结核分枝杆菌异烟肼耐药基

细菌全基因组测序的最新进展让研究人员成功绘制出了结核分枝杆菌抗生素耐药基因组特征的完整目录。近日，一篇发表在国际杂志Nature Communications上题为“Genomic signatures of pre-resistance in Mycobacterium tuberculosis”的研究报告中，来自帝国理工学院等机构的科学家们通过研究首次发现了细菌中“预抗性”（pre-resistance）存在的迹象，相关研究结果或能帮助临床医生未来选择针对细菌性感染的最佳疗法。图片来源：Unsplash/CC0 Public Domain文章中，研究人员对3000多份结核病样本进行全基因组测序，并在近20年里来追踪患者的结核病感染情况；结核分枝杆菌（MTB）是一种影响肺部功能的细菌性感染性疾病，2020年在传染病引发的死亡病例中其所引发的死亡仅次于COVID-19；如果使用正确的抗生素进行治疗的话，结核病患者就能被治愈，但治疗的时间很长，而且很多患者会面临无法获得足够医疗保健的风险，如果患者无法完成整个治疗过程，或者没有药物以及药物质量较差的话，就会出现耐药性结核病的发生。多重耐药性的结核病是一种巨大且不可持续的人类疾病负担，如今研究人员在少数国家已经发现了完全耐药的菌株，由于卫生系统正在努力应对当前新冠疫情，全球结核病治疗的进展已经大大放缓了。为了能够更好地理解并最终开发治疗结核病的新型疗法，这篇研究报告中，研究人员首次揭示了如何在耐药性突变发生之前预防结核病患者所出现的耐药性，研究人员将这一概念称之为“预抗性”，即当诸如病毒或细菌等致病微生物在未来产生耐药性的内在风险更大时。通过分析数以千计的细菌基因组，研究人员表示，这或许有望应用于其它传染性疾病的研究，并能为个体化的病原体基因组疗法铺平道路，研究人员会根据诱发疾病的特定病原体中的DNA来选择药物以免病原体产生一定的耐药性。文章中，研究人员比较了来自3135个不同样本中的结核病样本，以此来重建TB细菌家族族谱，其被称之为系统发育数，随后研究者利用计算机分析来识别出细菌的祖先遗传代码（随后会导致细菌产生耐药性），研究人员通过分析家族树的分支确定了与MTB耐药性发生相关的关键改变，从而就能理解哪些因素最有可能让MTB产生耐药性。图片来源：https://www.nature.com/articles/s41467-021-27616-7研究人员描述了TB基因组中的突变如何帮助预测一种可能会产生药物耐受性的特定分支，然后他们在一个独立的全球TB数据库中验证了他们的发现。Grandjean博士说道，目前应对超级耐药细菌时我们在抗生素上的选择越来越少，而我们进行的选择往往具有一定的毒副作用，因此我们就应该另辟蹊径寻找能有效预防TB耐药性的策略。这行研究就是首个阐明我们能够领先药物耐受性产生的案例，这或许就能让研究人员未来利用病原体的基因组选择最佳的治疗性手段。研究人员希望本文研究能提供一种策略，通过靶向作用最有可能在未来产生药物耐受性的特定病原体基因组来治疗人类难以应对的疾病。综上，本文中研究人员描述了与耐药性获得风险较高的未点化额基因组多态性；同时研究人员还识别出了未来抗生素耐药性产生的标志物，其或能帮助开发新型靶向性疗法来预防结核分枝杆菌和其它病原体抗生素耐药性的产生。原始出处：Torres Ortiz, A., Coronel, J., Vidal, J.R. et al. Genomic signatures of pre-resistance in Mycobacterium tuberculosis. Nat Commun 12, 7312 (2021). doi：10.1038/s41467-021-27616-7

导读结核病是严重威胁人类健康的重要传染性疾病之一。如何准确快速诊断和鉴别诊断结核病及其耐药性，对指导临床开展早期精准有效治疗至关重要。本篇将主要介绍核酸质谱技术在鉴定结核病及其耐药性方面的内容……结核病是严重威胁人类健康的重要传染性疾病之一。来自世界卫生组织的数据显示：2021年全球有1060万例新发结核病患者，死亡近160万例，新增45万例耐多药/利福平耐药结核病患者；我国新发78万例结核病患者，新增耐多药/利福平耐药结核病患者约3.3万例，是全球结核病及耐药结核病高负担国家之一；肺外结核占所有结核病的15%～40%，因其容易导致器官或组织功能性损伤和器质性障碍而成为近年来结核病领域关注的重点（数据摘自《中国防痨杂志》）。因此，准确快速诊断和鉴别诊断结核病及其耐药性，对指导临床开展早期精准有效治疗至关重要。常见的结核病及其耐药性的诊断方法目前对诊断结核病及其耐药性的方法有：实时荧光定量PCR技术、恒温扩增技术、基因芯片/线性探针技术、基因测序技术和核酸质谱技术等。核酸质谱技术鉴定结核分枝杆菌的优势目前，核酸质谱技术可鉴定结核分枝杆菌复合群8个亚种和40个非分枝杆菌菌种及其亚种，合计48个分枝杆菌菌种和亚种，几乎覆盖了临床上分枝杆菌病的所有常见致病菌。而对于分枝杆菌的保守基因片段，核酸质谱技术可以针对基因的多态性进行设计和鉴定。其优势如下：01敏感度高：目前核酸扩增技术的结核分枝杆菌检测均基于IS6110、IS1081等位点进行扩增，选择其中的1个或2个，而核酸质谱技术可在此基础上增加其他位点的多肽性检测；02特异性高：核酸质谱可以用多基因结果验证，保证结核分枝杆菌检测的特异度；03耐药性检测方面应用范围广：几乎覆盖了目前常用的抗结核和抗分枝杆菌病的药物，检测针对性强、准确性高；04检测速度快：近百例样本同时进行检测分析，检测周期短于一代和二代测序，对少量样本也能进行多基因多位点检测。无需培养，实现单个核苷酸碱基的直接鉴定。核酸质谱技术鉴定结核分枝杆菌抗结核药物目前核酸质谱技术可检测结核分枝杆菌4种一线抗结核药物（异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇）和常用的二线抗结核药物（氟喹诺酮类、链霉素等）的耐药基因型。药物的检测结果与表型药物敏感性（简称“药敏”）试验结果具有很好的一致性；并可根据耐药相关的基因多态性进行设计，从而获得相关的耐药基因突变结果。可用于检测常用一线、二线抗结核药物的耐药基因位点。如利福平和异烟肼等。* 利福平：利福平的耐药决定区集中了95%以上的临床耐药菌株。核酸质谱技术能够检测出此决定区的所有突变位点，以及区外的常见位点，从而较全面地预测利福平耐药性。同时，核酸质谱法检测的结果还会提示是低水平耐药还是高水平耐药，从而避免出现使用药敏方法检测时的遗漏。综上所述：对于结核病的诊断，我国主要通过患者的临床表现、影像学检查结果及免疫学检测结果进行综合分析，但缺点是检测时间长及准确率有待提高。近年来，分子诊断技术包括核酸质谱技术的迅速崛起和发展，为结核病的快速诊断提供了新的方法。东西分析经过数年的开发，基于飞行时间质谱技术平台开发出快速鉴定结核分枝杆菌及其抗结核药物的应用方案。基于用户的具体需求，通过核酸质谱这个快速及强有力的辅助诊断工具，东西分析可对结核分枝杆菌进行精确到种乃至亚种水平的鉴定，从而为临床提供早期精准诊断和治疗参考建议。对于阳性的检测结果，还可进一步进行耐药性检测。即根据检测结果，临床医生不仅能够进行高效精准的结核病诊断，还能够及时调整治疗药物，从而优化治疗方案。Ebio Reader 3700 Plus飞行时间质谱仪操作简单无需复杂的样品前处理。性能稳定长寿命固体激光器；飞行管随环境温度、湿度的变化小，保证检测的稳定 ；高效网筛离子源，提高仪器的灵敏度 ；PIE高压脉冲电源控制，实现离子的延迟推斥，提高整体仪器的分辨能力。软件智能基于神经网络聚合分类法的人工智能软件；拥有强大数据库，实现对菌种的实时鉴定；具备聚类分析功能，可进行T-test等数据分析；具有自建库功能，可根据用户实际情况建立自有菌种库 ；可根据用户具体需求，进行相应升级，用于疾病蛋白标志物和核酸基因分型的检测。应用范围广广泛用于临床、疾控、食品安全、农业、工业、出入境检疫等领域。往期回顾BREAK AWAY核酸质谱之漫话一：什么是核酸质谱

结核病问题的解决仍是一个长期的世界性的难题。从20世纪90年代初世界卫生组织宣布全球进入结核病公共卫生紧急状态起,在相当长的一个时期内公众普遍乐观地认为,通过推行直接面视下短程化疗(DOTS)措施就可以有效解决结核病的问题。但是随着全球范围结核病防治工作的普遍开展和实践,到2011年前后,全球逐渐形成解决结核病问题需要将公共卫生管理和技术工具开发相结合的共识。结核病的有效防治需要在诊断、预防、治疗等3个方面(新诊断技术、新疫苗和新药物)下力气。在传染病相关的行政管理中,中国的模式和行政效率在世界上都是领先有效的。在行政手段有效保障的基础上,进一步提高控制能力的任务就需要客观具体的技术产品来实现了。随着我们对结核病、耐药结核病、耐多药结核病、广泛耐药结核病研究的日益深入,对其认识也是逐步提高的。在应用已有手段解决普遍性问题的同时,针对新发现的尚缺乏有效诊治手段的结核病类型,我们就需要研究更多新技术并开发更多的新产品,从技术能力上切实解决这些问题。免疫学诊断方法免疫分子用于结核病诊断新进展：在活动性结核病患者体内结核分枝杆菌特异性单阳性TNF-α+和双阳性IFN-γ+/TNF-a+CD4+T细胞的比例显著高于潜伏性感染者和未感染者。此外，表达IL-17的CD4+T细胞（主要为单阳性IL-17+和双阳性IL-2+/IL-17+表型）的频率在活动性结核病患者中高于其他两种组。分枝杆菌特异性CD4+T细胞的数量和功能特征在结核病感染和未感染结核的儿童之间以及潜伏和活动性结核病之间存在显着差异【1】。细胞因子和可溶性粘附分子谱和生物标志物用于治疗监测再治疗涂阳肺结核患者。复治期间，IFN-γ、IL-2、IL-7和可溶性CD54水平以及IL-2/IL-10和IFN-γ/IL-10比率呈上升趋势，可作为复治是否有效的血清指标【1】。IP-10和RANTES的组合可能被用作诊断和治疗监测肺结核中的生物标志物。肺结核患者血浆IP-10和RANTES水平显着高于健康对照组，IP-10和RANTES的组合在训练组中的AUC为1.0时表现**。响应治疗时，IP-10和RANTES均显着水平在6个月内减少【2】。γ-干扰素释放试验（IGRAs）用于结核病诊断新进展：IGRAs的原理是当机体内被结核菌抗原致敏的效应T细胞，在体外受到相同抗原的刺激（在APC细胞辅助下）后，会分泌大量的γ干扰素。通过IFN-γ的检测来判断结核感染的情况。IGRAs试验灵敏度高，特异性高，快速简便，是一种值得推广的检测方法，为潜伏性感染和活动性结核的辅助诊断，阴性结果对排除结核感染有一定的帮助。IGRAs试验用于筛查潜伏性感染时不受卡介苗接种的影响，但不适用于流行病学筛查。但是IGRAs预测哪些患者将来进展为活动性结核病的方面的应用较少。最近的一个大样本研究评估IGRAs和TSTs显示在低发病率国家，IGRAs和TST的阴性预测值＞99%，但阳性预测值仅为3%-4%【3】。下一代IGRAs发展前瞻需考虑以下几个方面：增加预测潜伏性感染到活动性结核的能力；能够检测结核分枝杆菌感染的临床阶段；监测潜伏感染或结核病的治疗效果；增加新抗原（如Rv3873、Rv3879和Rv3615）及增加更多细胞因子（IP-10，MCP-2，MIG等）来提高IGRA的敏感性。此外，随着结核分枝杆菌的菌量增加，结核特异性的CD8+ T细胞更容易检测到。CD8反应可以初步区别活动性与潜伏感染，与治疗效果相关【4】。双因子检测DeFine.TB 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒结核分枝杆菌特异性细胞因子（IFN-γ和IL-2）检测试剂是 “十三五” 国家科技重大专项传染病防治专项成果转化产品。在检测时，将人外周血单个核细胞从全血样本中分离出来 ，消除血液本底干扰因素，通过计数单个核细胞数量，排除人群中免疫细胞数量的个体差异影响。将定量的单个核细胞与融合蛋白ESAT-6-CFP-10-Rv1985c在细胞培养板上共培养，结核特异性 T 细胞由于记忆反应而分泌γ-干扰素及白细胞介素-2因子，再利用双抗体夹心酶联免疫法，检测培养上清中的γ-干扰素、白细胞介素-2的浓度，来判断其是否存在结核分枝杆菌特异性的细胞免疫反应。用于结核病的辅助诊断，能够及时发现活动性结核患者，同时对于潜伏感染患者能够进行及时、准确的排筛。01 新的检测靶标IL-2特异性高达94.3%研究结果发现IFN-γ的ROC 曲线下面积为0.859，而IL-2 的ROC 曲线面积0.865（详见Fig. 2 ） ，IFN-γ的总体敏感性和特异性分别为83.8% 和81.5%，IL-2的特异性为94.3%，灵敏度为72.6%（详见Table2）。02 新的检测靶标IL-2提高结核病的检出率双因子检测的敏感性为87.9%，单因子检测敏感性为83.8%，敏感性的增加主要是由于引入新的检测靶标IL-2，表明约16%的活动性结核患者中IFN-γ结果为阴性，而这些患者中有1/4的IL-2 结果为阳性。当IFN-γ和IL-2 串联组合时，特异性进一步提高到96.0%，可与分子诊断的培养阳性检测结果相媲美，甚至可以对培养阴性的患者产生可靠的结果。03 并联检测敏感性高达87.9%，串联检测特异性高达96.0%进一步分析IFN-γ和IL-2联合应用对活动性结核病的诊断价值。对IFN-γ和IL-2 进行并联检测时，敏感性升至最高的87.9%，特异性达到79.8%，阳性预测值达93.9%；当IFN-γ和IL-2 进行串联检测时，718 例非结核患者中有689 例检测结果为阴性，特异性为96.0%，敏感性为68.5%，阳性预测值为98.4%。值得注意的是，串联检测在结核病确诊患者的敏感性（72.1%），高于临床诊断敏感性（65.8%），提示IFN-γ和IL-2串联检测的准确度与结核病的严重程度相关。04 双因子联合检测灵活性高，满足不同的检测场景研究团队根据活动性结核病不同流行模型，分别阐述了IFN-γ和IL-2联合检测在不同模型中诊断价值，并提出了适用于综合性医院和专科医院各自的诊断算法。在综合性医院中，约有10%的结核疑似患者最终确诊为活动性结核，与常规涂片镜检相比，使用具有更高敏感性的双因子并联检测可帮助临床医生发现更多活动性结核病患者（如图B）；在结核病专科医院，结核病疑似患者中活动性结核病的比例达到50%，使用具有高特异性的双因子串联检测可为活动性结核病患者特别是菌阴结核患者提供诊断依据（如图A）。在检测时，将人外周血单个核细胞从全血样本中分离出来 ，消除血液本底干扰因素，通过计数单个核细胞数量，排除人群中免疫细胞数量的个体差异影响。将定量的单个核细胞与融合蛋白ESAT-6-CFP-10-Rv1985c在细胞培养板上共培养，结核特异性 T 细胞由于记忆反应而分泌γ-干扰素及白细胞介素-2因子，再利用双抗体夹心酶联免疫法，检测培养上清中的γ-干扰素、白细胞介素-2的浓度，来判断其是否存在结核分枝杆菌特异性的细胞免疫反应。用于结核病的辅助诊断，能够及时发现活动性结核患者，同时对于潜伏感染患者能够进行及时、准确的排筛。

结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mtb）引起的一类重大传染性疾病。据世卫组织发布的最新报告，在2020年，全球有近990万结核病患者，并有约151万人因结核感染导致死亡。中国科学院微生物研究所刘翠华课题组长期致力于研究Mtb等重要病原菌与宿主相互作用的分子机制，近年来发表系列研究工作，在病原菌与宿主相互作用机制方面取得重要成果，为抗结核治疗及药物研发提供了多种新思路和潜在新靶点。　　以往认为，健康个体受到Mtb感染时，往往会发展成为潜伏感染者或活动性TB患者。有趣的是，近年来临床上发现有一部分与TB患者持续密切接触的个体，既不发展为活动性TB患者并显示出相关症状，也未表现出潜伏感染者的免疫学诊断特征。这类长期密切接触病原菌的健康个体被称作TB抵抗者。　　目前对于这类TB抵抗者的抗感染免疫机制所知甚少，深入揭示相关机制有望为TB的预防和治疗提供新线索和新策略。近日，刘翠华课题组与首都医科大学附属北京胸科医院教授逄宇团队合作，揭示了TB抵抗者人群在应对Mtb感染时的固有免疫应答特征。该合作研究发现：与对照组、潜伏感染者及活动性TB患者相比，TB抵抗者的外周血单核巨噬细胞在受到Mtb侵染时，可产生更高水平的TNF-α、IL-1β及IL-6等细胞因子，并且其清除胞内病原菌的能力更强。　　随后的一系列筛选及功能验证实验结果表明：在Mtb感染过程中，组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）仅在TB抵抗者来源的巨噬细胞中维持稳定的表达水平及酶活性，而在其他实验组人群中出现显著下降。同时，进一步抑制或沉默HDAC6可阻抑TB抵抗者来源巨噬细胞中细胞因子的分泌以及其中含Mtb的囊泡的酸化能力。这些结果提示，TB抵抗者来源的巨噬细胞高效清除Mtb感染的能力依赖于HDAC6，后者可能是一个促进细胞因子产生以及自噬流畅通进而加速Mtb清除的关键宿主因子。综上，该研究揭示了TB抵抗者人群依赖HDAC6清除Mtb感染的固有免疫新机制，为临床上TB患者密切接触者的TB感染和发病风险预测提供了重要新标识，并为靶向宿主的TB治疗提供了新思路。　　目前，相关结果已在线发表于The FASEB Journal。该工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金及北京市医院管理中心“扬帆”项目的支持。　　论文链接

p style=" text-indent: 2em " 3月21日，国家食品药品监督管理总局（CFDA）发布了《结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂注册技术审查指导原则》（2018年第57号），旨在加强医疗器械产品注册工作的监督和指导，进一步提高注册审查质量。 /p p style=" text-indent: 2em " 附件： a href=" http://img1.17img.cn/17img/files/201803/ueattachment/a12b34e3-7d21-4a6a-8a02-03a277136204.doc" 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂注册技术审查指导原则.doc /a /p

一、项目基本情况项目编号：JSTCC2401111222项目名称：结核分枝杆菌rpoB基因和突变检测试剂盒采购预算金额：人民币1260.00万元最高限价：人民币210元/人份采购需求：结核分枝杆菌rpoB基因和突变检测试剂盒，具体技术参数要求详见采购文件。结核分枝杆菌rpoB基因和突变检测试剂盒，具体技术参数要求详见招标文件；合同履行期限：接招标人通知后3日内交货本项目是否接受联合体投标：不接受本项目是否接受进口产品投标：接受二、获取招标文件1、招标文件获取时间：2024年3月25日起至2024年4月1日止，每天9:00―11:30，14:00―17:00（北京时间，节假日除外）。2、招标文件获取方式：线上下载。1)在江苏省招标中心有限公司官网免费注册（具体步骤请参考登录网页相关指南或使用手册，注册咨询电话：400-058-0203，技术电话：025-83303461，13951767623）；2)注册成功后登录江苏省招标中心有限公司官网平台，点击屏幕左侧“项目搜索”，在搜索框中输入该项目招标编号，点击关注并支付平台使用费500.00元，售后不退；3)点击屏幕左侧“正在执行项目”，下载该项目招标文件；4)制作《招标文件领取确认表》(格式自拟)，要求word可编辑版，写明单位名称、联系人姓名、联系手机、邮箱、参与项目名称及编号、增值税开票资料和发票邮寄地址,并发送至邮箱wanghui@jitc.cn。提醒：投标人必须在上述招标文件发售截止时间前完成注册及领取招标文件事宜,否则系统到时即关闭,投标人将不再允许获取招标文件。《招标文件领取确认表》由投标单位填写，必须准确无误，否则后果自负！三、对本次招标提出询问，请按以下方式联系1.采购人信息名称：江苏省疾病预防控制中心（江苏省公共卫生研究院）地址：南京市江苏路172号联系方式：徐老师电话：025-837595432.采购代理机构信息名称：江苏省招标中心有限公司地 址：江苏省南京市郑和中路118号D座联系方式：姜瑶、陈诚、鲁民颉电 话：025-83249926、83248600、832499273.项目联系方式：项目联系人：姜瑶、陈诚、鲁民颉电 话：025-83249926、83248600、83249927网 址：江苏政府采购网 中国政府采购网

01研究背景膜蛋白生命活动中具有重要作用，也是重要的药物靶点，而膜蛋白在进行互作研究过程中会有许多难点：1. 膜蛋白一般需要去垢剂来模拟脂质生物环境。对于基于固定的互作技术，去垢剂会增加背景信号，或者存在参比通道和样品通道背景不同的可能。2. 膜蛋白结构复杂，且与配体结合后可能发生变构。因此研究互作时，膜蛋白的正确构象至关重要。基于固定的技术可能阻碍变构过程，或者在固定和再生过程中破坏膜蛋白的构象。3. 膜蛋白的表达量低、纯化难，因此需要消耗量少的方法进行检测。本期文献解读，讲述如何利用MST及nanoDSF的手段来进行膜蛋白互作研究的故事。02研究内容2024年3月15日，上海科技大学张璐研究员/饶子和院士团队在Nature Microbiology发表题为“Structural analysis of phosphoribosyltransferase-mediated cell wall precursor synthesis in Mycobacterium tuberculosis”的研究，解析结核分枝杆菌全新药物靶标——膜蛋白磷酸核糖转移酶Rv3806c与其受体底物DP和供体底物PRPP结合复合物的精细三维结构，为研究Rv3806c作为新靶点的靶向性药物研发提供了重要的理论基础。https://doi.org/10.1038/s41564-024-01643-8IF: 28.3 Q1通过对Rv3806c与供体底物PRPP复合物结构分析，推测可能影响Rv3806c结合和酶活的位点，并通过MST进行大量突变Rv3806c亲和力检测进行验证。Rv3806c为膜蛋白，并且在脂质环境中以三聚体形式组装。实验种共有10种突变体需进行Kd检测，每次实验均进行了5次重复。MST进行一次亲和力检测时，仅需32pmol、1μg的膜蛋白Rv3806c，大大节约蛋白消耗量。此外，MST技术是在溶液条件下进行，无需固定，且兼容去垢剂，使膜蛋白能保持正确的构象，甚至可以完成nanodisc或者膜提取物形式的膜蛋白亲和力检测，从而可以轻松表征膜蛋白Rv3806c多种突变体与底物PRPP的亲和力。图示：MST测定PRPP与WT-Rv3806c及突变体的结合亲和力此外，研究发现，供体底物PRPP通过一个Mg2+结合在TM螺旋束-1的空腔。为了研究Mg2+对Rv3806c结合供体底物PRPP的作用，作者使用MST和nanoDSF技术检测存在或不存在Mg2+时，Rv3806c与底物PRPP的结合。NanoDSF技术通过监测蛋白内源荧光的变化来表征蛋白结构，无需加入外源荧光染料，兼容去垢剂。使用GDN纯化的Rv3806c完成MST亲和力实验和nanoDSF的热迁移实验，结果显示Mg2+对于PRPP的结合至关重要。图示：MST分析在Mg2+存在或不存在的情况下，PRPP与Rv3806c的结合亲和力。在没有Mg2+的情况下，结合亲和力急剧下降，而在金属螯合剂EDTA的存在下，没有检测到结合。图示：在Mg2+、PRPP和EDTA存在或不存在的情况下，纯化后的Rv3806c的nanoDSF热稳定性分析。PRPP-Mg2+存在时Rv3806c表现出最高的热稳定性。03技术优势在这篇工作中，通过MST技术及nanoDSF技术，确定了膜蛋白Rv3806c与PRPP结合的关键残基，以及Mg2+在互作过程中的关键作用。对于分子互作亲和力的检测，Monolith系列仪器无需固定样品，且不限制缓冲条件，蛋白用量少，可以在溶液中表征膜蛋白与小分子的亲和力。Promethus系列仪器，以nanoDSF技术为核心，通过检测蛋白内源荧光监测蛋白的稳定性，无需外源荧光染料，兼容去垢剂，低浓度也可轻松表征，在膜蛋白稳定性分析和TSA互作定性研究上具有显著优势。-Monolith分子互作检测仪--PR Panta蛋白稳定性分析仪-

幽门螺杆菌是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的革兰氏阴性细菌，1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中分离成功。世界上有约一半的人感染了幽门螺杆菌，但很多没有临床症状。幽门螺杆菌及其患病率在某些人群中高达80％。幽门螺杆菌可能通过接触感染者的唾液、呕吐物或粪便传播，食用受污染的食物或水也会感染。大多数感染幽门螺杆菌的人都是在儿童时期感染的。幽门螺杆菌感染可导致慢性胃炎、消化性溃疡病（PUD）、胃癌和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等胃肠道疾病。它还可能与非消化系统疾病有关，如口臭、身材矮小、营养不良和儿童难治性缺铁性贫血。根除幽门螺杆菌有助于治疗慢性胃炎、PUD 和其他相关疾病，并降低患胃癌的风险。 近期，重庆医科大学附属儿童医院消化科主任李中跃老师课题组在欧洲儿科医学期刊《European Journal of Pediatrics》上发表Antibiotic resistance of Helicobacter pylori isolated from children in Chongqing, China的研究论文，研究团队对重庆地区儿童幽门螺杆菌耐药性进行了分析。 研究背景幽门螺杆菌 (H. pylori) 感染是人类最常见的慢性细菌感染之一，作为幽门螺杆菌的一线治疗方案，标准的三联疗法包括一种质子泵抑制剂(PPI) 和两种抗生素：克拉霉素和阿莫西林（如果对青霉素过敏，可以用甲硝唑代替阿莫西林）。首次引入该疗法时，它达到了很高的根除率（ 90%）。然而，近年来该方案在世界许多地区的疗效一直在下降，根除率156例疑似幽门螺杆菌感染患儿进行胃活检，在调查前的最后2个月内，所有儿童均未服用任何H2受体拮抗剂、PPI、铋和抗生素。通过上消化道内镜在胃窦处采集胃黏膜活检标本，样本经处理培养后，对疑似透明菌落通过革兰氏染色和脲酶、过氧化氢酶、氧化酶活性试验鉴定，然后确定幽门螺杆菌。抗生素药敏试验：采用琼脂稀释法检测幽门螺杆菌菌株对六种抗生素（克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林、四环素和呋喃唑酮）的耐药性。将幽门螺杆菌悬浮液接种到含有5% 羊血和临界浓度的单一抗生素的培养板上，然后在微需氧条件下在37°C 下孵育 3 至 5 天。抗生素折点（breakpoints）为克拉霉素≥1.0 μg/mL、甲硝唑≥8.0 μg/mL、左氧氟沙星≥2.0 μg/mL、阿莫西林≥2.0 μg/mL、四环素≥2.0 μg/mL、呋喃唑酮≥2.0 μg/mL。试验中ACTC11637用作对照菌株。23S rRNA 和 gyrA 基因的突变分析：提取分离菌株的DNA，设计引物用于扩增23S rRNA 和 gyrA 基因。使用 BIO-GENER PCR 扩增仪进行PCR扩增，最后对PCR 产物进行鉴定，并进行 Sanger 测序以检测 23S rRNA 中 2143、2142 位、gyrA 基因中 87 和 91 位密码子的突变。统计学分析：数据采用SPSS 26.0统计软件进行分析。不同性别、年龄组和内镜检查结果的耐药发生率采用卡方检验（χ2 检验），概率（p）值≤0.05被认为具有统计学意义。其中，基因扩增实验中用到的PCR扩增仪来自柏恒科技。 结果研究显示，共分离出112株（71.8%）幽门螺杆菌。有56名男孩和56名女孩，所有儿童的平均年龄为9.6±3.0岁，范围为3.0至17.9岁。112例患者中，最常见的症状是腹痛（77.7%），内镜下主要表现为幽门螺杆菌相关性胃炎（86.6%），仅有15例患者出现十二指肠溃疡。在 112 个样本中，102 个菌株检测到 23S rRNA 和 gyrA 基因的突变。A2143G突变率为48.0%（49/102）；没有发现任何 A2142G 突变。gyrA基因突变率为16.7%（17/102），在17株菌株中，对应Asn87和Asp91的突变率分别为9.8%（10/102）和6.9%（7/102）。研究人员还发现11株同时具有23S rRNA和gyrA基因突变。没有观察到 Asn87 和 Asp91 突变之间的 MIC (最低抑菌浓度)值有显著差异(p0.05)。讨论许多国家都报道了儿童对克拉霉素的耐药性，其患病率从 16.0% 到 50.9% 不等。在该研究中，克拉霉素的耐药率为47.3%，高于中国其他地区以往报道（16.4-31.8%），但低于北京（84.9-96.6%）。欧洲的一项多中心研究分析了门诊社区中抗生素使用与抗生素耐药性之间的关系，以治疗幽门螺杆菌感染，并表明长效大环内酯类药物的使用与幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性相关。在大环内酯类中也观察到强烈的交叉耐药性。因此，中国幽门螺杆菌感染儿童对克拉霉素的高耐药性可能归因于大环内酯类药物在呼吸系统和其他疾病中的频繁使用。 在临床实践中调节和限制大环内酯类的给药可能有利于降低高耐药性。重庆市幽门螺旋杆菌感染儿童对克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星耐药率较高。大多数克拉霉素耐药菌株均检测到A2143G突变，而gyrA突变点的Asn87和Asp91在左氧氟沙星耐药菌株中常见。在临床实践中，抗幽门螺杆菌治疗应根据药敏试验个体化。 在今天的介绍中，我们了解了关于幽门螺杆菌耐药一些情况及背后分子层面机理，对于我们预防和治疗幽门螺杆菌提供了不少信息。分子层面研究可以用到的PCR仪简介如下，欢迎咨询了解更多。 PCR仪产品简介 RePure系列智能二维梯度PCR仪本系列PCR仪具有二维梯度摸索功能，多种梯度摸索模式；自适应压杆式热盖，合盖紧盖一步到位；前进后出式风道，机器可并排放置，节约实验空间； Q3200系列荧光定量PCR仪本系列荧光PCR仪采用四通道双16孔模块设计，可实现一机多用；最大升降温速率8℃/s，大大节约实验时间；体积小，重量轻，方便携带；

众所周知，肺结核多数是由结核分枝杆菌感染肺部引起的肺部感染性疾病，已成为一个严重威胁人类健康的疾病。世界卫生组织（WHO）统计表明，全世界每年发生结核病800～1000万，每年约有300万人死于结核病，是造成死亡人数最多的单一传染病。1993年WHO宣布&ldquo 全球结核病紧急状态&rdquo ，认为结核病已成为全世界重要的公共卫生问题。我国是世界上结核疫情最严重的国家之一。 然而细菌也一直处于不断突变及进化的过程中，要对症下药就需要知道细菌的准确分型。传统的细菌分型技术仅针对细菌的某几个基因进行检测，在传染病疫情爆发时往往缺乏更具体的信息，于是在全基因组测序费用不断下降的现在，研究者们也在尝试用新一代的检测技术对细菌进行分型，以发现传染病爆发的传播模式和几率。 近期，据《PLoS Medicine》杂志报道，有研究者们利用454技术对86例人结核分枝杆菌进行了全基因组测序，并与传统分型技术结果进行了比较。这86例细菌是从1997年和2010年两次爆发的2301个结核病患者身上分离出来的。通过新一代测序技术的检测结果，研究者们表示，全基因组测序法揭示了第一次结合爆发所分离的人结核分枝杆菌不属于最近爆发的结合杆菌传播链，另外通过计算估计出人结核分枝杆菌每2.5年会发生1个发生突变，这表明细菌在感染的人群中倍增的时间为22小时或每年400代，因此，只有通过全基因组测序进行细菌分型才能够提供准确的关于结核分枝杆菌爆发的相关流行病信息。 参考文献：Roetzer A, Diel R, Kohl TA, Ru¨ ckert C, Nu¨ bel U, et al. (2013) Whole Genome Sequencing versus Traditional Genotyping for Investigation of aMycobacterium tuberculosisOutbreak: A Longitudinal Molecular Epidemiological Study. PLoS Med 10(2): e1001387. doi:10.1371/journal.pmed.1001387

由结核杆菌引起的结核病是全球重要的慢性疾病。据世界卫生组织发布的《2019年全球结核病报告》数据，全球结核潜伏感染人群约17亿，占全人群的1/4左右，结核病仍是全球前10位死因之一。目前结核杆菌耐药性问题日益严重，了解结核杆菌耐药机制并研发新的治疗结核病药物对实现“终止结核病策略”意义重大。　　近日，复旦大学和北京大学为主的联合团队在《Emerging Microbes & Infections》杂志上发表了题为“Cryo-EM structure of Mycobacterium tuberculosis 50S ribosomal subunit bound with clarithromycin reveals dynamic and specific interactions with macrolides”的文章，该研究解析了结核杆菌核糖体大亚基与大环内酯类抗生素克拉霉素（Clarithromycin，CTY）结合的冷冻电镜三维结构。　　研究团队发现抗生素CTY结合位点位于结核杆菌核糖体大亚基新生肽链通道靠近rRNA第2062位腺嘌呤（A2062）的位置，与其他大环内酯抗生素的结合位置基本一致。研究团队基于研究获得的密度图，认为结合CTY的结核杆菌大亚基的A2062存在两种构象；与已发表的核糖体与大环内酯结合的结构比较，认为A2062与特定的大环内酯类抗生素结合的动力学可能调节肽基转移酶向翻译阻滞方向发展。该研究对结核杆菌核糖体大亚基A2062与大环内酯类药物的动力学研究结果，可能有助于合理设计下一代抗结核药物，以对抗日益严重的结核杆菌耐药问题。　　论文链接：　　https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/22221751.2021.2022439　　注：此研究成果摘自《Emerging Microbes & Infections》杂志，文章内容不代表本网站观点和立场，仅供参考。

立菲达安基于一代测序平台成功开发出HBV耐药、HCV分型、TB耐药三款检测试剂盒，目前已获中国国家食品药品监督管理总局(CFDA)受理号，有望于2014年6月份通过审批，提供给中国广大医务工作者使用。 　　乙型肝炎病毒(HBV)是传染性疾病乙型病毒性肝炎的主要病因，感染HBV可引起肝硬化和肝细胞癌变。我国是乙型肝炎高发区，据WHO报道，2013年我国乙肝病毒携带者1.2亿人，慢性乙肝患者超过2000万人。 　　目前临床上常用的抗HBV药物为核苷(酸)类似物，患者需长期维持治疗。HBV在宿主体内感染以及抗病毒治疗的过程中易发生变异，随之出现耐药问题。耐药突变易引起肝病活动，甚至诱发重症肝炎。而且，突变发生后继续用药不仅会增加病人的经济负担、造成资源浪费，还可能产生严重的流行病学危害。因此，动态监测乙肝病毒耐药突变对及时调整治疗方案、合理用药及提高疗效具有重要的指导意义。 　　据WHO报道，全球有1.7亿感染者，流行率约为3%。HCV感染后病情隐匿，50%~80%会转变成慢性肝炎，如不进行合理治疗，10~20年后有10~30%会发展成为肝硬化，1%~5%甚至会发展为肝癌，严重危害患者的健康和生命。 　　HCV是一类球形的单股正链RNA病毒，基因组序列具有高度变异性。根据不同区域的基因序列变异情况，HCV分为6个基因型和80多种基因亚型。研究表明了解患者HCV基因型有助于制定治疗方案及治疗周期。 　　结核病是由结核分枝杆菌(简称结核杆菌)所引起的慢性传染病，主要经呼吸道传播，是我国重大传染病之一。利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素是临床上最常见的一线抗结核药物，由于不合理用药等原因，我国的耐药患者高达28-41%。准确的耐药性检测是指导临床合理用药的前提，也是结核防治的关键。 　　基因测序作为分子诊断的一个技术平台，是分子诊断技术最精确的方法，可应用于传染病耐药检测、肿瘤靶向用药指导、化疗药物毒性检测等。最小量的DNA起始样品，完成多个靶位的检测。配套有自动结果分析软件，帮助广大医务工作者轻松实现从样本到报告结果。 　　Life Technologies员工表示&ldquo 该技术检测结果具有准确、可靠等特点是基因检测公认的&ldquo 金标准&rdquo 。我们相信这一系列产品的上市将为中国广大医务工作者提供有力的帮助，同时给患者带来福音。&rdquo

19世纪早期发展起来的自动化工业一方面是为了提高生产性能，降低成本，另一方面是为了工人的安全利益考虑。信息技术使自动化得到快速发展，自动化能够减轻人们繁琐的体力劳动和重复性劳动，还能够给企业在不增加员工的情况下提高了生产率，同时企业降低了运营成本，提高了产品利用率，提高了生产效率，操作还具有可靠性。大家虽然认识到自动化有许多好处，但自动化也面临诸多现实问题。目前自动化几乎在所有的行业中都得到了有效实施应用，包括医学实验室。全实验室自动化临床标本的处理TLA（Total Lab Automation）可以提高效率和样本可追溯性。实验室收到样本后，立即对所有样本进行连续处理。根据样本类型和要求的分析，自动选择并标记适用的培养基。根据划线模式，利用标定后的接种环对样本进行接种。接种的培养基通过传送带迅速转移到培养箱中。这允许跳过样本的批处理以及手动工作列表的创建。TLA还通过大幅减少标本的处理来提高技术人员的安全水平，因为培养皿的检查是通过数字图像在屏幕上进行的。培养基平板的培养和成像通过使用TLA，接种的培养基可以及时地从处理区转移到培养箱。琼脂平板在最佳生长条件、稳定的温度和适宜的环境下培养，因为培养箱的门在整个培养过程中始终保持关闭。微生物生长通过在预定时间点拍摄的高分辨率数字图像进行监测。这使得能够更快速地检测微生物生长，同时也提高了缓慢生长病原体的复壮。此外，TLA使用一种软件，可以在更高的放大率下查看数字图像，从而促进对菌落形态的进一步判断和混合培养物的检测。数字图像由训练有素的技术人员进行解读，与传统的诊断工作相比，情况完全不同，因为细菌菌落在屏幕上呈现形态和手工操作判断非常不同。TLA最终建立了一个图像库，可以用于对比校对，也可以在与传染病专家讨论时提供帮助并对个别患者进行分析。培养基平板的检验为了最大限度地利用成像，应在不同的时间点拍摄数字图像，同时观察最早出现的微生物，以便尽早检测较早出现的微生物生长情况（Figure1）。因此，与常规检查相比，病原体的鉴定和抗生素耐药性检测（AST）可以更早地获得，因此缩短了周转时间（TAT）。使用TLA，将每个接种的培养皿培养一段时间，以便在白天和晚上都可以进行处理。这种处理效率最高，对TAT产生了有益的影响，可以更好地管理工作任务和工作流程。（Figure 2）使用数字图像对培养基平板进行评估判断和解读仍由实验技术人员执行，他们确定需要分离哪些目标菌落，并对其进行进一步处理，以进行鉴定和AST。当前版本的TLA无法取代这些人工操作。然而，市场上新推出的其他自动化系统（例如Copan Colibri™ ), 可以通过MALDI-TOF和标准化接种物制备目标微生物鉴定（ID）以及AST（Figure 3）。ID和AST结果也必须由熟练的技术人员进行解读，这需要在人员配备方面进行充分考虑。为了匹配实验室工作量与诊断活动水平，TLA允许在任何时候跟踪整个诊断路径中的所有样本。TLA还提供了评估流程和团队效率的不同指标，以及对患者检测结果的其他解读，包括抗生素耐药性的趋势分析。实施和应用临床微生物学实验室如今面临着许多不同的挑战，包括需要：（1）提高效率（即提供更具成本效益的诊断）；（2）提供早期结果（即缩短TAT）；（3）遵守要求越来越高的认证要求（即提供可追溯性和文件，以评估整个诊断过程的质量）；（4）应对越来越多的耐多药生物带来的挑战（即快速提供更全面的AST，但在需要时）。大多数这样的挑战都可以通过TLA得到显著解决。然而，TLA的成功实施需要：（1）传统工作流程的重大变化；（2）强大的领导技能，以及项目所有合作者的团队合作；（3）在整个实验室转型期内技术人员的个性化支持。减少临床样本周转时间在过去20年中，医疗行业投入了大量资源来开发准确和快速的检测方法，以减少临床医学中的样本周转时间（TAT）。随着抗生素耐药性的不断增加，需要快速地给出应对策略，以便对患者能够及时治疗。在全实验室自动化（TLA）出现之前，主要用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定细菌、分枝杆菌、酵母和霉菌，目前该方法取代了常规的生物化学实验检测方法。与用于微生物鉴定的常规方法或分子水平分析相比，MALDI-TOF-MS具有以下三个优点：（1）周转时间快（2）样本量要求低（3）试剂成本适中。使用MALDI-TOF-MS能够准确、快速地鉴定微生物，有助于快速提供治疗方案，特别是意外感染了病原体时，该方法特别有效。因此，这项技术使抗菌治疗、感染预防和控制措施能够得到有效的实施（Figure 4A/B）。纸片扩散试验实现检测自动化全实验室自动化（TLA）在许多领域得到推广应用，抗生素耐药性检测全自动化解决方案的实施，是全实验室自动化成功案例之一。在一项研究中，Copan为自动纸片扩散AST开发了一种新模块，包括一个可容纳50个抗生素药筒的转盘。开发这个新模块的明确目标是，通过增加第二条传送带，最大限度地减少AST线上的工作流程瓶颈。这个新的全集成自动化系统能够实现：可以使用至少四个不同的菌落制备接种悬浮液，以筛选不同的抗性模式；在特定平板的整个表面上自动接种细菌细胞悬浮液；根据预设置的面板分配抗生素盘；将培养基运输至培养箱；在设置的时间点获取平板的高质量数字化图像；最后获得并解读所有受试抗生素的抑制圈直径大小。通过纸片扩散来评估AST全自动解决方案的准确性时，需要遵循的基本规则可以总结为两点：（1）评估这种新方法检测最重要的耐药机制，应包括具有代表性的非重复临床菌株数量，以及这些菌株对不同类别的抗生素表现出耐药模式；（2）为了计算耐药的百分比误差，分析中还应包括大量非重复敏感临床菌株。革兰氏阴性菌常规AST在过去十年中，研究表明，厌氧菌中抗生素耐药性稳步增加了。面对这样的现状，对厌氧菌进行常规耐药性试验十分必要。作为全自动纸片扩散的补充，通过与目前的常规方法ATB ANA® 测试法（BioMérieux）进行比较，在大量临床相关厌氧菌株上测试了Thermo Scientific™ Sensititre™ 厌氧菌MIC平板的准确性，两种方法之间的一致性达到95%。通过整合靶向治疗中使用的最新分子，为多重抗性革兰氏阴性菌设计了一种新的平板。该平板由Thermo Scientific™ 制造并使用ATCC参考菌株进行验证。目前只要AST纸片扩散检测到设定的抗性模式，这个平板就可以进行下一步测试。正如自动AST测试所研究的那样，这一设计能够通过系统地针对可疑菌株，以合理的成本有效监测抗生素耐药性。Sensitre® 敏感性系统采用一种固体平板设计方法。该方法可以测试定性（敏感或耐药）和定量最小抑制浓度（MIC）试验。人工制备菌株悬浮液，并使用Sensitre Autoinvocator® /AIM® 自动接种平板。固体平板上添加了为测试的微生物选择的连续稀释的抗菌剂。接种培养后，使用Sensitire® 手动查看器读取结果。通过浑浊或底部细胞沉积来测试细菌生长情况。最小抑制浓度（MIC）是指抑菌试验中可见细菌生长的最低药物浓度。在过去的几十年里，多重耐药的革兰氏阴性细菌感染已经成为医学和全球卫生领域关注的主要领域之一。为了优化治疗方案，并应对不断增加的产碳青霉烯酶的革兰氏阴性细菌，使用最有效药物的添加使用最小抑制浓度（MIC）已变得至关重要。通过对多重耐药（MDR）菌株进行靶向AST测定，同时结合治疗药物监测（TDM），可以得到最有效的治疗方法。由于琼脂扩散不能提供MIC，如在培养MDR菌株或厌氧菌时，Sensititre® 是对全自动AST纸片扩散的补充。结论全实验室自动化（TLA）现已被证明能够有效进行临床微生物学检测，可以克服微生物实验室培养检测所面临的多样性和复杂性。能够实现对各种指标（临床应用、检测效率、可追溯性、质量管理和TAT）进行监测，通过纸片扩散能够实现AST的完全自动化。人工智能（AI）的实施不仅可以快速识别细菌生长（检测），还可以区分细菌形态（分割）和统计相应的菌落（计数），这将进一步增强微生物检测工作流程，并能够确保试验的可重复和可预测。现在需要进行仔细的验证研究，以便使用人工智能自动处理阴性培养物，并在无需人工干预的情况下自动获取试验结果。全文完信息来源：Cherkaoui A, Schrenzel J. Total Laboratory Automation for Rapid Detection and Identification of Microorganisms and Their Antimicrobial Resistance Profiles. Front Cell Infect Microbiol. 2022 Feb 3 12:807668. doi: 10.3389/fcimb.2022.807668.文献来源 | 本文由中科院上海生命科学信息中心与上海曼森生物合作供稿内容审核 | 曼森生物郝玉有排版编辑 | 曼森生物刘娟娟

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1882年3月24日是著名德国科学家罗伯特科赫在柏林宣读发现结核菌的日子。在1982年纪念科赫发现结核菌100周年时，世界卫生组织(WHO)和国际防痨和肺病联合会(IUATLD)共同倡议将3月24日作为“世界防治结核病日”，以提醒公众加深对结核病的认识。2021年3月24日是第26个世界防治结核病日，今年我国的宣传主题是：“终结结核流行，自由健康呼吸” 结核病(Tuberculosis，TB)是常见并可致命的一种传染病，由结核分枝杆菌感染引起，主要通过空气传播。结核病困扰人类已经有成千上万年的历史。科学家们在9000年前的以色列人遗骸和2000年前的埃及木乃伊上都发现了肺结核感染的痕迹。如今，这种病每年仍导致大概150万人死亡，多于其他任何一种传染病，是目前全球面临的重大公共卫生问题之一。 2020年10月14日，世界卫生组织（WHO）正式发布了最新的全球结核病年度报告。报告估计过去一年全球新发结核病患者仍有1000万，其中32%为女性，12%为15岁以下儿童，全球因结核死亡患者约141万。大多数结核病病例集中在东南亚（44%）、非洲（25%）和西太平洋（18%），而东地中海（8.2%）、美洲（2.9%）和欧洲（2.5%）占比较小；三分之二的结核患者来自8个国家：印度（26%）、印度尼西亚（8.5%）、中国（8.4%）、菲律宾（6.0%）、巴基斯坦（5.7%）、尼日利亚（4.4%）、孟加拉国（3.6%）和南非（3.6%）。中国新发患者数约83.3万，居全球第三位，仅次于印度和印度尼西亚。防治肺结核的工作依旧严峻。 早期快速确诊及治疗是控制结核病传播的关键，目前肺结核的诊断主要依靠患者症状、胸部影像学检查及痰涂片抗酸染色和痰MTB培养。然而，肺结核患者症状及影像学检查往往缺乏特异性，痰涂片抗酸染色法检查敏感性和特异性都很低，很多时候会导致漏诊；痰MTB培养耗时长，以上检测手段难以满足早期快速诊断肺结核的要求。随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子诊断方法被应用于结核病临床诊断。2017 年我国颁布的《“十三五”全国结核病防治规划》中明确提出分子生物学检验阳性可以辅助确诊肺结核。 分子生物学诊断 结核病分子生物学诊断方法主要分为：①实时荧光定量PCR 检测②恒温扩增检测③基因探针（基因芯片）检测 实时荧光定量PCR 通过监测荧光信号实时检测结核菌的特异基因及耐药相关基因 单核苷酸多态性（SNP） 位点，可以在 2 小时内检测样本中是否存在结核分枝杆菌以及是否耐药，是目前最快的结核病分子诊断技术之一，并且该方法操作简便、检测准确性高（敏感度 88％，特异度 99％）、污染几率小，不足之处是价格昂贵，并且目前仅能针对利福平耐药相关 rpoB 做出检测，能够检测的耐药相关基因及位点较少。2010年12月WHO批准了利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术( Xpert MTB /RIF)的应用，该技术被WHO誉为结核病诊断中革命性的突破。 恒温扩增 利用链置换型 DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温条件下对目标基因进行快速扩增反应。该方法可用于涂阴结核病的诊断，检测灵敏度在 50％～80％之间，并且恒温诊断方法对仪器的依赖程度小，试剂成本低，非常适用于基层结核病的检测，代表方法：loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP Eiken Chemical, Tokyo, Japan)。但是该方法容易产生假阳性结果，实验室检测时需要注意分子气溶胶的产生。 基因探针（基因芯片）检测 分为扩增和检测两步，首先对特异的片段进行 PCR 扩增，然后检测扩增后片段是否与结核分枝杆菌（MTB）检测探针或者耐药检测探针结合。其特点是可以区分结核病与非结核病，检测通量高，并且可以在 5～8 小时内检测是否为耐多药结核病（MDR-TB），代表方法： line-probe assays (LPAs GenoType® MTBDRplus and GenoType® MTBDRsl, HAIN Lifescience, Nehren, Germany NTM+MDRTB Detection Kit, NIPRO Corporation, Osaka, Japan)，该方法特异度及灵敏度较高（80％～90％）。其缺点是需要开盖操作，容易产生污染，并且操作繁琐，价格昂贵。 未来展望 过去几十年，为预防和治疗结核病及耐药性结核病，全球进行了大量努力。结核病的基础研究、诊断方法和治疗手段都取得了巨大进步。通过此次新冠疫情我们也认识到分子诊断技术推广的必要性，随着人工智能和实验室自动化技术的快速发展，全面实现肺结核自动化分子诊断将是未来的一大趋势。 参考文献：[1]:World Health Organization 2020.[2]:Dorman Se,et al.Performance of Xpert MTB/RIF Ultra and Xpert MTB/RIF for the Diagnosis of Tuberculosis through Testing of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissues.2019,32,(12).[3]:刘权贤等.TB-LAMP、Xpert MTB/RIF及罗氏固体培养在肺结核诊断中的比较.2018,31.（12）.

中国疾控中心结核病控制中心副主任成诗明近日在广州调研期间透露，根据即将出台的结核病防治“十三五”规划要求，到2020年，100%地市级定点医疗机构需具备开展药敏试验、菌种鉴定和分子生物学诊断能力，80%东中部、70%西部县区需具备开展分子生物学检测的能力。　　分析人士认为，目前国内3000多家县级医疗机构几乎没有结核病分子生物学检测能力，对于从事结核病新型诊断技术的企业是难得的机遇。粗略估算，按目前市面分子诊断仪器15万元/台的售价，以及每台仪器平均一年配备1000份试剂的水平来看，一年的市场容量将达到6亿元，且试剂销售在疫苗广泛普及前将持续的增长。　　分子诊断等新技术将推广　　“在2020年前，不会有新的结核疫苗上市，加快推进结核病新型诊断技术是结核病防治重点。同时，新型诊断工具将逐步纳入基层医疗保险范围，并将加快新诊断试剂的供应。”成诗明指出。　　结核病防控一直是医疗领域的难题，主要原因之一在于缺乏精准有效的病原学实验室诊断方法。国内常用的检测方法为痰涂片法，其检出能力仅为15%，容易造成患者漏检 而作为诊断确诊标准的痰培养法检测周期长达月余，可能延误患者最佳治疗时期。　　为此，国家在“十二五”科技重大专项-传染病防治专项中，着力推进结核病新型诊断技术的研发及产业化，力图从源头控制病发范围，大幅降低治疗负担。其中，以迪澳生物为创新代表的恒温PCR扩增技术在实践中受到重点关注。恒温PCR扩增技术具备效率高、成本低、设备简单、操作方便等特点，特别适合于综合医疗机构快速筛查，以及地县级基层疾控单位的推广使用。　　细分领域公司获关注　　迪澳生物作为国家“十二五”传染病重大专项课题牵头单位，自主研发了国内首个获得国家食品药品监督管理局(CFDA)认证的结核分枝杆菌恒温荧光检测系统DeFast.TB，提供由专有仪器、配套试剂组成的结核分枝杆菌复合群核酸检测解决方案。　　2015年，国家卫计委疾病局向全国推荐使用的结核病新诊断技术中，建议将恒温扩增法在县区级以上的疾控系统及各大医院推广使用。另外，公司正在CFDA注册中的结核感染免疫诊断产品SPOTest，临床实验与国际同类产品具有同比竞争性。　　值得关注的是，公司首创的国际领先结核诊断产品也已进入临床验证，有望解决菌阴类结核诊断的世界难题。下一步，迪澳生物将发挥分子和免疫两大研发平台的作用，纵向深入结核病耐药诊断和疫苗研发，横向开发其他类重大传染病检测技术，力争成为传染病IVD诊断行业领导者。　　据悉，公司结核分枝杆菌恒温荧光检测系统DeFast.TB已签约终端客户共28家。其中，省、市级专科医院10家，省级疾控4家，共600多台仪器进入各省2016年疾控集中采购计划。公司目前已启动A轮融资计划，预计2016年销售额将达到4000万元，将实现净利润1000万元。

随着精准医学的发展、多组学研究上的突破，临床质谱迎来了发展机会。仪器信息网特别策划“临床质谱技术及应用进展”专题，聚焦临床质谱新产品新技术及相关临床领域的最新应用，以增强业界相关人员之间的信息交流，展示更丰富的临床诊断质谱产品、技术解决方案。基因检测技术在临床诊断与用药指导等方面应用越来越广泛，尤其是这次新型冠状病毒肺炎疫情防控中，核酸检测起到了至关重要的作用。随着临床医学的快速发展对基因检测技术提出了新的需求，特别是从单基因位点向多基因多位点发展。质谱仪根据核心部件质量分析器的不同可以分为飞行时间质谱仪、四极杆质谱仪、离子阱质谱仪、离子回旋共振质谱仪、磁质谱仪等类型。其中二十世纪八十年代出现的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术是利用电场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测的技术，具有前处理要求低、高灵敏度、高特异性、高通量、多位点、低成本的特点，打破了以往质谱仅可进行小分子物质分析的传统，使得核酸、蛋白质、多肽等生物大分子也可应用质谱进行研究，极大推进了基因组学、蛋白质组学的发展，并且给生物领域及医学领域带来了革命性的突破，由此其奠基人田中耕一和约翰贝内特芬恩于2002年获得诺贝尔化学奖。MALDI-TOF MS可分为微生物蛋白质谱与核酸质谱。微生物蛋白质谱技术发展相对成熟，在临床上已经应用于细菌/真菌鉴定，但是仍然需要培养，检测周期过长（2-40天），阳性率偏低，而且无法检测耐药。而核酸质谱要求准确度达到±3Da、分辨率达到750和稳定性达到±2Da，还需要高效固态芯片作为离子源、分子量及检测溯源体系，因此直到2014年美国Agena Bioscience公司才首次将MALDI-TOF MS用于核酸检测，该技术结合了质谱技术的高灵敏度、高特异性和芯片技术的高通量和低成本特性，能够精确分辨A、T、C、G碱基之间的质量差异（≤16Dalton），适用于多种基因分型，包括基因突变、拷贝数变异、插入/缺失等类型检测，仪器在美国经FDA批准上市，并应用于新型冠状病毒检测、精神疾病用药指导、肿瘤液体活检等临床领域。目前国内基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术的应用开发仅限于微生物鉴定，未见进入核酸检测应用领域。迪谱诊断自主研发的飞行时间核酸质谱获得国内首台通用型核酸质谱医疗器械注册证及国内首台(套)重大技术装备认定。目前DP-TOF核酸质谱仪器灵敏度可达到15fmol，采用寡核苷酸标准参考品进行测定，分辨率可达到900以上，是检测几十到几百个基因性价比最高的中通量基因检测设备。其应用范围覆盖生物学的各个领域，慢病精准用药、感染精准防控、肿瘤精准治疗、遗传病精准筛查领域和临床转化医学研究等。践行国家“健康中国”战略，服务社稷民生，围绕慢病管理、癌症防治、传染防控、出生缺陷重大难题，迪谱致力提供临床可及的高端技术“产品+服务“一体化解决方案。一、构建中国心血管疾病精准用药管理模式。据《中国心血管病报告2019》显示我国心血管疾病总患病人数高达3.3亿。心脑血管疾病以其高发病率、高死亡率、高复发率和高社会负担，已成为威胁我国国民健康的罪魁祸首，每年约53457例患者因心血管药物不良反应接受紧急治疗。其中遗传基因是造成用药效果和不良反应个体差异大的重要原因，研究者也发现同一药物在不同个体的效果和毒副作用的差异巨大。因此随着药物基因组学的发展，新的生物标记物的发现，循证医学证据的完善，越来越多的研究结果将会应用于临床，为个体化药物治疗提供更确切的依据。以冠心病为例，临床治疗选择减轻症状、改善缺血的药物和预防心肌梗死、改善预后的药物。两类药物联合使用，冠心病常用药物主要包括抗血栓(华法林、氯吡格雷)、抗心绞痛（硝酸甘油）、降脂(他汀类)、降血压(β受体阻滞剂、ACEI、ARB)、降血糖(磺酰脲类)等。利用飞行时间核酸质谱，一次检测可以解决棘手问题与联合用药难题，准确、经济、高效、安全。二、大规模推广结核耐多药新技术的应用研究。2018年国家卫计委提出卫生计生2018年重点任务之一要启动实施“中国2035终结结核病大行动”。然而结核病流行长达5000多年，号称“世界第一大传染病”，并没有那么容易被消灭，结核病仍然是当前全球感染数、发病数、死亡数最严重的疾病之一。目前核酸检测结核分枝杆菌已广泛应用于临床实验室，此外核酸检测也已大量用于结核杆菌的耐药性分析。但是当前已上市核酸检测产品只能检测有限的几种抗结核药物，远无法满足临床对于快速诊断耐药结核病尤其是耐多药结核病的需求。开发结核分枝杆菌鉴定和耐药基因检测(利福霉素类/异烟肼/乙胺丁醇/吡嗪酰胺/链霉素/氟喹诺酮类)，可以实现在6-8小时内一次准确的完成结核杆菌复合群鉴定以及6类药物的耐药基因检测。三、临床转化大样本量验证的重要工具。飞行时间核酸质谱作为国际公认SNP、DNA甲基化分析的黄金标准，从疾病发现到大样本验证、转化应用、商品化试剂盒均可利用此平台开展大样本筛查验证研究，例如肿瘤易感、心血管易感、易栓症等大队列人群数据，发现中国人群常见的易感基因频率、热点突变和差异表达水平，建立中国人群特异数据库与快速试剂开发转化，实现健康管理综合干预目标。迪谱诊断以客户为中心构建临床科研合作网络，建立前沿技术设备研发基地、新产品试剂研发基地、重大慢病、感染、肿瘤、妇幼科研基地，秉持转化创新，服务临床。四、自主深耕，打造应用合作生态圈。DP-TOF飞行时间质谱检测系统 (浙械注准20202220910作为)与配套试剂用于生命体来源（如血液、体液、组织）样本中已知核苷酸的检测。在药物基因组（冠心病、高血压、脑卒中、精神神经类等疾病、抗栓/抗凝用药指导）、肿瘤（肿瘤化疗用药、肺癌、结直肠癌、甲状腺癌等）、感染（病原体多重、结核耐药等）、出生缺陷（遗传性耳聋、地贫、G6PD、SMA等）、健康管理（肿瘤风险、心血管疾病风险、遗传性易栓症、营养代谢、体重管理）临床应用上自主深耕细作，广泛建立合作。 未来希望与各领域专家、生物企业开展合作，基于此款通用型核酸质谱仪，开发更多满足临床需求的检测方案，共同打造核酸质谱的应用生态圈。根据国外成熟的质谱仪市场发展趋势可见，随着我国经济的不断发展，质谱仪因其高特异性、高灵敏度的优势将会不断得到市场认可，应用领域涉及经济社会各个环节，对其他产业的发展具有巨大的带动作用，在各大检测领域都将会有更加广泛地应用，包括临床机构检测、疾控中心检测，农林畜牧业检测，海关检疫检测等。随着积极推动核酸质谱诊断项目的临床应用指南、专家共识以及行业技术应用标准的建立，迪谱有信心和业内专家以及同仁共同推进质谱技术研发、临床应用以及产业化发展。供稿人：浙江迪谱诊断技术有限公司

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什么是结核病？结核病，俗称“痨病”，是由结核分枝杆菌感染人体后引起的慢性传染病。结核分枝杆菌可以侵犯人体任何部位，人体除了头发和指甲外都可发生结核病。当结核分枝杆菌侵犯肺脏的时候，称为肺结核（俗称“肺痨”）。肺结核占各种类型结核病的80%以上，是迄今为止导致死亡人数最多的传染病。肺结核也是当前我国严重危害我国人民群众身体健康的重大传染病，被我国定为乙类法定报告传染病。 结核病的危害根据2020年WHO发布的全球结核病报告显示，结核病作为致死率最高的十种疾病之一，在2019年全球新发结核病患者数达到约996万，我国新发患者数达到83.3万，现存活动性肺结核的患者约有600万人，其中全球结核潜伏感染人群接近20亿，造成全球约140万患者的死亡［1］。2019年，我国结核病发病率为58/10万人。值得注意的是，在2019年感染结核病的人群中，87%是来自全球30个结核病高负担国家，而占三分之二的患者来自8个国家，包括中国（8.4%，第三位）［2］。肺结核会严重影响患者个体的身体健康。得了肺结核如发现不及时，治疗不彻底，会对健康造成严重危害，甚至引起呼吸衰竭和死亡，给患者和家庭带来沉重的经济负担。肺结核病人如不规范治疗，容易产生耐药肺结核。病人一旦耐药，治愈率底，治疗费用高，社会危害大。除此外，肺结核通过呼吸道传播，传染性强，危及他人的身体健康。一名涂阳肺结核患者，如不进行治疗，一年平均可以感染10-15名健康人。 结核病的传播途径及传染性肺结核的传染源主要是痰中带有结核杆菌的肺结核患者，尤其患者在未获得有效治疗前，细菌生长活跃，最具传染性。结核杆菌主要以飞沫的形式通过呼吸道传播，患者咳嗽，打喷嚏，大声说话和唱歌均能产生含菌飞沫，其中打喷嚏产生含菌飞沫量最多，咳嗽次之，健康人可因吸入含菌飞沫感染。结核病还可通过尘埃（带菌尘埃），消化道，极少数通过受损皮肤，黏膜接触等传播。 结核病的临床症状［3-4］结核病是慢性传染性疾病，其临床症状多种多样，轻重不等，结核病的症状和其他疾病一样大多是非特异性的。全身症状部分结核病患者或在结核病早期没有明显症状或仅有轻微症状，一般全身症状比局部症状出现得早一些，早期比较轻微，不容易发现。全身症状包括：A. 乏力、倦怠、全身不适较常见，容易烦躁，可出现心悸、食欲减退、体重下降、女性患者可出现月经不正常等；B. 发热：是肺结核常见的早期症状之一，多见于下午或者傍晚，第二天早晨降至正常，多数表现为低热，温度在38℃以下，也有少部分患者出现高热，是由于病灶扩散速度快或者病情进展快，发热明显，可达39-40℃；C. 盗汗：也多发生在重症患者，入睡后出汗，醒来后出汗停止，严重者衣服均湿透；D. 其他全身症状如食欲不振，消瘦和体重减轻，女性可出现月经不调或者闭经等。 局部症状结核病随着发生的部位不同，局部症状也不一样。 结核病的确诊手段［3-4］肺结核的诊断是以病原学（包括细菌学、分子生物学）检测为主，结合流行病史、临床表现、胸部影像、相关辅助检测（γ-干扰素释放试验）及鉴别诊断等，进行综合分析做出判断。 细菌学检查涂片显微镜检查：临床标本涂片染色后显微镜下直接寻找、观察病原菌，是结核诊断和发现传染源的主要手段。分枝杆菌培养和菌种鉴定：在人工培养基分离菌落，或检测分枝杆菌生长的代谢产物来检测目标病原菌，是结核诊断的金标准。 子生物学检查分结核分枝杆菌核酸检测：通过分子扩增手段检测临床标本中特异性的靶标，从而检测是否存在分枝杆菌。该方法灵敏度高、特异性强，快速，一天内即可获得检测结果。（如迪澳生物DeFast.TB® ） 病理学检查常规病理学诊断方法：大体观察、组织学观察（HE染色）、细胞学检查。免疫组织化学法：利用抗原-抗体的特异性结合反应原理，以抗原或抗体来检测和定位组织中的目标蛋白的一种技术。 DeFast.TB® 结核分枝杆菌复合群核酸检测解决方案预期用途结核病的确诊技术检测原理通过Bst聚合酶及特异性引物在恒温（63℃）条件下对样本中结核分枝杆菌核酸片段(IS6110)进行特异性扩增，扩增产物（DNA）与核酸染料结合后发出荧光信号，通过恒温荧光扩增检测仪实时读取荧光信号，根据仪器给出的扩增曲线和出峰时间判断结果。实验流程实验操作流程↓结果判读：自动判读、出报告。自动判读扩增曲线应用价值结果准确，辅助制定治疗方案灵敏度高，病原学阳性率为64%；特异性强（96.53%），与痰培养相当样本种类多样化，满足临床多样化的送检需求痰液（包括血痰）、肺泡灌洗液，支气管冲洗液、胸腹水、脓液、脑脊液、肉芽组织、腹腔积液、盆腔积液、输卵管积 液、关节积液、骨腔积液、尿液、血液等操作简便，快速获得检测结果痰液样本无需特殊处理，耗时短，70min即可获得检测结果仪器通量高、便携检测通量高（1-48个）、仪器轻巧、携带方便，移动后无需进行荧光校准，直接用于检测样本要求 参考文献：[1] World Health Organization.Global tuberculosis report 2020[R]. Geneva: WHO,2020.[2] 张慧，赵雁林等.2015-2019年全国肺结核报告发病情况分析.中国防痨杂志2021年2月第43卷第2期.Chin J Antituberc,February 2021,Vol,43,No.2.[3] 唐神结，高文 . 临床结核病学（第二版）. 北京：人民卫生出版社，2019：ISBN 987-7-117-28404-2[4] 唐神结，李亮，高文，许绍发 . 中国结核年鉴（2018）.北京：人民卫生出版社，2019：ISBN 978-7-117-28470-7

背景近年来，多重耐药性 (multi-drug resistance, MDR) 的出现已成为多国关注的公共卫生问题，作为细菌变异及过度使用抗菌药物的结果，它的主要机制是外排膜泵基因突变，其次是外膜渗透性的改变和产生超广谱酶。最常见的耐药菌为革兰阳性菌MDR-TB和MDR-MRSA，以及在ICU中常出现的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌。统计数据显示，血液感染细菌铜绿假单胞菌与30%至50%的高死亡率有关。正因为如此，迫切需要开发新的抗菌药来对抗感染。数字PCR 技术作为一项高灵敏性、高精确性、绝对定量技术，可有效助力病原微生物耐药性分析及新药研发等应用。QIAGEN的QIAcuity数字PCR系统基于纳米微孔板技术，采用集成式一体化设计理念，支持多通道检测，可实现高通量、高灵敏性检测。接下来小编带您一起解读QIAcuity数字PCR系统在该研究领域的实际应用案例。本案例中，来自英国朴茨茅斯大学、泰国纳瑞宣大学和披博宋甘皇家大学的研究人员基于QIAGEN QIAcuity dPCR平台，建立了多重反转录数字PCR (mRT-dPCR)，深入研究了氢奎宁（抗疟疾药物）的天然化合物对临床常见微生物的抗感染机制。方法与结果研究者首先在前期细菌实验中发现氢奎宁可以抑制和杀死几种临床重要细菌，即金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌以及常见的多重耐药病原体铜绿假单胞菌。通过进一步研究，作者发现氢奎宁对铜绿假单胞菌的杀菌浓度是其他菌株的2-4倍，且在4-8h内对铜绿假单胞菌不仅有抑菌杀菌作用，还存在呈剂量依赖性。为了进一步验证氢奎宁对多重耐药病原体铜绿假单胞菌的抗菌和耐药机理，即氢奎宁是否能够在铜绿假单胞菌中诱导其主要的外排泵类型，即耐药节结化细胞分化家族 (RND) 相关基因的异常表达。作者利用QIAcuity dPCR系统，建立了多重数字PCR (mdPCR) 和多重反转录数字PCR (mRT-dPCR) 两套研究路线，成功用于快速检测多种临床相关细菌中是否存在mexB、mexD和mexY这三种关键基因，并对其表达量的变化也进行了进一步的分析。结果表明，在0.5X MIC氢奎宁作用1h后，mexD和mexY的表达量分别提高了20.8±4.31和11.8±5.01倍，而相比之下mexB的表达水平则相对稳定（1.6±0.15倍）。这些数据表明，在P. aeruginosa ATCC27853菌株中，虽然氢奎宁诱导了MexCD-OprJ和MexXY外排膜泵的上调，但MexAB-OprM外排膜泵则并没有上调，意味着铜绿假单胞菌是通过上调MexCD-OprJ和MexXY外排膜泵的水平而诱导了一种保护机制来避免氢奎宁引起的细胞应激，进而产生一定程度的耐药性。结论研究者基于QIAcuity dPCR系统建立的多重反转录数字PCR (mRT-dPCR) 技术路线，阐明了低剂量的氢奎宁可诱导铜绿假单胞菌特异性RND型外排膜泵基因表达水平变化，进而引起了一定程度的耐药性。研究者也表示将进一步研究氢奎宁的抗菌活性和副作用，揭示氢奎宁的分子靶标，从而对氢奎宁在临床中的使用提供更多指导。 参考文献：Hydroquinine Possesses Antibacterial Activity, and at Half the MIC, Induces the Overexpression of RND-Type Efflux Pumps Using Multiplex Digital PCR in Pseudomonas aeruginosa. Nontaporn Rattanachak, Sattaporn Weawsiangsang, Touchkanin Jongjitvimol, Robert A Baldock and Jirapas Jongjitwimol 1,4,5,END

为进一步加强医疗质量安全管理，持续提升医疗质量安全管理科学化、精细化水平，构建优质高效的医疗质量管理与控制体系，国家卫生健康委制定并发布了10项《2021年国家医疗质量安全改进目标》。在此基础上，医政医管局组织各专业国家级质控中心围绕本专业医疗质量安全的薄弱环节和关键点，提出了2021年质控工作改进目标（共33项）。其中，在感染性疾病专业提出了“提高呼吸道病原核酸检测率”的目标。 肺结核：经呼吸道传播的乙类传染病结核病是由结核分枝杆菌感染人体后引起的慢性传染病，人体除头发和指甲外都可以发生结核病。其中，肺脏是最常被侵犯的器官，如被侵犯就叫肺结核。肺结核是我国法定报告的乙类传染病，其主要通过呼吸道传播，1名传染性肺结核患者若不加以治疗，1年平均可感染10-15名健康人。根据世界卫生组织2020年10月14日发布的最新全球结核病年度报告，我国2019年新发结核病患者数约83万例，位居全球第三位；利福平耐药结核病患者数约6.5万例，占全球利福平耐药肺结核患者的14%，位居全球第二位，是全球结核感染负担最重的国家之一。 结核病的早期快速诊断是预防和控制结核病蔓延的关键《“十三五”全国结核病防治规划》要求：到2020年全国结核病患者病原学诊断率达到50%以上，东中部地区和西部地区分别有80%和70%的县（市、区）具备开展结核病分子生物学诊断的能力。为进一步遏制结核病流行，推进健康中国建设，2019年5月国家卫生健康委、国家发展改革委、教育部、科技部、民政部、财政部、国务院扶贫办和国家医保局联合制定了《遏制结核病行动计划（2019—2022 年）》，并指出：结核病的早期快速诊断是预防和控制结核病蔓延的关键。 结核分枝杆菌核酸检测阳性为确诊病例2017年11月，新的《肺结核诊断》行业标准正式发布，明确将结核分枝杆菌核酸检测阳性列为确诊病例，该标准的发布为结核病的确诊提供了新的手段。2020年全球结核病报告数据显示，2019年我国结核病病原学阳性率为47%，在原有的传统痰涂片和痰培养确诊病例的基础上有了大幅提升。 迪澳恒温核酸检测系统优选方案该系统是“十二五”国家科技重大专项成果转化产品，主要通过bst聚合酶及特异性引物在恒温条件下（63℃）对标本中结核分枝杆菌复合群核酸片段进行特异性扩增，扩增产物（dna）与核酸染料结合后发出荧光信号，通过恒温扩增荧光检测仪实时读取荧光信号，根据仪器给出的扩增曲线和出峰时间判断结果，可以快速对人痰标本中的结核分枝杆菌复合群dna进行定性检测。其优势在于：l 结果准确敏感性高，病原学阳性率为64%，远高于痰涂片和痰培养，优于传统pcr；特异性高（96.26%），与痰培养相当。l 安全性高专用收集管全封闭提取痰液样本，无病原体暴露，降低感染风险。l 操作简便，结果快速痰液样本无需特殊处理；耗时短，70min即可获得检测结果。l 通量高、便携检测通量：1-48个，最多可一次性检测46个样本；仪器轻巧，携带方便，移动后无需进行荧光校准，直接检测。l 智能化自动上传数据，无缝接入医院lis、his系统；自动实时监控、判读、出报告。 小结：此次医政医管局提出“提高呼吸道病原核酸检测率”的目标，重点指出：提高呼吸道病原核酸检测率，助力快速明确病因，合理使用抗菌药物，实现呼吸道传染病的早发现、早隔离、早报告和早治疗。结核病作为常见的呼吸道传染病，其早期快速诊断是防控的关键。迪澳恒温核酸检测系统是国家“十二五”重大传染病专项课题成果，因其“安全、准确、快速、便携、联网”，被纳入国家结核病参比实验室的推荐检测方法，已经服务于全国多个省市的结核病防控工作，并在疫情应急防控中也得到了很好的应用，可有效助力提高呼吸道病原核酸检测率。

鲍曼不动杆菌的治疗和研究进展！鲍曼不动杆菌感染的治疗一直是临床上很大的难题，因为鲍曼不动杆菌极易对各种消毒剂和抗菌药物产生耐药性，对重症患者、ICU病房的患者等威胁很大。MDR-AB（多重耐药鲍曼不动杆菌）、PDR-AB（泛耐药鲍曼不动杆菌）、CRAB（耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌）等的广泛传播更是成了医生和患者的噩梦。 在院内感染中，不动杆菌属的感染占有较高的比例，而在院内提取到的不动杆菌属的菌株，绝大多数为鲍曼不动杆菌。鲍曼不动杆菌为革兰氏阴性菌，故对万古霉素等存在固有耐药，对青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、氯霉素、四环素、diyi及第二代头孢菌素也保持着较高的耐药率。通常情况下，对鲍曼不动杆菌有较强作用的药物主要有抗绿脓杆菌的青霉素类、第三和第四代头孢菌素（主要是头孢他啶、头孢吡肟等）、碳青霉烯类、β-内酰胺类抗生素复合制剂（头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦等）、氟喹诺酮类、氨基糖苷类、替加环素、多粘菌素、舒巴坦等。但是因为近年来抗菌药物的滥用，鲍曼不动杆菌对以上药物的耐药率也在不断上升，氟喹诺酮类、氨基糖苷类等耐药率甚高，碳青霉烯类的耐药率也有上升。 考虑到鲍曼不动杆菌极易对抗菌药物耐药，故用药时应联合用药。常用的方案有β-内酰胺类+氟喹诺酮类、β-内酰胺类+氨基糖苷类等。我个人shouxuan的方案为头孢哌酮/舒巴坦+磷霉素（时间差攻击疗法），也可选择氨苄西林/舒巴坦+环丙沙星等）。 研究进展 随着医学技术的飞速发展，对疾病特别是危重病的救治水平不断提高，广谱抗生素的广泛使用是其重要手段之一。但是，临床治疗中滥用抗生素现象非常普遍，在抗生素的强大压力下，不可避免地产生大量耐药菌株，这些耐药菌株已成为当代医院感染的棘手问题，从本组资料结果显示，鲍曼不动杆菌对亚安培南、美罗培南的耐药率相对较低，原因是碳青霉烯类药物对青霉素结合蛋白（PBPS）亲和力强。　　但仍有少部分鲍曼不动杆菌对其耐药，原因可能是其能产生一种能水解碳青霉烯类药物的β-内酰胺酶ARI-I，这无疑是一个可怕的信号。此外，与头孢哌酮/舒巴坦的化学结构不同或鲍曼不动杆菌的多重耐药性表达形式不同有关。而对喹诺酮类抗生素耐药率达60%以上，这可能是近年来喹诺酮类药物的广泛应用引起抗菌药物介导的耐药性基因突变，编码DNA旋转酶的gyra 或gyrb基因发生突变被认为是细菌产生耐药的主要原因。此外，氨基糖苷类抗生素的耐药率皆较高，这可能是本院普遍应用该类抗生素出现的耐药，给临床治疗带来了巨大的困难，因此，应注意各类抗生素的合理应用。 试验结果表明，临床上不动杆菌感染中，鲍曼不动杆菌占绝大多数(75.0%)，其次为醋酸钙不动杆菌、洛菲不动杆菌、琼氏不动杆菌，与有关报道不一致，可能是由于不动杆菌属的命名较混乱，分类原则及鉴定系统不同所致。在4种不动杆菌的鉴定中，41℃培养时生长，苹果酸盐同化试验阳性，可初步鉴定为鲍曼不动杆菌与琼氏不动杆菌，两者的区别在于前者苯乙酸盐同化试验阳性，且氧化木糖，而后者不氧化木糖，且苯乙酸盐同化试验阴性。41℃培养时不生长，癸酸盐同化试验阳性，可初步鉴定为醋酸钙不动杆菌与洛菲不动杆菌，两者区别在于前者枸橼酸盐、苯乙酸盐同化试验均阳性，而后者均阴性。　　从72株鲍曼不动杆菌的来源看，其感染部位分布广泛，如呼吸系统、泌尿系统、伤口、腹腔及神经系统等。其中以呼吸系统感染占多数(54.2%)。不动杆菌是近几年医院内感染出现率较高的菌属，其中鲍曼不动杆菌所引起的感染应引起重视。 2001～2005年对12种抗菌药物的药物敏感监测显示，12种药物对鲍曼不动杆菌的耐药率呈总体上升趋势，耐药率zuijin的IMP，其耐药率从2001年的6.5%上升至2005年的31.7%，头孢菌素类（CAZ、CFP、FEP）的耐药率从2001年的20.0%、38.6%、31.5%上升至2005年的66.7%、72.4%、67.7%；PIP、SXT、ATM、CIP、TZP、LEV耐药率也从2001年的19.6%～60.2%增加到2005年的52.2%～72.1%；耐药率下降的有TOB和GEN 2种药物，其耐药率分别从2001年的62.8%和63.6%下降到2005年的48.2%和45.2%，这可能与这类药物临床上现在不常使用有关。从表3可见，ICU 12种药物的耐药率明显高于非ICU，差异存在非常显著性（P0.01），在ICU耐药率较低的是IMP和TZP，耐药率分别为41.7%和53.3%，除此外其余抗生素的耐药率均在70.0%以上，由此可见，ICU鲍曼不动杆菌耐药现象已十分严重，且表现为多重耐药。这与鲍曼不动杆菌产生多种酶有关：对头孢菌素类的耐药，主要是产超广谱β-内酰胺酶；对亚胺培南耐药，主要与产金属β-内酰胺酶有关；喹诺酮类的耐药主要与gyrA和parC基因突变有关。 综上所述，鉴于近年鲍曼不动杆菌的耐药率有进一步上升的趋势，这应当引起临床医师及微生物界的高度重视。为减少该菌医院感染的发生及多重耐药菌株的出现，我们应对医疗器械进行严格彻底的消毒及对鲍曼不动杆菌进行规范的连续监测，弄清其耐药机制并及时监测其耐药情况。同时，临床医师应重视获得性鲍曼不动杆菌感染，与临床微生物实验室密切协作，加强耐药性的监测，有效预防和控制感染。欢迎访问中国微生物菌种查询网，本站隶属于北京百欧博伟生物技术有限公司，单位现提供微生物菌种及其细胞等相关产品查询、咨询、订购、售后服务！与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

为贯彻落实《遏制细菌耐药性国家行动计划(2016-2020年)》，进一步加强动物源细菌耐药性监测工作，保证动物源性食品安全和公共卫生安全，我部制定了《2017年动物源细菌耐药性监测计划》(附件1，以下简称《监测计划》)，现印发给你们，请遵照执行。有关事项通知如下。　　一、任务分工　　农业部负责组织全国动物源细菌耐药性监测工作。　　各省(自治区、直辖市)兽医行政管理部门负责选定连续定点监测养殖场(猪场、肉鸡场、蛋鸡场或奶牛场各1个，共3个)，保证监测工作的连续性，并协助监测任务承担单位做好屠宰场和养殖场采样工作。在完成国家监测计划的同时，有条件的省份，应制定并组织实施辖区动物源细菌耐药性监测计划。　　中国兽医药品监察所、中国动物疫病预防控制中心、中国动物卫生与流行病学中心和辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心、上海市兽药饲料检测所、河南省兽药饲料监察所、四川省兽药监察所、广东省兽药饲料质量检验所、湖南省兽药饲料监察所、陕西省兽药监测所等10家监测机构承担《监测计划》的检测任务。　　中国兽医药品监察所负责全国动物源细菌耐药性监测的技术指导和数据库建设与维护工作 负责罕见表型菌株的确认、收集和保存 负责各地耐药性监测实验室分离的人畜共患菌(沙门氏菌和弯曲杆菌)的菌种保存，并指导任务承担单位进行沙门氏菌血清分型。　　二、技术要求　　(一)各监测任务承担单位应按照《2017年动物源细菌耐药性监测采样和检测技术要点》(附件2)开展采样、细菌分离和鉴定、耐药性监测和结果上报等工作。　　(二)样品应从养殖场(包括鸡场、猪场、奶牛场)或屠宰场抽取。其中，规模养殖场和小型养殖场应各占50%。　　(三)采样的同时，应做好养殖场用药情况和饲料来源调查，认真填写《采样记录表》(附件3)。对同一养殖场用药情况不同的动物群，应分开填写采样表。　　(四)大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和弯曲杆菌的分离和鉴定按照《动物源细菌分离和鉴定方法》(附件4)或参照相关国际标准执行。　　(五)中国兽医药品监察所负责药敏试验板的质量控制，各监测任务承担单位进行药敏试验时应按照药敏板使用说明书进行检测。药敏试验检测试剂盒(MIC测定)使用方法见附件5。　　三、结果报送　　(一)监测结果电子版和纸质材料并行上报。其中，电子版直接登录中国兽药信息网(www.ivdc.org.cn)，在中国兽药数据库下选择“耐药性监测”数据库，输入本单位用户名和密码，打开后直接输入监测结果。纸质采样记录和药物敏感性试验统计表(附件6)应按统一格式填报。　　(二)各监测任务承担单位的电子版总结于2017年11月25日前上报中国兽医药品监察所。2017年12月31日前，由中国兽医药品监察所完成汇总报我部兽医局。　　联 系 人：农业部兽医局冯华兵　　中国兽医药品监察所徐士新　　联系电话：010-59192829，59191652(传真)　　010-62103658，62103698(传真)　　附件：1.2017年动物源细菌耐药性监测计划　　2.2017年动物源细菌耐药性监测采样和检测技术要点　　3.采样记录表　　4.动物源细菌分离和鉴定方法　　5.药敏试验检测试剂盒(MIC测定)使用方法　　6.耐药性监测结果统计表　　农业部　　2017年2月9日　　附件1-6：2017年动物源细菌耐药性监测计划.doc

包含肺结核细菌的痰液样本遇到CDG-3能够发出荧光。图片来源：Jeffrey D. Cirillo 一种便宜的便携诊断系统可以将辨识肺结核（TB）细菌的时间从几周乃至数月缩减至不足半小时，从而有望帮助医生赶在病人不知不觉将这种疾病传染给他人之前对其展开治疗。 美国加利福尼亚州斯坦福大学流行病学家Jason Andrews指出，导致TB的细菌&mdash &mdash 结核分枝杆菌&mdash &mdash 在实验室中生长得非常缓慢，因此临床医生鲜有选择来确诊这种传染病。他们要么尝试着从一个样本中培养细菌&mdash &mdash 这大约需要2个月的时间，要么尝试着在涂抹于一块载玻片上的痰液样本中寻找这种细菌，而这种技术每次大约会漏掉一半的传染病细菌。 由加利福尼亚州森尼维尔市希菲尔德公司研制的一种名为GeneXpert的方法&mdash &mdash 并于2010年得到了世界卫生组织（WHO）的大力支持，能够在两三个小时内准确测定结核分枝杆菌的脱氧核糖核酸（DNA），但这种方法需要专门的设备以及人员培训，因此对于农村地区或发展中国家而言有些不切实际。 为了加速这一过程，斯坦福大学化学家Jianghong Rao与得克萨斯农工大学健康科学中心微生物学家Jeffrey Cirillo研制了一种名为CDG-3的化学制品，这种化合物在被结核分枝杆菌的一种名为BlaC的酶分解后便会发光。研究人员发现，利用这种方法，他们在1毫升样本中便可以检测到10个细菌。 研究人员随后利用采自得克萨斯州的50个痰液样本对这种方法进行了测试。结果表明，该方法可以正确识别所有在显微镜下可见的结核分枝杆菌样本，同时还能够识别80%不可见的传染源。在对非TB患者进行测试时，CDG-3探针的诊断准确率达到了73%。研究人员在7月3日的德国《应用化学》网络版上报告了这一研究成果。 新泽西州纽瓦克市罗格斯大学传染病专家David Alland表示，尽管这项测试有着令人印象深刻的敏感性，但健康人有27%的几率被误诊为TB的事实意味着它将成为一种最有用的分诊方法。例如，在一些偏远的山村，这种方法可以用来排除那些不需要治疗的人们，以便为剩下的人用更昂贵和精确的方法&mdash &mdash 例如GeneXpert&mdash &mdash 进行更进一步的临床测试创造条件。在2013年发布的一项研究结果中，Alland及其同事通过计算得出，一套假设的分诊系统能够削减30%到40%的开销。 Rao和Cirillo如今正在与得克萨斯州的诊断公司GBDbio合作，开发一种靠电池供电的便携装置。该装置将能够识别CDG-3被分解时发出的荧光。该公司首席执行官Michael Norman表示，他们希望能够在2015年完成研制工作并顺利上市。他预测，一次单项测试将花费5美元，并且用不了30分钟便能够给出诊断结果。 阿尔伯克基市新墨西哥大学毒理学家Graham Timmins说：&ldquo 这里为更快速的分诊测试留下了许多空间。&rdquo 他指出，从健康的角度而言，假阴性（导致感染者被送回家）比假阳性（这会使健康人接受不必要的治疗）更令人担忧&mdash &mdash 尽管过度使用抗生素会导致耐药性。他称赞这篇论文实现了从实验室到临床的&ldquo 巨大飞跃&rdquo ，但他同时表示，该项技术还需要对更加广泛的人群进行测试。 Rao和Cirillo表示，他们正在确认CDG-3的测试结果，并且在更大的人群中进行试验，其中包括一些发展中国家。肺结核是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵及许多脏器，以肺部结核感染最为常见。排菌者为其重要的传染源。人体感染结核菌后不一定发病，当抵抗力降低或细胞介导的变态反应增高时，才可能引起临床发病。若能及时诊断，并予合理治疗，大多可获临床痊愈。

导读自青霉素发现以来，抗生素已经成为人类对抗细菌的最有效武器，挽救了无数人的生命，但随着抗生素使用上的无节制，抗生素耐药性已成为一个重大的全球问题。因此了解微生物对抗生素适应的分子机制成为抗击抗生素耐药性（AMR）的一个重要途径。近日，法国巴斯德研究所的科学家运用转录组测序、naica® 微滴芯片数字PCR等技术证实VchM（霍乱弧菌特有甲基转移酶）参与应对氨基糖苷类抗生素的应激反应，这表明，DNA甲基化在氨基糖苷类抗生素的耐药机制中也发挥着重要作用，该文章刊载于《PLOS GENETICS》。应用亮点：▶ 运用naica® 微滴芯片数字PCR系统分析霍乱弧菌操纵子表达情况。▶ VchM缺失会导致生长缺陷，但却可以使霍乱弧菌对氨基糖苷产生应激。▶ VchM直接调节groES-2（伴侣蛋白编码基因）的胞嘧啶甲基化，从而改变其表达情况，影响霍乱弧菌耐药性。氨基糖苷（AGs，如：妥布霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素和新霉素）是一类针对细菌核糖体小亚基的抗生素，其破坏翻译保真度，增加细胞中错误折叠蛋白质的水平。而本文的研究主要针对霍乱弧菌对其的耐药性机理。科学家们在之前的研究中发现，特定DNA甲基转移酶基因突变（VchM）的霍乱弧菌相比WT具有更强的耐药性，这表明DNA甲基化可能在霍乱弧菌适应AGs中发挥作用。VchM编码一种Orphan m5C DNA甲基转移酶，导致5‘-RCCGGY-3’基序的胞嘧啶甲基化，虽然VchM的缺失会导致生长缺陷，但霍乱弧菌细胞可以在亚致死浓度和致死浓度的抗生素下对氨基糖苷应激。▲图1：霍乱弧菌ΔVchM对亚致死浓度氨基糖苷的敏感性较低。GAs类，TOB（妥布霉素），0.6 μg/ml、GEN（庆大霉素），0.5 μg/ml、NEO（新霉素），2.0 μg/ml；非Gas类，CAM（氯霉素），0.4 μg/ml和CARB（β -内酰胺类西林），2.5 μg/ml对于ΔVchM霍乱弧菌的转录组测序和遗传分析发现，ΔVchM菌株中有4个直接参与蛋白质折叠的基因被上调。包括groEL-1，groEL-2，groES-1，groES-2。通过naica® 微滴芯片数字PCR系统对基因表达进行验证分析发现，ΔVchM霍乱弧菌中groES-2的表达在不同时期均有较大上调。进一步通过缺失验证表明了groESL-2对ΔVchM的抗生素高耐受性的作用。▲图2：ΔVchM菌株中groESL-2操纵子上调(对数生长期，Exp, OD600 ≈ 0.3；指数生长期，Stat, OD600 ≈ 1.8–2.0)在groESL-2区域观察存在四个VchM甲基化基序存在。进一步对基序分析发现，破坏这些基序会导致groESL-2基因表达增加（如图3）。且基序破环越多，则导致的表达上调更加明显。同时，ΔVchM中的groESL-2基因表达一直高于基序突变，表明还存在其他因素与甲基化协同控制groESL-2表达。这些结果表明，在霍乱杆菌中，一组特定的伴侣蛋白编码基因受DNA胞嘧啶甲基化的控制，将DNA甲基化与伴侣蛋白表达的调节和对抗生素的耐受联系起来。▲图3：在WT中，groESL-2区域的VchM位点突变导致基因表达增加法国巴斯德研究所是世界上最著名的研究所之一，成立130余年来一直走在世界科技前沿，是微生物学、免疫学、传染病学等学科的起源地，曾开发出狂犬病疫苗、天花疫苗、流感疫苗、黄热病疫苗等多个造福人类的疫苗产品，并培养了10名诺贝尔奖生理学或医学奖获得者，实现研究、教育、健康、创新“四位一体”的研究机构。

导读细菌耐药性的出现严重威胁到全球人类和动物的健康，研究细菌耐药性是微生物研究的重点领域。近年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）已成为微生物鉴定的常规技术，但其在微生物耐药性研究中的应用尚处于起步阶段。替加环素是一种新型四环素类抗生素，被世界卫生组织列为治疗临床多重耐药菌感染极其重要的抗菌药物，被认为是治疗产碳青霉烯酶多重耐药肠杆菌感染的“最后一道防线”。然而，质粒介导的新型高水平替加环素耐药基因Tet(X3/X4)的出现，威胁到替加环素在临床多重耐药菌感染中的疗效，但其潜在机制尚不清楚。使用MALDI-TOF快速地对替加环素耐药基因Tet(X)不同突变体的单加氧产物进行定性分析的方法，大大地拓展了MALDI-TOF在细菌耐药性检测中的应用。细菌耐药性的出现威胁抗生素的疗效 近期，华南农业大学兽医学院孙坚教授团队在微生物领域知名刊物《mSystems》上发表题为《Evolutionary Trajectory of the Tet(X) Family: Critical Residue Changes towards High-Level Tigecycline Resistance》的研究成果。该研究探索了导致Tet(X)功能增强的关键氨基酸变化，并据此阐明了Tet(X)的结构特征和进化路径。通过结构域互换和位点定向突变实验，成功识别了5个导致Tet(X)活性增强的残基突变(L282S、A339T、D340N、V350I和K351E)。结构分析表明突变残基不直接参与底物结合或催化，而是通过间接改变构象动力学影响酶的活性。该研究扩展了对Tet(X)同系物的结构特征和功能演变的认识，为后续特异性抑制剂的筛选和新型四环素类抗生素的开发提供了依据。mSystems，May/June 2021 Volume 6 Issue 3 e00050-21 MALDI-TOF/TOF对不同Tet(X)突变体进行功能验证在BL21(DE3)-pET28大肠埃希菌表达系统中引入Tet(X2)、Tet(X4)和3个定点诱变突变体（L282S、A339T-D340N和V350l-K351E）。将体外纯化后的蛋白（酶）依次加入含Mg2+和NADPH的伊拉瓦环素缓冲液中，反应15分钟后，用质谱法检测药物的单加氧产物峰（图1）。取1 μL的上清溶液点到靶板上，待干燥后，覆盖1 μL CHCA（ α-氰基-4-羟基肉桂酸）基质溶液，待自然干燥后，将靶板送入质谱分析（岛津AXIMA-Performance）。 图1. AXIMA Performance – MALDI TOF/TOF上机流程图 结果显示，在反应15分钟后，所有突变体在m/z 574处都出现了额外的峰，与伊拉瓦环素分子量增加16Da后的单加氧产物的分子量相对应（图2)。结合紫外全波长扫描结果，证明了这几个位点的氨基酸变化仅增加酶的活性而未改变Tet(X)的单加氧特性。图2. 不同Tet(X)突变体的功能验证(a) Tet(X)降解伊拉瓦环素的模型图 (b)基于MALDI-TOF的单加氧产物的质谱测定 AXIMA Performance – MALDI-TOF/TOF 质谱仪AXIMA Performance 作为岛津功能强大的科学研究级MALDI-TOF/TOF仪器，可用于常规分子量检测、微生物的快速鉴定、聚合物分析。还可以多方位的开展高通量蛋白质组学研究，包括多肽、蛋白分子量测定，蛋白鉴定，多肽序列分析，翻译后修饰研究，如磷酸化，糖基化研究等。高通量自动化蛋白鉴定，高分辨双离子门，高能CID技术进行MS/MS，新型曲线场反射器等前沿技术使该仪器成为蛋白质组学研究的有力工具。 图3. 岛津AXIMA-Performance质谱仪 l 真正的高能MS/MS—实验室参考系的碰撞能量为20keV的CID。l 采用革新的离子门技术达到理想的母离子选择分辨率。l 出色的灵敏度-无损失技术保证无MS/MS信号丢失。 专家心声华南农业大学兽医学院孙坚教授在开展细菌耐药性相关的课题研究中，常使用岛津MALDI-TOF质谱仪进行样品检测。孙老师表示，在细菌耐药性研究过程中，岛津公司生产的AXIMA Performance质谱仪能够帮助他们快速地对不同Tet(X)突变体的单加氧产物进行定性分析，该仪器具备操作简单，高通量和准确性高等优点，为该团队的研究提供了有力的帮助，提高了研究效率。 华南农业大学兽医学院孙坚教授 参考文献1.Cui C-Y, He Q, Jia Q-L, et al. 2021. Evolutionary trajectory of the Tet(X) family: critical residue changes towards high-level tigecycline resistance. mSystems 6:e00050-21. https://doi.org/10.1128/mSystems.00050-21.2.Cui Z-H, Zheng Z-J, Tang T, et al. (2020) Rapid Detection of High-Level Tigecycline Resistance in Tet(X)-Producing Escherichia coli and Acinetobacter spp. Based on MALDI-TOF MS. Front. Cell. Infect. Microbiol. 10:583341. doi: 10.3389/fcimb.2020.583341. 本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

导读据中国经济网近日报道，美国FDA针对印度某药企生产的眼药水发出警告，该眼药水可能导致细菌感染，造成失明甚至死亡。该款眼药水是人工泪液，用于润滑眼球。美国疾控中心已确认共有55名患者感染了一种罕见绿脓杆菌耐药菌株，其中5名患者永久性失明，1名患者因血液感染死亡。绿脓杆菌又称铜绿假单胞菌，是比较常见的一种致病菌，常引发呼吸道、胃肠道、尿道等感染。专家认为，本次感染是由于眼睛可以通过泪管与鼻腔相连，致病菌可以从眼睛进入鼻腔，再进入血液等其他体液或组织，从而导致疾病。使用岛津MALDI-TOF微生物鉴定系统，可以快速鉴定绿脓杆菌，守护明亮双眸。认识绿脓杆菌绿脓杆菌又称铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa) ，是一种革兰阴性条件致病菌，抗药性较强，是一种重要的食源性和水源性致病菌，如蔬菜、水果、瓶装水、桶装水中均较常见。同时也是医院内常见的引发慢性感染和急性感染的致病菌之一，严重者可引发患者肺部功能衰竭以及纤维化囊肿。其引起的感染具有进展快、易耐药、病死率高等特点，所以快速准确的鉴定铜绿假单胞菌显得尤为重要。常见检测方法目前，传统的微生物检测方法有生化反应法和16S rRNA序列分析法。生化反应法主要依靠铜绿假单胞菌的生物学特征，通过分离培养结合生化检测等方法对细菌进行鉴定，需经过增菌、选择性分离培养、鉴定等步骤，不仅操作繁琐、检测时间长、费时费力，且容易延误诊断，难以满足快速诊断及治疗的需要。因此，致病菌的快速鉴定仍是临床微生物检验工作者面临的重要问题。MALDI-TOF质谱法是近年来广泛用于微生物快速鉴定的方法，微生物都有自身独特的蛋白组成, 因而拥有独特的蛋白质图谱。细菌蛋白主要取决于细菌自身的遗传因素, 受培养基、培养时间以及其他培养条件等外部因素的影响较小, 因而具有很好的稳定性和可重复性。常见检测方法比较表岛津解决方案MALDI-TOF微生物鉴定系统优势&bull 数据库使用岛津MALDI-TOF iDPlus Assurance、Confidence、Performance等多款仪器，采集待测微生物的核糖体蛋白质谱图，与数据库中的标准谱图进行匹配检索，可以快速的进行致病菌鉴定。数据库中含有3400种以上微生物的标准图谱，涵盖大部分常见细菌及真菌。同时还支持用户自行追加新的标准谱图，以满足数据库中未收录菌种的鉴定需要。自建库流程图（以绿脓杆菌为例）&bull MALDI-TOF质谱法检测速度快从质谱数据采集到给出鉴定结果最快只需数十秒。日常使用只需要基质、纯水及少量有机试剂，成本低廉。使用MALDI-TOF专用384孔靶板，可以单次高通量检测384个样品，同时靶板可重复使用。鉴定流程图微生物鉴定流程图绿脓杆菌鉴定案例使用MALDI-TOF采集绿脓杆菌质谱图，导入微生物鉴定数据库匹配检索，可以快速检测绿脓杆菌。绿脓杆菌质谱图绿脓杆菌数据库检索结果结语使用岛津MALDI-TOF iDPlus微生物鉴定系统采集菌株的核糖体蛋白质谱图, 与数据库比对后, 可以快速获得绿脓杆菌的鉴定结果，为科研分析或临床筛查提供依据。MALDI-TOF质谱法快捷、准确、成本低，将在致病菌快速鉴定与分析中, 发挥着越来越大的作用。本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

喷雾干燥技术制备利福平可吸入干粉制剂结核是一种全球性健康问题，由结核分枝杆菌从感染者通过气溶胶形式传播到健康人肺部，随后发展为主要局限于肺部的坏死性肉芽肿性炎症，同时也影响人体的任何肺外部位。结核主要影响低收入国家，2018 年造成 1000 多万例新发感染和 150 多万人死亡。治疗药物敏感性结核病的推荐方法是口服多药治疗方案，包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和链霉素作为抗结核分枝杆菌的一线药物。目前的治疗方法面临着挑战，因为治疗方案冗长，药物在位于肺部干酪化病变内的细菌靶点的浓度低，导致细菌杀灭效率低，治疗失败，并出现耐药菌株。通过吸入途径直接给药到肺部局部感染部位可以治疗局部和全身性疾病。抗结核药物肺部给药可以在肺部实现高浓度，从而有效治疗结核病，使用比口服剂量更低的总剂量，同时避免口服途径的全身副作用。利福平是一种非常有效的一线抗结核药物，目前通过口服途径给药，剂量为每日 10mg/kg 体重，推荐的最大剂量为每日 600mg。利福平由于其对结核分枝杆菌的高效杀菌活性，在结核病治疗中发挥着重要作用，多年来一直是抗结核病方案的核心。利福平在人类中的长期使用历史以及有充分记录的安全性和有效性使其成为一种很有前途的肺部给药候选药物，因此，吸入型利福平剂型以前曾被探索用于结核病治疗，涉及：自组装纳米颗粒、脂质体干粉、聚合纳米和微粒到利福平负载胶束等。所有这些制剂都采用喷雾干燥或冷冻干燥来获得可吸入的干粉。这些技术产生的粉末通常是无定型的或含有无定型部分。干粉制剂中的无定型颗粒可以实现难溶性药物的更高溶解度和生物利用度，并且还以其在深肺给药的快速吸收而闻名。在这项研究中，我们报道了使用喷雾干燥技术，改良的溶剂-抗溶剂沉淀结合超声结晶，以制备用于结核病治疗的高剂量利福平无定型和不同晶型干粉可吸入制剂；同时又比较了晶体剂型与非晶形利福平剂型的粉体性能、体外雾化性和雾化稳定性等性质差异。 1实验材料和方法材料：利福平（英国药典，BP 级）、磷酸二氢钠（试剂级）、正磷酸（HPLC 电化学级）、六水硝酸镁、硅油、3 号 HPMC 胶囊、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、制水系统（Millipore miller-q）本实验使用结晶技术和喷雾干燥技术制备了 3 个批次的 4 种不同的可吸入利福平干粉制剂，如表 2。并将获得的粉末制剂收集在螺旋盖玻璃小瓶中，在室温（22±3℃）下存储在干燥器中，然后进行药物含量、粒径、粒径分布、粉末密度和流动性、颗粒形态、颗粒溶解度、XRPD、DSC、TGA 等的粉体表征研究。结晶方法：将利福平添加到玻璃瓶中的结晶溶剂中，并使用磁力搅拌器搅拌 30min，以避免形成团块并使利福平均匀分散。然后将药物悬浮液转移至浴式超声波仪中 30min，温度保持在 25℃ 到 30℃ 之间，使利福平的固态转变来实现结晶。经肉眼观察证实，结晶发生在超声 30min 内。然后，将悬浮液在 25℃ 下以 200rpm 离心 5min 以从溶液（上清液）中分离颗粒（沉淀物）。分离上清液，将沉淀物重新悬浮于去离子水中，涡旋混合 30s，在 25℃ 下以 2000rpm 再次离心 5min。获得的上清液与沉淀物分离，将沉淀物进行干燥得到结晶粉末。喷雾干燥方法采用 BUCHI Mini Spray Dry B-290 以高性能气旋闭合模式连接到 B-295 惰性回路进行工艺研究，具体操作：干燥 90% 乙醇溶液，进口温度 90℃，吸气率为 90%（约35m3/h），进料速率 2.0ml/min，0.7mm 不锈钢喷嘴。出口温度在 67-70℃。▲ BUCHI Mini Spray Dryer B-290 & 295 2结果与讨论工艺回收率和粉体颜色分析：由表 2 可知四种不同工艺制备的粉剂制剂中，每种配方在 3-4g 的批量下，利福平粉末的百分比产率均超过 74.8%，所有配方的百分比产率的标准偏差均＜5.0，表明批次间变化较小。RIF C2、RIF C3 的工艺成品率显著高于 RIF A，说明结晶法的活性原料损耗量低于喷雾干燥法， RIF C1 的工艺成品率高于 RIF A，但差异不显著。干燥的粉末有其特有的颜色，其中 RIF C1 和 RIF C2 在目测上似乎相似，如图 1 所示。干粉颗粒尺寸分布和药物含量分析：表3中列出了不同配方在工艺条件下获得的粒径和药物回收率。喷雾干燥法和结晶法制备的粉末粒径D50都小于5 μm。粉末制备后，立即通过HPLC法分析利福平的平均药物含量值，所有配方中平均药物含量值在99.5%至100.7%之间，完全满足药典规定要求。粉体粒子形态分析：如图2所示，与喷雾干燥的颗粒在形状上呈褶皱，类似于文献中报道的非晶形喷雾干燥利福平颗粒的形态。在喷雾干燥过程中，来自喷嘴尖端的液滴在其表面含有高浓度的溶质，这增加了局部粘度，并有助于形成一定厚度的壳层，溶剂通过该壳层快速蒸发，导致中空颗粒坍塌，最终形成褶皱颗粒。结晶法制备的颗粒 SEM 图像显示出与喷雾干燥颗粒不同的形貌。在结晶法制备的颗粒中，RIF C1 和 RIF C2 呈长方体形状，具有结晶性。通过对两种配方的 SEM 图像的进一步比较，RIF C2 颗粒被拉长，而 RIF C2 颗粒被拓宽。然而，两种制剂中的粒子均呈立方体形状。在另一种通过结晶制备的粉末制剂 RIF C3 的情况下，观察到颗粒呈片状，类似于 Son 和 McConville 在其研究中报道的利福平二水合物结晶颗粒。粉体密度和流动性：通过喷雾干燥和结晶后获得的粉末配方，堆密度和振实密度与供应商的利福平相比显著降低，见表 4。对于相同尺寸的颗粒，较高的流动性可能对应较好的气溶胶性能。因此，在制备粉末制剂中，具有最低振实密度的 RIF A 有望显示出最佳的雾化性能。粉体溶解性：溶解性是可吸入粉末的一个重要特性，可调节吸入后药物的溶出度，肺内停留时间和生物利用度，因此也被用于不同剂型的比较。因此，评估可吸入药物粉末的水溶性是很重要的。在制备的利福平制剂中，与无定型利福平制剂 RIF A 相比，RIF C1 和 RIF C2 在水中的溶解度较低，如表 5 所示。这符合理论概念，即与结晶形式相比，无定型形式以更高的自由能状态存在，因此是一种具有更高水分的亚稳定形式，溶解度比结晶形式更稳定。利福平干粉体外沉积或气溶胶雾化分析：通过喷雾干燥和结晶制备的利福平粉剂在 NGI 不同阶段的体外沉积模式研究如下图 Fig. 7A，计算得到的体外雾化参数如图 Fig. 7B 所示。与结晶粉末相比，无定型粉末在吸入器装置中的滞留较高，这导致结晶粉末与无定型配方相比具有显著较高的发射剂量。无定型与晶形粉末配方之间发射剂量的这些差异支持无定型粒子往往具有较低的发射剂量，这是由于这些粒子中较高的表面静电荷增加了粉末的聚集性和内聚性。然而，一旦颗粒从吸入器装置中释放出来，我们发现无定型颗粒在 NGI 阶段 1 中的滞留量较低，而结晶粉末在阶段 1 中的沉积量较高。所有制剂的细颗粒部分-直径≤5 μm差异无统计学意义。但 RIF A 的 MMAD 值显著低于 RIF C1、RIF C2 和 RIF C3，表明通过喷雾干燥制备的利福平无定型剂型的体外雾化能力总体优于结晶剂型。 3结论在这项研究中，来自新西兰奥塔哥大学的科学家们使用喷雾干燥和结晶技术制备了可吸入的利福平粉末制剂，以分别获得无定型和结晶剂型的利福平，用于大剂量输送到肺部。本研究制备的利福平粉剂有希望用于进一步的体外和体内研究，以研究它们的溶出性能；与肺细胞系的相互作用；以及吸入后的安全性和药代动力学。本研究中报告的用于生产利福平粉末的喷雾干燥技术和结晶方法是新颖和有前景的，为利福平口服制剂的开发提供一些思路。综上，使用瑞士步琦喷雾干燥技术，可以轻松获得 5μm 粒径以内的可吸入粉体，同时步琦具有高功率、强制冷、全回收、平台式的有机溶剂处理惰性循环装置系统，确保安全性，同时具有出口温度和样品温度双重监控设计，保护您的珍贵样品，如需喷雾干燥设备，请联系我们！ 4文献来源A study on polymorphic forms of rifampicin for inhaled high dose delivery in tuberculosis treatment

你有没有想过细菌会发出独特的声音？如果我们能听到细菌的声音，我们就能知道它们是否还活着。当细菌被抗生素杀死时，这些声音就会停止，除非细菌对抗生素产生耐药性。现在，荷兰代尔夫特理工大学法尔博德阿里贾尼课题组研究人员成功使用石墨烯捕捉到了单一细菌的低水平噪音。相关研究发表在18日《自然纳米技术》杂志上。研究团队最初是研究石墨烯的基本力学原理，但他们想知道如果这种极其敏感的材料与单个生物物体接触会发生什么。“石墨烯是碳的一种存在形式，由单层原子组成，也被称为‘神奇材料’。”法尔博德阿里贾尼说，“它非常坚固，具有良好的电气和机械性能，而且对外力也非常敏感。”研究人员对大肠杆菌进行了首次实验。结果发现，当细菌附着在石墨烯鼓的表面时，它会产生幅度低至几纳米的随机振动，研究人员可以检测并听到单个细菌的声音。这种极小的振动源自细菌生物的过程，主要来自它们的鞭毛。为了让人们更好地理解石墨烯上细菌鞭毛的“节拍”是多么微小，阿里贾尼打比方说，如果也让细菌来打拳击沙袋的话，它们至少比人类拳击手的拳头力度小100亿倍。现在，这些纳米级的“节拍”可以被转换为音轨并被听到了。研究人员表示，这项研究对抗生素耐药性的检测具有巨大的意义。实验结果是明确的：如果细菌对抗生素产生耐药性，振动会在相同的水平上继续。当细菌容易受到药物作用时，振动会在一两个小时内逐渐减弱，直到完全消失。由于石墨烯鼓的高灵敏度，只需一个电池就可以检测到这一现象。阿里贾尼说：“未来，我们的目标是优化我们的单细胞石墨烯抗生素敏感性平台，并针对各种致病样本进行验证。从而最终可以作为一种有效的诊断工具包，在临床实践中快速检测抗生素耐药性。”抗生素耐药性是世界各地对人类健康日益增长的威胁。在对抗抗生素耐药性方面，这将是一个“无价的工具”。【总编辑圈点】对微观世界，大多数时候我们还是“只见其人，未闻其声”，用显微镜来观察，用染色法、培养法来判断细菌的生死。这次，科研人员打开了新思路。既然石墨烯是这么神奇又敏感的材料，若细菌在其表面运动，会不会留下“脚步”声？这种力度极其轻微，要有灵敏的材料和“耳朵”才能捕捉。研究人员认为，听到细菌活动的声音，就有了判断细菌活力的新方法。抗生素耐药性是个世界难题，若开发出石墨烯抗生素敏感性平台，则可快速对细菌耐药性进行检验。

加州的一位微生物学家正在参与朝鲜结核病实验室的建设 　　当美国和朝鲜还处于对立状态时，在非营利组织和制药公司的帮助下，美国斯坦福大学的流行病学家、微生物学家来到了朝鲜首都平壤，帮助这个国家建立了第一个结核病实验室。尽管他们需要带上所需要的“每一颗螺母、螺钉和电灯泡”，然而，由世界卫生组织推荐购置的实验室材料让这个实验室成为超现代实验室。 　　美国方面希望，通过这次实验室的建设而构筑的外交联系，能够成为两国科学家之间和实验室之间合作的开始。 　　莎伦佩里是美国斯坦福大学的流行病学家、斯坦福大学领导的加州湾区结核病联盟主席。据新出版的美国《科学》杂志报道，去年11月，她在朝鲜首都平壤停留了10天的时间，和朝鲜公共健康部门的同事肩并肩地工作，包括学生护士到高级医生，目的是帮助这个国家创建第一个能生长分支杆菌属和鉴别耐药物菌株的实验室，分枝杆菌属是导致肺结核的罪魁祸首。 　　11月的平壤，天气异常寒冷，他们每天工作12个小时，穿着厚重的皮大衣，用大锤猛烈敲打破旧的地砖，测试显微镜，安装处理病菌的超现代化橱柜。她说：“我们都全力投入。” 　　佩里和她的同事一直努力让这个合作项目启动。长期以来，美国科学家和他们的朝鲜同事有着断断续续的合作。然而，无论目的多么崇高，除了极少数特例之外，美朝科学家之间的合作项目基本上都是以胎死腹中或放弃而告终。一位资深观察家说，最近几个月，美国部分非营利组织努力与朝鲜同事接触，而结核病实验室的建设则以飞快的速度进行。“援朝美国基督教团体”是位于美国北卡罗来纳州黑山的一个人道主义团体，在过去15年中该团体为朝鲜提供人道主义援助，如今，它与加州湾区的结核病联盟和核威胁倡议(nuclear threat initiative)组织合作。团体主席海蒂林顿说：“我们埋头工作，远离政治。” 　　《科学》的文章指出，合作不是一蹴而就的事。经过多年的经济衰退和20世纪90年代严重的食物短缺，肺结核和其他传染性疾病在朝鲜骤然增加。佩里说，统计数据显示，在2006年至2008年期间，朝鲜结核病从344例增加到1万例。加里斯图里特是斯坦福大学医学院的传染病专家和医生，他说：“这种速度类似于非洲撒哈拉沙漠以南地区(的发病率)。” 　　到目前为止，朝鲜的临床医生们仍然依赖于老化的诊断技术进行检查，但这种技术只能诊断出一半的结核病患者，而且不能发现患者是否感染具有抗药性的菌株。斯图里特说：“抗药性菌株的流行因此会非常高。” 　　迫在眉睫的药物短缺让形势日益严重。在朝鲜，超过90%的结核病治疗药物由全球药品机构提供，该机构是世界卫生组织所属的一个非营利组织，它今年预算即将告罄。与抗击艾滋病、结核病和疟疾全球基金会的一项协议将持续提供这些药物，但消息人士说，这项协议最早也要在明年才能开始执行，留下半年的空档期。“这真是一个噩梦。”林顿说，“你不可能让结核病患者没有药物。”根据与世界卫生组织的协调，佩里希望在今年7月前筹措到100万美元用于购买药品，她和其他人正在努力寻找捐助者。 　　流行病学家路易丝格雷西姆是全球核威胁倡议组织所属的全球健康安全和流行病学组织的主席，他说，未受抑制的流行性结核病将给“中国和其他邻近国家带来直接威胁”。他希望新的合作项目能加强至今仍处于敌对状态的美朝两国间的关系。斯图亚特托森是美国雪城大学麦克斯威尔学院的政治科学家，他领导了一项美国—朝鲜信息交流项目，他说：“我们希望，朝鲜和美国的专家在健康领域的合作和信息分享能建立起双方的信任，以解决紧迫的安全问题。”

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）是人类最常见的慢性感染细菌，它生长缓慢且培养条件苛刻，因此临床合理用药和精准溯源均面临挑战。青岛能源所与中国疾病预防控制中心传染病预防控制所（中国疾控中心传染病所）、青岛市立医院、青岛星赛生物等医产学研联合团队，依托原创的临床单细胞拉曼药敏快检系统（CAST-R），建立了单个细菌细胞精度、“鉴定-药敏-溯源”全流程一体化的H. pylori诊疗技术CAST-R-HP，具有快速病原鉴定、精确药敏表型检测、基于单细胞全基因组支撑耐药机制研究与精准溯源等优势。该成果近日发表于Clinical Chemistry《临床化学》。　幽门螺杆菌单细胞精准诊疗技术CAST-R-HP 　　全球约半数人口感染H. pylori，70%以上的胃癌与H. pylori感染有关，根除H. pylori可显著减少胃癌发生。我国H. pylori感染呈现高感染率（约50%）、高疾病负担、高耐药率和低根除率特征，而低根除率的主要原因为H. pylori菌株耐药严重。因此，建立一个高效的药敏诊断、治疗与溯源体系，对于临床和相关疾病防控至关重要。　　目前H. pylori耐药菌鉴定的临床金标准是内镜检查与细菌培养相结合的药敏检验。由于其生长条件苛刻，分离和培养胃活检标本中的H. pylori通常需7~10天，且难以考察临床样品中“原位”的病原多样性。在获得纯培养后开展的表型药敏实验，同样耗时很长，且技术要求高。而基于基因型的药敏检测方法仅能预测部分已知耐药基因的突变，并存在不同程度的假阴性。目前临床医生主要依赖经验用药而非药敏结果指导性下的精准治疗。但是，随着H. pylori耐药性的不断增加，经验治疗的根除失败率日益严重。　　针对以上瓶颈问题，单细胞中心刘敏、朱鹏飞、张磊等和中国疾控中心传染病所孙路、青岛市立医院王莉莉等合作，建立了单个细菌细胞精度、“鉴定-药敏-溯源”全流程一体化的H. pylori诊疗技术CAST-R-HP。　　首先，他们构建了15种临床常见胃部共生菌的单细胞拉曼光谱（SCRS）参考数据库；进而利用端到端的深度卷积神经网络（DCNN），将拉曼光谱特征提取与分类模型训练过程相融合，有效提升了基于SCRS的病原鉴定准确率。直接从临床胃黏膜样品出发，对H. pylori细胞进行识别和鉴定，准确率达98.5 ± 0.27%。　　进而，研究人员建立了单细胞精度测定代谢抑制程度的H. pylori药敏表型快检技术。与临床标准E-test法相比，17株H. pylori临床分离株对左氧氟沙星、克拉霉素的药敏检测准确率分别为94%和100%。另外，针对7例患者胃黏膜组织样本，通过48~72小时的重水饲喂和药物孵育，无需分离培养，直接测定样品中H. pylori细胞对于左氧氟沙星的药敏性，准确率为100%。　　最后，针对耐药机制研究和全基因组溯源，研究人员从临床样品中直接识别特定药敏表型的H. pylori细胞，进而通过拉曼光镊液滴单细胞分选（RAGE）芯片，完成高均衡性的目标单细胞分选和核酸扩增。拉曼分选后的单个H. pylori细胞，全基因组覆盖度可达99.7%，通过基因型验证了药敏表型。 　　总之，利用CAST-R-HP，从临床样品到药敏结果的完整流程可大幅缩短至3天，而且能在单细胞分辨率、全基因组水平完成耐药机制研究与精准溯源。下一步，研究人员将基于“微生物药敏单细胞技术临床示范网络”（SinCheckNet）”，进一步开发CAST-R-HP系统，拓展其应用，从而为建立单细胞精度的幽门螺杆菌诊疗与疾控体系奠定技术和装备基础。　　该工作由中国疾控中心传染病所张建中研究员和单细胞中心徐健研究员共同主持完成，得到了青岛市立医院消化科董全江主任和单细胞中心马波研究员等的帮助。并获得了中科院先导专项、基金委国家重大科学仪器研制项目、国家科技重大专项项目、广州生物岛实验室等的资助。　　原文链接： https://doi.org/10.1093/clinchem/hvac082　　Min Liu#, Pengfei Zhu#, Lei Zhang#, Yanhai Gong, Chen Wang, Lu Sun, Lili Wang, Rongze Chen, Yuli Mao, Xiaoting Fu, Lili Zhang, Teng Xu, Yuetong Ji, Quanjiang Dong, Bo Ma, Jianzhong Zhang*, Jian Xu*. Single-Cell Identification,Drug Susceptibility Test, and Whole-genome Sequencing of Helicobacter pylori Directly from Gastric Biopsy by Clinical Antimicrobial Susceptibility Test Ramanometry, Clinical Chemistry, 2022.