人输尿管上皮永生化细胞

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）最常见且严重的微血管病变之一，常伴有肾小球硬化和肾小管间质纤维化，最终可发展为终末期肾脏病（ESRD），严重危及生命。西医治疗DN主要以降糖、降压、调脂、抗感染为主，但这些手段仍难以阻止炎症反应与肾纤维化的发生，且存在一定的局限性及不良反应，因此，探寻行之有效的DN防治策略，提高治疗水平迫在眉睫［1-3］。中医药根据辨证分型对DN进行治疗已有上千年的历史，对其记载可追溯至《黄帝内经》之“消瘅”及“消渴病”继发的“虚劳、水肿、尿浊、关格、肾劳”等，可通过调节代谢、自噬、抗氧化、抗炎、抗纤维化等机制，对DN进行多靶点调控治疗。在改善DN客观指标、保护肾功能及远期疗效方面，中医药都显示出了独特的优势［4-5］。 黄芪六一汤始载于《太平惠民和剂局方》，由黄芪60 g、甘草10 g组成，具有大补肺气、滋益肾水、调和脾胃的功效［6］。课题组前期发现［7-11］，由黄芪六一汤提取、分离出来的黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖、甘草酸所组成的黄芪六一汤组分（简称“HQD”）具有防治DN、显著改善肾功能的作用。并鉴定出HQD中6个主要原型入血成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、甘草酸）。然而，HQD作为中药复杂化学成分的混合体，其在体内发挥抗DN药效的分子作用机制尚不完全明确，制约了其深层次开发利用。 网络药理学能高效整合中药、成分和靶点之间关系，构建中药-成分-靶点网络，诠释药物与疾病之间的复杂关系，为中药及其复方作用机制研究提供了行之有效的新方法［12-13］。故本实验首先采用网络药理学技术对HQD抗DN的机制进行探索，发现HQD发挥药理作用可能与细胞自噬缺陷有关。据报道［14-15］，自噬缺陷可导致肾小管上皮细胞的损伤，而激活自噬能够减轻这一损伤从而保护肾功能。根据药效学及网络药理学实验结果，推测HQD发挥抗糖尿病肾病的作用机制可能和肾小管上皮细胞自噬水平失调有关，为验证推测结果，本研究从细胞自噬角度出发，采用DN大鼠模型对筛选出的核心通路进行验证，以期为黄芪六一汤及中药复方的分子作用机制研究及深层次开发提供创新思路与借鉴。 1　材料 1.1　仪器 EnVision酶标仪（PerkinElmer）；H1-16KR台式高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；Rayto全自动生化分析仪（Chemray 800）；Tissuelyser-24L多样品组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；三诺血糖仪（长沙三诺生物传感技术有限公司）；Multiskan FC酶标仪（Thermo Scientific）；免染蛋白印迹系统（ChemiDooTM）、蛋白快速转印仪（Trans-Blot Turbo）、胶凝成像系统（GBOXChemiXL1.4）均购自美国Bio-rad公司；电泳仪（PowerPacBasic）、核酸蛋白紫外检测仪（Biomate 3S）、垂直电泳槽，均购自美国Thermo公司；纯水超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；透射电子显微镜（日本电子JEOL）生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；台式高速微量离心机（大龙兴创实验仪器北京股份）；超薄切片机（LEICA）；组织脱水机（LEICA）。 1.2　试药 黄芪（批号220604、211104、220901，四川盛世锦荣药业有限公司）、甘草（批号201024、200306、220805，四川盛世锦荣药业有限公司），黄芪、甘草经贵州中医药大学谢军丽讲师鉴定分别为豆科植物膜荚黄芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.干燥根和根茎。细胞凋亡检测试剂盒（货号E-CK-A322，Elabscience），DAPI（货号C1002，上海碧云天生物技术有限公司），抗荧光淬灭封片剂（货号0100-01，southernbiotech），苏木素（货号H9627，Sigma）；二甲苯（货号10023418）、包埋石蜡（货号69019361）、伊红Y（水溶性，货号71014544）、中性树胶（货号10004160）均购于中国医药集团有限公司；肌酐（Scr，货号C074-d）、尿素氮（BUN，货号C010-a）、总胆固醇（TC，货号C048-a）、三酰甘油（TG，货号C019-a）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C，货号C047-a）检测试剂盒均购于长春汇力生物科技有限公司；尿蛋白测试试剂盒（货号C035-2，南京建成生物工程研究所），RIPA裂解液、PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒、1xTBST 缓冲液、5x蛋白上样缓冲液、β-actin 兔多克隆抗体（货号AC230205001）均购于武汉塞维尔生物科技有限公司；mTOR（货号66888-1-lg）、Beclin 1（货号66665-1-lg）、p-mTOR（货号66882-1-lg）、HRP标记的羊抗鼠 IgG（货号SA00001-2）、HRP标记的羊抗兔 IgG（货号20000373）鼠单克隆抗体均购于武汉Proteintech有限公司；LC3α/β（货号R10241506）、PI3K（货号N09263380）、Akt（货号M04201652）兔多克隆抗体购于沈阳万类生物科技有限公司，链脲佐菌素（STZ，索莱宝生物有限公司，批号2230520002）。 根据本课题组前期确定的HQD制备工艺［10］，按照原处方黄芪与甘草6∶1比例，取符合药典标准的黄芪饮片12 kg和甘草饮片2 kg，制备得质量分数为72.04%的黄芪总皂苷干浸膏76.02 g（含黄芪甲苷2.69%）；质量分数为70.03 %的黄芪总黄酮干浸膏31.64 g（含毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.72%、毛蕊异黄酮1.52%、芒柄花苷0.94%、芒柄花素0.31%）；质量分数为67.12%的黄芪总多糖干浸膏185.04 g，质量分数为80.05%的甘草酸精制品22.01 g。将上述制备所得黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖干浸膏与甘草酸精制品全部混合均匀，即得本实验所需HQD样品。 1.3　实验动物 SPF级雄性SD大鼠35只，体质量（300.00±10.82）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（湘）2022-0011，饲养于通风良好，室温18～25 ℃，相对湿度50%～70%，按常规定期消毒的动物房。按每笼4只分装，由专人饲养管理，自由饮水及饲料，实验操作和处理严格遵循国际准则。 2　方法 2.1　HQD抗DN的药效实验 2.1.1 　DN模型大鼠的制备 大鼠适应性喂养1周后，选取8只作为对照组，对照组大鼠喂食普通饲料。其余大鼠高糖高脂饲料喂养2周，尾iv STZ（溶于pH 4.5，0.01 molL-1无菌柠檬酸钠缓冲液）33 mgkg-1，注射4周后测定空腹血糖（FBG）及24 h尿蛋白（24 h U-Alb）含量，以FBG≥11.1 mmolL-1［16-17］，肾组织出现病变为造模成功。其中，24只大鼠造模成功，3只血糖低于11.1 mmolL-1，无死亡大鼠。 2.1.2　分组及给药 将造模成功大鼠随机分为模型组，HQD高、低剂量给药组，每组8只。以黄芪六一汤临床生药用量（黄芪60 g、甘草10 g）的4倍、1倍剂量，换算本实验的HQD高剂量（0.66 gkg-1）与低剂量（0.17 gkg-1）。按照给药剂量，每日固定时间ig 1次，对照组与模型组ig等量的0.9%氯化钠溶液，连续给药8周。 2.1.3　各组大鼠相关生化指标检测 实验期间观察各组大鼠活动情况、精神状态、毛色、进食、饮水量及排泄量状况等。末次给药后，代谢笼收集24 h尿液并记录尿量（禁食不禁水），1 400 rmin-1离心5 min，收集上清。尾静脉采血测FBG，于腹主动脉取血，4 ℃下3 000 rmin-1离心15 min，收集上清。取血后断颈处死各组大鼠，取肾脏，除去被膜，部分肾组织用于病理学、细胞凋亡等检测，其余组织于-20 ℃保存备用。采用全自动生化分析仪，检测血清Scr、BUN、TG、TC、LDL-C水平。按照尿蛋白定量测试盒说明书操作测定尿总蛋白。 2.1.4　肾脏组织病理学观察 取上述部分肾脏置于4%多聚甲醛中固定，蒸馏水冲洗，将组织包裹在石蜡块中，组织脱水，浸蜡、包埋、切片、烤片、切片脱蜡，HE染色、Masson染色，封片，光镜下观察肾脏组织病理学改变。 2.1.5　TUNEL检测细胞凋亡情况 取肾组织石蜡切片进行脱蜡、水化，以蛋白酶K工作液在25℃下消化组织15 min，PBS漂洗，按照说明书对切片进行TUNEL染色，荧光显微镜下观察采集图像，计算细胞凋亡率。 2.1.6　数据统计分析 所有数据以±s表示，统计分析采用SPSS 27单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 2.2　网络药理学研究 2.2.1　活性成分靶点预测 以HQD中6个主要原型入血成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、甘草酸）为研究对象。采用PubChem数据库 （https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载活性成分的SDF格式，将其导入SwissTargetPrediction 数据库（http：//swisstargetprediction.ch/）进行活性成分的靶点预测。剔除重复靶点，获取与6个活性成分相关的靶点。通过UniProt数据库 （https：//www.uniprot.org/）将得到的活性成分靶点蛋白名称进行标准化。 2.2.2　DN的靶点预测 通过GeneCard（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（https：//www. disgenet.org/）和OMIM（https：//omim.org/）数据库以“Diabetic nephropathy”为关键词进行检索，剔除重复得到疾病靶点，并用Venny工具将6个活性成分的作用靶点与DN靶点进行交集比对，得到其共同作用的靶点作为6个活性成分治疗DN的潜在靶点。 2.2.3　蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 为了进一步明确HQD治疗DN预测靶点之间的直接或间接调控关系，将潜在靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/）中构建PPI网络，限定物种为“Homo sapiens”，为了具有高置信度，设置minimum required interaction score≥0.9，并隐藏游离蛋白，以TSV格式保存结果，将其导入可视化的Cytoscape 3.6.0软件进行拓扑分析，筛选得到核心靶点。 2.2.4　基因本体（GO）注释及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将交集靶点导入Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html），进行GO功能富集分析；将交集靶点导入KOBAS 3.0数据库（http：//kobas.cbi. pku.edu. cn/ kobas3/genelist/），进行KEGG通路富集分析。下载分析结果，将其分别按P值和“Count”（每条通路中含有的潜在基因靶点的数量）值的大小进行排序。 2.3　实验验证网络药理学预测结果 2.3.1　透射电镜观察肾小管上皮细胞中自噬体及自噬溶酶体的形成 取“2.1.3项”下对照组、模型组、HQD高剂量给药组大鼠部分肾组织约1 cm3，经3%戊二醛预固定24 h左右，1%四氧化锇再固定2 h；依次加入30%、50%、70%、80%、95%、100%的丙酮溶液进行逐级脱水，每次20 min；脱水后，采用丙酮和Epon812包埋剂对其进行渗透和包埋；采用超薄切片机制备60～90 nm的超薄切片；并以醋酸铀避光染色10～15 min，再用柠檬酸铅避二氧化碳染色1～10 min，超纯水清洗3次，滤纸吸干、室温干燥过夜后，采用JEM-1400FLASH透射电镜对各组肾组织中的肾小管上皮细胞外形及其中的自噬体及自噬溶酶体进行观察。 2.3.2 Western blotting检测肾脏组织中自噬相关蛋白及磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信号通路关键蛋白的表达 随机从对照组、模型组、HQD高剂量给药组选取3只大鼠的肾组织，加入含蛋白酶和磷酸化酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上匀浆，裂解1 h后，12 000 rmin-1离心10 min，收集上清液；BCA法测定总蛋白浓度。每孔以20 μg蛋白上样，100 V电泳，100 V湿转；5%的脱脂牛奶封闭2 h，加入Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，显色曝光。扫描胶片，分析胶片灰度值。考察HQD对肾组织中Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、PI3K、Akt、mTOR及p-mTOR蛋白表达的影响。 3　结果 3.1　HQD抗DN的药效实验 3.1.1　各组大鼠相关生化指标检测 结果见图1。对照组大鼠精神状态良好，饮食、饮水与大小便正常，皮毛有光泽，体质量逐渐增加。模型组大鼠呈明显的多饮、多尿、多食、体质量下降等糖尿病“三多一少”症状，后期出现不同程度的体毛暗淡、稀疏、精神萎靡，反应迟钝症状。与对照组比较，模型组大鼠FBG、Scr、BUN、TG、TC、LDL-C、24 h U-Alb显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，HQD高剂量组均能显著降低上述药效指标（P＜0.05、0.01）；低剂量组FBG、Scr、BUN、TG、24 h U-Alb显著降低（P＜0.05、0.01）。 3.1.2　肾脏组织病理学观察 HE染色结果显示，细胞核呈蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。对照组肾小球结构清晰，肾小球系膜区未见明显改变。模型组大鼠肾小球系膜基质增宽、增多，基底膜弥漫增厚，肾小囊腔狭窄，肾小球体积增大。HQD给药组大鼠肾小球系膜轻度增生，肾组织损伤情况较模型组明显减轻，见图2。 Masson染色结果显示，胶原纤维、黏液、软骨呈蓝色，肌肉、胞浆、纤维素、红细胞呈红色，胞核呈蓝黑色。主要用于区分肌纤维和胶原纤维。与模型组相比，HQD给药组大鼠的肾纤维化程度较轻，见图3。 3.1.3　TUNEL检测细胞凋亡情况 荧光显微镜下组织切片上凋亡的细胞呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。每个样品选取3个高倍视野（400倍），每个高倍视野计数各视野总细胞数，同时计数各视野的凋亡阳性细胞。结果见图4。与对照组比较，模型组细胞凋亡率明显上升（P＜0.01）；而HQD高、低剂量组细胞凋亡率显著下降（P＜0.05）。 3.2　网络药理学研究 3.2.1　潜在靶点 通过检索SwissTargetPrediction得到各个活性成分所对应的靶点基因共600个，去掉重复的244个，剩余356个靶点。通过GeneCard、DisGeNET和OMIM 数据库共获得1 480个与DN相关的靶点，通过制作韦恩图分析，得到114个药物-疾病共同靶点作为活性成分治疗DN的潜在靶点，见图5。 3.2.2　潜在靶点的PPI网络分析 为了获得有关潜在靶点交互作用的信息，将114个潜在靶点上传到STRING平台，进行PPI网络分析，结果见图6。并将结果的TSV文件导入Cytoscape 3.6.0 进行可视化和拓扑分析，PPI网络包括102个节点和451条边，选择“度”（degree）、“介数中心性”（betweenness centrality）和“接近中心性”（closeness centrality）高于中位数的靶点作为关键目标，首次筛选值为degree＞6，betweenness centrality＞0.003 836 8，closeness centrality＞0.413 800 8，筛选后，获得了一个包含41个节点和258条边的新网络；随后筛选值为degree＞10，betweenness centrality＞0.007 837 44，closeness centrality＞0.571 428 57，获得包含19个节点和107条边的中心网络；为了在PPI网络中找到最关键的目标，最后一次筛选值为degree＞11，betweenness cenTrality＞0.014 000 41，closeness centrality＞0.72，筛选获得STAT3、EGFR、VEGFA、JUN、TNF、AKT1、CASP3、mTOR及IL2作为PPI网络中的核心靶点，见图7。其中，mTOR是调节自噬的关键激酶，抑制mTOR可促进自噬。 3.2.3　GO分析和KEGG分析 将114个交集靶点导入Metascape平台进行GO富集分析，共获得 1 581条结果，包含1 388条生物过程（BP）结果，122条分子功能（MF）结果，71条细胞组成（CC）结果，分别选取显著丰富的前15个结果进行可视化处理，见图8。BP主要对激素的反应、MAPK级联调节、细胞对氮化合物的反应、细胞对有机氮化合物的反应和蛋白质磷酸化的正调控等；CC主要涉及膜筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）、细胞外基质（extracellular matrix）、膜面（side of membrane）和囊泡腔（vesicle lumen）等；MF主要涉及激酶结合（kinase binding）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）、激酶活性（kinase activity）、内肽酶活性（endopeptidase activity）和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）等。表明HQD治疗DN的机制涉及多种生物学过程，体现多重治疗作用。 使用KOBAS3.0共检索到235条富集通路，选取P＜0.001的结果，获得147条显著富集通路，并按“Count” 值由高到低排列，选取前20条通路作为核心通路进行展示，见图9。显示6个成分治疗DN的靶点主要涉及癌症通路、癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等信号通路，其中PI3K-Akt信号通路、MAPK通路均与自噬调控相关。与上述“3.2.2 ”项下PPI网络分析得出的“HQD核心作用靶点”进行联合分析后，选择对自噬经典通路PI3K/Akt/mTOR进行验证。 3.3　实验验证 3.3.1　透射电镜观察肾小管上皮细胞中自噬体及自噬溶酶体的形成 结果见图10。检测自噬的金标准是电镜下可观察到结构完整的自噬体及自噬溶媒体。采用透射电镜观察对照组、模型组、HQD高剂量组大鼠肾小管上皮细胞中自噬体及自噬溶酶体的数量。结果显示，对照组肾小管上皮细胞形态结构较正常；细胞核呈椭圆形或类圆形，核仁明显；线粒体呈圆形、椭圆形或长梭形，嵴排列较紧密，胞浆中可见大量溶酶体、自噬溶酶体和空泡。模型组肾小管上皮细胞形态结构出现明显异常。细胞核呈类圆形或椭圆形，核仁明显；线粒体发生肿胀，仅可见少量残留嵴结构，基质颗粒大量丢失；胞浆中自噬溶酶体数量较对照组明显降低。HQD高剂量组肾小管上皮细胞形态结构轻度异常。细胞核呈类椭圆形或类圆形，核仁明显；部分线粒体轻度肿胀，嵴溶解断裂，基质颗粒减少；胞浆中自噬溶酶体及自噬小体数量较模型组有所增加，溶酶体与自噬小体融合较好。 3.3.2　Western blotting检测肾脏组织中自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ及PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白的表达 结果见图11。与对照组比，模型组PI3K、Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平显著升高；Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比，HQD高剂量给药组PI3K、Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平显著降低；Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。 4　讨论 自噬是真核细胞的一种自我保护机制，也是细胞内蛋白质降解的主要途径之一。自噬活性正常时，细胞能够及时降解自噬小体内包裹的受损细胞器、侵入的病原体及衰老的蛋白质等，以维持细胞稳态、能量生成及细胞器的更新［19-20］。研究表明［21-23］，DN发生时，肾脏存在显著的自噬失调。自噬缺陷可导致肾小管上皮细胞的损伤，激活自噬能够减轻这一损伤从而保护肾功能。恢复自噬活性可能成为保护肾脏免受高糖损伤的一种新的治疗选择，有望成为防治DN的新靶点。 课题组前期已鉴定出HQD中6个主要原型入血成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、甘草酸）。文献报道［24-28］，黄芪甲苷可通过激活AMPK/eNOS信号通路，改善大鼠糖尿病肾损伤；毛蕊异黄酮葡萄糖苷具有保护血管内皮细胞的作用，能延缓DN患者的血管病变；毛蕊异黄酮能通过调节NF-κB/p65/NLRP3/TXNIP炎症小体信号通路延缓DN的发展；芒柄花素可通过调节Sirt1/PGC-1α通路减轻DN大鼠的肾小管及线粒体损伤；芒柄花苷能通过降低氧化应激和炎症标志物减轻链脲佐菌素诱导的DN大鼠模型的肾损伤；甘草酸能通过调节SNARK/AMPK信号通路保护高糖诱导的肾小球足细胞损伤。然而， HQD在体内发挥抗DN药效作用的分子机制尚不完全明确，限制了其深层次研究。网络药理学能基于中药多靶点效应，从生物信息学上整体分析在HQD治疗DN上所涉及的靶点及信号通路。故本实验以HQD中6个主要原型入血成分为研究对象，采用网络药理学方法对HQD作用靶点及信号通路进行预测，并将114个潜在靶点进行了PPI分析，发现HQD可能主要作用于STAT3、EGFR、VEGFA、JUN、TNF、AKT1、CASP3、mTOR及IL2等核心靶点。其中，mTOR是调控自噬的重要因子。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白酶，是磷脂酰肌醇3激酶的相关激酶（PIKK），mTOR复合体是调节细胞自噬的关键分子之一，可作为多条信号通路的中间环节参与细胞自噬调节过程，并影响自噬标志性蛋白LC3的表达。mTOR可与其他调控蛋白相互作用至少形成两个不同的复合物，分别是mTOR复合物1（mTORC1）和复合物2（mTORC2）。虽然这两个复合物含有相同的催化亚基——TOR，但均可磷酸化不同的下游靶点，从而显示出不同的细胞功能。抑制mTOR可促进自噬，响胰岛素抵抗和炎性反应［29-30］。因此，调控mTOR不同的上游信号通路可能是治疗DN的一个新思路。 KEGG通路功能富集分析显示，HQD可能通过作用于癌症通路、癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、MAPK等信号通路发挥药理作用。其中PI3K/Akt/mTOR通路为自噬调控的经典通路，通路活化后可激活mTORC1抑制细胞自噬过程［31］。据报道［32］，Beclin-1、LC3蛋白参与自噬小体的形成与自噬溶酶体降解过程，是经典的自噬标志物。自噬小体的减少会导致Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平降低，而激活Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ表达可诱导细胞发生自噬。故本项目选择对经典自噬调控通路PI3K/Akt/mTOR进行验证，并进一步考察HQD对自噬标志蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的调节作用。Western blotting结果表明，HQD可以上调肾组织自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达，抑制PI3K/Akt通路活化，抑制mTOR的激活；透射电镜观察显示，HQD可以增加肾小管上皮细胞自噬体及自噬溶酶体数量。研究结

[font=宋体][size=15px]淫羊藿苷[/size][/font][size=15px][font=宋体]（[/font][font=&]Icariin[/font][font=宋体]，[/font][font=&]ICA[/font][font=宋体]）[/font][font=宋体]是传统中药淫羊藿的主要活性成分，在体内会被代谢为淫羊藿素（[/font][font=&]Icaritin[/font][font=宋体]，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]）发挥作用。[/font][font=&]2022[/font][font=宋体]年，以[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]为主要成分的[/font][font=&]Icaritin[/font][font=宋体]胶囊获得[/font][font=&]NMPA[/font][font=宋体]批准用于晚期无法手术的肝细胞癌的一线治疗。[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]不仅通过诱导细胞凋亡和自噬直接作用杀死肿瘤，而且调节肿瘤免疫微环境，促进抗肿瘤免疫应答。然而，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]调节[/font][font=&]TME[i][/i][/font][font=宋体]的具体机制，特别是在尿路上皮癌中，尚不完全清楚。[/font][font=&][/font][/size] [size=15px][font=宋体]淫羊藿素（[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]）通过减少肿瘤微环境中[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]（中性粒细胞胞外诱捕网）的形成和中性粒细胞浸润来预防尿路上皮癌转移。[/font][b][font=宋体]机制上，在中性粒细胞中，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]结合并抑制[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化。此外，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制[/font][font=&]ROS[/font][font=宋体]的产生，抑制[/font][font=&]MAPK[/font][font=宋体]信号通路，抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]诱导的肿瘤转移。同时，在肿瘤细胞中，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制肿瘤[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]诱导的组蛋白瓜氨酸化，从而降低[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]转录，[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]表达的下调通过[/font][font=&] JAK2/STAT3/IL-6 [/font][font=宋体]轴形成调节反馈回路并限制中性粒细胞募集。[/font][/b][font=&][/font][/size] [size=15px][b][font=&]1[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]在体外抑制尿路上皮癌细胞的恶性生物学行为[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]为阐明[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]对肿瘤的调控机制，[/font][b][font=宋体]作者通过体外实验（[/font][font=&]CCK8[/font][font=宋体]、集落形成、流式细胞术、划痕和[/font][font=&]Transwel[/font][font=宋体]等）评估了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]对恶性生物学特性的抑制作用[/font][/b][font=宋体]。结果显示[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]显著抑制多种尿路上皮癌细胞系的细胞活力，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，诱导细胞周期停滞。这些体外研究结果证明了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]作为抗肿瘤药物的潜力[/font][/size] [align=center][img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img][/align][align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]2[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制体内中性粒细胞浸润来抑制肿瘤转移[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]进一步作者研究了[/font][b][font=&]ICT[/font][font=宋体]对尿路上皮癌的体内抗肿瘤功效[/font][/b][font=宋体]。通过皮下肿瘤模型发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制肿瘤增长，增强细胞毒性[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞和[/font][font=&]M1[/font][font=宋体]型巨噬细胞的浸润，促进抗肿瘤免疫效应分子的分泌，显著抑制中性粒细胞浸润。尾静脉肺转移试验显示，[/font][b][font=&]ICT[/font][font=宋体]在体内显著抑制肿瘤转移，而在中性粒细胞耗竭后，这种对转移的抑制作用减弱。[/font][/b][font=宋体]此外，在[/font][font=&]CD4[/font][font=宋体]或[/font][font=&]CD8 T[/font][font=宋体]细胞单独耗竭后，对肿瘤转移的抑制仍然存在。结果表明[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]调节肿瘤免疫微环境中的中性粒细胞，从而通过抑制中性粒细胞浸润来增强抗肿瘤免疫。[/font][font=&][/font][/size] [align=center][img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img][/align] [size=15px][b][font=&]3[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]逆转[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]介导的肿瘤上皮[/font][font=&]-[/font][font=宋体]间充质转化（[/font][font=&]EMT[/font][font=宋体]）和干性以抑制转移[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]中性粒细胞胞外陷阱（[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]）作为中性粒细胞中[/font][font=&]NETosis[/font][font=宋体]的产物，在介导肿瘤免疫微环境中的免疫抑制中起着关键作用。[/font][b][font=宋体]作者发现[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]标志物组蛋白[/font][font=&]3[/font][font=宋体]瓜氨酸化（[/font][font=&]H3CIT[/font][font=宋体]）和髓过氧化物酶（[/font][font=&]MPO[i][/i][/font][font=宋体]）的表达显著降低，进一步通过体外共培养系统发现[/font][font=&]PMA[/font][font=宋体]诱导的[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成增强了肿瘤的侵袭和转移，而[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]有效逆转了这一作用。[/font][/b][font=宋体]此外，[/font][font=&]DNase I[/font][font=宋体]（一种[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]降解剂）与[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]表现出协同作用。体内实验进一步证实了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]对[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成的抑制作用。接着作者检查了共培养后肿瘤的[/font][font=&]EMT[/font][font=宋体]表型，发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]不仅能抑制中性粒细胞浸润，还能有效抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成，从而抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]介导的肿瘤[/font][font=&]EMT[/font][font=宋体]和干性。[/font][font=&][/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]4[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT [/font][font=宋体]通过靶向[/font][font=&] PADI2 [/font][font=宋体]和抑制自杀性[/font][font=&] NETosis [/font][font=宋体]来抑制[/font][font=&] NET [/font][font=宋体]的形成[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][b][font=宋体]为了研究[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成的机制，作者分离[/font][font=&]CD45CD11b[/font][font=宋体]中性粒细胞，用[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]处理，并进行[/font][font=&]RNA-seq[/font][font=宋体]分析。功能富集分析表明，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]调节了与[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成和趋化因子信号传导相关的通路，差异基因表达分析显示[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达显著降低[/font][/b][font=宋体]，[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]是一种与组蛋白瓜氨酸化和[/font][font=&] NET[/font][font=宋体]形成相关的基因。分子对接实验表明，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]可以在六个潜在位点与[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]结合。相关性分析表明[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达与中性粒细胞浸润有关。[/font][font=&]GSVA[/font][font=宋体]分析揭示[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达与[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]相关基因表达之间的相关性，从而得出了[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]介导的[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]形成调控可能与[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]相关的假设，并通过一系列实验证实[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]通过抑制自杀性[/font][font=&]NETosis[/font][font=宋体]和[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化来抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]的形成。[/font][font=&][/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]5[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化和[/font][font=&]IL-6/JAK2/STAT3[/font][font=宋体]信号传导的正反馈回路来抑制中性粒细胞浸润[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]先前的研究表明，[/font][b][font=&]ICT[/font][font=宋体]不仅可以抑制[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]的形成，还可以抑制中性粒细胞浸润。作者进一步剖析[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]抑制中性粒细胞浸润的机制，发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]处理后与中性粒细胞募集相关的几种细胞因子下调，功能富集分析表明这种抑制可能与[/font][font=&]JAK/STAT[/font][font=宋体]信号通路有关。[/font][/b][font=宋体]体外中性粒细胞[/font][font=&]-[/font][font=宋体]肿瘤共培养系统发现[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]处理后招募到下腔室的中性粒细胞数量减少，[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]和[/font][font=&]IL-8[/font][font=宋体]的转录在不同肿瘤细胞系中受到抑制。鉴于[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的组蛋白瓜氨酸化可以增强[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]的转录，[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]与[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]抑制剂[/font][font=&]AFM32a[/font][font=宋体]的组合用于进一步的机制探索，发现[/font][font=&]ICT [/font][font=宋体]同样抑制肿瘤内[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]的表达，并且抑制[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]表达导致肿瘤细胞内组蛋白瓜氨酸化减少，导致[/font][font=&] IL-6 [/font][font=宋体]转录的下游减少并阻碍中性粒细胞募集。[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]水平降低可进一步抑制[/font][font=&]JAK2/STAT3[/font][font=宋体]信号通路，从而破坏[/font][font=&]IL-6[/font][font=宋体]的正转录反馈回路。[/font][font=&][/font][/size] [align=center] [/align] [size=15px][b][font=&]6[/font][font=宋体]、[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的[/font][font=&]NETs[i][/i][/font][font=宋体]对尿路上皮癌具有预后价值[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][b][font=宋体]为了验证[/font][font=&]PADI2[/font][font=宋体]介导的[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]是尿路上皮癌的预后生物标志物，作者收集了尿路上皮癌患者的组织和血液样本进行相关性分析。[/font][/b][font=宋体]结果显示[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]标志物[/font][font=&]CD66b[/font][font=宋体]和[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]标志物[/font][font=&]H3CIT[/font][font=宋体]的联合分析显示，两种标志物高表达的患者预后最差，且中性粒细胞浸润与化疗耐药性相关。肌层浸润性膀胱癌[/font][font=宋体]患者的[/font][font=&]MPO-DNA[/font][font=宋体]水平高于非肌层浸润性膀胱癌患者[/font][font=宋体]，且手术后血浆[/font][font=&] MPO-DNA [/font][font=宋体]升高的患者往往会复发。这些结果强调了中性粒细胞[/font][font=&]NE[/font][font=宋体]相关成分在预测尿路上皮癌复发和进展方面的潜力。[/font][font=&][/font][/size] [align=center][img=图片,1,]data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version='1.0' encoding='UTF-8'%3F%3E%3Csvg width='1px' height='1px' viewBox='0 0 1 1' version='1.1' xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' xmlns:xlink='http://www.w3.org/1999/xlink'%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke='none' stroke-width='1' fill='none' fill-rule='evenodd' fill-opacity='0'%3E%3Cg transform='translate(-249.000000, -126.000000)' fill='%23FFFFFF'%3E%3Crect x='249' y='126' width='1' height='1'%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E[/img][/align] [size=15px][b][font=&]7[/font][font=宋体]、[/font][font=&]ICT[/font][font=宋体]与抗[/font][font=&]PD-1[/font][font=宋体]免疫疗法协同作用，以抵消[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]诱导的[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞耗竭[/font][font=&][/font][/b][/size] [size=15px][font=宋体]既往研究证实，[/font][b][font=宋体]中性粒细胞和[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]可以抑制肿瘤微环境中[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞的抗肿瘤功能，诱导[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞耗竭，导致免疫逃逸。[/font][/b][font=宋体]因此，作者分析了肿瘤中中性粒细胞、[/font][font=&]NETs[/font][font=宋体]和[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞耗竭之间的关系。相关性分析显示，肿瘤中中性粒细胞浸润和[/font][font=&]NET[/font][font=宋体]与[/font][font=&]T[/font][font=宋体]细胞浸润增加有关。然而，

[align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]上皮细胞[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]间充质转化[/color][/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]上皮细胞[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]间充质转化，是指上皮细胞转化为具有间质表型细胞的生物学过程，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在肿瘤的侵袭和转移等方面[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]具有[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]重要作用[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][31][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]经历[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程的细胞具有类似干细胞的特性，耐药性也随之增强[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][32][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。研究发现，在乳腺癌的小鼠模型中，降低[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]snail[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的表达，肺转移的发生显著减少[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][33][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。胰腺癌、肺腺癌细胞在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程后表现出更强的迁移和侵袭能力[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][34, 35][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]从[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]转录调控的角度看，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]与非小细胞肺癌相比，人小细胞肺癌细胞系中[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]相关转录因子的表达量较高[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][36][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Krohn[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]等人研究发现，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]E[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-cadherin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达下调，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Vimentin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达上调的贴壁的小细胞肺癌亚系[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]NCIH69V[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]具有更高的侵袭性[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][37][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。在小细胞肺癌中，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]与[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]抑制剂、顺铂、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bcl-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]抑制剂等药物的耐药具有显著关联性。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]E[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-cadherin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达量较高的小细胞肺癌对[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bcl-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]抑制剂具有更好的应答率[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][38][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Contactin 1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通过诱导[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程调节小细胞肺癌聚乙二醇精氨酸酶的耐药性[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][39][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。越来越多的研究证明，小细胞肺癌[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程受到多种通路的调节，促进小细胞肺癌细胞的增殖、侵袭和转移，并促进化疗的耐药性[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][40-44][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]指的是上皮细胞变成具备间质细胞形态和特性的细胞的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的发生过程中[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]细胞丧失上皮表型[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]同时获得间质表型。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]E-cadherin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]水平下降可以导致细胞的粘附力降低[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]使细胞获得易于侵袭和转移的特性[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，这[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]已经被认为是[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]最显著的特征。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在乳腺癌及宫颈癌中发现，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]促进肿瘤[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][29][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。通过[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Western blot[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]技术检测[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]低表达后[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]相关蛋白的表达情况。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]如果[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]与对照相比，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]H69[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-sh[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]组[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]N-cadherin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Vimentin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达量下降，而[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]E-cadherin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达量上升，表明[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]低表达的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]H69[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]细胞的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程受到了抑制，减少了肿瘤转移的概率。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Wnt[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]信号通路能通过抑制[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]GSK3β[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]（糖原合成酶激酶[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3β[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]glycogen synthase kinase -3β[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）介导的磷酸化作用以及抑制胞质中的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]β-catenin[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]降解等作用来诱发[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]转换[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][75][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]研究显示，抑制[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Wnt[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]信号通路逆转非小细胞肺癌[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][76][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，而肿瘤干细胞[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]LGR5[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通过活化[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Wnt[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通路促进神经胶质瘤[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][77][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。参与[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程的信号通路还有：[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]TGF-β[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Notch[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]SMAD[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PI3K-AKT-MTOR[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]信号通路[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]等，其中涉及[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]调节的信号通路。在人小细胞肺癌细胞系中，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]可能通过[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Wnt[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通路调节[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]EMT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]过程，也可能通过其他通路协同作用，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]具体机制仍需进一步关注与研究。[/color][/size][/font]

胆固醇稳态对机体正常的细胞和系统功能至关重要，胆固醇平衡失调是心血管疾病、神经退行性疾病和癌症等其他疾病的基础[1]。胆固醇代谢包括内源性胆固醇合成、吸收和排泄等环节。研究表明，胆固醇在体内不能被降解，有效排泄是维持其稳态的重要环节[2]。体内积累的胆固醇最终通过肠道以粪便消除胆固醇和胆汁酸的形式达到平衡，目前已知的胆固醇排泄途径包括了胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport，RCT）途径和经肠胆固醇排泄（transintestinal cholesterol excretion，TICE）途径；前者是肝脏将胆固醇转化为胆汁酸后经肠排出，后者是由血直接经肠道分泌和排出血浆脂蛋白来源的胆固醇，二者交汇于肠道，因此，肠道在胆固醇稳态中发挥了重要作用[3-4]。调血脂治疗是防治体内高胆固醇含量诱导的相关疾病的有效方法，目前临床常用调血脂药物他汀类的作用是通过降低低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）以限制内源性胆固醇合成，从而防治心血管等疾病的发生发展，但其相关发病率和死亡率仅降低了30%[5]。这意味着需要更多策略来解决这个严重的公共卫生事件。 雷公藤红素（celastrol，CeT）是一种从传统中药雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.中提取分离出的活性成分，具有抗炎、抗癌和抗动脉粥样硬化等多种药理活性[6]，且具有良好的成药性，被《Cell》杂志列为最可能转化为现代药物的5种有潜力传统药物之一[7]。Zhang等[8]前期研究发现，体外有效成分为CeT的南蛇藤能够通过在促进RCT减少脂质蓄积方面具有积极作用，其机制主要是通过激活清除剂受体B类成员1（scavenger receptor class B member 1，SRB1）、ABC转运体和细胞色素P450家族7亚家族A成员1（cytochrome P450 family 7 subfamily A member 1，CYP7A1）途径促进胆固醇代谢。然而，有关CeT调控胆固醇代谢的作用机制探索尚不完善。此外，迄今为止，并无有关CeT通过调控肠道TICE途径介导胆固醇代谢的相关研究。因此，本研究采用网络药理学和系统生物学理论，通过构建“CeT-靶点-肠道胆固醇代谢”多层次网络，初步预测CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢的作用机制[9-10]，并结合实验深入探讨和验证CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢的作用及机制，旨在为维持体内胆固醇稳态提供新的方向和理论依据。 1 材料 1.1 细胞 大鼠小肠隐窝上皮IEC-6细胞（批号ZQ0783）由中国科学院上海细胞库提供。 1.2 药品与试剂 CeT（批号C0869）购自美国Sigma公司；肝X受体α（liver X receptor α，LXRα）抑制剂GSK2033（批号HY-108688）、Bodipy荧光染色（批号HY-W090090）购自美国MCE公司；0.25%胰蛋白酶（批号PB180229）购自美国Hyclone公司；DMEM高糖完全培养基（批号ZQ-121）、DMEM基础培养基（批号09122）购自上海中乔新舟生物科技有限公司；磷酸酶抑制剂（批号CW2383S）、蛋白酶抑制剂（批号CW2200S）、BCA试剂盒（批号CW0014S）、SDS-PAGE试剂盒（批号CW0022S）、Loading buffer（批号CW0028S）液购自康为世纪生物科技股份有限公司；CCK-8试剂盒（批号C0037）、RIPA裂解液（批号P0013B）、ECL化学发光试剂盒（批号P0018S）购自碧云天生物技术股份有限公司；油红O染色试剂盒（批号G1262-4）购自北京索莱宝科技有限公司；PVDF膜（批号ISEQ00010）购自美国Millipore公司；兔抗三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G5（adenosine triphosphate-binding cassette transporters G5，ABCG5）抗体（批号27722-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号10494-1-AP）、山羊抗兔二抗（批号SA00001-2）购自美国Proteintech公司；兔抗ATP结合盒转运蛋白G8（ATP-binding cassette transporters G8，ABCG8）抗体（批号A01482-2）购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗NPC1样细胞内胆固醇转运蛋白1（NPC1 like intracellular cholesterol transporter 1，NPC1L1）抗体（批号PA5-116672）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；兔抗LXRα抗体（批号ab41902）、DAPI染液（批号ab228549）购自英国Abcam公司。 1.3 仪器 ix 73型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；FC型酶标仪、Forma 3系列CO2培养箱、EVOS fl auto全自动荧光倒置荧光学显微镜（美国Thermo Fisher Scientific公司）；ChemiDoc XRS+化学发光成像系统、Mini-PROTEAN Tetra蛋白电泳系统（美国Bio-Rad公司）。 2 方法 2.1 网络药理学研究 将PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到的CeT 3D结构导入PharmMapper（http://www. lilab-ecust.cn/pharmmapper/）进行药物靶点预测。通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）得到肠道和胆固醇代谢靶点。并与CeT靶点取交集得到共有靶点；通过STRING（https://STRING-db.org）进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建，并导入Cytoscape 3.9.1软件构建网络模型并分析；通过DAVID（https://david. ncifcrf.gov/）进行基因本体（gene ontology，GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；利用PDB（https://www.rcsb.org/）筛选并下载分辨率小于0.25 nm的靶点的结晶复合式，结合上述得到的CeT 3D结构，采用Autodock进行分子对接，运用PyMol可视化处理。 2.2 实验验证 2.2.1 IEC-6细胞培养 IEC-6细胞用DMEM高糖完全培养基于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中常规培养。 2.2.2 CCK-8法检测细胞存活率 将对数生长期的IEC-6细胞接种于96孔板中，5×103个/孔。每孔加入100 μL含不同浓度（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 μmol/L）CeT的培养基，另设置加入无药物培养基的对照组，每组设置5个复孔，培养箱中培养24、48 h。每孔加入10 μL CCK-8试剂，于培养箱中孵育1～2 h后，采用酶标仪在450 nm处检测吸光度（A）值，计算细胞存活率。 细胞存活率＝A给药/A对照 2.2.3 油红O染色评估CeT对肠上皮细胞胆固醇的影响 设置对照组、模型组和CeT（0.05、0.10、0.20 μmol/L）组，除对照组外，其余各组加入DMEM基本培养基配制的胆固醇胶束（cholesterol micelles, C-M，10 mmol/L）构建肠上皮细胞高胆固醇模型[11]，给药组加入不同浓度的CeT溶液，对照组加入不含药物的培养基。干预24 h后，加入ORO Fixative固定液固定细胞；加入1 mL 60%异丙醇浸洗；加入油红O染液（ORO Stain A∶ORO Stain B＝3∶2），洗涤至孔内无红色剩余；加入Mayer苏木素染色液，洗涤；加入油红O染液缓冲液；加入蒸馏水覆盖细胞并拍照，使用Image-Pro Plus软件以脂滴与整个图像的面积比进行定量。 2.2.4 Bodipy荧光标记法 按“2.2.3”项下方法进行分组和给药，干预24 h后，PBS洗涤，室温下多聚甲醛固定30 min；每孔加入2 μmol/L Bodipy染色液，于37 ℃细胞培养箱中孵育15 min；弃去染色液，PBS洗涤；DAPI复染核5 min，PBS洗涤；观察并拍照。使用Image-Pro Plus软件以荧光强度进行统计。 2.2.5 Western blotting检测TICE相关蛋白表达 按“2.2.3”项下方法进行分组和给药，干预24 h后，收集细胞；PBS洗涤后使用蛋白裂解液提取总蛋白质，BCA定量法测定蛋白质浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶封闭3 h，用TBST洗涤后加入一抗，4 ℃孵育过夜；洗涤后加入二抗，室温孵育2 h；洗涤后进行显影，使用Image-Pro Plus软件分析条带灰度值。 2.2.6 免疫荧光检测LXRα/ABCG8和LXRα/ NPC1L1通路相关蛋白的影响 设置对照组、模型组、CeT（0.1 μmol/L）组、GSK2033（10 μmol/L）组和CeT＋GSK2033组，除对照组外，其余各组加入DMEM基本培养基配制的胆固醇胶束（10 mmol/L）构建肠上皮细胞高胆固醇模型，各给药组加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基。干预24 h后，PBS洗涤3次；4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次后加入Trition X-100，室温下通透10 min；PBS洗涤3次后，加入免疫染色封闭液封闭60 min，吸去多余的牛血清白蛋白；分别滴加100 μL LXRα（1∶200）、ABCG8（1∶200）、NPC1L1（1∶200）一抗，4 ℃孵育过夜；回收一抗，PBS浸洗3次，滴加100 μL二抗（1∶300），室温避光孵育60 min；PBS洗涤3次，滴加DAPI复染核15 min，PBS洗涤3次；滴加抗淬灭剂10 μL，扣片，正面朝下盖在载玻片上，荧光显微镜下观察并拍照。使用Image-Pro Plus软件分析荧光强度。 2.2.7 统计学分析 采用GraphPad Prism 9.0和SPSS 26.0软件进行统计分析，数据以表示。两组间数据分布的正态性和方差齐性分别以Kolmogo? rov-Smirnov和Levene检验确定。组间均数比较采用t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，组间有差异进一步采用SNK-q检验进行两两比较。 3 结果 3.1 网络药理学研究 3.1.1 CeT-肠道胆固醇代谢靶点 通过TCMSP等数据库得到94个CeT相关靶点。通过NCBI Gene等数据库得到15 415个肠道相关靶点、14 177个胆固醇代谢相关靶点。并构建韦恩图预测CeT-肠道胆固醇代谢共有靶点，见图1。 图片 3.1.2 CeT-靶点-肠道胆固醇代谢网络构建 将PPI导入Cytoscape 3.8.1软件进行可视化，发现1个关键的子网络，见图2。 图片 3.1.3 CeT-肠道胆固醇代谢的GO功能富集分析 对CeT调控肠道胆固醇代谢的作用及机制进行GO富集分析，分别得到855个生物进程、17个细胞组成、53个分子功能，根据P＜0.05，选出排名前10的条目，见图3。 图片 3.1.4 CeT-肠道胆固醇代谢的KEGG通路富集分析 CeT调控肠道胆固醇代谢的通路涉及34条，根据P＜0.05，选出排名前10的通路，见图4。其中，主要涉及脂肪的消化和吸收、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）等信号通路。其中，肠道脂质代谢的关键通路（fat digestion and absorption）的靶点（ABCG5、ABCG8、NPC1L1）主要涉及CeT-靶点-肠道胆固醇代谢网络的关键网络之一（图5）。并且该网络主要涉及胆固醇排泄的关键途径——TICE途径。 图片 图片 3.2 分子对接分析 CeT与NR1H3（LXRα）结合能为?28.131 4 kJ/mol，可视化显示，匹配度良好，化合物与靶点结合的最优构象以氢键的方式呈现，结合活性良好，见图6。 图片 3.3 体外实验研究 3.3.1 CeT浓度筛选 不同浓度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L）的CeT分别干预IEC-6细胞24、48 h后，如图7所示，干预24 h时随着CeT浓度的增加细胞存活率降低，CeT的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）为0.2 μmol/L。本研究在探索CeT安全浓度调控IEC-6细胞胆固醇代谢活性的同时，为了更进一步研究CeT在IC50时是否较安全浓度的效果更好，因此，选择0.05、0.10、0.20 μmol/L的CeT处理细胞24 h进行后续研究。 图片 3.3.2 CeT对IEC-6细胞内脂质的影响 如图8所示，油红O染色与Bodipy荧光标记结果均显示，与对照组比较，胆固醇胶束干预显著增加脂滴染色和荧光强度（P＜0.001），表明造模成功；与模型组比较，各剂量CeT均显著抑制IEC-6细胞中脂质积累（P＜0.05、0.01、0.001）。 图片 3.3.3 CeT对TICE途径关键蛋白的影响 NPC1L1是胆固醇吸收的重要蛋白，ABCG5/G8与胆固醇流出密切相关。如图9所示，与对照组比较，模型组NPC1L1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），ABCG5和ABCG8蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，CeT（0.2 μmol/L）组NPC1L1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），CeT（0.1、0.2 μmol/L）组ABCG5和ABCG8蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。因此，CeT可能通过抑制NPC1L1，促进ABCG5、ABCG8的表达，调控TICE途径介导的胆固醇摄取和流出。 图片 3.3.4 LXRα是CeT调控TICE途径的关键蛋白 如图10所示，与对照组比较，模型组LXRα、ABCG8表达显著降低（P＜0.01），NPC1L1表达显著增加（P＜0.001）；与模型组比较，CeT组LXRα、ABCG8表达显著增加（P＜0.001），NPC1L1表达显著降低（P＜0.01），LXRα抑制剂GSK2033组ABCG8表达显著降低（P＜0.01），NPC1L1表达显著增加（P＜0.05）；与CeT组比较，CeT＋GSK2033组LXRα、ABCG8表达显著降低（P＜0.01），NPC1L1表达显著增加（P＜0.01）。因此，CeT可能通过促进LXRα的表达，调控TICE途径中的关键蛋白NPC1L1、ABCG8介导的胆固醇摄取和流出。 图片 4 讨论 胆固醇广泛存在于机体中，具有广泛的生理作用，是组织细胞中不可缺少的重要物质，它不仅参与细胞膜的形成，也是合成胆汁酸、维生素D及甾体激素的重要原料，但当其过量时便会导致高胆固醇血症，研究表明，心血管疾病、胆石症和肿瘤与高胆固醇血症密切相关[12-13]。胆固醇在体内不能被降解，机体有效排泄胆固醇是维持胆固醇稳态的重要环节[2]。因此，促进体内胆固醇排泄以维持体内胆固醇的动态平衡可能是治疗胆固醇失衡相关疾病的新策略。 基于此，本研究通过网络药理学方法，探讨CeT通过调控肠上皮细胞胆固醇代谢的潜在靶点及相关机制。PPI网络发现，CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢涉及1个核心子网络。其中，ABCG5/8与NPC1L1为胆固醇摄取与流出相关的核心靶点。本研究通过体外构建和模拟肠上皮细胞高胆固醇环境，探索CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢的机制，油红O和Bodipy结果均显示，CeT能够呈浓度相关性地降低胆固醇胶束干预的肠上皮细胞内的脂质积蓄。进一步通过结合KEGG通路分析发现，该子网络中的核心靶点与肠道脂质代谢的关键通路（fat digestion and absorption）相匹配，通过深度分析该通路发现，其主要涉及肠上皮细胞摄取与流出胆固醇中的TICE途径。已有研究表明，胆固醇从体内排出的唯一途径是通过粪便直接排出或转化为胆汁酸后排出，粪便排泄可通过2种独立途径进行，第1种途径是胆汁分泌，该途径已被广泛描述和研究。第2种途径是通过TICE途径[14]。在2009年Van团队初步研究估计，TICE对野生型小鼠体内排出的粪便中性固醇总量的贡献约为30%[15]。接下来，该团队在2010年通过实验得出在小鼠中TICE途径占粪便中性甾醇排泄的70%[16]。在人体生理情况下，TICE途径排泄的胆固醇占粪便胆固醇排泄总量的35%[2,17]。TICE指由血直接经肠道分泌和排出血浆脂蛋白来源的胆固醇。包括肝源性含载脂蛋白B的脂蛋白被基底膜侧低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）和其他可能受体吸收、内化，最终通过ABCG5/G8以及其他可能的转运体从顶端膜流出排泄到肠腔[18]。另有研究发现，利用Ezetimibe抑制NPC1L1介导的胆固醇摄取可显著增强TICE途径[2]。而本研究表明，CeT干预处于高胆固醇环境中的肠上皮细胞后，NPC1L1被抑制，而ABCG5、ABCG8被激活。提示，CeT主要通过抑制NPC1L1减少肠上皮细胞胆固醇摄取和促进ABCG5、ABCG8增加胆固醇流出。 LXRα由于其抗动脉粥样硬化、去除胆固醇和抗炎活性，在胆固醇稳态的转录调控中发挥极其关键作用[19]。研究发现，LXRα可调控NPC1L1在肠上皮细胞中的表达，降低肠道胆固醇的吸收[20]。此外，ABCG5和ABCG8是LXRα的直接靶基因，常形成异二聚体ABCG5/G8发挥作用，负责将细胞内胆固醇泵入肠腔并最终通过粪便排出体外[21]。PPI子网络表明，NPC1L1、ABCG5以及ABCG8主要由LXRα交联。因此，在上述研究的基础上，通过分子对接模拟了CeT与LXRα的对接模式，结合活性良好。采用LXRα抑制剂GSK2033处理，结果显示，NPC1L1和ABCG5/G8主要受LXRα调控。提示，CeT可能通过LXRα/ABCG5/ABCG8和LXRα/ NPC1L1途径分别介导IEC-6细胞胆固醇摄取和流出，进而促进TICE途径介导的胆固醇排泄。 本研究通过网络药理学和相关实验发现，CeT可能通过抑制肠上皮细胞胆固醇摄取和促进胆固醇流出维持机体胆固醇稳态，这一效应与核心靶点LXRα密切相关，本研究拓展了CeT调控体内胆固醇代谢的机制，为维持体内胆固醇稳态和胆固醇失衡相关疾病的新药研发提供了新思路。

[align=center][b][color=#33383D]奶牛疾病之泌尿系统检查——尿液检查[/color][/b][/align][align=center]作者：宋娜娜[/align][color=#33383D]正常奶牛的尿液性质较为稳定，病牛尿液的性质往往发生一定变化。检查尿液的物理性状（尿量、颜色、透明度、粘稠度、气味、比重等），化学性质（酸碱性质、蛋白质、蛋白胨，葡萄糖、血液及血红蛋白、胆色素、尿兰母）及尿沉渣（红细胞、白纲胞、脓细胞、上皮细胞、管型及无机物等），对诊断肾脏疾病具有十分重要意义。[/color][color=#33383D]1[/color][color=#33383D]尿液的采集法[/color][color=#33383D]检查前采尿，最好用导尿法导尿，或趁奶牛排尿时直接接取，或将手伸入直肠内按压膀胱促其排尿。导尿时，奶牛须站立保定，用2％来苏儿洗净外阴部，将消毒过的右手伸入阴道，用中指挑起尿道外口。左手持消毒过的导尿背沿手指下插入尿道。如插入尿道忙囊时，要抽出导尿管重新插入，严禁粗暴，防止尿道损伤。[/color][color=#33383D]尿中蛋白质检查正常尿液含极微量蛋白质，用一般方法不能检出，如在尿中检出蛋白质称为蛋白尿，见于肾炎，膀胱炎和尿道炎等。检查方法常用的有以下两种。[/color][color=#33383D]血尿是指尿液中含有红细胞。奶牛排尿过程中，常用三杯法判定血尿来源。尿初有血，而后无血，表示尿道出血，尿初无血，仅最后排出血尿，表示膀胱出血，排尿自始至终都含有血液。表示肾脏出血。血尿常见于肾盂肾炎、膀胱炎、尿道炎、尿结石、某些传染病（如钩端螺旋体病、炭疽等）、中毒病及肾、膀胱、尿道损伤。[/color][color=#33383D]血红蛋白尿及肌红蛋白尿尿液呈淡红色、红色、深红色乃至黑红色，无红细胞，尿中含有血红蛋白，称血红蛋白尿，见于产后血红蛋白尿病、牛焦虫病等。尿中含有肌红蛋白，称肌红蛋白尿，多见于犊牛自肌病等。[/color][b][color=#33383D] [/color][color=#33383D]三、尿中酮体的检查可用改良骆氏法[/color][/b][color=#33383D] 1[/color][color=#33383D]、骆氏试剂[/color][color=#33383D]硫酸铵100克，无水碳酸钠50克，亚硝基铁氰化钠8克，共研成粉末储于褐色瓶内备用。[/color][color=#33383D] 2[/color][color=#33383D]、检查方法[/color][color=#33383D]在一干燥小试管内加入骆氏试剂l～2厘米高。然后小心地将被检尿重积于试剂之上，放置数分钟后，如有酮体存在。则呈现红色，如酮体量多，呈现紫色。多应用于牛醋酮血病的检查。[/color][color=#33383D]3[/color][color=#33383D]、检查尿沉渣种类[/color][color=#33383D]尿沉渣显微镜检查尿沉渣可分为两类，一类为无机沉渣，包括各种无机盐类的结晶，另一类为有饥沉渣，包括红细胞、白细胞、上皮细胞、管型和微生物等。有机沉渣的检查，对诊断肾脏和尿道疾病有重要意义。[/color][color=#33383D] [/color][color=#33383D]制作尿沉渣标本前，要采取新鲜尿液5～10毫升，用离心机按每分钟l000～1500转，离心5～10分钟，倾去上清液。播匀沉淀物，用吸管吸取一滴置载玻片上，加上盖玻片，即可镜检。如无离心机，可将尿液静置2～8小时，使之自然沉淀。[/color][b][color=#33383D]四、镜检时[/color][/b][color=#33383D]镜检时，应缩小光圈，在较暗的视野先用低倍接物镜全而观察标本，找出需要检查的区域后，再换高倍接物镜，仔细辨认细胞成分和管型等。检查结果，对细胞成分可按每个高倍视野内最低至最高数值报告，对管型和无机盐类，按偶见、少量或多量等记载。[/color][b][color=#33383D]五、红细胞[/color][/b][color=#33383D]红细胞，健康奶牛尿中无红细胞。如上面说到，尿中出现多量红细胞时，则表示肾脏、输尿管、膀胱或尿道有出血[/color][color=#33383D]奶牛排尿时直接接取，或将手伸入直肠内按压膀胱促其排尿。导尿时，奶牛须站立保定，用2％来苏儿洗净外阴部，将消毒过的右手伸入阴道，用中指挑起尿道外口。左手持消毒过的导尿背沿手指下插入尿道。如插入尿道忙囊时，要抽出导尿管重新插入，严禁粗暴，防止尿道损伤。[/color][b][color=#33383D]六、脓细胞[/color][/b][color=#33383D]在肾脏和尿道有炎症时，白细胞积聚成堆，其结构模糊，在细胞中有残存颗粒，即称为脓细胞，但应与自细胞区别。[/color][b][color=#33383D]七、上皮细胞[/color][/b][color=#33383D]是泌尿系统发生病变时脱落下来的上皮组织。当肾脏病变时，特别是肾小管病变时，可见到肾上皮细胞，比白细胞约大1／3，多呈多角形、圆形、椭圆形或圆锥形。肾盂、输尿管发生疾患时，可见到肾盂上皮细胞，其形状呈梭形或犁形，有较大的核，比脓细胞大2～4倍。膀胱炎时，可见到膀胱上皮细胞，细胞大而扁平，核小而圆，有时呈长尾状。[/color][b][color=#33383D]八、管型[/color][/b][color=#33383D]也称尿圆柱。正常尿液中没有管型，肾脏发生病变时，肾小球滤出的蛋白质在肾小管中变性凝固，形成透明管状物，故称管型。管型是直的或稍弯曲的圆柱状物，两端多钝圆，或呈折断样。长短和宽窄很不一致。根据管型的来源及构造不同，可分下列几种。[/color][b][color=#33383D]九、上皮细胞管型[/color][/b][color=#33383D]是细尿管中脱落的上皮细胞与蚤自质粘集而成，见于急性肾炎。[/color][b][color=#33383D]10[/color][color=#33383D]、玻璃样管型（即透明管型）[/color][/b][color=#33383D]玻璃样管型（即透明管型）是肾小管中蛋白质凝固而成。结构均匀，无色半透明，多见于慢性肾病。 [/color][b][color=#33383D]十、血细胞性管型[/color][/b][color=#33383D]肾小管中的血细胞互相粘集而成。红细跑管型是在透明或颗粒管型内含有多量红细胞，见于肾脏出血性炎症。白细胞或脓细胞管型为白细胞或脓细胞所构成，地予化脓性肾炎、肾盂肾炎、急性肾炎。[/color][b][color=#33383D]十一、颗粒性管型[/color][/b][color=#33383D]是由肾上皮细胞的分解产物互相粘集而形成，较粗短，内含有颗粒，见于慢性肾炎或肾脏变性。[/color][b][color=#33383D]十二、蜡样管型[/color][/b][color=#33383D]一般较粗，有蜡样光泽，末端往往折断呈正方形。边缘常有缺口，近似玻璃样管型，但色较灰暗。尿中出现蜡样管型，表明肾小管有严重变性和坏死，表示预后不良，见于重症慢性肾炎。[/color][color=#33383D] [/color][color=#33383D]尿中无机沉渣检查在尿沉渣中有很多无机盐类结晶和非结品形物，各种结晶有其特有形状，但在奶牛疾病诊断上意义不大。[/color]

我们体内所有的正常细胞都配备一种自动的自我摧毁机制：在经过大约60次分裂之后，它们都死亡。这种内在时钟引起癌症研究人员的极大兴趣，这是因为大多数类型的癌症在这种天生的定时机制上存在缺陷。癌细胞的分裂发生差错而不受控制，因而它们能够继续无限分裂下去而导致肿瘤快速生长。在一项新研究中，瑞士研究人员发现一种蛋白复合物参与这种不受控制的过程。2012年7月4日，相关研究成果发表在《自然》杂志上。http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/201207/2012070615373433.jpg

研究人员报告说，以能检测到皮肤中的外来入侵物而最为出名的一组免疫细胞也能通过代谢环境中的化学物质而促进肿瘤的生长。包括皮肤及那些覆盖许多身体表面的上皮组织形成了一种抵御微生物及可以引起癌症的化学毒素的关键性的屏障。（在人类中，90%的癌症起源于上皮组织。）这些组织常常充满了树突状细胞，其中包括一个叫做朗格汉斯细胞的亚组细胞，这些细胞可识别抗原并将它们“穿戴”在其表面以警示T细胞进行防御反应。这些抗原可以是微生物，或它们也可来自肿瘤。然而，令人感到惊讶的是，缺乏朗格汉斯细胞的小鼠则可不受化学性致癌作用的侵害，而Badri Modi及其同事希望能找出其原因。他们如今用一种鳞状细胞癌的小鼠模型揭示了朗格汉斯细胞可驱使健康的皮肤细胞转变成为癌性细胞。朗格汉斯细胞在对致癌物7,12二甲基苯丙蒽（DMBA）进行回应时会增加其对某种叫做CYP1B1酶的表达，这种酶会将DMBA代谢成为一种可诱导细胞内突变的化合物。文章的作者指出，DMBA是一种聚芳烃，或PAH，而这些烃类化合物一般在工业污染中非常普遍。他们说，含有PAH的颗粒物质可能是人类皮肤癌中的一种未得到正确评价的环境因素。 —————————————————————————————————————————— 令人震惊的比例（人类90%），不过PAHs尤其是苯并芘（BAP）是强致癌物倒是听说过！

标题：聚酰胺-胺对永生化的人角膜上皮细胞的毒性作者：曲涛 梁娜 周绣棣 慕宏杰 魏俊花 孙考祥杂志： 眼科新进展日期卷号：2011,31（11）：1001~1003

国际学术期刊Cell Research于4月24日在线发表了中科院上海生命科学研究院生化与细胞所刘默芳组关于Onconase抑制恶性间皮瘤细胞microRNA（miRNA）表达的最新研究成果。该工作与上海南方模式生物研究中心王庆诚教授合作完成。 Onconase是从北方豹蛙卵或胚胎中提取的一种核糖核酸酶，是RNase A超家族中最小的成员，目前已被欧盟、澳大利亚和美国FDA批准作为罕见病药物（Orphan drug）用于恶性间皮瘤临床治疗使用。因接触石棉是其主要诱因，恶性间皮瘤也俗称为石棉癌，该恶性肿瘤预后极差，至今尚无有效的治疗措施。Onconase特异性地诱导癌细胞凋亡，而对正常细胞的毒性较低，对非小细胞肺癌、乳腺癌等的临床试验目前也正在进行中。然而，作为一种很有前景的抗肿瘤药物，Onconase的细胞毒性机理尚不完全清楚。 miRNA在肿瘤发生发展中有重要作用。刘默芳研究组研究生乔萌和祖立东等发现，Onconase对恶性间皮瘤细胞的miRNA表达具有普遍下调作用，而对细胞中一些oncomiR（如miR-155和miR-21）的下游靶基因，如socs1、pten、pdcd4等肿瘤抑制基因有明显上调作用。有趣的是，该工作发现Onconase降解miRNA前体，而对miRNA成熟链无明显作用；与之一致的是，Onconase抑制Dicer对miRNA前体的加工、降低Dicer生产成熟miRNA。进一步的研究发现，Onconase对miRNA前体的切割位点偏好于U-G和U-U。 该工作揭示了Onconase抗癌活性的一种新机制，完善了Onconase的抗癌作用机理，为与Onconase有关的更加合理、有效、安全的用药提供了科学依据。 该项研究工作得到了科技部、国家自然科学基金委、中国科学院及上海市科委的资助。

组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。　　　　实体组织材料的细胞分离方法　　　　对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。　　　　(一)机械分散法　　　　所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的实验室试剂软组织。　　　　(二)消化分离法　　　　组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。　　　　1、酶消化分离法　　　　酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：　　　　(1)胰蛋白酶分散技术　　　　胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用人血清 AB的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。　　　　①细胞类型胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效，但若与胶原酶合用,就能增加其对组织的分离作用。　　　　②酶的活力市售的胰蛋白酶,其活力都经过测定而有效，但配制时必须新鲜，需保存在低温冰箱中，消化时的pH和温度都要适宜，否则会影响活力，细胞的分散直接与酶的活力有关，最终使用活力为1:200或1:250，56℃pH8.0时活力最强。　　　　该酶为粉剂，保藏时要防潮，室内温度不宜过高，保存时间不能太长，若粉剂结团块,说明该部分受潮或失效。　　　　③酶的浓度胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。　　　　④温度一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为37℃，通常在37℃进行消化比室温作用快。　　　　⑤pHpH8~pH9是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时PH只能选用7.6～8.0之间，否则对细胞有损伤。　　　　⑥无机盐离子若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。　　　　⑦消化时间如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为20分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于4℃过夜也可。　　　　分离方法如下：　　　　①过夜冷消化将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。　　　　②多次提取消化法多次提取消化法有以下三种：　　　　热消化多次提取将剪碎的细胞块加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。　　　　冷消化多次提取方法同上，只是消化温度为4℃。　　　　先热消化后冷消化将组织块先用胰蛋白酶于37℃下消化20分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。　　　　(2)胶原酶(Collagenase)消化法　　　　胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。细胞培养此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。　　　　经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。　　　　鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间(小时)有差异，以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶(对细胞表面糖基有作用)，采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。　　　　除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年来，还有一种从灰霉菌中提取的Pronase新酶分散细胞更佳。　　　　2、非酶消化法(EDTA消化法)　　　　EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用(1:1或2:1)，不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。　　　　消化分离法的操作步骤：　　　　(1)剪切把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。　　　　(2)加液漂洗将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2-3次(采用倾斜，自然沉降法)。　　　　(3)消化加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次)，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。　　　　(4)弃去消化液采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。　　　　(5)漂洗将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。　　　　(6)机械分散采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。

胎盘亚全能干细胞定义： 　　亚全能干细胞自胚胎形成的第5到7天开始出现，能分化形成200 多种人体组织器官细胞，但不能形成一个完整的人体。胎盘亚全能干细胞是来源于新生儿胎盘组织的一族亚全能干细胞，其在发育阶段与胚胎干细胞接近，具备分化形成三个胚层的组织细胞的能力，但不会形成畸胎瘤。 　　胎盘亚全能干细胞的主要特性与功能： 　　胎盘亚全能干细胞是取自胎盘组织的一类亚全能干细胞，胎盘亚全能干细胞具有以下特性： 　　1. 具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为间充质干细胞，上皮干细胞、神经干细胞、肝干细胞，肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。可以用来修复受损或病变的组织器官，治疗心、脑血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病、骨组织病、角膜损伤、烧伤烫伤、肌病等多种疾病。 　　2.具有免疫调节作用，通过负性免疫调节功能，抑制机体亢进的免疫反应，使机体免疫功能恢复平衡，从而可以用来治疗造血干细胞移植之后的免疫排斥反应以及克隆氏病、红斑狼疮，硬皮病等自身免疫系统疾病。 　　3.胎盘亚全能干细胞定向培养的间充质干细胞是人体微环境的重要组成部分，移植间充质干细胞可以改变造血微环境，重建免疫系统，促进造血功能恢复，与造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等的治疗效果。 　　4.具有来源方便，细胞数量充足，易于分离、培养、扩增和纯化，传代扩增30多代后仍具有干细胞特性。 　　胎盘亚全能干细胞的用途： 　　胎盘作为理想的亚全能干细胞来源，在抗衰老及疾病治疗领域显示了其独特的功能，治疗疾病种类如下： 　　心脑血管系统疾病 　　糖尿病 　　肝肾损伤 　　脑及脊髓神经损伤 　　自身免疫性疾病 　　移植物抗宿主病 　　与造血干细胞共移植治疗血液病 　　缺血性血管病 　　肺及其它组织器官纤维化 　　抗衰老，恢复健康体态 　　胎盘亚全能干细胞的储存流程： 　　在新生儿娩出、胎盘剥离子宫排出后，由接生的医生尽快按照干细胞库胎盘标准采集规程进行胎盘的采集，然后放置在干细胞库特定的装置工具中，在限定时限内运送到干细胞库，由专业的技术人员进行亚全能干细胞的分离、提取、培养、检测等技术流程，直到根据最终检测结果来确认所获得的干细胞是否具有长期保存的价值。 　　保存和期限 　　目前国际上通用的干细胞保存技术是将获得的干细胞储存在-196℃深低温状态，医学研究与临床实践证明保存一百多年的细胞仍然具有活性。干细胞保存已有几十年的历史，胎盘干细胞库在与客户签订的合同期限内对干细胞库中所保管的胎盘亚全能干细胞活性负责。 　　安全性 　　胎盘的采集简便易行，不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。过去胎盘通常作为废物丢弃，而从胎盘中提取亚全能干细胞进行保存，是宝贵的生命资源再生。 　　而干细胞行业数据显示，胎盘亚全能干细胞基因稳定、不易突变，动物实验证明无致瘤性，使用安全可靠，对适应症范围疾病治疗效果好，优于传统医疗手段。 　　胎盘亚全能干细胞的优势 　　1.取材方便，原料来源充足，是生命资源的再生。 　　2.分化能力强可以定向诱导分化为间充质干细胞、血管干细胞、上皮干细胞、神经干细胞和肝干细胞等多种干细胞。 　　3.数量充足，使用方便，增殖能力强，培养后数目可达10亿，可以供多人多次使用。 　　4.在人群中使用不需要配型，不会产生免疫排斥反应，同时，血缘关系越亲近，生物利用度会越高，使用的效果越好。 　　5.治疗疾病范围广，抗衰老，恢复健康体态，心脑血管系统疾病，糖尿病，肝肾损伤，脑及脊髓神经损伤，自身免疫性疾病，移植物抗宿主病等多种疾病。

牛奶体细胞数的英文为somatic cell count,SCC。牛奶体细胞数是指每毫升牛奶中的细胞总数，多数是白细胞，通常由巨噬细胞、淋巴细胞、多形核嗜中性白细胞和少量乳腺组织上皮细胞等组成，约占牛体细胞数的95%，其余是乳腺组织死去脱落的上皮细胞。体细胞数反映了牛奶质量及奶牛的健康状况,在正常情况下,牛奶中体细胞数一般在20万～30万个/mL。

牛奶体细胞数的英文为somatic cell count,SCC。牛奶体细胞数是指每毫升牛奶中的细胞总数，多数是白细胞，通常由巨噬细胞、淋巴细胞、多形核嗜中性白细胞和少量乳腺组织上皮细胞等组成，约占牛体细胞数的95%，其余是乳腺组织死去脱落的上皮细胞。体细胞数反映了牛奶质量及奶牛的健康状况,在正常情况下,牛奶中体细胞数一般在20万～30万个/mL。

近日哈佛医学院和哈佛牙科学院的研究人员在培养皿中模拟一种罕见的遗传性疾病时，发现了一种新方法可以扭转成熟细胞的生物钟，使细胞返回成体干细胞状态。由此生成的新“干细胞“可在培养基及动物模型中分化为各种细胞类型。新发现发表在《自然-医学》（Nature Medicine）的网络版上。“新发现对于推动个体化用药尤其是组织工程学的发展具有重要的意义，”哈佛医学院细胞生物学系教授及哈佛牙科学院院长Bjorn Olsen说。进行性骨化性纤维发育不良（FOP）是一种罕见的遗传性疾病，目前全球的患者不到1000人。临床表现为急性炎症引起软组织转变为软骨和骨骼。在漫长的几十年病程中，患者身体的各个部分逐渐发生僵化，目前临床对此病征尚无有效的治疗策略。哈佛医学院及波士顿贝斯以色列女执事医疗中心的医学系讲师Damian Medici对来自这些患者的病变软骨细胞和骨细胞进行检测时，发现不同于正常的骨骼组织，病变细胞中包含有上皮细胞（一种排列在血管内壁的细胞）特异的生物标记物，这使得Damian Medici开始怀疑在FOP患者软组织中生成的软骨和骨是否有可能起源于内皮细胞。Medici和他的同事们将引起FOP的突变基因导入到正常上皮细胞中，意外地发现上皮细胞转化成了与间充质干细胞或成体干细胞非常相近的细胞类型，这些细胞可以分化为骨骼、软骨、肌肉、脂肪，甚至是神经细胞。研究人员在接下来的试验中证实当不使用突变基因时，用特异的蛋白TGF-β2或BMP4（功能与突变基因效应非常相似）孵育上皮细胞均可有效地诱导细胞重编程。进而Medici证实这些重编程细胞在培养皿和动物模型中均可诱导分化为一些相关的组织类型。“我们发现这些新细胞与骨髓间充质干细胞并不完全相同，两者之间存在一些非常重要的差异，”Medici说：“然而新细胞却拥有与骨髓间充质干细胞相同的潜能性和可塑性。”Olsen 说：“通过这个系统我们简单地重复和模拟了在自然界发生的过程。从这个意义上来说，它相比于当前其他的细胞重编程技术更少一些人为的影响。”“新发现必将推动组织工程学和个体化医疗领域的发展。可以想见或许在某天患者就可以通过获取自身的上皮细胞，将其培养为所需的组织类型进行移植，这样同时还避免了宿主免疫排斥等问题，”Medici和Olsen echo说。

重金属汞的危害■急性汞中毒●全身症状为头痛、头晕、乏力、低度发热，睡眠障碍，情绪激动，易兴奋等；●呼吸道症状表现为胸闷、胸痛、气促、剧烈咳嗽、咳痰、呼吸困难； 口●口腔炎可在早期出现，有流涎、口渴、齿龈红肿、疼痛，在齿●缘可见“汞线”，口腔黏膜肿胀、糜烂、溃疡，牙齿松动、脱落； 胃●胃肠道症状为恶心、呕吐、食欲不振、腹痛，有时出现腹泻，水 水样便或大便带血； ●汞对肾脏损伤，可造成肾小管上皮细胞坏死；出现浮肿、腰痛，尿少、甚至尿闭；尿蛋白阳性，尿中有红细胞、脱落上皮细胞等；尿汞明显增高。 ●少数病人可出现皮炎，如红色丘疹，水疱疹，重疹者形成脓疱或糜烂。

单核细胞增生李斯特菌的 生化血清型有哪些？

培养细胞的形态 根据形状和外观(即:形态)可将培养的细胞分为三大类。 成纤维细胞(或者成纤维细胞样细胞)为双极或多极细胞，呈细长形，贴附在基质上生长。 https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/10/202410092222481050_2727_6698225_3.jpg 上皮样细胞呈多角形，尺寸更为规则，贴附在基质上呈散在斑片状生长。 https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/10/202410092223137830_3164_6698225_3.jpg 淋巴母细胞样细胞呈球形，通常悬浮生长，不贴附在基质表面。 https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/10/202410092223436792_389_6698225_3.jpg 细胞培养的应用 细胞培养是细胞和分子生物学中最重要的一项技术，可为细胞正常生理和生化(例如:代谢研究、衰老研究)、药物和毒性化合物对细胞的作用以及致突变和致癌研究提供上佳的模型系统。细胞培养还可用于药物筛选和开发以及生物化合物(例如:疫苗、治疗性蛋白)的大规模生产。细胞培养在上述领域应用的主要优势在于，可以使用一批同源细胞获得稳定、可重复的结果。 基本设备 细胞培养通风橱(即:层流通风橱或生物安全柜)培养箱(推荐使用湿式二氧化碳培养箱) 水浴锅 离心机 冰箱和冰柜(-20°C) 细胞计数器(例如:Countess”自动细胞计数器或血球计数器 倒置显微镜 液氮(N,)冷冻柜或冻存容器 灭菌器(即:高压灭菌器) 扩增设备 抽吸泵(蠕动泵或真空泵) pH 计 共聚焦显微镜 流式细胞仪 其他用品 细胞培养容器(例如:培养瓶、培养皿、滚瓶、多孔板) 吸管和移液器 注射器和针头 废物容器 培养基、血清和试剂 细胞 无菌工作区域 细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养工作区域处于无菌状态。尽管最好设置独立的组织培养室，在较大的实验室内划出的细胞培养区域同样可用于无菌操作、孵育以及细胞培养物、试剂和培养基的储存。获得无菌条件的最为简单、经济的方式就是使用细胞培养通风橱(即:生物安全柜)。

http://www.biomart.cn//upload/userfiles/image/2012/02/1328771705.jpg英国剑桥大学科学家首次从人皮肤样品中构建出大脑皮层细胞(cerebral cortex cell)---这些细胞组成大脑灰质。2012年2月5日，这项研究结果在线发表在《自然-神经科学》期刊上。大脑皮层疾病包括从诸如癫痫和自闭症之类的发育疾病到诸如阿尔茨海默(Alzheimer)疾病之类的神经退化疾病。这些研究发现将使得科学家们能够研究人大脑皮层如何发育和它如何“连接接通”以及这种接通如何出错(一种导致学习障碍的常见原因)。它也将允许科学家在实验室中重建诸如阿尔茨海默疾病之类的大脑疾病。这将给予他们之前不可能获得的启示，允许它们实时观察疾病发展同时也可测试阻止疾病发展的新药物。剑桥大学生物化学部门Rick Livesey 博士是这篇研究论文的主要研究员。他说，“这种方法让我们有能力研究人大脑发育和疾病，而这在5年前是难以想象的。”对他们的研究而言，科学家从病人中获取皮肤活组织，然后将来自皮肤样品中的细胞重编程为干细胞。这些干细胞如同人胚胎干细胞一样就能够被用来产生大脑皮层细胞。Livesey博士补充道，“我们正使用这种体系来重建阿尔茨海默疾病。阿尔茨海默疾病是世界上一种最为常见形式的痴呆症。当前在英国痴呆症影响着800000个人。这种疾病主要影响一种神经细胞类型，而这种神经细胞我们已能够在实验室中制造出来，因此我们在实验室中有一种非常好的工具创建出该疾病的一种完整的人类模型。”英国阿尔茨海默疾病研究中心是英国一家主要的痴呆症研究慈善组织。该中心研究主任Simon Ridley说，“我们为资助了这项研究而感到非常高兴。这项研究向前迈出了积极性的一步。在实验室中将干细胞变成完全功能性的神经细胞网络很有希望能够解密诸如阿尔茨海默疾病之类的复杂大脑疾病。痴呆症是我们时代面临的最大医学挑战，我们迫切需要更多地了解和如何阻止该疾病。我们希望这些发现能有让我们更接近这种目标。”

如果要在液体环境下扫描细胞表面形貌，应该用哪种模式呢？对探针的参数又有哪些要求？我用的是NT-MDT的AFM和配套探针CSG10/NSG10，锥形针尖，刚度分别为0.2N/M和12N/M，细胞是贴壁的狗肾上皮细胞，但效果都不太好。接触模式下，探针把细胞推来推去，轻敲模式也差不多，感觉是不是探针没用对。如果给细胞加载的话，是不是球形探针比较好。

【序号】：6【作者】： 林凯桑1范丽君1王思妤【题名】：温敏水凝胶负载脂源性干细胞对糖尿病大鼠皮肤创面血管新生影响的观察【期刊】：中国糖尿病杂志. 【年、卷、期、起止页码】：2017,25(05)【全文链接】：[url]https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CJFD&dbname=CJFDLAST2017&filename=ZGTL201705016&uniplatform=NZKPT&v=EA0CPV8r76bbb--4Qj1qW8mJCho712c0S7Rn_S1GBICG9z5E1xkrKRZnX-sKhVIn[/url]

[size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]1、慢性肾脏病患者肾小管上皮细胞（TEC）中NEU1升高[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]作者首先通过分析肾脏转录组学数据库检测神经氨酸酶（NEU1-NEU4）的表达，发现肾活检组织中NEU1而非NEU2-NEU4的mRNA显著上调，NEU1在大多数类型的CKD（IgA、糖尿病肾病、狼疮性肾炎等）中升高。此外，作者纳入临床样本发现肾纤维化患者的NEU1蛋白水平显著高于无肾纤维化患者，NEU1含量的增加主要与肾损伤分子1（KIM1）共定位，NEU1表达与肾小球滤过率呈负相关。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]2、NEU1在小鼠纤维化肾脏中上调[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]接下来，作者测定了小鼠中NEU1的蛋白水平，通过单侧输尿管梗阻（UUO）或叶酸刺激建立肾纤维化模型，发现NEU1 mRNA和蛋白水平在纤维化小鼠的肾脏中显著增加，肾脏切片的染色显示NEU1在TEC中的定位增加。此外，NEU1的水平与纤维化指数呈正相关。进一步在TEC中敲低/过表达究NEU1来研究NEU1在TEC损伤中的作用，发现NEU1介导的TGFβ诱导的HK-2细胞上皮/间质标志物改变。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]3、TEC特异性NEU1缺失抑制小鼠肾纤维化[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]为了研究 NEU1 在肾纤维化中的作用，作者构建了TEC 特异性缺失Neu1的小鼠，通过单侧输尿管梗阻（UUO），发现NEU1敲除显著改善了形态，减少胶原沉积，抑制肾小管坏死和肾小管间质炎症，抑制巨噬细胞浸润和肾小管细胞中的pNF-κB，抑制UUO 诱导的KIM1 表达，抑制了EMT进展，抑制了UUO诱导的炎症细胞因子水平。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]在另一种由叶酸诱导的肾纤维化模型中，Neu1CKO小鼠的形态和肾重也明显改善，NEU1敲低显著改善肾功能相关肌酐和血尿素氮水平，抑制叶酸诱导的KIM1表达，减少肾小管损伤和间质纤维化。巨噬细胞浸润，EMT标记基因表达，促炎细胞因子，纤维化因子等均由于肾小管上皮细胞中NEU1缺乏而明显逆转。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]4、NEU1过表达增强UUO诱导的小鼠肾纤维化[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]除功能丧失外，作者还使用AAV9-NEU1将其注射到小鼠的肾皮层中进行NEU1过表达，免疫荧光结果显示AAV9-NEU1成功转导到TEC中。此外，NEU1过表达加剧了UUO诱导的肾脏萎缩，管状膨胀和胶原蛋白在肾脏皮质和髓质中的沉积，增强了UUO诱导的KIM1表达和肾脏中的EMT进展，增加了UUO刺激的巨噬细胞浸润，促炎细胞因子，纤维化因子的表达。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]5、NEU1与ALK5在160–200区域相互作用[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]为了深入研究NEU1促进肾纤维化的潜在机制，作者通过[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]芯片检测差异表达基因，前三位富集的KEGG通路包括TGF-β信号通路，由于TGFβ是驱动CKD中EMT和纤维化的主要致病因素，作者以TGF-β信号通路为中心。通过测试NEU1与TGF-β受体直接互作的可能性，Co-IP发现NEU1选择性地与ALK5结合，但不能与ALK2、ALK3等受体结合。Co-IP结合质谱法确认NEU1与ALK5的相互作用，免疫荧光显示NEU1与ALK5共定位于人纤维化肾脏。此外，双分子荧光互补（BiFC）以及原位邻位连接测定（PLA）均验证了NEU1和ALK5在患者纤维化肾中的直接相互作用。进一步SPR、PLA和Co-IP确定了ALK5的特异性结合域，证实NEU1与ALK5在160–200区域相互作用。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]6、NEU1与ALK5互作并稳定ALK5以增强 ALK5-SMAD2/3信号通路[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]为了研究NEU1-ALK5互作对ALK5的影响，作者测量了ALK5在存在或不存在NEU1的情况下的稳定性，发现NEU1敲低促进ALK5降解，而NEU1过表达抑制ALK5降解，表明NEU1与ALK5相互作用并稳定ALK5。ALK5 能够磷酸化其底物SMAD家族，作者发现NEU1沉默显著抑制TGFβ诱导的SMAD2/3激活，而NEU1过表达在TGFβ存在下维持SMAD2/3连续激活。此外，酶活性位点（mtNEU1：D103A、Y370A、E394A）的突变降低了NEU1过表达对TGFβ诱导的ALK5-SMAD2/3激活的影响，这些结果表明，NEU1与细胞质中ALK5的GS 结构域（氨基酸160-200）互作，然后增强ALK5-SMAD2/3信号通路，导致肾纤维化。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]7、丹酚酸B靶向 NEU1保护肾脏[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]为了鉴定靶向NEU1的候选化合物，作者采用SPR筛选了来自药用植物的74种天然产物与重组人NEU1蛋白的结合亲和力，发现NEU结合亲和力最强的前两种化合物是来自丹参的丹酚酸B和和迷迭香酸中的迷迭香酸。Co-IP和PLA实验表明丹酚酸B显著抑制NEU1与ALK5之间的相互作用，TGFβ诱导的ALK5-SMAD2/3信号通路激活也被丹酚酸B阻断。随后，作者在小鼠模型中研究了丹酚酸B对肾损伤的保护作用，证实丹酚酸B可显著减轻UUO诱导的肾损伤和肾纤维化，抑制Kim1、Snai1和Snai2表达，抑制促炎细胞因子的产生，抑制ALK5的磷酸化和SMAD2/3的下游磷酸化，在缺血/再灌注诱导的小鼠模型中复制了丹酚酸B对肾损伤的保护作用。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]为了测试NEU1是否介导丹酚酸B的保护作用，作者采用了Neu1 CKO小鼠模型，发现在Neu1 CKO小鼠中，丹酚酸B的治疗未能进一步减少UUO刺激下的肾损伤和肾纤维化，不能进一步抑制UUO诱导的Kim1表达。此外，在Neu1CKO小鼠中，丹酚酸B处理对ALK5磷酸化的抑制作用没有进一步增强。这些数据表明NEU1是保护肾脏的丹酚酸B所必需的。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]总结[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]研究揭示了NEU1在慢性肾病中的新功能、新机制、新药物。研究人员首先基于临床样本、多种肾纤维化动物、细胞模型，发现NEU1在肾纤维化中过度活化。应用免疫荧光技术检测，发现高表达的NEU1主要定位在肾小管上皮细胞中。进一步构建了肾小管上皮细胞特异性NEU1敲除和过表达小鼠，在单侧输尿管结扎（UUO）和叶酸（FA）刺激模型下，敲除NEU1抑制上皮-间质转化、炎细胞因子产生和胶原沉积，从而改善肾纤维化、对抗肾损伤；相反，过表达NEU1则加重UUO诱导的肾纤维化。采用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] array、Co-IP、BiFC、PLA等技术手段发现NEU1选择性结合TGFβ I型受体ALK5，截短质粒、SPR技术明确NEU1与ALK5的160-200氨基酸区域结合，从而稳定ALK5，促使ALK5-Smad2/3信号通路持续激活，诱发肾纤维化发生发展。研究人员进一步以人源NEU1为靶点，从中药中筛选具有肾脏保护作用的活性成分。从近百个中药单体化合物中发现中药丹参中的丹酚酸B与人源NEU1重组蛋白具有极强亲和力；通过动物水平研究，明确了丹酚酸B抑制NEU1、对抗ALK5-Smad2/3通路激活改善肾纤维化，利用NEU1敲除小鼠，证实丹酚酸B依赖于NEU1对抗肾损伤，为揭示丹参发挥肾保护作用的科学内涵提供直接靶点证据，也为靶向NEU1途径治疗慢性肾病的临床应用和药物研发开拓了新方向。[/size]

作为一只刚进实验室的菜鸟把自己遇到的东东总结一点发出来，抛砖引玉吧，为即将进实验室的朋友些资料，同时欢迎老鸟们指正。1、在实验室登记领试剂和药品pbs 1640 Gbico的FBS 台盼蓝 计数板 酒精灯 胶塞 封口胶 消毒的喷剂 记号笔 镊子 标签 饭盒 消毒时包饭盒的布 冻存管 冻存剂 离心管 培养瓶 6孔板 96空板 吸管 吸球。pbs 1640 Gbico的FBS 我都是买的现成的，就是那些实验室老师用原料配好了来卖的那种，我是害怕自己本来就是一个新手，为省那钱自己配，别污染了多的事情都来了，当然很多老鸟都自己配，别鄙视我哈。2、换液a 开瓶盖的时候，网上的视频里是用镊子开的，但是现在用的瓶塞多是新的，稍微一使劲，胶塞就会被扯破（我这周换了好多塞子了），扯破了的塞子把瓶子包不住，有污染的危险，特别是冰箱里试剂装得很拥挤的时候。方法：切忌男生像我一样用力过猛，如果实在要扯烂，干脆就用手去扯塞子，不过严格按照翻起塞子-烧-扯-再烧就是了，完全没有污染的顾虑b 加液体的时候很很容易就吸到赛棉花那一截去了（很多熟练的都不塞棉花了，他们力度控制得好，只要不吸过头，完全ok的），这时候，就不要再吝惜你的培养基了，全部甩到废液缸里去吧，毕竟吸球没有消毒（我们这里是这样的哈），浸湿过了棉花就可能沾到吸球。c 往培养瓶里加pbs、FBS等液体时候，手抖得厉害。不是滴在瓶口，瓶壁上，就是滴在超净台上。方法：滴在瓶口的一定要烧干，不然小心污染，瓶壁和台子上的可以用消毒后的干净纱布擦拭；另外就是自己找个空瓶子，自己练习加液体，熟能生巧。3、传代a 消化细胞的时间真的是不同细胞就不同，我的细胞是消化5分钟，还是在孵箱里放着的，拿出来以后还要又拍又晃的，朋友的一分钟就全飘起来了，如果你是第一次做，或者你们实验室没有做过这个细胞，您就最好一直在镜下看着细胞，摸一下时间（用表记录时间，不光是“摸”哈），消化过头的细胞，长得不好，如果你是外面买的细胞，就又可能浪费经费了。另外，认真分析了一下，我的癌细胞稍微比朋友的正常组织的细胞消化得慢，他的细胞长得慢，细胞少（毕竟正常细胞不能和癌细胞比），3天才传第一代，我的都2代的瓶子了都铺满60%，他的贴的也不怎么紧。b 离心离心的时候，因为忙着把刚终止了消化的细胞拿去离心，很容易忘记在您的离心管上标记，配平完了，机子都转到1000转了，才想起来，也没法子了。方法：实在是忘记了标记，用于配平的管子里的液体没有你刚做完消化的液体清亮，你反正选最清亮的那个就是了。c 分装的时候，我一传3，加上离心管的盖子，满桌子都是瓶盖，很容易搞错，尤其是在和别个拼台子做实验的时候，更是拥挤，千万要放好，不然空间一拥挤，你取东西的时候很容易从这些面朝上的盖子塞子上面经过，就有可能污染了，虽然盖盖子的时候还要过火烧，但是说实话，烧那几下，连手指都烧不烫，咱还是从不污染的角度做起吧。4、我犯其他的傻a 进细胞间去照台子（说实话，是去抢台子，别人要是紫外照起了，就只能等他们做完再照，就又要等半小时），结果口罩帽子都忘记了带，挨了顿批评。b 吸管在酒精灯上过火烧几次的时候，吸管尖碰在了灯芯旁的酒精瓶铜的那部分。c 倒老的培养液的时候才发觉，废液缸没拿进细胞间。跑出去再拿。记得重新消毒手，而且我离开台子的时候，很怕其他人经过污染我已经打开了的各个试剂的瓶子。不放心的只有盖好再走，再进来时再从头弄，浪费时间。5、其他要注意的问题a 我看见也是个新进实验室的女生，双手悬在空中费劲的塞胶塞（估计也是新胶塞，太紧了，塞不大进去），结果手一滑，整瓶胰酶倒在超净台上。（还好不是加GbicoFBS的1640，呵呵），倒了记得把台子擦干净，上次不知道是谁把什么有机溶剂都倒在台子上了，我一去，还沾手，郁闷，自己做好自己分内的，别让实验室里其他的人说你是个污染源或者细胞杀手。b 某天朋友准备换液，结果就把培养基pbs胰酶全都放在37摄氏度水浴里，结果后来有事走了，只把照台子时候放那的东西收拾了，5个小时后才突然想起，只好暂时不用那个培养基了，重新再用新的。养到后面细胞多了，不怕细胞死的时候，还是可以试验着用用那瓶培养基的。

利用活细胞成像工作站进行细胞和基因的功能研究，是生物医学研究的最新趋势。固定细胞观察仅能提供固定瞬间细胞的静态信息，无法反映细胞在正常生理生化条件下的状态活细胞观察，对处于正常生理状况下的细胞进行全程扫描和记录，获得其连续、全面、动态过程。由于其显示的正常细胞动态的活动过程，很容易发现和确定细胞间相互作用和信号传导的过程，以及在活细胞水平上的生物分子间的相互作用，不仅可以解决长期以来悬而未解的问题，更为未来的研究提出新的问题，指出新的方向。

尿干化学法分析仪和传统显微镜镜检是基于两种不同原理的检验手段，因此检测结果可能存在一定程度的差异。临床中两种诊断血尿方法常配合使用以达到检测效率与质量的统一，总结起来，对检测结果的影响因素主要有以下几方面。　　3．1 假阳性 即尿干化学分析仪潜血实验呈阳性，但镜检却呈阴性 。其原因包括：(1)尿液分析仪潜血实验可与完整红细胞阳性反应，也能够与血红细胞释放的血红蛋白(hemoglobin，Hb)进行反应，这与显微镜只能够观察到完整的红细胞存在差异。健康人群尿Hb水平极低，定为阴性；(2)肌红蛋白(myoglobin，Mb)分子中包含Hb基团，当骨骼肌、心肌严重受损，血MB浓度升高，经肾排泄，导致尿液MB水平升高，潜血反应因此呈阳性，而显微镜检查却呈阴性；(3)部分患者尿中存在对热不稳定的酶，也可导致试剂块发生颜色变化，发生潜血反应；氧化性物质的污染也是造成潜血反应假阳性因素；高温或标本存放时间过长导致潜血反应阳性率增高 ；(4)尿试纸条超过保质期，或没有妥善保存、操作不当、仪器故障等均可能造成假阳性。　　3．2 假阴性 即尿干化学分析仪潜血实验呈阴性，但镜检却呈阳性。其原因包括：(I)食物、药物影响：某些饮食、药物可引起尿液成份的改变如当尿液中存在大量的维生素时，维生素具有的强还原性使其竞争性结合反应产生的氧，导致尿试纸条无法出现潜血反应即出现假阴性反应；(2)高蛋白、高比重尿样削弱了试剂块潜血反应的敏感度，使能够发生反应的成分被包裹，反应试剂无法接触到，从而出现假阴性结果。　　3．3 离心对检测结果的影响 离心中若速度过快，致使有形成分遭到破坏；但过慢时，沉渣中可能无法找到，以至于漏掉。因此对检验结果出现怀疑时，可实验潜血证实进行验证。总之，随着尿干化学分析仪普及，工作效率得到了极大提升，也使检测红细胞敏感度提高，但显微镜镜检也是无法替代的。对于疑似阳性反应的病例，应采用尿沉渣镜检进行复测，以求结论准确，提高检测可靠性。

幹細胞可以說是人體的主要細胞，可以在所有組織中存在。這些細胞十分罕有，它們主要是每天取替已死或將死的細胞組織，這是正常細胞自我更新及在病後和受破壞後組織修復的重要環節。幹細胞的特點除了可以自己進行複製外，更可以轉化成不同的細胞種類（多向細胞）。研究中採用的多功能幹細胞包括誘導多功能幹細胞。在特定生長環境及外在因素下，這種細胞可以轉化成身體任何種類的細胞。雖然這些細胞用途可能很令人興奮，但是現在利用幹細胞治療仍然很少，主要是因為有演變成腫瘤的風險。另一方面，胎盤中的新生幹細胞是現成的幹細胞，而且是多效性及多功能的，但卻不會產生畸胎瘤。 http://www.prostemcell.com/zh/images/stemcell_whatarestemcell_11.jpg http://www.prostemcell.com/zh/images/stemcell_whatarestemcell_14.jpg嬰兒出生時的胎盤組織是新生幹細胞的豐富來源。當中包括用以修復血液及免疫系統的臍帶血造血幹細胞，以及用作修復骨骼、肌肉、軟骨及其潛在治療免疫抑制特性的臍帶間葉幹細胞。至於胎盤羊膜幹細胞，其潛能可用於修復一系列上皮和非上皮組織，包括皮膚（傷口）、呼吸系統及免疫系統。因此，新生幹細胞整體可以代表人體修復工具，它不單有潛力可以治療一系列的疾病外，還可治療神經系統、呼吸系統、心血管、胃腸道及泌尿生殖系統等疾病。此外，新生幹細胞在治療炎症、敏感、哮喘、風濕、燒傷、物理創傷、運動損傷及老化所帶來的磨損亦具潛效。新生幹細胞是人生最健康的幹細胞，因為它們從未經歷過疾病、環境或基因等因素侵入，所以能保存細胞最年輕時的形態http://www.prostemcell.com/zh/images/stemcell_whatarestemcell_17.jpg有關幹細胞研究的正不斷益增長。直至目前已有超過170,000篇關於幹細胞研究的刊物已載錄於PubMed1 ，這是美國國立醫學圖書館提供的搜尋引擎。PubMed有超過二千萬篇有關生物醫學方面的引文。不少國際醫學權威協會均建議在於嬰兒出生後即時從臍帶血中提取幹細胞是最好的。這些協會包括美國血液和骨髓移植協會、美國婦產科學院、美國醫學協會、美國兒科學會2、皇家婦產科學院3、新英格蘭醫學雜誌4，以及歐洲倫理學集團5等。 1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2 Nietfeld et al. 20083 RCOG Scientific Advisory Committee Opinion Paper 24 Perspective Steinbrook, R. NEJM 2004; 351(22):2255"The Cord-Blood-Bank Controversies"5 Opinion no.19 of the European Group on Ethics (EGE), released 16 March 2004

鸡蛋，在如今的社会里，更多时候是作为一种营养丰富的食品出现在我们的餐桌上。现代化大型养殖场如生产产品般输出鸡蛋的方式颠覆了人们对鸡蛋的认识，或许已经很少有人能够联想到从蛋黄蛋白到一个小生命的奇迹升华。但在人类漫长的历史中，农业是文明的核心。就在不太遥远的过去，大多数人还可以在家中目睹鸡生蛋、蛋生鸡的奇迹。这种神秘的现象让古时的人们感到好奇、困惑，甚至产生莫名的崇拜。我们华夏文明由雏鸡的诞生联想到世界的起源，“天地混沌如鸡子，盘古生其中”，看来在我们祖先的眼中，鸡蛋的孵化犹如天地诞生般神秘。这种“卵生崇拜”在史籍中屡见不鲜，如《史记·殷本纪》记述商朝人先祖契的来历时提到有娀氏的女儿简狄“见玄鸟坠其卵，简狄取吞之，因孕生契”，同样，在《史记·秦本纪》中，文章伊始就记载了颛顼的孙女女修织布时“玄鸟陨卵，女修吞之，生子大业”，而这位大业就是秦人的先祖。不得不佩服古人的想象，这玄鸟蛋孵化出了两个重要朝代。在漫长的历史中，这种对蛋朦胧而浪漫的崇拜逐渐融入了我们的文化中，直到如今，染红壳的鸡蛋依旧是新婚、生子、满月时，人们表达祝福的重要载体。随着科技的进步，人们对蛋的理解逐渐清晰，现在很多人都知道蛋和卵细胞有千丝万缕的关系。可是鸡蛋到底是否就是一个细胞？答案可谓五花八门，有人说整个鸡蛋就是一个放大的卵细胞，蛋壳内的那层膜是细胞膜，蛋清是细胞质，蛋黄是细胞核；也有人说蛋黄是卵细胞，卵黄膜就是细胞膜，蛋黄就是细胞质，而蛋黄上面的小白点是细胞核；还有人认为鸡蛋本就是由很多细胞构成的。

各国争相发展的重点项目　　iPS技术，即诱导性多能干细胞技术，是一种将成体成熟、分化的体细胞重编程获得类似胚胎干细胞的新兴技术。2007年11月美国和日本科学家分别独立宣布可将人类皮肤细胞转化为iPS细胞。这一发现被《自然》和《科学》杂志分别评为2007年第一和第二大科学进展。之后，iPS细胞研究迅猛发展，不同的国家和实验室纷纷报道了多种方法建立的iPS细胞系。就连世界第一只体细胞克隆动物多利羊的培育者伊恩·威尔莫特也宣布放弃人类胚胎干细胞克隆研究，转而进行 iPS 细胞研究，因为他认为这种细胞比胚胎干细胞更具潜在优势。　　我国连续多年将干细胞研究列入“863”、“973”、国家自然基金重点项目。国务院2006年发布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年）》中，干细胞作为五项生物技术之一成为未来15年我国前沿技术的重点研究领域。　　致瘤风险浮出水面　　Yamanaka研究组在《自然·生物技术》上发表的文章显示，用iPS细胞诱导的神经干细胞，即使不含c-Myc（曾被认为是导致肿瘤的主要原因），在植入NOD/SCID免疫缺陷小鼠后仍有很强的致瘤性，甚至高于胚胎干细胞。　　　他们共研究了36个iPS细胞克隆，在诱导方式上，有些诱导剂配方中含有c-Myc基因，有些没有，因此具有较好的代表性。同时他们选择了3株胚胎干细胞作为对照。在45周的观察中，移植胚胎干细胞来源神经干细胞的34只小鼠有4只长出肿瘤。在100只移植胚胎成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中34只发现肿瘤，概率和胚胎干细胞相当。在55只移植成人成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中46只发现肿瘤，概率远高于胚胎干细胞。在36只移植肝细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中10只发现肿瘤，概率高于胚胎干细胞。8只移植胃上皮细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中未发现肿瘤。病理学检查证实肿瘤均为畸胎瘤，部分为恶性畸胎瘤。　　研究还发现，以前认为致瘤性很强的c-Myc在去掉后并没有减少iPS神经干细胞的致瘤性，相反以前认为没有致瘤性的Nanog基因却可以明显增强iPS神经干细胞的致瘤性。　　这次试验的另一个意外结果是并未发现在生成的肿瘤细胞中有c-Myc或其他基因的激活。以前的观点认为，转入的癌基因是iPS致瘤性的基础，只要在iPS细胞诱导成功后通过各种方法去除已完成使命的癌基因即可使iPS细胞免于致瘤性。这次试验的结果无疑给这些想法留下了阴影，而且使iPS致瘤的机制更加扑朔迷离。