活细胞

原标题 “纳米生物间谍”技术能进入活细胞取样 可用于深入揭示线粒体基因组变异的重要性 科技日报讯 据物理学家组织网近日报道，美国加利福尼亚大学圣克鲁兹分校（UCSC）研究人员开发出一种机器人式的“纳米生物间谍”系统，能从单个活细胞内提取出微量样本，进行RNA或DNA测序，而不会杀死细胞。研究人员表示，这种单细胞“纳米生物间谍”技术是一种了解活细胞内部动态过程的有力工具。相关论文发表在最近出版的美国化学协会《纳米》杂志上。 “我们能从活细胞中拿走一个‘生物间谍’，再把它送回该细胞，在几天内这样重复多次而不会杀死细胞。如果用其他技术，你不得不牺牲这个细胞才能分析它。”该生物传感与生物电技术小组负责人、UCSC巴斯金工程学院生物分子工程教授内德·波曼德说。 “纳米生物间谍”平台是研究小组用纳米吸液管开发的最新设备。纳米吸液管是一种小玻璃管，取液端越来越细，至尖端直径仅50到100纳米。波曼德说：“我能在实验室造出纳米吸液管，这不需要昂贵的纳米制造设备。但要进入一个细胞，问题是即使在高倍显微镜下，你也看不见吸液管尖端，不知道它偏离了细胞有多远。” 实验室博士后研究员亚当·赛格尔解决了这一问题。他基于在一台改造过的扫描离子电导显微镜（SICM），开发出一种反馈控制系统。该系统能利用通过纳米吸液管尖端的离子流作为反馈信号，在尖端接近细胞表面时探测其中的液滴。在尖端进入细胞之前，一种自动控制系统能定位它在细胞上面的位置，然后尖端很快插入穿透细胞膜，通过操控电压有控制地提取一小点细胞内物质。由于吸液管尖端极精细，对细胞造成的损害极微小。 研究小组用这种系统从活细胞中提取的微量细胞物质，估计只有50毫微微升（千万亿分之一升），约一个人体细胞百分之一的量。他们从单个人体癌细胞中提取物质并进行RNA测序，还从人类成纤维细胞中提取了线粒体并对其进行了DNA测序。“人们已经知道，线粒体和多种神经退化疾病有关。该技术可用于深入揭示线粒体基因组变异的重要性。”波曼德说。 该技术应用前景广阔。波曼德希望能与其他研究人员合作，探索其更多用途。“对于癌症生物学家、干细胞生物学家等想要了解细胞内部情况的科学家来说，这是一种多功能的平台。”（常丽君）来源：中国科技网-科技日报 2014年01月20日

利用活细胞成像工作站进行细胞和基因的功能研究，是生物医学研究的最新趋势。固定细胞观察仅能提供固定瞬间细胞的静态信息，无法反映细胞在正常生理生化条件下的状态活细胞观察，对处于正常生理状况下的细胞进行全程扫描和记录，获得其连续、全面、动态过程。由于其显示的正常细胞动态的活动过程，很容易发现和确定细胞间相互作用和信号传导的过程，以及在活细胞水平上的生物分子间的相互作用，不仅可以解决长期以来悬而未解的问题，更为未来的研究提出新的问题，指出新的方向。

最近研究所买了活细胞工作站，但功能似乎开发的不到位，求助那位战友可以相互讨论讨论在使用活细胞工作站拍摄时遇到的问题

发酵过程中，细胞浓度是一个非常重要的生理参数，不但可以计算比生长速率，底物消耗速率、生物量产率和维持系数等参数，还可以及时判断是否有染菌等异常情况发生。目前测量细胞浓度的方法主要有化学法（DNA/RNA分析）和物理法（干重、光密度、呼吸商等）两大类。一般来说，与物理法相比，化学法能较准确的测量有代谢活性的生物量，缺点是花费时间长，而利用物理法测量，无法区分区分处于悬浮状态的颗粒和微生物，也无法分别活死细胞。 实现在线活细胞浓度一直是发酵领域的热门话题，仅些年来出现了不少的测量方法，依据的工作原理也是五花八门，其中最具代表性的有声学，激光散色、荧光、核磁、量热或电容。 其中法国fogale公司的测量仪器，以电容法为工作原理，直接将传感器安装与发酵罐上，可承受121℃高温灭菌，理论技术也比较成熟，是目前最为理想的适合工业级别的在线活细胞传感器。工作原理：电容传感器采用活细胞的介电特性，实时连续测量活细胞的生物体积，可应用于实验室桌面型的反应器或者是工业规模的大型反应器两对对电极位于传感器的顶部，一对用于在培养基中产生交变的电场，在电场范围内，带有完整细胞膜的细胞会在培养基中发生极化现象，发生极化的细胞可以认为是极小的电容，死细胞或者其他粒子没有完整的细胞膜，所以不能形成电容型号。另一对电极用于检测培养基中的介电信号，培养基中的介电信号和细胞的浓度是精确关联的。细胞的极化率和电场的频率纯在函数关系，当频率增加时，培养基中细胞的介电常数由低频峰（最大极化）降低到高频峰（最小极化）。这种随频率增加极化率降低的现象称为β-散射。传感器采用双频测量模式：培养基的基线在10MHz左右得到，细胞的信号在临界频率区域获得，在曲线的拐点，（动物细胞和细菌在1MHz，酵母在2MHz）我们获得了最佳的信号线性。应用：这项技术可广泛应用于各种细胞培养，生物发酵过程。已被文献证实可应用的细胞如下：动物细胞：CHO, BHK, MDCK, PERC6, NSO, HEK, Hela,Hybridoma, Vero细 菌：E.Coli, Bacillus Thuringensis, Salmonella,Streptomyces, Lactic Bacteria酵 母：Pichia Pastoris, Saccharomyces Cervisiae, PolymorphaHasenula昆虫细胞：sf9, Hi-5真 菌：Absidia

[url=http://www.f-lab.cn/microscope-incubators/mio.html][b]显微镜活细胞培养箱[/b]([b]Microscope Incubation Chamber[/b] )[/url]是欧盟专业为生物,生命科学,医学等科学实验而设计的[b]显微镜CO2培养箱[/b]和[b]显微镜活细胞培养系统[/b]，它为科学家提供CO2浓度,O2浓度,温度和气流可调的环境用于显微镜观察实验。[img=显微镜活细胞培养箱]http://www.f-lab.cn/Upload/Mio2.jpg[/img][img=显微镜活细胞培养箱]http://www.f-lab.cn/Upload/MOFI-600_.jpg[/img][b]显微镜活细胞培养箱[/b]可匹配全世界所有品牌所有型号的商用显微镜，为实时活细胞实验提供理想可控的环境。科学家拥有这种显微镜活细胞培养箱可观察细胞内和细胞为发成的变化，以往，没有这种CO2显微培养箱时，科学家需要对死亡细胞染色后在显微镜下观察，现在， 这种显微镜CO2培养箱可以架设到显微镜上直接观察培养中的活细胞，它可以控制温度，气流，湿度，CO2浓度，氧气浓度等，为细胞实验创造出局部可控环 境[img=显微镜活细胞培养箱]http://www.f-lab.cn/App/Tpl/Home/Default/Public/images/grey.gif[/img]显微镜活细胞培养系统是全球唯一做到100%可控的封闭空间，其它同类显微镜活细胞培养箱的控制是被动的，随机的，热空气扩散从一个热源发出以维持设定 温度，而这套显微镜活细胞培养箱没有热空气回风口问题，加热空气从培养箱与显微镜结合处的预留缝隙中自然随机逸出，使得腔内的热空气和温度更加均匀，克服 了其它产品温度不均匀问题。即使电流不稳或振动干扰，热点也不漂移，规避了剧烈温度漂移对环境的干扰。[img=显微镜活细胞培养箱]http://www.f-lab.cn/Upload/Mio.jpg[/img][b][b]显微镜活细胞培养箱[/b]特色[/b]独特的热扩散机制，结合领先空气导入和回风机制，提供连续稳定的气流，腔内温度均匀，没有局部温度热点和冷点外部加热器可以远离这个显微镜CO2培养箱，消除电干扰和振动干扰超高温度精度控制和温度稳定性具有最小的温度漂移，达到缓解平衡点后，样品处的温度精度高达±0.1º C，腔内平均温度精度高0.2º C即使开门，领先的气流流型和温度均匀性控制能力也消除剧烈的环境温度变化人体工程学设计，操作方便，XY位移台和聚焦控制器外置于腔体外，大面积开门设计，更为方便操作操作样品，试管等超精密封闭温度探针实时探测内部温度CO2浓度和O2浓度可调高精度控制器控制气流，CO2，O2和温度，并显示当前监测到的浓度数据和温度数据显微镜活细胞培养箱：[url]http://www.f-lab.cn/microscope-incubators/mio.html[/url]

[size=24px][b]课程详情[/b][/size]肿瘤的发生及发展机制是当前生命科学和基础医学的重要研究领域，对应的抗肿瘤药物和细胞治疗方法的研发也是行业研究热点。本次讲座将围绕肿瘤细胞和细胞治疗研究方法，介绍赛多利斯提供的活细胞水平检测方法及整体解决方案。[size=18px][b]讲师简介：[/b][/size]黄雯琪:黄雯琪，女，就职于赛多利斯公司生物分析部门，负责细胞检测产品线的应用支持、产品培训等业务，在细胞生物学检测技术及实验方法方面具有丰富的经验。[size=18px][b]相关领域：[/b][/size](生物产业)-(综合)[size=18px][b]相关仪器：[/b][/size](生命科学仪器及设备)-(细胞生物学仪器)-(高内涵细胞成像分析系统)点击链接立即报名：[url]https://www.instrument.com.cn/webinar/meeting_13888.html[/url]

http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/201203/2012030911450761.jpg细胞S-腺苷甲硫氨酸成像图，随着每个时间点蛋氨酸（右下）的增加，荧光强度也增高通过基因工程技术使得细胞表达一种经修饰（改造）过的RNA，又称Spinach，研究人员能对活细胞中的小分子代谢物进行成像，并观察它们随时间变化是如何改变的。每个细胞新陈代谢都会产生代谢产物。假如能得知产物生成效率的话，就能辨识如癌症状态下细胞代谢的异常或确定药物能否将细胞的代谢状况恢复到正常状态。康奈尔大学威尔医学院的研究人员说发表在3月9日的《科学》杂志上的相关论文详细描述了这种先进的技术方法，这一技术将有可能彻底颠覆以往对代谢组学的认识，提供数千种细胞内代谢产物的动态变化的化学指纹图谱。威尔康乃尔医学院药理学副教授Samie R. Jaffrey博士说：“动态观察到代谢产物的变化将为我们提供新的和强大的武器，方便我们了解代谢在疾病状态下是如何改变的，并帮助我们找到可以将它们恢复到正常水平的方法”。Jaffrey博士领导威尔康乃尔的其他三名研究人员共同完成了这项研究。他说：“细胞的代谢水平调控着细胞诸多功能，也正因为如此，代谢水平的变化可以是细胞内在特定的时间内发生什么变化的写照”。例如生物学家都知道，肿瘤细胞存在代谢异常，这些细胞对葡萄糖能源的利用存在异常并产生独特的代谢产物如乳酸，从而有不一样的新陈代谢过程。Jaffrey博士说：“能够看到这些代谢异常的话，就可以了解癌症的发生发展。但是到现在为止，测量活细胞中代谢产物一直非常困难。Jaffrey博士和他的团队展开的科学研究表明：可以用特定的RNA序列来检测细胞中代谢产物的水平。这些RNAs是基于能在细胞发出绿色光的Spinach RNA设计的。Jaffrey博士研究小组修改Spinach的RNAs，使得它们一旦遇到它们专属绑定的代谢物时就关闭，造成Spinach荧光开启。他们设计出了RNA序列以追踪细胞中五个不同代谢产物包括二磷酸腺苷、细胞能量分子ATP和参与调节基因活性的甲基化过程的SAM（S-腺苷蛋氨酸）水平的变化。他说：“在此之前，一直没有人能够实时观察到细胞中代谢产物水平是如何变化的”。Jaffrey博士说：“在活细胞中运用RNA传感器，研究人员能够测量单个细胞中的目标代谢产物水平随着时间的变化而发生的改变，你可以看到这些代谢物如何响应信号刺激或遗传变化进而发生动态变化的。你可以筛选出能使得这些基因异常发生正常化的药物，我们的一个主要目标是确定药物是否能使细胞的新陈代谢正常化。新技术克服了现行的用绿色荧光蛋白（GFP）标记活细胞以充当传感器的缺点。如果将绿色荧光蛋白和其他发光蛋白质融合到能结合某种代谢物产物的自然存在的蛋白质中的话，绿色荧光蛋白和其他发光蛋白质就可以用来充当代谢感应器。但在某些情况下，代谢产物与自然存在的蛋白质结合方式会扭转蛋白质结构，进而影响已经融入到这些蛋白质中的荧光蛋白。另外，对于大多数的代谢产物，并没有可用来融合绿色荧光蛋白以制造传感器的蛋白质。通过使用RNA作为代谢物传感器，这个问题引刃而解了。Jaffrey博士说：“关于RNA令人惊奇的是，你可以得到基本上你想要结合任何一种小分子代谢物的RNA序列。他们可以在几个星期就能生产出来”。然后，这些人造序列融合到Spinach中，并在细胞中以单链RNA的形式表达。Jaffrey博士说：“这种做法能让你得到任何你想研究的小分子代谢物，以及这些小分子代谢物在细胞内的情况”，他和他的同事们将这一技术的运用范围扩大到能检测活细胞内的蛋白质和其他分子。他补充说道：该技术可应用于多种疾病研究中。Jaffrey博士说：“我们非常有兴趣研究导致发育障碍如自闭症的大脑神经细胞内的代谢如何是变化的，有很多的机会能让这一新的工具发挥用处”。这篇研究论文的合著者包括威尔康乃尔医学院药理系Jeremy S. Paige博士、Thinh Nguyen Duc博士、Wenjiao Song博士。这项研究由美国国立卫生研究院的生物医学成像和生物研究所以及McKnight基金会资助。康奈尔科技企业和商业中心（CCTEC）已经代表康奈尔大学提出了这项技术的专利保护申请。Samie Jaffrey博士是Lucerna技术的创始人和科学顾问，并持有该公司股权。此外，Lucerna技术拥有上述描述技术的相关许可证。

β分散频率范围内，生物量容积率与培养液中介电系数有关。在一定电场频率范围内，生物量容积与细胞大小无关，只与细胞浓度成线性关系。在外界交变电场的影响下，培养基中的离子向电极靠近，带有完整细胞膜的细胞（活细胞）在培养基中发生极化现象，形成一个极小的电容，这些小的“电容”可以被传感器两端的检测器检测到，从而得到实时的细胞浓度不知道这种仪器在学术研究上作用如何？请大家给点建议！

特点：实时在线测量活细胞浓度，只对活细胞敏感，电容探头对于悬浮液中的死细胞、细胞碎片、微载体、非细胞粒子不敏感。优化细胞生长、培养基、补料策略、诱导时间、收获时间、或者检测细胞裂解以及其他培养过程中的偏差工作原理：电容传感器采用活细胞的介电特性，实时连续测量活细胞的生物体积，可应用于实验室桌面型的反应器或者是工业规模的大型反应器两对电极位于传感器的顶部，一对用于在培养基中产生交变的电场，在电场范围内，带有完整细胞膜的细胞会在培养基中发生极化现象，发生极化的细胞可以认为是极小的电容，死细胞或者其他粒子没有完整的细胞膜，所以不能形成电容型号。另一对电极用于检测培养基中的介电信号，培养基中的介电信号和细胞的浓度是精确关联的。细胞的极化率和电场的频率纯在函数关系，当频率增加时，培养基中细胞的介电常数由低频峰（最大极化）降低到高频峰（最小极化）。这种随频率增加极化率降低的现象称为β-散射。传感器采用双频测量模式：培养基的基线在10MHz左右得到，细胞的信号在临界频率区域获得，在曲线的拐点，（动物细胞和细菌在1MHz，酵母在2MHz）我们获得了最佳的信号线性。参考文献：如果您想进一步了解这项技术、相关应用、结果，请查看以下文献Monitoring nutrient limitations by onlinecapacitance measurements in batch and fed-batch CHO fermentations. SvenAnsorge. ESACT 2005 Poster; CCEX 2006 PosterOnline Measurement of Viable Cell Density inAnimal Cell Culture Processes. Georg Schmid. CCE IX 2003 Poster. Evaluation of a Novel Capacitance Probe forOn-Line Monitoring of Viable Cell Densities in Batch and Fed-Batch Animal CellCulture Processes. Georg Schmid. ESACT 2003 Poster On-line viable cell density andphysiological states monitoring by dielectric spectroscopy sf9 growth andinfection process. G.Esteban. CCEX 2006 Poster. On-line monitoring of infected Sf-9 insectcell cultures by scanning permittivity measurements and comparison withoff-line biovolume measurements. Sven Ansorge. Cytotechnology (2007) 55:115–124Process optimization of large-scaleproduction of recombinant adeno-associated vectors using dielectricspectroscopy. Alejandro Negrete. Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76:761–772. Online monitoring of vero cells culturesduring the growth and rabies virus process using biomass spectrometer. Samia Rourou.ESACT 2007 Poster On-Line Monitoring of Lentiviral VectorProduction for Characterization of Viral Production and Release Kinetics. SvenAnsorge. ESACT 2009 Poster On-line Pichia pastoris physiological statemonitoring by dielectric spectroscopy. L. PREZIOSI-BELLOY. ECB12 2005 Poster

美国斯坦福大学的生物工程团队设计出一种基因器件，可在个体活细胞中像晶体管一样起作用，从而将计算从机械和电子带入到生物学活细胞领域。研究团队在28日出版的《科学》杂志上详细描述了这种由遗传物质DNA（脱氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）制成的生物晶体管，并称之为“转录器”。　　论文第一作者、生物工程博士后杰罗姆·博内特表示，与晶体管和电子器件相类似，转录器是对基因逻辑进行放大的关键组成部分。转录器的创建将允许工程师们在活细胞内进行计算和记录。当细胞暴露于某些外部刺激或环境因素，就能按需打开和关闭。　　在电子设备中，晶体管控制电子沿着电路流动。同样地，在生物设备中，转录器控制特定蛋白——RNA聚合酶沿着DNA链的流动。研究团队已利用该转录器创建出电子工程中熟知的逻辑门。研究人员将这种以转录器为基础的逻辑门称为“布尔聚合酶逻辑”（BIL）门。　　所有的现代计算机尽管存在外在差异，但都具有3个共同的基本功能：信息的存储、传输和逻辑运算。基于转录器的门单独并不能构成一台计算机，但它们是可在单个活细胞内运行的生物计算机的第三个、也是最后一个器件。　　在生物环境中，逻辑的可能性像在电子学中一样是无限的。研究人员可测试一个给定细胞是否接触到任何数量的外部刺激，如葡萄糖和咖啡因的存在。BIL门将决定是否将这些信息进行存储，如此即可简单地识别出细胞是否与外部刺激接触。同样，在某些因素下，也可告诉细胞开始或停止繁殖。将BIL门与研究团队的生物学网络进行连接，就有可能实现从细胞到细胞的遗传信息交流，从而协调一组细胞的行为。　　为了创建转录器和逻辑门，研究团队使用了经过仔细校准的酶组合，其能控制RNA聚合酶沿着DNA链的流动。DNA相当于电线，RNA聚合酶相当于电子。对6个基本逻辑门的设计和构建是基于2种丝氨酸重组酶的活性基础之上的。每个逻辑门由3个基因组成：2个为编码输入的基因，一个为输出基因，该基因含有不同的转录控制元件（启动子，终止子），而这些转录控制元件在其侧面上具有重组酶识别位点。　　该转录器获得了介于生物学晶体管和半导体晶体管之间的一些类似重要功能：信号放大。聚合酶表达的微小变化，即可引起其他两个基因表达的很大变化。此一结果或将成为构建更大、更复杂基因电路的进身之阶。

为活体研究和临床诊断提供了一种全新的技术手段2013年05月09日 来源： 中国科技网 作者： 吴长锋 最新发现与创新 中国科技网讯 中国科学技术大学光学与光学工程系李银妹课题组，近日与上海交通大学魏勋斌教授合作，采用活体动物内的细胞，发展了动物体内细胞三维光学捕获技术。日前，国际著名学术期刊《自然·通讯》在线发表了这项研究成果，网站还以《医学研究：用光清除血管被堵塞的血管》为题对该研究工作进行报道。 在活的动物体内研究细胞生长、迁移、细胞及蛋白质间相互作用等生物学过程，对生命科学、医学研究及临床诊断具有重大意义，因此体内研究技术一直是活体研究热点之一。 李银妹课题组利用光镊技术，首次对活体动物内的细胞实现光学捕获。研究表明，光镊可以直接深入到活体内，对细胞进行有效操控。研究人员用光镊穿过小鼠耳朵真皮层，到达深度约50微米毛细血管中，捕获和操控血管中的红细胞。将光镊固定在血管中心，血管中快速流动的细胞经过光阱时被逐渐减速，直到一个细胞停留在光阱中，光镊将细胞捕获，并实现了三维操控。 课题组还利用光陷阱的作用聚集红细胞，人为制造出血管堵塞；针对血管中已聚集的细胞团簇，拖拽其中一个细胞引导疏通，使聚集的细胞逐渐疏散开，恢复正常血液流动，从而实施非接触手术式的血管疏通。 过去，光镊技术在生物医学领域的应用仅限于体外的单分子和细胞研究。李银妹课题组的这项研究技术能直接深入到动物活体内，对细胞进行实时观察、操控与测量，实施非接触式手术的实验取证，从而开拓了光镊技术研究活体动物新领域，为活体研究和临床诊断提供了一种全新的技术手段。（记者 吴长锋） 《科技日报》（2013-5-9 一版）

有望提供一种新的治疗癌症的方法2013年08月01日 来源： 科技日报 作者： 陈丹 科技日报讯（记者陈丹）据《自然》杂志网站8月1日（北京时间）报道，纳米钻石可用于量子计算机中处理量子信息，而哈佛大学的研究人员利用纳米钻石的量子效应，将其变为“温度计”，测量出了人类胚胎干细胞内部的温度变化，精确度是现有技术的10倍。通过加入金纳米粒子，研究人员还能够利用激光对细胞的特定部分加热甚至杀死细胞，这有望提供一种新的治疗癌症而不损害健康组织的方法，以及研究细胞行为的新手段。研究论文发表在本周的《自然》杂志上。 在这项最新研究中，研究人员使用纳米线将直径约100纳米的钻石晶体注入一个人类胚胎干细胞中，然后用绿色激光照射细胞，使氮杂质发出红色荧光。当细胞内局部温度出现变化时，红色荧光的强度会受到影响。通过测量荧光的强度，便可以计算出相应的纳米钻石的温度。由于钻石具有良好的导热性，就可以像温度计一样显示出其所处细胞内部环境的即时温度。 研究人员同时还将金纳米粒子注入细胞内，然后用激光来加热细胞的不同部位，加热点的选择和温度升高多少都可由纳米钻石“温度计”来精确控制。“现在我们有了一个可以在细胞水平上控制温度的工具，让我们能够研究生物系统对温度变化的反应。”参与该研究的哈佛大学物理学家彼得·毛瑞尔说。 他指出，基础生物学涉及到的很多生物过程，从基因表达到细胞新陈代谢，都会受到温度的强烈影响，纳米钻石“温度计”将是一个有用的工具。例如，通过控制线虫的局部温度，生物学家可以了解简单有机体的发育。“你可以加热单个细胞，研究其周围的细胞是否会减慢或者加快它们的繁殖率。”毛瑞尔说。 目前也有一些其他测量细胞温度的方法，比如利用荧光蛋白或碳纳米管，但这些测量手段在敏感性和准确度方面都有欠缺，因为其中的一些成分会和细胞内的物质发生反应。毛瑞尔说，他们的纳米钻石“温度计”的敏感度至少提高了10倍，能够检测出细微到0.05开的温度波动。而且其还有改进的余地，因为在活细胞外部，该“温度计”的敏感度已经达到0.0018开的温度波动。 总编辑圈点 这样的“温度计”应该造价不菲，好在钻石是纳米级的。而其能够检测出细微到0.05开的温度波动，让其他测量细胞温度的方法难以望其项背，我们有理由相信，这项技术不仅仅只应用于医学领域。目前晶体管已经达到极小量度，在20或30纳米级别，离原子级别已经不远。然后，最重要的事情就是要理解热量散播和设备电子结构之间的关系，只有掌握这方面的知识，才能真正操控原子级设备，而纳米钻石“温度计”或许能派上大用场。 《科技日报》（2013-08-02 一版）

现在大多数对细胞超微结构的观察多采用化学染色法固定、染色、脱水、包埋的前处理，电镜观察。想请教一下各位大虾，有没有什么好的技术能实现对活细胞的超微结构的实时动态观察啊？最好不要染色什么的处理，直接在生理状态下就能观察。需要国内能够买到的仪器，谢谢大家了。目前查了一下文献，好像原子力显微镜、相差显微镜说可以，但我看了一下成像，感觉不如电镜的分辨率高啊。还有共聚焦显微镜，需要使用特定的荧光探针。

日前，科学家宣称成功研制新型生物计算机，分子在细胞中“运行”最新研制的新型生物计算机可让科学家对分子进行“编程”，并由活细胞执行“命令”。美国加州理工学院(California Institute of Technology)的克里斯蒂娜斯默尔克(Christina Smolke)是该研究的合著作者之一，他指出，像这样的生物计算机有朝一日可使人类直接控制生物学计算系统。该研究将发表在10月17日出版的《科学》杂志上。生物计算机最终将具有智能，从细胞中生成生物燃料，比如：可以实现在某种特殊状况下有效控制“智能药物”。斯默尔克说，“如果探测到某种疾病，一种智能药物能够从一个细胞环境中采样，并形成自防御序列结构。”这种新型生物计算机包括着装配在细胞中的工程RNA片断，RNA是类似于DNA的一种生物分子，它可以编码遗传基因信息，比如：如何制造多样化的蛋白质。从计算工程角度来讲，生物计算机的“输入”是分子漂浮在细胞内；“输出”是蛋白质产物的变化。举个例子，RNA计算机很可能捆绑着两种不同的分子，如果两种不同分子附着在一起，将导致出现生物计算机的外形变化。改变形状后的生物计算机对DNA进行捆绑时，将直接影响基因表达，并减缓蛋白质制造。

[size=4]人类体细胞克隆胚胎是福还是祸？！进行人类治疗性克隆研究，造福人类呢？还是制造克隆人的时代到来？福兮？祸兮？[/size]

美国研究人员说，已经在利用皮肤细胞“制造”精子的研究中取得初步成功，完成关键步骤。受不育问题困扰的男士有望在几年内通过这种新型人工干预手段实现为人父的梦想。相关研究报告由《细胞—报告》月刊发表。 击破关键美国匹兹堡大学医学院詹姆斯·伊斯利博士带领研究小组，用多种化学品混合物“回拨”皮肤细胞的生物钟，把它们变成功能与胚胎干细胞类似的细胞，接着使用营养物质培养成圆形细胞。 伊斯利说，这是用皮肤细胞“制造”精子过程中最困难的一步。先前，已经有研究人员成功地用胚胎干细胞“造”出精子。这些研究结果可以为伊斯利博士团队接下来的研究提供借鉴，也就是说，他们距成功可能只有几步之遥。伊斯利博士团队使用的皮肤细胞全部来自男性。他们也曾经尝试使用女性皮肤细胞，但没有成功。 伦理之争今年早些时候，以色列与德国研究人员在实验室中利用老鼠生殖细胞“造”出精子。与用老鼠生殖细胞或胚胎干细胞相比，用男性皮肤细胞制造精子有无可比拟的优势。 老鼠生殖细胞来自老鼠，胚胎干细胞通常来自胚胎，与之相比，利用皮肤细胞培养精子在伦理上更容易为人接受。因为这种细胞可以从想圆“父亲梦”的成年男性身上采集，由它“制造”的精子里含有这名男性的基因。不过，受到相关法律限制，即使伊斯利博士团队的研究在短时间内获得成功，也不可能随后在欧美等地投入临床。一直以来，关于通过人工手段干预生殖是否符合伦理规范的争论从未停止。 英国《每日邮报》28日援引从事相关医学研究的菲莉帕·泰勒的话报道：“研究人员承认，他们的工作‘充满生物伦理学挑战’。” 带来希望伊斯利博士团队在研究报告中写道，不管存在何种争论，至少在短期内，这一成果可能帮助人们开发新型治疗不孕症的药物和避孕用具。不孕已经成为困扰不少育龄夫妇的难题。统计数字显示，在英国，六分之一的夫妇有生育困难问题，其中，40%的“责任”在男方。三分之一的不孕夫妇经过一系列复杂检查后仍然无法确定不孕的原因。因此，伊斯利博士团队的研究成果对不少不孕夫妇而言意义重大。英国设菲尔德大学男性生殖专家艾伦·佩西谈到这项研究结果时说：“毫无疑问，这是一项好成果。”

液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、步骤：（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。（4）冷冻保存之细胞浓度：①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml②hybridoma:1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。③adherent tumor lines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。（6）冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4度时），复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。3、材料37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤：（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。（4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理：（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。3、步骤：（1）取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。5、范例：T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106存活率：225/243﹦92.6%

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德国科学家日前成功获取了显示单细胞酵母菌内部构成的高分辨率三维图片，为研究更高级别的生物提供了新的依据。 据此间媒体３０日报道，位于海德堡的欧洲分子生物实验室的科学家们使用电子束从不同角度照射酵母菌细胞，再通过电脑组合完成了这张细胞内部结构高清图片。图片除了显示细胞核 及其他组成部分外，还可以显示细胞内细微的丝状物。通过类似的方式，科学家也获取了人脑细胞内部结构的图片。 科学家认为，如同人体由骨骼支撑一样，一个细胞内部的组成部分也决定了细胞的结构和形状。单细胞的酵母菌被认为能够为研究包括人类在内的高级生物提供依据。来源:新华网

[size=15px][color=#333333]细胞的机械特性对其生物学功能（如增殖、分化和凋亡）和形态状态（如迁移、附着和病理状态）至关重要。目前常用的细胞弹性模量测量技术包括原子力显微镜、微管吮吸、光镊和磁镊等。这些技术可以有效测量单个细胞的机械性质，但是通量低，限制了其实际应用。[/color][/size][size=15px][color=#333333]近年来，微流控芯片因其在小体积液体操控方面的独特优势，也被用于测量细胞弹性模量。现有的微流控芯片主要侧重于平台开发，虽然通量大幅提高，但很少将测量后的细胞进一步收集以实现后续分析。[/color][/size][size=15px][color=#333333]单细胞分析技术的发展要求能够准确地打印单个细胞。传统单细胞打印技术包括荧光激活细胞分选、有限稀释和手动细胞挑选，这些方法打印效率较低且难以实现自动化。[/color][/size][font=mp-quote, -apple-system-font, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#333333]近年来，各种微流控技术被开发用于高通量精确打印单个细胞，如喷墨打印、精确分配、双阀门筛选和移液管式单细胞分离等。这些技术可以根据目标细胞的荧光、形态等特征进行识别并打印，但是大多技术难以获得单细胞的机械信息。[/color][/size][/font][font=mp-quote, -apple-system-font, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#333333]因此，本研究报道了一款基于 U 型阵列的微流控系统，集成了单细胞连续捕获，弹性测量和可寻址打印。该装置在研究细胞力学与其他生物学特性的关系方面具有强大的应用潜力。[/color][/size][/font][b]研究内容[/b][size=15px]近日，哈尔滨工业大学（深圳）[color=#004976][b]陈华英课题组[/b][/color]在英国皇家化学会（RSC）期刊[color=#004976][b] Lab on a chip[/b][/color] 上发表题为“Continuous trapping, elasticity measuring and deterministic printing of single cells using arrayed microfluidic traps” ([color=#007aaa]《单细胞连续捕获、弹性模量测量和可寻址分选打印》[/color])的研究论文，报道了一款创新的微流控芯片，实现了基于精确调节的压力对微球/细胞进行捕获和逐个打印，并将已知弹性模量的单细胞确定性地打印到孔板中（图 1）。[/size][size=15px]该论文第一作者是哈工大（深圳）在读硕士研究生[color=#004976][b]蔡逸珂[/b][/color]和硕士毕业生[color=#004976][b]余恩[/b][/color]。[color=#004976][b]陈华英副教授[/b][/color]为通讯作者。[/size][img=图片]https://img1.17img.cn/17img/images/202403/uepic/b3ebc9a4-6d42-4ef1-bfd0-c7cf1f5c3a15.jpg[/img]微流控芯片（图 1A）由冲洗入口、样品入口、打印入口、压力维持口和两个平行的主通道组成，下游有打印出口。在所有入口通道中设计了宽度从 200μm 减小到 25μm 的微通道阵列，以过滤介质中较大的颗粒/细胞碎片。如图 1A 和 B 所示，在每个主通道的一侧有 16 个 U 型捕获陷阱，且吮吸通道的高度比分流通道的高度低 15 μm，以保证细胞停留在 U 型陷阱中并诱导其微小变形。[img=图片]https://img1.17img.cn/17img/images/202403/uepic/b3ee5e4c-b99c-4b5e-8904-b5a6d2817633.jpg[/img][table=677][tr][td=1,1,5]▲[/td][td=1,1,549][b]图1[/b] 单细胞连续捕获、弹性测量和可寻址打印系统。(A)微流控芯片连接到压力泵，将单细胞精确分配到孔板中；(B)通过调节打印压力(Po)捕获(Pi-Po0)和释放(Pi-Po0)单个细胞的机制；(C)用于捕获和分离细胞的吮吸通道；(D)用于捕获和分离微球的分流通道。[/td][/tr][/table][来源：陈华英团队 RSC英国皇家化学会][align=right][/align]

[color=#c00000][i]同济大学附属东方医院再生医学研究所何志颖研究员表示：项目研究从2018年开始，2021年4月Pre-IND，2024年1月18日IND获批！历时6年艰辛。[b]这是东方医院首个干细胞成药临床试验项目，希望能造福于心衰患者！[/b][/i][/color]据报道1月18日，天士力公告其一款创新干细胞药物获得国家药监局批准进入临床试验，主治慢性心力衰竭。公告称，公司收到国家药监局核准签发关于[b]人脐带间充质干细胞注射液（B2278注射液）[/b]项目的《药物临床试验批准通知书》，同意开展伴冠状动脉旁路移植术指征的慢性缺血性心肌病导致的慢性心力衰竭的临床试验。[b]人脐带间充质干细胞注射液[b]（B2278注射液）[/b]由上海市东方医院（同济大学附属东方医院）研发，2022年8月天士力与东方医院签署《技术转让（合作）合同》受让相关技术及成果，并在全球范围内，优先在中国开展药品注册申报及后续临床试验开发。[/b]临床前研究证明，B2278注射液可通过旁分泌作用调控心肌组织微环境，对于缺血性心肌病中的心肌细胞组织损伤有明显抑制作用，增加动物心功能，促进血管再生，减少心肌凋亡。心力衰竭是由于心脏结构和/或功能异常导致心室充盈和/或射血能力受损的一组临床综合征，是大部分心血管疾病发展的最终阶段，随着年龄增长，心衰患病率和发病率均明显增加。目前对于心力衰竭的治疗主要包括药物治疗、血运重建、细胞和基因治疗，其中冠状动脉旁路移植术（CABG）是常用的血运重建治疗方式，《2022年中国心血管外科手术和体外循环数据白皮书》显示，2022年CABG占心外科手术总量21.1%。上述治疗手段可以在一定程度上延缓心力衰竭的进展，但不能使死亡心肌再生。伴随CABG手术的心肌局部注射干细胞有望通过刺激心脏细胞的增殖和分化、抑制心肌细胞损伤及免疫调节等作用，修复心肌细胞使心肌收缩增强从而对心力衰竭发挥治疗作用。目前国际上获批的干细胞品种已达十余种，但是尚无治疗心衰的干细胞产品上市。[来源：仪器信息网] 未经授权不得转载[align=right][/align]

细胞自噬是机体一种重要的防御和保护机制。但是这种自噬“信号”如何传递给细胞从而使其“执行”自噬过程，则一直是科学界的难题。近期，我校生命科学学院林圣彩教授课题组成功找到高等动物细胞在生长因子缺失条件下，启动自噬的部分“密码”，从而在细胞自噬机制研究方面取得重大突破。　　4月27日，最新一期的美国《科学》杂志以研究文章的形式刊发了这项研究成果，并配发专门评述。这也是近三年来，我校生命科学学院第二篇发表在这一世界顶级学术刊物上的论文。2009年6月，该院韩家淮教授的一篇有关细胞选择死亡方式机制的研究文章曾“登上”该杂志。　　所谓自噬，是指细胞消化自身蛋白质或细胞内的结构（细胞器）的一种自食现象。通过这种现象，细胞可以降解、消除和消化受损、变性、衰老和失去功能的细胞器和变性蛋白质等生物大分子，为细胞的生存和修复提供必须的能量。　　科学家们认为，自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样，是一种十分重要的生物学现象。有关实验表明，包括肥胖症、糖尿病、神经退行性疾病、免疫失调及癌症在内的人类许多重大疾病的发生都与该过程的异常有关。为此，自噬也是当前生命科学中最热门的研究领域之一。　　据林圣彩介绍，对自噬进行分子机制的研究始于上世纪90年代的以单细胞生物酿酒酵母为模型的研究，目前，一系列构成单细胞生物自噬核心机器的基因已被发现并命名。　　然而，对自噬在多细胞生物特别是哺乳动物中的调控机制的研究，科学界至今仍在不断探索中。摆在科学家面前的一个根源性的问题是：在多细胞生物中，诱导自噬的各种信号是如何被传递到细胞内自噬“核心机器”从而启动自噬过程的？　　研究表明，与单细胞生物不同，在多细胞生物内，外界营养元素要依赖于生长因子的调控才能被转运到细胞内。一旦细胞外的生长因子匮乏，细胞便能启动自噬以维持能量平衡。那么，生长因子缺失这一信号又是如何“传达”的呢？　　这也成为长期致力于细胞信号转导研究的林圣彩教授课题组近年来的研究目标之一。经过多年研究，课题组终于成功“**”这一自噬启动“密码”——即通过一种名为GSK3的激酶活性增高后磷酸化并随之激活乙酰转移酶TIP60，进而导致自噬核心机器中的蛋白激酶ULK1的乙酰化水平增强而启动细胞自噬。简言之，这一发现揭示了多细胞生物在生长因子缺失条件下的细胞自噬过程的新的介导分子及其通路。　　林圣彩认为，弄清楚了细胞内到底有哪些蛋白分子“参与”了自噬和它们如何串联在一起，将有益于科学界从“源头”上认识相关疾病，并为这些疾病的诊断和治疗提供新的靶点。

各国争相发展的重点项目　　iPS技术，即诱导性多能干细胞技术，是一种将成体成熟、分化的体细胞重编程获得类似胚胎干细胞的新兴技术。2007年11月美国和日本科学家分别独立宣布可将人类皮肤细胞转化为iPS细胞。这一发现被《自然》和《科学》杂志分别评为2007年第一和第二大科学进展。之后，iPS细胞研究迅猛发展，不同的国家和实验室纷纷报道了多种方法建立的iPS细胞系。就连世界第一只体细胞克隆动物多利羊的培育者伊恩·威尔莫特也宣布放弃人类胚胎干细胞克隆研究，转而进行 iPS 细胞研究，因为他认为这种细胞比胚胎干细胞更具潜在优势。　　我国连续多年将干细胞研究列入“863”、“973”、国家自然基金重点项目。国务院2006年发布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年）》中，干细胞作为五项生物技术之一成为未来15年我国前沿技术的重点研究领域。　　致瘤风险浮出水面　　Yamanaka研究组在《自然·生物技术》上发表的文章显示，用iPS细胞诱导的神经干细胞，即使不含c-Myc（曾被认为是导致肿瘤的主要原因），在植入NOD/SCID免疫缺陷小鼠后仍有很强的致瘤性，甚至高于胚胎干细胞。　　　他们共研究了36个iPS细胞克隆，在诱导方式上，有些诱导剂配方中含有c-Myc基因，有些没有，因此具有较好的代表性。同时他们选择了3株胚胎干细胞作为对照。在45周的观察中，移植胚胎干细胞来源神经干细胞的34只小鼠有4只长出肿瘤。在100只移植胚胎成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中34只发现肿瘤，概率和胚胎干细胞相当。在55只移植成人成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中46只发现肿瘤，概率远高于胚胎干细胞。在36只移植肝细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中10只发现肿瘤，概率高于胚胎干细胞。8只移植胃上皮细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中未发现肿瘤。病理学检查证实肿瘤均为畸胎瘤，部分为恶性畸胎瘤。　　研究还发现，以前认为致瘤性很强的c-Myc在去掉后并没有减少iPS神经干细胞的致瘤性，相反以前认为没有致瘤性的Nanog基因却可以明显增强iPS神经干细胞的致瘤性。　　这次试验的另一个意外结果是并未发现在生成的肿瘤细胞中有c-Myc或其他基因的激活。以前的观点认为，转入的癌基因是iPS致瘤性的基础，只要在iPS细胞诱导成功后通过各种方法去除已完成使命的癌基因即可使iPS细胞免于致瘤性。这次试验的结果无疑给这些想法留下了阴影，而且使iPS致瘤的机制更加扑朔迷离。

二、仪器、用品与试剂0.4 % w/v 台盼兰trypan blue (GibcoBRL 15250-061) Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline 血球计数盘及盖玻片(Hem℃ytometer and coverslip) 计数器(counter) 低倍倒立显微镜 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics) 三、操作步骤（一）细胞计数3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。 3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色 ( 或红色- Erythrosin bluish) 。3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线 上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细 胞。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数x 2/ 4×10000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占 10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。（二）细胞活力1、将细胞悬液以 0.5ml加入试管中。2、加入 0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色 2一 3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用 。

科技日报讯（记者常丽君）据美国物理学家组织网6月20日（北京时间）报道，美国杜克大学科学家开发出一种碳纳米管制成的“鱼叉”，可用于捕获单个脑细胞发出的信号。相关论文发表在6月19日的《公共科学图书馆·综合》上。 目前用于记录脑细胞信号的电极主要有两种：金属和玻璃。金属电极可用在活动物中，记录脑细胞群体活动峰值及其工作情况；玻璃电极既可用于检测峰值，也能检测单个细胞活动，但却脆弱易碎。以往实验中曾用过碳纳米管探针，但那种电极要么太厚会造成组织损伤；要么太短而限制了电极穿透深度，无法探测到内部的神经元。 最新研制出的碳纳米管“鱼叉”只有一毫米长、几纳米宽，可利用碳纳米管卓越的机电性能来捕获单个脑细胞的电信号。杜克大学神经生物学家理查德·穆尼和该校计算机科学与生物化学教授布鲁斯·唐纳德5年前开始合作，研究用纳米材料来缩小机械并改良探针。他们先以电化技术处理过的钨丝为基础，用自缠多壁碳纳米管延长它，制成了一毫米长的小棒，然后用聚焦离子束将纳米管磨锋利，使其一端逐渐变细到只有一根碳纳米管粗细，就像微小的“鱼叉”。杜克大学神经生物学家迈克尔·普拉特说：“这种碳纳米管‘鱼叉’结合了金属和玻璃电极的优点，无论是在脑细胞内外，它们都能记录良好，非常灵活而且不会碎，可以用来记录活动物的单个脑细胞信号。” 在穆尼的实验室，他们把“鱼叉”分别刺入小鼠脑组织切片和麻醉小鼠大脑中来实验，结果显示探针能传输脑信号，而且有时比传统的玻璃电极效果更好，信号中断的可能性更小。 新探针还能刺穿单个神经元，记录单个细胞的信号，而不是附近的一群神经元。唐纳德强调，这被称为细胞内记录，应是人们首次用碳纳米管在脑切片或完整脊椎动物大脑中记录单个神经元信号。 总编辑圈点 碳纳米管可用于研究单个神经细胞发出的信号，如今的成果就是极好的理论证明。这种对单个神经元信号及神经元之间相互作用的进一步挖掘，将会帮助我们更好地理解大脑的计算功能，从而弥补人类对自身“司令部”认知上的缺陷。从另一个角度看，杜克大学此次所采用的探针技术也十分有前途，可在多领域——包括从基础科学到人脑计算接口、脑组织假体等等方面都有着广泛应用，亦因此其进一步开发备受业界期待。 《科技日报》（2013-06-21 三版）

现如今市场上的ELISA试剂盒种类繁多，但是要如何找到适合你的那款呢？一款合适的细胞分离试剂盒可以说是实验成功的保障，因为只有获得正确的细胞，下游的分析结果才可能准确。目前，市面上有多种多样的分离试剂盒可供选择，它们的主要区别在于分离方法和筛选标志。正向选择VS负向选择细胞分离试剂盒的工作原理主要有两种，正向选择和负向选择。正向选择的试剂盒，使用与目标细胞直接结合的抗体来进行捕获。这种抗体通常与磁珠相连，可以利用磁铁将悬液中的抗体-磁珠-细胞复合物提取出来，再通过二抗将磁珠与目标细胞分开。负向选择的试剂盒也采用类似的抗体包被磁珠，不过这种试剂盒是通过去除样品中的非目的细胞，来间接捕获目的细胞。这两种细胞分离试剂盒如何取舍，主要取决于目标细胞的表面是否具有特异性强的筛选标志。这样的筛选标志能够实现特异性的捕获，避免所获得的细胞被非目标细胞污染。如果你的目标细胞刚好具有这样的筛选标志，那么正向选择的细胞分离试剂盒就是最佳选择。但如果目标细胞并不具有特异性强的筛选标志，那我们最好还是选用负向选择的细胞分离试剂盒。

作为第一位获美国麦克阿瑟基金会“天才奖”的华人女科学家，庄晓薇教授获得了许多重要成果，尤其是在生物物理显微成像领域，近期庄晓薇教授在《细胞》发表了题为“Breaking the Diffraction Barrier: Super-Resolution Imaging of Cells”，描述了超分辨率细胞成像的最新进展。传统光学显微镜受限于光的波长，对于200nm以下的小东西只能摇头兴叹。虽然电子显微镜可以达到纳米级的分辨率，但通电的结果容易造成样品的破坏，因此能观测的样本也相当有限。分子生物学家虽然可以做到把若干想观察的蛋白质贴上荧光卷标，但这些蛋白质还是经常挤在一块，在显微镜下分不出谁是谁。这几年高分辨率荧光显微镜跨越了一大步，使得研究者可以从纳米级观测细胞突起的伸展，从而宣告200—750纳米大小范围的模糊团块的时代结束了。比如利用光敏定位显微镜：PALM可以用来观察纳米级生物，相较于电子显微镜有更清晰的对比度，如果给不同蛋白接上不同的荧光标记，就能用来进一步研究蛋白质间的相互作用。庄晓薇研究组一直在研究如何用光敏开关探针来实现单分子发光技术。他们希望能用光敏开关将原本重叠在一起的几个分子图像暂时分开，这样就能获得单分子图像，从而提高分辨率。2004年庄晓薇研究组偶然发现某种花青染料具有光控开关，也就是说，通过使用不同颜色的光，可以随意地把它们激活成荧光状态和失活成黑暗状态。自此庄晓薇生开始研究这些光控探针，用它们来短暂地分离个体分子在空间上的重叠影像从而提高分辨率。之后这一研究组在Nature Methods杂志上发表文章，命名了一种随机光学重建显微镜（stochastic optical reconstruction microscopy, STORM）。使用STORM可以以20nm的分辨率看到DNA分子和DNA-蛋白质复合体分子。这一方法基于光子可控开关的荧光探针和质心定位原理，在双激光激发下荧光探针随机发光，通过分子定位和分子位置重叠重构形成超高分辨率的图像，其空间分辨率目前可达20nm。STORM虽然可以提供更高的空间分辨率，但成像时间往往需要几分钟，同时还不能满足活体实时可视的成像的需要，发展空间很大。近期庄晓薇研究组也在Science杂志上发表了他们的3D STORM成像成果，该技术的空间分辨率比以往所有光学3D成像技术的分辨率都要高出10倍。研究人员展示了用3D STORM成像技术拍摄的肾细胞内微管结构图和其它的分子结构图。随后，他们又进一步将该技术发展成了多色3D成像技术（multicolor 3D imaging）。除了庄晓薇研究组之外，另外一个华人研究团队在这方面也获得了杰出成果，来自哈佛大学的谢晓亮教授在单分子光谱检测及其在生命科学中的应用方面也作出了许多贡献，十年前，谢晓亮教授因为发布了CARS显微技术而引发了巨大轰动。这种技术通过一种叫做自发拉曼散射的现象来增强信号。在自发拉曼散射中，样品内的化学键能够改变通过其中的光的波长。更早使用的拉曼散射显微术要求的激光功率很高，而且有时候需要曝光时间长达一天。近期谢晓亮教授研究组将SRS显微技术与核磁共振成像（MRI）技术联合起来，从而能快速灵敏的捕捉活体组织中分子运动，比如血细胞挤压通过血管的过程。这项技术镜头分辨程度达到亚细胞水平，可记录下蛋白、脂肪及细胞内液的情况。由于SRS显微镜可以探测到原子间化学键的共振，因此无需荧光标记。研究人员认为SRS显微镜可以在肿瘤摘除手术方面有所帮助，加快手术进程。传统的样本分析需要花费约20分钟，SRS 显微镜几乎可以做到实时扫描。同多种常用的观察生物分子的技术相比，新型SRS显微技术优势明显：它能采集分析照射生物样本的近30%激光，比传统SRS显微镜高出30倍；并且不需要插入荧光标记，避免了绿色荧光标记蛋白质扰乱生物路径或压住较小生物分子的问题。此外，传统的红外显微镜空间分辨率太低，并需要给样本脱水；自然的拉曼显微镜需要很高的激光能量，整体耗时很长，在活样本中的应用受到限制；相干反斯托克拉曼散射显微镜在拍摄除了脂质以外的大多数分子时对比度不够，而新型SRS显微技术都能突破这些局限。（来源：生物通 万纹）

【背景】CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g, IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。【培养原理】CIK培养用细胞因子和抗体：nCD3激发型单抗：T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。nIL-2 (白细胞介素-2)IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。nIFN-g (干扰素-g)IFN-g 具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN- g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN- g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。nIL-1a(白细胞介素-1a)IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK 的细胞毒作用。【细胞制备】1．外周血单个核细胞的采集1.1用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；1.2淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；1.3无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。2．CIK细胞的培养及鉴定2.1将PBMC按1-2 x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g，37oC，5%CO2培养箱中培养；2.224h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。2.3每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；2.4在培养的第14d，收获CIK细胞。2.5CIK细胞质控：2.9.1台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；2.9.2流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。2.9.3细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10 : 1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200 ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。2.9.4收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素5 Eu)。【步骤简图】http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/04/B1366873006_small.jpg 【推荐试剂】http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/04/B1366873008_small.jpg 注：Animal Free意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质，尤其是牛蛋白的混入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病原体(如疯牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成分的重组细胞因子。【其它相关试剂】 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/04/B1366873009_small.jpg【参考文献】 Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125-2133