studies of low temperature nitrided and collagen-I coated AISI 316L austenitic stainless steel." Journal of Materials Science: Materials in Medicine 24.6 (2013): 1501-1513.l向全球科学工作者提供多研究领域的生化、免疫试剂和分析试剂盒，其产品被广泛应用于肿瘤、氧化氮、神经学、凋亡、氧化性损伤、内分泌学等不同研究领域。Cayman Chemical还提供各种有机化合物和生物化合物的定制合成服务，被视为全球最复杂和最不稳定化合物合成的唯一供应商。作为Cayman Chemical在中国的区域总代理，将为中国客户提供最全面的Cayman Chemical产品及客户订制化服务。如果您对以上产品及Cayman Chemical产品感兴趣，

elisa试剂盒种类繁多，有检测食品残留物的食品安全检测elisa试剂盒，也有检测动植物的人elisa试剂盒，猪elisa试剂盒，小鼠elisa试剂盒，植物elisa试剂盒；还有检测细胞因子试剂盒，传染病检测ELISA试剂盒，肿瘤标志物检测ELISA试剂盒等等，下面为您详细介绍常见的一些elisa试剂盒种类有哪些。一、食品安全检验ELISA试剂盒是指食品中的激素、药物、霉菌毒素、过敏原残留、转基因产品的检测试剂盒，以及微生物、维生素等的检测产品。包括植物病毒、细菌、真菌、植物激素和转基因作物的农业诊断试剂盒，以及动植物疾病诊断类如猪、牛、羊、马等家畜和禽类以及宠物类检测试剂盒。二、生物原装ELISA试剂盒以及各类国产ELISA试剂盒1、细胞因子检测试剂盒：如白介素、选择素、集落刺激因子，肿瘤坏死因子，干扰素，转化生长因子，趋化因子，细胞因子受体，粘附分子，生长因子，凋亡因子等等2、心肌梗塞检测ELISA试剂盒如肌钙蛋白，肌红蛋白，C-反应蛋白等等3、内分泌检测ELISA试剂盒如甲状腺，胰腺，性激素，孕酮，睾酮，生长激素，生长抑素，内皮素，皮质醇，骨钙素，催乳素，促肾上腺皮质激素，促卵泡素，雌二醇，雌三醇，5-羟色胺，17-羟孕酮等等4、肝纤维化检测ELISA试剂盒如纤维连接蛋白，透明质酸，胶原，基质金属蛋白酶抑制因子，基质金属蛋白酶，层粘蛋白等等5、自身免疫检测ELISA试剂盒如甲状腺，盐水可提取核抗原抗体(ENA)，抗核抗体，DNA，抗心磷脂抗体，类风湿因子，循环免疫复合物，抗胰岛细胞抗体，胰蛋白酶原，Sm，大疱性类疱疮，蛋白酶，短膜虫法，肝-肾，肝-肾-胃，肌内膜抗体，角蛋白抗体，抗核抗体，抗核糖体蛋白抗体，抗聚角蛋白微丝蛋白抗体，抗链O，抗卵巢抗体，抗平滑肌抗体，抗线粒体抗体，等等7、优生优育检测ELISA试剂盒如早早孕，新生儿TSH，胎膜早破检测，抗子宫内膜抗体，抗心磷脂抗体，抗透明带抗体，抗卵细胞透明带抗体，抗卵巢抗体，抗精子抗体，巨细胞病毒，弓形体，风疹病毒，分娩预测，单核白细胞增多症，单纯疱疹病毒，促卵泡素，促黄体生成素，便隐血试纸，HCG等等8、传染病检测ELISA试剂盒如幽门螺杆菌，乙脑，乙肝，丙肝，丁肝，戊肝，庚肝，衣原体，性病，腺病毒，微小病毒B19，天疱疮，水痘-带状疱疹病毒，生殖支原体，伤寒，沙眼，腮腺炎，人型支原体，麻疹，轮状病毒，流行性出血热，淋球菌，莱姆病，柯萨奇，抗解尿支原体，军团菌，结核，胶原，尖锐湿疣，甲肝，脊髓灰质炎，急性胰腺炎尿胰蛋白酶，霍乱，呼吸道合胞病毒，肝吸虫，副流感，肺炎，带状疱疹，传染性单核细胞增多症，层粘蛋白，布鲁氏杆菌，百日咳，白喉，艾柯病毒，EB 病毒，A族链球菌等等9、特种蛋白检测ELISA试剂盒如免疫球蛋白，抗链O-aso，类风湿因子RF，C反应蛋白，微量白蛋白，β-2微球蛋白human，铁蛋白，转铁蛋白transferrin等等

[quote]项目概况中国科学院动物研究所单细胞建库试剂盒采购项目 采购项目的潜在供应商应在北京市海淀区西直门北大街甲43号金运大厦B座1103室（西直门文慧桥西南角）。获取采购文件，并于2022年11月16日 14点00分（北京时间）前提交响应文件。[/quote][font=inherit]一、项目基本情况[/font]项目编号：HSZT2022HC/186项目名称：中国科学院动物研究所单细胞建库试剂盒采购项目采购方式：竞争性磋商预算金额：96.9193000 万元（人民币）最高限价（如有）：96.9193000 万元（人民币）采购需求：1.1.4 采购内容：遴选1家供应商为采购人提供如下试剂采购[table][tr][td][align=center][font=inherit]包号[/font][/align][/td][td][align=center][font=inherit]采购试剂名称[/font][/align][/td][td][align=center][font=inherit]数量[/font][/align][align=center][font=inherit]（台/套）[/font][/align][/td][td][align=center][font=inherit]最高投标限价[/font][/align][align=center][font=inherit]（人民币：万元）[/font][/align][/td][td][align=center][font=inherit]是否允许采购进口产品[/font][/align][/td][td][align=center][font=inherit]项目用途[/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]单细胞建库试剂盒[/align][/td][td][align=center]可做80个样本，含80次单细胞基因表达的全部试剂[/align][/td][td][align=center]96.9193[/align][/td][td][align=center]是[/align][/td][td][align=center]科研[/align][/td][/tr][/table][b][font=inherit]附件：采购内容及要求[/font][/b][align=center][font=inherit]单细胞建库试剂盒采购内容及要求[/font][/align][b][font=inherit]1.工作条件：参照中国科学院动物所实验室相关要求。[/font][font=inherit]2.试剂功能：[/font][/b]试剂盒可以完成80个反应的单细胞基因表达测序文库构建，提供从悬浮细胞到构建完成的测序文库的全部相关试剂。[b][font=inherit]3.技术指标：[/font][/b]#3.1 每份凝胶微珠反应试剂可以通过10x Genomics仪器在微流控芯片中为每个样本提供不少于200万个独立的液滴反应体系，凝胶微珠含有75万个独特的序列标签（每个标签由14个碱基构成）；3.2 一张芯片实验可处理样本数量不少于8个。[font=inherit]#[/font]3.3 试剂捕获细胞的效率：在每份样本的细胞群体中捕获大于50%的细胞，每1000个捕获细胞中含有双细胞的比例低于0.8%；[font=inherit]#[/font]3.4 反应时间及通量：在30分钟内完成独立样本的细胞包裹裂解等过程，针对单个样本可同时完成1000-10000个细胞的制备；[font=inherit]#[/font]3.5 提供单细胞建库全部应用试剂；3.6 系统提供Illumina兼容测序文库；[font=inherit]#[/font]3.7 在100k reads/cell测序深度下，检测293T细胞的基因数量不少于3000个[font=inherit]*3.8[/font]试剂到货验收后，有效期不少于3个月。[b][font=inherit]4.产品配置要求[/font][/b]单细胞建库试剂盒：数量要求——可做80个样本，含80次单细胞基因表达的全部试剂[b][font=inherit]5.技术文件：[/font][/b]5.1 试剂详细配置清单、各项技术参数及技术证明文件。5.2 技术服务条款、技术培训条款及售后服务承诺。[b][font=inherit]6.报价方式：[/font][/b]以免税单价报价，对原产于美国的产品，进口时在正常的科创免税之外，中国政府加征的特殊关税由中标人承担。[b][font=inherit]7．延误到货处罚：[/font][/b]超过约定的时间到货或发货（非免税试剂在合同签订后1个月内到货，免税试剂在拿到免表通知后2周内发货），罚金为当批次货款的5%，之后每延后5个工作日，增加1%的当批次货款罚金，罚金不超过当批次货款的15% 。[font=inherit]8. [/font][font=inherit]订货数量：可做80个样本，含80次单细胞基因表达的全部试剂[/font][font=inherit]9.交货地点：[/font][font=inherit]中国科学院动物研究所用户指定地点[/font][font=inherit]。[/font][font=inherit]10.交货日期：非免税试剂在合同签订后1个月内到货，免税试剂在拿到免表通知后2周内发货。[/font]合同履行期限：非免税试剂在合同签订后1个月内到货，免税试剂在拿到免表通知后2周内发货。本项目( 不接受 )联合体投标。

CCK-8检测试剂盒的优势有很多，看下面的详细介绍如下表，CCK-8检测试剂盒对细胞增殖/毒性检测优势比较，结果不言而喻！ 检测方法MTT法XTT法WST-1法CCK-8法甲臜产物的水溶性差（需加有机溶剂溶解后再检测）好好好产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用即开即用即开即用检测灵敏度高很高很高高检测时间较长较短较短最短检测波长560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm细胞毒性高，细胞形态完全消失很低，细胞形态不变很低，细胞形态不变很低，细胞形态不变试剂稳定性一般较差一般很好批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷* 细胞毒性非常低，因此加入WST-8显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到最佳测定时间* 酚红和血清对CCK法的检测不会造成干扰（扣除空白孔即可）如何选择合适的CCK-8检测试剂盒？目前市面上能提供的【CCK-8】细胞增殖／毒性检测试剂盒有国产分装或原产的，国产分装的CCK-8试剂盒在质量稳定性上有不足。而原产于国内实验室的CCK-8试剂盒有些具有较好的检测结果，在批次之间的稳定性上较难控制。至于原装进口供应CCK-8试剂盒的进口品牌并不多，就连Abcam、Thermo，Sigma等等几个品牌都不能够提供CCK-8试剂盒，而其它品牌在性价比上远逊于Abbkine产品。CCK-8检测试剂盒综合对比品牌（规格）AbbkineSigmaDojindo100次200 元703.17 元350 元500次640 元2779.92 元890 元2000次2050 元13899.6 元(3000次）——10000次7180 元——8380 元

目前市场上的ELISA试剂盒质量参差不齐，如何去挑选适合自己的试剂盒就显得特别重要，具体有以下几点可供参考： 一、特异性ELISA试剂盒的特异性与试剂盒的关键组分，抗体对有关，若抗体对中之一为多抗，另一个必须为单抗，建议使用双单抗。 二、灵敏度灵敏度反映的是试剂盒检出被检物质的最低量的能力，用户可根据自己样本中待检指标的量选择合适的试剂盒，如果待检指标量很低，一般的试剂盒不能满足要求，可选择高敏的ELISA试剂盒。 三、重复性科学实验讲求重复性，一般ELISA试剂盒，其板内和板间变异系数应该控制在15%以内。 四、简便性试剂盒在保证高质量数据的情况下，实验时间越短，操作越便利，越容易受到用户欢迎！这也不妨作为选择试剂盒的一个指标。 五、经济性进口分装试剂盒因为省去不少物流和报关费用，与国外原装进口试剂相比价格上有比较大的优惠，而且能提供比较灵活的包装规格，特别是48T等小包装，目前很多客户因为对品牌的信任度问题，主要还是选择国外原装进口，但是国内进口分装比较成熟的公司仍然是一个非常好的选择！ 六、美誉度一个品牌不光要有知名度，更重要的是美誉度。通过行业调查公司以及网络，相关宣传资料等可以找到美誉度高的ELISA试剂盒供应商，这个反映的不仅是产品质量的问题，对供应商的售前售后服务也是一个非常严格的检验。目前国际上主要的ELISA供应商有R&D细胞因子方面的试剂盒，Bender粘附分子方面的试剂盒，Cayman花生四烯酸类产品的试剂盒，Merck(Linco)内分泌研究方面的试剂盒，Invitrogen(Biosource)磷酸化蛋白的ELISA，动物细胞因子ELISA试剂盒等，国内主要的ELISA试剂盒供应商有欣博盛生物科技有限公司，上海吉泰（依科赛）等。 七、文献引用产品的文献引用特别是高质量的SCI文章的引用是很多用户都关心的问题，这是业界对产品认可的一个非常重要指标，而且对相关用户的科研有一定的借鉴作用。

ELISA酶联免疫法是如今最热门的实验操作方法，但是科研人员似乎并不满足，一直在研究更快捷更高效的elisa试剂盒，正是因为有他们的努力才能让我们的实验做的越来越成功。RNA提取实验已经是大家耳熟能详的基础生物学实验了，目前有关RNA提取的elisa试剂盒产品也是五花八门，各具特色，我们也都知道，从原始样本到试剂盒操作提取, 到核酸的步骤越多，无疑最后得到的数据相对于样本的真实性偏离得越远，那么有没有什么方法能打破这个局限性，尽量省去中间操作步骤而减少实验误差呢？ZyGEM公司现推出完全不同于传统RNA提取的新型RNAGEM™核酸纯化系列产品，主要有RNAGEM™ Tissue和RNAGEM™ Tissue Plus二大类，用于从哺乳动物细胞、激光捕获微组织以及流式细胞检测样本如巨噬细胞等快速自动化提取RNA。所有的反应均在PCR管中进行，单管封闭操作，仅需控制温度，整个过程只需20分钟，中途无需过柱离心等烦琐步骤，非常适合大规模自动化提取。产品所有优点都只为更好地应用于科研，让实验变得更简单，更省心，更安心。 1 无需花大量时间做样本预处理 2 无需昂贵的大型仪器及配套试剂 3 节省大量管和枪头的费用 4 避免接触苯酚等毒害试剂，健康环保 5 操作简便省时，可以快速进入下游基因表达实验，并得到100％可重复结果

乳腺癌是世界范围内女性最常见的致死性恶性肿瘤，据统计，2020年女性乳腺癌已超越肺癌成为全球癌症发病率最高的癌种[1-2]。其中三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）均呈阴性表达的乳腺癌亚型，占所有乳腺癌的15%～20%[3]，具有侵袭力强、转移率高、术后复发率高、预后差的特点[4]。由于TNBC内分泌治疗的不确定性及靶向治疗的不应答性，导致临床上的治疗效果不理想[5-6]。因此，寻找有效抑制TNBC增殖转移的药物、降低患者的病死率一直是乳腺癌基础研究的一个重要方向[7-8]。 石蒜碱是石蒜Lycoris radiata (L'Hér.) Herb.、文殊兰Crinum asiaticum L. var. sinicum (Roxb. et Herb.) Baker、朱顶红Hippeastrum rutilum (Ker.-Gawl.) Herb.等石蒜属植物鳞茎中含量较高的异喹啉类生物碱，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎镇痛、保肝等药理活性[9-10]，近年来石蒜碱的抗肿瘤作用受到众多研究者的关注。有文献报道石蒜碱对人乳腺癌MCF-7细胞[11]、人宫颈癌Hela细胞[12-13]、人肝癌HepG-2细胞[13-16]、人胃癌SGC-7901细胞[17]、人结肠腺癌LoVo细胞[18-19]具有显著的抑制作用，但对其作用机制的研究仍然处于初始阶段。本研究以人乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究对象，主要通过体外实验从细胞水平和分子水平探讨石蒜碱对MDA-MB-231细胞的体外抑制活性及其通过线粒体氧化损伤诱导肿瘤细胞自噬及凋亡的机制，为今后石蒜碱抗肿瘤新药的深入研发和临床实践提供理论基础和实验参考。 1 材料 1.1 细胞株 MDA-MB-231细胞由国家教育部抗肿瘤天然药物工程技术研究中心提供。 1.2 药品与试剂 石蒜碱（批号34296，质量分数98%）购自阿拉丁试剂有限公司；胎牛血清（批号0201021）购自浙江杭天生物科技公司；RPMI 1640细胞培养基（批号AD123707271）购自美国HyClone公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批号20200901）购自天津中和盛泰化工有限公司；Hoechst 33258染液（批号C1011）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（批号P0015）、吉姆萨染液（批号C0131）、CCK-8试剂盒（批号C0043）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒（批号S0033S）、PMSF（批号ST505）、HRP标记的山羊抗大鼠IgG二抗（批号A0192）、Western blotting及IP细胞裂解液（批号072318180723）、30% Acr-Bis（批号093018181017）购自碧云天生物技术研究所；碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液（批号R20285）、Rhodamine 123（批号R8004）购自美国Sigma公司；台盼蓝（批号72-52-1）购自美国默克公司；Reagent A染液（批号5000113）购自北京诺博莱德科技有限公司；聚山梨酯20（批号20190207）购自美国Biotopped公司；Tris（批号181127）购自美国Amresco公司；兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗体（批号WL02512）、兔抗B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体（批号WL01506）、兔抗Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体（批号WL02385）、兔抗细胞色素C（cytochrome-C，Cyt-C）抗体（批号WL04963）、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号WL01114）购自沈阳万类生物科技有限公司；兔抗线粒体内膜转位酶（translocase of inner membrane，TIM）抗体（批号PSI-RF16109）、兔抗线粒体外膜转位酶（translocase of outer membrane，TOM）抗体（批号PSI57577）、兔抗E3泛素连接酶（E3 ubiquitin protein ligase，PARKIN）抗体（批号PSI50248）、兔抗PTEN诱导的激酶1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）抗体（批号PSI7859）、兔抗微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3-B）抗体（批号BS79705）、兔抗p62抗体（批号p196-269）购自艾美捷科技有限公司。 1.3 仪器 ECO-170P-230型细胞培养箱、Model 680型酶标仪（美国NBS公司）；Adventurer型万分之一电子天平（美国OHAUS公司）；EPICS-XL型流式细胞仪、AllegraTM 64R型低温高速离心机（美国Beckman-Coulter公司）；CKX-41-32型倒置显微镜（日本Olympus公司）；荧光显微镜、TCS-SP2激光共聚焦扫描显微镜（德国Leica公司）；680型全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）；P型微量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url]（芬兰百得公司）；标准型PB-10 pH计（德国Sartorius公司）；GIS-2019型Tannon凝胶成像系统（天能科技有限公司）；DYY-7C型电泳仪、M344039型垂直电泳转印槽（北京六一仪器厂）。 2 方法 2.1 细胞培养 MDA-MB-231细胞复苏后接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，待细胞长势良好时进行传代，取对数生长期的细胞进行实验。 2.2 CCK-8法检测细胞增殖活性 MDA-MB-231细胞以2×103个/孔接种于96孔板中，细胞培养24 h后，给药组每孔加入不同浓度（2、4、8、16、32 μmol/L）的石蒜碱100 μL，对照组加入100 μL细胞培养基，每组均设置6个平行孔，处理48 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养4 h。采用酶标仪检测490 nm处的吸光度（A）值，计算各组细胞的增殖抑制率与石蒜碱对MDA-MB-231细胞的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）。 2.3 倒置显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜观察细胞形态变化 MDA-MB-231细胞以3×103个/孔分别接种于2块6孔板中，细胞培养24 h后，根据石蒜碱对MDA-MB-231细胞的IC50设定3个给药剂量，分别以3、6、12 μmol/L的给药浓度每孔加入石蒜碱1 mL，对照组加入1 mL细胞培养基，继续处理48 h。取1块板用倒置显微镜观察并拍照后，每孔加入1 mL多聚甲醛固定1 h，冲洗后加入200 μL Hoechst 33258染液，37 ℃孵育30 min后，用荧光显微镜观察并拍照；取另1块板收集各组细胞，用预冷的PBS重悬细胞并弃去上清液，加入Annexin V-FITC于37 ℃避光孵育15 min，冲洗后加入PI染液于4 ℃避光孵育15 min后，用激光共聚焦扫描显微镜观察并拍照。 2.4 集落实验检测细胞克隆能力 MDA-MB-231细胞以1×103个/孔接种于6孔板中，细胞培养24 h后，按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，连续培养7 d后弃去培养基。PBS洗涤后用甲醇固定10 min，冲洗后加入吉姆萨染液染色后，用倒置显微镜观察细胞集落形成率并拍照。 2.5 划痕实验检测细胞迁移能力 MDA-MB-231细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，细胞培养24 h，细胞融合至70%～80%后，用200 μL[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url]倚靠直尺，枪头垂直于每孔底部竖直划痕。PBS冲洗后，按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h后，用倒置显微镜观察细胞的迁移情况并拍照记录，比较各组间的划痕宽度，使用Image J软件测量并计算划痕愈合率。 2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率 按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h后，收集各组细胞，加入70%冷乙醇2 mL于4 ℃固定24 h后离心。弃去上清液，PBS冲洗后，加入800 μL PI染液，4 ℃避光孵育30 min，经尼龙网滤过后，采用流式细胞仪进行检测，激发波长为488 nm。 2.7 流式细胞仪检测ROS水平 按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h，收集各组细胞，PBS洗涤后加入5 μmol/L DCFH-DA染液0.2 mL，37 ℃避光孵育20 min，经尼龙网滤过后，采用流式细胞仪进行检测。 2.8 流式细胞仪检测线粒体膜电位 按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h后，收集各组细胞，PBS洗涤后，避光加入Rhodamine 123染料，避光孵育30 min后离心弃去上清液，用PBS洗涤并混匀细胞，经尼龙网滤过后，采用流式细胞仪进行检测。 2.9 激光共聚焦扫描显微镜检测线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）活性 按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h后，收集各组细胞，加入37 ℃预热的Reagent A染液500 μL，离心后弃去上清液。37 ℃避光加入染色工作液，混匀后孵育20 min，离心去除上清液，将细胞吹打混匀后，经尼龙网滤过，采用激光扫描共聚焦显微镜检测并进行拍照。 2.10 Western blotting检测线粒体自噬相关蛋白TIM、TOM、PARKIN、PINK1、LC3-B、p62和凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2、Cyt-C表达 按“2.3”项下方法对细胞进行分组和给药，培养48 h后，收集各组细胞，加入含PMSF的细胞裂解液，冰上裂解30 min后将细胞加入EP管中，离心15 min。取上清液，煮沸使蛋白变性，采用BCA试剂盒定量蛋白浓度。采用SDS-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后加入二抗，37 ℃孵化2 h，洗膜后加入化学发光试剂，采用凝胶成像系统拍照并进行分析。 2.11 统计学分析 用SPSS 21.0软件进行统计分析，数据以表示，多样本均数比较采用One-way ANOVA分析，通过Graphpad Prism 8软件绘图。 3 结果 3.1 石蒜碱对MDA-MB-231细胞增殖的影响 如图1所示，石蒜碱对MDA-MB-231细胞具有显著的增殖抑制作用（P＜0.01），且呈浓度相关性。石蒜碱对MDA-MB-231细胞的IC50为6.21 μmol/L，并参考IC50值设定后续石蒜碱给药浓度分别为3、6、12 μmol/L。 3.2 石蒜碱对MDA-MB-231细胞形态的影响 采用倒置显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察石蒜碱对MDA-MB-231细胞形态的影响，如图2所示，与对照组比较，石蒜碱给药后，随着给药浓度增加，细胞生长逐渐变稀疏，细胞膜破裂现象更加明显，细胞间轮廓更加模糊，细胞核固缩形成凋亡小体，发出较强荧光。 3.3石蒜碱对MDA-MB-231细胞克隆、迁移的影响 集落实验结果表明，石蒜碱可以抑制MDA-MB-231细胞的克隆能力（图3-A），且随着浓度的增加细胞集落数量逐渐减少，且呈浓度相关性。划痕实验结果显示，石蒜碱可以显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力（P＜0.01，图3-B、C），呈剂量相关性。 3.4 石蒜碱对MDA-MB-231细胞凋亡率、ROS水平的影响 如图4-A、B所示，经流式细胞仪PI单染法检测出现明显的凋亡峰，表明DNA的合成受到抑制，且随着给药浓度增加，凋亡峰越明显，凋亡率也呈上升趋势，与对照组比较有显著性差异（P＜0.01），且呈浓度相关性。如图4-C、D所示，随着给药浓度增加，细胞内ROS水平逐渐升高，具有显著性差异（P＜0.01），且呈浓度相关性。 3.5 石蒜碱对MDA-MB-231细胞线粒体膜电位和MPTP的影响 如图5-A、B所示，经流式细胞仪检测，随着石蒜碱给药浓度增加，细胞内线粒体膜阳性表达率逐渐降低，具有显著性差异（P＜0.01），且呈浓度相关性。如图5-C、D所示，应用激光扫描共聚焦显微镜结合AM染色技术对不同浓度的石蒜碱作用48 h后的MDA-MB-23细胞进行检测，激光扫描共聚焦显微镜扫描得到的荧光象素强度反映出细胞膜通透性的改变，随着给药浓度增加，细胞内线粒体膜通透性逐渐升高，具有显著性差异（P＜0.01），且呈浓度相关性。 3.6 石蒜碱对MDA-MB-231线粒体自噬和凋亡相关蛋白表达的影响 应用凝胶成像系统分析MDA-MB-231细胞中线粒体自噬和凋亡相关蛋白表达的情况。如图6所示，随着石蒜碱浓度增加，细胞自噬相关蛋白TIM、TOM和p62蛋白表达量逐渐降低，PARKIN、PINK1和LC3-B蛋白表达量逐渐升高，均具有显著性差异（P＜0.01）。如图7所示，随着石蒜碱浓度增加，细胞凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白表达量逐渐降低，Bax、Caspase-3和Cyt-C蛋白表达量逐渐升高，均具有显著性差异（P＜0.01）。 4 讨论 乳腺癌已成为全球最常见的恶性肿瘤，与乳腺癌的其他分子亚型相比，TNBC最具侵袭性和高度异质性[20-22]，使其在临床上难以得到有效治疗。因此如何有效抑制TNBC侵袭、增殖和转移是目前亟待解决的问题。近年来，有研究表明中药在抗肿瘤方面具有显著的优势[23-25]。石蒜碱是异喹啉类生物碱，广泛分布于石蒜属植物鳞茎中，具有较强的抗肿瘤活性[26-27]。基于石蒜碱的抗肿瘤作用，结合课题组前期研究中TNBC细胞活性筛选，发现石蒜碱对MDA-MB-231细胞较为敏感，故选择MDA-MB-231细胞作为研究对象，本研究结果发现石蒜碱对MDA-MB-231细胞的增殖和迁移具有显著抑制作用，且呈浓度相关性。 ROS水平升高和线粒体功能障碍是诱导肿瘤细胞自噬和凋亡的重要途径[28]。研究发现，过量ROS的产生会诱发肿瘤细胞的损伤、自噬及凋亡并降低细胞的多药耐药性[29]。此外，肿瘤细胞对外源性ROS比正常细胞更敏感且ROS具有一定的细胞毒性。因此，促进ROS水平升高的药物可表现出一定的抗癌活性。有研究表明，线粒体功能障碍与多种恶性肿瘤的发生及ROS的过量产生密切相关[30]。本研究通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测结果表明，石蒜碱可以显著提高MDA-MB-231细胞凋亡率和ROS水平，并使线粒体膜电位下降，MPTP开放。这表明石蒜碱诱导细胞自噬和凋亡作用可能与线粒体的氧化损伤有关。 TOM及TIM是线粒体膜蛋白，当线粒体自噬增强时，其细胞内表达水平下降。研究表明线粒体损伤会使线粒体膜电位降低，导致PINK1在线粒体外膜上表达，从而使PINK1-PARKIN依赖性线粒体自噬反应被激活[31]。LC3-B是自噬体形成的特异性标志物，其含量与自噬泡数量成正比，因此被广泛用于监测细胞自噬。p62作为自噬降解的产物，自噬增强，p62水平会下降。p62还可与自噬体膜上的LC3-B蛋白及泛素化的蛋白形成复合物，在自噬溶酶体内完成降解[32]。ROS的过度累积，会触发MPTP开放，导致线粒体膜电位下降，引起Cyt-C从线粒体释放并进入细胞质中，进而激发Caspase的级联反应并启动细胞线粒体凋亡[33]。Bcl-2为抗凋亡蛋白，Bax为促凋亡蛋白，当接收到凋亡刺激信号后可转位至线粒体膜上，Bcl-2和Bax可形成二聚体或多聚体，从而增加细胞线粒体膜的通透性，进一步激活Caspase级联反应，Caspase-3可通过抑制凋亡抑制物，从而破坏细胞结构使蛋白丧失功能[34]。本研究通过Western blotting检测自噬相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达，结果显示石蒜碱能够上调PARKIN、PINK1、LC3-B、Caspase-3、Bax和Cyt-C蛋白表达，下调TIM、TOM、p62和Bcl-2蛋白表达，表明石蒜碱可通过线粒体的氧化损伤介导MDA-MB-231细胞的自噬及凋亡。 综上，石蒜碱对MDA-MB-231细胞具有生长抑制作用，并可通过调控线粒体氧化损伤介导MDA-MB-231细胞的自噬及凋亡。本研究为石蒜碱抗肿瘤新药的深入研发和临床实践提供理论基础。

用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子。主要有：　　1免疫共沉淀试剂盒　　2elisa试剂盒　　3sod试剂盒　　4反转录试剂盒　　5检测试剂盒　　6rna提取试剂盒　　7rt [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]试剂盒　　8诊断试剂盒　　9生化试剂盒　　10氯霉素检测试剂盒　　11葡萄糖试剂盒　　12免疫组化试剂盒　　13tunel 试剂盒　　14逆转录试剂盒　　15免疫荧光试剂盒　　16化学发光试剂盒　　17放射免疫试剂盒　　18细胞凋亡试剂盒　　19乳酸脱氢酶试剂盒　　20葡萄糖检测试剂盒　　21ldh试剂盒　　22脂联素试剂盒　　23胶回收试剂盒　　24mda试剂盒　　25猪瘟 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] 试剂盒　　26ip3放免试剂盒　　27防癌隐血试剂盒　　28试剂盒价格　　29[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]试剂盒　　30蛋白提取试剂盒　　31dna提取试剂盒　　32mts试剂盒　　33bca 试剂盒　　34出血热试剂盒　　35sod试剂盒　　36酶联免疫试剂盒　　37心肌抗体试剂盒　　38支原体检测试剂盒　　39蛋白抽提试剂盒

2015年3月底，第一个中国科学院和中国食品药品检定研究院联合开发的试剂盒出现在中国食品药品检定研究院网站的国家药品标准物质目录中：CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒（PCR-荧光探针法）。在2016年7月举办的生物制品研讨会上，中检院吕萍主任对这个试剂盒做了精彩的说明。这个由中检院与中科院联合研发，由生物制药企业参与标定的试剂盒与现行美国药典（USP）建议的检测方法同步，但与2010版药典附录中外源性 DNA 残留量测定法有所不同，将是国内生物制品的研发和生产的上下游企业检测宿主细胞DNA残留的第一选择,其后又联合开发了宿主细胞DNA残留样本前处理试剂盒,E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒,Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒,毕赤酵母DNA残留检测试剂盒,大大的方便的广大厂商的选择。产品优势:1:中检所参与开发并认可其质量2:灵敏度高,稳定性好3:高效回收微量dna,回收率70-130%4:操作快捷,整个过程只要4小时5:满足自动化操作要求,可以高通量检测 ,6:参考品溯源至中检所DNA国家标准品7:价格便宜,基本价格都在ABI公司价格的一半以下,大大节约了企业成本订货信息货号 品名 包装SK030203D100 宿主细胞DNA残留样本前处理试剂盒 100TSK030201c100 CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒 100TSK030202e100 E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒 100TSK030204v100 Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒 100TSK030205p100 毕赤酵母DNA残留检测试剂盒 100T生物制品中宿主细胞残留DNA具有潜在致瘤和传染风险，所以各国药品监管部门对DNA杂质的限量要求非常严格。美国药典在General Chapter 介绍了三种常用技术，但将在2015年颁布的新版（USP38-NF33）中增加全新章节（General Chapter ）来进一步规范残留DNA检测的方法和标准物质。与1000号以上的章节不同的是，USP编号1000以内的章节详细规定了检测技术、系统适应性标准和标准物质。新版USP中将唯一推荐qPCR法作为生物制品中宿主残留DNA的标准方法。qPCR法的技术优势在于序列特异性高、灵敏度高、重现性好，可以为生物制药工业在工艺研究和成品质量控制方面提供可靠的检测手段。我国参照WHO、FDA和欧盟的标准，很早以前开始就对生物制品中残余DNA含量进行限制。从卫生部颁布的《人用重组DNA制品质量控制要点》到近年的《中国生物制品规程》都对DNA含量做了严格要求，部分标准高于国际标准。2010年版中国药典附录收录了DAN探针杂交法和荧光染料法，这两种方法都存在技术缺陷，很难达到杂质限量检测的灵敏度，已经被欧美药典摒弃。目前，仍有很多国内企业沿用这两种方法检测残留DNA，致使生产工艺和产品质量很难达到国际一流水平。根据残余DNA检测技术的发展趋势，小编预计我国2015版药典或增补版本中将出现qPCR方法。企业在生产与研发中采用中检院标准物质目录中提供的成套试剂盒，可以大幅度减少费时、耗力、成本高昂的方法学考察，只需开展少量方法适应性实验，就可以在生产工艺和质控体系的优化方面发挥实际作用，同时满足美国FDA相关标准的要求。同时，联合研发单位中科院湖州营养中心提供免费技术咨询和培训，帮助企业解决试剂盒应用中的各种技术问题。生物制品可用于治疗和预防疾病，关系到患者和健康人的用药安全，产品质量必须得到保障。我国药品监管部门对生物制品中残留DNA的限量标准制订的非常严格，但药典修订存在一定滞后性，附录中的检测技术与先进国家尚存在差距，企业在研发和生产中应具有一定前瞻性，否则会使改进工艺、提高质量、保障安全的努力大打折扣。为什么要检测残余DNA？生物制剂是制药行业中发展最快的领域，2014年全球十大畅销药中7个是生物制剂。这些销售在临床上疗效确切，但研发成本高，生产和质量控制要求非常严格。绝大部分生物制剂是不经过胃肠道直接进入体内，所以除了生物活性外，监管部门对药品中杂质的限量要求非常严格。其中，宿主细胞残留DNA因为具有特别的潜在安全风险，一直是国内外药品监管机构关注的重点。美国药典会从2011年开始就组织专门小组讨论修订生物制品中残留DNA检测方法，并在2014年Prescription/Non-Prescription Stakeholder Forum Meeting#5上宣布将在2015年药典修订版中增加新的章节（General Chapter ）来规范检测方法和标准物质。为什么美国药典会的专家组花几年时间讨论一个微量成分（100pg/剂量）的检测方法？还要专门增加章节来规范化？回答这些问题，先要了解它的来源和潜在危害性。生物制品中的重组蛋白药、抗体药、疫苗等产品是用连续传代的动物细胞株表达生产，虽然经过严格的纯化工艺，但产品中仍有可能残余宿主细胞的DNA片段。这些残余DNA可能带来传染性或致瘤性风险，比如残留DNA可能携带HIV病毒或Ras癌基因。分布在哺乳动物细胞基因组的LINE-1序列可能发挥逆转录转座子作用插入到染色体中，这种插入可能影响关键基因功能的发挥，比如激活癌基因或抑制抑癌基因。此外，由于微生物来源的基因组DNA富含CpG和非甲基化序列，增加了重组蛋白药物在体内的免疫源性风险。目前的研究结果显示，残留DNA的致瘤性相比传染性风险要低，但考虑到致瘤性实验是动物实验，传染性实验是在细胞水平做的，或许对两方面的风险都不能掉以轻心。众所周知，外源蛋白可能引起严重免疫反应，但关于残留DNA诱导的免疫反应的研究还不多。在一些临床前和临床研究中报道了高剂量的核酸样品，比如DNA疫苗或佐剂中的CpG寡聚核苷酸，可以诱导免疫反应，还诱导产生DNA抗体。生物制品中宿主残余DNA既是是生产中带来的杂质，还存在一定安全隐患。因此，WHO和各国药物注册监管机构一般只允许生物制剂中存在100pg/剂量以下的残留DNA。根据杂质来源和工艺，特殊情况下最高允许10ng/剂量。各种残余核酸检测技术的优劣正如前面讲过，2015年版的美国药典将新增章节对残余DNA检测进行规范化，那究竟和现有方法有什么不同？为什么最后只确定了一种方法？我们来看看现行美国药典对于残余DNA检测的总体要求。"因为残留DNA涉及到潜在来源（传染性病毒DNA）、管理规程等关键问题，药品监管部门建议必须建立产品的DNA残留检测方法。不论是否成品的常规检测包含DNA残留含量检测，还是工艺开发中已经证实了DNA清除率，残留DNA技术指标和定量分析监测规程都必须确立。分析方法包括杂交法、基于DNA结合蛋白的免疫色谱法（阀值法）、定量PCR（Q-PCR）或其他DNA扩增方法。理想的定量检测方法的灵敏度应该能够检测到约10pg/剂量的残留DNA。杂交法、阀值法和定量PCR方法因为灵敏度可以达到检测要求，所以属于经典方法。"下面我们引用美国药典（USP）的内容分别介绍一下这三种方法。杂交法（Hybridization-based）：在这种方法中，根据宿主DNA序列设计DNA探针用于测定产品中配对DNA的数量。双链DNA被变性成单链后固定在尼龙膜或硝化纤维膜上，DNA探针被放射或荧光随机掺入标记以后，与膜上固定的样品宿主DNA杂交结合，并在胶片或成像仪对应位置中显现斑点。对于荧光标记的探针，斑点的光密度结果可以在仪器中定量分析。斑点光密度对应结合在目标DNA上的探针数，进而推测出残留DNA的数量。通过目测方法可以半定量地检测样品中残留DNA，仪器读片可以对应斑点光密度绘制标准曲线，对应检测结果更加准确。DNA结合蛋白免疫阈值法（DNA-BINDING PROTEIN-BASED）：这种方法使用DNA结合蛋白和DNA抗体，分四步检测。第一步，通过加热把DNA变性成单链DNA，变性后DNA与偶联了亲和素的DNA结合蛋白以及偶联了尿素酶的DNA单克隆抗体混合反应，液相中的单链DNA、DNA结合蛋白、DNA抗体共同形成序列非特异的复合物。第二步，样品混合液通过生物素标记的膜，亲和素-生物素结合把DNA复合物固定在膜上，洗去非特异吸附。第三步，膜放入检测仪器中与尿素溶液反应，反应产物氨改变溶液pH值并被仪器记录变化。这种pH值的变化直接与样品中的DNA数目相关。第四步，仪器软件自动分析原始数据确定样品中残留DNA数量。定量PCR法（QUANTITATION PCR-BASED）：qPCR方法以其快速、高通量的特点已经被应用于生物制药的一些领域（拷贝数检测与病毒检测）。这项技术能够确定各种样品中目标DNA序列的准确数量。DNA探针的设计非常关键，这种DNA探针包含一端染料分子和另一端淬灭分子。当特殊设计的DNA引物引导DNA聚合酶沿着模板序列复制合成另一条对应序列时，DNA聚合酶切断结合在目标DNA上的探针染料端，释放到反应液里的染料信号被仪器测量。经过数十个循环的DNA扩增，荧光信号与起始DNA模板成对应关系，对应标准曲线可以准确计算出样品中残留DNA的数量。美国药典附录进一步对三种方法进行了应用评价。杂交法可以序列特异性地检测目标DNA，但32P标记的探针因为存在半衰期短、放射等问题，实际应用并不广泛。

ELISA酶联免疫法因其灵敏度高，特异性好的有点被广泛运用与各种实验。在ELISA试剂盒实验虽然时间短，但是过程十分复杂，且实验中的每个步骤都需要实验人员百分之百的投入。稍有疏忽很可能就会导致实验结果背景值过高、白板等现象。为了能让大家在ELISA实验前有个充分的了解，今天要为大家讲解的是ELISA试剂盒实验操作之标本采集及贮存。血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的 试剂 本底加深。超过一周测定的需-20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使 抗体 效价跌落，所以测 抗体 的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存;最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管;并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关;EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性;血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。严重溶血，以 HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性; 混有红细胞的血清 易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净;如有 细菌污染 ，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应; 标本凝固不全 ，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果; 采血试管洗涤不彻底 、反复使用易交叉污染; 塑料试管能吸附抗原物质 ，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。所以为了保证我们实验的结果，在标本采集和贮存的时候我们需要保证其不被污染不受到破坏。

缺血性脑卒中是人类死亡的主要原因之一，也是全球范围内成人致残的主要原因[1]。2019年我国有缺血性脑卒中患者2 418万例，给我国医疗卫生系统造成巨大负担[2]。缺血后大脑血液供应的中断会引发一系列病理生理改变。尽管恢复脑血流对挽救缺血组织至关重要，但血流恢复可能会进一步加重脑损伤[3]。再灌注损伤的机制包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）的突然产生、自噬的激活和细胞因子的释放，其中线粒体功能障碍在介导这些病理生理过程中发挥重要作用[4]。目前，重组组织纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）已被批准应用于缺血性脑卒中的治疗[5]。由于治疗时间窗窄，能够应用rt-PA治疗的患者不足10%[6]。因此，寻找更有效的防治缺血性脑卒中的药物至关重要。 在中医理论中，缺血性脑卒中属于“中风”范畴。补阳还五汤是治疗缺血性脑卒中的经典方剂，已有数百年的临床应用历史[7-8]。方中以生黄芪为君药，补益元气，旨在气旺则血行，瘀去则络通，对中风之气虚血瘀证有显著疗效。现代药理学研究证实，芒柄花素是黄芪的主要活性成分之一，具有抗炎[9]、抗氧化[10]、神经保护[11]等作用。但是，水溶性差限制了其在中枢神经系统的应用。通过磺化反应合成的芒柄花素磺酸钠（sodium formononetin-3?-sulphonate，Sul-F）克服了其水溶性差的难题，为其应用于缺血性脑卒中的研究提供了物质基础。 本研究通过建立大脑中动脉栓塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型，考察Sul-F对大鼠脑缺血再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）损伤的改善作用和对线粒体凋亡通路的影响，旨在探讨Sul-F是否通过调控线粒体凋亡通路改善脑I/R损伤。 1 材料 1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠75只，体质量（300±10）g，购自斯贝福（北京）有限公司，许可证号SYXK（冀）2021-006。大鼠饲养于动物房，温度（25±1）℃，相对湿度（50±10）%，昼夜周期为12 h，自由摄食饮水，实验开展前适应性饲养1周。本实验所有操作均严格按照动物伦理要求进行，且经河北中医学院实验动物管理和伦理委员会批准（批准号DWLL202306001）。 1.2 药品与试剂 依达拉奉注射液（国药准字H20080056，批号2109050）购自国瑞药业有限公司；Sul-F（质量分数＞95%，批号160901）由河北国金药业有限责任公司提供；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染液（批号1222A23）购自美国Sigma-Aldrich公司；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染液试剂盒（批号MD070823）购自碧云天生物技术有限公司；原位末端标记（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）检测试剂盒（批号061223240108）、线粒体膜电位（JC-1）检测试剂盒（批号C2006）购自碧云天生物技术有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）测定试剂盒（批号A005-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒（批号A001-3）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（批号A003-1）均购自南京建成生物工程研究所；电镜固定液（批号02607-BA）、包埋剂（批号90529-77-4）、醋酸双氧铀（批号H60602624A8）购自SPI公司；无水乙醇（批号100092183）、丙酮（批号10000418）购自国药集团化学试剂有限公司；铜网（批号BZ100205a）购自北京中镜科仪技术有限公司；锇酸（批号18456）购自Ted Pella公司；柠檬酸铅（批号180705-C5382）购自EMS公司；β-actin抗体（批号86e1489）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体（批号35y4418）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体（批号43z8686）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗体（批号53j2158）购自Affinity公司；HRP标记的山羊抗兔二抗（批号20220521）购自北京百奥思科生物科技有限公司；Trizol（批号342430AX）购自艾德莱公司；ExonScript First-Strand Synthesis SuperMix with dsDNase试剂盒（批号231106-A5）购自成都市蓉为基因生物科技有限公司；硅胶线栓（批号230701162）购自长沙迈越生物科技有限公司。 1.3 仪器 JT-12J型全自动脱水机、JB-L5型加热石蜡包埋系统（武汉俊杰电子有限公司）；RM2235型石蜡切片机、UC7型超薄切片机（德国Leica公司）；XS-2100型光学显微镜（NOVEL公司）；ELCIPSE-CI型正置荧光显微镜（日本Nikon公司）；7800型透射电子显微镜（日本Hitachi公司）；LF-2000型SDS-PAGE电泳系统（北京龙方科技有限公司）；JYO2S型凝胶成像系统（北京君意东方电泳设备有限公司）；chemiscope 6100型化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；272005652型实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪（美国Life Techologies公司）；BeamCyte-1026型流式细胞仪（必达科生物科技有限公司）；680型酶标仪（美国Bio-Rad公司）。 2 方法 2.1 动物造模、分组及给药 大鼠I/R损伤模型的建立参照文献方法[12]，大鼠ip 1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉后，置于加热垫上，保持肛温37 ℃。颈前皮肤备毛，在前正中线做切口，暴露颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉远端，夹闭颈内动脉远端颈总动脉近端，将线栓经颈内动脉送入大脑中动脉，推送线栓18～20 mm，缺血2 h后拔出线栓并且结扎端口。再灌注0 h时，选择神经功能评分为1～3分的大鼠，随机分为模型组、依达拉奉（3 mg/kg）[13]组和Sul-F高、低剂量（80、40 mg/kg）组，每组15只。另取15只大鼠仅分离血管不插线栓作为假手术组。分别于再灌注0、12 h尾iv给药（4 mL/kg），假手术组和模型组给予等体积的生理盐水。再灌注24 h后取材进行后续实验。 2.2 神经功能评分 再灌注0、24 h时，采用盲法对各组大鼠进行Zea-Longa评分[14]：0分，活动基本正常；1分，提起时对侧前爪无法完全伸展；2分，向手术对侧转圈；3分，向手术对侧倾倒；4分，意识丧失。 2.3 TTC染色测定脑梗死体积 大鼠麻醉，断头取脑，?20 ℃冷冻30 min，以1.5～2 mm厚度进行冠状面切片。置于TTC染液玻璃皿中，37 ℃避光孵育30 min，吸出多余的TTC染液，倒入4%多聚甲醛固定过夜，相机拍照后用Image J软件进行分析，记录脑梗死面积（灰白色）及全脑面积（红色），计算脑梗死体积率[15]。 脑梗死体积率＝(脑梗死面积×厚度)/(全脑面积×厚度) 2.4 HE染色观察脑组织病理变化 大鼠麻醉，断头取脑，4%多聚甲醛固定24 h，沉糖1周，石蜡包埋，以4 μm厚度行冠状切片，HE染色后于光学显微镜下进行观察与拍照。 2.5 TUNEL荧光染色观察脑组织细胞凋亡情况 将石蜡切片标本进行脱蜡、复水、抗原修复以及H2O2封闭，按照TUNEL凋亡检测试剂盒说明书进行TUNEL染色，并使用DAPI对细胞核进行复染。封片后置于荧光显微镜下观察与拍照，并计算细胞凋亡率。 细胞凋亡率＝TUNEL阳性细胞数/DAPI阳性细胞数 2.6 JC-1探针检测脑缺血半暗带组织线粒体膜电位情况 取脑缺血半暗带组织，经300目钢网研磨、滤过到60 mm培养皿中，将滤过后的组织悬液转入15 mL新离心管中。加入Hank平衡盐溶液稀释至10 mL，反复吹打30次，冰上静置5 min，取上清液至15 mL新离心管中。滤过2次，滤液经1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入Hank平衡盐溶液重悬，离心后弃上清。加入1 mL Hank平衡盐溶液重悬，细胞计数板计数，并调整细胞密度为1×106个/mL。取200 μL细胞，重悬于0.5 mL细胞培养液中。按照试剂说明书进行染色，流式细胞仪上机检测，以红绿荧光的比值表示线粒体膜电位变化。 2.7 透射电镜观察脑缺血半暗带组织超微结构 取缺血半暗带脑组织，剪成1 mm3小块，经PBS漂洗、4 ℃固定（2.5%戊二醛，12 h）、PBS漂洗、固定（1%锇酸，2 h）、PBS漂洗、丙酮脱水（30%、50%、70%、80%、95%、100%）、渗透包埋（Epon812）、超薄切片、染色（醋酸双氧铀和柠檬酸铅）后，在透射电子显微镜下采集图像分析。 2.8 ELISA检测脑缺血半暗带组织匀浆中MDA水平和SOD、GSH-Px活性 取缺血半暗带脑组织匀浆，按照试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪测量吸光度（A）值，并计算MDA水平和SOD、GSH-Px活性。 2.9 qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测脑缺血半暗带组织Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA表达 取缺血半暗带脑组织，Trizol法提取总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度。利用逆转录试剂盒Superscript III将RNA反转录成cDNA，加入引物，以β-actin为内参，荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪扩增，采用2???Ct法计算缺血半暗带Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA表达水平。 图片 2.10 Western blotting检测脑缺血半暗带组织Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达 取缺血半暗带脑组织，加入裂解液提取蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%牛血清白蛋白中封闭，分别加入Caspase-3、Bcl-2、Bax抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，洗膜后，加入二抗（1∶20 000），37 ℃孵育1 h。滴加ECL混合液反应4 min后，采用化学发光成像系统显影并对条带灰度值进行分析。 2.11 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行数据分析，正态分布计量资料以表示，非正态分布计量资料以M（P25～P75）表示。多组间均数比较，服从正态分布与方差齐者，采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD检验；不服从正态分布者，采用Kruskal-Wallis检验。 3 结果 3.1 Sul-F对MCAO大鼠神经功能评分的影响 如表2所示，与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，依达拉奉组和Sul-F高剂量组大鼠神经功能评分均显著降低（P＜0.01），Sul-F低剂量组神经功能评分无显著变化；依达拉奉组与Sul-F高剂量组比较，神经功能评分无统计学差异。 图片 3.2 Sul-F对MCAO大鼠脑梗死体积的影响 如图1-A、B所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死体积率显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，依达拉奉组和Sul-F高剂量组大鼠的脑梗死体积率显著降低（P＜0.05）；依达拉奉组与Sul-F高剂量组比较差异无统计学意义。 图片 3.3 Sul-F对MCAO大鼠脑缺血半暗带病理损伤与细胞凋亡的影响 如图1-C所示，假手术组大鼠脑缺血半暗带神经细胞形态结构正常，结构致密，核仁清晰；模型组脑缺血半暗带神经细胞肿胀，空泡增多，细胞核大小不一，形态不规则，核固缩偏于细胞一侧，部分核溶解。与模型组比较，依达拉奉组与Sul-F高剂量组脑缺血半暗带组织病理损伤情况明显改善，Sul-F低剂量组脑缺血半暗带组织病理损伤情况无明显改善。 如图1-D、E所示，与假手术组比较，模型组脑缺血半暗带TUNEL阳性细胞数显著增多（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组TUNEL阳性细胞数显著降低（P＜0.01）；依达拉奉组与Sul-F高剂量组比较，TUNEL阳性细胞数无统计学差异。 3.4 Sul-F对MCAO大鼠脑缺血半暗带线粒体膜电位变化的影响 如图2所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑缺血半暗带线粒体膜电位显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，依达拉奉组和Sul-F高剂量组线粒体膜电位显著升高（P＜0.05），两组之间比较无明显差异。 图片 3.5 Sul-F对MCAO大鼠脑组织超微结构的影响 如图3所示，假手术组大鼠脑组织线粒体丰富，分布均匀，线粒体嵴清晰可见，未见明显损伤的线粒体，无典型的线粒体自噬结构。模型组线粒体总体数量减少，线粒体嵴不清晰、水肿，可见典型自噬小体形成。与模型组比较，依达拉奉组线粒体数量增多，大部分线粒体嵴清晰，偶见线粒体自噬结构；Sul-F低剂量组线粒体数量增多，一部分线粒体嵴清晰，另一部分线粒体水肿，可见典型自噬小体形成；Sul-F高剂量组线粒体数量增多，大部分线粒体嵴清晰，偶见线粒体自噬结构。 图片 3.6 Sul-F对MCAO大鼠脑缺血半暗带组织氧化应激水平的影响 如图4所示，与假手术组比较，模型组大鼠脑缺血半暗带区组织MDA水平显著升高（P＜0.01），SOD和GSH-Px活性显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组MDA水平显著降低（P＜0.05、0.01），SOD活性显著升高（P＜0.01）；Sul-F高剂量组GSH-Px活性显著升高（P＜0.01）。 图片 3.7 Sul-F对MCAO大鼠脑缺血半暗带组织Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表达的影响 如图5所示，与假手术组比较，模型组大鼠缺血半暗带区Caspase-3和Bax mRNA表达水平显著升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠缺血半暗带区Caspase-3和Bax mRNA表达水平显著降低（P＜0.01），Bcl-2 mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）；与依达拉奉组比较，Sul-F高剂量组大鼠缺血半暗带区Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA表达水平无显著差异。 图片 如图6所示，与假手术组比较，模型组大鼠缺血半暗带区Caspase-3和Bax蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠缺血半暗带区Caspase-3和Bax蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与依达拉奉组比较，Sul-F高剂量组大鼠缺血半暗带区Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平无显著差异。 图片 4 讨论 缺血性脑卒中占所有脑卒中的80%～85%，具有较高的致死率和致残率[16]。目前，缺血性脑卒中的治疗手段有机械取栓和药物溶栓，以尽快恢复脑血流、挽救缺血脑组织，但复流复氧可能加重脑组织损伤[3,17]。脑I/R损伤会引发一系列的病理反应，如离子失衡、细胞膜通透性改变、能量代谢障碍等，最终触发凋亡程序，引发细胞凋亡。细胞凋亡涉及线粒体通路和死亡受体通路，其中线粒体通路是启动凋亡程序的关键。因此，改善线粒体功能、保护神经元是治疗脑I/R损伤的关键。 正常情况下，线粒体产生的自由基及其清除处于动态平衡，在缺血等应激条件下，ROS生成过多，氧化还原平衡受损线粒体膜脂质过氧化和结构破坏，造成线粒体功能紊乱和氧化应激损伤[17]。SOD与GSH-Px是机体抗氧化酶系统的重要物质，通过清除线粒体ROS来减轻氧化应激损伤。线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）是由三羧酸循环产生的能量传递给电子并经呼吸链传递过程中，将质子从线粒体内膜的基质侧泵到内膜外所形成的跨膜电位差，MMP的下降是线粒体氧化应激损伤的早期指标[18]。本研究显示，在脑I/R损伤时，脑组织线粒体受损，主要表现有线粒体肿胀变形、线粒体嵴结构不清，可见线粒体自噬小体。同时，线粒体膜电位显著下降，氧化应激反应被激活，MDA含量显著升高，SOD和GSH-Px活力显著降低。 线粒体途径作为细胞凋亡的关键途径，主要受到Bcl-2家族和Caspase家族相关基因的调控。线粒体功能受损产生大量ROS，ROS过度累积会触发线粒体膜通透性转换孔打开，线粒体膜电位下降[19]。Bcl-2家族蛋白通过调节线粒体外膜通透性在细胞内凋亡信号转导中发挥重要作用。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族的主要成员，二者通常以异源二聚体的形式存在。MMP升高时，Bcl-2表达上调，抑制细胞色素C释放以维持线粒体平衡，当Bax高表达时，MMP降低，线粒体中的细胞色素C释放入胞质中，在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和dATP的协助下生成凋亡复合物，招募并启动Caspase-9，Caspase-9解体形成cleaved Caspase-9并进一步启动Caspase-3，激活下游Caspase级联瀑布，启动线粒体介导的细胞凋亡[20-21]。Caspase-3是Caspase家族中参与细胞凋亡的关键酶，可导致线粒体膜通透性增加、DNA断裂和染色质浓缩，可能是缺血性神经元核降解的关键执行者[17]。本研究中，脑I/R损伤使促凋亡基因Bax表达显著上调，抑凋亡基因Bcl-2表达显著下调，Caspase-3表达显著上调，提示脑I/R损伤时，线粒体介导的细胞凋亡途径启动。 芒柄花素是经典名方补阳还五汤君药黄芪的活性成分之一。体外研究发现，芒柄花素能够抑制多腺苷二磷酸核糖聚合酶1/凋亡诱导因子/蛋白激酶B（poly-adenosine diphosphate ribose polymerase/ apoptosis inducing factor/protein kinase B，PARP1/ AIF/Akt）信号通路减轻糖氧剥夺/复氧复糖条件下HT22小鼠神经元细胞损伤[22]。为提高其水溶性和生物利用度，经磺化反应合成芒柄花素磺酸钠。前期研究证实，Sul-F能够通过血脑屏障、低毒[23-25]。本研究发现，Sul-F能够减低脑I/R损伤大鼠的神经功能评分、降低脑梗死体积、减轻脑缺血半暗带的病理损伤及细胞凋亡，进而改善脑I/R损伤。 线粒体功能障碍是脑缺血再灌注诱导神经元死亡的标志之一[26]，因此机制研究旨在探讨Sul-F对线粒体介导的细胞凋亡途径的影响。结果显示，Sul-F能够降低脑组织氧化应激水平，部分逆转线粒体膜电位的降低，改善线粒体超微结构损伤，调节Bcl-2/Bax平衡，降低Caspase-3表达，进而抑制线粒体凋亡途径，降低细胞凋亡，对脑I/R损伤具有潜在的治疗价值。 本研究以大鼠大脑中动脉栓塞模型模拟脑I/R损伤，结果显示Sul-F干预能够降低脑组织氧化应激水平，部分逆转线粒体膜电位的降低，改善线粒体超微结构损伤，降低细胞凋亡，改善脑梗死体积和神经功能评分。进一步研究发现，Sul-F能够降低Bax表达、升高Bcl-2表达，降低下游Caspase-3表达，抑制线粒体凋亡信号通路。综上，Sul-F通过调控Bcl-2/Bax平衡，降低线粒体介导的细胞凋亡，改善脑缺血再灌注损伤。

1. 实验类型ELISA试剂盒有多种类型，不过它们都有一个共同特点，就是进行抗原捕获。一般捕获形式包括将抗原吸附到微孔板或者用微孔板上的抗体进行捕获。In-cell ELISA和酶联免疫斑点ELISPOT是两种特殊的类型，In-cell ELISA需要将微孔板中培养的细胞进行固定和通透化，然后再用抗体原位检测。ELISPOT有点像蛋白印迹Western blot，先在带膜的微孔板中培养细胞，然后在膜上检测细胞分泌的抗原形成斑点。此外，我们还需要根据自身需要选择96孔板或是384孔板进行ELISA实验。2. 抗体类型单克隆抗体和多克隆抗体都能够用于ELISA，实际上有时候二者结合效果更好。例如，对于双抗夹心法而言，用多抗进行捕获而单抗进行检测有时更有帮助。多抗能够确保捕获所有抗原，随后单抗再特异性检测拥有特定抗原表位的抗原。3. 交叉反应如果抗体间发生冲突或交叉反应就会影响整个实验的特异性。其中抗体来源所带来的兼容性就是交叉反应的一个因素。尽管现在购买源自指定动物的抗体越来越容易，我们仍有必要确认一下是否会产生交叉反应的问题。在用双抗夹心法进行ELISA检测时，检测用的二抗必须特异性针对检测一抗，而不能与捕获抗体起反应。如果检测用二抗与捕获抗体结合，实验特异性就会大打折扣。通常我们选用源自不同宿主的捕获抗体和检测一抗，来避免上述问题。4. 检测方式如今检测ELISA有许多途径，我们可以根据自己的喜好进行选择。一般ELISA检测的是酶促反应的可溶性产物，抗体上结合有相应的酶（例如通常使用的辣根过氧化物酶HRP），而反应体系中添加有相应的底物。这种酶促反应生成具有特征性的颜色，可以通过分光光度计进行检测，碱性磷酸酶AP也是一种常用酶。酶可以结合在一抗上，也可以结合在二抗上，还可以使用链霉亲和素标记的酶与亲和素标记的一抗结合。此外ELISA的结果检测还包括放射性检测、荧光检测、化学发光或显色法检测等。

[font=inherit]一、项目基本情况[/font]项目编号：TC240V00S项目名称：中国疾病预防控制中心营养与健康所人多细胞因子（炎症因子）检测试剂盒采购项目预算金额：90.000000 万元（人民币）采购需求：[table=100%][tr][td][align=center][font=inherit]包号[/font][/align][/td][td][align=center][font=inherit]包名称[/font][/align][/td][td][align=center][font=inherit]数量[/font][/align][/td][td][align=center][font=inherit]最高限价单价（万元）[/font][/align][/td][td][align=center][font=inherit]最高限价总价（万元）[/font][/align][/td][td][align=center][font=inherit]是否允许进口[/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]人多细胞因子（炎症因子）检测试剂盒[/align][/td][td][align=center]50盒（4000人份）[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]是[/align][/td][/tr][/table]合同履行期限：交货期：接到采购人通知后60日内交货本项目( 不接受 )联合体投标。[font=inherit]二、申请人的资格要求：[/font]1.满足《中华人民共和国政府采购法》第二十二条规定；2.落实政府采购政策需满足的资格要求：无3.本项目的特定资格要求：1．提供产品属于医疗器械的，根据产品分类应按《医疗器械监督管理条例》，办理医疗器械注册证或者办理备案，供应商须提供医疗器械注册证或备案凭证（复印件加盖供应商单位公章）。2．提供产品属于医疗器械的，中华人民共和国境内制造商应按《医疗器械监督管理条例》办理医疗器械生产许可证或者办理备案。供应商为制造商的须提供医疗器械生产许可证或备案凭证（复印件加盖供应商单位公章），供应商为代理商的须提供医疗器械经营许可证或备案凭证（复印件加盖供应商单位公章）。[font=inherit]三、获取招标文件[/font]时间：2024年01月31日 至 2024年02月07日，每天上午9:00至11:00，下午13:30至17:00。（北京时间，法定节假日除外）地点：http://www.365trade.com.cn方式：支持网上发售售价：￥300.0 元，本公告包含的招标文件售价总和[font=inherit]四、提交投标文件截止时间、开标时间和地点[/font]提交投标文件截止时间：2024年02月21日 10点00分（北京时间）开标时间：2024年02月21日 10点00分（北京时间）地点：中招国际招标有限公司（北京市海淀区学院南路62号中关村资本大厦）会议室[font=inherit]五、公告期限[/font]自本公告发布之日起5个工作日。[font=inherit]六、其他补充事宜[/font][align=left]1.本项目需要落实的政府采购政策[/align][align=left]1.1 中小企业、监狱企业及残疾人福利性单位；[/align][align=left]1.2 政府采购节能产品、环境标志产品；[/align][font=inherit]七、对本次招标提出询问，请按以下方式联系。[/font]1.采购人信息名 称：中国疾病预防控制中心营养与健康所地址：北京市西城区南纬路27号联系方式：于老师：010-662370412.采购代理机构信息名 称：中招国际招标有限公司地　址：北京市海淀区学院南路62号院1号楼6层(601-615室)、9层(903-915室)联系方式：范君、曹武宁、卢燕、梅建伟3.项目联系方式项目联系人：范君、曹武宁、卢燕、梅建伟电　话：　　010-62108225

[font=宋体][font=Calibri]CAR-T [/font][font=宋体]细胞质量的优劣直接影响临床治疗效果和患者的健康。[/font][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]药物的质量在批次和患者间存在差异，因此对[/font][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]药物的质量和功能进行表征至关重要。细胞因子释放检测是[/font][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]细胞功能检测的重要环节。除此之外，不容忽视的是[/font][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]生产工艺过程中引入的杂质检测，如细胞因子残留检测。细胞因子[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]检测试剂盒可以通过检测代表性细胞因子的表达来评估[/font][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]细胞对靶细胞的杀伤活性和特异性。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]酶联免疫吸附测定（[/font][font=Calibri]enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA[/font][font=宋体]）的技术基础在于抗原、抗体之间的特异结合反应。义翘神州自主研发的高品质细胞因子[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]试剂盒，可准确定量检测血清、血浆和细胞上清液中细胞因子的浓度，获得兼具灵敏度和特异性的结果，全面支持客户进行细胞因子残留检测、[/font][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]细胞功能评估以及[/font][font=Calibri]CRS[/font][font=宋体]监测等[/font][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]相关研究。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]下面是关于[/font][font=宋体][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]质量检测[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]试剂盒常见问题解析：[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、同一样品多次活性测试结果差异大怎么解决？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]答：样本保存不当，会导致多次实验结果偏差较大，样本应尽量减少反复冻融，如需多次检测，需在取样后分装保存。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、检测样本是细胞培养上清，那么细胞数目对炎症因子的浓度有影响吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]答：有影响，所以不同样本可以比较的前提条件是培养细胞数水平接近一致。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、请问标曲是每次都要做吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]答：是的，每次实验，孵育时间，洗板次数等等条件均不一样，不同实验的标曲不能混用，做一次实验需要做一次标准曲线，并且用当次，同一块板上的标准曲线结果去计算板内样品的浓度，才能得到准确的结果。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、做预实验时每种要做几个复孔呀？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]答：预实验视情况而定，如果整个板子孔数较为充足，建议两个复孔，如不充足，单孔也可以。要尽量保证实验过程中加样准确。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、血清样本少量溶血，颜色稍深，对结有影响吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]答：会有影响，建议取样时需注意，避免溶血、脂血等样本。如样本条件受限，建议用样本稀释液适当稀释，减少基质效应影响。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、试剂盒有推荐稀释浓度还需要自己测吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]答：试剂盒一般会给出不同样品的推荐稀释比例，但是为大致范围，最好还是根据自己的样本情况，设计预实验测量计算。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、加完终止液之后测的几次数据差别也蛮大？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]答：加完终止液后，显色反应也不是永远停止，形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深，建议在[/font][font=Calibri]15 min[/font][font=宋体]内读数。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]8[/font][font=宋体]、副孔差别比较大，是没洗干净吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]答：复孔值差异较大，主要原因应考虑加样是否准确，洗板过程中是否有残留以及是否有交叉污染。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]9[/font][font=宋体]、配好的抗体没用完如何保存，可保存多久？预实验用了一个试剂盒里面的部分板子和试剂，剩下的板子和试剂还能继续用于正式实验吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]答：一般来讲，配好的母液，可以在四度保存，最多一个月左右。剩下的板子和试剂是可以继续用于正式实验的，间隔时间不要太长，一个月之内均可，需注意试剂避免污染，板子保持干燥。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]10[/font][font=宋体]、最后显示的[/font][font=Calibri]OD[/font][font=宋体]值在多少之间属于可用值，有要求吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]答：有的，建议标准曲线最高浓度点的[/font][font=Calibri]OD[/font][font=宋体]值在[/font][font=Calibri]2.0[/font][font=宋体]左右较好，也可参考说明书标曲的数据。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]11[/font][font=宋体]、样本总是在标准曲线之外，稀释[/font][font=Calibri]100[/font][font=宋体]倍也是，怎么办？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]答：在设置稀释倍数之前，需要参考相关文献，对于一些表达极高的蛋白，确实会出现这种情况，建议继续提高稀释比例。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]12[/font][font=宋体]、试剂盒推荐用[/font][font=Calibri]450[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]540nm[/font][font=宋体]双波长检测，但条件有限可否换成[/font][font=Calibri]450[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]620[/font][font=宋体]的双波长？如何使用校准波长？还有，用空白孔校准可以么？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]答：可以的，[/font][font=Calibri]TMB[/font][font=宋体]底物显色后，吸光峰值在[/font][font=Calibri]450nm[/font][font=宋体]，另外的校准波长是防止气泡等杂质造成的干扰设置，避开[/font][font=Calibri]450[/font][font=宋体]左右[/font][font=Calibri]50nm[/font][font=宋体]以上即可。两次读取的[/font][font=Calibri]OD[/font][font=宋体]值，用[/font][font=Calibri]OD450 - OD[/font][font=宋体]校准波长即可。尽量还是建议有条件的选用双波长校准的方法，因为避免了不同孔的读数影响，防止出现空白孔污染，导致读数较高，无法校准的情况。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]13[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]可以检测胞内蛋白么？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]答：可以的，选用支持组织匀浆的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]试剂盒即可，将组织样品或细胞样品进行裂解，提取胞内蛋白后进行蛋白定量，保证每孔上样总蛋白量一致即可。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]14[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]试剂盒显色液是双组份的，有些其他品牌的是单组分的，使用单组分的有影响么？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]答：[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]酶标二抗的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]试剂盒，显色底物一般为[/font][font=Calibri]TMB[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]TMB[/font][font=宋体]不稳定，曝光或污染氧化后会出现显色反应，导致实验背景升高，或无法使用，所以爱必信的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]试剂盒将显色液调整为双组份，方便稳定保存，仅在使用前混合，避免了[/font][font=Calibri]TMB[/font][font=宋体]的不稳定影响实验结果。如您选用的试剂盒为单组分显色液，在使用前检测是否为无色透明，如果是正常的，对结果也没有影响，可以放心使用。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]15[/font][font=宋体]、整个过程需要避光吗？避光需要避到什么程度呢？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]答：[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]实验中，在酶标抗体孵育，以及显色底物孵育这两步建议避光，其他步骤无需避光。避光可采用锡纸包裹，或将整个[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]16[/font][font=宋体]、标准曲线在推荐的浓度下，[/font][font=Calibri]r[/font][font=宋体]值为[/font][font=Calibri]0.9[/font][font=宋体]，做了多次都是这样，怎么办？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]答：要仔细核对产品说明书，看是否用了推荐的拟合方法，如爱必信的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]试剂盒，需要使用四参数拟合方式进行拟合，用错拟合方式，会导致[/font][font=Calibri]r[/font][font=宋体]方值较低；如拟合方式无误，需检查是否有个别标曲孔数值异常，排查实验中是否出现污染或倍比稀释时出现失误。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]17[/font][font=宋体]、封板膜什么时候用？每次加液后都要换吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]答：封板膜在孵育样品、检测抗体以及[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]酶标抗体是，都要盖好封板膜，减少挥发及污染几率。每次使用后要更换新的封板膜。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]18[/font][font=宋体]、手动洗板过程中，拍过抗体或抗原的滤纸需要扔吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]答：是需要更换的，防止造成交叉污染，影响实验结果的准确性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]19[/font][font=宋体]、有的[/font][font=Calibri]wash buffer[/font][font=宋体]析出结晶后在[/font][font=Calibri]37[/font][font=宋体]℃也不溶解，怎么办？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]答：可提高至[/font][font=Calibri]55[/font][font=宋体]度，并多次摇晃。溶解后按比例稀释即可使用。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]20[/font][font=宋体]、测得的值都低于标准曲线的最低值，是什么原因，应该怎么解决？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]答：原因较多，首先是检查样品是否稀释倍数过高，降低稀释比，直至直接加样本原液，如还检测不出，需排查原因，建议在实验组别设置中添加阳性对照孔，用明确表达的样品作为阳性对照，如果标准曲线及阳性样品均可测得正常的表达浓度，则表明实验成功，其余待测样品表达含量低于检测下限，按照[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]计算即可。这种情况尤其对于炎症因子较为常见，在健康样本中，表达含量极低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]21[/font][font=宋体]、因为检测限的原因，同一块[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]板子，部分样本稀释，部分样本[/font][font=Calibri]1:10[/font][font=宋体]稀释，部分[/font][font=Calibri]1:20[/font][font=宋体]稀释，这样设置可行吗？结果可以比较吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]答：可以比较，不同稀释比例，是因为不同样本间的表达差异较大，只要保证稀释后的检测样品测量值准确，还原回稀释倍数后的浓度是可信的。可以用来比较不同样本的原始浓度差。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]23[/font][font=宋体]、试剂盒里面有捕获抗体么？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]答：即用型[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]试剂盒中，捕获抗体已经预包被至试剂盒中的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]板上，没有单独的捕获抗体提供，直接使用[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]板孵育稀释后的样本及标准品即可。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]24[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]实验中，检测计算抗原的浓度，临界值怎么确定？[/font][/font][font=宋体]答：根据曲线测定的浓度，建议落在标准曲线的中间位置较好，极限最好不要超过标准曲线的上下限，如果超出较多，会影响计算结果准确性，建议调整稀释比例。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]25[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]In vivo[/font][font=宋体]周期长的话，不太好做预实验，怎么办？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]答：[/font][font=Calibri]In vivo[/font][font=宋体]造模取样后，可将样品分装，取一部分样品做[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]预实验，剩余样品再进行正式实验；如多批次实验，操作较为一致，后续可取消预实验，根据前期结果进行[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]实验浓度设置。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]26[/font][font=宋体]、做实验前怎么知道待测血清中炎症因子的范围呢？多大是高多小是低？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]答：需要根据文献推测，一般在健康人样本中，炎症因子表达很低，接近[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]检测下限，样品无需稀释或[/font][font=Calibri]1:1[/font][font=宋体]稀释即可，如已知为炎症疾病或造模样本，可参考文献，在预实验中设置[/font][font=Calibri]1:10-100[/font][font=宋体]（或更高）的稀释比例，预实验检测后确定最佳浓度进行正式实验。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]27[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]实验中的洗板步骤如果没有洗板机，需要如何操作？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]答：实验室[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]实验做的较多，还是建议使用洗板机洗板，效果更好，也更方便控制。如果没有洗板机，在洗板过程中，需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出，在加洗板液后，静置[/font][font=Calibri]1-2min[/font][font=宋体]，甩干液体后，在吸水纸上大力拍干；重复三次。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]28[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]实验中，酶标抗体识别的是哪个抗体？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]答：在双抗夹心法[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]中，酶标抗体识别的是检测抗体，对检测抗体进行识别和酶标记。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]29[/font][font=宋体]、捕获抗体如何包被在[/font][font=Calibri]96[/font][font=宋体]孔板上？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]答：如果选用的是即用型[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]试剂盒，无需进行抗体包被；如果是非即用型的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]试剂盒，首先，要选择[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]级别的板子，材质应为聚苯乙烯；然后用抗体包被液稀释（[/font][font=Calibri]pH9.6[/font][font=宋体]的碳酸盐缓冲液或[/font][font=Calibri]pH7.2[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]pH7-8[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]Tris-HCl[/font][font=宋体]）成工作浓度，然后每孔加[/font][font=Calibri]100 [/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]l[/font][font=宋体]稀释后的捕获抗体，室温或[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃过夜包被，然后进行洗板和封闭之后即可使用，如需长期保存，需要真空冻干后保存。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]30[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]实验中的捕获抗体和检测抗体是同一个抗体么？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]答：不是的，在双抗夹心法[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]实验中，会同时用到捕获抗体和检测抗体，这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体，这样才可以同时结合抗原分子。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]31[/font][font=宋体]、 [/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]可以测[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的表观么？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]答：不可以，[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]是利用免疫学原理，定量检测蛋白质表达的技术。测[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]表观遗传学，主要是检测[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]甲基化，可以选用[/font][font=Calibri]ChIP[/font][font=宋体]技术。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多义翘神州[/font][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]质量检测相关[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]试剂盒可以参看[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/research/car-t-therapy/t-cell-cytokine-elisa-kits[/font][/font]

问：在ELISA试剂盒实验前我们需要的基本试剂有哪些？答：捕获抗体检测抗体链霉亲和素-HRP标准品96孔酶标板：选择具有中等或高吸附力的酶标板，禁止使用培养板包被溶液：0.1M的PBS或者TBS，PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液阻断溶液：含3％BSA的TTBS或PBS，或者含有3-5%血清的PBS标准品/标本稀释液：含1％BSA的TTBS或PBS洗液：含0.02％吐温20的0.002M咪唑盐溶液或者PH7.4的PBS溶液底物溶液：两组份或者一组份的TMB显色液终止液：2N的硫酸或者1％HCl溶液封板膜问：elisa试剂盒血清标本采集需要注意什么呢？答：1) 要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。2) 样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用;二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。3) 血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70℃以下。4) 冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。5) 标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。问：测抗体可以用什么方法，有操作步骤么，谢谢。答：捕获法测IgM抗体 　　血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下： 　　（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。 　　（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 　　（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 　　（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。 　　（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 问：血清的类别有哪些还有要怎么鉴别呢？答：血清的类别：胎牛血清、透析型胎牛血清 、天然低IGG胎牛血清 、干细胞培养胎牛血清 、特殊用途胎牛血清 、活性炭/葡萄糖处理胎牛血清 、胎牛血清替代物 、小牛血清 、新生牛血清 、加强型小牛血清 、补铁小牛血清 、成牛血清 、供体马血清 、兔血清 、鸡血清 、猪血清 、马血清 、其他动物血清 、合成血清替代品鉴别方法：血液凝固析出的淡黄色透明液体。如将血液自血管内抽出，放入试管中，不加抗凝剂，则凝血反应被激活，血液迅速凝固，形成胶冻。凝血块收缩，其周围所析出之淡黄色透明液体即为血清，也可于凝血后经离心取得。在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原，这一点是与血浆最大的区别。而在凝血反应中，血小板释放出许多物质，各凝血因子也都发生了变化。这些成分都留在血清中并继续发生变化，如凝血酶原变成凝血酶，并随血清存放时间逐渐减少以至消失。这些也都是与血浆区别之处。但大量未参加凝血反应的物质则与血浆基本相同。为避免抗凝剂的干扰，血液中许多化学成分的分析，都以血清为样品。

乳酸菌、单细胞核李斯特氏菌、副溶血性弧菌这几种细菌的测定有没有相关的试剂盒呢？即便有试剂盒，前增菌、纯培养阶段仍需购买相关的培养基吧？有没有用过的朋友？

试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中肝细胞生长因子受体（HGFR/ c-MET）的含量。实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肝细胞生长因子受体（HGFR/ c-MET）水平。用纯化的人肝细胞生长因子受体（HGFR/ c-MET）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肝细胞生长因子受体（HGFR/ c-MET），再与HRP标记的羊抗人抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肝细胞生长因子受体（HGFR/ c-MET）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人肝细胞生长因子受体（HGFR/ c-MET）浓度。试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：1350ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存终止液[align=cente

求购克伦特罗试剂盒、氯霉素试剂盒、莱克多巴胺试剂盒及孔雀石绿试剂盒？麻烦各位能人告知各种试剂盒的价格，以便我考量。谢谢！

课题研究的开始阶段，必须获得非典病毒基因。香港大学微生物系袁国勇教授是国际上较早分离出非典病毒并完成其基因分析的专家，车小燕曾与他进行过多年的合作，第一军医大学也早与香港大学建立了合作关系。于是，车小燕与袁国勇教授联系并达成合作研究协议，港大无偿提供非典病毒基因，使科研一开始就处于高起点的领先地位，为快速诊断试剂盒早日上市赢得了时间。　　六、七月的广州正值盛夏，天气异常炎热，大家穿着厚厚的防护服，戴着面具和口罩，在实验室一呆就是十多个小时，出来时人都快虚脱了。课题组成员郝卫回忆，为最快拿出成果，他们与时间赛跑，一进实验室就像高速运转的机器，许多仪器因超负荷运转频发故障，但大家咬牙坚持，每天工作多达十八九个小时。饿了就吃碗方便面，实在顶不住了就趴在桌子上打个盹。　　车小燕工作起来像上足发条的时钟，不知疲倦。她的丈夫工作也很忙，孩子面临中考，无人照顾，只好常吃方便面，以致现在“一见方便面就想吐”。负责制备针对非典病毒抗体的丘立文，在实验室连续工作一个半月，甚至有三四天没合过眼。技师廖志勇的父亲病危，家里多次来电报，但他没向任何人提起，仍全身心地投入工作，直到父亲病故的消息传来，他才请几天假回去料理后事。未能见上父亲最后一面成了他一辈子的遗憾。　　去年9月，终于拿出了“SARS冠状病毒抗原诊断试剂盒”、“SARS冠状病毒酶促增敏化学发光免疫分析试剂盒”。但拿到中国生物制品检定所检定时，竟然对一些非典病毒敏感性较低。“难道我们选择的实验材料有问题？”　　课题组决定对每一株非典病毒抗体都重新检测一遍。这意味着检测方法要推倒重来，又需一个半月时间。大家毫无怨言，毫不气馁，夜以继日，把制备的病毒抗体重新配对组合，用几十种配对方式对非典病毒广东株、香港株、北京株、美国毒株等10多种毒株进行敏感性检测。不到10天，一套新的试剂盒构建方案形成了。经复核对世界各地分离出的不同非典病毒毒株均能实现敏感检测，新的快速诊断方法符合国家质量标准。　　兄弟单位无私提供非典样本，让试剂盒通过了对1000多份样本的临床考核，从而获准上市　　试剂盒研制出来了，但更大的难题还在后面，必须通过非典样本的临床考核。这看上去简单，操作起来很难，因为非典样本少。比如，广东总共才有1000多例病人，不是每个病人都留下血清样本，再扣除污染因素，满打满算样本也就1000来份。而关于非典科研项目又多，有限的样本根本不能满足需要。另外，为防止非典样本发生泄露，国家又进行严格控制，所以要获得大量样本来考核试剂盒是否合格，非常难。　　这时，省卫生厅伸出援手，由省疾病预防控制中心提供试验样本。总后卫生部部长作出批示，军事医学科学院也提供了200多份样本。这样，费了九牛二虎之力，终于弄到600多份样本。　　今年4月1日，试剂盒拿到国家药审中心审评。尽管严谨的药审专家对检测结果感到欢欣，但还是认为临床考核病例数不够，需要补充临床资料。　　还要弄样本？大家几乎被“逼”上绝境。就在这一关键时刻，学校和医院领导将情况向省科技厅作了专题汇报。省委常委、常务副省长钟阳胜，副省长雷于蓝高度重视，亲自协调，广州市疾病预防控制中心及时提供了300多份标本。　　“借”样本虽然难，但也成为大家苦中有乐的回忆。在北京做实验时，大家吃住都在学校驻京办事处的小院里。为保证大家有充沛的体力，带队的黄震副院长亲自到超市采购、下厨，煲鸡汤、卤牛肉，给大家改善伙食。在科研碰到难题、压力时，院长、政委靠前指挥，解决问题。　　兄弟单位无私提供的1000多份样本，让课题组如获至宝，加班加点进行检测，获得了1000余例临床考核资料，证明从病人发病的第一天到第10天均可在其血液中检出非典病毒，检出率达到了90％以上，准确率高达99%.今年4月，北京新发现几例非典疑似病例，国家疾病预防控制中心紧急调用珠江医院刚研制出来的试剂盒进行检测，检测结果与确诊意见完全一致。　　中国工程院院士钟南山等专家建议将该诊断方法纳入国家非典诊断方案，便于早期发现和排查非典病人，及时阻断非典的传播。　　为加快试剂盒的审批，使研究成果尽快推向市场，应用于临床，省和国家药监局开通“绿色通道”，第一时间审核申报资料。全国防治非典攻关领导小组亲临现场对项目进行考察论证，为试剂盒早日批准上市创造了条件。

[em49] [em49] 国外的药物残留检测各种试剂盒，例如：克伦特罗试剂盒，莱克多巴胺试剂盒，苯磺胺试剂盒，氯霉素试剂盒等产品大都是拜发的，国内的试剂盒已经有国际水平，为什么大家就不能试用国内的产品呢？海尔产品现在一点都不比其他的差，国家十五攻关课题里就有食品安全检测这一块，为什么市场推广这么难！！是不是有“国外的产品就是比国内的好”这样的想法呢？

我们实验室检测一年多，目前主要检测抗生素及β-受体激动剂一些药物和违禁物残留量，所用方法均为试剂盒ELISA检测，但试剂盒本身定位为半定量检测，测量有较大的不确定范围，想咨询下有没有做过试剂盒认证的老师，问一下方法验证如何开展试验

用试剂盒方法(酶法)测定食品中葡聚糖含量摘要:描述了用试剂盒(酶法)测定食品中葡聚糖含量的方法前言: β-葡聚糖是禾谷类植物籽粒细胞壁中的多糖，是籽粒细胞壁的主要成分，化学名称为(1，3)(1，4) -β-D-葡聚糖，其含量以大麦和燕麦中较高其主要功能有：降低胆固醇，降血脂，调节血糖，提高免疫力，抗肿瘤和预防心血管疾病等。还有研究发现，它可以缓解和减轻肥胖症状。 β-葡聚糖测定方法包括酶测定法、荧光法、高效液相色谱法等，其中酶测定法因其反应专一性，测定准确可靠，而被采用为国际测定方法。酶法的方法过程如下：样品经水合和糊化，用地衣酶(β一葡聚糖酶)将样品中的β一葡聚糖酶解成β-葡基-寡聚糖。经调整体积和过滤分离后，用β一葡萄糖苷酶将这些可溶的B-葡基-寡聚糖水解成葡萄糖。葡萄糖用葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，后者用过氧化酶分解，以便在苯酚存在下，生色基4一氨基非那宗存在下形成适于比色分析的光吸收络合物，在紫外分光光度计下测定。 本文采用爱尔兰的Megazyme公司提供的测定(1，3)(1，4) -β-D-葡聚糖试剂盒，借鉴了EBC法3.11.1、AOAC法995.16，AACC法32-23方法，建立了测定相关制品中β-葡聚糖的测定方法。

在ELISA试剂盒实验中每一个步骤都至关重要，其中的温育是在试剂盒实验中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和 2～8℃。 保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA试剂盒板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜笼盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。ELISA试剂盒若用保温箱，应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。应留意温育的温度和时间应按划定力求正确。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。室温温育的反应，操纵时的室温应严格限制在划定的范围内，尺度室温温度是指20～25℃，详细操纵时可根据仿单的要求控制温育。 要保证在设定的温度下有足够的反应时间，一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温 升至37℃，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在临床实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔 板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。因此，为保证37℃下足够的温育时间，临 床实验室可自行确定本实验室不同季节(不同室温下)微孔板从室温拿至温箱后需要多长时间孔内温度才能达到37℃，从而适当延长板条在温箱中的放置时间。

原创与否转贴线粒体功能状态和不少疾病的密切相关，线粒体膜电位（MMP）则是反映细胞内线粒体功能状态的重要参数之一。本人整理一下线粒体膜电位测量方法，包括主要测量仪器和常用荧光探针，欢迎补充讨论。常用测量仪器：（1）普通荧光显微镜；（2）激光扫描共聚焦显微镜；（3）流式细胞仪。常用荧光探针：JC-1，DioC6，mitocapture，罗丹明123，TMRM等。JC-1（也称CBIC2(3)）是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm 的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。JC-1单体可采用488或514nm激光激发，发出绿色荧光波长为529nm左右；JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为585nm，发出红色波长为590nm。罗丹明123（Rhodamine 123, Rh123）是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质，荧光强度减弱或消失。在细胞凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的崩溃，Rh123 重新释放出线粒体，从而发出强黄绿色荧光，通过荧光信号的强弱来检测线粒体膜电位的变化和凋亡的发生，可用于培养的细胞或从组织中提取出的线粒体的膜电位检测。Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) 也是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，单激光激发和单荧光发射峰。可用543nm激光激发，发射橙红色荧光波长在580nm左右。相对其他荧光探针，TMRM具有许多优点如染料在线粒体积累仅源于膜电位变化更；相对毒性更小；和细胞器结合率低；适合做线粒体膜电位的定量分析等。

ELISA酶联免疫法是如今实验室最为常见的检测方法，在做ELISA试剂盒实验时我们的首要当然是确定实验类型，然后就是样本收集，样本收集好了我们就可以开始进行实验。但是关于ELISA试剂盒标准操作方法您是否做对了呢？一起来检查一下您的实验步骤是否规范吧。试剂准备在临床实验室，对试剂准备一般不太注意，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。加血清样本及反应试剂在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器加样必须注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。温育温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。

这次新冠疫情监测全靠快检试剂盒，学习一下试剂盒的分类种类，求大神们指导。

实验室购买的商品化ELISA试剂盒，CNAS文件规定须有质量评价记录，这里的质量评价记录是什么？商家提供还是自己验收？有没有必要跟培养基一样做技术验收？