甲醇中克伦特罗溶液标准物

[align=center]固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗残留量及条件优化[/align][align=left]1、前言 克伦特罗（Clenbuterol）既不是兽药，也不属于添加剂，而是一种激素类物质，俗称“瘦肉精”，该物质能促进动物体内脂肪分解代谢，增加蛋白质合成，提高瘦肉率，然而人体食用高残留量的内脏组织或者累计摄入量超过一定值时便可能引发食物中毒事件。1997 年我国明令禁止在畜牧行业生产、销售和使用克伦特罗，但是非法使用克伦特罗的事件仍时有发生。 目前，现行有效的标准中测定克伦特罗的方法有酶联免疫法、胶体金免疫层析法、液相色谱法和质谱法，针对不同的样品基质和实验室条件可以选择合适的测定方法。国家标准GB/T 22944-2008中采用液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中克伦特罗的残留量，但是实验室没有[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质[/color][/url]，关于高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗的文献也不多，于是尝试建立固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗的方法并对测试条件进行优化。2、实验方法2.1 仪器和试剂 Waters e2695液相色谱仪（主要包括2998光电二极管矩阵检测器，柱温箱，自动进样器，自动脱气四元梯度泵等）；微型漩涡混合仪；12位固相萃取真空装置；12位干浴氮吹仪； Millpore超纯水系统。 甲醇中盐酸克伦特罗标准溶液（250μg/mL，坛墨质检）；甲醇、乙酸乙酯和乙酸为色谱纯；乙酸钠、乙酸铵、磷酸二氢钠、氨水和磷酸为分析纯；实验用水为Millpore超纯水系统制得，18MΩ• cm，25 ℃。2.2色谱条件 色谱柱：CNW Athena C18-WP(250mm×4.6mm ,5μm) 流动相：甲醇：磷酸二氢钠（0.02mol/L）=40：60 流速：1.0mL/min 进样体积：20μL 柱温：30℃ 检测波长：210nm3 结果与讨论3.1 检测波长的确定 采用Waters 2998二级管阵列检测器的3D扫描功能，在波长190~400nm范围内对高浓度的克伦特罗标准工作溶液进行测定，并在克伦特罗出峰位置提取光谱图，见下图，从图中可以看出，克伦特罗的最大吸收波长在210nm附近，因此选择210nm作为检测波长，此时克伦特罗的响应值最大。[/align][align=center][img=,690,345]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301354_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.2 流动相的选择3.2.1甲醇-水为流动相3.2.1.1 流动相pH值对测定结果的影响 首先参考GB/T 5009.192-2003第二法中的色谱条件，以甲醇-水为流动相进行测试，然而结果并不理想，克伦特罗标准溶液在此流动相下并未出峰，几番尝试后决定更换流动相。看到几个采用质谱测定的标准方法均在流动相中加入了酸，于是仍然以甲醇-水为流动相，往水中加入不同体积的磷酸溶液，考察pH值对克伦特罗测定结果的影响（甲醇：水=30:70），测定结果见下图。[/align][align=center][img=,583,845]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301356_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left] 从上述测定结果中可以发现，未调pH时色谱图中并没有明显的色谱峰，流动相中加入磷酸后克伦特罗在8min左右出峰；随着磷酸加入量的增加，其出峰时间提前并且峰高与峰面积也随着增加；当进一步提高流动相中磷酸含量时，克伦特罗的出峰时间逐渐延长，但是峰面积保持不变。这可能是由于克伦特罗呈弱酸性，在水溶液中以离子形态存在，降低了在C18色谱柱上的保留行为，而磷酸的加入能够抑制克伦特罗的电离，使其以分子的形态存在，增加克伦特罗在C18色谱柱上的保留，并改善峰形。当pH=3.5时，克伦特罗呈部分解离的状态，因此虽然能够出峰，但是峰面积偏小，而当pH=3.0时，克伦特罗则全部以分子形态存在，峰面积保持不变。随着磷酸加入量的增加，克伦特罗的出峰时间延长，峰展宽变大，峰高变小，方法的灵敏度也随着降低。3.2.1.2 流动相比例对测定结果的影响 流动相中有机相比例对高效液相色谱的分离行为有很大影响，调节流动相比例可以改善待测组分的峰形、出峰时间以及与杂质组分的分离度，因此实验中考察了有机相比例对克伦特罗测定结果的影响（pH=2.8），测定结果见下图。从图中可以看出，提高流动相中甲醇含量对克伦特罗的出峰时间有很大的影响，当流动相中甲醇含量为20%时，克伦特罗的出峰时间为17min左右，而当流动相中甲醇含量为45%时，克伦特罗的出峰时间提前到3min左右，而且与溶剂峰重叠，不利于定性和定量分析。[/align][align=center][img=,578,826]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301359_02_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.2.1.3 方法重复性测试 根据上述测试结果，初步决定采用甲醇：水（pH=2.8）=30:70的流动相条件进行测试，然而在测试过程中发现，此流动相条件下克伦特罗的保留时间不稳定，随着进样次数的增加，保留时间不断前移，6针进样后克伦特罗保留时间的相对标准偏差（RSD）值为1.3%。产生保留时间漂移的原因可能有两种（1）色谱柱的性能下降，流动相中加了磷酸，色谱柱平衡所需的时间比较长（这是一根服役了很久的色谱柱）；（2）此流动相条件的缓冲能力弱，在线混合以及样品的加入导致流动相的pH值发生变化，从而保留时间不稳定。于是修改流动相条件，pH值保持不变，将流动相中甲醇的比例由30%提高至40%，重新考察方法的重复性，实验结果见下图。实验表明，甲醇：水（pH=2.8）=40:60时方法具有较好的重复性，连续6针进样，克伦特罗保留时间的RSD值为0.1%。[/align][align=center][img=,589,419]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301401_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.2.2甲醇-磷酸盐为流动相 通过上述实验，初步确立了以甲醇-水为流动相测定克伦特罗的高效液相色谱条件，并对部分实验参数进行了优化，然而上述实验结果均是针对克伦特罗标准工作溶液进行的测定，样品成分单一，没有杂质干扰，因此不用考虑杂质与克伦特罗之间的分离度。色谱条件为甲醇：水（pH=2.8）=40:60时虽然解决了方法重复性的问题，但是从色谱图中可以看到，此时克伦特罗的出峰时间较早，仅需3.5min左右就能出峰，而且出峰时间早于溶剂峰，在实际样品分析中很容易受到杂质峰的影响，此方法是否适合测定蜂蜜中的克伦特罗残留量还需进一步验证。 在对蜂蜜样品测定验证之前，先尝试寻找是否有更合适的流动相。以甲醇-水为流动相进行测试时，磷酸的加入对克伦特罗的出峰影响较大，于是尝试改用甲醇-磷酸盐为流动相进行下一步测试。从流动相pH值、流动相比例和方法重复性3个方面对方法进行考察，磷酸盐选用0.02mol/L的磷酸二氢钠，通过磷酸调节流动相的pH值，实验结果见下图。实验表明，以甲醇-磷酸二氢钠（0.02mol/L）为流动相时，有机相比例对克伦特罗出峰时间也有很大的影响，pH值的影响较小，因此后续的实验中直接采用甲醇-磷酸二氢钠（0.02mol/L）为流动相，未对流动相的pH值进行调节。当甲醇：磷酸二氢钠（0.02mol/L）=40:60时，连续6针进样，克伦特罗保留时间的RSD值为0.1%，测试方法具有较好的重复性，同时，克伦特罗的出峰时间远离溶剂峰，可以减小样品中杂质组分对待测物质测定的干扰。[/align][align=center][img=,597,550]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301403_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.2.3甲醇-乙酸盐为流动相 在查阅文献的过程中发现，也有老师采用乙酸盐缓冲溶液对克伦特罗进行测定，于是决定试一下效果。同样，从流动相pH值、流动相比例和方法重复性3个方面对方法进行考察，乙酸盐选用0.02mol/L的乙酸铵，通过乙酸调节流动相的pH值，实验结果见下图。实验表明，采用甲醇-乙酸铵（0.02mol/L）为流动相时，有机相比例对克伦特罗出峰时间有很大的影响，pH值的影响较小，方法的重复性较好，但是此时基线噪音较大，峰高变小，影响方法的检出限。[/align][align=center][img=,581,588]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301405_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left] 通过上述实验，分别以甲醇-水、甲醇-磷酸盐和甲醇-乙酸盐为流动相，建立了高效液相色谱法测定克伦特罗的方法，并对部分实验条件进行了优化，在实验中发现了各自方法的优缺点，哪种方法更适合蜂蜜中克伦特罗的测定，还需用蜂蜜样品进行验证。3.3 样品前处理 蜂蜜中通常不含有克伦特罗，即使有，其残留值也很小，而且蜂蜜为半固态粘稠样品，无法直接进样测定，因此需要对蜂蜜样品进行前处理。前处理过程主要包含提取、富集、净化和浓缩4个步骤，此次实验蜂蜜中克伦特罗的提取方法参考GB/T 22944-2008：称取约2g蜂蜜样品于50mL离心管中，加入20mL乙酸钠缓冲溶液（0.2mol/L，pH=5.0），漩涡混匀，蜂蜜完全溶解后备用。 样品中克伦特罗残留量富集、净化的方法有很多种，本次实验分别参照标准GB/T5009.192-2003、SN/T1924-2007、SN/T1924-2011以及GB/T22944-2008，采用CNWBONDWCX(500mg，6mL)、CNWBOND SCX(500mg，6mL)、CNW Poly-Sery MCX(60mg，3mL)和CNW Poly-SeryHLB(500mg，6mL)固相萃取柱对蜂蜜中的克伦特罗残留量进行富集、净化，其中SN/T1924-2007标准已作废，但是标准中所涉及的富集净化方法也曾出现在上海安谱实验科技股份有限公司(以下简称上海安谱）的技术应用文章中，因此对此方法也做了尝试。同时，采用Oasis MCX(60mg，3mL)和OasisHLB(200mg，6mL)固相萃取柱对蜂蜜中的克伦特罗残留量进行富集、净化，简单比较了不同品牌固相萃取柱在净化效果、回收率等性能方面的差异。[/align][align=center][img=,578,358]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301407_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left] 固相萃取柱所用的填料不同，活化和净化方法也有所区别，具体实验方法如下： （1）WCX固相萃取柱 依次用5mL乙醇和5mL水活化固相萃取柱，将上述蜂蜜提取液全部转移至活化后的固相萃取柱中，分别用5mL水和5mL 乙醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽干2min，最后用10mL氨水-乙醇溶液（体积比2：98）进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入1mL水溶解残渣，过0.22μm滤膜后，进样测定。 （2）SCX固相萃取柱 依次用5mL甲醇、5mL水和5mL0.03mol/L盐酸溶液活化固相萃取柱，将上述蜂蜜提取液全部转移至活化后的固相萃取柱中，分别用5mL水和5mL甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽干2min，最后用10mL氨水-甲醇溶液（体积比5：95）进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入1mL水溶解残渣，过0.22μm滤膜后，进样测定。 （3）MCX固相萃取柱 依次用3mL甲醇、3mL水和3mL 0.1mol/L盐酸溶液活化固相萃取柱，将上述蜂蜜提取液全部转移至活化后的固相萃取柱中，分别用3mL 0.1mol/L盐酸溶液、3mL水和3mL50%甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽干2min，最后用5mL氨水-甲醇-乙酸乙酯溶液（体积比5：45：50）进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入1mL水溶解残渣，过0.22μm滤膜后，进样测定。 （4）HLB固相萃取柱 依次用5mL甲醇和5mL水活化固相萃取柱，将上述蜂蜜提取液全部转移至活化后的固相萃取柱中，分别用5mL水和5mL甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽干2min，最后用10mL氨水-甲醇溶液（体积比5：95）进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入1mL流动相溶解残渣，过0.22μm滤膜后，进样测定。[/align][align=center][img=,578,190]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301408_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.4 蜂蜜样品的测定3.4.1甲醇-水为流动相 以甲醇-水（pH=2.8）为流动相，测定固相萃取柱净化后的蜂蜜及蜂蜜加标样品，考察该色谱条件对蜂蜜中克伦特罗残留量测定的影响。 当甲醇：水（pH=2.8）=40：60时，测定结果见下图。从图中可以看出，蜂蜜样品提取后直接进样测定色谱图中，在克伦特罗保留时间处有一个很大的杂质峰，虽然该杂质峰经HLB固相萃取柱净化后消失，但是实际检测时该杂质峰对克伦特罗仍然存在隐患，如果净化不干净，就可能出现假阳性的结果，同时，在该流动相条件下，样品在2~6min内有许多杂质峰，影响克伦特罗与杂质组分之间的分离度。对比HLB与MCX固相萃取柱净化后测定的色谱图，在此色谱条件下，HLB的净化效果要优于MCX固相萃取柱，蜂蜜样品经HLB固相萃取柱净化后杂质峰明显减少，MCX固相萃取柱净化后仍有杂质组分会对克伦特罗的测定产生干扰。[/align][align=center][img=,581,863]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301411_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left] 改变流动相比例，测定蜂蜜加标样品经MCX固相萃取柱净化后的样品，改善克伦特罗与杂质间的分离度，实验结果见下图。从图中可以看出，当甲醇：水（pH2.8）=30：70时克伦特罗与杂质组分的分离度较差，不能实现基线分离；当甲醇：水（pH2.8）=20：80时，克伦特罗与杂质组分虽然能实现基线分离，而且附近没有杂峰干扰，但是此时克伦特罗的峰高变小，灵敏度变低，不利于低浓度克伦特罗残留量的检查。[/align][align=center][img=,584,295]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301413_02_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.4.2甲醇-乙酸铵为流动相 以甲醇-乙酸铵（0.02mol/L）为流动相，测定MCX固相萃取柱净化后的蜂蜜加标样品，考察该色谱条件对蜂蜜中克伦特罗残留量测定的影响，实验结果见下图。从图中可以看出，当流动相为甲醇：乙酸铵（0.02mol/L）=60：40时，克伦特罗的测定受到杂质组分的影响很大，克伦特罗出峰时基线较高，而且与杂质组分不能基线分离；当流动相为甲醇：乙酸铵（0.02mol/L）=40：60时，样品中克伦特罗的灵敏度明显降低。[/align][align=center][img=,586,354]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301414_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.4.3甲醇-磷酸二氢钠为流动相 以甲醇-磷酸二氢钠（0.02mol/L）为流动相，当甲醇：磷酸二氢钠（0.02mol/L）=40：60时，测定固相萃取柱净化后的蜂蜜及蜂蜜加标样品，考察该色谱条件对蜂蜜中克伦特罗残留量测定的影响，实验结果见下图。从图中可以看出，当甲醇：磷酸二氢钠（0.02mol/L）=40：60时，克伦特罗与样品中的杂质实现基线分离，其保留时间附近的干扰组分较少，灵敏度能够满足残留量检测的要求。同时，在此色谱条件下，蜂蜜加标样品只需经过简单的提取便能直接测定，给高残留值蜂蜜样品的测定提供了便捷的方法(直接提取进样时的加标量远高于采用固相萃取柱净化时的加标量)。结合上述实验，最终本实验选择采用甲醇-磷酸二氢钠（0.02mol/L）为流动相对蜂蜜中克伦特罗残留量进行测定。[/align][align=center][img=,578,594]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301416_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=center][img=,580,634]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301417_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left] 找到合适的流动相后，在该色谱条件下对固相萃取柱的净化效果进行考察。从上图可以看出，乙酸钠缓冲溶液提取后直接进样的色谱图中虽然也能检出克伦特罗，但是其加标量较大（约为固相萃取柱方法的20倍，该实验主要是为了考察杂质对待测物质的干扰），实际样品中克伦特罗的残留值远小于此次的加标量，因此实际样品测定时需要采用固相萃取柱对克伦特罗残留量进行富集、净化和浓缩。对比不同填料固相萃取柱对蜂蜜加标样品净化后测定的色谱图可以发现，以甲醇-磷酸二氢钠（0.02mol/L）为流动相时，CNWBOND SCX固相萃取柱净化后杂质组分的响应值依然很大，SN/T 1924-2007中采用了C18和SCX固相萃取柱串联的方法进行净化，而本实验仅采用了SCX固相萃取柱进行净化，这可能是导致杂质去除不完全的原因之一；采用其他几种固相萃取柱净化后，色谱图中杂质峰的响应值明显降低，其中采用WCX固相萃取柱净化后的色谱图中杂质少，基线比较平整。对比相同填料不同品牌固相萃取柱净化后的色谱图可以发现，两种品牌的固相萃取柱对杂质去除能力难分伯仲。3.5 标准曲线的绘制 准确吸取1.0mL盐酸克伦特罗标准溶液于25mL容量瓶中，用水稀释成浓度为10.0μg/mL的标准储备溶液。吸取适量体积克伦特罗标准储备溶液，用水稀释配成相应浓度的标准工作溶液，并按上述选定的色谱条件进行测定。以样品峰面积Y(mV)对质量浓度X（μg/mL）作图，得到线性回归方程Y=146893X+311，相关系数R2=0.9991，结果表明：克伦特罗含量在0.10~1.00μg/mL之间时，该方法呈现良好的线性关系。标准曲线见下图。[/align][align=center][img=,581,408]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301418_01_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]3.6 回收率的测定 称取约2g蜂蜜样品，共12份，往每份样品中加入0.50mL浓度为1.0μg/mL的克伦特罗标准工作溶液，样品经乙酸钠缓冲溶液提取后，分别采用上述6种固相萃取柱对样品进行净化，每种固相萃取柱做2平行，并以甲醇-磷酸二氢钠（0.02mol/L）为流动相进行测定，考察固相萃取柱的回收率，实验结果见下表。测定结果表明，6种固相萃取柱均具有较好的回收率，回收率大于85%，其中MCX和HLB固相萃取柱的回收率明显高于其他两种填料的固相萃取柱；实验中所使用的相同填料不同品牌的固相萃取柱回收率结果相近。[/align][align=center][img=,690,126]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709301420_02_1669358_3.jpg[/img][/align][align=left]4、小结 （1）本实验建立了固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗的方法，分别以甲醇-水、甲醇-乙酸盐和甲醇-磷酸盐为流动相，考察了流动相对测定结果的影响。实验结果表明，以甲醇-水为流动相时，流动相对pH值的缓冲能力较弱，克伦特罗的保留时间发生漂移；以甲醇-乙酸盐为流动相时，基线噪音较大，方法灵敏度低；以甲醇-磷酸盐为流动相，方法重复性好，灵敏度较高。 （2）实验中参考不同的标准方法对蜂蜜样品进行前处理，考察了前处理方法对样品净化和回收率影响，同时比较了固相萃取柱性能和品牌对蜂蜜中克伦特罗残留量测定的影响。实验结果表明，固相萃取柱性能对蜂蜜中克伦特罗残留量的测定结果有很大的影响，4种不同填料的固相萃取柱中，MCX和HLB固相萃取柱的回收率较高，WCX和SCX固相萃取柱的回收率略低。 （3）实验中考察了WCX和SCX固相萃取柱的回收率较低的原因：WCX固相萃取柱在乙醇淋洗的过程中会有部分克伦特罗被淋洗下来，从而回收率降低；采用SCX固相萃取柱净化时，洗脱液的碱性需要足够强，否则洗脱不完全，但是提高洗脱液的碱性后，杂质也会一同被洗脱下来。 （4）通过此次实验可以发现，流动相条件和固相萃取柱的选择对样品测定具有很大的影响，不同的流动相其洗脱能力不一样，截止波长也会有差别，实验中以甲醇-乙酸铵为流动相时基线噪音明显大于其中两种流动相；同样是MCX净化后的样品，以甲醇-磷酸盐为流动相时测定得到的样品色谱图中杂质要少于其他两种流动相。 （5）液相色谱虽然对克伦特罗具有较高的响应，但是与质谱相比，质谱具有更高的响应，因此对于残留量很低的样品，还是需要用质谱进行验证，液相方法可以作为前期的筛查手段，[/align]

瘦肉精莱克多巴、盐酸克伦特罗检测瘦肉精莱克多巴、盐酸克伦特罗检测仪器高效液相色谱仪，紫外检测器超声波振动器溶剂过滤器离心机分析天平恒温摇床固相萃取装置，带萃取小柱匀浆机氮吹仪试剂乙腈：色谱纯磷酸二氢钾：分析纯磷酸甲醇：色谱纯乙醚；分析纯正己烷：分析纯盐酸溶液乙酸缓冲液NaOH溶液超纯水标准品：莱克多巴、盐酸克伦特罗样品制备 看到上面的仪器和试剂，大家可能也会看出前处理的方法了。不管的饲料还是肉制品样品的制备，过程一般都是称取，粉碎（匀浆），溶解，超声提取，离心提取，过滤，固相萃取，吹干，过滤等。只是在提取时样品完全提取可能比较困难，提取条件一定得控制好，比如温度、振动、时间（如果其它前处理设备性能不够理想的话，处理时间尽量长一点）、提取试剂等因数的控制和把握。色谱条件色谱柱：Venusil CN ，4.6mm×250mm，5µm流动相：乙腈：0.01mol/L磷酸二氢钾（用磷酸调节pH值至3.0）=30:70（V:V）检测波长：215nm流速：1.0mL/min柱温：室温进样量：20ul标准品色谱图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/12/201312281531_485166_2369266_3.png 分析实验讲的就是准确、可靠，准确可靠的方法就是好方法。实验过程中我们一般没必要把实验做的最好，但我们可以通过优化色谱条件把实验尽量最好。

[font='Times New Roman'] [font=宋体]各位前辈，[/font] [font=宋体]萌新求助。[/font] [/font][font='Times New Roman'][font=宋体]萌新做了盐酸克伦特罗测定，[/font] [font=宋体]在跑测试样的时候，[/font] [font=宋体]得到了如下图谱[/font][/font][font=宋体][font=宋体]。流动相是甲酸酸化过的水和乙腈。[/font] [font=宋体]仪器是[/font][font=Times New Roman]AB[/font][font=宋体]的[/font][font=Times New Roman]api4000[/font][font=宋体]。测试样是[/font][font=Times New Roman]240ppb[/font][font=宋体]的甲醇溶解的克伦特罗标准品和克伦特罗[/font][font=Times New Roman]D9[/font][font=宋体]内标物。 进样量[/font][font=Times New Roman]10[/font][font=宋体]微升， 流动相流速[/font][font=Times New Roman]0.4[/font][font=宋体]毫升每分钟。色谱柱是岛津的[/font][font=Times New Roman]2.0mm X 50mm 1.6[/font][font=宋体]微米。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]质谱图里有四个峰，[/font] [font=宋体]萌新判断第一个是克伦特罗盐酸盐，[/font] [font=宋体]第二个是克伦特罗，[/font] [font=宋体]第三个和第四个是克伦特罗残留。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]请问如何优化条件，[/font] [font=宋体]解决双峰和残留问题呢[/font][font=Times New Roman]? 拜谢 [img=Clenbuterol 240ppb testrun,690,380]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/05/202205201243121935_6191_5492007_3.jpg!w690x380.jpg[/img][img=Clenbuterol 240ppb testrun 01,690,377]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/05/202205201245484139_446_5492007_3.jpg!w690x377.jpg[/img][img=Clenbuterol 240ppb testrun parametre,690,223]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/05/202205201251327903_4534_5492007_3.jpg!w690x223.jpg[/img][img=Clenbuterol 240ppb Gradient Curve,534,187]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/05/202205201254059976_4411_5492007_3.jpg!w534x187.jpg[/img][/font][/font]

动物源性食品中盐酸克仑特罗检测的固相萃取方法（Silibase™ C8/SCX）一、实验目的本研究利用固相萃取法作为猪肉样品的前处理方法，GC-MS法作为检测手段。该方法可简化猪肉样品的前处理过程，节省有机溶剂的使用，操作简便。 二、实验目标物盐酸克仑特罗(CAS;21898-19-1)三、应用范围本方法适用于动物源性食品中盐酸克仑特罗的GC-MS检测及确证。 四、参考标准农业部推行标准《NY/T 468-2006 动物组织中盐酸克伦特罗的测定气相色谱-质谱法》五、实验材料 C8/SCX固相萃取柱6mL/500mg。六、实验方法1、样品提取 称取均质试样5.0ｇ试样（精确至0.01ｇ）于50mL离心管中，加入15mL乙酸乙酯，再加入3mL10.0%碳酸钠溶液，然后以10000r/min以上的速度均质60s。盖上盖子以5000r/min的速度离心2min，吸取上层有机试剂于离心管中，在残渣中再加入10mL乙酸乙酯在旋涡混合器上混合1min，离心后吸取有机溶剂并合并提取液。在收集的有机试剂中加入5mL 0.1mol/L的盐酸溶液，涡旋混合30s。以5000r/min的速度离心2min，吸取下层溶液，同样步骤重复萃取一次，合并两次萃取液，用2.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至5.2。 2、SPE柱净化(1)活化：向C8/MCX复合柱小柱中依次加入5mL甲醇、水5mL和5mL 30mmol/L盐酸润洗固相萃取小柱。(2)上样和洗脱：将上述备用液过柱，依次用5mL水、5mL甲醇淋洗，真空抽干，用4%氨化甲醇5mL洗脱小柱，收集洗脱液。(3)衍生化及检测：0℃缓慢氮气流条件下吹至近干，加入甲苯100μL和双三甲基硅基三氟乙酰胺100μL，涡旋震荡20s，密封玻璃塞，置于80℃恒温烘箱中加热1h，冷却后加300μL甲苯，作为试样溶液，供气相色谱-质谱分析，上气相色谱-质谱仪测定。3、GC-MS条件气相色谱-质谱仪；色谱柱：HP-5MS进样口：220℃柱温：70℃（保持0.6min），以25℃/min升温至200℃（保持6min），以25℃/min升温至280℃（保持5min）载气：高纯He，流速：0.9mL/min进样体积:1μlGC/MS传输线温度:280℃溶剂延迟：8min分析器温度：230℃四级杆温度:150℃ 七、实验结果1、添加回收结果实验结果表明，C8/SCX复合固相萃取柱适用于动物组织中盐酸克伦特罗的预处理，能净化动物组织样品，实验加标回收率及RSD能满足定量实验的要求。表1动物源性食品中盐酸克伦特罗的添加回收结果 1 2 3 4 5 平均回收率（%） RSD(%) n=5 回收率（%） 85.6 92.4 94.1 95.7 87.6 90.8 4.23 2、标准溶液色谱图在GC-MS操作条件下，得到标准溶液色谱图如图1和图2http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508141658_560811_3310_3.jpg

[align=center][size=21px]生猪肉中瘦肉精[/size][size=21px]克伦特罗[/size][size=21px]提取方法研究[/size][/align][size=16px] 沙丁醇胺、莱克多巴胺、克伦特罗等同属瘦肉精，国家[/size][size=16px]禁止在饲料和动物饮用水中使用[/size][size=16px]的药物，在动物生肉和肉制品中禁止检出。[/size][size=16px] 目前各实验室检测方法和手段都比较多，该药物检测不[/size][size=16px]成[/size][size=16px]问题[/size][size=16px]。[/size][size=16px]因为样品差异，有的提取方法不一定适用所有[/size][size=16px]类型[/size][size=16px]样品，药物提取倒存在一定麻烦。比如我们前几年做的一个项目，生猪肉（瘦肉）中克伦特罗检测，参照标准[/size][size=16px]GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定[/size][size=16px]中高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法。[/size][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/10/202210061911126886_1469_2369266_3.png[/img][size=16px] 这个实验要做加标回收率验证，要求8[/size][size=16px]5%-110%[/size][size=16px]。加标[/size][size=16px]样品[/size][size=16px]要求将[/size][size=16px]20g[/size][size=16px]生猪肉充分粉碎，[/size][size=16px]加入0[/size][size=16px].[/size][size=16px]1毫升[/size][size=16px]1[/size][size=16px]0[/size][size=16px]μg[/size][size=16px]/ml[/size][size=16px]克伦特罗标准品溶液震荡仪震荡至少1[/size][size=16px]0[/size][size=16px]min，后超声波超声至少2[/size][size=16px]0[/size][size=16px]min，后4[/size][size=16px]0[/size][size=16px]℃温度下静止至少2[/size][size=16px]4[/size][size=16px]小时。[/size][size=16px] 按国标[/size][size=16px]GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定[/size][size=16px]方法提取。[/size][img=,690,481]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/10/202210061923370244_1980_2369266_3.jpg!w690x481.jpg[/img][size=16px]色谱条件[/size][size=16px]色谱柱：C18色谱柱，2[/size][size=16px]50[/size][size=16px]mm[/size][size=16px] x 4.6mm[/size][size=16px]，5μ[/size][size=16px]m[/size][size=16px]流动相：甲醇：水=[/size][size=16px]45%[/size][size=16px]：[/size][size=16px]55%[/size][size=16px]流速：1ml/min[/size][size=16px]检测波长：2[/size][size=16px]44[/size][size=16px]nm[/size][size=16px]柱温箱：3[/size][size=16px]0[/size][size=16px]℃[/size][size=16px]进样量：2[/size][size=16px]0[/size][size=16px]μl[/size][size=16px] 按该方法我们前处理完成后就检测，[/size][size=16px]检测未加标的样品，结果克伦特罗零含量，未检出。加标样[/size][size=16px]品[/size][size=16px]含量[/size][size=16px]0.[/size][size=16px]1[/size][size=16px]765[/size][size=16px]μ[/size][size=16px]g[/size][size=16px]/ml[/size][size=16px]，约[/size][size=16px]8.825μ[/size][size=16px]g[/size][size=16px]/kg[/size][size=16px]，加标回收率为1[/size][size=16px]7.65%[/size][size=16px]。多次检测，结果基本都这样[/size][size=16px]，[/size][size=16px]相差不大。[/size][size=16px] 后我们将样品前处理进行到超声波超声2[/size][size=16px]0[/size][size=16px]min后静止一天后再进行后面的[/size][size=16px]处理[/size][size=16px]。检测未加标的样品，结果克伦特罗仍零含量，未检出。加标样[/size][size=16px]品[/size][size=16px]含量[/size][size=16px]0.[/size][size=16px]3931[/size][size=16px]μ[/size][size=16px]g/ml，约1[/size][size=16px]9.65[/size][size=16px]5ng/kg，加标回收率为39.31%。多次检测，结果[/size][size=16px]也[/size][size=16px]相差不大。[/size][size=16px] 后我们将样品前处理进行到超声波超声[/size][size=16px]20min后静止[/size][size=16px]三[/size][size=16px]天后再进行后面的[/size][size=16px]处理[/size][size=16px]。检测未加标的样品，结果克伦特罗仍零含量，未检出。加标样[/size][size=16px]品[/size][size=16px]含量[/size][size=16px]0.[/size][size=16px]9163[/size][size=16px]μ[/size][size=16px]g/ml，约[/size][size=16px]45.815μ[/size][size=16px]g/kg，加标回收率为[/size][size=16px]91.63[/size][size=16px]%。多次检测，结果也相差不大[/size][size=16px]，[/size][size=16px]该结果[/size][size=16px]满足加标回收[/size][size=16px]率[/size][size=16px]要求。[/size][size=16px] 这前处理提取效率明显[/size][size=16px]存在[/size][size=16px]问题，最后虽然满足要求但所需时间太长，当然这也许和我们操作手法和实验试剂有关。后我们经过查文献和多次实验摸索，发现一种效果比较好的提取方法。[/size][size=16px] 取一定量生猪肉（瘦肉）充分粉碎后准确称取2[/size][size=16px]0[/size][size=16px]g，加入[/size][size=16px]0.1毫升[/size][size=16px]1[/size][size=16px]0μg/ml克伦特罗标准品溶液震荡仪震荡至少10min，后超声波超声至少20min，后40℃温度下静止至少24小时[/size][size=16px]，作为待检测[/size][size=16px]加标[/size][size=16px]样品[/size][size=16px]。[/size][size=16px] 用0[/size][size=16px].5%[/size][size=16px]甲酸水溶液和甲醇以2[/size][size=16px]0%[/size][size=16px]：8[/size][size=16px]0%[/size][size=16px]混合作为提取液，准确称取5g待检测[/size][size=16px]加标[/size][size=16px]样品，加提取液至2[/size][size=16px]0[/size][size=16px]ml，震荡仪震荡5min，超声波超声2[/size][size=16px]0[/size][size=16px]min，后恒温水域6[/size][size=16px]0[/size][size=16px]℃保持3[/size][size=16px]0[/size][size=16px]min，[/size][size=16px]待温度降至[/size][size=16px]30℃-40℃，[/size][size=16px]离心机5[/size][size=16px]000r/min[/size][size=16px]离心1[/size][size=16px]0[/size][size=16px]min，取离心后上清液[/size][size=16px]于[/size][size=16px]备用试管中。离心后沉淀物加提取液至2[/size][size=16px]0[/size][size=16px]ml重复提取一次，取离心后上清液与第一次上清液合并。[/size][size=16px] 按国标净化和试样测定前的准确方法[/size][size=16px]处理[/size][size=16px]，检测结果，克伦特罗加标样[/size][size=16px]品[/size][size=16px]含量[/size][size=16px]0.4654μ[/size][size=16px]g/ml，约[/size][size=16px]46.54μ[/size][size=16px]g/kg，加标回收率为[/size][size=16px]93.08[/size][size=16px]%。多次检测，结果相差不大[/size][size=16px]，说明该提取方法可靠[/size][size=16px]。[/size][size=16px] 经过该研究我们发现国标方法虽是通用方法，但针对某些样品国标方法不一定是最理想的方法，选择或研究一种理想的检测方法检测时既省时又省力，结果准确度还有保证。[/size][size=16px] 以上方法可能存在个人操作及实验室条件所限，可能存在一定误差，仅供参考。[/size]

猪肉、猪肝中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、特布他林及沙丁醇胺的检测本文就瘦肉精（克伦特罗、莱克多巴胺、特布他林及沙丁醇胺）扩项认证实验方法的确认过程进行详细解读。涉及的标准：[img=,690,84]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162144287540_8130_2166779_3.png!w690x84.jpg[/img]液相色谱条件：[img=,690,311]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162142182407_2039_2166779_3.png!w690x311.jpg[/img]MRM质谱条件：[img=,656,332]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162143190310_6780_2166779_3.png!w656x332.jpg[/img]盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、特布他林及沙丁醇胺均为5ng/mL（含内标物）的TIC图及MRM图：[img=,649,449]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162209329386_2102_2166779_3.png!w649x449.jpg[/img]其中克伦物罗只采集277.2＞132、277.2＞202.9这两个子离子：[img=,690,219]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162210045860_1385_2166779_3.png!w690x219.jpg[/img][img=,656,206]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162211276827_3238_2166779_3.png!w656x206.jpg[/img][img=,690,397]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162213301990_3525_2166779_3.png!w690x397.jpg[/img][img=,690,412]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162213400460_418_2166779_3.png!w690x412.jpg[/img]猪肉样品的测定结果：[img=,690,458]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162218508377_830_2166779_3.png!w690x458.jpg[/img][img=,678,221]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162219077610_3828_2166779_3.png!w678x221.jpg[/img][img=,690,435]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162219185997_7107_2166779_3.png!w690x435.jpg[/img][img=,690,423]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162219325567_679_2166779_3.png!w690x423.jpg[/img]在猪肉基质中的检测限：0.1ng/mL克伦特罗：[img=,690,526]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162223406730_6485_2166779_3.png!w690x526.jpg[/img]0.5ng/mL莱克多巴胺：[img=,690,521]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162226394828_9955_2166779_3.png!w690x521.jpg[/img]0.5ng/mL沙丁醇胺：[img=,690,405]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162228398089_6245_2166779_3.png!w690x405.jpg[/img]0.5ng/mL特布他林：[img=,690,506]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162233035297_131_2166779_3.png!w690x506.jpg[/img]克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁醇胺、特布他林的检出限及工作曲线方程及相关系数：[img=,690,333]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162233124587_911_2166779_3.png!w690x333.jpg[/img]猪肉样品加标回收：[img=,690,81]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162242399324_8197_2166779_3.png!w690x81.jpg[/img][img=,690,595]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162245573160_5901_2166779_3.png!w690x595.jpg[/img][img=,690,464]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162246112180_6133_2166779_3.png!w690x464.jpg[/img][img=,642,359]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162246257140_8429_2166779_3.png!w642x359.jpg[/img]鸡肝样品中的克伦特罗如果只采集277.2＞132、277.2＞202.9这两个子离子出现了假阳性：代入工作曲线得鸡肝样品中的克伦特罗为4ug/kg，不合格啊？？[img=,690,388]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162256222427_6524_2166779_3.jpg!w690x388.jpg[/img]样品与标液重叠图谱克伦特罗：[img=,690,388]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162259258447_6528_2166779_3.jpg!w690x388.jpg[/img]结合好几个检测方法，决定对克伦特罗多采集几个子集子进行定性：[img=,380,40]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162301552495_1773_2166779_3.png!w380x40.jpg[/img]2ng/mL的克伦特罗标液的MRM图：[img=,690,920]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162307457540_8130_2166779_3.jpg!w690x920.jpg[/img][img=,690,920]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162307574590_6583_2166779_3.jpg!w690x920.jpg[/img][img=,690,920]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808162308050790_4421_2166779_3.jpg!w690x920.jpg[/img]通过比对标液、鸡肝样品，鸡肝样品加标的子离子碎片: 277.2＞259.1、277.2＞203.1、277.2＞168.1的丰度比，可知鸡肝样品并未检出克伦特罗。结论：平时检测瘦肉精（克伦特罗）时，可以只采集277.2＞203.1、277.2＞132，但是如果遇到有检出的情况，一定要多采集几对的离子对：277.2＞259.1、277.2＞203.1、277.2＞168.1、277.2＞132进一定进行定性确认，以免出现假阳性造成误判。