核糖体

自然生命，有情众生，都难逃衰老的命运。从微观的调度来看，衰老会导致细胞适应性的下降和蛋白质功能的丧失。然而，衰老导致蛋白质聚集的机制还没有被完全理解。实际上，科学家们已经知道，随着年龄增长的蛋白质聚集是一个与许多疾病相关的问题。因此，深入研究这些疾病的基本生物学，了解导致它们的机制，可以帮助我们选择更好的治疗方法。衰老的根源在于核糖体？Nature最新研究发现，衰老加剧核糖体暂停，破坏共翻译蛋白质稳态！近日，斯坦福大学的研究人员在国际顶尖学术期刊 Nature 发表了题为：Ageing exacerbates ribosome pausing to disrupt cotranslational proteostasis 的研究论文。该研究提出，随着细胞衰老，核糖体翻译暂停将不断增加，导致核糖体相关质量控制（RQC）超载和新生多肽聚集，从而在衰老过程中至关重要地促进了蛋白平衡障碍和全身衰退。该论文开辟了一个新的研究方向，将衰老如何导致蛋白质聚集的问题追溯到了核糖体的年龄依赖性损伤。核糖体（Ribosome）是细胞内普遍存在的一种细胞器，主要由rRNA和蛋白质构成，“中心法则”中mRNA翻译成蛋白质这一过程就发生在核糖体。其功能是按照mRNA的指令将遗传密码转换成氨基酸序列并从氨基酸单体构建蛋白质聚合物。因此，核糖体也被称为细胞内蛋白质合成机器。核糖体的结构和功能本研究的第一作者 Kevin C. Stein 博士表示：“衰老伴随着细胞蛋白平衡的失调，这是许多与年龄相关的蛋白质错误折叠疾病的基础。然而，衰老是如何破坏蛋白质平衡的仍不清楚。由于新生多肽对蛋白平衡网络构成了巨大的负担，我们假设，衰老过程中翻译效率的改变可能有助于推动蛋白平衡的崩溃。”在这项最新研究中，研究团队发现衰老改变了秀丽隐杆线虫和酿酒酵母的翻译延伸过程的动力学。在衰老的线虫和酵母的特定位置（例如多碱基区域）核糖体暂停被加剧，导致核糖体碰撞增加，从而触发核糖体相关质量控制（RQC）。事实上，长寿的酵母突变体减少了年龄依赖的核糖体暂停，并且延长了寿命，具体与更大通量的RQC途径相关。研究人员还发现，线虫中显示年龄依赖核糖体暂停的新生多肽在年龄依赖的蛋白聚集体中强烈富集，进一步将核糖体翻译停顿与蛋白平衡崩溃联系起来。研究衰老对翻译动力学和协同翻译的影响通过结合实验和计算数据分析，研究人员发现核糖体的功能会随年龄的增长而退化，与此同时，有缺陷的蛋白质也会不断增加，使得原本会阻止蛋白质聚集的质量控制失效保护机制无法发挥作用。斯坦福大学生物学和遗传学教授、本研究的通讯作者 Judith Frydman 博士说道：“蛋白质在生命中最脆弱和最关键的时刻——也就是它最容易发生错误折叠的时候——恰恰是它形成的时候。”衰老加剧了酵母中核糖体在多碱基区域的暂停研究团队使用了一种称为核糖体图谱的技术，这种技术可以让他们准确地看到在翻译过程中核糖体是如何在mRNA上移动的。他们观察到，在年龄较大的细胞中，核糖体的周期性移动变得更慢，并且核糖体性能的下降与年龄相关的错误折叠蛋白质聚集的增加相一致。核糖体暂停后，被截断的新生多肽的年龄依赖性聚集对此，论文第一作者 Kevin C. Stein 博士解释道：“有两种情况，衰老导致核糖体碰撞的增加和停滞，但细胞失去了处理它的安全网络。”核糖体暂停和截断的新生多肽在衰老过程中的聚集本研究的另一位主要作者 Fabián Morales-Polanco 博士兴奋地表示，这个发现只是一个非常迷人的未来的开端，这开创了一个新的研究方向，也随之而来了无数个等待回答的问题，并可能因此产生数百篇论文。总而言之，这项研究提出，随着细胞衰老，核糖体翻译暂停将不断增加，导致核糖体相关质量控制（RQC）超载和新生多肽聚集，从而在衰老过程中至关重要地促进了蛋白平衡障碍和全身衰退。 论文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-021-04295-4

大多数人身上携带真菌白色念珠菌，没有它会引起很多问题。然而，这种真菌的全身感染是危险的并且难以治疗。很少有抗菌剂是有效的，而且它的耐药性正在增加。包括格罗宁根大学副教授 Albert Guskov 在内的一个国际科学家小组已经使用单粒子冷冻电镜来确定真菌核糖体的结构。他们的研究结果近日发表在《科学进展》上，揭示了新药的潜在目标。白色念珠菌通常不会引起任何问题，或者只是容易治疗的皮肤瘙痒感染。然而，在极少数情况下，它可能会导致可能致命的全身感染。现有的抗真菌药物会引起很多副作用并且价格昂贵。此外，白色念珠菌的耐药性越来越强，因此确实需要新的药物靶点。“我们注意到没有抗真菌药物针对蛋白质合成，而一半的抗菌药物会干扰这个系统，”Guskov说。造成这种情况的一个原因是真菌核糖体，即将遗传密码转化为蛋白质的细胞机器，在人类和真菌中非常相似。所以，你需要一种非常有选择性的药物来避免杀死我们自己的细胞。——Albert Guskov，格罗宁根大学副教授原子分辨率因此，Guskov 和他的合作者推断，获得白色念珠菌核糖体的结构对于寻找药物靶点很有价值。经典的方法是从纯化的核糖体中生长晶体，并使用 X 射线晶体学确定它们的结构；然而，这是一项费力的技术。相反，他们使用单粒子冷冻电镜，其中大量单粒子在电子显微镜中在非常低的温度下成像。从不同角度看到的单个粒子的图像随后被组合以产生原子分辨率的结构。突变' 通过这种方式，我们解决了空缺和抑制剂结合的真菌核糖体的结构，并将它们的功能与酵母和兔子的核糖体进行了比较——后者作为人类核糖体的模型——并重复了与不同核糖体结合的核糖体抑制剂，”Guskov 解释道。其中一种抑制剂是抗微生物放线菌酮 (CHX)，已知白色念珠菌对其具有抗药性。通过比较这些结构，科学家们注意到在蛋白质合成中起关键作用的 E 位点的单个突变阻止了 CHX 与白色念珠菌核糖体结合。 ' 突变将这个E位点结构中的一个氨基酸从脯氨酸改变为谷氨酰胺。这种替代减少了结合位点的大小，因此抑制剂不能附着，因此无效。另一种抑制剂叶花苷不会被突变阻断。威胁' 通过比较白色念珠菌和人类空缺核糖体中 E 位点的结构以及不同抑制剂与该位点结合方式的信息，我们可以开发出一种特异性抑制剂，它可以阻断真菌核糖体，但不能阻断人类的核糖体。这将成为治疗真菌感染的选择性药物。科学家们目前正在筛选分子库以寻找药物先导物。 “开发针对白色念珠菌的疫苗极具挑战性，就像我们针对冠状病毒所做的那样。因此，我们需要药物来治疗全身感染，”Guskov解释道。 “这种真菌日益增加的耐药性是一个真正的威胁。如果这种情况继续下去，除非开发出新药，否则我们可能会遇到严重的麻烦。Source:University of GroningenJournal reference:Zgadzay, Y., et al. (2022) E-site drug specificity of the human pathogen Candida albicans ribosome. Science Advances. doi.org/10.1126/sciadv.abn1062.

核糖体是一种广泛存在于细胞中的分子机器。所有生物，包括微小的细菌直至人类个体，都依赖核糖体对各种各样的蛋白质进行生物合成。作为一个分子量巨大的复合物，核糖体本身是如何在细胞中由多条RNA链及超过70种蛋白分子装配而成?这一问题已困扰相关领域科学家近30年。　　核糖体自身是一个由核糖核酸(RNA)和蛋白质组成的超大复合物(半径20纳米)，其三维结构和分子机制的研究一直是生命科学基础研究中的重要方向。2009年的诺贝尔化学奖即授予了首次解析出细菌核糖体原子分辨率的三位结构生物学家。　　真核细胞核糖体装配过程是个高度复杂的动态过程，有超过300种不同功能的辅助装配因子(蛋白质或者RNA)参与其中。然而绝大多数装配因子的结构及其行使功能的分子机理完全未知。此外，核糖体的组装与细胞的生长调控通路密切相关，某些装配因子的遗传突变会导致核糖体生物生成的失调，引起一系列的人类遗传性疾病(称为ribosomopathies)。某些特定的装配因子(例如eIF6)不正常表达也在多种人类癌症细胞中被发现。因此，针对核糖体装配过程的研究不仅具有重要的科学意义，还具有潜在的临床应用潜力。　　图1酵母核糖体大亚基组装中间体的3.08埃冷冻电镜结构。a，3.08 埃冷冻电镜密度图，核糖体蛋白颜色为米色，核糖体RNA颜色为灰色。b，19个装配因子的原子模型。　　清华大学生命科学学院高宁研究组自2009年一直致力于研究各种生物的核糖体装配过程。2013年，高宁研究组和美国卡内基梅隆大学的约翰伍尔福德(John L. Woolford Jr)教授研究组携手合作，利用清华大学的高端冷冻电镜平台，以真核生物酵母菌为材料，开展真核核糖体的装配研究工作。2015年，合作研究获得重大突破，课题组得到了酵母细胞核内的一系列组成上和结构上不同的核糖体60S亚基前体复合物的冷冻电镜结构。其中一种状态的三维结构分辨率达到3.08埃，其核心部分的分辨率可达2.8埃，是国际在核糖体组装研究领域迄今为止分辨率最高的结构。基于这一冷冻电镜结构，课题组确定了超过20种不同装配因子在核糖体60S前体上的结合位置，并获得了19种装配因子的原子模型。课题组所提供的丰富结构信息为详细阐释真核核糖体装配过程中的多种装配因子功能和分子机制提供了重要基础。　　2016年5月25日，报道这一重大突破的研究论文在线发表于《自然》(Nature)期刊，题目为《细胞核内的核糖体组装前体结构揭示了装配熟因子的功能多样性》(Diverse roles of assembly factors revealed by structures of late nuclear pre-60S particles)。高宁研究员和卡内基梅隆大学约翰伍尔福德(John L. Woolford Jr)教授为论文共同通讯作者，清华大学生命学院2013级博士生吴姗为第一作者。北京生命科学研究所董梦秋教授及谭丹博士提供了化学偶联交联质谱数据。论文中冷冻电镜数据收集和处理工作获得了国家蛋白质科学(北京)设施清华大学冷冻电镜平台及高性能计算平台支持。课题组得到了中国科技部、国家自然科学基金委、清华大学自主科研、北京高精尖结构生物学中心的经费支持。　　论文链接

核糖体是由RNA和大量蛋白质构成的大型分子机器，负责地球上所有生物的蛋白质合成。在真核生物中，核糖体组装是个非常复杂的过程。核糖体在成熟过程中需要和大量的组装因子暂时结合，形成了一系列核糖体前体复合物。小亚基核糖体在组装过程中形成两个主要的中间体：早期的90S和晚期的pre-40S前体。90S前体是个巨大的复合物，除了含有核糖体RNA和蛋白质组分，还含有约50个非核糖体蛋白质和U3 snoRNA，分子量高达5百万道尔顿。　　中国科学院生物物理研究所叶克穷实验室利用冷冻电镜和单颗粒重构技术获得了出芽酵母90S核糖体前体的3个电子密度图，其中最好的密度图的整体分辨率达到4.5埃。研究人员利用已知的晶体结构、从头建模和化学交联质谱数据构建了接近完整的90S结构模型。　　90S的结构显示新生核糖体小亚基折叠形成多个分离的亚结构，并和大量组装因子结合。核糖体前体RNA的5' 间隔区域、U3 snoRNA和大量组装因子形成巨大的基座，支撑新生核糖体的结构。结构还揭示了U3 snoRNA和核糖体前体RNA结合的新颖方式。该结构对理解核糖体小亚基的早期组装原理和组装因子的功能具有里程碑的意义。　　报道该工作的论文Molecular architecture of the 90S small subunit pre-ribosome 于2月28日在eLife 杂志在线发表。　　叶克穷是该论文的通信作者，孙奇、朱星、奇佳和安卫东是共同第一作者。合作者董梦秋和谭丹以及叶克穷课题组多位研究人员对该研究也有重要的贡献。中科院生物成像中心为该研究提供关键的冷冻电镜研究设备和技术支持。该研究得到了国家自然科学基金委、中科院战略性先导科技专项(B类)、科技部和北京市政府的资助。　　文章链接 90S核糖体前体的冷冻电镜结构

由结核杆菌引起的结核病是全球重要的慢性疾病。据世界卫生组织发布的《2019年全球结核病报告》数据，全球结核潜伏感染人群约17亿，占全人群的1/4左右，结核病仍是全球前10位死因之一。目前结核杆菌耐药性问题日益严重，了解结核杆菌耐药机制并研发新的治疗结核病药物对实现“终止结核病策略”意义重大。　　近日，复旦大学和北京大学为主的联合团队在《Emerging Microbes & Infections》杂志上发表了题为“Cryo-EM structure of Mycobacterium tuberculosis 50S ribosomal subunit bound with clarithromycin reveals dynamic and specific interactions with macrolides”的文章，该研究解析了结核杆菌核糖体大亚基与大环内酯类抗生素克拉霉素（Clarithromycin，CTY）结合的冷冻电镜三维结构。　　研究团队发现抗生素CTY结合位点位于结核杆菌核糖体大亚基新生肽链通道靠近rRNA第2062位腺嘌呤（A2062）的位置，与其他大环内酯抗生素的结合位置基本一致。研究团队基于研究获得的密度图，认为结合CTY的结核杆菌大亚基的A2062存在两种构象；与已发表的核糖体与大环内酯结合的结构比较，认为A2062与特定的大环内酯类抗生素结合的动力学可能调节肽基转移酶向翻译阻滞方向发展。该研究对结核杆菌核糖体大亚基A2062与大环内酯类药物的动力学研究结果，可能有助于合理设计下一代抗结核药物，以对抗日益严重的结核杆菌耐药问题。　　论文链接：　　https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/22221751.2021.2022439　　注：此研究成果摘自《Emerging Microbes & Infections》杂志，文章内容不代表本网站观点和立场，仅供参考。

大家好，本周为大家分享一篇本课题组发表在Journal of Pharmaceutical Analysis上的文章，Integrated top-down and bottom-up proteomics mass spectrometry for the characterization of endogenous ribosomal protein heterogeneity [1]，文章的通讯作者是中山大学药学院的李惠琳教授。　　蛋白质的合成过程是生物体内最重要的生命活动之一。在细胞中，核糖体是信使RNA翻译合成蛋白质的细胞机器。核糖体高度复杂，它主要由特化的RNA和几十个蛋白组成。这些蛋白和RNA组装成两个不同大小的核糖体亚基即大亚基和小亚基。近年来，多项研究表明，核糖体与多种疾病的发生密切相关，包括恶性肿瘤、阿尔兹海默病和帕金森病等，这些过程中除发生rRNA合成异常和核糖体蛋白表达失调外，还伴有核糖体蛋白基因突变、RNA剪切、翻译后修饰(PTMs)变化所形成的核糖体蛋白异质体(proteoforms)的异常表达和调节。本文中，作者整合了Top-down及Bottom-up蛋白质组学质谱全面表征了核糖体蛋白异质性，为发现疾病特异型proteoform生物标志物或靶点提供了方法。　　首先，作者采用E.coli 70S核糖体在Waters SYNAPT G2-Si MS仪器上建立了Top-down检测方法(图1)。50S核糖体大亚基蛋白质L7和L12具有相同序列，其差别在于L7在N-端含有乙酰化修饰而L12无N-端非乙酰化修饰。实验发现，L7和L12在Top-down分析中取得了良好的分离，并且L7和L12的峰放大图显示二者除含有其对应野生型外，它们都具有甲基化的proteoforms，而Bottom-up仅能检测到甲基化的肽段(图2)。L7/L12在蛋白质生物合成过程中参与和翻译因子的相互作用，是肽链终止所必需的。L7/L12发生异常会降低蛋白质的合成速度和准确性。本研究中，作者采用Top-down方法对L7/L12的PTMs和proteoforms进行了全面分析，并结合Bottom-up定位了甲基化位点。同时，该结果也反映出Bottom-up方法固有的缺陷，即从小肽推断出的有限的序列信息往往不足以鉴别proteoforms。　　图1. Top-down和Bottom-up蛋白质组学表征E.coli 70S核糖体总览　　图2. Top-down和Bottom-up蛋白质组学表征E.coli 50S核糖体亚基蛋白质L7/L12　　随后，作者采用建立好的方法分析了HeLa 80S核糖体蛋白。如图3A所示，实验检测到大量Methionine剪切伴随的N-端乙酰化、40S RP S10和S25上的二甲基化、40S RP S23上的hydroxyproline、60S RP L8上的hydroxyhistidine、乙酰化和甲基化等多种修饰。值得关注的是，Top-down结果显示多种蛋白存在截短型的truncated proteoforms。分子完整性是保证蛋白质生物学功能的重要因素之一。分子完整性的缺失，特别是由于选择性剪接或蛋白质水解而导致的截短，已成为一个重要的问题。作者在排除蛋白质提取过程造成的影响、色谱柱上酶切和质谱源内裂解等因素后，认为截短型的proteoforms很大程度上与生物过程相关。RP L19是一个从60S亚基突出并跨越到40S亚基的长螺旋蛋白质，L19的C端螺旋在pre-translocation状态下扭结，在亚基旋转时动态地改变构象，在post-translocation状态下变为线性(图3B)。这种构象转变导致蛋白质L19带正电的Arg172和Arg176侧链与18S rRNA核苷酸G909和G910的磷酸根之间形成盐桥。本文中，作者观察到C端部分序列缺失的截断型L19。除此之外，其他截短型的蛋白质如图C所示。目前研究发现，核糖体蛋白质除了在细胞翻译和蛋白质合成中发挥核心作用外，还具有核糖体外功能，参与细胞增殖、分化、凋亡、DNA修复、调节细胞迁移和侵袭等细胞过程。以截短型形式观察到的许多核糖体蛋白，都与血液、代谢、心血管疾病和癌症的发展与进展有关，核糖体蛋白proteoforms的全面表征为发现潜在疾病生物标志物或靶点提供了前题条件。　　图3. 利用Top-down蛋白质组学方法鉴定HeLa 80S核糖体蛋白质PTM及proteoforms　　总的来说，本文整合了Top-down及Bottom-up蛋白质组学质谱方法，全面表征了E.coli 70S核糖体和HeLa 80S核糖体蛋白质。尽管这些proteoforms和疾病的相关性还需要深入挖掘，但实验提供了一种先进的方法来确定疾病特异性proteoforms或靶点。

目的：建立了离子色谱-积分脉冲安培法同时检测黄酒中的阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、核糖、乳糖，并对这几种糖的含量进行探讨。方法：色谱分离选用CarboPacTM10（250 mm×4 mm）分析柱，以氢氧化钠和无水乙酸钠为淋洗液进行梯度洗脱，流速为 1.0 mLmin-1，柱温为30℃的色谱条件，在20 min内实现6种糖的分离，利用建立的方法对26个黄酒样品中的单糖含量进行了测定。结果：该方法的重现性（RSD）≤3.70%，相关系数R2≥0.9990，加标回收率为91.6%～109.1%，最低检出限为2.99×10-3 ～1.38×10-3 μgmL-1。结论：黄酒中主要存在的单糖是葡萄糖，阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、核糖和乳糖的含量较低；半甜型黄酒中单糖的含量高于加饭酒，其含量的差异可能与酿造工艺有关。 离子色谱_积分脉冲安培法检测黄酒_省略_乳糖_甘露糖_葡萄糖_核糖_乳糖_徐诺.pdf

食品添加剂d-核糖准确定量仪器配置 ● P230高压恒流泵 ● Shodex RI-201H示差折光检测器 ● DG230在线脱气机 ● Rheodyne 7725i手动进样阀orAS1201自动进样器 ● ZWⅡ色谱柱恒温箱 ● EC2000色谱数据工作站 ● Shodex KS-801色谱柱 色谱条件 ● 流动相：水 ● 流速：0.5 mL/min ● 柱温：80℃ ● 检测池温度：40℃ ● 进样量：10µ L

2021年6月4日中国计量科学研究院发布全球首个新型冠状病毒核糖核酸假病毒弱阳性口腔粘液基质标准物质(高浓度和低浓度)。▲规格：200μL/管（研制单位：中国计量科学研究院）新冠病毒核酸检测最常见的样品为咽拭子，但目前国内外尚未有以口腔粘液为基质的新型冠状病毒核糖核酸检测标准物质。通过模拟临床检验咽拭子样本的基质和病毒浓度，可最大限度地重现新冠病毒核酸临检样本检测过程，对咽拭子样品从RNA提取至核酸扩增检测的全过程进行质控，为新型冠状病毒检测实验室的弱阳性和位于灰区的检测结果提供判定参考，满足了国家卫健委新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南中的新型冠状病毒核酸检测过程质量控制的要求，并可用于新型冠状病毒检测试剂盒性能验证。该标准物质是采用重量法，将NIM-RM5203新型冠状病毒（2019-nCoV）假病毒核糖核酸标准物质添加到人工模拟的口腔粘液基质中制备而得。将重量法配制值作为标准物质ORF1ab基因和N基因的标准值。资源来源于：中国计量科学院。

癌症一直是威胁着人类身体健康最严重的疾病，科学研究人员一直在研究治疗癌症的有效药物。据广州优瓦标准品网的了解，近日日本冈山大学医院宣布，其研究人员在人体血液中发现了一种能遏制癌细胞增殖并消灭癌细胞的抗体，这一发现将有助于开发出副作用较小的化疗药物。　　在健康人的体内，每天都会出现数千个癌细胞，不过都被各种抗体和免疫细胞清理掉了，但是科学家还不清楚其中的机制。该院研究人员注意到，在癌细胞中，核糖体蛋白L29得以高度表达，而人体血液中就存在核糖体蛋白L29的抗体。研究人员将每毫升中含有5微克(1微克是百万分之一克)抗体的溶液滴到人类肝癌细胞上，再调查癌细胞的增殖状况。结果发现，癌细胞的增殖减少40%。　　研究还发现，这种抗体能够遏制胰腺癌、肺癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌等癌细胞增殖。研究人员指出，血液中的抗体与核糖体蛋白L29结合后，能够遏制后者的功能，使癌细胞难以分裂，从而凋亡，因此这种抗体应该就是构成人体内肿瘤免疫系统的物质之一。　　这项发现是近期来对癌症治疗研究的最新发现，将有助于研究出对治疗癌症更有效的化疗药物，给身患癌症的患者带来福音。对于目前治疗癌症的相关药物，广州优瓦能够为癌症科研实验提供各类标准品，如需要，敬请拨打我司服务专线咨询详情：020-81215950!

p 　　 span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 施一公教授是剪切体结构和功能研究的权威，自2015年8月以来在Science杂志先后发表了6篇研究文章，解析了酵母中剪切体催化过程中5个关键状态的高分辨率结构。5月11日，施一公教授领导的团队又在Cell杂志上发表了题为“An Atomic Structure of the Human Spliceosome”的论文，这是该研究组在这一领域发表的第7篇高水平论文，也是首个人源剪切体关键状态的原子分辨率结构，第一次在原子水平解释了剪切体催化第二步转酯反应的功能机理。该论文的第一作者分别为张晓峰、闫创业和杭婧，施一公教授和闫创业博士为共同通讯作者。特别值得一提的是，这篇Cell论文从投稿到接收只用了11天。鉴于该成果的重要意义，BioArt特别邀请了著名的结构生物学家、清华大学生命科学学院杨茂君教授撰写了该篇特别评论文章，以飨读者。 /span /p p span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " /span /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201705/insimg/4bc262af-0d77-4cd2-9b46-7d997bd2ca4c.jpg" title=" 微信图片_20170512000929_副本.jpg" / /p p span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " /span br/ /p p 　　5月11日，清华大学施一公教授研究组在《细胞》杂志发表研究文章，首次报道了人源剪切体C* complex的原子分辨率结构。施一公教授是剪切体结构和功能研究的权威，自2015年8月以来在《科学》杂志先后发表了6篇研究文章，解析了酵母中剪切体催化过程中5个关键状态的高分辨率结构。这是施一公教授研究组在这一领域发表的第7篇高水平论文，也是首个人源剪切体关键状态的原子分辨率结构，第一次在原子水平解释了剪切体催化第二步转酯反应的功能机理。 /p p 　　剪切体催化的前体mRNA剪切过程是生物体内最基础最关键的生命活动之一，是遗传信息从DNA传递给蛋白质的中心法则中关键的一环。在所有真核细胞中，基因表达分为三步进行，分别由RNA聚合酶 (RNA polymerase)、剪接体(Spliceosome)和核糖体 (Ribosome)执行。第一步简称转录(transcription)，即储存在遗传物质DNA序列中的遗传信息通过RNA聚合酶的作用转变成前体信使RNA(pre-mRNA) 第二步简称剪接(splicing)，即由多个内含子和外显子间隔形成的前体信使RNA通过剪接体的作用去除内含子、连接外显子，转变为成熟的信使RNA 第三步简称翻译(translation)，即成熟的信使RNA通过核糖体的作用转变成蛋白质，从而行使生命活动的各种功能。描述这一过程的规律被称为分子生物学的中心法则，多个诺贝尔奖围绕此发现和阐述产生。其中，RNA聚合酶的结构解析获得2006年的诺贝尔化学奖，而核糖体的结构解析获得2009年的诺贝尔化学奖。 /p p 　　由于真核生物中的基因编码区中存在不翻译成蛋白质的序列(称为内含子)，染色体DNA转录出来的前体mRNA(pre-mRNA)并不直接参与蛋白质翻译，而是需要先将其中的内含子片段去除，才能进入核糖体进行蛋白质合成。内含子的去除需要通过两步转酯反应来实现：首先，位于内含子序列中下游被称为分支点(branch point sequence)的序列中有一个高度保守的腺嘌呤核苷酸(A)，其2’羟基亲核攻击内含子5’末端的鸟嘌呤(G)，于是第一步反应发生，形成套索结构 然后，5’外显子末端暴露出的3’-OH向内含子3’末端的鸟嘌呤发起攻击，第二步反应发生，两个外显子连在一起。通过这两步反应，前体信使RNA中数量、长度不等的内含子被剔除，剩下的外显子按照特异顺序连接起来从而形成成熟的信使RNA(mRNA)(下图)。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201705/insimg/8c47205d-f67a-471b-b897-662b42995cae.jpg" title=" 微信图片_20170512001013_副本.jpg" / /p p 　　这两步化学反应在细胞内是由庞大、复杂而动态的分子机器——剪接体催化完成的。对于每一个内含子来说，为了调控反应的各个基团在适当时机呈现合适的构象从而发挥其活性，剪接体各组分按照高度精确的顺序结合和解离，组装成一系列具有不同构象的分子机器，统称为剪接体。根据它们在RNA剪接过程中的生化性质，这些剪接体又被区分为E、A、B、Bact、B*、C、C*、P、ILS等若干状态。剪接体由五个小核核糖核蛋白(snRNP)、十九号复合物(Nineteen Complex，简称NTC)、十九号复合物相关蛋白(NTC Related)和一系列的辅助蛋白所构成,共涉及到100多个蛋白质和至少五条RNA分子。在剪接的过程中，剪接体以前体信使RNA分子为中心，按照高度精确的顺序进行逐步组装并发生大规模结构重组，使之得以完成复杂的剪接任务。剪接是真核细胞进行正常生命活动不可或缺的核心环节，因此具有重大的生物学意义，获取剪接体在组装、激活、催化反应过程中各个状态的结构是最基础也是最富挑战性的结构生物学难题之一。 /p p 　　此前，施一公教授研究组共报道了酵母来源的剪接反应中5个关键状态的剪接体复合物的高分辨率结构，分别是3.8埃的预组装复合物tri-snRNP、3.5埃的激活状态复合物Bact complex、3.4埃的第一步催化反应后复合物C complex、4.0埃的第二步催化激活状态下的C* complex以及3.6埃的内含子套索剪接体ILS complex。这5个酵母来源的高分辨率结构所代表的剪接体状态，基本覆盖了整个剪接通路中关键的催化步骤，提供了迄今为止最为清晰的剪接体不同工作状态下的结构信息，大大推动了RNA剪接研究领域的发展。而最新的这一篇《细胞》论文所报道的3.76埃第二步催化激活状态下的人源C* complex使我们第一次在原子分辨率上看到了人源剪切体的工作状态，并首次详细阐释了人源剪切体催化第二步转酯反应的功能机理。 /p p 　　人源C* complex与酵母来源C* complex在结构上有许多不同。与酿酒酵母来源的复合物结构相比，在这一原子分辨率人源复合物结构中额外鉴定出9个蛋白亚基(Aquarius、Brr2、PPIL1、PRKRIP1、U5-40K、以及EJC的4个蛋白亚基)。另外，第二步反应的关键因子Slu7和Prp17在人源复合物中更加清晰。相反的，酵母复合物中第二步反应的关键因子Prp18在人源复合物中缺失，反映了人和酵母在催化第二步反应过程中功能机理的细微差别。另一个重要的差别是酵母复合物中的Ecm2和Cwc2亚基被人源复合物中的RBM22亚基所取代，使得其周围的蛋白亚基重新排布(下图)。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201705/insimg/f0ba68fc-ec88-43f2-b80b-2353dc5f37a3.jpg" title=" 微信图片_20170512001027_副本.jpg" / /p p 　　此次发表的关于人源剪切体复合物原子分辨率结构的研究承接之前酵母来源剪切体复合物的研究工作，在攻克剪切过程详细反应机理的道路上再进一步。施一公教授这一系列的研究工作具有极为重要的意义，是对中心法则的研究中最为复杂、最为关键的一环。自1993年RNA剪接的发现被授予诺贝尔生理及医学奖以来，科学家们一直在步履维艰地探索其中的分子奥秘，期待早日揭示这个复杂过程的分子机理。剪切体一系列关键状态复合物高分辨率结构的解析，一步一步揭开了RNA剪接这一复杂生化过程神秘的面纱，可以说，这一系列研究工作是当今结构生物学领域里一项里程碑式的、有望获得诺贝尔奖的重量级工作。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201705/insimg/95c0871b-e076-40e5-8e71-19b0f0a22f55.jpg" title=" 微信图片_20170512001044_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 图为Cell论文的通讯作者施一公教授和卓越中心创新学者闫创业博士 /p p style=" text-align: right " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 撰文丨杨茂君 (清华大学生命科学学院、结构生物学高精尖创新中心教授，“长江学者”特聘教授，国家“杰青”) /span /p p 　　 span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 后记：到目前为止，闫创业博士已发表的53篇SCI论文中，其中在Nature、Science和Cell杂志上以第一作者(包含共同一作)或共同通讯作者身份已发表10篇研究型论文。自闫创业博士2005年进入清华化学系以来到如今成为清华结构生物学高精尖创新中心卓越学者总共已经快12年了。从施一公教授课题组的相继发表的这7篇有关剪接体结构的论文署名来看，闫创业博士是这7篇论文的第一作者(三篇)或共同第一作者(4篇)，特别值得一提的是在这篇Cell文章中首次成为共同通讯作者。可以说，整个剪接体系列工作中，闫创业博士起到了中流砥柱般的作用，称得上当今结构生物学领域“夜空中最亮的星” /span 。 /p p br/ /p

退火——在冶金学中很常见——将金属或合金加热到设定温度，保持该温度，然后将金属冷却到室温，以改善材料的物理性质，有时还改善材料的化学性质。退火材料倾向于采用同质状态并容易组装成三维 (3D) 或二维 (2D) 晶体。人们可以通过原子力显微镜 (AFM)、X 射线衍射 (XRD) 或电子显微镜 (EM) 轻松地观察到这种规则堆积。退火是否对生物大分子，尤其是蛋白质表现出类似的影响，是一个迷人的科学问题。2022年2月22日，上海科技大学沈庆涛研究员团队等在PNAS发表题为Annealing synchronizes the 70S ribosome into a minimum-energy conformation的研究论文，将退火技术引入冷冻电镜解析蛋白质结构，在模拟退火中引入了一个类似的概念，以预测生物大分子的最小能量构象。通过实验验证，在自由能分析中，以快速冷却速率退火可以将 70 S核糖体同步到具有最小能量的非旋转状态。此结果不仅提供了一种简单而可靠的方法来稳定蛋白质以进行高分辨率结构分析，而且有助于理解蛋白质折叠和温度适应。与金属和有机聚合物不同，蛋白质和蛋白质复合物通常是由化学上不同的亚基以不同的几何形状结合在一起的离散实体。这种显着的结构异质性阻碍了通过 AFM 或 XRD 直接确定结构。相比之下，cryo-EM 分辨率的最新进展为在单分子水平上获得高分辨率蛋白质结构提供了绝佳机会。通过使用冷冻电镜比较退火前后的详细结构，可以获得退火影响蛋白质构象的直接实验证据。退火提高了局部分辨率研究中，选择来自大肠杆菌的载脂蛋白状态 70 S核糖体作为模型，其中 30 S亚基经历热驱动的亚基间旋转并表现出显着的结构灵活性以及明显的自由能。在 0°C 下将纯化的脱基态 70 S核糖体培养 5 分钟，然后立即将核糖体快速冷冻以进行低温 EM 分析，这可能保留了与玻璃化之前相同的构象（描绘为未退火状态）。筛选了收集到的 70 S核糖体颗粒通过 2D 和 3D 分类丢弃明显的垃圾和拆卸的核糖体。根据金标准傅里叶壳相关性，从 200,000 个随机选择的粒子中重建得到最终分辨率为 2.6 Å 的结构。由于缺乏稳定因素，例如信使 (mRNA) 和转移 RNA (tRNA)，对未退火的 70 S核糖体的局部分辨率估计表明，在 2.6 至 7.2 埃范围内的整个密度图上存在可变分辨率（图 1A )。相对于 50 S亚基，30 S亚基——尤其是它的头部结构域——没有得到很好的解析，这在其他脱辅基态核糖体中很常见。图1 退火提高了 70 S核糖体的局部分辨率为了量化不同区域的分辨率变化，通过平均选定区域内的局部分辨率值来计算局部分辨率。分析表明，50 S亚基的平均局部分辨率为 3.1 Å，而 30 S亚基的分辨率要低得多——只有 5.2 Å。此外，30 S头域的分辨率更低——平均分辨率为 6.1 Å（图 1 B ）。50 S和 30 S亚基之间的亚基间棘轮是分辨率差的主要原因；30 S的亚基内漩涡亚基是次要的，这会降低头部域的分辨率。为简单起见，使用 30 S亚基的局部分辨率作为标记来监测退火对 70 S核糖体的影响。未退火的、加热的和退火的核糖体结构变化退火使柔性区域稳定退火诱导的分辨率改善在整个 70 S核糖体中并不均匀。相对于 30 S亚基的 1.5-Å 分辨率提高，良好分辨的 50 S亚基在退火后仅提高了 0.3 Å（即从 3.1 Å 值到 2.8 Å 值）（图 1 B ） . 因此，退火对具有更大结构灵活性的低分辨率区域特别有益。为了进一步验证这一推论，我们对未退火和退火 70 S之间相同子区域的平均局部分辨率进行了综合统计分析核糖体。例如，退火将不同区域的平均局部分辨率提高到 0.1、0.6、0.8、1.2 和 2.0 Å 的水平；未退火核糖体中相应区域的局部分辨率范围为 2.5 至 3.0、3.0 至 3.5、4.0 至 4.5、5.0 至 5.5 和 5.5 至 6.0 Å（图 2 A ） 。指数曲线与数据非常吻合，表明未退火的 70 S核糖体具有更大的灵活性，对应于退火后局部分辨率的更大提高。图 2 退火稳定了 70 S核糖体的柔性区域讨论不限于金属、合金或半导体，我们通过实验证明退火还可以使 70 S核糖体同步到具有窄构象分布的最小能量状态（图 3）。核糖体/核小体的结晶具有类似退火的处理，其中研究人员通常将核糖体/核小体加热到 37 °C 和 55 °C 之间，然后将它们降低到室温 (19 °C)。对 70 S核糖体进行严格退火以进行结晶将有助于探索退火对70 S核糖体的物理和化学影响，如在冶金学中。除了 70 S核糖体，在其他生物大分子上退火，特别是那些具有动态结构的大分子，将有助于验证该方法的普遍性。图3 模型说明退火可以使核糖体同步到最小能量状态并提高局部分辨率。显示了自由能曲线（实线）和粒子分布概率（浅绿色峰）。结构灵活性虽然对蛋白质功能至关重要，但阻碍了研究人员应用结构研究在分子水平上阐明功能的能力。持续的努力——例如关键残基的突变，引入额外的二硫键，添加抗体/结合蛋白 ，或在溶液中或甘油内交联/葡萄糖梯度——对于优化样品以提高结构稳定性很有用。然而，这样的努力耗时且缺乏明确的方向，最终的结构仅限于固定状态，有时甚至会在额外的操作后发生扭曲。退火——适当加热和冷却的组合——对蛋白质没有破坏性，是一种简便而可靠的高分辨率冷冻电镜方法。有趣的是，与通过戊二醛交联的 70 S核糖体相比，退火提高了 50 S和 30 S亚基的局部分辨率。研究人员还尝试通过在低温 EM 图像处理期间对柔性区域进行局部细化来提高局部分辨率。我们对未退火和退火核糖体的灵活 30 S亚基进行了局部改进。在局部细化后，未退火核糖体的 30 S亚基的平均局部分辨率提高了 ~1 Å，达到 4.2 Å。与通过退火提高分辨率不同，局部细化本身仍然导致 30 S亚基头部域的平均分辨率不足 5.5 Å 。显然，退火和局部细化通过不同的机制提高了局部分辨率。退火可以将生物大分子驱动到最小能量状态，并且无论区域大小如何，都可以全局提高整个地图的分辨率。作为对照，局部细化在算法级别上起作用，并且仅适用于大小合理的区域。当我们对退火核糖体应用局部细化时，30 S亚基的主体和头部结构域分别提高到 2.9 和 3.9 Å。这表明退火与柔性区域的局部细化兼容，并且可以进一步优化局部分辨率以进行详细的结构分析。可以使用退火将蛋白质同步到最低能量状态，这可能有利于许多单分子方法，例如光镊和单分子荧光共振能量转移 。人们还可以使用退火来研究温度适应和蛋白质折叠，并促进分子动力学模拟中的算法开发。因此，研究人员应彻底研究退火机制并进一步优化退火条件以提高分辨率。本研究由国家重点研发计划项目2017YFA0504800（Q.-TS）、2021YFF1200403（Q.-TS）和2018YFC1406700（Q.-TS）和国家自然科学基金项目31870743（Q. .-TS）等支持。论文链接：https://www.pnas.org/content/119/8/e2111231119#sec-6

2009年诺贝尔化学奖揭晓 美以三科学家因“对核糖体结构和功能的研究”而获奖 Venkatraman Ramakrishnan Thomas A. Steitz Ada E. Yonath 　　北京时间10月7日下午5点45分，2009年诺贝尔化学奖揭晓，美以三科学家因“对核糖体结构和功能的研究”而获奖。这三位科学家为美国的Venkatraman Ramakrishnan、Thomas A. Steitz及以色列的Ada E. Yonath。 　　Venkatraman Ramakrishnan，1952年出生于印度的Chidambaram，美国公民。1976年从美国俄亥俄大学获得物理学博士学位。现为英国剑桥MRC分子生物学实验室结构研究部资深科学家和团队领导人。Thomas A. Steitz，1940年出生于美国密尔沃基市，美国公民。1966年从哈佛大学获得分子生物学与生物化学博士学位。现为耶鲁大学分子生物物理学和生物化学教授(Sterling Professor)及霍华德• 休斯医学研究所研究人员。Ada E. Yonath，1939年出生于以色列耶路撒冷，以色列公民。1968年从以色列魏茨曼科学研究所获得X射线结晶学博士学位。现为魏茨曼科学研究所结构生物学教授及生物分子结构与装配研究中心主任。 　　今年的诺贝尔化学奖奖金为1000万瑞典克朗，三位科学家将各获得三分之一的奖金。 　　2009年诺贝尔化学奖奖励的是对生命一个核心过程的研究——核糖体将DNA信息“翻译”成生命。核糖体制造蛋白质，控制着所有活有机体内的化学。因为核糖体对于生命至关重要，所以它们也是新抗生素的一个主要靶标。 　　今年的诺贝尔化学奖奖励Venkatraman Ramakrishnan、Thomas A. Steitz和Ada E. Yonath这三位科学家，他们在原子水平上显示了核糖体的形态和功能。三位科学家利用X射线结晶学技术标出了构成核糖体的无数个原子每个所在的位置。 　　在所有有机体的每个细胞内都存在DNA分子，它们包含的蓝图决定着一个人、一棵植物或一个细菌的外形和功能。但是DNA分子是被动的，如果没有其他东西存在，就不会有生命。 　　这些蓝图通过核糖体的作用被转变成活物质。依据DNA内的信息，核糖体制造蛋白质——运输氧的血红蛋白、免疫系统的抗体、胰岛素等激素、皮肤胶原质或分解糖的酶等。身体内存在成千上万种蛋白质，各自具有不同的形态和功能。它们在化学水平上构造并控制着生命。 　　理解核糖体最基本的工作方式对于科学地理解生命是重要的。这一知识可被直接应用于实践，比如，目前许多抗生素通过阻滞细菌核糖体的功能而治愈多种疾病。没有起作用的核糖体，细菌就无法生存。这就是为什么核糖体对于新抗生素来说是如此重要的一个靶标。 　　今年的三位获奖者均制造了3D模型，展示了不同的抗生素如何绑定到核糖体。这些模型如今被科学家们所应用以开发新的抗生素，直接帮助了挽救生命及减少人类的痛苦。

利用合成生物学开发的细胞治疗系统具有广阔的疾病治疗前景。其原理是在细胞中装配药物蛋白表达调控开关，在外源刺激信号作用下，细胞调控并释放药物蛋白。将细胞治疗系统应用于糖尿病，可以口服小分子作为外源刺激信号调控胰岛素表达，避免胰岛素注射带来的痛苦。目前，大多数药物蛋白调控开关都是基于转录水平调控设计的，外源刺激信号首先需要刺激转录因子，将药物蛋白基因转录并加工为mRNA，然后翻译出药物蛋白。这种调控过程相对复杂，蛋白表达时间较为缓慢，限制了细胞治疗系统在糖尿病等疾病中的应用。因此，开发快速的蛋白表达调控系统是合成生物学中的研究热点。2021年11月15日，北京大学刘涛团队与华东师范大学叶海峰团队在Nature Chemical Biology杂志发表了题为Genetic code expanded cell-based therapy for treating diabetes in mice的研究论文。文章利用基因密码子扩展技术开发了非天然氨基酸调控的胰岛素细胞治疗系统（Noncanonical Amino acids (ncAAs)-triggered Therapeutic Switch, NATS），证明了该系统能够在翻译水平快速调控蛋白质表达（图1）。该研究补充了合成生物学中的蛋白调控开关工具库，也为基因密码子扩展技术的应用创新提供了新的思路。图1 NAST系统在翻译水平快速调控蛋白表达基因密码子扩展技术通过进化能够识别ncAA的氨酰tRNA合成酶和tRNA分子对，在翻译含有异位琥珀密码子的mRNA过程中将ncAA插入蛋白质。基因密码子扩展技术的最重要应用是蛋白质的定点修饰，刘涛团队则关注该技术的蛋白质翻译机制，建立了在蛋白质翻译水平调控的药物蛋白调控系统。研究人员将含有异位琥珀密码子的药物蛋白基因以及氨酰tRNA合成酶和tRNA分子对插入哺乳动物细胞基因组，构建了NATS系统细胞系（图2a）。在普通培养基中，NATS细胞的核糖体翻译到异位琥珀密码子时由于缺乏ncAA而导致翻译终止。而在含有ncAA的培养基中，NATS细胞可以利用ncAA翻译药物蛋白（图2b）。图2 NATS系统的开关调控方式NATS系统激活的蛋白表达对ncAA有明显的浓度依赖和可逆调控。ncAA与细胞只需要接触1分钟就足以激活NATS系统：这是经典的转录水平调控系统所无法达到的。为了在动物体内能够实现口服ncAA调控目的蛋白表达，研究人员首先做了ncAA药物代谢动力学实验，并证明ncAA可以口服被小鼠吸收。人细胞体外改造后移植到小鼠体内需要克服免疫排斥反应，为此研究人员选用两种用于临床研究的细胞包埋方法，将NATS细胞包裹选择性透过膜后进行细胞移植。选择性透过膜只允许蛋白质等生物大分子以及小分子自由通过，而将小鼠免疫细胞隔离在外，使得NATS细胞可以在小鼠体内存活并分泌目的蛋白进入血液。糖尿病患者的血糖会随着进食情况而波动，准确和及时的血糖控制可以大幅度降低糖尿病并发症的发病概率。转录水平调控的胰岛素表达系统至少需要4小时才能降低小鼠血糖，这很难满足对于快速血糖控制的要求。为研究翻译水平调控系统的降血糖速度，研究人员对移植了NATS细胞的糖尿病小鼠进行单一剂次ncAA灌胃，结果显示小鼠口服ncAA后90分钟，就可以检测到血清胰岛素水平升高和血糖值明显降低，证明了翻译水平调控蛋白表达的速度优势。糖尿病是需要终身服药的慢性疾病，为证明NATS细胞的长期治疗效果，研究人员连续一个月监控糖尿病小鼠的胰岛素和血糖水平，发现NATS细胞可以持续控制小鼠血糖。同时，研究人员将ncAA加入小鼠饲料制成“ncAA饼干“，可以通过小鼠直接进食来控制血糖，提高了给药的便利程度。而且长期毒性实验中并没有发现ncAA对小鼠造成异常。该文章开发的NATS系统跨越了传统的转录水平调控，直接在翻译阶段控制蛋白表达，提高了蛋白质调控速度，扩展了合成生物学用于细胞治疗的调控工具，为糖尿病等需要即时干预的疾病提供了新的治疗策略。文章首次将基因密码子扩展技术应用于细胞治疗，期待未来科学家能够进一步开发基因密码子扩展技术在疾病治疗方面的应用。文章的第一作者是北京大学博士生陈超和黄雨佳，华东师范大学博士生余贵玲。通讯作者为北京大学药学院的刘涛研究员和华东师范大学生命科学学院叶海峰教授。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-021-00899-z

2021年7月8日，国际结构生物学领域权威期刊《Journal of Structural Biology》在线发表了由中国科学院生物物理研究所蛋白质科学研究平台生物成像中心与孙飞研究组合作的技术创新成果《VHUT-cryo-FIB, a method to fabricate frozen hydrated lamellae from tissue specimens for in situ cryo-electron tomography》，针对组织样品原位结构生物学研究的技术瓶颈开发了组织样品冷冻含水切片制备技术VHUT-cryo-FIB，这是该中心在2016年开发的细胞样品冷冻含水切片制备技术（Journal Structural Biology, 2016，194：218-222）后的又一技术创新，将原位结构生物学的研究对象从单细胞拓展到更接近于生理状态的组织样品。　　冷冻电子断层成像技术（cryo-electron tomography，cryo-ET）是一项重要的冷冻电镜技术，可以获得细胞和组织样品原位三维高分辨率超微结构、生物大分子的原位结构信息以及蛋白质机器原位相互作用信息。该技术被认为是分子生物学和细胞生物学联结的桥梁，被称为"可视化蛋白质组学"。然而该技术要求样品的厚度必须在300nm以下，获取高分辨率信息则需要更薄的样品（150nm以下），但是大多数生物样品厚度都在数微米以上，无法直接应用该技术进行研究。此外，为了研究生物组织样品更接近生理状态的结构，通常需要利用高压冷冻技术对生物组织样品进行冷冻固定，但是高压冷冻后的样品厚度一般都在100μm以上，如何制备出适合冷冻电子断层成像技术研究的高质量的生物组织样品切片是原位结构生物学领域面临的一个重要技术问题。　　本项技术研究基于最新的冷冻聚焦离子束技术（cryo-FIB），设计和研制了一套冷冻传输硬件，有效将振颤切片技术、高压冷冻技术、冷冻修块技术和冷冻聚焦离子束减薄技术结合起来，创新冷冻聚焦离子束切割工艺，形成了一套完整高效的组织样品冷冻含水切片制备技术流程VHUT-cryo-FIB。利用该技术流程可以高效制备出厚度在150-300nm之间的组织样品冷冻含水切片。本研究中应用VHUT-cryo-FIB方法分别制备了菠菜叶片、小鼠骨骼肌、肝脏和心肌的冷冻含水切片，并成功解析了菠菜胞质核糖体（34 Å）和小鼠肝脏胞质核糖体（18 Å）的原位三维结构（图1）。这些结果证明VHUT-cryo-FIB方法可以广泛应用于各种生物组织样品的冷冻含水切片制备，为原位结构生物学研究提供有力的样品制备方法。　　孙飞研究员为该论文的通讯作者，高级工程师张建国、孙飞研究组张丹阳博士（已毕业）和高级工程师孙磊为共同第一作者。蛋白质科学研究平台生物成像中心的多位工程师季刚、黄小俊、牛彤欣为该项成果贡献了力量，徐伟研究员为实验的设计和方向提供建议。北京大学生命科学学院的高宁教授和马成英博士在小鼠肝脏核糖体数据分析方面给予了帮助。　　该工作受到国家自然科学基金委、科技部重点研发计划、北京市科委等的资助。图1. Cryo-FIB方法制备的冷冻含水切片样品，Cryo-ET 方法解析菠菜叶片和小鼠肝样品中核糖体三维结构。a菠菜叶片重构后的细胞内部结构，其超微结构包括细胞壁、细胞质、叶绿体、囊泡、核糖体和基粒。b三维渲染后的图a，黄色,核糖体 淡粉色，细胞壁 橙色,细胞膜 紫色,囊泡 绿色,叶绿体膜 青色, 叶绿体基质。菠菜核糖体的原位结构，大亚基蓝色的，小亚基黄色。c Subtomo average得到小鼠肝脏核糖体的原位结构(左)，与通过单粒子重构得到小鼠胞质核糖体密度图(右)。d小鼠肝脏核糖体原位结构密度图，大亚基和小亚基分别为蓝色和黄色。红色(P/E位点)和紫色(A/P位点)显示了两个tRNAs。Scale bar:150nm。　　文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S104784772100068X?dgcid=coauthor#s0075

近期，来自美国哈佛大学和伊利诺伊大学芝加哥分校等研究团队开发了一种对多重耐药细菌有效的合成抗生素。研究成果发表在《Nature》上，题为：A synthetic antibiotic class overcoming bacterial multidrug resistance。　　研究人员报告了一种具有特殊效力和活性谱的抗生素，它的合成是以刚性牛脯氨酸支架为结构导向设计，基于其组分与克林霉素的氨基辛糖残基连接形成。研究人员称之iboxamycin（IBX）。IBX对ESKAPE（六大超级细菌缩写）病原体有效，包括表达耐药基因Erm和Cfr核糖体RNA甲基转移酶的菌株。这些基因的产物对所有针对大核糖体亚基的相关抗生素，即大环内酯类、林可酰胺类、酚类、噁唑烷酮类、胸腺素类和链霉素类等都有抗性。　　IBX与细菌核糖体以及与Erm甲基化的核糖体复合物的X射线晶体结构研究显示了这种活性增强的结构基础，以及抗生素结合后m6 2A2058核苷酸的位移情况。口服IBX可治疗小鼠的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌感染，具有安全性和有效性。　　在耐药性不断增加的时代，该项研究为化学合成抗生素提供了新思路。 　　论文链接：　　https://www.nature.com/articles/s41586-021-04045-6

单细胞测序的方法对于不同的生物体、不同组织以及不同细胞种类达到了更为深入的探究。这些工具集中于对单细胞的基因组【1】、表观遗传组【2】以及转录组进行分析【3】。但是现今想要在单个细胞中进行翻译过程的测量并非易事。 2021年9月8日，荷兰皇家艺术和科学学院与乌得勒支大学医学中心Oncode研究所Alexander van Oudenaarden研究组以及Michael VanInsberghe（第一作者）在Nature期刊上发表Single-cell Ribo-seq reveals cell cycle-dependent translational pausing，构建了能够达到单密码子精度的翻译测量测序技术scRibo-seq，并且通过该技术对细胞周期依赖的翻译暂停特点进行了揭示。 近年来，关于单细胞水平、翻译过程的检测的技术有一定的进展，比如在单细胞分辨率上进行的质谱分析技术SCoPE-MS【4】。SCoPE-MS技术可以对小鼠胚胎干细胞分化过程中的一千多种蛋白进行量化。但是，分辨率还不够。由此，scRibo-seq技术应运而生。 scRibo-seq技术是将核酸酶足迹与小RNA文库构建、尺寸富集技术结合起来，以测量单细胞中的翻译动态变化过程（图1）。单个活细胞被分选到含有放线菌酮（Cycloheximide）的裂解缓冲液中，以稳定和停止转录本上的核糖体，随后暴露的RNA被微球菌核酸酶MNase消化，由此产生核糖体保护足迹（Ribosome-protected footprints，RPFs）。这些足迹通过连接包含独特分子标识符（Unique molecular identifier，UMI）和引物位点的适配子，转化为测序库，用于后续的cDNA合成和PCR扩增。最后，对PCR翻译过产物进行尺寸富集，选择符合典型核糖体保护足迹的产物进行测序。 为了验证该方法的有效性，作者们首先对HEK293T细胞以及hTERT RPE-1中scRibo-seq技术的应用效果进行检测。结果证明该方法能够有效的显示蛋白编码转录本的5’UTR、CDS以及3’UTR区域的核糖体分布。先前的研究表明在培养基移除后细胞中的核糖体会在某些关键的密码子上停顿，这一停顿是受到密码子类型影响的【5,6】。为了进一步验证scRibo-seq测量翻译动力学的能力，作者们从HEK 293T培养基中去除精氨酸和亮氨酸的不同时间点后再进行细胞分选和检测，发现核糖体的停顿的确是不同处理依赖性的暂停。比如，精氨酸的缺失会造成CGC以及CGU密码子上足迹的频率升高，而去除培养基中的亮氨酸则不会有此现象。而UAA密码子上核糖体占位的增加则只在亮氨酸饥饿的情况下出现。因此，该结果证明了scRibo-seq技术的准确性和有效性。 随后，作者们想知道细胞周期的状态是否会对细胞响应氨基酸限制具有影响，所以作者们将scRibo-seq技术与FUCCI（Fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicators）技术进行联用，对不同细胞周期的细胞进行分选和收集。作者们发现核糖体的活性位点的确受到细胞周期的显著影响。 在体外培养的细胞中证明了scRibo-seq的作用之后，作者们希望对原代小鼠内分泌细胞（Enteroendocrine cells）中的应用进行检测。EECs细胞群在胃肠道细胞中所占的比例极低，数量少于细胞总量的1%，会在营养刺激下产生和分泌不同的激素【7】。通过scRibo-seq检测，作者们根据已经建立的激素细胞标记物基因的翻译特征鉴定发现了8个细胞类型，并对EECs细胞中的密码子特异性核糖体停顿进行了鉴定。因此，该结果说明scRibo-seq可以直接应用于原代细胞样品，并对稀有细胞群的翻译动力学过程进行测量。 总的来说，该工作建立了用于检测单密码子精度的翻译过程的高通量测序方法scRibo-seq，填补了目前单细胞基因组学方法的关键空白。另外，由于scRibo-seq技术不依赖于标记物以及转基因体系，可以直接对核糖体谱进行分析，其灵敏度和分辨率相较于先前的方法都更胜一筹。未来，该技术将会得到进一步广泛的应用，可以用于揭开高度动态系统中罕见细胞群的转录特征。 原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-03887-4【参考文献】1. Navin, N. et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature 472, 90-94, doi:10.1038/nature09807 (2011).2. Smallwood, S. A. et al. Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nature methods 11, 817-820, doi:10.1038/nmeth.3035 (2014).3. Tang, F. et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature methods 6, 377-382, doi:10.1038/nmeth.1315 (2009).4. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G. & Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome biology 19, 161, doi:10.1186/s13059-018-1547-5 (2018).5. Darnell, A. M., Subramaniam, A. R. & O' Shea, E. K. Translational Control through Differential Ribosome Pausing during Amino Acid Limitation in Mammalian Cells. Molecular cell 71, 229-243.e211, doi:10.1016/j.molcel.2018.06.041 (2018).6. Subramaniam, A. R., Pan, T. & Cluzel, P. Environmental perturbations lift the degeneracy of the genetic code to regulate protein levels in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, 2419-2424, doi:10.1073/pnas.1211077110 (2013).7. Gribble, F. M. & Reimann, F. Enteroendocrine Cells: Chemosensors in the Intestinal Epithelium. Annual review of physiology 78, 277-299, doi:10.1146/annurev-physiol-021115-105439 (2016).

p 　　精确认识细胞当中的大分子结构对于理解它们的功能至关重要。Amunts等人利用冷冻电镜获得线粒体核糖体大亚基3.2埃的分辨率结构，还有最近利用冷冻电镜获取的其他一些高分辨率结构，这些成就预示着分子生物学研究的新时代，获取近原子分辨率的大分子结构将不再是X射线晶体学和核磁共振的特权。 /p p style=" text-align: center " img alt=" " src=" http://img1.17img.cn/17img/old/NewsImags/images/2014912171159.jpg" style=" width: 600px height: 350px " / /p p 　　图：利用冷冻电镜获得的近原子分辨率结构：(A)酵母线粒体核糖体大亚基，分辨率3.2 埃。(B) TRPV1离子通道，分辨率3.4 埃。(C)F sub 420 /sub -还原[NiFe]氢化酶，分辨率3.36埃。注：该图并不是按比例绘制的。 /p p 　　核糖体是古老的，大规模的蛋白RNA复合物，它将线性遗传密码翻译成三维蛋白质。线粒体——半自主细胞器，为细胞提供能量，拥有它们自己的核糖体，这一点和细菌非常类似。许多抗生素，如红霉素，通过阻止细菌的核糖体翻译机器来抑制细菌的生长。当设计新的抗生素，不能让他们同时阻断线粒体核糖体很重要。因此，认识这两种核糖体的详细结构是很有价值的。其他核糖体的结构已经通过X射线晶体学确定。Amunts等利用冷冻电镜确定了线粒体核糖体的高分辨率结构，这在不到一年前，很少有人会想到可能实现。 /p p 　　不用晶体而能够做到这一点无异于是一场革命。主要是因为采用了新的探测器——具有前所未有的速度和灵敏度的直接电子探测器。直接电子探测器能够直接检测电子，而不是需要先将它们转换成光子，然后再转化为光电子探测进行，目前广泛使用的CCD(电荷耦合器件)相机就是这样，但它们的分辨率不是很好。照相胶片从工作原理上来说，高分辨率成像效果应该更好，但它很难和越来越重要的快速读出电子速度及高数据吞吐量相兼容。 /p p 　　大约10年前，Henderson和Faruqi意识到，应该有可能设计出一种结合了CCD相机和胶片优点的直接探测电子的传感器。他们和两个竞争团队研发的探测器，采用了和大多数手机中的摄像头芯片基本相同的有源像素传感器技术。然而，手机的芯片不能用于电子显微镜，因为强烈的电子束会瞬间破坏它们。因此，首先探测器必须能够抗辐射。第二，探测器所需的像素要大很多，以防止富含能量的电子一次激发多个像素。第三，摄像头采用的芯片必须非常薄，完成每次读出电子160万像素，否则电子散射将会使图像模糊并降低分辨率。目前传感器的厚度大约是一张纸厚度的一半。 /p p 　　冷冻电镜只需要少量的样品，因此那些无法分离得到大量样品，利用X射线晶体学方法进行分析的物质，现在可以利用冷冻电镜得到高分辨率结构。这同样适用于不容易结晶的非均相样品或柔性复合物，因为不同颗粒或构象的物质的冷冻电镜图像在图像处理阶段很容易分离开。 /p p 　　新的检测器提供了另一种决定性的优势：当电子束撞击薄的、不支持冷冻的样品时，它们的快速读出能够补偿小的不可避免地移动。在新的相机问世前，由于电子束诱导移动引起的模糊是一个看似不可逾越的问题。现在，通过快速连续拍摄，可以得到一个区域的数十张图像，并且电子束诱导移动被检测到并反转在电脑上。这种去除模糊的影响戏剧性的和天文学哈勃望远镜相类似，尽管在这两种情况下引起模糊的原因是不同的。 /p p 　　新的相机也促使了低温电子断层扫描成像的重大突破，低温电子断层扫描能够得到全细胞、细胞片、或细胞区室的三维图像，如线粒体。利用断层成像识别分子特征，采用标准CCD相机甚至已达到亚纳米细节，新的探测器问世也必然给断层成像研究带来巨大的变化。 /p p 　　在新相机问世的同时，强大的极大似然图像处理程序也被开发出来。这些程序定义可靠客观的标准，来对几万或几十万个的单粒子图像进行平均处理，为的是要实现高分辨率。先进的检测器和软件相结合，获取的冷冻电镜结构，在相同的标称分辨率下，其清晰度和map definition比采用X射线晶体学解析的结构要好，因为在冷冻电镜图像中包含着高质量的相位信息。 /p p 　　冷冻电镜的分辨率革命是否意味着X射线蛋白质晶体学时代即将结束?当然不是。在可预见的将来，分子量小于100kD的小蛋白，分辨率达到2 Å 或更好将依然是X射线晶体学的领域。但是对于大的，易碎的，或者柔性结构蛋白(如膜蛋白复合物)，它们很难形成晶体，但却在生物医学中起着关键的作用，新技术将对此带来重大突破。在未来，对分子量大、已知的蛋白复合物，如核糖体，进行结晶将可能不再是必要的。相反，它们的结构可以从容并迅速的通过冷冻电镜来确定。这真是激动人心的时刻。（编译：秦丽娟） /p p & nbsp & nbsp 原文检索： a href=" http://www.sciencemag.org/content/343/6178/1443.short" http://www.sciencemag.org/content/343/6178/1443.short /a /p

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日前，Nature杂志展开了本年度的年终大盘点，选出了十位举足轻重的科学人物。结构生物学家Sjors Scheres因开发了RELION软件包，将冷冻电镜图像转变为精细的分子结构而入选。 Sjors Scheres 　　核糖体是合成蛋白质的复杂分子机器，今年Scheres获得了迄今为止最清晰的核糖体图像。然而，作为一个结构生物学家他最感兴趣的并不是核糖体，&ldquo 我的主要贡献是数学方面的，&rdquo Scheres说。 　　Scheres的数学为结构生物学带来了一场革命。这一领域曾经是X射线晶体学技术的天下，现在冷冻电镜(cryo-EM)却占据了优势，这多亏了Sjors开发的软件。这个软件能够将cryo-EM图像转变为精细的分子结构，让生物学们更简单更清晰的看到分子机器。 　　2010年Scheres加入MRC分子生物学实验室之后，显微镜技术经历了一次较大的发展。Scheres意识到需要更好的计算机程序来解读大量的数据，于是他把自己关在办公室里写了一个出来，这就是RELION。 　　&ldquo 他一个人呆了几年，然后就拿出了这个美妙的软件，&rdquo 2009年诺贝尔化学奖得主Venki Ramakrishnan说。Ramakrishnan曾通过X射线晶体学技术揭示了细菌核糖体的结构，而Cryo-EM能够更快更好地完成这项工作。 　　今年，Ramakrishnan与Scheres合作为人们展示了酵母和人类核糖体的精密结构。现在Ramakrishnan实验室基本上已经改用冷冻电镜了。 　　Scheres还在破解更多更复杂的结构。举例来说，他和清华大学施一公教授合作确定了&gamma -分泌酶的结构，这是一种与阿尔茨海默症有关的蛋白。 　　就在不久前，Sjors Scheres教授课题组又和清华大学的颜宁教授、施一公院士的研究团队合作通过单颗粒低温电子显微技术，解析了兔RyR1与其调节子FKBP12结合时的结构，总体分辨率达到了3.8 Å 。这一成果于12月15日发表在Nature杂志上网站上。 　　Sjors Scheres教授还曾多次来中国向从事冷冻电镜研究应用的学者讲解其开发的软件包RELION，并介绍最大概然统计分析理论和贝叶斯理论在电镜图像分析和三维重构中的重要应用，为我国冷冻电镜图像分析领域带来了最前沿的理论。 Sjors Scheres教授在第七届郭可信电子显微学和晶体学暑期学校期间作报告

1898年，国外科研人员在用显微镜观察软体动物生发泡的时候，在核仁里发现了一个新的结构，他们将其命名为核仁腔。随后100多年里，研究者对它的认识仍十分有限。近日，中国科大光寿红/冯雪竹团队在《细胞报导 Cell Reports》杂志上发表文章，该研究以模式生物秀丽隐杆线虫为模型，首次揭示了核仁腔中含有大量的核质蛋白以及核糖体RNA中间体参与核仁腔的调控。  核仁是由rDNA、RNA和蛋白质交织在一起的复杂多层凝聚体，从内到外依次分布着纤维中心（FC）、致密纤维成分（DFC）、致密纤维成分外围（PDFC）和颗粒成分（GC）四个亚区室。除此之外，各种动植物细胞的核仁中还广泛存在一个与上述四个区室迥然不同的保守亚区室——核仁腔。  通过微分干涉相差显微镜和荧光显微镜，课题组在野生型秀丽隐杆线虫的细胞核仁中观察到核仁腔的存在，并发现核仁腔具有组织特异性和发育时期特异性的特点。随后，通过对一系列荧光蛋白标记的细胞核和核仁定位蛋白质的观察，发现核仁腔的组分有别于已知的核仁亚区，其并不包含定位于核仁的核糖体RNA转录和加工因子，而是储存了大量的核质定位蛋白。  最后，通过大规模的反向遗传学筛选，发现了第一类，而非第二类，核糖体大亚基加工和组装蛋白的异常会诱导核仁腔的形成，而核糖体小亚基加工和组装的异常则不会导致核仁腔的生成。进一步的实验证明，核仁腔的形成伴随着27SA2rRNA的显著富集。而喂食线虫RNA转录抑制剂放线菌素D可以有效地抑制27SA2rRNA的富集，同时抑制核仁腔的形成。该研究还解析了27SA2rRNA调控核仁腔形成的遗传学通路，发现两个保守的RNA结合蛋白FIB-1和NUCL-1在27SA2rRNA的下游，参与核仁腔的形成。

12月2日，中山大学医学院迎来了2009年诺贝尔化学奖得主阿达约纳特。讲座开始前一个小时，通道里已是人头涌涌。约纳特配得上这种礼遇，这位女科学家在核糖体结构和功能研究取得的成绩，让世人瞩目。当晚，约纳特教授在下榻的酒店接受了羊城晚报记者的专访。 　　阿达约纳特教授在中山大学医学院演讲 　　科研没有配方可遵循 　　羊城晚报：你开始这个研究(核糖体结构和功能)的时候是否得到公司的资助，是否有把研究转换成产品的想法? 　　阿达：在开始的时候，没有人相信我们这个研究，没有人相信我的思路(利用X射线晶体衍射技术来探索核糖体的立体结构)，也没有公司资助。当我的研究开始涉及抗生素，那些公司才开始表现出兴趣来。研究刚开始有眉目，需要进一步的发展，而那些公司更希望我们可以加快步伐。项目开始25年后，我才发现我们有资源去做一些外面公司完全不明白的研究，而不仅仅是为了出产品。我们团队在研究选题上不仅仅注重应用，还注重基础研究，这与公司的需求并不对立。 　　现在，我的团队有足够的经费可以做我感兴趣的研究。如果有公司对我的研究方向有兴趣，便可合作。我不喜欢那些想要和我合作却对有诸多限制的公司，因为科研不像做蛋糕，没有配方可遵循。 　　羊城晚报：您获得诺贝尔化学奖的抗生素研究跟医药业有很密切的关系，获奖后有没有公司找上门? 　　阿达：我获奖还不到一年。我的研究离具体抗生素产品出产估计还要15年。如果我们15年后相见，估计我能告诉你。其实这跟诺贝尔奖没有太大关系，这只跟具体研究有关。我们开始研究的时候，我们考虑是出于生产产品还是出于兴趣，我们希望能够两者兼顾。 　　男女科研能力无区别 　　羊城晚报：你怎么看待诺贝尔科学类奖项中获奖女性明显少于男性这个现象? 　　阿达：首先我不觉得科研上男女能力有别。但是在二三十年前，因为社会的各种阻碍，很少女性从事科研。而现在从事科研，例如医药科研的女性明显增多。只是从事科研的男性更多，所以他们拿奖多。 　　羊城晚报：你遇到过最大的问题是什么? 　　阿达：很难回答。每次问题来的时候都显得很大，像阿尔卑斯山一样。我遇到过的最大的问题，我想是如何让其他人相信我的研究方法是有效的，我一共花了15年来证明。15年后，就开始有人仿效我们的研究了。 　　诺贝尔奖不需被神化 　　羊城晚报：你喜欢“居里夫人第二”这个称谓么? 　　阿达：不喜欢。第一，这个称呼属于居里夫人的女儿，她也是个科学家 第二，我就是我。居里夫人或许会喜欢我，也或许不喜欢我，而在我眼中，居里夫人是个巨人，我只是个普通人。 　　羊城晚报：科学研究是不是只有第一，没有第二? 　　阿达：诺贝尔奖仅仅是一个奖，代表不了什么。诺贝尔基金会想要做得最好，但也不能顾及所有顶尖的科学家。他们并不是无所不知的，只有在实验室里面有所发现，才是最好的奖项。当我第一次发现核糖体的结构的时候，那就是我获得的最大的奖项。诺贝尔奖仅仅是诺贝尔奖，不需要神化。 　　巨变的广州充满机会 　　羊城晚报：您此次广州之行除了来分享学术成果外，有没有带来合作项目? 　　阿达：我没有，但是其他人带来了很多合作项目。我只有一个人，做不来那么多。但是我回去会思考能够开展合作项目。我认为中山大学的医学院有非常良好的合作环境。 　　羊城晚报：您对广州的印象如何? 　　阿达：我曾在1986年到过广州，这次亲眼目睹到了广州的巨变。广州是一个充满着机会的城市，可以为研究人员提供许多机会。今天上午我和你们的汪洋书记进行了会面，相信此后在以色列和广东之间的合作会越来越多。 　　人物简介：阿达约纳特，以色列科学家，因“核糖体的结构和功能”的研究而获得2009年的诺贝尔化学奖。约纳特1939年出生于耶路撒冷，1970年她组建了以色列第一个蛋白晶体学实验室。2008年，约纳特因在细菌抗药性方面的研究获“世界杰出女科学家成就奖”。

结构生物学领域有一条不成文的观点：结构决定功能。只有知道生物分子的原子排布，科学家们才能了解这个蛋白的功能。几十年来，分析蛋白结构有一个无冕之王——X射线晶体衍射。在X射线晶体衍射中，科学家们让蛋白结晶，然后利用X射线照射，随后根据X射线的衍射来重建蛋白的结构。在蛋白质数据银行(Protein Data Bank)的100000多条蛋白词目里，超过90%的蛋白结构是利用X射线晶体衍射技术解析得到的。　　尽管X射线晶体衍射一直是结构生物学家的最佳工具，但是它存在较大的限制。科学家们将蛋白进行大块结晶通常需要多年的时间。而很多基础蛋白分子，例如嵌在细胞膜上的蛋白，或是形成复合体的蛋白却无法被结晶。　　X射线晶体衍射技术(X-ray crystallography)即将成为历史，低温电子显微技术(cryo-electron microscopy, 也称作electron cryomicroscopy, cryo-EM)引发结构生物学变革。　　低温电子显微镜适用于研究大的、稳定的分子，这些分子能够承受电子的轰击，而不发生变形——由多个蛋白组成的分子机器是最好的样本。因此由RNA紧紧围绕的核糖体是最佳的样本。三位化学家用X射线晶体衍射研究核糖体溶液的工作在2009年获得了诺贝尔化学奖，但这些工作花了几十年。近几年，低温电镜研究者们也陷入了“核糖体热”。多个团队研究了多种生物的核糖体，包括人类核糖体的首个高清模型。X射线晶体衍射的研究成果远远落后于LMB的Venki Ramakrishnan实验室，Venki获得了2009年的诺奖。Venki表示，对于大分子来说，低温电子显微镜远比X射线晶体衍射要实用。　　这几年，低温电子显微镜的相关文章有很多：2015年一年，这个技术就用于100多个分子的结构研究。X-射线晶体衍射只能对单个、静态的蛋白晶体成像，但低温电子显微镜能够对蛋白的多种构象进行成像，帮助科学家们推断蛋白的功能。　　现在低温电镜迅猛发展，专家们正在寻找更大的挑战作为下一个解析目标。对很多人来说，最想解析的是夹在细胞膜内的蛋白。这些蛋白是细胞信号通路中的关键分子，也是比较热门的药物靶标。这些蛋白很难结晶，而低温电子显微镜不大可能对单个蛋白进行成像，这是因为很难从背景噪音中提取这些信号。　　这些困难都无法阻挡加利福利亚大学(University of California)的生物物理学家程亦凡。他计划解析一种细小的膜蛋白TRPV1。TRPV1是检测辣椒中引起灼烧感的物质的受体，并与其它痛感蛋白紧密相关。加利福利亚大学病理学家David Julius等人之前尝试结晶TRPV1，结果失败。用低温电子显微镜解析TRPV1项目，一开始进展缓慢。但2013年底，技术进步使得这一项目有了重大突破，他们获得了分辨率为0.34纳米的TRPV1蛋白的结构。该成果的发表对于领域来说，无异于惊雷。因为这证实了低温电子显微镜能够解析小的、重要的分子。　　尽管低温电子显微镜发展迅速，很多研究者认为，它仍有巨大提升空间。他们希望能制造出更灵敏的电子探测器，以及更好地制备蛋白样本的方法。这样的话，就能够对更小的、更动态的分子进行成像，并且分辨率更高。5月，有研究者发表了一篇细菌蛋白的结构，分辨率达到了0.22纳米。这也显示了低温显微镜的潜力。　　1997年时，英国医学研究委员会分子生物学实验室结构生物学家Richard Henderson非常坚定地宣称，低温电镜会成为解析蛋白结构的主流工具。在将近20年后的今天，他的预测比当年有了更多底气。Henderson表示，如果低温电镜保持这样的势头继续发展，技术问题也得以解决，那么低温电镜不仅会成为解析蛋白结构的第一选择，而是主流选择。这个目标已经离我们不远了。　　1. 施一公小组在《Science》发两篇论文报道剪接体三维结构　　　　U4/U6.U5 tri-snRNP电镜密度及三维结构示意图。　　2015年8月21日，清华大学生命科学学院施一公教授研究组在国际顶级期刊《科学》(Science)同时在线发表了两篇背靠背研究长文，题目分别为“3.6埃的酵母剪接体结构”(Structure of a Yeast Spliceosome at 3.6 Angstrom Resolution)和“前体信使RNA剪接的结构基础”(Structural Basis of Pre-mRNA Splicing)。第一篇文章报道了通过单颗粒冷冻电子显微技术(冷冻电镜)解析的酵母剪接体近原子分辨率的三维结构，第二篇文章在此结构的基础上进行了详细分析，阐述了剪接体对前体信使RNA执行剪接的基本工作机理。清华大学生命学院博士后闫创业、医学院博士研究生杭婧和万蕊雪为两篇文章的共同第一作者。　　这一研究成果具有极为重大的意义。自上世纪70年代后期RNA剪接的发现以来，科学家们一直在步履维艰地探索其中的分子奥秘，期待早日揭示这个复杂过程的分子机理。施一公院士研究组对剪接体近原子分辨率结构的解析，不仅初步解答了这一基础生命科学领域长期以来备受关注的核心问题，又为进一步揭示与剪接体相关疾病的发病机理提供了结构基础和理论指导。详细新闻报道参见：施一公研究组在《科学》发表论文报道剪接体组装过程重要复合物U4/U6.U5 tri-snRNP的三维结构。(Science, 20 Aug 2015, doi: 10.1126/science.aac7629 doi: 10.1126/science.aac8159)　　2. Science：HIV重大突破!史上最详细HIV包膜三维结构出炉!　　　　这项研究首次解析出HIV Env三聚体处于自然状态下的高分辨率结构图，其中HIV利用Env三聚体侵入宿主细胞。图片来自The Scripps Research Institute。　　在一项新的研究中，TSRI的研究人员解析出负责识别和感染宿主细胞的HIV蛋白的高分辨率结构图片。相关研究结果发表在2016年3月4日那期Science期刊上，论文标题为“Cryo-EM structure of a native, fully glycosylated, cleaved HIV-1 envelope trimer”。　　这项研究是首次解析出这种被称作包膜糖蛋白三聚体(envelope glycoprotein trimer，以下称Env三聚体)的HIV蛋白处于自然状态下的结构图。这些也包括详细地绘制这种蛋白底部的脆弱位点图，以及能够中和HIV的抗体结合位点图。(Science, 04 Mar 2016, doi: 10.1126/science.aad2450)　　3. Nature：史上最详细转录因子TFIID三维结构出炉，力助揭示人类基因表达秘密　　在一项新的研究中，来自美国加州大学伯克利分校、劳伦斯伯克利国家实验室和西班牙国家研究委员会(CSIC)罗卡索拉诺物理化学研究所的研究人员在理解我们体内被称作转录起始前复合物(pre-initiation complex, PIC)的分子机构(molecular machinery)如何发现合适的DNA片段进行转录方面取得重大进展。他们史无前例地详细呈现一种被称作TFIID的转录因子所发挥的作用。相关研究结果于2016年3月23日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Structure of promoter-bound TFIID and model of human pre-initiation complex assembly”。论文通信作者是劳伦斯伯克利国家实验室生物物理学家Eva Nogales，论文第一作者是Nogales实验室生物物理学研究生Robert Louder。其他作者是Yuan He、José Ramón López-Blanco、Jie Fang和Pablo Chacón。　　这一发现是非常重要的，这是因为它为科学家们理解和治疗一系列恶性肿瘤铺平道路。Eva Nogales说，“理解细胞中的这种调节过程是操纵它或当它变坏时修复它的唯一方式。基因表达是包括从胚胎发育到癌症在内的很多重要生物学过程的关键。一旦我们能够操纵这些基本机制，那么我们就能够要么校正应当或不应当存在的基因表达，要么阻止这种过程[即基因表达]失去控制时的恶性状态。”(Nature, 31 March 2016, doi:10.1038/nature17394)　　4. Science：科学家成功解析人类剪接体关键结构　　　在最近发表的一篇Science研究论文中，来自德国的科学家们利用冷冻电镜技术首次在分子级分辨率水平上重现了人类剪接体中一个关键复合体——U4/U6.U5 tri-snRNP的结构。剪接体是一种由RNA和蛋白质组成的用于切掉mRNA前体中内含子的分子机器。该研究解析的U4/U6.U5 tri-snRNP是构成剪接体的一个重要组成部分，研究人员利用单颗粒冷冻电镜获得了人类U4/U6.U5 tri-snRNP的三维结构，该复合体分子量达到180万道尔顿，解析分辨率达到7埃。该研究模型揭示了Brr2 RNA解螺旋酶如何在分离的人类tri-snRNP中通过空间结构阻止未成熟的U4/U6 RNA发生解链，还展现了泛素C端水解酶样蛋白Sad1如何将Brr2固定在预激活位置。　　研究人员将他们获得的结构模型与酿酒酵母tri-snRNP以及裂殖酵母剪接体的结构进行了对比，结果表明Brr2在剪接体激活过程中发生了显著的构象变化，支架蛋白Prp8也发生了结构变化以容纳剪接体的催化RNA网络。(Science, 25 Mar 2016, doi: 10.1126/science.aad2085)　　5.北京大学毛有东、欧阳颀课题组与其合作者在Science发表炎症复合体冷冻电镜结构　　　　炎症复合体三维结构　　北京大学物理学院毛有东研究员、北京大学物理学院/定量生物学中心欧阳颀院士与哈佛医学院吴皓教授合作利用冷冻电子显微镜技术解析了近原子分辨率的炎症复合体的三维结构，首次阐释了其复合物在免疫信号转导过程中的单向多聚活化的分子结构机理。该研究工作以“Cryo-EM Structure of the Activated NAIP2/NLRC4 Inflammasome Reveals Nucleated Polymerization”为题于2015年10月8日在线发表在国际期刊Science。　　先天免疫是人类免疫系统的重要组成部分，炎症复合体在触发先天免疫响应的过程中起到了关键信号转导的效应器作用，从而启动细胞凋亡等免疫应答和炎症反应。炎症复合体是胞浆内一组复杂的多蛋白复合体，是胱天蛋白酶活化所必需的反应平台，其复合物单体由多个结构域构成，并在上游蛋白的激活下诱导组装形成环状复合物。炎症复合体的结构对于认识先天免疫的信号转导过程、免疫调控和病原诱导活化等免疫响应机理具有关键的核心价值，因而成为国内外一流结构生物学和免疫学实验室追捧的研究对象。(Science, 23 Oct 2015, 10.1126/science.aac5789)　　6. Nature：施一公团队揭示γ -分泌酶原子分辨率结构　　　　人体γ -分泌酶3.4埃三维结构　　日前，清华大学教授施一公团队与国外学者合作，构建了分辨率高达3.4埃的人体γ -分泌酶的电镜结构，并且基于结构分析了γ -分泌酶致病突变体的功能，为理解γ -分泌酶的工作机制以及阿尔茨海默氏症的发病机理提供了重要基础。相关成果8月18日在《自然》发表。　　阿尔茨海默氏症是最为严峻的老年神经退行性疾病之一，但其发病机理尚待揭示。目前研究已知β -淀粉样沉淀是该病的标志性症状之一。而β -淀粉样沉淀的产生是APP蛋白经过一系列蛋白酶切割产生的短肽聚集而来。在此切割过程中，最关键的蛋白酶是γ -分泌酶。γ -分泌酶由四个跨膜蛋白亚基组成，其中，编码Presenilin(PS1)蛋白的基因中有200多个突变与阿尔茨海默氏症病人相关。γ -分泌酶在阿尔茨海默氏症的发病中扮演着重要角色。　　研究人员通过收集更多的数据、大量的计算并升级分类方法，计算构建出3.4埃原子分辨率γ -分泌酶的三维结构，可以观察到绝大部分氨基酸的侧链以及胞外区部分糖基化修饰和结合的脂类分子。在高分辨结构的基础上，施一公研究组对PS1上的致病性突变体进行了研究，发现这些突变主要集中在两个较为集中的区域内。他们对于其中一些突变体进行了生化性质的研究，发现这些突变会影响γ -分泌酶对于底物APP的酶切活性，然而对切割活性的影响却有所不同。(Nature, 10 September 2015, doi:10.1038/nature14892)　　7. Nature：人类核糖体结构终于被解析!　　　　核糖体是进行蛋白质翻译的机器，能够催化蛋白质合成。目前，许多研究已经对多种生物的核糖体结构进行了原子水平的结构解析，但获得人核糖体结构一直存在很大挑战，这一问题的解决对于人类疾病的深入了解以及治疗手段和策略的开发都有重要意义。　　近日，著名国际学术期刊nature在线发表了法国科学家关于人类核糖体结构解析的最新研究进展。　　在该项研究中，研究人员利用高分辨率单颗粒低温电子显微镜以及原子模型构建的方法获得了人类核糖体接近原子水平的结构。该核糖体结构的平均分辨率为3.6A，接近最稳定区域的2.9A分辨率水平。这一研究成果对人类核糖体RNA，氨基酸侧链的实体结构，特别是转运RNA结合位点以及tRNA脱离位点处的特定分子相互作用提供了深入见解，揭示了核糖体大小亚基接触面的原子细节，发现在核糖体大小亚基的旋转运动过程中，其接触面发生了强烈的重构过程。(Nature, 30 April 2015, doi:10.1038/nature14427)　　8. Nature：日本科学家成功解析代谢关键因子受体结构　　近日，著名国际学术期刊nature在线发表了日本科学家的最新研究进展，他们利用结构生物学方法对脂联素(adiponectin)受体，AdipoR1和AdipoR2，进行了结构解析，发现脂联素受体具有与G蛋白偶联受体不同的七次跨膜螺旋，对于靶向脂联素受体的肥胖及其相关代谢疾病治疗方法开发具有重要意义。　　在该项研究中，研究人员对人类AdipoR1和AdipoR2的晶体结构进行了解析，分辨率分别达到2.9 ?和2.4 ?，他们通过解析发现脂联素受体是具有不同结构的一类新受体。脂联素受体的这种七次跨膜螺旋在构象上与G蛋白偶联受体的七次跨膜螺旋不同，在这种新的 七次跨膜螺旋中，由三个保守组氨酸残基协同一个锌离子形成了一个大的腔体。这种锌结合结构可能在adiponectin刺激的AMPK磷酸化和UCP2表达上调方面具有一定作用。(Nature, 16 April 2015, doi:10.1038/nature14301 )　　9. Molecular Cell：中国科学家揭示A型流感病毒RNA聚合酶复合体的三维冷冻电镜结构　　2015年1月22日，中科院生物物理所刘迎芳研究组与清华大学王宏伟研究组在著名期刊Molecular Cell杂志在线发表了题目为 “Cryo-EM Structure of Influenza Virus RNA Polymerase Complex at 4.3 ? Resolution”的论文，揭示了流感病毒RNA聚合酶复合体的结构和功能。　　生物物理所刘迎芳和清华大学王宏伟课题组等中外多方参与的实验室通过使用最新的高分辨率单颗粒冷冻电镜三维重构技术，解析了含有A型流感病毒RNA聚合酶大部分成分的4.3埃分辨率的四聚体电镜结构。该复合体涵盖了流感病毒聚合酶催化活性的核心区域。从三维重构密度图中可以清晰识别出该空腔内PB1上的催化结构域以及结合的RNA复制起始链，据此，研究人员推测这是进行RNA合成反应的区域。这一活性中心结构与正链RNA聚合酶具有相似性，研究人员也因此提出了流感病毒合成新生RNA链的机制。(Molecular Cell, 5 March 2015, doi:10.1016/j.molcel.2014.12.031)　　10. Cell：科学家获得首个中介体复合物精确结构图　　　　中介体复合物(Mediator Complex)是细胞中最大也最为复杂的分子机器之一。现在，来自斯克利普斯研究所(TSRI)的科学家们在《细胞》杂志上报告称，他们利用用电镜获得了首个中介体复合物(Mediator)的精确结构图。　　Mediator是所有动植物细胞中的关键分子机器，对于绝大多数基因的转录有着至关重要的调控作用。Mediator拥有二十多个蛋白亚基，解析它的结构是基础细胞生物学的一大进步。这一成果能够为许多疾病提供宝贵的线索(从癌症到遗传性的发育疾病)。论文资深作者，TSRI副教授Francisco Asturias表示："明确这些大分子机器的结构和作用机制，可以帮助我们理解许多关键的细胞过程。"　　在这项新研究中，研究人员获得了高纯度的酵母Mediator，并通过电镜成像得到了迄今为止最为清晰的Mediator3D模型，分辨率达到约18埃。随后他们又进行了多种生化分析，例如在逐个去除蛋白亚基的同时观察电镜图像发生的改变。他们由此确定了酵母Mediator25个蛋白亚基的精确定位。　　项新研究获得的结构图谱，全面修正了之前的Mediator' 粗略模型。论文第一作者Kuang-LeiTsai表示："定位了所有的蛋白亚基之后，我们发现头部模块应该位于Mediator的顶部而不是底部。"此外，研究人员还对人类Mediator进行了深入研究。Tsai说："大体上看，人类和酵母的Mediator总体结构颇为类似。"最后研究人员在结构数据的基础上，为人们展示了Mediator调控转录时的构象变化。(Cell, 29 May 2014, doi: 10.1016/j.cell.2014.05.015)

图中展示的就是构成酵母线粒体大核糖体亚单位(yeast mitochondrial large ribosomal subunit)的各个组成蛋白质。Amunts等人根据利用低温冷冻电镜技术获得的酵母线粒体大核糖体亚单位及完整核糖体的结构图谱，一个个地合成出了上述这些组分蛋白。这个经过不断完善的结果与根据X线晶体成像技术获得的原子模型非常吻合。 　　先进的低温冷冻电镜(cryo&ndash electron microscopy)技术让我们获得了大量高分辨率的蛋白质结构图。 　　结构生物学(structural biology)研究的主要目的就是获得用于构成活体细胞的各种各样大分子(macro-molecules)生物组件的高分辨率图像信息。该研究主要依赖的技术手段就是X线晶体照相术(x-ray crystallography)以及核磁共振光谱分析检测技术(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR spectroscopy)。不过这两种技术都有各自的局限性，比如X线晶体照相术只能够对生长得极为有序的三维结晶进行观察，而核磁共振光谱分析检测技术则要求被检测样品的纯度非常高，不能够有重叠峰出现。有很多生物大分子相互结合、组装之后形成的都是非常大的，或者非常不稳定、比较罕见的结构，都不太适合用上述这两种技术进行分析和检测。单粒子电子显微镜技术(Single-particle electron microscopy, EM)则能够观察少量非结晶样品，获得高分辨率的结构图谱。 　　使用单粒子电子显微镜技术可以获得任意排列方向的分子复合体( molecular complexes)的结构图像。该技术会从每一幅图像中选出单个的复合体(粒子)，然后借助计算机来判断它们的排列方向。最后将各个不同视角的图像组合在一起，得到该分子的三维立体图像。不过由于高能电子束会对生物大分子起到破坏作用，打断分子内的共价键(covalent bonds)，并且诱发一系列级联式的有害化学反应，所以这种放射性损伤效应给单粒子电子显微镜技术带来了极大的局限性，在实验时用来记录影像的电子束的能量受到了非常大的约束。 　　20世纪80年代，Dubochet等人报道了一种单粒子电子显微镜技术革新成果，将该技术引向了高分辨率成像之路。他们在低温条件(cryogenic conditions)下将待检样品放在一层薄薄的、透明的冰上用单粒子电子显微镜进行成像观察。这种方法就是所谓的&ldquo 低温冷冻电镜技术(cryo&ndash electron microscopy, cryo-EM)&rdquo ，他能够对含水的粒子(hydrated particles)进行直接成像。低温除了具有这些优势之外，还能够减少电子束对样品产生的放射性损害。不过电子束的照射量还是不能够太大，只有这样才能够清晰地反映出分子结构的细节，获得高质量的、低信噪比(signal-to-noise ratio, SNR)的三维结构图像。由于将每个分子的多张图像信息组合在一起能够更进一步地降低图像的信噪比，所以，对数万、乃至数百万个蛋白质复合体进行分析就会产生数十万张图像。 　　不过依靠低温冷冻电镜图像来判断生物大分子的结构给计算机处理分析工作带来了一大挑战。在借助多图像组合平均手段来改善信噪比时，必须知道每一颗粒子的方向，但是由于信噪比太低，我们对这些粒子方向的判断又明显感觉准确性不够，这就形成了一个矛盾。要解决这个问题，最成功的方法就是&ldquo 重复(iterative)&rdquo ，质量高的图像能够给出更准确的方向信息，而这些方向信息又可以帮助我们获得更高质量的图像。 　　直到最近这一段时间，绝大部分单粒子低温冷冻电镜图片的分辨率都非常低，连10埃都达不到，所以很多人都将这种技术嘲笑为 &ldquo 一团浆糊学(blob-ology)&rdquo 。蛋白质二级结构中的&alpha 螺旋(&alpha helices)结构只有在分辨率达到9~10埃，甚至更高分辨率的情况下才能够看清 而另外一种二级结构，&beta 折叠(&beta strands)结构则只有在分辨率达到4.8埃以上时才能够看清。达到3.5埃的分辨率，就可以为蛋白质或核酸等生物大分子构建原子模型(atomic models)，将各种目前已知的核酸结构或氨基酸结构填入其中了。如果要了解蛋白质复合体形成时发生的各种化学变化，就必须获得原子级别分辨率的细节信息。低分辨率的结构信息也不是一无是处，当在与高分辨率结晶图像相互配合、印证，用来判断组成复合体的各种不同组分时更加有意义。因此，即便分辨率较低，低温冷冻电镜技术也还是帮助科学家们解决了很多生物学难题，比如解析出了与其他辅因子共同结合的核糖体的结构问题，以及构象只能够维持片刻时间的核糖体瞬时结构等问题。 　　在过去的三十年，低温冷冻电镜设备取得了长足的进展，在样品制备、成像、计算机处理等实验技术方面有了一定的提升，这些使低温冷冻电镜成像技术的分辨率有了极大的提高。高度连贯的场发射电子枪(Highly coherent feld-emission electron guns)也使保留焦点以外的图像的高分辨率信息成为可能，这对于单粒子低温冷冻电镜非常有帮助。这种技术创新帮助科研人员获得了20面体病毒粒子(icosahedral virus particles)的图像，而且清楚地看到了其中的&alpha 螺旋结构。由于这种病毒是高度对称的，所以比较容易生成高质量的、最佳分辨率的低温冷冻电镜图像。 　　随着研究人员不断地开发出更稳定的载物台、更好的显微镜抽真空技术，以及自动化的数据采集系统，这一切的技术进步都让我们能够获得更多、质量更好的电镜图像，因此才能够得到高质量的、能够对其中的氨基酸侧链进行解析的二十面体病毒粒子三维结构图像，以及分辨率达到5埃的核糖体结构图像。不过在对更小一点的非对称粒子的解析工作中还是很难解析到&alpha 螺旋结构。 　　最近在低温冷冻电镜设备领域取得的最大进展就是引入了直接检测设备(direct detector device, DDD)照相机。这种DDD设备能够直接在传感器上记录图像，从而绕过了传统的、需要闪烁设备和光纤的电荷耦合装置(charge-coupled device, CCD)探测器，以及其他一些在用摄影胶片(photographic film)记录图像时必须要经过的繁杂的处理过程。因此，图像的信噪比也得到了极大的提升。在分辨率方面的提升也与之前的一些革新手段相当。在使用了DDD设备之后，还有可能在电镜图像中直接构建原子模型，甚至能够在最具挑战性的检测工作中进行&alpha 螺旋和&beta 折叠的解析工作。 　　DDD设备的引入还在另外一个方面对低温冷冻电镜的图像起到了改善作用，凭借的就是该设备极快的读出速度(readout rate)，该读出速度能够发现被冰包裹的被观测粒子在电子束中的运动情况。使用DDD设备不仅能够发现这种问题，还能够解决这种问题，因为现在的电镜就好像是一台摄像机，可以拍摄一段录影，记录整个过程，而不再像以前那样，只是一台照相机，只能够拍摄出一张张固定的图像。 　　有了高质量的图像，又有可以借助计算机对因为电子束而移位的粒子进行矫正的工具，我们就可以获得大量高质量的低温冷冻电镜图像，比如本文开头展示的那张分辨率高达3.2埃的线粒体核糖体亚单位图像，以及下图那张分辨率达到3.3埃的20S蛋白酶体图像和哺乳动物感受器通道TRPV1的图像。 TRPV1的图像尤其值得一提，因为TRPV1蛋白是一种膜蛋白，只有四级对称性(four-fold symmetry)，比核糖体要小一个数量级。所以之前大家一直都认为很难用低温冷冻电镜对该蛋白进行结构解析的研究工作。有了 DDD成像技术、更好的计算机辅助和生物化学技术之后，Liao等人终于在某些区域获得了分辨率高达3.4埃的图像，从而有机会开展原子建模工作，在整个结构生物学(structural biology)发展历史上写下了重重的一笔。 　　单粒子低温冷冻电镜结构解析图。左图展示的是随机排列的蛋白质粒子在电镜下的图像，这些图像经过计算机处理之后可以用来计算大分子复合物的三维立体结构图像。由于有了DDD技术，左边的这些图像信息就可以构建出右图中展示的原子模型。图中展示的就是20S蛋白酶体的结构图。 　　乍一看上去，这些成果都好像是特例。比如核糖体里由于含有大量的RNA，所以是一幅高度紧缩的图像，非常紧密，不太容易受到辐射的损失。而20S蛋白酶体拥有14级对称性，所以也非常适于进行低温冷冻电镜成像操作。即便是TRPV1通道蛋白也都拥有一定的内部对称性。但是最近刚刚成功获得的一幅电镜图像就完全不具备上述这些&ldquo 先天优势&rdquo ，这就是分辨率达到4.5埃的人&gamma 分泌酶复合物(&gamma -secretase)的结构图。人&gamma 分泌酶复合物是一种更小的膜蛋白复合体，完全没有对称性。该成果说明，只要待测样品能够准备得恰当，尽可能减少其在结构上的异质性，我们就完全有可能利用低温冷冻电镜技术获得各种蛋白质的三维立体结构图。 　　这些科研新进展恰好出现在低温冷冻电镜技术的低谷期。最近刚刚获得的HIV-1病毒糖蛋白三聚体结构模型就引起了极大的争议，因为多位电镜专家都坚持认为，这个结构模型不仅在结构上不准确，就连用来进行分析的原始图像也都没有真实地反映该三聚体的真实信息。这场争论也让我们意识到，我们目前的确没有太多的手段对低温冷冻电镜图像的质量进行验证，虽然有一些手段，但是都没有得到广泛的推广和应用，另外也缺乏一套规范，图像的信号非常差，所以也很难判断最终得出的结构图是否就是被测样品的结构。这是一个非常值得关注的问题，不仅仅是因为这次的HIV-1病毒糖蛋白三聚体结构模型具有重大的科研价值，比如在HIV疫苗的开发工作中会起到非常重要的指导作用等。 　　在结构解析方面还有大量的工作需要我们去完善：方便使用的显微镜相板(phase plates)有助于更好地聚焦，获得高对比度的图像，就好像相衬光学显微镜(phasecontrast light microscopy)那样，这能够让对图像进行信息采集的工作更加简便，而且质量更高。另外在探测器方面也可以进一步提高图像的质量。即便是最先进的探测器也达不到符合理论要求的表现。各种用来进行图像分析的计算机软件，比如用来矫正电子束相关移位的软件，或者对各种粒子进行分类、解读的软件也将会变得越来越强大。新型的样品承载系统会进一步减少电子束对样品的位移作用。更加可靠的、更加强大的验证工具可以让我们更有信心，保证不会纳入质量不高的原始图片素材。虽然现在还不知道低温冷冻电镜技术未来会走向何方，但是有一点是可以肯定的，那就是低温冷冻电镜图像绝对不再是一团浆糊了。 　　原文检索： 　　Martin T. J. Smith, John L. Rubinstein. Beyond blob-ology. Science 8 August 2014 DOI: 10.1126/science.1256358

项目概况北京荷塘生华医疗科技有限公司仪器设备采购项目 招标项目的潜在投标人应在www.o-science.com；北京市海淀区西三环北路甲2号院科技园6号楼13层01室获取招标文件，并于2021年12月27日 09点30分（北京时间）前递交投标文件。一、项目基本情况项目编号：OITC-G210222015项目名称：北京荷塘生华医疗科技有限公司仪器设备采购项目预算金额：780.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：780.0000000 万元（人民币）采购需求：1、采购项目的名称、数量：包号货物名称数量是否允许采购进口产品采购预算（万元人民币）1荧光定量PCR仪等1批是780投标人可对其中一个包或多个包进行投标，须以包为单位对包中全部内容进行投标，不得拆分，评标、授标以包为单位。2、技术要求详见公告附件。合同履行期限：合同签订后的3个月内交货本项目( 不接受 )联合体投标。二、申请人的资格要求：1.满足《中华人民共和国政府采购法》第二十二条规定；2.落实政府采购政策需满足的资格要求：本项目不属于专门面向中小微企业、监狱企业、残疾人福利性单位采购的项目。3.本项目的特定资格要求：1）在中华人民共和国境内依法注册的，具有独立承担民事责任能力，遵守国家法律法规，具有良好信誉，具有履行合同能力和良好的履行合同的记录，具有良好资金、财务状况的法人实体；2）为本项目提供整体设计、规范编制或者项目管理、监理、检测等服务的供应商，不得参加本项目投标；3）投标单位负责人为同一人或者存在直接控股、管理关系的不同供应商，不得参加同一合同项下的政府采购活动；4）按本投标邀请的规定获取招标文件；5）投标人不得为列入失信被执行人、重大税收违法案件当事人名单、政府采购严重违法失信行为记录名单的供应商。三、获取招标文件时间：2021年12月06日 至 2021年12月14日，每天上午9:00至11:00，下午13:00至17:00。（北京时间，法定节假日除外）地点：www.o-science.com；北京市海淀区西三环北路甲2号院科技园6号楼13层01室方式：登录东方在线www.o-science.com注册并购买。售价：￥600.0 元，本公告包含的招标文件售价总和四、提交投标文件截止时间、开标时间和地点提交投标文件截止时间：2021年12月27日 09点30分（北京时间）开标时间：2021年12月27日 09点30分（北京时间）地点：北京市海淀区西三环北路甲2号院国防科技园6号楼16层小会议室五、公告期限自本公告发布之日起5个工作日。六、其他补充事宜1、投标文件递交地点：北京市海淀区西三环北路甲2号院国防科技园6号楼16层小会议室2、招标文件采用网上电子发售购买方式：1）有兴趣的投标人可登陆“东方在线”（http://www.o-science.com 招标在线频道），完成投标人注册手续（免费），然后登录系统浏览该项目下产品的“技术指标”，已注册的投标人无需重新注册。招标文件售价：每包人民币600 元。如决定购买招标文件，请完成标书款缴费及标书下载手续。2）投标人可以电汇的形式支付标书款（应以公司名义汇款至下述指定账号）。开户名称：东方国际招标有限责任公司开户行：招商银行北京西三环支行账 号：8620816577100013）投标人应在“东方在线“上填写开票信息。在投标人足额缴纳标书款后，标书款电子发票将发送至投标人在“东方在线”上登记的电子邮箱，投标人自行下载打印。3、以电汇方式购买招标文件和递交投标保证金的，须在电汇凭据附言栏中写明招标编号、包号及用途（如未标明招标编号，有可能导致投标无效）。4、采购项目需要落实的政府采购政策：（1）政府采购促进中小企业发展（2）政府采购支持监狱企业发展（3）政府采购促进残疾人就业（4）政府采购鼓励采购节能环保产品七、对本次招标提出询问，请按以下方式联系。1.采购人信息名 称：北京荷塘生华医疗科技有限公司　　　　　地址：北京市昌平区生命科学园医药科技中心9号院1号楼 　　　　　　　　联系方式：010-68290510、010-68917573、010-68290524　　　　　　2.采购代理机构信息名 称：东方国际招标有限责任公司　　　　　　　　　　　　地　址：北京市海淀区西三环北路甲2号院科技园6号楼13层01室　　　　　　　　　　　　联系方式：吴旭 李祥宁 李媛 010-68290510、010-68917573、010-68290524　　　　　　　　　　　　3.项目联系方式项目联系人：吴旭 李祥宁 李媛 xwu@osic.com.cn电　话：　　吴旭 李祥宁 李媛 010-68290510、010-68917573、010-68290524

5月29-30日，2021年病原检测与传染病监测学术交流大会在山城重庆隆重启幕。本次会议由中华医学会杂志社、北京协和医学院群医学及公共卫生学院主办，数十位来自疾控、临床的专家分享了在病原检测方面的技术经验，吸引了300余专业观众到场。大会现场融智生物携手战略合作伙伴硕世诊断亮相此次大会，并展出了QuanID微生物质谱系统。目前，更新后的QuanID微生物质谱数据库拥有超过1800属、6600种、44000个菌株的微生物，独有的二级菌库可对基因型相近的难分辨微生物做出准确鉴定。展台另外在此次大会上，融智生物合作单位江西省疾病预防控制中心营养与食品安全所副所长刘道峰博士还进行了主题演讲，报告题目是《质谱技术在沙门氏菌检测与分型领域的应用》。江西省疾病预防控制中心营养与食品安全所副所长 刘道峰博士沙门氏菌是世界上食源性腹泻最常见的病原菌之一。全球每年估计发生13亿因沙门氏菌导致的急性肠胃炎病例，其中300万患者死亡。2016年起，沙门氏菌引起的食源性疾病病例数超过了诺如病毒，成为了我国食源性疾病的“头号元凶”。迄今为止世界上已鉴定出2500多个不同的沙门氏菌血清型，血清型的正确鉴定对确定人和动物沙门氏菌病的感染源和控制减少发病率具有重要意义。为此，许多国家和地区采取了众多措施以正确鉴定来自不同国家和地区、不同动物和外环境的沙门菌血清型。报告重点介绍了基于MALDI-TOF MS技术的“网鱼式”检测方法。该方法操作简单、鉴定速度快、鉴定概率高、结果准确，尤为适合医院、卫生防疫系统。沙门氏菌致病性、毒力、传播途径、耐药性在不同型别间有较大差异，因此，除沙门氏菌的检测外，沙门氏菌的致病菌分型是病原体溯源的关键环节。江西省疾病预防控制中心营养与食品安全所通过扩大采集范围，改变培养条件等，比对核糖体蛋白和非核糖体蛋白，寻找出某些血清型区别于其他沙门氏菌的特征蛋白进行建库，用于鉴定部分沙门氏菌血清型，完善沙门氏菌血清型质谱数据库。目前，共采集了285株不同血清型的沙门氏菌，经过血清型和测序验证，包含28种血清型；已成功鉴别至少三类沙门氏菌（肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌变种）；已发现若干可以区分沙门氏菌血清型的核糖体蛋白特征峰。沙门氏菌数据库的建立得益于QuanID微生物质谱系统对每个靶孔都进行了大量Shots数的采集，保证了靶孔间质谱图的重复性，尤其是沙门氏菌不同血清型之间的差异更多的是来源于丰度很低的蛋白多肽，只有保证了质谱图的重复性以及对于低丰度蛋白的检测灵敏度才能够实现对于沙门氏菌血清型的鉴定。

如果继续发展下去，并且所有技术问题都得到解决，冷冻电镜确实会成为一种占据统治地位的技术，而不仅仅是第一选择。　　在英国剑桥市一座钢结构建筑深处的地下室里，一场大规模的“叛乱”正在上演。　　一个约3米高的庞大金属箱正通过消失在屋顶上的橙色粗电缆，静悄悄地发射兆兆字节的数据。这是全球最先进的冷冻电子显微镜之一：一台利用电子束为冷冻的生物分子成像并揭秘其分子形状的设备。英国医学研究委员会分子生物学实验室(LMB)结构生物学家Sjors Scheres像个矮子一样站在这台价值500万英镑(合770万美元)的设备旁边介绍说，这台显微镜非常敏感，以至于一个叫喊声就能毁掉试验。　　在全球实验室中，类似这样的冷冻电镜正影响着结构生物学领域。过去3年里，它们揭示了制造蛋白的核糖体细节，而这些发现正在以飞快的速度发表于顶级期刊。结构生物学家们毫不夸张地认为，他们的领域正处于一场革命当中：冷冻电镜能快速创建那些抗拒X射线结晶学和其他方法的分子的高分辨率模型。与此同时，利用此前技术获得诺贝尔奖的实验室正争先恐后地学习这种“新贵”方法。　　挑战“王者”　　当1973年生物学家Richard Henderson到LMB研究一种被称为菌视紫红质的蛋白时，利用光能量推动质子穿过细胞膜的X射线结晶学是毫无疑问的“王者”。Henderson和他的同事Nigel Unwin利用这种蛋白制成二维晶体，但它们并不适合X射线衍射。因此，两人决定尝试电子显微镜。　　当时，电子显微镜用于研究被重金属染色剂处理过的病毒或组织切片。一束电子被射向样品，其中挣脱开来的电子被探测到并用于描绘它们所撞入的材料结构。这种方法产生了烟草病菌的首幅清晰图像，但染色剂使观察单个蛋白变得困难，更不用说X射线所能揭示的原子水平上的细节。　　在一个关键步骤中，当Henderson和 Unwin利用电子显微镜对菌视紫红质的晶片进行成像时，他们省略了染色剂，相反把晶体放在金属网格上，以便使蛋白凸显出来。“你能看到蛋白中的原子。”和Unwin在1975年发表了菌视紫红质结构的Henderson介绍说。“这是一个巨大的进步。”美国加州大学旧金山分校细胞生物学家David Agard表示，“这就是说，利用电子显微镜研究蛋白结构将成为可能。”　　冷冻电镜领域在上世纪八九十年代得到发展。一个关键进步是将液态乙烷用于瞬间冻结溶液中的蛋白并使其保持静止。不过，通常情况下，这种技术仍然只能将蛋白结构解析到10埃(1埃相当于1纳米的十分之一)的分辨率——与X射线晶体学超过4埃的模型相比并没有竞争力，并且远远无法满足将这些结构用于药物设计的要求。当诸如美国国立卫生研究院等资助者把上亿美元投资到野心勃勃的晶体学项目时，对冷冻电镜的资助远远落后于此。　　1997年，当Henderson参加关于3D电子显微镜的年度高登研究会议时，一位同事在开幕式上发表了颇有挑衅意味的声明：冷冻电镜是一种“小生境”方法，不可能取代X射线晶体学。不过，Henderson能看到一个不同的未来，并且在随后的演讲中进行了反驳。“当时我说，我们应当让冷冻电镜在全球统治所有结构学方法。”他回忆道。　　革命从此开始　　此后第二年，Henderson、Agard和其他冷冻电镜的狂热支持者有条不紊地实现了各种技术改善，尤其是找到了感知电子的更好方法。在数码相机风靡世界很久之后，很多电子显微镜专家仍然偏好过时的胶片，因为它能比数字传感器更高效地记录电子。不过，和显微镜生产厂商一道，研究人员开发出远超胶片和数码相机探测器的新一代直接电子探测器。　　这些从2012年左右获得应用的探测器，能以每秒几十帧的速率捕捉单一分子的速射图像。与此同时，诸如Scheres等研究人员编写了复杂的软件程序，将上千幅2D图像转变成在很多情况下可与晶体学解析的分子图像质量相媲美的3D模型。　　冷冻电镜适合能忍受电子轰击而不会四处晃动的稳定、大型分子，因此通常由几十个蛋白制成的分子机器是很好的目标。而研究证明，没有什么比由RNA相互缠绕支撑的核糖体更加合适了。通过X射线晶体学解析核糖体结构的方法，让3位化学家获得了2009年诺贝尔化学奖。过去几年里，不同的研究团队迅速发表了来自众多生物体的核糖体冷冻电镜结构，包括首个人类核糖体高分辨率模型。在由分享了2009年诺贝尔奖的Venki Ramakrishnan领导的LMB实验室，X射线晶体学在很大程度上变得无人问津。他认为，对于大型分子来说，“冷冻电镜将大幅取代晶体学技术的预测是可靠的”。　　今年5月，加拿大多伦多大学结构生物学家John Rubinstein和他的同事利用约10万幅冷冻电镜图像，创建了一种名为V-ATPase、形状类似转子的酶的“分子影片”。V-ATPase通过燃烧三磷酸腺苷(ATP)推动质子进出细胞液泡。“我们看到的是一切事情都在灵活进行。”Rubinstein说，“它在弯曲、扭动和变形。”在他看来，这种酶的灵活性能帮助其高效传递ATP释放的能量。　　统治结构生物学领域　　像任何新兴领域一样，冷冻电镜领域也有着成长的烦恼。一些专家担心，竞相利用此项技术的研究人员会产生有问题的结果。2013年发表的一种艾滋病病毒表面蛋白的结构，便受到科学家的质疑。他们认为，用于构建模型的图像是白噪声。从那以后，虽然其他团队产生的X射线和冷冻电镜模型对原始模型提出了挑战，但这些研究人员一直坚守他们的成果。　　今年6月，在高登会议上，想要更多质量控制的研究人员通过一项决议，督促各期刊为审稿人提供关于冷冻电镜结构如何被创建的细节资料。　　成本也会减缓此项技术的扩散。据Scheres估算，LMB每天花费约3000英镑运行其冷冻电镜设备，还要加上1000英镑的电费。大部分电费是由储存和处理图像所需的计算机产生的。“对于很多实验室来说，这是一项很高的开支。”　　为了让冷冻电镜的使用更加便利，一些资助者建立了研究人员能预定时间的共享设备。霍华德休斯医学研究所(HHMI)在其弗吉尼亚州珍利亚农场校区运营着一个对HHMI资助的研究人员开放的冷冻电镜实验室。在英国，由政府和惠康基金会资助的一台全国性冷冻电镜设备，今年在牛津附近的迪德科特开始运行。“人们想要了解冷冻电镜，已成为当下的一股浪潮。”帮助建立上述设备的伦敦大学伯克贝克学院结构生物学家Helen Saibil表示。　　追赶这一浪潮的还有纽约洛克菲勒大学生物物理学家Rod MacKinnon。他因确定了特定离子通道的晶体结构而共同分享了2003年诺贝尔化学奖，但如今却在深入研究冷冻电镜。“我正处在学习曲线的陡坡上，而这总是令我兴奋不已。”MacKinnon希望利用冷冻电镜研究离子通道是如何打开和关闭的。　　当Henderson在1997年反驳说冷冻电镜将统治结构生物学世界时，他或许是在口是心非。但将近20年以后，他的预言已不像当时看上去的那么夸张。“如果继续发展下去，并且所有技术问题都得到解决，冷冻电镜确实会成为一种占据统治地位的技术，而不仅仅是第一选择。”Henderson说，“我们或许已经成功了一半。”

细菌必须经过培养之后才能进行物种鉴定，这是一直以来我们的认知。法国马赛地中海感染研究所的研究可能会改变我们的看法。尿样是临床实验室中处理最多的样品之一。以作者所在的马赛大学医院为例，细菌学实验室每年能收到大约62050份尿样，约占所有分析生物样品的17%（中国医院的尿样肯定比这个数字多得多）。而事实上，尿路感染在细菌感染中很普遍。快速鉴定引起尿路感染的病原体十分重要，可以避免感染性休克等致命并发症。由于细菌需要培养后才能进行鉴定，常规方法需要24至48小时才能准确识别存在于尿样中的病原体。在这个时差内，患者通常会接受不必要的广谱治疗，显然，这会影响微生物群和细菌耐药性。减少接收样本和诊断之间的延迟时间，可以帮助患者更快地使用上恰当的药物，从而防止细菌耐药的发生。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)目前已经成为临床实验室病原体鉴定的重要工具，它能对细菌进行快速而可靠的鉴定，有潜力成为尿液病原体直接鉴定的工具。研究团队使用被感染的尿液样本创建了MALDI-TOF质谱参考数据库，建立了使用该数据库来直接识别尿液中病原体的新方法。该方法使用少量样品(1mL)和低细菌计数，即可快速鉴定多种尿路病原体，且无需事先培养。研究人员收集了1000个感染尿样的MALDI-TOF质谱，用于创建参考数据库。并将使用参考数据库的鉴定结果与标准数据库进行比较，对参考数据库进行评估。结果显示，使用参考数据库可以正确诊断500个受感染的单杆菌样本中的近90%，而使用标准数据库可以正确诊断50%。对肠杆菌科、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌和屎肠球菌的鉴定有了很大的提高，但对表皮葡萄球菌的鉴定却没有得到很大的改善。显而易见地，创建适合特定类型临床样本的数据库对于提高病原体鉴定的准确率和速度具有非常重要的意义。总之，研究人员开发的方法能够快速鉴定尿液中的病原菌，方案可以用于需要快速诊断的特定患者群体，例如肾移植患者或新生儿。目前，临床上所用的病原鉴定方法仍然需要先培养，然后进行微生物质谱鉴定。虽然病原体直接鉴定距离真正临床应用还有很远的距离，但是这项研究给临床病原体鉴定带来了新思路。融智生物QuanTOF新一代宽谱定量飞行时间质谱平台，集核糖体蛋白与核酸（RNA、DNA）检测于一机，新一代的MALDI-TOF MS（QuanTOF）不仅能鉴定细菌、真菌，对于病毒鉴定也游刃有余，同样可以为临床病原体鉴定提供新的思路。QuanTOF新一代宽谱定量飞行时间质谱平台参考文献：Direct identification of pathogens in urine using a specific MALDI-TOF spectra database. doi:10.1128/JCM.01678-18

从一类技术角度来说，直接和间接获得诺贝尔奖的技术非结构生物学莫属。经过半个多世纪的耕耘，这一技术现在到了快速收割的季节。现在代表结构生物学技术的多种技术正在走向整合，但整合技术仍然需要进一步推动和推广。 　　上世纪50年代，开文迪许实验室M.Perutz J.Kendrew用X-射线晶体衍射技术获得了球蛋白结构。X射线晶体衍射技术的应用，使人们可在晶体水平研究大分子的结构，在分子原子基础上解释了大分子。1962年，Waston和 Crick因基于结构生物学技术的研究结果发现了DNA双螺旋结构获得了诺贝尔生理学与医学奖，M.Pertt和J.Kendrew获得了同年的诺贝尔化学奖。 　　60-70年代，开文迪许实验室又发展了电子晶体学技术，研究对象主要是有序、对称性高的生物体系，如二维晶体和高对称性三维晶体。70-80年代，多维核磁共振波谱学使研究水溶液中生物大分子成为可能，溶液中生物大分子更接近于生理状态。 　　80年代，冷冻电子显微镜出现，这种技术不仅能够研究生物大分子在晶体状态和溶液状态的结构，且能够研究研究复杂大分子体系和超分子体系，如核糖体、病毒、溶酶体和线粒体等。 　　杂交或整合方法把多种结构生物学方法结合在一起，大大推动了结构生物学的研究。荧光能量共振转移(FRET)是20世纪初发现的，随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，FRET已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。 　　冷冻电子显微镜技术通过快速冷冻的方法进行固定的，克服了因化学固定、染色、金属镀膜等过程对样品构象的影响，更加接近样品的生活状态。研究对象非常广泛，包括病毒、膜蛋白、肌丝、蛋白质核苷酸复合体、亚细胞器等等。所研究的生物样品既可具有二维晶体结构，也可是非晶体。由于对于样品分子量没有限制，突破了X-射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究小分子量样品的限制。计算机技术则可以将各种信息进行整合，从而可以获得接近真实的三维分子模拟数据。 　　现在结构生物学研究越来越多地依赖这种整合技术。2012年加州大学Andrej Sali等解析了26S蛋白酶体的结构。这种结构在许多神经退行性疾病的神经细胞都存在异常。现在科学家正利用这种结构作为模型开发能调节蛋白酶体活性的药物。今年另外一个小组利用整合技术分析决定感染细胞的艾滋病蛋白结构，利用这种结构开发治疗艾滋病的药物。整合技术也被用在解析核糖体结构。核糖体是细胞制造蛋白质的细胞器，是实现基因表达的关键机构。 　　目前的蛋白数据库存在一些问题，如这些数据主要依靠晶体结构数据，缺乏对其他相关数据的整合，这一问题给结构生物学领域提出要求应该大力推动整合技术的发展。10月6-7日，由4个机构组织了一次整合结构生物学培训班，以推动结构生物学技术的扩展和引领大家将结构和疾病结合起来研究。 　　参加学习的大部分学员都支持应该采用标准模式描述多方面的数据，这有利于其他学者整合和利用这些数据。但由于结构数据往往十分巨大，如何有效储存和获取这些数据仍然存在一些问题。会议结束时达成一项共识，将申请经费构建一种&ldquo 分子机器&rdquo 数据库中心。 　　欧洲分子生物学实验室细胞生物学家Jan Ellenberg说，获取全部分子结构的数据是结构生物学的目标，这个愿望或许能在10或20年后实现。 　　原文检索： 　　Ewen Callaway. Data bank struggles as protein imaging ups its game. Nature, 22 October 2014 doi:10.1038/514416a

RNA 分子具有多种修饰，这些修饰在各种生物过程中发挥着重要的调节作用。已在 RNA 分子中鉴定出超过 150 种修饰。N6-甲基腺苷 (m6A) 和 1-甲基腺苷 (m1A) 是哺乳动物的各种 RNA 物种中普遍存在的修饰。除了腺苷的单甲基化(m6A 和 m1A)外，据报道，在腺苷的核碱基中发生的双重甲基化修饰，例如 N6,N6-二甲基腺苷 (m6,6A)，也存在于哺乳动物的 RNA 中。除了 m6,6A 之外，腺苷的核碱基中是否存在其他形式的双重甲基化修饰仍然难以捉摸。2022年9月12日，武汉大学袁必锋团队在Nucleic Acids Research (IF=19)在线发表题为“Formation and removal of 1,N6-dimethyladenosine in mammalian transfer RNA ”的研究论文，该研究报告了在活生物体的 tRNA 中存在一种新的腺苷双甲基化修饰，即 1,N6-二甲基腺苷 (m1,6A)。该研究证实 m1,6A 位于 tRNA 的第 58 位，并且在哺乳动物细胞和组织中普遍存在。tRNA 中 m1,6A 的测量水平范围为 0.0049% 至 0.047%。此外，该研究证明了 TRMT6/61A 可以催化 tRNA 中 m1,6A 的形成，并且 m1,6A 可以被 ALKBH3 去甲基化。总的来说，m1,6A 的发现扩大了 RNA 修饰的多样性，并可能引发新的 tRNA 修饰介导的基因调控途径。　　除了四种典型的核碱基之外，RNA 分子还带有多种修饰。近年来，为了揭示和表征 RNA 上存在的修饰，人们付出了巨大的努力，这些修饰具有调节 RNA 代谢的潜力。据报道，超过 150 种不同类型的修饰存在于各种 RNA 。RNA 分子中这些自然发生的修饰在影响 RNA 结构方面发挥着关键作用，也拓宽了我们对 RNA 分子功能的理解。以类似于 DNA 的方式，越来越多的证据表明 RNA 分子中的这些修饰参与调节 RNA 过程。甲基化是哺乳动物 RNA 分子中最普遍的修饰。据报道，N6-甲基腺苷 (m6A) 和 1-甲基腺苷 (m1A) 的两种异构腺苷甲基化修饰广泛存在于哺乳动物的不同 RNA 中。m6A 存在于真核信使 RNA (mRNA)、转移 RNA (tRNA)、核糖体 RNA (rRNA) 和非编码 RNA (ncRNA)。近年来对 m6A 的深入研究表明 m6A 与广泛的关键功能有关，从细胞发育和分化 、应激反应到癌症的发展 。在分子水平上，m6A 参与 RNA 稳定性、翻译调控和 microRNA 生物合成 。m1A 是一种修饰，主要在 rRNA 和 tRNA 的保守位点中观察到。m1A 也在哺乳动物 mRNA 中发现，在 5' 非翻译区 (5' UTR) 中富集。RNA 中的 m1A 可以影响核糖体的生物合成，对环境应激作出反应，并介导细菌的抗生素耐药性。　　文章模式图(图源自Nucleic Acids Research )　　除了腺苷(m6A和m1A)的核碱基上的单甲基化外，据报道，腺苷的核碱基中发生的双重甲基化修饰，例如N6，N6-二甲基腺苷(m6,6A)也存在于RNA中。m6,6A 是在人类 18S rRNA 中发现的保守修饰，在核糖体生物发生中起关键作用 。由于 m1A 和 m6A 都是哺乳动物 RNA 中普遍存在的修饰，研究人员推测除 m6,6A 之外的二甲基化腺苷，例如 1,N6-二甲基腺苷 (m1,6A)，可能存在于 RNA 中。然而，与 m6,6A 不同的是，m1,6A 从未在包括古生菌、细菌和真核生物在内的三域系统的生物体中被发现。RNA 中 m1,6A 的存在仍然是一个悬而未决的问题。在这项研究中，报道了哺乳动物细胞和组织的 tRNA 中存在一种新的腺苷双甲基化修饰，即 m1,6A。值得注意的是，该研究证明了 m1,6A 位于 tRNA 的第 58 位。此外，该研究证明了 TRMT6/61A 负责 tRNA 中 m1,6A 的形成，而 ALKBH3 能够使 tRNA 中的 m1,6A 去甲基化。总的来说，m1,6A 的发现扩大了 RNA 修饰的多样性，并可能引发新的 tRNA 修饰介导的基因调控途径。