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[align=center]高效液相色谱切换波长法同时测定不同复杂生物体系中有机酸[/align][b][color=#ff0000]1引 言[/color][/b] 有机酸是众多复杂生物体系中的一类重要功能性成分，其种类和含量高低是评价相应生物体系质量的重要指标，比如葡萄酒中有机酸的含量及种类直接影响葡萄酒感官质量和对其生产工艺条件的控制。不同的生物体系中，有机酸的种类和含量差别很大，因此，如何实现不同复杂生物体系中多种有机酸的准确、快速、便捷、统一测定具有重要的现实意义。 高效液相色谱法(HPLC-UV)是一种检测微量、痕量物质的有效手段，对于多组分体系来说，根据各种组分的最大吸收波长来选择检测波长，使得每种组分都在其最大吸收波长下得到检测是精确测定的关键。目前，利用高效液相色谱法测定复杂生物体系中多种有机酸的方法已经有很多报道，这些方法的检测波长均为物质的非最大吸收波长，且方法的广适性有限。本实验采用高效液相色谱切换波长的方法，进行非线性梯度洗脱，在第14分钟引入15%乙腈并保持2分钟，短时间内完成了对多种有机酸的有效分离，并对葡萄酒、食醋、果汁、和根系分泌物等多个复杂生物体系中的有机酸进行了有效分析，得到了基线平稳、分离效果和峰形皆好的色谱图，该方法便捷、精确，具有较强的广适性。[b][color=#ff0000]2实验部分[/color]2.1仪器和试剂[/b] SHIMADZU LC-2010AHT型配备自动进样装置的高效液相色谱仪，所有部件均由岛津 CLASS-VP 6.12工作站控制，SHIMADZU UV-1700 型紫外分光光度计（日本岛津公司）；MILIPORE ZMQS 5001型超纯水制备仪（法国MILIPORE公司）；。草酸、酒石酸、甲酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、富马酸和丙酸等标样均购自Sigma公司；甲醇和乙腈为色谱纯（美国Fisher公司）；KH2PO4和H3PO4为国产分析纯。实验材料为根系分泌物、市售干红和干白葡萄酒、食醋（老陈醋、白醋和桑葚果醋）、自榨苹果汁和柑橘汁。[b]2.2色谱条件[/b] 色谱柱：SHIMADZU Shim-pack VP-ODS-C18 4.6 mm×150 mm；流动相：A为0.01 mmol/L KH2PO4水溶液，用H3PO4调节pH为2.50，B为乙腈；洗脱程序：0.00~ 14.00 min 0% B，14.00~ 14.01 min 0~ 15% B，14.01~ 15.00 min 15% B，15.00~ 15.01 min 15%~ 0% B，15.01~ 20.00 min 0% B；波长程序：3.35~ 4.48 min 200 nm，4.99~ 5.33 min 200 nm，5.63~ 6.09 min 245 nm，6.10~ 6.96 min 200 nm，9.91~ 12.50 min 200 nm， 17.16 ~ 17.94 min 200 nm，其余时间段的检测波长均为360 nm；流速：0.6 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30℃。[b]2.3对照品溶液的配制[/b] 精确称取抗坏血酸、富马酸12 mg，草酸40 mg，酒石酸、苹果酸100 mg，乳酸、柠檬酸300 mg，丙酸、甲酸、乙酸、琥珀酸500 mg，用流动相定容在25 mL的棕色容量瓶中，此为母液，取适量依次稀释为6个梯度，混标溶液密封保存于冰箱中备用。[b]2.4样品的制备[/b] 将葡萄酒、桑椹果醋、苹果汁和柑橘汁用流动相稀释6倍，老陈醋、白醋稀释10倍过0.45μm滤头后直接进样；根系分泌物用自制连续收集装置于超纯水中收集36h后直接过滤进样。[b][color=#ff0000]3结果和讨论[/color]3.1色谱条件的优化[/b]3.1.1 流动相pH值的选择 选择不同pH值（用H3PO4调节）的0.01 mmol/L KH2PO4溶液作为流动相对各有机酸的分离有很大的影响，考察了pH值分别为2.1、2.3、2.5、2.7、2.9、3.1时各标准有机酸溶液的分离效果，结果表明：随着pH值的增大，各有机酸的保留时间均提前。 2.7≤pH≤3.1时，酒石酸和甲酸、乳酸和乙酸或琥珀酸和柠檬酸不能达到基线分离；pH≤2.5时，各种有机酸均能得到有效分离；pH值为2.1时，丙酸存在严重的拖尾现象，且分析时间过长。综合色谱柱耐受性能考虑，本研究确定pH2.5为流动相最佳pH值。3.1.2 柱温和流速的选择 分别考察了柱温为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃和流速为0.4 mL/min、0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min时对分离效果的影响，发现提高柱温和流速使大部分有机酸保留时间前移，但是柱温对分离效果的影响较流速小得多，流速超过0.8 mL/min时，个别峰出现重叠问题，考虑到快速检测的目的，最终选择柱温为30℃，流速为0.6 mL/min。3.1.3 乙腈添加情况和检测波长的选择 在流动相中添加适量的乙腈等有机溶剂可以使有机酸的保留时间提前且能在一定程度上改善峰形。本实验在不使用有机溶剂的情况下，各种有机酸的色谱峰均能分开，但分析时间较长，尤其是丙酸的保留时间比较靠后，与前一个色谱峰相差8 min多，且考虑到实际样品中可能含有比丙酸保留时间更靠后的物质，为了能够在连续实际测量过程中保证测定结果的稳定准确，对乙腈添加量和添加时间进行了反复考察，发现在第14 min引入15%的乙腈并保持2 min，这样既能使丙酸的保留时间提前，色谱峰形得到改良，也能在20 min内洗脱掉绝大部分保留时间较长的物质，从而提高测定结果的稳定性。 利用紫外分光光度计对11种有机酸标样溶液在190~ 400 nm范围内进行扫描确定各物质最大吸收波长。草酸、酒石酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、富马酸和丙酸的最大吸收波长均为200 nm（图1 a），抗坏血酸为245 nm（图1 b）。根据有机酸相对保留时间选择合适的切换波长时间点，其余检测时间段均为恒定波长360 nm，因为在360 nm下可以避免溶剂峰及许多杂质峰的影响，这样也就保证了同一方法可以测定不同复杂生物体系中多种有机酸含量，见图2。[align=center][img=,613,416]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707010959_01_2984502_3.png[/img][/align][b]3.2分析方法的评价3.2.1 [/b]工作曲线、相关系数和检出限 将混合标样溶液按照浓度由低到高的梯度设置自动进样，每个梯度重复进样3次，以平均峰面积（A）对浓度（C, mg/L）绘制校准曲线，计算相关系数，以信噪比（S/N）大于3时所检测出各有机酸的量为最低检出限（LOD），并在其他色谱条件相同的情况下，考察了切换检测波长和恒定检测波长下每一种有机酸的检出限，切换波长明显降低了各有机酸的检出限，见表1。[align=center][img=,619,387]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707011004_01_2984502_3.png[/img][/align][b]3.2.2 [/b]加标回收率及方法的精密度、稳定性实验 准确量取一定体积的干红葡萄酒两份，按照2.4的条件处理，一份作本底，另一份加入高、中、低3个水平的混合标样溶液进行加标回收率实验，每组重复进样9次，计算每一种有机酸的平均加标回收率和含量的相对标准偏差（RSD），采集相对保留时间和峰面积的数据并计算它们的RSD（见表2）[align=center][img=,587,612]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707011004_02_2984502_3.png[/img][/align][b]3.3 多种复杂生物体系中有机酸的测定[/b] 利用上述所建立的方法，对葡萄酒、食醋、果汁和根系分泌物等多种复杂生物体系中的有机酸进行了分析，每种生物体系设置3个重复，每个样重复测定3次，进样量为10 μL，色谱图见图2。结果表明：该方法可以有效地分析不同复杂生物体系中的有机酸，测定结果准确、可靠，见表3。[align=center][img=,592,662]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707011005_01_2984502_3.png[/img][/align]