活细胞

前所未有的全自动高精度单细胞操纵平台！多功能单细胞显微操作FluidFM技术首次将原子力系统、显微成像系统、微流控系统、活细胞培养系统融为一体的单细胞显微操作平台，其核心技术——FluidFM技术采用了纳米级别中空探针，完美实现了单个细胞水平、fL级别超高精度、全自动化的细胞及细胞器的操作。是一套超温柔，纳米级，全自动的细胞操纵方案。这项技术将传统细胞显微操作实验无法触及领域的大门彻底打开，科学家可以在单个细胞上实现前所未有的精妙操纵。其主要功能包括单细胞提取、单细胞分离、活细胞细胞器移植、单细胞注射、单细胞力谱等。图1 FluidFM技术整机外观及原理示意图在活细胞中也能进行细胞器操纵？多功能单细胞显微操作FluidFM技术首次实现活细胞间线粒体移植线粒体和复杂的内膜系统是真核细胞的重要特征。到目前为止，对活细胞内的细胞器进行操纵仍然十分困难。多功能单细胞显微操作FluidFM技术能够从活细胞中提取、注射细胞器，将定量的线粒体移植到细胞中，同时保持它们的活力。近期，Julia A. Vorholt课题组使用多功能单细胞显微操作FluidFM技术，将线粒体移植至培养的细胞中，并实时跟踪线粒体注射后的情况，监测它们在新宿主细胞中的命运。通过跟踪，作者发现与受体细胞线粒体网络融合发生在移植后20分钟，持续16小时以上。活细胞之间移植线粒体不仅为细胞器生理学的研究开辟了新的前景，也为机械生物学、合成生物学和疾病治疗开辟了新的前景。该篇文章以” Mitochondria transplantation between living cells.”为题，发表在BioRxiv.上。1从活细胞中提取线粒体在FluidFM负压下的线粒体小体会经历形状的转变，类似于“串上珍珠”的形态。其特征是离散的线粒体基质球体状，并且通过细长的膜结构相互连接，在进一步负压拉力的作用下，这些球状结构最终被拉断，并在悬臂中呈现为球状线粒体（图2）。当牵引力保持数秒后，OMM在先前形成的“珍珠”之间的一个或多个收缩点分离，从而产生独立的球形线粒体，而管状结构的其余部分放松并恢复。图2 提取线粒体后的FluidFM悬臂探针的显微图像及示意图2线粒体移植至新细胞研究人员的下一个目标是将线粒体移植到新的宿主细胞中，并保持细胞活性。FluidFM技术为线粒体转移提供了最佳的两步走方案：第一步，用FluidFM技术直接提取线粒体，第二步，将提取的线粒体注入到新的宿主细胞中。该方案的成功率高达95%，而且保持了细胞活力，其优点是细胞器在细胞外停留的时间短(作者标记供体细胞的线粒体(su9-mCherry)和受体细胞的线粒体(su9- BFP)，能够观察移植细胞线粒体网络的实时状态（图3）。实验跟踪了22个细胞的移植命运：18个细胞显示移植的线粒体完全融合，4个细胞的线粒体发生降解。多数细胞样本(18个细胞中的14个)在移植后30分钟内首次观察到融合事件而后扩展到线粒体网络。综上所述，作者建立了将线粒体转移到单个培养细胞的方法。该方案显示移植后细胞活力高，允许观察移植后线粒体的动态行为，是一种高效方案。图3 单个移植线粒体的延时图像序列(su9-mCherry)。细胞器供体为HeLa细胞，受体细胞为U2OS细胞，带有荧光标记线粒体网络(su9-BFP)。Scale bar = 10 μm。本文使用的FluidFM技术采用微型探针，可以在微环境中以高时空分辨率操纵单细胞或者对单个细胞进行采样，并与组学方法相结合，使细胞器的研究成为可能。FluidFM技术将原子力显微镜的高精度力学调节手段与光学检测下的纳米尺度微流控系统相结合，提供与单细胞操作相关的力学和定量的体积控制。这些特性在现有微型探针中是独一无二的，在本研究中，作者将FluidFM单细胞技术用于活细胞真核内和细胞间的细胞器微操作。成功实现了活细胞之间的线粒体移植。单个线粒体移植视频该研究将启发人们将FluidFM技术应用于更多领域，例如，干细胞治疗中低代谢活性细胞的再生，作为线粒体替代治疗方法的一种备选方案等。此外，FluidFM技术为解决细胞生物学、生物力学和细胞工程等问题提供了新的视角。

摘要：线粒体和复杂的内膜系统是真核细胞的重要特征。到目前为止，对活细胞内的细胞器进行操纵仍然十分困难。多功能单细胞显微操作FluidFM技术能够从活细胞中提取、注射细胞器，将定量的线粒体移植到细胞中，同时保持它们的活力。近期，Julia A. Vorholt课题组使用多功能单细胞显微操作FluidFM技术，将线粒体移植至培养的细胞中，并实时跟踪线粒体注射后的情况，监测它们在新宿主细胞中的命运。通过跟踪，作者发现与受体细胞线粒体网络融合发生在移植后20分钟，持续16小时以上。活细胞之间移植线粒体不仅为细胞器生理学的研究开辟了新的前景，也为机械生物学、合成生物学和疾病治疗开辟了新的前景。该篇文章以” Mitochondria transplantation between living cells.”为题，发表在BioRxiv.上。 结果：1. 从活细胞中提取线粒体为了检测FluidFM探针对单细胞细胞器采样的能力。作者使用了两种探针，分别是锥型探针(A=1.2 um2)和圆柱型探针(A=1.6 um2)(图1B)。实验结果表明，使用这两种探针都可以对线粒体及单个线粒体进行提取或大量抽提。作者对内质网（ER）和线粒体提取后的细胞活力进行了检测，发现细胞仍保持较高的细胞活力 (95%)。为了进一步确保FluidFM提取方案在探针插入时不会破坏细胞质膜，作者使用荧光探针(mito-R-GECO1)监测细胞培养基中可能发生的Ca2+内流。实验显示，在操作过程中和操作后都没有Ca2+流入，表明细胞器提取过程中细胞质膜的完整性。本研究还发现暴露在FluidFM负压下的线粒体小体会经历形状的转变，类似于“串上珍珠”的形态。 其特征是离散的线粒体基质球体状，并且通过细长的膜结构相互连接，在进一步负压拉力的作用下，这些球状结构终被拉断，并在悬臂中呈现为球状线粒体(图2E)。进一步探究显示，施加FluidFM负压后，力诱导的形状转变沿线粒体小管在毫秒到秒的范围内传播了数十微米。形状转变沿这一方向均匀传播，而外层线粒体膜(OMM)保持了初的完整性。当牵引力保持数秒后，OMM在先前形成的“珍珠”之间的一个或多个收缩点分离，从而产生立的球形线粒体，而管状结构的其余部分放松并恢复。结合线粒体牵引实验和线粒体定位的钙流实验，结果证明线粒体的串上珍珠表型的形状转变以及随后细胞质内的线粒体裂变是不依赖钙的。 图1：(A) 示意图：使用FluidFM技术进行细胞器提取。通过调整悬臂探针中的负压(-Δp)进行提取。(B) 通过调节孔径大小和流体作用力的适用范围，选择性地提取不同的细胞器成分。1行：用悬梁臂探针提取单细胞细胞器的示意图。2行：不同孔径的悬臂扫描电镜图。3行：FluidFM悬臂探针孔径与对应的流体力范围。(C) 示意图：使用FluidFM技术进行细胞器注射。通过调整悬臂探针中的正压(+Δp)进行将探针中的细胞器注射到受体细胞内。 图2：(A) FluidFM悬臂探针的扫描电子显微镜图像。具体尺寸参数是：L = 200 μm, W = 35 μm, H = 1 μm。Scale bar= 5 μm。(B) 提取线粒体后的FluidFM悬臂的荧光显微镜图像。由于折射率不同，可以看到提取物和悬臂探针填充物之间的边界。Scale bar = 10 μm。(C) 是图(B)的示意图，提取物的体积是1170 fL。(D- F) 活细胞器提取的延时图像和提取后金字塔悬臂图像。黄框表示细胞内的悬臂的位置。(D) 对表达su9-BFP(线粒体)和Sec61-GFP (ER) 的U2OS细胞进行提取。箭头表示ER区域。使用孔径为0.5µm2的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。(E) 从表达su9-BFP的U2OS细胞中提取单个线粒体。使用1µm2孔径的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。(F) 从表达su9-BFP的U2OS细胞中提取数个线粒体。使用1µm2孔径的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。 2. 线粒体移植至新细胞研究人员的下一个目标是将线粒体移植到新的宿主细胞中，并保持细胞活性。FluidFM技术为线粒体转移提供了两种可能性方案：方案一、用FluidFM技术直接提取线粒体而后注入到新的宿主细胞中；方案二、将从细胞中分离纯化的线粒体回充入FluidFM探针，然后注射(图3A-D)。作者比较了两种方法，为了实现可视化的线粒体的转移，作者在供体和受体细胞中分别对线粒体进行了差异化标记 (图3E-F 供体细胞线粒体su9-mCherry和受体细胞线粒体su9-BFP)。当使用FluidFM直接将线粒体从一个细胞移植到另一个细胞时，成功率高达95%，而且保持了细胞活力(图3G, 41个移植细胞中有39个)。在注射纯化线粒体后，作者观察到46%的样本(19/41)发生了线粒体转移且保持了细胞活力(图3G)。移植的定量结果显示，这些实验中移植的线粒体数量从3到15个线粒体每个细胞不等(图3H)。两种替代方案的不同成功率可以由线粒体分离获取的条件差异来解释。在评估线粒体提取方案时，作者观察到部分提取的线粒体外膜发生破裂。线粒体的不可逆损伤导致细胞内降解，细胞色素C释放可能导致细胞凋亡。虽然线粒体的细胞间移植降低了通量，但它的优点是细胞外时间短(如上所述，细胞间移植即方案一的效率高，并可以直接观察单个移植线粒体的命运。为了展示这一点，作者将标记好的线粒体(su9-mCherry)从HeLa细胞移植到差异标记的U2OS细胞(su9-BFP)中，这种细胞通常用于研究动态线粒体行为。高灵敏度相机可以用于追踪受体细胞内的单个线粒体(图3L)。作者观察到荧光线粒体基质标签在移植后23分钟的发生初始融合而后扩展到线粒体网络。综上所述，作者建立了两种将线粒体转移到单个培养细胞的方法。 一种方法是活细胞间移植。该方案显示移植后细胞活力高，允许观察移植后线粒体的动态行为，是一种高效方案。二种方法是大量纯化线粒体并将其注射到受体细胞中。 注射速度相当快，但不可避免地损害线粒体和细胞功能。图3：(A) 方案一示意图（活细胞间线粒体移植）：通过FluidFM吸入法提取线粒体。 随后，将带有提取物的悬臂探针移至受体细胞插入并注入提取物。(B) 方案一预填充C8F18的FluidFM悬臂梁的图像，被移植线粒体通过su9-mCherry标记，提取量~0.8 pL。Scale bar = 10 μm。(C) 方案二示意图（纯化线粒体注入细胞）：使用标准线粒体纯化方案纯化的线粒体进行线粒体移植的方案。 将纯化的线粒体重悬在HEPES-2缓冲液中，直接填充到FluidFM探针中并对细胞进行注射。(D) 方案二由su9-mCherry标记的FluidFM悬臂充满线粒体的图像。Scale bar = 10 μm。(E) 通过方案一（活细胞间线粒体移植）进行线粒体移植后的宿主细胞图像。宿主细胞的线粒体通过su9-BFP标记，移植细胞线粒体通过su9-mCherry标记。Scale bar = 10 μm。(F) 通过方案二（纯化线粒体注入细胞）进行线粒体移植后的受体细胞图像。宿主细胞的线粒体通过su9-BFP标记，移植细胞线粒体通过su9-mCherry标记。Scale bar = 10 μm。(G) 通过光学成像对两种方案注射的细胞进行评估。每种方法评估了40个细胞。(H) 两种方案的线粒体的计数评估。每种方法评估了22个细胞。(I) 方案一移植线粒体后，对移植线粒体(su9-mCherry)和宿主线粒体网络(su9-BFP)使用不同的荧光标记进行成像，融合。Scale bar = 5μm。(J) 方案二注入纯化线粒体后移的融合状态，标记方案同(I)。Scale bar = 5 μm。(K) 移植线粒体发生降解，分裂成多个更小的荧光囊泡(su9-mCherry)，荧光与标记的宿主细胞线粒体网络(su9-BFP)没有重叠。Scale bar=5 μm。 (L) 单个移植线粒体的延时图像序列(su9-mCherry)。细胞器供体为HeLa细胞，受体细胞为U2OS细胞，带有荧光标记线粒体网络(su9-BFP)。Scale bar = 10 μm。 讨论单细胞的操纵一直是细胞生物学领域的热点和难点，尤其是在不损害细胞活力的情况下从细胞中提取细胞器或将外源物质直接导入到细胞中。截止到目前，尽管单细胞技术有了较大的发展，但要实现将细胞器从一个细胞移植到另一个细胞，除了更大的卵母细胞外，几乎是不可能实现的。线粒体是细胞中的能量转换的核心，与细胞代谢和信号通路以及细胞命运紧密联系在一起。线粒体含有自身的遗传成分(mtDNA)，通常是严格垂直遗传给子细胞的。目前将线粒体地转移到细胞的手段有限，对于线粒体移植后的剂量-反应关系分析更是十分困难，这样我们就很难从机制上了解健康或疾病细胞的线粒体移植后的生物学效应。本文使用的FluidFM技术采用微型探针，可以在微环境中以高时空分辨率操纵单细胞或者对单个细胞进行采样，并与组学方法相结合，使细胞器的研究成为可能。FluidFM技术将原子力显微镜的高精度力学调节手段与光学检测下的纳米尺度微流控系统相结合，提供与单细胞操作相关的力学和定量的体积控制。这些特性在现有微型探针中是的，在本研究中，作者将FluidFM单细胞技术用于活细胞真核内和细胞间的细胞器微操作。成功实现了活细胞之间的线粒体移植。该研究将启发人们将FluidFM技术应用于更多领域，例如，干细胞治疗中低代谢活性细胞的再生，作为线粒体替代治疗方法的一种备选方案等。此外，FluidFM技术为解决细胞生物学、生物力学和细胞工程等问题提供了新的视角。 多功能单细胞显微操作系统- FluidFM OMNIUM参考文献[1].C. Gäbelein, Q. Feng, E. Sarajlic, T. Zambelli, O. Guillaume-Gentil, B. Kornmann & J. Vorholt. Mitochondria transplantation between living cells. (2021). BioRxiv.

• 什么是活细胞成像？ 活细胞成像(live cell imaging)统称为捕捉活的、活动状态的细胞图像的技术，这些细胞图像可以是单个静态图像，也可以是延时系列图像。相应地，活细胞成像的应用可以分为两大类：❶ 细胞在自然状态下的图像记录。❷ 实时观察和记录细胞、组织或整个生物体的动态过程。• 观察分析活细胞时面临的挑战 ▷ 在相对较短的时间内采集大量信息。▷ 要保持细胞保存在可调节培养环境气体浓度和温度（在很多情况下）的培养室中。▷ 激发光源会损害活细胞。▷ 细胞焦面漂移，无法聚焦。▷ 需要使用配备有软件或硬件控制自动对焦的成像仪器来避免这种情况。Revolution全自动显微镜成像系统Revolution全自动显微镜成像系统部件高度集成内置，节省空间，避免繁琐调试及维护；触屏式操控观察工作站，界面直观简洁，易于学习，方便使用。Revolution全自动显微镜成像系统的光源采用高能LED光源，自动荧光切换把光毒降到最低。▌智能化全自动多功能系统：▶ TimeLapse延时摄影：可以根据设定在特定时间内完成特定间隔时间和特定的拍照张数。▶ 独有的Hyperscan快速成像：30帧高速成像，可以在几秒钟内完成上百张照片的采集。▶ Multi-well Point孔板导航成像：不限定孔位大小，只需输入参数就可以自动完成多孔或单孔采集。▶ Focus Map自定义多点聚焦：可以自动完成不同层面的自动聚焦。▶ Z-Stacking多层扫描大景深成像：完成多层面大景深成像。▶ DHR智能实时数字化降噪：实时完成反卷积计算，得到清晰图像。▌ECHO INCUBATOR为活细胞观察提供一个稳定而灵活的培养环境ECHO INCUBATOR采用紧凑的一体式设计，方便用户快速安装和拆卸。箱体结构透明和大型前置开门设计，可为用户提供清晰的观察视野并方便操作样本。采用无风扇对流加热和循环热空气方案，在消除振动的同时并可防止外部灰尘进入您的样品和仪器光学元件。提供稳定的细胞生长环境，确保适合的细胞培养条件，使细胞处于最佳生长状态。

在活细胞中以原子分辨率确定蛋白的三维结构，对结构生物学家来说是一大挑战。本期Nature报告的两项进展，应能拓宽这一领域中一项很有希望的方法——细胞内NMR光谱的应用范围。以前，光谱方法较低的灵敏度及样本的短寿命，使得人们难以获得足够的结构信息来用这种方法确定蛋白结构。为NMR实验收集数据一般需要一到两天时间，这对活细胞来说太长了。Sakakibara等人通过在2至3个小时内收集到足够数据而克服了这一局限。他们报告了完全根据在活大肠杆菌中获得的信息确定的第一个三维蛋白结构。 　　该原理证明研究中所用模型蛋白，是来自嗜热菌的假设的重金属结合蛋白TTHA1718。此前，活细胞的细胞内NMR光谱仅限于细菌和非洲爪蟾卵母细胞，对活真核细胞的广泛应用受到向这些细胞中输送同位素标记蛋白效率相对较低的限制。现在，Inomata等人发现，通过细胞穿透肽由吡啶酸调控的作用，有可能将合适标记的蛋白输送到人细胞的细胞液中，所用细胞穿透肽通过共价键与目标蛋白相结合。当输入的蛋白被内生酶活性或自体还原裂解作用释放时，研究人员便能够获得活的人细胞内蛋白质的高分辨率二维异核NMR光谱。这一方法有可能成为以细胞内蛋白为作用目标的药物的设计及筛选工作的一个强大工具。

p style=" TEXT-ALIGN: center" img style=" WIDTH: 500px HEIGHT: 404px" title=" 2015812530441140.jpg" border=" 0" hspace=" 0" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201508/uepic/28a495d3-f847-4968-980e-a818f89bc0ae.jpg" width=" 500" height=" 404" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" strong 活细胞中的塑料球能发出激光。图片来源：M. SCHUBERT /strong /p p 　　两组研究人员分别将微小激光器放置在了活细胞内。这听上去可能有点像蚂蚁侠的下一代武器，但这个“小玩意”将极大提高生物学家追踪单个细胞活动的能力——这可能惠及从发育生物学到癌症研究的诸多领域。 /p p 　　“这有可能做一些你利用其他技术做不到的事。”英国敦提大学生物物理学家David McGloin说。例如，该激光器能追踪的细胞比荧光标记能追踪的更多，并且比高频ID等萌芽技术更简单易用。剑桥大学神经生物学家Kristian Franze也赞同这一观点。“如果他们能开发出适用于活细胞的此类技术，那对许多人而言将非常有趣。”他说。 /p p 　　要制作一个激光器，你需要两件东西：一种能被激发产生光的材料或“媒介”以及一个回荡着特定波长的光的“共振腔”，就像管风琴会同特有频率的声波共鸣一样。与谐振腔共振的光会刺激该材料发出更多光，极大地放大其效果来创造激光，结果将产生一个能放大光量的反馈回路。 /p p 　　之前，科学家也曾“摆弄”过以细胞为基础的激光器。例如，2011年，美国哈佛大学医学院生物医学家Seok Hyun Yun和现供职于英国圣· 安德鲁大学的物理学家Malte Gather，利用工程改造后包含绿色荧光蛋白的单个细胞作为发光媒介，并将其置于一个共振腔内，从而制造了一个激光器。但没有人制出放置在单个细胞内的激光器。 /p p 　　研究小组多年来一直在探索以单细胞为基础的激光，希望在活组织内造出会发荧光的细胞，以便在这些细胞工作时跟踪它们，深入揭示身体内部机制，比如癌症是如何开始的。目前，Gather和Yun正在利用类似技术分别进行研究。 /p p 　　一个困难环节是将腔囊放置在细胞内。Gather和同事将细胞与直径约为5~10微米的塑料球混合，这些小球被掺杂了荧光染料。小珠子充当了空腔，而染料则充当了媒介。细胞经由内吞作用将小球吸入“体内”，这一过程就像免疫细胞吞噬病原体。由于这些球体用荧光染料浸过，所以用一种颜色的光撞击后，它们会发出另一种颜色的光。这种光接着在球体内共振，引发激光作用，并放大自己。重要的是，每一束激光会根据球体的精确尺寸发出12种不同波长的光。相关论文发表在近日出版的《纳米快报》上。这一技术能作用于4类细胞，包括人类巨噬细胞和一种白血细胞。 /p p 　　研究人员指出，这一技术在细胞传感、医疗成像等领域有着广泛应用。“改写传统激光研究领域的知识并在这个平台上展开研究以便将激光性能最优化，将是一件有趣或者说非常激动人心的事情。”Yun表示。 /p p 　　之后，研究人员设计出一种5纳秒的光脉冲激活这些染料。它发射的光能沿球体的中间线运行——通过一种名为全内反射的过程进行约束。特定波长的共振和增加会更强烈，直到珠子发出足够的激光。 /p p 　　Yun和同事Matjaz Humar还设法诱导细胞“吞下”塑料珠子，并且他们制造了两类共振球，相关成果日前在线发表于《自然—光子学》期刊。研究人员利用一个细胞内的脂肪滴或油滴反射和放大光，从而产生激光。Yun和Humar报告说，他们能改变波长，并且利用不同直径的荧光聚苯乙烯微球而不是被注射进去的油滴或脂肪滴标记单个细胞。理论上，利用不同组合的微球和具有不同光谱特性的染料，应当可以使为人体中存在的几乎所有细胞进行单独标记成为可能。 /p p 　　Yun和Gather表示，这些激光器最显著的应用可能将是追踪单个细胞的行动。每个塑料珠子的直径和光学特性都略有不同，因此它们能有效区分波长，充当细胞条形码。Gather和同事用19小时在细胞培养皿中追踪了少量巨噬细胞，而Yun和Humar也进行了类似验证。 /p p 　　由于激光器能在明确的波长上照亮细胞，这让它们比荧光蛋白质标记等其他细胞追踪技术更有优势。包含荧光染料和蛋白的传统荧光探针拥有相对较宽的发射光谱——约30～100纳米。这限制了能被同时使用的探针数量，因为通常很难从组织中天然分子广泛的背景发射中区分出这些发光源。但这种激光器的光谱特性使其能同时追踪数千个微小指向标。研究人员通过为每个细胞装载数个小球将这一数字扩展到数百万或数十亿。然后，每个细胞将以不同的波长组合发射激光。 /p p 　　但这一技术还有很长的路要走。首先，研究人员需要确定不同的细胞类型都能“吞下”小球，尤其是活组织中的细胞。Gather预测，这将不是问题。“我相信该技术是可归纳的。”他说。另外，研发人员必须缩小塑料球的尺寸。Yun承认，现在的小球会将细胞填满。但Yun和Gather已经证实，他们可以用更小的玻璃球代替塑料球。 /p p 　　由于细胞发光可以持续一个较长的周期，可以在较长时间里识别和跟踪活组织内的细胞，有望为研究人员提供一种很有潜力的手段，执行细胞内传感、自适应成像，还可能真正看到肿瘤细胞的生长过程。但科学家指出，目前这一技术还只用在实验室培养的活细胞中，但他们希望进一步研究能带来用于动物实验的细胞跟踪系统，并最终用于人类。“不管怎样，它非常酷!”McGloin说。 /p

单细胞测序在疾病诊断和细胞异质性研究中发挥着重要作用。然而目前的单细胞测序手段需要将细胞消化并裂解才能够进行，而细胞状态在这一操作中不可避免的会发生改变，因此很难掌握细胞真实的基因表达情况，尤其对于基因通路上表达变化的检测为不利。近期苏伊士理工大学使用FluidFM创建了一种原位活细胞基因测序方法，这种方法能够在不杀死细胞的情况下完成对细胞的测序工作。通过这种技术该团队成功完成单细胞RNA基因测序，并通过这种方法检测到了细胞的基因表达和细胞周期状态变化。下面本文就这项工作的具体内容进行阐述。1. Live-Seq测序技术简述由于单个细胞的RNA总量仅有10 pg。为了实现无损的单细胞测序，该团队先使用FluidFM对现有的scRNA-Seq单细胞测序的方法进行了优化。为了尽可能的接近Smart-Seq的测试条件，该团队采用了先将缓冲液吸入探针，然后再进行细胞提取的操作。这样可以确保所提取的RNA能够很快与缓冲液混合，从而避免RNA的降解。通过这一方法，该团队成功实现了IBA细胞的测序，证明了这种方法的可行性（图1）。图1. Live-Seq技术a. Live-Seq技术的示意图和代表图片，黑色箭头指代液面；b. IBA细胞测序的质量控制图（n=10）。2. Live-Seq技术分析细胞系和细胞状态为了证实Live-Seq的有效性，该团队对多种细胞系进行了测序，这其中包括IBA细胞、小鼠脂肪干细胞和祖细胞（ASPCs）以及脂多糖处理的RAW264.7细胞和Mock处理的RAW264.7细胞。通过对这些细胞系进行测序发现，该方法能够区分上述细胞系，并且在特征基因检测中能够找到每种细胞所对应的特征基因，证明了Live-Seq方法的有效性（图2）。图2. Live-Seq单细胞测序区分细胞型及细胞状态a. 实验方法示意图，使用LPS和PBS对RAW细胞进行处理；b. 前500个高度易变基因的tSNE图；c. 前十的细胞型、细胞状态差别基因的热图；d. 小鼠基因图谱预测，使用前100个标记基因的团簇；e. Live-Seq对比scRNA-Seq的锚点分析，显示两者没有显著差异。3. Live-Seq技术对细胞的活力基本没有影响Live-Seq技术的显著优势在于提取过程中不会破坏细胞。通过对提取前后的测序对比可以发现，提取组与空白组之间的团簇没有显著性差异。并且通过对细胞形态的观察，发现细胞的形态基本没有改变，并且多数细胞仍然能够正常分裂（图3）。图3. Live-Seq对细胞活力的影响a. 细胞实验的示意图；b. Live-Seq测序后不同时间点（1h,4h）的scRNA-Seq的tSNE图；c.不同时间点scRNA-Seq所有能够发现差异的基因（共12个）；d.不同时间点的细胞形态图片。4. Live-Seq技术能够记录细胞下游分子表型事件由于Live-Seq对细胞生理状态影响小，因此能够监测在细胞代谢过程中的基因变化。通过对比LPS处理的巨噬细胞周期实验发现，Live-seq技术与对照组的细胞代谢水平相比没有明显变化，因此这种方法测量的数据十分接近细胞代谢中基因表达的真实水平。通过测序对比LPS处理与空白的测序结果发现Nfkbia与Tnf的表达为相关。这一结果也验证这种测序方法在检测细胞下游表型时的优势。图4. Live-Seq技术的单细胞纵向分析a. 实验示意图；b. 不同处理细胞的mCherry强度变化；c. 3~7.5h之间mCherry强度变化；d.Tnf-mCherry强度变化的线性回归模型；e. Nfkbia与Tnf在Live-Seq测序中的表达关系；f. Nfkbia与Tnf在scRNA-Seq测序中的表达关系；g. Live-Seq测序中细胞处于S期的评分；h. Live-Seq测序中细胞周期的mTnf-mCherry强度变化；i.Tnf-mCherry的荧光强度增量（3~7.5h）。5. Live-Seq技术对同一细胞多次测序Live-Seq技术的无损性甚至能够实现对单个细胞的多次测序。通过对单个细胞两次提取后细胞活力变化的观察中发现，细胞的活力即使在2次提取后仍没有发生明显的变化，基因型分析也没有发现明显的基因表型改变。图5. Live-Seq对细胞的多次提取j.连续测序的示意图和代表图像；k.Live-Seq的tSNE图；l.整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE图。 6. 总结Live-Seq是一种十分具有前景的单细胞测序的新方法，得益于FluidFM技术的无损提取的优势，Live-Seq技术除了能够实现传统测序的功能外，还降低了细胞的损伤，能够提供更加原生和真实的测序信息。这种特点甚至让单细胞的基因表达动力学研究成为可能。相信随着这种技术自动化的提高，将为单细胞测序技术带来更多可能。 参考文献：[1]. Genome-wide molecular recording using Live-seq, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Riccardo Dainese, Pernille Yde Rainer, Magda Zachara, Christoph G. Gäbelein, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, bioRxiv 2021.03.24.436752 DOI: https://doi.org/10.1101/2021.03.24.436752

[报告简介] 单细胞的操纵一直是细胞生物学领域的热点和难点，尤其是在不损害细胞活力的情况下从细胞中提取细胞器或将外源物质直接导入到细胞中。截止到目前，尽管单细胞技术有了较大的发展，但要实现将细胞器从一个细胞移植到另一个细胞，除了更大的卵母细胞外，几乎是不可能实现的。 线粒体和复杂的内膜系统是真核细胞的重要特征，是细胞中能量转换的核心，与细胞代谢和信号通路以及细胞命运紧密联系在一起。线粒体含有自身的遗传成分(mtDNA)，通常是严格垂直遗传给子细胞的。到目前为止，对活细胞内的细胞器进行操纵十分困难，将线粒体地转移到细胞的手段有限，对于线粒体移植后的剂量-反应关系分析更是十分困难，这样我们就很难从机制上了解健康或疾病细胞的线粒体移植后的生物学效应。多功能单细胞显微操作FluidFM技术能够从活细胞中提取、注射细胞器，将定量的线粒体移植到细胞中，同时保持它们的活力。 本报告分为两部分：1. 来自ETH的Dr. Christoph G. Gäbelein使用多功能单细胞显微操作FluidFM技术，将线粒体移植至培养的细胞中，并实时跟踪线粒体注射后的情况，监测它们在新宿主细胞中的命运。通过跟踪发现被移植线粒体与受体细胞线粒体网络融合发生在移植后20分钟，持续16小时以上。活细胞之间移植线粒体不仅为细胞器生理学的研究开辟了新的前景，也为机械生物学、合成生物学和疾病治疗开辟了新的前景。本次报告Dr. Christoph G. Gäbelein将对上述文章和数据进行详细分享。2. 2020年9月，国内套FluidFM多功能单细胞显微操作系统在北京大学生命科学学院顺利安装并交付使用。期间，在北京大学生命科学学院公共仪器中心光学成像平台覃思颖老师和Quantum Design中国工程师胡西博士的帮助下，成功举办多场workshop，FluidFM多功能单细胞显微操作系统助力北大发表多篇paper。本次报告中，覃思颖老师将分享多功能单细胞显微操作系统FluidFM技术的实验操作案例与运行维护经验。[直播入口]请扫描下方二维码进入FluidFM单细胞显微操作技术群，届时会在微信群中实时更新直播入口，无需注册！扫码进群，即刻获取直播链接，无需注册！[报告时间]06月08日 下午15:00-16:00 [主讲人介绍]Christoph G. Gäbelein，ETHChristoph是一名来自ETH的青年科学家，科研中他一直致力于将FluidFM单细胞显微操作技术应用于更多的生命科学场景中。在过去两年间，他以一作或参与者的身份发表了FluidFM多篇文章：2022 Mitochondria transplantation between living cells2022 Injection into and extraction from single fungal cells.2021 Single cell engineering using fluidic force microscopy.2021 Genome-wide molecular recording using Live-seq.Christoph对于FluidFM技术的应用具备丰富而完善的经验，文章也是高产的，目前Christoph已经成为了FluidFM技术领域的专家。本次Webinar，Christoph将介绍他应用技术的新成果，并详细阐述从活细胞中提取、注射线粒体，将定量的线粒体移植到细胞中，同时保持它们的活力的技术细节。Christoph的座右铭是：Curiosity-driven young scientist interested in fundamental cell biology 覃思颖，北京大学生命科学学院公共仪器中心光学成像平台工程师。2016年于北京大学获得生物物理学博士学位，博士期间以作者在Nature Materials发表论文，博士后期间入选届北京大学博雅博士后项目。2019年加入北京大学生科院公共仪器中心，负责原子力显微镜、多功能单细胞显微操作系统、共聚焦显微镜等大型仪器的技术支持与运行管理，在多尺度生物样品的原子力制样与成像力学检测、单细胞注射与分离等显微操作、生物荧光成像与图像处理分析等方面有着丰富的经验，为校内外100余课题组提供技术服务，辅助课题组在Nature、Cell、Nature Cell Biology等国际期刊发表论文30余篇。本次报告将分享多功能单细胞显微操作系统FluidFM技术的实验操作案例与运行维护经验。[应用简介]1. 从活细胞中提取线粒体 为了检测FluidFM探针对单细胞细胞器采样的能力。作者使用了两种探针，分别是锥型探针(A=1.2 μm2)和圆柱型探针(A=1.6 μm2)(图1B)。实验结果表明，使用这两种探针都可以对单个线粒体及多个线粒体进行提取或大量抽提。图1：(A) 示意图：使用FluidFM技术进行细胞器提取。通过调整悬臂探针中的负压(-Δp)进行提取。(B) 通过调节孔径大小和流体作用力的适用范围，选择性地提取不同的细胞器成分。1行：用悬梁臂探针提取单细胞细胞器的示意图。2行：不同孔径的悬臂扫描电镜图。3行：FluidFM悬臂探针孔径与对应的流体力范围。(C) 示意图：使用FluidFM技术进行细胞器注射。通过调整悬臂探针中的正压(+Δp)进行将探针中的细胞器注射到受体细胞内。 对线粒体提取后的细胞活力进行了检测，发现细胞仍保持较高的细胞活力 (95%)。为了进一步确保FluidFM提取方案在探针插入时不会破坏细胞质膜，作者使用荧光探针(mito-R-GECO1)监测细胞培养基中可能发生的Ca2+内流。实验显示，在操作过程中和操作后都没有Ca2+流入，表明细胞器提取过程中细胞质膜的完整性。 本研究还发现暴露在FluidFM负压下的线粒体小体会经历形状的转变，类似于“串上珍珠”的形态。 其特征是离散的线粒体基质球体状，并且通过细长的膜结构相互连接，在进一步负压拉力的作用下，这些球状结构终被拉断，并在悬臂中呈现为球状线粒体(图2E)。进一步探究显示，施加FluidFM负压后，力诱导的形状转变沿线粒体小管在毫秒到秒的范围内传播了数十微米。形状转变沿这一方向均匀传播，而外层线粒体膜(OMM)保持了初的完整性。当牵引力保持数秒后，OMM在先前形成的“珍珠”之间的一个或多个收缩点分离，从而产生立的球形线粒体，而管状结构的其余部分放松并恢复。结合线粒体牵引实验和线粒体定位的钙流实验，结果证明线粒体的串上珍珠表型的形状转变以及随后细胞质内的线粒体裂变是不依赖钙的。图2(A) FluidFM悬臂探针的扫描电子显微镜图像。具体尺寸参数是：L = 200 μm, W = 35 μm, H = 1 μm。Scale bar = 5 μm。(B) 提取线粒体后的FluidFM悬臂的荧光显微镜图像。由于折射率不同，可以看到提取物和悬臂探针填充物之间的边界。Scale bar = 10 μm。(C) 是图(B)的示意图，提取物的体积是1170 fL。(D- F) 活细胞器提取的延时图像和提取后金字塔悬臂图像。黄框表示细胞内的悬臂的位置。(D) 对表达su9-BFP(线粒体)和Sec61-GFP (ER) 的U2OS细胞进行提取。箭头表示ER区域。使用孔径为0.5 µm2的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。(E) 从表达su9-BFP的U2OS细胞中提取单个线粒体。使用1 µm2孔径的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。(F) 从表达su9-BFP的U2OS细胞中提取数个线粒体。使用1 µm2孔径的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。 2. 将线粒体移植至新细胞 研究人员的下一个目标是将线粒体移植到新的宿主细胞中，并保持细胞活性。FluidFM技术为线粒体转移提供了两种可能性方案：方案一、用FluidFM技术直接提取线粒体而后注入到新的宿主细胞中；方案二、将从细胞中分离纯化的线粒体回充入FluidFM探针，然后注射(图3A-D)。作者比较了两种方法，为了实现可视化的线粒体的转移，作者在供体和受体细胞中分别对线粒体进行了差异化标记 (图3E-F 供体细胞线粒体su9-mCherry和受体细胞线粒体su9-BFP)。当使用FluidFM直接将线粒体从一个细胞移植到另一个细胞时，成功率高达95%，而且保持了细胞活力(图3G, 41个移植细胞中有39个)。在注射纯化线粒体后，作者观察到46%的样本(19/41)发生了线粒体转移且保持了细胞活力(图3G)。移植的定量结果显示，这些实验中移植的线粒体数量从3到15个线粒体每个细胞不等(图3H)。两种替代方案的不同成功率可以由线粒体分离获取的条件差异来解释。在评估线粒体提取方案时，作者观察到部分提取的线粒体外膜发生破裂。线粒体的不可逆损伤导致细胞内降解，细胞色素C释放可能导致细胞凋亡。 虽然线粒体的细胞间移植降低了通量，但它的优点是细胞外时间短(1分钟)，并且通过FluidFM采样的线粒体大限度地集中在原生细胞质液中，完全避免了人工缓冲液的使用。在提取和移植之前，作者通过在探针中填充不混溶的C8F18来确保提取液在提取过程中保持在孔径附近。因此，只有很小的体积(0.5 - 2pL)被注入到宿主细胞中(图3B)。 除了标记供体细胞的线粒体(su9-mCherry)外，还标记了受体细胞的线粒体(su9- BFP)，这样就能够观察移植细胞线粒体网络的实时状态。在上述两种移植方案(移植和纯化后注射)中，宿主-线粒体网络的管状状态不会因注射过程而产生影响。此外，标记可以让作者可视化地监测线粒体地移植，观察线粒体地融合。 无论移植方法是细胞到细胞(图3I)，还是注射纯化线粒体(图3J)，都可以观察到这些过程。实验跟踪了22个细胞的移植命运：18个细胞显示移植的线粒体完全融合，4个细胞的线粒体发生降解。多数细胞样本(18个细胞中的14个)在移植后30分钟内次观察到融合事件。 如上所述，细胞间移植即方案一的效率高，并可以直接观察单个移植线粒体的命运。为了展示这一点，作者将标记好的线粒体(su9-mCherry)从HeLa细胞移植到差异标记的U2OS细胞(su9-BFP)中，这种细胞通常用于研究动态线粒体行为。高灵敏度相机可以用于追踪受体细胞内的单个线粒体(图3L)。作者观察到荧光线粒体基质标签在移植后23分钟的发生初始融合而后扩展到线粒体网络。 综上所述，作者建立了两种将线粒体转移到单个培养细胞的方法。 一种方法是活细胞间移植。该方案显示移植后细胞活力高，允许观察移植后线粒体的动态行为，是一种高效方案。二种方法是大量纯化线粒体并将其注射到受体细胞中。 注射速度相当快，但不可避免地损害线粒体和细胞功能。图3(A) 方案一示意图（活细胞间线粒体移植）：通过FluidFM吸入法提取线粒体。 随后，将带有提取物的悬臂探针移至受体细胞插入并注入提取物。(B) 方案一预填充C8F18的FluidFM悬臂梁的图像，被移植线粒体通过su9-mCherry标记，提取量~0.8 pL。Scale bar = 10 μm。(C) 方案二示意图（纯化线粒体注入细胞）：使用标准线粒体纯化方案纯化的线粒体进行线粒体移植的方案。 将纯化的线粒体重悬在HEPES-2缓冲液中，直接填充到FluidFM探针中并对细胞进行注射。(D) 方案二由su9-mCherry标记的FluidFM悬臂充满线粒体的图像。Scale bar = 10 μm。(E) 通过方案一（活细胞间线粒体移植）进行线粒体移植后的宿主细胞图像。宿主细胞的线粒体通过su9-BFP标记，移植细胞线粒体通过su9-mCherry标记。Scale bar = 10 μm。(F) 通过方案二（纯化线粒体注入细胞）进行线粒体移植后的受体细胞图像。宿主细胞的线粒体通过su9-BFP标记，移植细胞线粒体通过su9-mCherry标记。Scale bar = 10 μm。(G) 通过光学成像对两种方案注射的细胞进行评估。每种方法评估了40个细胞。(H) 两种方案的线粒体的计数评估。每种方法评估了22个细胞。(I) 方案一移植线粒体后，对移植线粒体(su9-mCherry)和宿主线粒体网络(su9-BFP)使用不同的荧光标记进行成像，融合。Scale bar = 5μm。(J) 方案二注入纯化线粒体后移的融合状态，标记方案同(I)。Scale bar = 5 μm。(K) 移植线粒体发生降解，分裂成多个更小的荧光囊泡(su9-mCherry)，荧光与标记的宿主细胞线粒体网络(su9-BFP)没有重叠。Scale bar=5 μm。 (L) 单个移植线粒体的延时图像序列(su9-mCherry)。细胞器供体为HeLa细胞，受体细胞为U2OS细胞，带有荧光标记线粒体网络(su9-BFP)。Scale bar = 10 μm。 讨论 FluidFM技术采用微型探针，可以在微环境中以高时空分辨率操纵单细胞或者对单个细胞进行采样，并与组学方法相结合，使细胞器的研究成为可能。FluidFM技术将原子力显微镜的高精度力学调节手段与光学检测下的纳米尺度微流控系统相结合，提供与单细胞操作相关的力学和定量的体积控制。这些特性在现有微型探针中是的，在本研究中，作者将FluidFM单细胞技术用于活细胞真核内和细胞间的细胞器微操作。成功实现了活细胞之间的线粒体移植。 该研究将启发人们将FluidFM技术应用于更多领域，例如，干细胞治疗中低代谢活性细胞的再生，作为线粒体替代治疗方法的一种备选方案等。此外，FluidFM技术为解决细胞生物学、生物力学和细胞工程等问题提供了新的视角。

近日，华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室及光遗传学与合成生物学交叉学科研究中心教授杨弋团队和浙江大学研究员任艾明团队合作，在活细胞RNA成像技术研究中取得突破性进展，相关研究在线发表于《自然-方法》。RNA是活细胞中最重要的生物大分子之一，它不仅能将遗传信息从DNA传递到蛋白质，还在各种细胞生命活动功能调控方面发挥重要作用。活细胞中的RNA是高度时空动态变化的，它们往往需要在特定时间、空间和丰度下才能执行正确的生物学功能。因此，发展活细胞RNA成像技术对于探究RNA的复杂时空动态变化规律和生物学功能至关重要。荧光RNA是近年新兴发展的RNA荧光标记与成像技术，其原理是利用RNA适配体作为标签，特异性结合小分子染料并激活其荧光。相较于其他RNA标记与成像技术，荧光RNA具有操作简单直接、对靶标RNA干扰小、信噪比高等优点。研究人员只需要将靶标RNA序列与荧光RNA适配体序列融合，加入染料配体即可实现靶标RNA的低背景原位实时标记与成像。杨弋与朱麟勇组成的交叉学科联合攻关团队此前发展系列高性能荧光RNA，在国际上首次实现高等生物细胞内不同种类RNA的原位标记与高信噪比成像，成功解决了活细胞RNA实时标记与成像的难题。然而，许多细胞生命过程需要多种RNA分子同时参与。因此，亟需发展具有生物正交的高性能荧光RNA来实现活细胞内多种RNA分子的同时标记与成像，进而解析它们的功能与调控机制。针对这一挑战，联合团队基于全新的分子设计理念与分子共同定向进化策略，发展了国际上首个可用于细胞成像的大斯托克斯位移荧光RNA，实现了活细胞RNA与基因位点的单激光双发射多色实时成像，并进一步在活细胞与活体动物上完成了RNA-蛋白质相互作用的实时监测。研究人员发展出一种Clivia荧光RNA适配体，它由30个核苷酸构成，同时结合不发光的染料分子，进而激活高亮度荧光。通过对染料分子进行修饰改造，该团队成功获得了光谱涵盖黄色到红色系列高亮度荧光RNA，再结合两种荧光RNA光谱特性，利用单色激光实现了两种活细胞RNA或基因位点的荧光成像。受益于Clivia小巧的结构，这种成像方式可被插入到多种小核RNA序列中，在不影响这些RNA本身定位与功能的情况下，实现高信噪比原位实时RNA标记与动态成像。研究人员随后发展了RNA-蛋白质相互作用检测技术，首次实现了活体动物中RNA-蛋白质相互作用的原位实时检测。Clivia具有高稳定性、高信噪比、高亮度，是目前唯一可用于活细胞分析的大斯托克斯位移荧光RNA，也是唯一可在活体上对RNA动态进行测量的荧光RNA。Clivia将为活细胞与活体RNA的多色成像以及RNA功能与调控机制研究提供极具价值的实用工具，也有望为活细胞与活体生物传感、即时诊断甚至实时诊断技术的发展提供新的机遇。

多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT，是将原子力系统、微流控系统、细胞培养系统合为一体的单细胞操作系统，采用不同孔径的微型纳米注射器，可实现单细胞注射（Injection）、活细胞内物质提取（Extraction）、单细胞分离（Isolation）、粘附力测定（Adhesion）、纳米打印(Nano-printing)等多种功能，更多功能及应用请参考如下文章。点击了解更多详情：多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT的原理与应用介绍本次讲座与培训将介绍FluidFM技术的原理及应用，着重讲解在活细胞单细胞组学领域的进展，Live-Seq技术可直接在活细胞无损提取细胞内容物进行测序工作，能够提供更加原生和真实的测序信息，让单细胞的基因表达动力学研究成为可能。报告信息：应用讲座：5月25日北京大学金光楼311上午09:30—10:30上机培训（扫码报名，名额有限）：5月25日北京大学金光楼126下午13:00—17:30报告人: 胡西 博士报名注册：点击此处或扫描下方二维码即可报名扫码即刻报名报告人简介：胡西，Application Scientist of Quantum Design China，加州大学洛杉矶分校博士后。主要负责单细胞显微操作设备的技术支持和市场推广活动，并具有丰富的流体力显微镜（FluidFM）的操作经验。主办单位：凤凰工程北大基地光学成像平台协办单位：Quantum Design 中国科研进展文章导读：单细胞测序在疾病诊断和细胞异质性研究中发挥着重要作用。然而目前的单细胞测序手段需要将细胞消化并裂解才能够进行，而细胞状态在这一操作中不可避免的会发生改变，因此很难掌握细胞真实的基因表达情况， 尤其对于基因通路上表达变化的检测为不利。近期苏黎世联邦理工学院使用FluidFM创建了一种原位活细胞基因测序方法，这种方法能够在不杀死细胞的情况下完成对细胞的测序工作。通过这种技术该团队成功完成单细胞RNA基因测序，并通过这种方法检测到了细胞的基因表达和细胞周期状态变化。下面本文就这项工作的具体内容进行阐述。1. Live-Seq测序技术简述由于单个细胞的RNA总量仅有10 pg。为了实现无损的单细胞测序，该团队先使用FluidFM对现有的scRNA-Seq单细胞测序的方法进行了优化。为了尽可能的接近Smart-Seq的测试条件，该团队采用了先将缓冲液吸入探针，然后再进行细胞提取的操作。这样可以确保所提取的RNA能够先与缓冲液混合，从而避免RNA的降解。通过这一方法，该团队成功实现了IBA细胞的测序，证明了这种方法的可行性（图1）。图1. Live-Seq技术a. Live-Seq技术的示意图和代表图片，黑色箭头指代液面；b. IBA细胞测序的质量控制图（n=10）。2. Live-Seq技术分析细胞系和细胞状态为了证实Live-Seq的有效性，该团队对多种细胞系进行了测序，这其中包括IBA细胞、小鼠脂肪干细胞和祖细胞（ASPCs）以及脂多糖处理的RAW264.7细胞和Mock处理的RAW264.7细胞。通过对这些细胞系进行测序发现，该方法能够区分上述细胞系，并且在特征基因检测中能够找到每种细胞所对应的特征基因，证明了Live-Seq方法的有效性（图2）。图2. Live-Seq单细胞测序区分细胞型及细胞状态a. 实验方法示意图，使用LPS和PBS对RAW细胞进行处理；b. 前500个高度易变基因的tSNE图；c. 前十的细胞型、细胞状态差别基因的热图；d. 小鼠基因图谱预测，使用前100个标记基因的团簇；e. Live-Seq对比scRNA-Seq的锚点分析，显示两者没有显著差异。3. Live-Seq技术对细胞的活力基本没有影响Live-Seq技术的优势在于提取过程中不会破坏细胞。通过对提取前后的测序对比可以发现，提取组与空白组之间的团簇没有显著性差异。并且通过对细胞形态的观察中，发现细胞的形态基本没有改变，并且多数细胞仍然能够正常分裂（图3）。图3. Live-Seq对细胞活力的影响a. 细胞实验的示意图；b. Live-Seq测序后不同时间点（1h,4h）的scRNA-Seq的tSNE图；c.不同时间点scRNA-Seq所有能够发现差异的基因（共12个）；d.不同时间点的细胞形态图片。4. Live-Seq技术能够记录细胞下游分子表型事件由于Live-Seq对细胞生理状态影响小，因此能够监测在细胞代谢过程中的基因变化。通过对比LPS处理的巨噬细胞周期实验中发现，Live-seq技术与对照组的细胞代谢水平相比没有明显变化，因此这种方法测量的数据十分接近细胞代谢中基因表达的真实水平。通过测序对比LPS处理与空白的测序结果发现Nfkbia与Tnf的表达为相关。这一结果也验证这种测序方法在检测细胞下游表型时的优势。图4. Live-Seq技术的单细胞纵向分析a. 实验示意图；b. 不同处理细胞的mCherry强度变化；c. 3~7.5h之间mCherry强度变化；d. Tnf-mCherry强度变化的线性回归模型；e. Nfkbia与Tnf在Live-Seq测序中的表达关系；f. Nfkbia与Tnf在scRNA-Seq测序中的表达关系；g. Live-Seq测序中细胞处于S期的评分；h. Live-Seq测序中细胞周期的mTnf-mCherry强度变化；i.Tnf-mCherry的荧光强度增量（3~7.5h）。5. Live-Seq技术对同一细胞多次测序Live-Seq技术的无损性甚至能够实现对单个细胞的多次测序。通过对单个细胞两次提取后细胞活力变化的观察中发现，细胞的活力即使在2次提取后仍没有发生明显的变化，基因型分析也没有发现明显的基因表型改变。图5. Live-Seq对细胞的多次提取j.连续测序的示意图和代表图像；k.Live-Seq的tSNE图；l.整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE图。6. 总结Live-Seq是一种十分具有前景的单细胞测序的新方法，得益于FluidFM技术的无损提取的优势，Live-Seq技术除了能够实现传统测序的功能外，还降低了细胞的损伤，能够提供更加原生和真实的测序信息。这种特点甚至让单细胞的基因表达动力学研究成为可能。相信随着这种技术自动化的提高，将为单细胞测序技术带来更多可能。参考文献：[1]. Genome-wide molecular recording using Live-seq, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Riccardo Dainese, Pernille Yde Rainer, Magda Zachara, Christoph G. Gäbelein, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, bioRxiv 2021.03.24.436752；doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.24.436752

2016年12月31日，中国科学院生物物理研究所徐平勇课题组、中国科学院计算技术研究所张法课题组以及美国科学院院士HHMI研究员Jennifer Lippincott-Schwartz合作在《细胞研究》(Cell Research)在线发表了题为Live-cell single molecule-guided Bayesian localization super-resolution microscopy 的文章，介绍了一种新型活细胞超分辨率显微技术及其独特优势。　　超分辨率荧光显微技术由于打破了传统光学衍射的限制，使得人们能够更深入地理解细胞生物学，获得了2014年诺贝尔化学奖。但是由于设备和时空分辨率的影响，活细胞超分辨率技术仍面临诸多挑战。近年来，贝叶斯定位显微技术(Bayesian analysis of the blinking and bleaching，3B)利用荧光蛋白漂白和闪烁的特性，通过分析整个图像序列的变化得到荧光蛋白的概率分布图，该方法用简单的光学设备就能实现活细胞动态结构的超分辨率成像，成为活细胞超分辨率成像的重要工具之一。作为细胞成像新的重要工具，它仍然有三个关键的问题没有解决：1)在精度方面，存在严重的结构缺失，定位精度不高 2)在速度方面，该方法极其耗时，为了得到1.5μ m的超分辨率结构，大约需要6小时，并且随着图像尺寸的增加，计算时间急剧增长 3)在分析尺度方面，由于速度的限制，该方法很难获得全细胞大尺度长时间的动态变化。针对以上问题，实验人员通过将单分子定位和贝叶斯技术相结合，开发了一种新型活细胞超分辨率显微技术(single molecule guided Bayesian localization microscopy，SIMBA)，该技术有以下优点：1)适用范围广，不需要任何额外的硬件设备，就能与主流TIRFM、PALM、STROM和light-sheet显微镜相结合，便于推广和使用 2)时空分辨率高，减少了结构伪迹的同时实现了50nm的空间分辨率和0.5-2s的时间分辨率 3)运行速度快，相比3B，加速比超过100倍，并且随着图像尺度的增大，加速效果更加明显 4)分析尺度大，实现了全细胞大尺度长时间动态变化分析。　　活细胞超分辨率显微技术是当前研究的热点，开发新型活细胞超分辨率成像探针和新方法是中科院生物物理所徐平勇课题组的重要研究方向。徐平勇、张法、Jennifer Lippincott-Schwartz为本文的通讯作者 徐帆、张名姝为共同第一作者。该工作受到国家“973”计划 、国家自然科学基金、北京市自然科学基金、中科院基金先导项目等的资助，并申请专利“一种贝叶斯显微成像方法”。SIMBA对于固定细胞actin和活细胞CLC重构结果展示

近日，华东理工大学光遗传学与合成生物学交叉学科研究中心杨弋、朱麟勇、陈显军团队在活细胞蛋白质标记与成像研究中取得重要进展，相关研究在《细胞发现》发表。 人造荧光蛋白及荧光探针。华东理工供图生物过程可视化一直吸引着科学家的好奇心。不同类型的荧光成像工具可以帮助科学家观察生命体中多种生物事件的发生过程，其中最著名的是荧光蛋白标记技术。荧光蛋白及其衍生技术经历了近30年的飞速发展，为生物学各个领域的研究作出了极大贡献，但伴随着显微镜技术的飞速发展，现有荧光蛋白的性质已经难以适应新型仪器的成像要求。相比之下，基于蛋白质标签和激活型荧光团的荧光标记工具凭借其理化性质成为新的研究热点。该团队针对自催化蛋白质标签SNAP-tag，设计开发了高信噪比的青色人造荧光蛋白SmFP485。SmFP485的荧光产生十分迅速，避免了荧光蛋白生色团成熟导致的延迟，因此可以用于实时监测蛋白质的合成过程。研究团队随后对SmFP485的结构进行了解析，探究了人造荧光蛋白的荧光激活原理。在此基础上，研究团队通过化学进化方法设计出一系列光谱覆盖绿色到近红外波段的人造荧光蛋白，它们均具有高亮度和高信噪比特点，特别是其在近红外波段的亮度已远超现有成像工具，能够对活细胞以及活体动物中的蛋白质表达、蛋白质降解、蛋白质组装、蛋白质相互作用以及蛋白质运输进行原位实时标记与成像。最后，研究团队在多色人造荧光蛋白的基础上，采用蛋白质与荧光团共进化的方法设计开发出一系列光谱涵盖青色到近红外波段的钙离子遗传编码荧光探针，实现了对哺乳动物细胞中钙离子震荡的实时监测，为荧光探针的构建提供了新的荧光载体。综上，研究团队开发了一系列高性能人造荧光蛋白，它们具有荧光产生迅速、亮度高、信噪比高、光谱范围广等优点，为活细胞以及活体动物中蛋白质的可视化提供了有力工具，同时也为荧光探针的构建提供了新的思路和策略。

在细胞治疗过程中，评价免疫细胞的增殖能力，以其对靶细胞的杀伤能力是细胞治疗过程中非常关键的环节。其中DELFIA® EuTDA细胞毒法和DELFIA® BrdU细胞增殖方法，凭借其高灵敏度、易操作性性等诸多优势，已逐渐成为主流的检测技术。在此，通过以下一系列的应用案例，我们将向大家展示DELFIA® EuTDA、DELFIA® BrdU、活体影像及放射性检测等方法如何助力免疫细胞杀伤研究。 一，CAR-T细胞杀伤毫无疑问，CAR-T疗法已成为当下最火的肿瘤细胞疗法之一。同样作为CAR-T大国，中国多数CAR-T疗法已进入临床研究，并且产业化发展迅速，而美国则还集中在临床前研发[1]。安全性是CAR-T疗法的一大挑战。除了细胞因子风暴外，CAR-T疗法还会诱发移植物抗宿主反应 （graft versus host disease GVHD）等安全隐患。鉴于选择性去除CD45RA阳性细胞能有效抑制GVHD发生[2]，研究利用CD45RA阴性T细胞群体开展靶向CD19的 CAR-T疗法，来提高治疗安全性。结合DELFIA的细胞杀伤检测法和基于Calcein-AM标记的流式法，研究证明CD45RA阴性 CAR-T细胞能有效杀伤CD19阳性肿瘤细胞系，并能作用于原代NK细胞杀伤耐受的MLL重排白血病原始细胞SJ4-11（K562为敏感细胞对照，RS4 11为耐受细胞对照）[3]。由于CD45RA-细胞主要为CD3+CD45O+记忆T细胞，因此针对常见的病原体和疫苗应有更好的回忆应答（Recall response）。通过使用DELFIA Cell Proliferation Assay 检测掺入的BrdU，研究确认CD45RA- T细胞对人CMV、Epstein–Barr 病毒、 herpes simplex 病毒和tetanustoxoid有更为显著的免疫反应（下图a，增殖指标）。基于同样的增殖检测平台，研究利用PBMC开展Mixed lymphocyte reaction (MLR)，对比不同细胞亚群的同种异体反应。相较于CDRA-效应细胞群体，CD45RA+细胞在MLR实验中具有更高的增殖能力（下图b）和IFN-γ分泌能力（下图c）[3]。 进一步的体内实验研究继续利用了PerkinElmer IVIS活体成像平台，在白血病小鼠模型的基础上，研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法在不诱导GVHD的同时，发挥强效的抗癌效果[3]。借助活体成像的优势，研究追踪CD19+ SEM细胞在小鼠体内的扩增情况，确认在接种18天后肿瘤的信号强度足以模拟顽固性白血病小鼠模型。在此模型的基础上CD45RA-的 CAR-T疗法同样能迅速发挥作用，两周内强力抑制生物发光信号至检测限以下。最后，基于同样的检测平台结合重复接种肿瘤细胞，研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法还能作用于复发白血病小鼠模型。 二，CAR-NK细胞杀伤CAR-T细胞疗法的成功和兴起也推动了其他类型的CAR研究，其中就包括针对实体瘤的CAR-NK疗法。相较于T细胞，NK细胞可以在没有抗体和MHC的帮助下靶向疾病细胞，因此能发动更为快速的免疫反应并能有效针对无MHC I表达的肿瘤细胞。同时, NK细胞更为安全，支持“Off-the-Shelf”的大规模生产和直接异体治疗。目前在国内已有多家医疗企业推动CAR-NK治疗，如博生吉的CD7 CAR-NK。在6月份的Molecular Therapy期刊上，广州医科大学附属第三医院的研究向我们展示了最新的CAR-NK临床应用。为了特异靶向肿瘤细胞表面抗原NKG2DLs，研究在NKG2D受体的胞外结构域基础上融合参与NK细胞活化的核心分子DAP12，并进一步通过RNA转染途径提升CAR-NK安全性。基于DELFIA的细胞杀伤检测法，研究证明NKG2D-DAP12 (NKG2Dp)能有效的裂解多种肿瘤细胞系，优于对照NK和NKG2D-CD3z(NKG2Dz)[4]。借助Perkinelmer提供的HCT116-luc报告细胞系，研究通过活体成像方法，在体内水平证明CAR-NK能有效控制肿瘤发展。进一步的临床研究证明CAR-NK的引入能迅速引起肿瘤退缩和肿瘤细胞减少，强调NKG2D CAR是一种很有前景的细胞治疗方案[4]。 三，T细胞杀伤T细胞不仅是免疫系统的核心成员，也是适应性免疫反应的基石。因此，T细胞功能的全面评价在肿瘤免疫疗法的开发过程中至关重要，其中就包括肿瘤疫苗的研发。早期基于经典肿瘤相关抗原gp100的研究证明细胞因子RANTES的引入能显著提升小鼠脾脏细胞的杀伤能力。同时，RANTES表达的时间点非常关键。疫苗引入前12和24小时表达RANTES能有效提升T细胞的杀伤能力，而48小时则没有这个现象。基于动物实验，研究推测多种细胞参与杀伤，包括CD8+，NK细胞和CD4+细胞群体。进一步基于DELFIA细胞毒法研究证明TRAIL和FasL参与了杀伤过程[5]。 除了传统T细胞杀伤外，DELFIA细胞毒法还可以被用于检测靶向T细胞的新型免疫治疗分子，如双特异抗体(BiTE)等的细胞杀伤功能[6]。 四，NK细胞杀伤鉴于NK细胞在天然免疫系统的重要性，其活力检测也是免疫检查点抑制剂研发过程中的核心项目。此外，NK细胞活力检测还可以用于衡量用于免疫疗法开发的新型小鼠模型。在2016年发表的一份研究中，基于DELFIA的细胞杀伤检测法证明PD-1抗体可以显著提升NOG-MHC Double Knockout小鼠脾中NK细胞靶向K562的杀伤活力。靶向免疫治疗的新小鼠模型不仅能加速新型免疫检查点药物（组合）研发，同时可以协助发现新的标志物预测疗效[7]。 除了直接杀伤靶细胞外，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）也是评价NK细胞功能的一个关键指标。在今年的一份研究中，DELFIA细胞毒法被用于衡量静脉注射免疫球蛋白( intravenous immunoglobulin, IVIG)对NK细胞功能的影响。从结果可以看出，除了阻断NK细胞的直接杀伤能力外，IVIG几乎完全抑制ADCC活力（下图上）[8]。在该研究中，除了ADCC检测外，Perkinelmer的放射检测解决方案（3 [H]-Thymidine和MicroBeta 2）也被用于衡量IVIG和免疫抑制药物对NK细胞增殖的影响。H3-掺入法证明相较于IVIG，免疫抑制药物能有效抑制NK细胞增殖（下图下），而IVIG则特异作用于T细胞活力。鉴于ADCC是单抗药物发挥临床效果的核心机制之一，其活力检测也成为大分子药物研发的必须环节[9]。 欢迎扫码登录珀金埃尔默生命科学试剂耗材平台，点击进入car-t细胞治疗应用专题关注二维码：进入试剂耗材平台：参考资料：[1] Jia Xin Yu, et al. The global pipeline of cell therapies for cancer. https://www.nature.com/articles/d41573-019-00090-z[2] Triplett BM, et al. Rapid Memory T-cell Reconstitution Recapitulating CD45RA-depleted Haploidentical Transplant Graft Content in Patients with Hematologic Malignancies. Bone Marrow Transplant. 2015 Jul 50(7): 968–977.[3] Chan WK, et al. Chimeric antigen receptor-redirected CD45RA-negative T cells have potent antileukemia and pathogen memory responsewithout graft-versus-host activity. Leukemia. 2015 Feb 29(2):387-95.[4] Xiao L, et al. Adoptive Transfer of NKG2D CAR mRNA-Engineered Natural Killer Cells in Colorectal Cancer Patients. Mol Ther. 2019 Jun 5 27(6):1114-1125.[5] Aravindaram K, et al. Transgenic expression of human gp100 and RANTES at specific time points for suppression of melanoma. Gene Ther. 2009 Nov 16(11):1329-39.[6] Lewis SM, et al. Generation of bispecific igG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat Biotechnol. 2014 Feb 32(2):191-8.[7] Ashizawa T, et al. Antitumor Effect of Programmed Death-1 (PD-1) Blockade in Humanized the NOG-MHC Double Knockout Mouse. Clin Cancer Res. 2017 Jan 1 23(1):149-158.[8] Pradier A, et al. Small-Molecule Immunosuppressive Drugs and Therapeutic Immunoglobulins Differentially Inhibit NK Cell Effector Functions in vitro. Front Immunol. 2019 Mar 27 10:556. [9] DELFIA经典技术应用于单抗研发及细胞治疗——AD0116细胞杀伤专题之ADCC https://mp.weixin.qq.com/s/0lkBdDHL5MFIyoeoFV4wWQ关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

最近，英国苏格兰圣安德鲁大学一个研究小组开发出一种新奇的方法，把一种微小的共振器放入人体活细胞内，一经照射就会发出荧光。研究人员指出，这一技术在细胞传感、医疗成像等领域有着广泛应用。相关论文发表在最近出版的《纳米快报》上。　　据物理学家组织网7月24日(北京时间)报道，研究小组多年来一直在探索以单细胞为基础的激光，希望在活组织内造出会发荧光的细胞，以便在这些细胞工作时跟踪它们，深入揭示身体内部机制，比如癌症是如何开始的。　　以往他们所用的光学共振器都比细胞要大，而新研究所用的共振器非常小，能放在细胞内。科学家曾把水母细胞中的绿色荧光蛋白引入到人类细胞中，然后用共振腔增强发光。新研究是对这一研究的扩展。　　研究人员诱导细胞“吞下”一种“回音廊式”的共振器，在细胞内部形成一个微小的泡泡——当用一束激光照射时，光会在泡泡内部反射而增强，共振器内的荧光染料就会发光。发出的光波长不同，其颜色取决于泡泡的大小和折射率，就像一个微小的植入式激光器。　　通过这种技术处理可以修改大量细胞。由于细胞发光可以持续一个较长的周期(几天或几周)，可以在较长时间里识别和跟踪活组织内的细胞，有望为研究人员提供一种很有潜力的手段，执行细胞内传感，自适应成像，还可能真正看到肿瘤细胞的生长过程。　　研究人员指出，目前这一技术还只用在实验室培养的活细胞中，但他们希望进一步研究能带来用于动物实验的细胞跟踪系统，并最终用于人类。

预计到2019年，全球活细胞成像市场将达54.5亿美元, 2014年该市场规模为35.7亿美元, 2014年到2019年之间的复合年增长率为8.8%。 　　市场的主要贡献来自于北美,其次为欧洲、亚洲和世界其他地区。在此期间预计亚洲增长速度最快。 　　活细胞成像包括利用显微镜和高内涵筛选系统获得的活细胞图像的研究。它已经成为单细胞生物机制和动态功能研究的受欢迎的分析工具。 　　全球市场可以按照产品、技术、应用和地区进行划分。基于产品，市场可以划分为设备、耗材、软件。2014年,设备部分占的市场份额最大。设备可以进一步划分为显微镜、独立的系统、细胞分析仪、影像捕获设备。2014年活细胞成像设备市场中,显微镜占比最大。耗材进一步划分为检测试剂盒、试剂、培养基等。其中，检测试剂盒占了耗材市场最大的份额。 　　在技术方面, 活细胞成像市场可以划分为荧光共振能量转移(FRET)，荧光原位杂交(FISH)，高内涵分析(HCA)，荧光光漂白恢复(FRAP)，比率成像、全内反射荧光显微术(TRIF)，多光子激发显微镜(MPE)以及其他技术。荧光共振能量转移(FRET)技术占最大的市场份额。 　　根据应用,活细胞成像市场可以划分为细胞生物学、干细胞、发育生物学和药物发现。2014年，细胞生物学市场份额最大。 　　有望刺激这个市场的关键因素包括：全球单克隆抗体需求的增加、制药和生物技术公司研发支出的上升。此外，新兴的亚洲市场,高内涵筛选逐渐成为主要的筛选手段，个性化医疗中活细胞成像技术应用的增加等可能会给市场带来巨大的机遇。然而，高内涵筛选系统的成本和知识渊博的专业技能人员的缺乏等可能会阻碍这个市场的增长。 　　全球市场中主要的厂商包括Carl Zeiss AG (Germany)、Leica Microsystems (Germany)、 Nikon (Japan)、 Molecular Devices (U.S.)、 PerkinElmer.(U.S.)、 GE Healthcare (U.K.)、 Becton, Dickinson and Company (U.S.)、Olympus Corporation (Japan)、 Sigma-Aldrich (U.S.)、Thermo Fisher(U.S.).

当地时间10月7日，瑞典卡罗琳医学院宣布，授予威廉凯林(William G. Kaelin Jr)、彼得拉特克利夫(Sir Peter J. Ratcliffe)及格雷格塞门扎(Gregg L. Semenza)诺贝尔生理学或医学奖，以表彰他们在“发现细胞如何感知和适应氧气供应”领域的卓越贡献。我们都知道，这次诺奖的核心发现就是围绕HIF-1（低氧诱导因子）这条信号通路，小编在这里不再赘述这条通路伟大而精妙的丰富内核，而要强调的是，人类的多种疾病都和常氧/低氧的调节有关，比如恶性肿瘤，肾性贫血，损伤修复，循环障碍疾病等，这次的三位诺奖得主已经为我们发现并阐明了生物体启动氧感知的重要钥匙，而仍然有太多未知的关键节点等待同道中人去探索发现。常用的方法包括体外化学模拟和体外物理模拟，说白了就是给细胞加工具药物（例如CoCl2）或者是低氧环境培养。对于有些细胞模型或研究方向来说，低氧环境培养是必不可少的，然而往往很多实验室的低氧培养设备和其他检测设备是分家的，或者甚至缺少低氧培养的相关设备，给许多实验设计造成了不大不小的困扰。点点点点一下嘛解决方案靠谱的隆重介绍所以Cytation & Lionheart氧浓度可调节活细胞检测系统上图便是能够便捷控制CO2和O2的气体控制装置，在面板上可以方便设定CO2和O2的浓度范围，比如上图，O2的浓度已经从常规的20%降低到5%。是不是惊讶于她的轻盈体型？咱们就是这么节约空间资源有木有！当然，作为控制器，是需要和咱们的核心检测设备Cytation或Lionheart搭载使用的，这样就能够完美实现低氧环境控制和灵活多样的活细胞检测同步进行（传送门）。新鲜小案例：研究一下3D细胞球的缺氧变化此前我们已经介绍过非常多的3D细胞的应用案例，由于3D细胞能够更好地模拟体内细胞的微环境，因此针对3D细胞培养的缺氧水平下的研究需求也是非常多的。11个小时内，人源肝细胞球内的低氧水平逐渐增加（Cyto-ID Hypoxia 染料用于标记细胞内缺氧水平，红色荧光信号增加，表示细胞低氧状态加剧） 请向后滑动_____通过Gen5软件的细胞圈选识别，可以对Cyto-ID标记的细胞缺氧信号定量分析。_____这个图展示了不同的分析方式下的信号倍比变化，数据说明一切，咱们还是需要选择对合适的分析方法__________使用低亲和力球形96板 ，能够快速的构建3D细胞模型（相关案例传送门），接入CO2和N2后，通过气体控制装置设定CO2条件5%，氧气条件8%，放入细胞培养板，即可在长时间内实时监测细胞球的形态或其他需要检测的指标。来自霍普金斯医学院的案例首先，Dr. Gilkes团队在分子水平，研究了多种乳腺癌细胞系在低氧（1%）培养条件下的HIF-1和RohB的mRNA水平及蛋白水平的表达变化，在发现显著差异后，当然是要研究一下这个关键的RohB在活细胞水平，特别是3D细胞培养模型中， 如何影响肿瘤细胞的表型变化，于是，Cytation和Lionheart就发挥了重，要，作，用啦。__

来自美国霍华德休斯医学研究所，Janelia研究园的科学家们，借助其发展的新光学超分辨率成像技术，在前所未有的高分辨率条件下研究了活体细胞 内的动态生物过程。他们的新方法显著的提高了结构光照明显微镜(structuredilluminationmicroscopy，SIM)的分辨率， 一种最适合活体超分辨成像的技术。 　　 　　新技术所拍摄的视频生动地展现了细胞内蛋白质的运动和相互作用。它们帮助生物学家理解细胞是怎样改变它们之间的依存结构，以及重整细胞膜结构使得细胞 外的分子可以被吸收到细胞内。来自Janelia研究园的研究员EricBetzig博士，李栋博士后*和他们的同事们基于原有的SIM显微镜原理新发展 了两种新的超分辨率成像技术。超分辨率光学显微成像技术能够跨越理论的分辨率极限，在极高的分辨率下展现细胞内的精细结构。但是，到目前为止，超分辨率显 微镜技术却依然不能进行有效的活体细胞成像。 　　“这些方法设立了超分辨率光学显微镜的成像速度和非侵入特性的新标准，它们使得超分辨率活体细胞成像成为现实。”Betzig博士说道。在传统的 SIM显微镜中，物镜下的物体被非均匀的结构光(类似于条纹码)所照明。在实验中，几束不同的结构光用来照明物体，它们和物体在不同角度混频所产生的摩尔 条纹被相机依次采集。然后计算机提取摩尔条纹编码的信息并将其解码生成三维的高分辨率图像。最终重建的SIM图像具有高于传统显微镜图像2倍的空间分辨 率。 　　Betzig博士和其他两位科学家因为发展超分辨率荧光显微镜而被授予2014年诺贝尔化学奖。他说道，SIM显微镜技术之所以没有得到像其它方法那 样多的关注，是因为其它技术能够提供比两倍更高的分辨率改进效果。但是，他强调SIM拥有两大其它的超分辨率方法所没有的优势。这些其它方法包括了两种去 年获得诺贝尔奖表彰的技术：他和同事HaraldHess博士于2006年开发的光激活定位显微镜 (photoactivatedlocalizationmicroscopy，PALM)，和受激辐射耗尽 (stimulatedemissiondepletion，STED)显微镜。但是，这两种技术都需要过多或过强的光来照明样品，以至于荧光蛋白很快被 漂白，细胞样品很快被损害，从而不可能长时间进行成像。然而，SIM在这些方面不一样，“我爱上了SIM，因为它的速度很快，而且它所需的照明光强度远远 小于其它方法。”Betzig博士说道。 　　Betzig博士在2011年MatsGustafsson博士去世后不久开始与SIM相关的研究。Gustafsson博士是SIM技术的先驱之 一，生前也是Janelia的研究员。Betzig博士那时已经深信SIM有潜力为解析细胞内部的工作机理提供重要的见解，如果SIM的空间分辨率可以被 提高，它对于生物研究的可用性将被大大增强。 　　在生前，Gustafsson博士和博士生HesperRego发展了一种利用饱和耗尽(saturateddepletion)的非线性SIM技 术，但这种技术在改进分辨率的同时需要使用很多的光照并且散失了SIM成像速度快的优势。Betzig博士想到了一种可以避免这些缺陷的方法。 　　饱和耗尽非线性SIM利用光可反复开关的荧光蛋白和其在开关过程中的饱和耗尽效应来提高分辨率。它产生图像的过程是，首先把所有的荧光蛋白分子激活到 可发光的状态(亮态)，然后用一束结构光把大部份的亮态分子反激活到暗态。通过结构光反激活之后，仅有少数处于结构光最弱区域的分子仍然保持在亮态。这些 光调控过程提供了物体的高空间频率信息，从而让图像更加清晰。这一过程需要重复25或更多次才能产生最终的高分辨率图像。Betzig博士说道，这一原理 非常类似于STED或另一种与其相关的叫做RESOLFT的超分辨率技术的原理。 　　这一技术并不适合于活体成像，因为激活和反激活荧光蛋白需要很长的时间。另外，反复的光照明会对细胞和荧光蛋白本身造成损伤。Betzig博士说道， “这一技术的问题在于你首先用光激活了所有的荧光蛋白分子，然后你马上又用另一束光反激活了大部份分子。这些被反激活的分子对最终的图像没有任何贡献，但 却被你用光“油炸”了两次。你让分子承受了很大“压力”，并且花了很多你并没有的时间，因为这段时间内细胞在运动。” 　　解决方法其实很简单，Betzig博士说道：“没有必要激活所有的分子。”在Betzig研究小组新发展的结构光激活非线性SIM的技术中，一开始用 结构光只激活样品里的一部分荧光蛋白分子。“这一结构光激活过程已经给你一些高分辨率的信息了。”Betzig博士解释道。另外一束结构光用于反激活分 子，额外的信息可以在反激活的过程中同时被读出。两个结构光叠加的效应给与最终图像62纳米的分辨率，这一结果好于原始的SIM，并且把由光波长决定的传 统分辨率极限改进了三倍。 　　“我们能够做到快速地超高分辨率成像。”Betzig博士说道。这很重要，他补充道，因为对于动态过程，单纯提高空间分辨率而没有相应地提高成像速度 是没有意义的。“如果细胞内部有的结构以1微米每秒的速度运动，并且我有1微米的分辨率，那么我需要在一秒内采集图像。但如果我有1/10微米的分辨率， 那么我就必需在1/10秒内采集图像，不然图像将变得模糊。”Betzig博士解释道。 　　结构光激活非线性SIM可在1/3秒内采集25幅原始图像，并从中重建出一幅高分辨率图像。它的图像采集很高效，只需用较低的照明光强，并且收集每一 个亮态荧光蛋白分子所携带的信息。从而有效地保护了荧光分子，使得显微镜能够进行更长时间的成像，让科学家们可以观测到更多的动态活动。 　　Betzig博士的团队利用结构光激活非线性SIM获得了在细胞运动和改变形状的过程中骨架蛋白的解体和自身再组装过程，以及在细胞膜表面的叫做caveolae的微小内吞体动态过程的影像。 　　在Science论文里，Betzig博士的团队也利用了已经商业化的高数值孔径物镜将传统SIM的空间分辨率提高到84纳米。高数值孔径限制了被光 照明的样品范围，从而降低了光对细胞以及荧光蛋白分子的损伤。这一方法可以同时对多个颜色通道进行成像，使得科学家们可以同时跟踪几种不同蛋白质的活动。 　　通过高数值孔径的方法，Betzig博士的团队观测了多个骨架蛋白质在形成粘着斑(链接细胞内外的物理链)过程中的运动和相互作用。他们也追踪了 clathrin修饰的内吞体的成长和内吞过程(内吞体将细胞外的分子转移到细胞内)。他们的定量分析回答了几个不能被以往的成像技术所解决的问题，例 如，内吞体的分布，以及内吞体尺寸和寿命之间的关系。最后，通过结合高数值孔径方法和结构光激活非线性SIM，Betzig博士和他的同事可以在超高分辨 率条件同时追踪两种蛋白质的活动。 　　Betzig博士的团队在进一步提高他们的SIM技术。他们也急切地盼望和生物学家一起探索潜在的应用并进一步改进这一技术的可用性。 　　现在，科学家们可以通过现在，科学家们可以通过JaneliaJanelia的高级成像中心利用这些新的的高级成像中心利用这些新的SIMSIM技 术，这个中心提供免费使用前沿的显微镜技术的机会。最后，技术，这个中心提供免费使用前沿的显微镜技术的机会。最后，BetzigBetzig博士说道， 使得博士说道，使得SIMSIM成为能够被其他实验室获得并能够承担的技术应该是比较直接的事。“大部份的‘魔术’在于软件而不是硬件。”成为能够被其他 实验室获得并能够承担的技术应该是比较直接的事。“大部份的‘魔术’在于软件而不是硬件。”

p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 活细胞成像技术已成为全球生命科学研究技术中必不可少的组成部分。经过多年发展，活细胞成像技术让科研人员的研究更加容易，如药物发现。此外，由于生物成像相关产品在各个研究领域中的广泛应用（如用于创建3D细胞建模、实时监测细胞的健康状况等），相应消耗品和售后服务产品的市场需求有所增长。 /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 432px height: 216px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202001/uepic/647ed1ca-de53-4a16-8c39-5103af00845a.jpg" title=" cells-1872666_640.jpg" alt=" cells-1872666_640.jpg" width=" 432" height=" 216" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 图片来源于网络 br/ /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 2019年11月，IBO的出版商国际战略方向（Strategic Directions International）发布了《2019年活细胞成像市场报告》，该报告研究了活细胞成像市场趋势、区域分布和行业需求。该报告将活细胞成像仪器分为五个技术领域： strong 光学显微镜，共聚焦显微镜，高级显微镜，高内涵分析 /strong 以及 strong 分析与标记 /strong 。报告还概述了提供这些技术的领先公司，其中包括徕卡显微系统公司（丹纳赫旗下）、蔡司、尼康、赛默飞和奥林巴斯等。 /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 435px height: 289px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202001/uepic/f8f2dfc7-c0b7-4ea3-a576-cdb87d8f1bd4.jpg" title=" 徕卡TCS SP8.png" alt=" 徕卡TCS SP8.png" width=" 435" height=" 289" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: center " 徕卡 TCS SP8激光扫描共聚焦显微镜 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 根据该报告， strong 2018年活细胞成像市场估计超过13亿美元，预计到2023年将实现高个位数销售额增长，达到19亿美元 /strong 。高级显微镜，高内涵分析系统和光学显微镜将占比最多。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 高级显微镜、分析与标记技术预计将成为增长最快的两个领域，到2023年，两者的销售额都将以高个位数增长。徕卡显微系统公司，蔡司和LaVision BioTec是提供高级显微镜产品的领先公司，而Bachem，Essen和赛默飞是分析与标记业务的领导者。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 在高级显微镜技术领域，由于供应商引入了改进的商业系统， strong 多光子和光片显微镜技术是主要的收入驱动力 /strong 。此外，服务和售后产品也为该技术行业的市场收入做出了贡献。成像分析和标记试剂技术领域涵盖了活细胞成像消耗品的最高百分比，成像分析占消耗品子市场的五分之一。标记试剂的需求源于不断的创新。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 从地域上看，2018年， strong 美国和加拿大、欧洲是活细胞成像技术的两个最大区域市场，中国是增长最快的区域 /strong 。这些地区的科研市场、制药和生命科学等终端市场对活细胞成像产品均具有高需求。该报告预测，到2023年，上述三个地区的销售增长将以高个位数增长。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 在终端市场方面， strong 制药/生物技术、科研市场以及政府终端市场在2018年的活细胞成像销售额中占最大份额 /strong 。科研市场和政府终端市场利用活细胞成像工具来研究细胞过程并记录定性数据。除了制药/生物技术领域使用该技术进行生物药物、治疗药物的开发，该报告还指出，由于个性化用药和癌症治疗的应用需求增加，医院和诊所对活细胞成像工具的需求将增加。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " strong 2017年-2019年，并购也是活细胞成像市场销售额增长的组成部分 /strong 。布鲁克于2017年以未公开的价格收购了光片显微镜制造商LUXENDO，以使其高级显微镜产品组合多样化。明年，布鲁克通过收购生物分子和细胞成像显微镜的供应商JPK Instruments来扩大其原子力显微镜的技术能力。今年，细胞成像板读取器制造商BioTek被安捷伦科技公司以12亿美元的价格收购。 /p

活细胞荧光成像是生命科学中不可或缺的研究工具。在荧光成像实验中，研究人员通常需将一个荧光团连接于细胞中的目标生物分子上。常用的荧光团包括荧光蛋白、量子点和小分子荧光染料等。其中，尺寸最小的小分子染料约为几个纳米，而多数生物分子本身的尺寸即在纳米级别。因此，如何进一步减小荧光团的尺寸，从而降低荧光标记对目标分子生物学功能的干扰是活细胞成像技术发展的一大挑战。 　　最近，生命科学联合中心陈兴研究组与北京大学生物动态光学成像中心黄岩谊研究组合作，开发了一种全新的活细胞成像技术，突破了成像标记基团的尺寸极限。为了实现这一目标，他们转向探索另外一种成像模式，即受激拉曼散射显微成像(Stimulated Raman Scattering Microscopy, SRS)。拉曼散射技术检测入射光与分子运动相互作用而引起的频率变化。一个化学键的振动即可产生特定的拉曼散射信号。基于这一特点，拉曼标记基团理论上可以小到一个化学键。 　　为了实现这一设想，两个研究组合作，发展了一种命名为&ldquo 生物正交受激拉曼散射成像&rdquo 的技术。自发拉曼由于散射截面小、灵敏度低，在生物成像的应用上受到很大的限制。近年来出现的受激拉曼散射成像技术极大地提高了成像的灵敏度和速度。在这项工作中，他们正是采用了这一前沿拉曼成像技术。同时，他们采用炔基作为拉曼报告基团。炔基的碳碳三键长0.12纳米，并具有较大的拉曼散射截面。更为重要的是，炔基的拉曼信号落在了细胞的&ldquo 拉曼静默区&rdquo (细胞中天然生物分子在1800 cm-1至2800 cm-1区间没有拉曼信号)。因此，炔基报告基团几乎没有背景干扰，即在拉曼光谱上&ldquo 生物正交&rdquo 。结合炔基代谢标记生物分子技术和受激拉曼显微成像技术，他们成功实现分子特异地标记成像活细胞的脂类、核酸、蛋白质和糖类。这一研究成果于近期发表于Angew. Chem. Int. Ed. (DOI: 10.1002/anie.201400328)。这项工作为活细胞成像提供了一种全新的技术，有望开启一系列荧光成像难以实现的研究。 　　北京大学博士研究生洪森炼和陈涛为该论文共同第一作者。该工作得到了国家自然科学基金委员会和科技部的资助。

显微镜技术取得重大突破!据最新发表在《自然》杂志上的文章，来自澳大利亚昆士兰大学的研究人员发明了一种量子显微镜，可使研究人员在的情况下检查活细胞，看到其他方式无法揭示的生物结构细节。这为生物技术的应用铺平了道路，且有望应用于导航、医学成像等领域。　　显微镜由量子纠缠提供动力，爱因斯坦将这种效应描述为“远距离幽灵般的相互作用”。　　来自昆士兰大学量子光学实验室和ARC工程量子系统卓越中心(EQUS)的沃里克鲍恩教授说：“这是第一个性能超过现有最佳技术的基于量子纠缠的传感器。”这台量子显微镜的成功首次证明，量子纠缠改变传感范式的潜力。　　量子显微镜的一个主要成功之处在于，它能够跨越传统光基显微镜的“硬障碍”。通常，传统的光学显微镜会在被观察的生物样本上聚焦照明光线，更强大的光源使研究人员能够更细致地看到细胞。但这种方法的精确度存在一个根本性限制：在某一时刻，足够明亮的光线会破坏活细胞。　　鲍恩和他的同事们已经找到了克服该问题的方法。他们使用了一种带有两个激光光源的显微镜，但通过一种特殊设计的晶体“挤压”了其中一束光线。它通过在光子(激光束中的光粒子)中引入量子纠缠来做到这一点。　　光子被耦合成相互关联的对，其中任何具有不同于其他光子能量的光子都被丢弃，而不是被配对。这一过程降低了光束的强度，同时降低了其噪声，从而可以进行更精确的成像。　　大约10纳米厚的酵母细胞的细胞壁及其细胞液，即使用最好的非量子显微镜，这两者的成像都是微弱的，用标准显微镜则是完全看不见的，而用量子显微镜则可以看到它们的结构细节，从而帮助我们在最小的尺度上理解生命的基本知识。　　英国埃克塞特大学的弗兰克沃尔默表示：“这是光学显微镜领域的一项非常令人兴奋的进展，它为改进最先进的显微镜的工作方式打开了大门，其光强度正好不会破坏生物样本。”　　鲍恩说，量子显微镜也将有实际应用。例如，光学显微镜经常被用来确定细胞是否癌变或诊断其他疾病，而量子显微镜可以显著提高这些测试的灵敏度，并加快测试速度。

日本研究人员日前利用新开发的显微镜，首次在世界上观测到了活细胞内的线粒体等非常微小的器官。 　　日本原子能研究开发机构和奈良女子大学研究人员说，他们联合开发出的新型显微镜称为“激光等离子体软X线显微镜”，它利用了波长比紫外线短但是比X射线长的电磁波“软X线”，无需使用荧光物质，就能观测到90纳米(1纳米是十亿分之一米)的微小结构。 　　原理上，光学显微镜的清晰度最多只能达到数百纳米，无法观察到制造细胞活动所需能量的线粒体，电子显微镜虽然清晰度高，但只能观察脱水干燥的死细胞。“软X线”具有难以被水吸收的特征，可以观察带水分的活细胞。 　　研究人员向金箔表面发射高强度激光产生等离子体，制造出“软X线”。然后将“软X线”照射感光材料上培养的细胞0.6纳秒(一纳秒是十亿分之一秒)，就拍摄下了线粒体。 　　新研究成果将于8月21日在美国举行的一个国际研讨会上正式发表。日本原子能研究开发机构研究员加道雅孝说，这是一款能够看到细胞内部变化的“梦幻显微镜”，有望应用于癌症研究等领域。

据美国物理学家组织网6月13日(北京时间)报道，美国马萨诸塞州综合医院研究人员成功利用表达了绿色荧光蛋白(GFP)的肾脏细胞产生了一种纳秒级的激光脉冲，首次用单个活细胞作为增益介质产生了激光。相关论文将于近日发表在《自然光子学》杂志上。 　　产生激光通常要有3个要素，第一是光源，第二是受激产生激光的“增益介质”，第三是将所产生的光聚拢到一起的“光学共振腔”。哈佛医学院皮肤病学副教授、论文作者尹淑贤(韩国名)博士说，激光发明50年来，通常都是用合成材料如晶体、染料、纯净气体作为光学增益介质，光脉冲在两面镜子间来回反射，在这些介质中被放大。而我们选择了能表达绿色荧光蛋白(GFP)的肾脏细胞作为增益介质。 　　GFP蛋白最初是在水母中发现，可在不添加其他酶的情况下诱导发光。研究人员给一个直径约20微米宽、1英寸(2.5厘米)长的圆筒两边装上镜子作为光学共振腔，共振腔内装满GFP水溶液，再向其中放入肾脏细胞。结果发现，肾脏细胞不仅能产生激光脉冲，而且能像透镜一样将光回聚并诱导激光发射。 　　更重要的是，该激光设备中的细胞在发光过程中仍然存活，能持续产生数百次激光脉冲。尽管单个激光脉冲比较微弱，仅持续几纳秒，但却很明亮，很容易探测到。 　　论文主要作者、马萨诸塞州综合医院马尔特加特说，这一成果源于好奇心。由于此前激光均由各种机械装置生成，他和同事就想，“为什么自然界中没有生物能制造激光”，产生了用细胞组织试试看的念头，结果显示这是有可能实现的。 　　对于这项成果的运用前景，研究人员提出了几种可能。首先，由于不同的细胞结构所产生的激光在光学性质上有差异，可以通过分析最后得到的光，来研究细胞和机体组织 第二，目前医学上有一种光动力疗法，可把对光敏感的药物送到要医治的机体部位，然后用光照来激发药效，如果在这种疗法中能用上“细胞激光器”，也许可以增进疗效。 　　但要在机体组织内产生激光，还要解决一个问题，即如何在机体组织内形成一个光学共振腔，而不是像本次研究那样利用外部的两面小镜子。“下一步，我们希望能在细胞里植入一种类似于镜盒的结构作为光学共振腔。而我们的长期目标是找到一种方法，将无生命的光通讯和计算机拓展到生物技术领域，这在一些涉及电子与生物组织转换界面的项目上尤其重要。”马尔特加特补充说。

p 　　近日，中国科学院上海应用物理研究所物理生物学研究室与加州大学圣地亚哥分校合作，发展了一种基于金纳米粒子的荧光-纳米等离子体双模态成像fPlas探针，并对其在胞内运输中的聚集过程及聚集态对其传输动力学的影响开展研究。相关结果发表于《自然-通讯》(Nature Communications, 2017, 5, 15646)。 /p p 　　胞吞及囊泡运输是细胞信号传导和能量交流的重要生理过程。其中，纳米粒子的胞吞和胞内运输过程研究是设计新型纳米药物载体和纳米诊疗方法的基础。物理生物学研究室的博士研究生刘蒙蒙和副研究员李茜等在研究员樊春海和加州大学教授Lal的指导下，通过发展fPlas探针实现了在单细胞水平半定量研究纳米粒子聚集状态的方法，可以清晰区分活细胞中呈单分散、小聚集体和大聚集体的金纳米粒子，并与暗场显微镜下的绿色、黄色以及亮黄色颗粒信号分别对应。他们进一步通过纳米等离子体成像与荧光成像的联用，实现了活细胞内纳米粒子聚集状态与定位信息同时获取。对金纳米粒子在细胞内通过微管进行运输，并且对在运输过程中发生逐步聚集的过程进行了实时成像，发现其聚集状态对相关囊泡的运动状态有重要影响。这一研究结果揭示了纳米粒子在细胞内的运输与其聚集状态直接相关，为设计新型纳米药物提供了新的思路和靶点。 /p p 　　 center img width=" 500" height=" 279" alt=" " src=" http://www.cas.cn/syky/201706/W020170614416182049650.jpg" / /center p /p p style=" text-align: center " & nbsp 上海应物所在金纳米粒子活细胞成像和胞内运输方面取得进展 /p /p

利用ImageXpress Micro进行长时间活细胞成像和心肌细胞功能评价 活细胞成像技术是最近几年兴起的一项技术，能够在细胞接近生理的状态下观察细胞形态改变和蛋白的表达，该技术能够避免传统采用固定细胞或组织的研究方法中，固定细胞过程中造成的细胞形态的改变和结构改变，能够更加真实的反映出细胞的特性，因而广受推崇。MD ImageXpress Micro高内涵系统具有多种特性能够进行长达数天的活细胞的观察，同时，由于采用著名的MD软件产品MetaMorph为基础的MetaXpress高内涵分析软件，具有极高的灵活性和扩展能力，除活细胞成像之外还能够能够对某些细胞（如心肌细胞）的生理药理特性进行评价。 神经细胞长时间成像 神经细胞是公认的较为敏感和脆弱的细胞，对于外界环境较为敏感。对于活的神经细胞的长时间培养和观察具有较大困难。采用ImageXpress Micro系统能够实现神经细胞的长时间观察培养。方法：从新生大鼠大脑海马获得约1立方毫米大小组织块。移入含有0.25%胰酶的离心管中37℃，5%CO2 孵育箱内消化20～30 min。加入含胎牛血清的培养液终止消化，离心重悬细胞，按0.6× 105/ml 铺于96 孔板中。24 h 后换为NeurolbasalMedium/B27 无血清培养液，以后每2~3 d 半量换液1 次。7 d 后获得原代神经细胞。 图像获取： 将样品放入有环境控制功能的MD ImageXpress Micro高内涵系统内，采用激光自动聚焦进行样品聚焦，在10X物镜下每隔5分钟进行一次相差图像拍摄，结果如下： 小结： ImageXpress Micro采用的环境控制系统能够维持细胞所需的温度、湿度和CO2条件，其中温度为细胞的酶活性提供了温度保障，确保细胞的生理机能，湿度维持能够保证细胞外液不会蒸发，避免了胞外渗透压的升高造成的细胞脱水，CO2能够维持细胞外液的pH值。 除了维持细胞的生存环境外，在进行敏感、脆弱细胞（如神经细胞）的长时间观察过程中，最为重要的是减小对细胞的刺激，尽可能的保持细胞的活性。ImageXpress Micro采用激光自动聚焦技术，在聚焦的过程中，细胞无需受到光照，这样就避免了细胞内的光化学反应和光照升温，能够很好的维持细胞的活性状态。因此，在长时间活细胞的观察过程中，以上两点不可或缺。心肌干细胞细胞的功能评价 ImageXpress Micro采用的软件系统功能强大，具有无限的扩展功能。因此，除了能够实现活细胞的长时间观察和细胞的形态、蛋白表达等分析，ImageXpress Micro还能够实现细胞功能学的评价。 干细胞研究是目前生物学研究的热点，采用人类的干细胞（如心肌干细胞）能够加快研究的速度，同时还能够真实反映人体细胞的功能，还能加快药物进入临床的速度。iPS来源的心肌细胞因其表达的离子通道、自发节律特性、与原代心肌细胞特性相似的特性尤其引人注目，通过该细胞可以进行心肌细胞特性的研究，并能缩短药物筛选的时间与临床前实验的周期。 方法： 采用Cellular Dynamics公司的iPS来源的心肌细胞，将其铺于96孔板，并在培养液中孵育2-7天，以Calcein AM孵育10分钟，将培养液弃去后，加入不同浓度的激动剂和抑制剂。 图像获取和结果： 心肌细胞的成熟状况要通过细胞自发的节律性收缩来进行判定。细胞的节律性收缩可以通过电生理的方法进行检测。但是电生理的方法相对较复杂，因此我们采用荧光图像的自动分析来取代。 首先采用延时拍摄或实时拍摄的方法我们可以获得细胞节律性收缩的一组图像，MetaXpress对心肌细胞跳动进行自动分析 图3. 将获得的心肌细胞跳动的一组图像生成图像堆栈，采用Journal扩展获得的功能模块自动分析相邻两个时间点图像的差别，一次来判定心肌细胞的跳动频率和幅度，采用功能模块中的计数器自动计算心肌跳动的频率和幅度。在Journal扩展的功能模块中以上功能自动完成，并直接报告心肌细胞跳动频率和幅度信息。 心肌跳动模式检测 我们采用经典阳性药物异丙肾上腺素、肾上腺素、咖啡因作为刺激剂，用已知的心肌细胞抑制剂乙酰胆碱来进行心肌跳动模式的检测和心肌跳动分析模块的功能。 图4：肾上腺素作用10分钟后，用ImageXpress Micro酶300ms拍摄一次，共拍摄15秒获得的一组图像分析获得的心肌细胞跳动的频率和幅度。 四种药物不同浓度作用下心肌细胞跳动频率的变化。细胞自发跳动节律各有不同，通常为20-40次/分钟。给药后的5-60分钟内，心肌跳动频率稳定，因此以上均为给药后10分钟检测结果。 小结：ImageXpress Micro采用的高度灵活的系统能够对心肌细胞进行自动成像，其采用的MetaXpress软件具有极高的灵活性，其具有的Journal功能能够根据图像和实验要求进行随意的扩展，除了进行心肌细胞生理学评价之外，还能进行超过1000个功能的扩展。

科学家们一直希望能够更清楚地看到大脑是如何工作的。以前研究人员只能在电子显微镜下摆弄死亡的脑细胞，而从来没有用高分辨率显微镜清晰地看到活的脑细胞在有生命的动物体内的活动图景。据美国物理学家组织网近日报道，现在，德国马克斯普朗克研究所的物理学家斯蒂芬和其同事将这一梦想付诸实现。相关论文刊登在最新一期美国《科学》杂志上。 　　斯蒂芬与该研究所的其他研究者多年来一直在研发一种被叫做“受激发射损耗” (STED)的超高分辨率显微镜。现在，他们将这项工作提高到一个新的水准。为了让实验结果更清晰，他们首先对一只老鼠的特定脑细胞进行基因修改，使其能够发出荧光，然后切掉老鼠头盖骨的一小部分，放进玻璃器皿里，通过STED观察那些发亮的脑细胞。同时，研究人员启动STED中所装置的软件以遮盖鼠脑里那些没有变亮的部分，这样即可在有生命的老鼠外部实时地再现出神经细胞的高清活动影像。 　　这个新型显微镜提供的清晰度可以达到70纳米级以下，四倍于以前的显微镜，足以帮助科学家观察到脑部树突棘的活动，树突棘是存在于哺乳动物大脑神经元树突上的小突起，构成中枢神经系统兴奋性突触传递的原始位点。 　　研究人员未来将有可能进一步发现这种新型显微镜的许多种用途，而其中最重要的领域是用于观察治疗精神病药物在脑部神经元突触里是如何工作的，也许还会引发制药学针对特殊疾病开发新药的突破性进展。

细胞迁移，指的是细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。移动过程中，细胞不断重复着向前方伸出突触/伪足，然后牵拉后方胞体的循环过程。细胞骨架和其结合蛋白，还有细胞间质是这个过程的物质基础，另外还有多种物质会对之进行精密调节。细胞的运动有很多种，有生理性运动，如发育过程中的细胞运动，生殖细胞、干细胞的成熟过程中的位置变化。也有病理性变化，如肿瘤的迁移和侵袭。从癌症的产生到转移，血管供给以及分裂增殖都一直是医学和生物学研究的热点。癌症细胞增殖失控，短时间内可以繁殖出大量后代，这样首先会造成生长空间的局促和养分，如氧气的紧张。这样恶性肿瘤内会形成一片坏死区，正如上面在组织损伤里面提到的，机体会尝试“修复”这些损伤。坏死组织会释放出一系列促血管生成因子，如血管内皮生长因子以及各种免疫细胞，如巨噬细胞。巨噬细胞也会释放大量促血管生成细胞因子和生长因子。因此肿瘤的研究伴随着复杂的细胞运动，如肿瘤细胞沿着循环系统的运动，血管内皮细胞和免疫细胞进入肿瘤实体的运动。划痕法是经典的细胞行为学检测方法。在平铺的细胞单层上划出一条痕迹，然后清洗更换培养液后，细胞会从原有位置向划痕处迁移。统计划痕宽度和面积的变化就可以监控细胞迁移的速度和细胞迁移的能力。以前在做划痕实验的时候受到诸多限制：首先微孔板的孔不能太小，孔越小，枪头越难伸进去；其次划出的痕迹边缘歪斜，无法形成一条直线；孔与孔之间的划痕宽度也不均一。这给划痕这个时间梯度的实验带来了很大的困扰。在多次的拍照过程中，由于划痕宽度的差异性对于划痕拍照位置的复位要求甚高。然而随着细胞迁移的发生，细胞的原位的形态和分布也发生的动态变化。所以复位划痕的拍照位置成为就成为了一个力气活：既然无法准确找到，那就全部拍下；既然每个位置宽度不一，那就全部统计。借助MuviCyte™ 长时间活细胞成像系统的划痕套装。轻轻一划，解决全部困扰。借助Scratcher整齐的96针，可以在96孔微孔板底面整齐的划出宽度均一的划痕。借助MuviCyte™ 长时间活细胞成像系统可以盯住一个视野不停的拍。然后生成无抖动的视频。借助专业的划痕分析软件，对划痕宽度、面积、愈合速度进行分析，可以获取的参数包括：划痕面积划痕的覆盖度划痕的宽度划痕的愈合速度相对划痕密度对于原始细胞区域、原始划痕区域、划痕分界线、迁移后细胞的区域进行精准的划分，保证分析结果的精确。轻松的完成整个实验，再也不用熬夜拍划痕了。MuviCyte™ 已于2020年1月1日全新上线，借助它的多荧光通道和多种物镜选择，可以完成多种复杂的复杂细胞模型的拍摄和观察，在肿瘤免疫、干细胞等多个领域都有重要的应用。扫描下方二维码或点击下载链接，即可下载珀金埃尔默MuviCyte™ 活细胞成像系统相关资料。下载链接: http://hyw3rjq7ezkfsnvu.mikecrm.com/naj9QZD

本文介绍流式细胞仪进口国内收货人资质|进口流式细胞仪报关注意事项|进口流式细胞仪清关单证|进口流式细胞仪报关流程手续|进口流式细胞仪海运清关换单要求。进口流式细胞仪报关代理手续下面我们来简单分析下上海港进口流式细胞仪的大致通关流程：一般进口流式细胞仪远洋线的靠上海洋山港，近洋线的靠上海外高桥港。目前海运的货物有舱单后可以提前申报清关。进口流式细胞仪一般需要收货人需要以下资质：A.进出口权（对外贸易经营者备案表）B.海关注册登记证C.用电子口岸法人卡签约通关无纸化进口流式细胞仪申报一般需要提供以下文件：A、海运提单B、INVIOCEC、装箱单D、贸易合同E、申报要素F、协定产地证（如享受协定税率）G、其他需要的文件（具体货物具体分析）进口流式细胞仪报关代理手续进口流式细胞仪海运换单一般所需资料如下：①海运提单（如电放则电放提单打印）盖章②电放保函（如提单为电放，有些船公司有固定格式，需要提前落实）③对外贸易经营者备案表（提单上的收货人英文名称与对外贸易经营者备案表上保持一致）④国外收货人章+国内通知人章（如提单收货人显示为TO ORDER）⑤其他所需文件海运进口流式细胞仪清关的一般流程：落实国外资料——查询是否有舱单——进口申报缴税——查验（如发生）——进口换单——送货——目的地查验（如有）【知识拓展】国际海运中集装箱拼箱运费的一般计算方式LCL运费计算主要采用“W/M”方式。通常货物运费吨分重量吨(W)和尺码吨(M)。按商品的毛重以1000千克为1重量吨 以1立方米为1尺码吨 计费标准“W/M”是指按商品的重量吨和尺码吨二者择大计费。在理论上一般默认单位费率是固定的，求解时更多只考虑运费吨单个变量的比较。但在实际业务中，不同货代给出的拼箱费率按重量吨和尺码吨往往是不相同的，在这种情况下就要考虑双重变量，根据不同费率、运费吨组合计算后再行比较。比如说，某商品重量5吨、体积8立方米，“W/M”费率是USD100/60，那么最后的运费总额就不能只看W和M的比较，而是5×100和8×60的比较，最后按总额高者重量吨的标准收取500美元。在计算FCL包厢费率时，要根据体积大小按照(40尺-20尺-拼箱)的先后比较顺序。同时有两方面一定要注意：一是涉及到LCL时，要注意“W/M”是将运费吨和费率的乘积进行比较，按拼箱运费高者计价 二是总运费计算时，不管是FCL还是FCL+LCL，一定要按总运费最低价来核算。低硫附加费LSS的含义低硫附加费（Low Sulphur Fuel Surcharge，缩写为LSS）是众多航运附加费中的一种，是指为弥补在新的硫氧化物排放控制区域航行船舶使用低硫燃油所增加的成本而收取的附加费。为支持全球节能减排，国际航运业、国际海事组织等先后出台船舶排放标准，要求在排放控制区严格控制船舶燃油排放物中硫化物的含量。航运中常规燃油为重质燃油，硫含量通常高于前述标准。为符合排放控制区含硫量要求，航运公司必须使用不同类型纯度更高的燃料，往往就多出的这部分额外成本向收货人征收低硫附加费。

近日来自美国乔治亚大学的一项新研究首次绘制出了一幅蓝图，揭示了干细胞是如何连接到一起对不断受到的外部信号分子做出响应的。这一研究发现使多年来自世界各地实验室相互矛盾的实验结果趋于一致，并使科学家们获得了精确调控干细胞发育或分化为特异细胞类型的能力。 文章的主要作者是乔治亚研究协会著名分子生物学学者、乔治亚大学富兰克林艺术与科学学院教授Stephen Dalton 。Dalton 表示：&ldquo 我们可以利用该研究中的信息作为指南书来调控干细胞的行为，这样就能够将这些干细胞以更有效和更加可控的方式分化为治疗细胞类型。&rdquo 举个过去的例子，某些信号分子单独作用就可激起一连串调控细胞命运的事件。从另一方面，Dalton的研究揭示了几种分子之间复杂的相互作用调控了一种重要的&ldquo 开关&rdquo ，决定了干细胞是维持自我更新状态或是分化为某种特殊的细胞类型，例如心脏、大脑或胰腺细胞等。 美国国家卫生研究院国立普通医学科学研究所干细胞生物学基金监管人Marion Zatz说：&ldquo 干细胞研究中面临的最大挑战之一就是如何调控干细胞转变为一种特异的细胞类型，这项工作涉及到了这一点。在这篇文章中，Dalton博士将几道谜题拼合到了一起，为了解多重信号通路如何协同作用操纵干细胞分化为特异的细胞类型提供了一个模型。这一研究不仅加深了对于胚胎发育的基础了解，还将推动再生医学中干细胞的应用。&rdquo 过去在干细胞分化研究中，科学家们对于一种称为Wnt的信号分子的作用持各种相反的观点。有一半发表的研究结果认为Wnt的作用是关闭分子开关，使干细胞维持在未分化状态。而另外一半的研究则提出了相反的结论。 那么相同的Wnt分子是否有可能导致双重结果？事实证明，答案确实是如此。Dalton发现少量的Wnt信号可使按细胞维持在多能状态，而大量的Wnt信号则起相反作用，促进细胞分化。 然而Wnt并非单独发挥功能。其他一些分子，诸如胰岛素样生长因子（IGF），成纤维生长因子（FGF2）和Activin A都能在其中发挥作用。这些信号分子相互放大彼此，使得在一种情况下放大2倍的信号，在另一种情况下被放大到10倍，从而使得情况变得更为的复杂。同时，信号进入的时机也会产生影响。 Dalton 说：&ldquo 让我们感到惊讶事情之一是所有这些信号均相互沟通。你不可能在调控IGF信号通路时不影响FGF2信号通路，你也不可能在调控FGF2信号通路不影响Wnt。它就像纸牌搭的房子，所有的一切完全是相互关联的。&rdquo Dalton和他的研究小组通过五年的艰辛努力，构建了一些关于这些信号分子如何发挥功能的假说，并对它们进行了验证。在面临着意料之外的结果时，他们不断重建假说，重复验证。持续这一过程直至解决了整个系统。 他们的研究发现使科学家们更深入地了解了干细胞分化第一步，Dalton相信相同的方法还可用于理解随胚胎内细胞分裂形成越来越特化的细胞类型，后续的发育步骤。

在婴儿呱呱坠地之前，受精卵是如何发育成复杂个体的？为什么正常的细胞会慢慢变成癌细胞？　　细胞是生命的基本单位，了解它的过去、现在和未来不仅有助于人们了解正常发育的过程，也对理解疾病的产生和发展至关重要。然而，“看清”细胞的“前世今生”仍然存在显著的技术困难。　　8月17日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所研究员陈万泽作为共同第一作者在《自然》发表长文，介绍了研究团队在国际首创的活细胞转录组测序技术（Live-seq）。该技术首次让单细胞进行转录测序后依然能保持细胞存活，实现了活细胞全基因表达的连续观测。　　“该研究实现了使用Live-seq技术对同一个活细胞多次分离部分细胞质进行多次转录组测序的可行性，表明这一技术有望在将来用于构建单个活细胞的转录组系列变化动态。该研究为单细胞转录组测序提供了全新的研究策略，为我们理解生命过程的动态变化提供了强有力的手段，是这一领域的又一重大突破。”北京大学生命科学学院教授汤富酬评论道。　　不杀死细胞就能测序　　人体内的细胞拥有几乎一样的基因组，但是为什么能够产生多种多样的细胞？基因组中数万个基因的表达与否和表达量的高低，很大程度上决定了细胞的种类和功能，比如神经细胞、免疫细胞、各种肿瘤细胞等。　　如果知道细胞不同时间的基因表达的变化，就能够了解细胞的过去、现在和未来。　　当前，单细胞转录组测序技术是了解细胞状态的重要手段。就像看一张“高清照片”，通过单细胞测序能够看清细胞现在所有基因的表达状态。但是，这些技术在理解细胞状态“电影”般的动态变化上却面临很大的挑战。　　“利用单细胞转录组测序技术观测细胞状态的前提是将细胞裂解，提取其中的RNA来测定每个基因表达量的高低，这样就不可避免地杀死了细胞。”陈万泽说，“此外，使用单细胞测序技术也只能了解到一个细胞当下的状态，却不能获得它的过去，也无法知晓它将来的功能。”　　通过近7年的努力，陈万泽与合作者开发了活细胞转录组测序技术Live-seq，其核心是通过对活细胞中的部分细胞质进行微创提取，并对极其微量的细胞质RNA进行扩增，在单细胞转录组测序后依旧保持细胞的存活和功能，从而实现细胞动态变化的跟踪。　　论文通讯作者、瑞士洛桑联邦理工学院教授Bart Deplancke表示，该技术兼具全基因表达分辨率和动态解析能力，是目前对单细胞转录组直接动态测量、偶联细胞现有状态及其后续表型的唯一解决方案。　　两次碰壁，终于“钓”出RNA　　如何在不杀死细胞的前提下看到细胞的动态变化？　　“我们首先想到的是外泌体，它是细胞向外面吐出来的小泡，里面有蛋白、RNA等物质。如果我们把单个细胞的外泌体都收集起来，再对其中的RNA进行测量，或许就可以在一定程度上反映细胞状态而又不杀死细胞。”陈万泽说。　　单个细胞中仅有10皮克RNA，相当于1克的一千亿分之一，而细胞外泌体中的RNA更是少之又少。研究团队设计了微流控芯片来完成单细胞捕获、外泌体收集等过程，发现由于外泌体中的RNA数量太少，根本无法实现单细胞分子水平的观测。　　随后，陈万泽尝试利用在生命科学领域非常小众的原子力显微镜——它有一个很尖的硅探针，多用来检测物质表面性质。研究团队对探针进行表面活化、修饰、洗脱等改造后，让其能够把细胞中的RNA“钓”出来。　　“这种探针很细，对细胞的损伤很小，就像‘鱼钩’一样，改造后可以把细胞中的RNA‘钓’出来，又能保证细胞继续存活。我们改造了数十个探针后，结果只在两个细胞上成功‘钓’到了基因。”陈万泽回忆道，当时购买一个原子力显微镜探针需要800美元，研究成本太高，成功率太低，让这项研究再次受阻。　　瑞士洛桑联邦理工学院学科交叉氛围浓厚。在一次偶然的学术交流中，陈万泽与导师了解到，瑞士苏黎世联邦理工学院的Julia Vorholt实验室开发了一种特殊的原子力显微镜，能够吸出一部分细胞质。　　一番交流后，两个课题组一拍即合，展开了联合攻关。联合团队对一系列实验过程进行了优化，解决了RNA降解、低温下的快速操作、超微量样品转移、采样通道清洗避免交叉污染、图像下追踪细胞等多种问题，以保证实验结果的可靠性。　　联合团队利用重新改造后的Live-seq，对5种类型共295个细胞进行了测序，发现Live-seq能够有效区分不同类型的细胞，且平均每个细胞能检测到约4112个基因的表达信息。　　仅对少量的细胞质进行测序，是否就能代表细胞的状态？“我们平行比较了单细胞测序结果，发现活细胞测序结果与普通的单细胞测序结果高度吻合，证明Live-seq能够很好地体现细胞的全转录组状态。”陈万泽说。　　细胞的存活率又如何保证呢？　　“原子力探针尖端只有几百个纳米大小，而且能和细胞膜密封，对细胞损伤极小。吸取约5%至50%的细胞质后，细胞体积可以快速恢复到正常水平，存活率在85%至89%之间，细胞能进行正常分裂。通过一系列的功能分析和分子表征，我们没有发现Live-seq对细胞状态有显著影响。”陈万泽表示。　　对此，审稿人在评审意见中也写道：“由于细胞测序后仍旧存活，Live-seq首次实现对同一个细胞全基因表达的连续测量。”　　细胞测序史从“高清图片”到“高清电影”的跨越　　在细胞观测技术史上，显微成像和基因编辑介导的分子记录等技术不仅能观察细胞水平的生长、分裂、死亡等过程，还能观测细胞中的单个或几个基因指标。　　2009年，单细胞转录组测序技术为更系统、全面地定义细胞类型和状态提供了变革性手段。但人们仍然只能观察到细胞的静态状态，无法连续观测细胞动态或者检查细胞后续的表型。　　如果把利用单细胞转录组测序技术观测细胞比喻为看一张细胞在分子水平的高清图片，那么利用Live-seq观测细胞就好比看一部高清电影，能够看见细胞的“前世今生”。　　“Live-seq可以回答细胞的过去怎样决定它的现在，不仅知道细胞中为何存在差异，还知道这些差异从何而来。”陈万泽介绍道。　　在验证实验中，团队利用Live-seq直接测定了同一个巨噬细胞在不同时间的状态变化，发现细胞起始状态的少数基因的表达差异和噪声（如Nfkbia、Gsn等）是决定细胞后续反应差异的重要原因。相对而言，普通的单细胞转录组无法找到这些规律。　　陈万泽表示，尽管Live-seq仍然存在诸多挑战，需要进一步完善，比如低通量、暂不能在体内应用、在高度极化且mRNA分布不均的细胞中无法实现全细胞转录组测序、对细胞更多次的采样还需进一步研究等，但该技术首次实现了活细胞连续观测，为单细胞测序技术发展带来了更多可能性。未来，团队将进一步提高Live-seq技术的实用性。

细胞是生物体基本的结构和功能单位，是生物学研究的基础。传统的细胞观察是通过倒置相差（荧光）显微镜来观察细胞生长或给药前后的形态变化。但是，传统的活细胞观察方式，仅能观察到细胞瞬间的生理信息，无法反映其长时间、连续、全面、动态过程的全部信息。▲ 图源：网络，侵删随着科学的进步，人们对活细胞观察的需求和要求越来越高。如细胞三维培养观察（类器官培养观察），药物筛选等。且在药物筛选实验过程中，需要观察给药后，细胞的形态变化、生长、分化、迁移、凋亡、蛋白的表达分布和细胞器观察等。这需要显微镜长时间观察和聚焦不同焦平面的细胞，并且光毒性要小，因为用荧光观察细胞内的蛋白分布时，荧光会对细胞产生一定的损伤；对一些细胞聚集成团的厚样品来说，需要显微镜具有Z-Stcaking和三维重塑功能且分辨率要求高；同时药筛具有高通量需求，在多孔板内药筛实验中，活细胞观察需要显微镜快速在多样品孔之间进行切换、自动聚焦和荧光通道切换等，这些活细胞观察需求对显微镜功能模块要求极高。▲ 图源：网络，侵删请注意！Revolution正倒置一体电动化智能显微成像系统所设计的功能模块完美契合活细胞观察，近为之而生，搭载的实时DHR技术，使分辨率得到进一步突破，简单多功能的联用让您感受不一样的操作体验。HyperScan高速拼接大视野成像功能，即可以快速扫描整个样品孔又能解决高倍镜下视野小的问题。孔板导航成像功能（Multi-well Point）结合延时摄影成像功能（TimeLapse）、自动对焦与长时间锁焦，再搭配活细胞工作站和全自动载物台，可以实现孔板中活细胞长时间观察又可以一次性研究筛选多种不同浓度的药物对细胞的影响。Z-Stacking+DHR功能再结合自动LED荧光系统，可以更加清晰的观察细胞内不同蛋白的分布，进行三维重塑，同时降低荧光光毒性和光漂白。高速高灵敏相机捕捉微弱荧光信号，使图片结果更准确更清晰。Revolution正倒置一体电动化智能显微成像系统是一台专业的智能活细胞观察显微成像系统，对从事研究活细胞观察研究的您，必须拥有一台高颜值、高性能、易操作的研究级显微系统，Revolution您值得拥有！

p 　　单个细胞是地球上细胞生命体功能和进化的基本单元。单细胞精度的高通量功能分选是解析生命体系异质性机制、探索自然界微生物暗物质的重要工具。单细胞拉曼光谱(SCRS)能够在无标记、无损的前提下揭示细胞固有的化学组成，因此拉曼激活细胞分选技术(RACS)日益受到广泛关注。但是分选通量是当前限制其广泛应用的最重要的瓶颈之一。据此，青岛能源所单细胞中心马波研究员与徐健研究员带领的多学科交叉团队通过耦合SCRS和液滴微流控技术，发明了拉曼激活单细胞液滴分选技术(Raman-activated single-cell Droplet Sorting RADS)，这是目前已公开报道的工作中分选通量最高的RACS系统。该工作于11月3号在线发表于Analytical Chemistry。 /p p 　　单细胞中心前期发明了基于微流控芯片的流式RACS技术(Zhang, et al, Analytical Chemistry, 2015)，通过集成基于介电的单细胞捕获释放和电磁阀吸吮技术，实现了高速流动状态下单细胞的捕获、拉曼采集、释放和分选，通量达~60 个细胞/分钟。为了进一步提高通量，研究人员提出，单细胞经液滴包裹后，通过耦合介电可实现超高通量分选。液滴包裹不仅可以保护细胞免受分选过程中的损伤，还能够与分选后细胞的培养、DNA、RNA、蛋白等的提取与分析等无缝衔接。因此，RADS技术有着广阔应用前景。 /p p 　　然而，在RADS技术中存在诸多技术难题。首先，液滴表面凸/凹的形状会产生透镜效应，从而影响拉曼激光聚焦，降低空间分辨率，最终导致无法获取液滴中细胞的拉曼信号。其次，单细胞液滴包裹需要油相的引入，而油相具有强拉曼背景，会严重影响细胞拉曼信号的精确获取。第三，如何实现拉曼采集、分析、单细胞液滴包裹及分选的自动化集成未见先例。单细胞中心研究人员巧妙利用先获取单细胞拉曼信号，后进行单细胞液滴包裹的策略，有效解决了液滴对拉曼信号采集的影响 同时，在线集成液滴发生和分选同步进行，大大简化了系统操作步骤 最后，通过自主开发的软件，实现了拉曼采集、分析、单细胞液滴包裹及分选的高度自动化。该系统实现了高产虾青素之雨生红球藻的精确化(分选准确率高达98.3%)、高通量(260 细胞/分钟)筛选。研究人员还证明，分选后有92.7%的雨生红球藻细胞保持活性并可增殖，和未经分选的对照组相比没有显著性差异，说明RADS技术充分保护了细胞的活性。 /p p 　　单细胞中心前期已证明，基于单细胞拉曼成像的拉曼组(Ramanome)技术能够非标记、非破坏性地识别与分析几近无限的细胞功能。与拉曼组技术相耦合的RADS将能够高通量分选广泛的细胞功能，从而允许下游特定功能单细胞的培养或组学分析。这一工作为研制高度通量化与集成化的单细胞拉曼分选与测序系统奠定了基础。 /p p 　　论文共同一作是青岛能源所单细胞中心的王喜先与任立辉。本工作得到了中科院武汉水生所胡强研究员、北京大学王玮教授等的帮助，并得到了中科院仪器专项、国家自然科学基金、中国博士后科学基金和山东省自然科学基金等的支持。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" W020171108322918001267.jpg" style=" HEIGHT: 279px WIDTH: 500px" border=" 0" hspace=" 0" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/noimg/dee566b0-1166-47be-9cbd-0a240348aece.jpg" width=" 500" height=" 279" / /p p /p p & nbsp /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 图1 拉曼激活单细胞液滴分选(RADS)系统示意图 /p