骨髓瘤

【序号】：3【作者】：平措卓嘎1,2王剑利1徐燕【题名】：自体造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤的疗效评价及影响因素：单中心真实世界研究【期刊】：西安交通大学学报(医学版). 【年、卷、期、起止页码】：2023,44(03)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7ioT0BO4yQ4m_mOgeS2ml3UD1jEw1SpgmMwojC3DSx7U3rDsqM34rgpF1W6HZ22weu&uniplatform=NZKPT

[size=15px][b][font=&][color=#0070c0]1[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0]、[/color][/font][font=&][color=#0070c0]GA[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0]诱导[/color][/font][font=&][color=#0070c0]KRAS[/color][/font][font=宋体][color=#0070c0]降解[/color][/font][font=&][color=#0070c0][/color][/font][/b][/size][size=15px][font=宋体]作者首先通过筛选了一个自制的化合物库，用含有[/font][font=&] KRAS[sup]G12A[/sup][/font][font=宋体]突变的[/font][font=&]MM[/font][font=宋体]细胞系[/font][font=&]MM.1S[/font][font=宋体]和[/font][font=&]RPMI 8226[/font][font=宋体]鉴定可以降低[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]水平的化合物，发现藤黄酸（[/font][font=&]Gambogic acid[/font][font=宋体]，[/font][font=&]GA[/font][font=宋体]，）处理可降低两种细胞系中[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]的水平，而其他化合物没有表现出相似或较弱的效果。进一步实验表明，[/font][font=&]GA[/font][font=宋体]可以以浓度和时间依赖性方式降低两种细胞系中[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]的水平，以及[/font][font=&] KRAS[/font][font=宋体]的下游[/font][font=&]p-ERK[/font][font=宋体]（[/font][font=&]MAPK[/font][font=宋体]通路）和[/font][font=&]p-AKT[/font][font=宋体]（[/font][font=&]PI3K[/font][font=宋体]通路）。此外，[/font][font=&]q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]显示[/font][font=&]GA[/font][font=宋体]不会改变[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]的转录水平，表明[/font][font=&]GA[/font][font=宋体]可能在转录后水平降低[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]。[/font][font=&][/font][/size][size=15px][font=宋体]进一步使用蛋白酶体抑制剂[/font][font=&]MG132[/font][font=宋体]发现[/font][font=&]MG132 [/font][font=宋体]部分挽救了[/font][font=&]GA[/font][font=宋体]诱导的[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]蛋白下调，表明[/font][font=&] KRAS [/font][font=宋体]蛋白降解与泛素[/font][font=&]-[/font][font=宋体]蛋白酶体途径有关，此外，我们采用放线菌酮（[/font][font=&]CHX[/font][font=宋体]）测定评估显示[/font][font=&]GA[/font][font=宋体]处理后，[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]的半衰期显著缩短。这些数据表明[/font][font=&]GA[/font][font=宋体]可以诱导[/font][font=&]KRAS[/font][font=宋体]的蛋白酶体降解，进而损害[/font][font=&]MM[/font][font=宋体]细胞中的下游信号转导[/font][font=宋体] [size=15px][b]2、鉴定USP2作为GA的新靶标[/b][/size][size=15px]为了确定GA诱导KRAS降解的靶标，作者合成了生物素标记的GA，发现它保留了在MM细胞中诱导KRAS降解的能力，进一步利用该探针开展Pulldown+MS，鉴定到的互作蛋白中，HSP90和USP2这两种与蛋白质降解相关。HSP90是一个已知的GA靶点，作为伴侣蛋白，它可以调节各种蛋白的稳定性，然而HSP90抑制剂STA9090处理不能降低MM.1S细胞中KRAS的蛋白水平，表明KRAS不是 HSP90的底物。因此，作者更加关注USP2，一种新型的GA互作蛋白。通过Pulldown+WB、免疫荧光共定位、竞争实验、CETSA、DARTS实验共同证实了USP2是GA的直接相互作用蛋白。此外，GA在体外相对特异性地抑制USP2的去泛素化活性（ [/size][size=15px][b]3、半胱氨酸284对于GA与USP2的共价结合至关重要[/b][/size][size=15px]然后，作者研究了GA和USP2之间的相互作用模式，发现碘乙酸（IAA，一种半胱氨酸烷化剂）与USP2的预孵育完全抑制了GA与USP2的结合，表明GA可能与USP2的半胱氨酸共价结合，这与之前的报道一致，即GA可以通过半胱氨酸残基与其靶标共价结合。接着，通过USP2蛋白与GA一起孵育后质谱鉴定，发现Cys284残基被GA共价修饰。此外，通过构建USP2的两个突变体（C276S、C284S），发现GA 与 USP2（C276S）结合，而不是USP2（C284S），表明GA可以与USP2的Cys284残基特异性形成共价键。结合动力学显示GA 以剂量和时间依赖性方式与 USP2 共价结合，分子对接显示P565和 R289对于形成GA与USP2结合的口袋至关重要。同样通过蛋白点突变实验发现P565 和 R289对GA-USP2相互作用至关重要 [/size][size=15px][b]4、USP2调节KRAS的稳定性[/b][/size][size=15px]前面发现GA降低MM细胞中KRAS蛋白水平并抑制USP2活性，表明USP2可能调节KRAS的稳定性。作者利用CRISPR/Cas9敲除MM.1S和RPMI 8226细胞系中的USP2，发现敲除USP2导致KRAS蛋白水平降低，mRNA水平不变， KRAS的下游效应子p-ERK水平也显著降低。此外，敲除诱导的KRAS下调可被两种细胞系中的蛋白酶体抑制剂MG132挽救。结果表明USP2可以增强KRAS的蛋白质稳定性。进一步研究发现USP2与KRAS互作并使KRAS去泛素化，表明KRAS是USP2的底物 [/size][size=15px][b]5、USP2敲除抑制MM细胞的增殖[/b][/size][size=15px]鉴于KRAS在MM细胞增殖和存活中的关键作用，作者假设USP2敲除可能会使KRAS不稳定，从而导致MM细胞增殖抑制。结果显示USP2敲除显著抑制MM.1S和RPMI 8226细胞系的增殖，诱导这两种MM细胞系凋亡。此外，MM.1S 细胞的异种移植 MM 模型发现，USP2敲除显著抑制肿瘤生长，免疫组化染色也显示USP2敲除组的KRAS水平降低，这些数据共同表明USP2在MM细胞的增殖和存活中起着关键作用 [/size][size=15px][b]6、GA通过靶向USP2和破坏KRAS的稳定性来诱导MM细胞凋亡[/b][/size][size=15px]据报道，GA通过抑制PI3K/Akt/mTOR、[i]NF-κ[/i]B 和其他信号通路诱导MM细胞凋亡。作者发现GA处理可以以剂量依赖性方式降低MM.1S和RPMI 8226细胞的活力并促进细胞凋亡。此外，过表达USP2的细胞对GA诱导的活力降低和KRAS降解表现出部分抗性，且GA处理可以提高 KRAS的泛素化水平。KRAS[sup]G12C[/sup]的过表达可以部分消除USP2敲除诱导的细胞生长抑制。这些数据表明，GA在 MM 细胞中诱导的细胞毒性至少部分归因于其靶向USP2，这降低了KRAS的稳定性。[/size][size=15px]最后，作者探讨了USP2在MM中的临床意义。通过GSE13591数据集发现MM患者骨髓样本中的USP2 mRNA水平明显更高。此外，作者发现原发性骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞系中USP2的蛋白水平高于正常外周血单核细胞（PBMC）和正常骨髓活检，且高USP2水平的MM患者的总生存期降低，这些结果共同表明USP2表达增加与MM中较差的结局之间存在很强的相关性，表明USP2可能是MM治疗的有前途的靶点。[/size][/font][font=&][/font][/size]

名 称：骨髓细胞的提取目的：分离并培养骨髓间充质干细胞原理：先分离出单核细胞然后再通过培养分离出骨髓间充质干细胞内容：步骤一：小鼠骨髓细胞的获取1． 断颈处死小鼠（7-12周，雌雄均可），投入盛有250ml左右的0.1%新洁尔灭或75%酒精中浸泡3-5分钟，拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。2． 用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。将它们放入另外一个消毒托盘中，并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。3． 小心剥离肌肉，分别剪下Femurs and Tibias, 剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。4． 拿两支5ml无菌注射器，每支吸取5ml IMDM(10%FBS, 50/50u/ml Pen/Strep)，换装一个4号针头（又称皮针）或1ml注射器的针头，并用无菌的针头套管将之轻轻拧弯。轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管，将细胞冲出。每根骨用2.5ml IMDM培养液左右即可基本冲下骨髓腔内的细胞。5． 300C下离心，1200转/10分钟，去上清，但留1ml，以便用于在振荡器上悬浮细胞。6． 加进氯化铵溶液（NH4Cl: 8.99g/L, KHCO3: 1g/L, Na4-EDTA: 0.037g/L ，过滤灭菌, 40C储存）裂解红细胞，按1: 9比例，即1ml 细胞悬液，加进9ml氯化铵溶液，混匀，冰上10分钟。 7． 300C离心，1200转/10分钟，去上清。步骤二：淋巴细胞分离液分离小鼠骨髓细胞1． 按步骤二方法采集小鼠骨髓细胞，并破红细胞2． 细胞用4ml培养液悬浮，缓慢留置于8ml淋巴细胞分离液液面上，2000rpm for 20min.3． 小心吸取云雾状底层的基质细胞约1.5ml的体积，置于1个盛有1ml无菌细胞培养用PBS的15ml离心管中，颠倒混匀，1200rpm for 10min, 去上清4． 如果是注射用细胞，则用5ml PBS洗涤细胞2次；5． 离心沉淀下来的细胞用50-200ul PBS，计数细胞，并计算所需细胞体积数铺板培养

随着医学知识的普及，“骨髓移植”早已不是什么新鲜词了，很多人都知道，如果人的骨髓出现问题，失去造血功能，就可能不得不接受骨髓移植手术。但是成功接受骨髓移植后，患者的身体方面会发生什么变化，一般人恐怕都不了解。 　　像还是不像？　　前些时候，有人提出：进行骨髓移植后，两个非亲非故的陌生人的相貌越长越像。还有一种比较流行的说法认为患者的性格会发生变化。　　这些问题，大都源于一些媒体的报道。　　说相貌越来越像的报道举了实例。第一个例子是１９９６年中华（上海）骨髓库第一个配型成 功，并捐献造血干细胞的志愿者孙伟，据报道，当年２６岁的他与１１岁的小患者术后一直保持联系，通信、寄照片。上海红十字会的工作人员表示：“所有见过照片的人，都觉得像极了。”而另一位捐髓者周海燕也是同样的情况。文章还提到，越长越像的是两位移植时间比较长的患者，因为孙伟和周海燕的捐髓手术分别是全国的第一例和第三例。　　还有报道说：“一名皮肤白皙的女士成功地将骨髓捐给一名皮肤黝黑的女大学生，奇怪的是这名大学生的皮肤奇迹般地日渐白皙；脾气暴躁的一名患者在接受了骨髓移植后，渐渐地脾气如同骨髓捐献者一般温和了。在中国仅有的十几例骨髓成功移植案例中，这种奇迹不能仅仅用巧合来解释。”　　这种说法有科学性吗？有的读者看到报道后告诉记者，生活中两个非亲缘关系的人越长越像是有可能的，“夫妻脸”就是一个例子，甚至还有说法认为孩子会长得像保姆或是奶妈，而血液，似乎比共同生活、奶水哺育等因素更“可靠”。　　骨髓移植，移植的是造血干细胞，干细胞在揭示生命奥秘方面的巨大潜力叫人对这些问题产生疑惑。　　骨髓移植到底改变了什么？　　中国医学科学院血液学研究所造血干细胞移植中心主任韩明哲博士接受了本报记者的采访，他从事血液病临床和基础研究工作已经近２０年。　　谈到骨髓移植，韩明哲博士更倾向使用的词是“造血干细胞移植”。他说，造血干细胞移植是经大剂量放化疗或其他免疫抑制预处理，清除受体体内的肿瘤细胞、异常克隆细胞，阻断发病机制，然后把自体或异体造血干细胞移植给受体，使受体重建正常造血和免疫，从而达到治疗目的的一种治疗手段。　　据介绍，造血干细胞移植目前广泛应用于恶性血液病、非恶性难治性血液病、遗传性疾病和某些实体瘤治疗，并获得了较好的疗效。１９９０年后这种治疗手段迅速发展，全世界１９９７年移植例数达到４．７万例以上，自１９９５年开始，自体造血干细胞移植例数超过异基因造血干细胞移植，占总数的６０％以上。同时移植种类逐渐增多，提高了临床疗效。　　造血干细胞移植后，患者身体的确会发生一些变化。韩明哲博士告诉记者，根据现有的已经被普遍接受的研究资料，接受骨髓移植者，最常见的改变是血型，移植后患者的红细胞血型变为供者红细胞血型。比如供者是Ａ型，移植后不论移植前患者血型为何型，均变为Ａ型。内分泌系统也会改变：由于移植前预处理为大剂量照射和化疗，这种治疗对身体器官有很大的损伤。移植后很多器官组织短期内得到恢复，但是性激素分泌变化显著。男性患者出现精子数量减少，但其性功能（性生活）不受影响。女性患者常常出现闭经。另外，由于移植后的免疫反应，部分患者会出现口腔溃疡、皮肤色素沉着。　　典型的伪科学思维？　　对于骨髓移植“移植”走了相貌、性格，某科技网站发表评论说：“这是典型的伪科学思维。即使所说的事例不是编造的，要在两个人之间找到某种无法定量测定的相似性有什么难的？为什么这一对是相貌相似，那一对是肤色相似，另一对又是性格相似？骨髓的影响会因人而异不成？怎么知道这种相似性就是骨髓引起的？如果统计表明大部分骨髓移植的结果是肤色都变相似了，还可以怀疑是否不是巧合。像这样因人而异的不同方面的相似性，连巧合都算不上。”　　也有专家认为，报道中所谓的“像”与“不像”是缺乏科学定义的，因为相貌受遗传背景控制，涉及到皮肤、骨骼、毛发等上百种细胞类型及其空间结构，是个相当复杂的多基因性状。而骨髓移植，主要为了将造血干细胞输给患者，以重建造血功能，这些都只能在血液中表达，怎么可能改变相貌呢？　　韩明哲博士告诉记者，近几年，研究结果表明造血干细胞具有可塑性，可以转变为血管、肝脏、脂肪、神经、肌肉等组织细胞。因此很多研究单位、医院研究用造血干细胞治疗冠心病、神经损伤、血管闭塞性疾病。但是他认为，因为成人患者骨骼生长已经停止，所以移植患者长相不会有大的改变。另外，同胞之间本身有一定的相似。他很肯定地说，据他所知，国内的研究和治疗中还没有出现这种情况，国外的科学文献也没有报道过这样的先例。　　韩明哲博士认为，接受捐赠者在性格方面的确可能会有改变，但是他强调这并非是造血干细胞移植的结果，而主要是因为患者通过一系列治疗后，对人生有另一种认识。并且移植后一段时间免疫力低下，在饮食、社交活动中需要注意避免感染，故很多患者会变得小心谨慎。　　至于其他方面，如异性之间的骨髓移植是否会改变患者的性别，韩明哲博士很明确表示绝对不会。他说，骨髓移植只是替换造血系统，尽管有的器官当中存在少量的供者细胞，但其他器官没有很大的改变，尤其是性器官。人的一生很多关键的生长发育是在胎儿期间完成的，一个器官的形成需要非常复杂的发育过程。因此，单纯通过骨髓移植改变人的性别是不可能的。　　不过也不是所有的专家都对此持怀疑态度，上海市血液中心专门从事白血病研究的仇志根博士在接受媒体采访时表示，也许有“越来越像”的可能，他说：传统观念认为，不同组织种类的干细胞是“世袭终身制”，不可逆转，然而在１９９９年，美国科学家首先证明人体干细胞具有“横向分化”的功能，比如造血干细胞可能转化为肌肉细胞、神经细胞、成骨细胞等等，反之亦然。这一里程碑式的发现立即轰动世界，两年后，《科学》杂志评出“２１世纪最重要的科学领域”，干细胞列十项之首。美国科学家曾将黑鼠的骨髓移植给白鼠，白鼠长出了黑毛发；英国科学家将骨髓植入心脏病人的心脏，结果骨髓干细胞分化构建成小的毛细血管，改善了心脏功能。在他看来，相貌的“移植”恐怕不仅仅是猜测或者空想。　　讨论还将继续。也有专家表示，关于国内的骨髓移植，可能这些话题都还不应该是“主角”，尽快解决国内骨髓库捐献者资料稀缺的问题才是目前最迫切的事情。

骨髓间充质干细胞总结 2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为详实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。一、骨髓间充质干细胞的分离 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。1. 直接培养法（全骨髓培养法） 1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法，得到了广泛的应用。culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：（1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞（2）原代培养24 h,48 h各换液一次（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来。（4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。（5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。（6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48 h~72 h后首次换液，一般7~10天可传代。天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6 w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48 h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。2. 密度梯度离心法 裴雪涛等用比重为1.073 g/ml的percoll分离（400 g×20 min）人骨髓MSCs，取界面处细胞层，离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种，72 h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每3 d换液一次。细胞长到80％汇合时1：1传代。菊花与刀利用PERCOLL密度1.073分离大鼠MSC 时，用2400 rpm×20 mins后可见中间有一层约1～2 mm厚的白色层，仔细用吸管吸取这一层再用PBS离心2遍即可加培养基和胎牛血清培养即rMSCs。周进明等利用密度为1.082的percoll分离小鼠MSCs，500g×30min离心后，取中间的单个核细胞层，PBS洗两次，接种于IMDM培养基，1 d后换液，去掉非贴壁细胞，以后每3-4天换液。jetter用过FICOLL,FERCOLL,上海二分厂的淋巴细胞分离液分离MSC细胞效果都不错，当然所获细胞群的纯度不一，Percoll最纯，而上海二分厂的淋巴细胞分离液所获细胞群的传代能力优秀（35 PASSAGE）。本版的部分园友认为MSC贴壁培养得到的细胞不均一，但是多能分化能力和增殖力好，percoll分离得到的细胞较为均一，多能分化性和增殖力不如贴壁培养的，尤其是增殖力相差很远，有人添加bFGF或/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力。二、骨髓间充质干细胞的培养 天之饺子认为，间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs获得或失去这些表面标记物的表达。三、骨髓间充质干细胞的特性 体外培养的MSC体积小，成梭形，核浆比大。不表达分化相关的细胞标志，如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶或Osteopontin；也不表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白，这群细胞特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95％和98％。MSC联系传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能，而且保持正常的核型核端粒酶活性，但不易自发分化，在体外特定的诱导条件下，MSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。四、其他相关内容 Jiang将从成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分离的间充质干细胞（CD45－TER119－）命名为多潜能成年祖细胞，他们证明，MAPC高表达端粒酶，而且随着细胞的扩增，端粒的长度不变，单个MAPC来源的细胞群不仅能在体外向3个胚层的细胞分化，而且能在体内能够向各种组织细胞分化，相比较而言，形态与MSC相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。参考文献 生理学报2003.55（2）：153－159 人骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑内的迁移及分化中华放射医学与防护杂志.2002,22(3).-167-169 培养小鼠骨髓间充质干细胞及其移植后在体内的定位分布Exp Biol Med Vol. 226:507 520, 2001 Mesenchymal Stem CellsNATURE |VOL 418 | 4 JULY 2002 Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow干细胞生物学 裴雪涛 主编

大神们，帮忙推荐台主要针对小鼠骨髓细胞数检测的仪器，再一个就是能对小鼠血细胞的种类分类，计数。要求不高。。但是这种针对性的仪器还这难找。。

大神们，帮忙推荐台主要针对小鼠骨髓细胞数检测的仪器，再一个就是能对小鼠血细胞的种类分类，计数。要求不高。。但是这种针对性的仪器还这难找。。

要测定骨髓的脂肪酸成分。用色谱分析来做。对色谱分析，我是盲点盼望得到达人指点，谢谢我有个实验，就是要测定骨髓的脂肪酸成分。用色谱分析来做。但是我不知道怎么取材恰当。请高手指点。知否第一步将实验动物椎体离断下来，接下来怎么弄？十分火急！

德国研究人员在新一期美国《血液》月刊上发表报告称，他们通过骨髓移植疗法“治愈”了一名艾滋病患者。但这一疗法能否推广引发争议。德国柏林沙里泰医院的研究人员介绍说，2007年，一名40多岁的美国男性艾滋病病毒携带者因患白血病在柏林接受骨髓移植治疗，当时捐献者的骨髓配型不仅非常吻合，而且还有一种能天然抵御艾滋病病毒的变异基因。以往研究发现，在很少一部分欧洲人体内存在这种变异基因。3年后，这名美国病人已不再有白血病和艾滋病病毒感染的迹象。研究人员在报告中说：“他们的结果非常明确地显示这名患者的艾滋病得到治愈。”但是，美国艾滋病病毒医学协会前会长迈克尔·扎格认为，如果将这种方法变成标准疗法，存在着较大风险。他说，目前，干细胞或骨髓移植常用于癌症治疗，但对健康人来说其风险尚属未知，因为它涉及利用强力药物和放射物摧毁人体原有的免疫系统，然后输入捐献者的骨髓，以重造一个新的免疫系统，这种疗法及其引发的并发症会提高死亡率。美国国家过敏和传染病研究所主任安东尼·福西也认为，目前这种治疗艾滋病的方法还不能应用，因为费用和风险都太高。不过，它为研究人员利用基因疗法或其他方法治疗艾滋病提供了更多线索。

麻烦各位英文好的大侠搜索一下国外关于骨髓干细胞移植的评价。我有个朋友初步配对成功，现在想知道如果捐献骨髓干细胞，有没有什么副作用。在国内的媒体上好像没有副作用、后遗症的报道，但对国内的媒体有点怀疑。不知道国外有没有权威报道。谢谢各位大侠了。毕竟是救人性命的大事

世界首个艾滋病治愈者出现 移植骨髓后获抗体 核心提示：全球艾滋病患者将看到曙光，世界上第一位艾滋病治愈者出现，康复者叫莫西·雷·布朗，身患两大绝症——艾滋病和白血病，治愈的方法是骨髓移植。 对于医生胡特而言，病人蒂莫西·雷·布朗就像漆黑抗艾研究道路上的一道亮光。这名被冠以“柏林病人”的特殊病患同时兼有白血病和艾滋病。在医学界看来，布朗已经是即将踏入坟墓的人，然而在接受骨髓移植后，布朗竟然奇迹般得以重生。这一事件震惊了整个医学界，医生们从他的身上看到了医学界的奇迹：终结艾滋。　　从1981年6月5日人类发现HIV病毒到现在，已经过去了整整30年。就在HIV30岁之际，世界医疗科技领域已吹响消灭号角，将全力把这种可怕的病毒从世界上消除。这种动力的来源，一是科学的进步；二是金钱压力的迫使。据悉，仅在全球发展中国家，每年用于艾滋病治疗的费用就已高达13亿美元。如果继续下去，到2031年这一数字将会变为现在的三倍。诺贝尔奖得主朗索瓦丝·巴尔·西诺西表示：“艾滋病患者长期用药会带来大量的花费，我们必须要找到治愈他们的方法，我们会不断地努力，直至找到。”　　无心插柳　　———发现骨髓移植法是巧合　　蒂莫西·雷·布朗是一名美国白血病患者，并同时患有艾滋病。2007年他来到柏林找到了胡特医生。胡特医生是一名肿瘤病和血液病专家，现工作于德国西南部的海德堡大学。胡特说：“当时布朗的状态非常不好，病情正在恶化，几乎已经到了死亡的边缘。”随即，胡特做出一个决定：进行骨髓移植，先治白血病。结果却出人意料，经过3年来的临床观察，这次移植同时治愈了布朗的艾滋病。原来，骨髓捐献者的配型不仅非常吻合，而且骨髓中还有一种能天然抵御艾滋病病毒的变异基因。据以往研究发现，这种变异基因只在少数北欧人体内存在。　　“真的不敢相信，我们治愈艾滋病的新方法竟然是这样开始的。”6月2日胡特对路透社记者说，“因为布朗患有艾滋病，本以为做完骨髓移植手术他依然会离开这个世界。真的没有想到，他竟然奇迹般地活了下来，还成为世界第一个被治愈的艾滋病病人。现在，他体内已经没有艾滋病病毒了，已经不再吃药。”　　对于这种骨髓移植方法，大多数科学家则表示，不可能用于其他艾滋病患者。骨髓移植方法费用高昂、复杂、充满风险，而且在这个方法中，需要找到特殊的捐献者———体内具有抵御艾滋病病毒基因的人。据目前研究所知，北欧人的后裔具有这一特征。因此，要找到准确的骨髓捐献者很难，这一部分捐献者只占所有捐献者的一小部分。　　去年，马里兰大学的博士罗伯特·加洛直率地表达了他的反对意见：“这个方法不具有实践性，会害死很多人。”　　面对这项新成果，诺贝尔奖得主西诺西则表示：“虽然这种方法花费巨大、风险也很大，但是从科研人员的角度来看，我不得不说这是一项进步，起码它告诉我们艾滋病是可以治愈的。”　　美国国家卫生局日前提出一项资助艾滋病治愈方法研究计划，这项计划共分为四个阶段，在第一阶段将投入8.5亿美元。研究动力　　———迫于全球抗艾资金压力　　1981年6月5日，美国亚特兰大疾病控制中心在《发病率与死亡率周刊》上介绍了5例艾滋病病人的病史，这是世界上第一次有关艾滋病的正式记载。“5个年轻的艾滋病病人，全部都是同性恋者。”在资料中这样记载着。据联合国所提供的数据显示，全球每天仍有7100多人感染艾滋病。　　在不发达国家，一个艾滋病患者每年花费在医药费上的开销大约为150美元；在发达国家，例如美国，一个患者大约则要花费20000美元。无论是发达国家还是不发达国家，当这些开销加在一起，这个数字无疑是巨大的。　　据一项由非政府组织发起的名为AIDS2031的活动显示，到2031年不发达国家每年需要花费35亿美元在防艾和抗艾行动上，而这一数字目前为每年13亿美元。对于发达国家而言，20年后，每年将要花费50亿到60亿美元。　　“很清楚，我们现在需要找到一个可行性的方法去治愈艾滋病，而不是仅仅应对艾滋病患者的发热症状。”澳大利亚墨尔本的莫纳什大学艾滋病问题专家莎伦·卢恩说。　　取得成就　　———基因疗法和抗艾新药等　　治疗艾滋病的终极目标是让病人停止用药，这将减少每年大约12亿美元的抗艾药物需求。这一消息或许对于制药商例如辉瑞、葛兰素史克、默克等公司不是一个好消息。虽然要得到能够普遍推广的治疗艾滋病方法还需要很长时间，但是布朗的新发现，为艾滋病科研打开了一扇新的大门。“布朗的发现告诉我们，我们可以让一个人的细胞变得能够抵御HIV病毒，然后再经过一段时间的治疗最终攻克病魔。”卢因说。　　目前一些科学家正在模拟“柏林病人”案例的做法，并且已经取得初步的进展。关于研究原理，简单地说主要是采用基因治疗法从病人体内取出一些细胞，然后在实验室中将其培养成具有抗HIV病毒的细胞，最后再放回病人体内，并期望这些具有抗病毒能力的细胞能够在病人体内成活进而不断繁殖。　　今年早些时候在柏林举行的HIV研讨会上，美国科学家提供了一系列的研究资料：从6个艾滋病病人的体内取出血细胞，然后去除其中的CCR5基因，再放回病人体内。这个工作就像是用剪刀剪掉细胞DNA中有问题的部分，然后再将它缝合，放回病人体内。这个母细胞就可以通过在人体内不断地繁殖产生新的健康细胞，从而抵御艾滋。　　在研讨会上，科学家们还提出了唤醒体内HIV细胞并杀死的方法。在上个世纪九十年代末期，人们发现HIV病毒可以把自己隐藏在免疫系统内的T细胞中，然后“沉睡”下去。如果HIV病毒躲避起来的话，就会使药物无法消灭它们。这也是为什么现在的抗艾药物无法治愈艾滋病的一个原因。　　“如果当它在一个细胞中‘睡去’，它将会永远地待在那里，那就是为什么我们现在的药物无法把它们彻底消灭的原因。”卢恩说。卢恩和她的科研团队已经研制出一种新的药物名为SAHA，据信这种药可唤醒那些沉睡的HIV细胞。接下来卢恩和她的团队将对SAHA做进一步的临床研究。（据羊城晚报）

【序号】：3【作者】：周年1,2,3刘波1,4徐彭【题名】：大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和分化能力鉴定【期刊】：江西中医药. 【年、卷、期、起止页码】：2018,49(05)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7i0-kJR0HYBJ80QN9L51zrP3ylMAV4CgQ9wpp7ZMmE5O8NBqbZq4aly75LaltU8u1l&uniplatform=NZKPT

【序号】：1【作者】：刘璐璐【题名】：三维培养条件下骨髓间充质干细胞的形态学观察【期刊】：山西医科大学【年、卷、期、起止页码】：2022【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C475KOm_zrgu4lQARvep2SAkueNJRSNVX-zc5TVHKmDNkhj_JpBBTDZS90To-XUT-zkJYyY14qZp-BPIDn6w4bDJ&uniplatform=NZKPT

近日，来自加利福尼亚大学的研究者发现了在人类骨髓干细胞和所有的免疫细胞之间存在一类“环节缺失”（missing link）的细胞。这或许为我们深入理解免疫系统以及免疫系统疾病发生的分子机制提供帮助。相关研究刊登在了9月2日的国际杂志Nature Immunology上。这项研究是在人类骨髓中进行的，因为其包含了产生人类自出生后所需血液的所有的干细胞。理解成人正常血液的形成是揭开白血病发病机制关键的一步。之前的研究中，研究者重点研究了骨髓中的血液干细胞，这种干细胞生存时间比较久，可以再生，而且可以产生所有的血液细胞。在这过程中，干细胞可以分裂产生其发育的中间状态体，称为前体干细胞，前体干细胞可以产生血液的不同谱系，比如产生红细胞或者血小板等。和干细胞一样，祖细胞也非常稀少，因此研究就好比海里捞针一样，研究者Lisa这样说，此前的研究工作中，他们发现了一种具有部分分化能力、相当成熟的淋巴祖细胞。在这项最新的研究中，研究者描述了一种更为原始的可以分化为整个免疫系统所需细胞的祖细胞。

【序号】：4【作者】：李倩晓1那荣妹2刘百亭【题名】：SD大鼠骨髓间充质干细胞原代培养条件的选择【期刊】：中国老年学杂志. 【年、卷、期、起止页码】：2017,37(05)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iAEhECQAQ9aTiC5BjCgn0RqLtq4qv82HhSJrd4mMlLD1sEVOCJ2Utcht-M6YZ-Ko0&uniplatform=NZKPT

【序号】：2【作者】：黄可欣1于军2石搏【题名】：大鼠骨髓间充质干细胞培养方法改良与鉴定【期刊】：中国老年学杂志. 【年、卷、期、起止页码】：2019,39(14)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iLik5jEcCI09uHa3oBxtWoNXIvaiQB80L3Jul38AtFf3UeTB_BlOzKJibUJyew7WW&uniplatform=NZKPT

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]，作为现代生物技术的瑰宝，自诞生以来便在生物医学领域产生了深远的影响。其基本原理在于利用细胞融合技术，将免疫的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，从而得到一种新型的杂交细胞——杂交瘤细胞。这种细胞既保留了[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞产生特异性抗体的能力，又继承了骨髓瘤细胞无限增殖的特性。通过筛选和克隆，我们可以获得稳定产生特定抗体的杂交瘤细胞系，进而制备出高纯度、高特异性的单克隆抗体。下面是具体的关于杂交瘤技术原理及应用：[/font][/font][font=宋体][b]杂交瘤技术的基于三种关键技术。[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一、动物免疫[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将特定的抗原注射到哺乳动物（如小鼠）体内，在外来抗原刺激下，被免疫动物脾脏内的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞大量增殖并且分泌针对于该抗原的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外来抗原对动物进行免疫，以刺激能分泌特异性抗体的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞大量增殖。 [/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]二、细胞融合[/font] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间（两周）便死亡[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]短命细胞；而骨髓瘤细胞不分泌抗体，却能在体外无限增殖存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞，细胞融合杂交瘤细胞中非常关键的一个步骤。 [/font][/font][font=宋体][font=宋体]通常使用的细胞融合技术有生物方法如仙台病毒，化学方法如聚乙二醇（[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]），物理方法如电融合。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合脾细胞，未融合骨髓瘤细胞，脾细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]脾细胞融合体，骨髓瘤细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞融合体，脾细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞杂合体（杂交瘤细胞）。其中，我们需要利用另一个关键技术[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]杂交瘤细胞筛选[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]将所需的杂交瘤细胞分离出来。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]三、杂交瘤细胞筛选[/font] [/font][font=宋体][font=宋体]筛选杂交瘤细胞一般使用[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基筛选方法基本原理：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基成分：含有次黄嘌呤[/font][font=Calibri](H)[/font][font=宋体]、氨基喋呤[/font][font=Calibri](A)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶[/font][font=Calibri](T)[/font][font=宋体]三种成分。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成途径：主要合成和补救合成途径两种方式。主要合成就是利用糖和氨基酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]；而补救合成途径则是通过次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶[/font][font=Calibri](Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase[/font][font=宋体]， [/font][font=Calibri]HGPRT)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶激酶[/font][font=Calibri](thymidine kinase[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]TK)[/font][font=宋体]将核苷酸前体合成核苷酸以供[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成原料。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成的内源性途径。融合前的骨髓瘤细胞不能产生抗体，并且缺乏次黄嘌呤 – 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]）基因，使得它们对[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基敏感，阻断了[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]补救合成途径。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将融合的细胞在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基中孵育大约[/font][font=Calibri]10[/font][font=宋体]至[/font][font=Calibri]14[/font][font=宋体]天，未融合的以及自身融合的骨髓瘤细胞死亡。这是因为[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基阻断了骨髓瘤细胞两大[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成途径。未融合的以及自身融合的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞虽然能够合成[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]酶，但其是正常细胞，存活一段时间（两周）也死亡。因此，在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]养基中，只有[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤杂合体存活，因为杂交瘤细胞继承了[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]酶和[/font][font=Calibri]TK[/font][font=宋体]酶。这些杂交瘤细胞能够分泌抗体（[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞特性）并且无限增殖（骨髓瘤细胞特性）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]然后将培养基稀释到多孔板中，使得每个孔仅含有一个杂交瘤细胞。再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株。由于孔中的抗体由相同的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞产生，针对相同的抗原表位，所以产生的抗体又被称之为单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]接下来采用体内或者体外方式对筛选的能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养，最后收集提纯获取单抗。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]杂交瘤技术应用：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①疾病诊断：单克隆抗体在疾病诊断中发挥着重要作用，以其准确且无交叉反应的特点，显著提高了诊断的准确性。例如，在乙型肝炎及潜伏的乙型肝炎病毒的诊断中，单克隆抗体能显著减少假阴性的漏诊。[/font][font=宋体]②治疗载体：单克隆抗体也可以作为治疗疾病的载体。通过与抗肿瘤药物结合，单克隆抗体能在体内选择性集中攻击肿瘤细胞，具有靶向性，从而减少对正常组织的损伤并减轻抗癌药物的副作用。这种载药单克隆抗体被誉为“生物导弹”。[/font][font=宋体][font=宋体]③抗体序列保护：获取抗体基因序列后，可以通过专利对[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区进行保护，从而保护创新性的抗体序列。[/font][/font][font=宋体]④生产方式备份：由于杂交瘤存在退化转阴的风险，抗体序列可以通过基因工程方式轻松获得抗体样品，为生产方式提供备份。[/font][font=宋体]⑤抗体工程改造：获得的抗体序列可用于抗体人源化、双特异性抗体等抗体工程改造项目，进一步拓展抗体的应用范围和效果。[/font][font=宋体]⑥癌症研究：杂交瘤技术可以制备大量的特异性抗体，用于检测肿瘤标志物、研究癌细胞的生物学特性、筛选分子靶点等。此外，该技术还可以用于检测肿瘤细胞表面的抗原，通过对来自不同患者的癌瘤细胞进行克隆化和筛选，发现不同肿瘤的抗原异质性，为临床肿瘤治疗提供新的思路和策略。[/font][font=宋体]总的来说，杂交瘤技术以其独特的优势在多个领域都有着广泛的应用，为生物医学研究和疾病治疗提供了有力的工具。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service][b]杂交瘤细胞抗体基因测序服务[/b][/url]和[url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service][b]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务[/b][/url]，有需求可以咨询。[/font][font=宋体][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

【序号】：1【作者】：柏秀娟李一凡时霄冰【题名】：SD大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及鉴定【期刊】：中国煤炭工业医学杂志. 【年、卷、期、起止页码】：2022,25(02)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iJTKGjg9uTdeTsOI_ra5_XQ1nc-PzVE0xyf-gP3YJd2uBAacMkWEJ5FZ3Wo5eFSGS&uniplatform=NZKPT

【序号】：5【作者】：王博荣1鲁曦1张敏龙【题名】：一种改良大鼠骨髓间充质干细胞培养方法【期刊】：中华肺部疾病杂志(电子版). 【年、卷、期、起止页码】：2017,10(01)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iAEhECQAQ9aTiC5BjCgn0RrntXS8bbQWa2nxXxa6LsSXxNfFO7FPG8wvrj5FsSgFx&uniplatform=NZKPT

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]是指建立杂交瘤细胞系的技术，其用于产生大量单克隆抗体，所以又称单克隆抗体技术。其是在细胞融合技术上发展起来的：将[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓细胞融合，即可形成在体外长期存活并分泌免疫蛋白的杂交瘤细胞。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原结合位点的抗体，即单克隆抗体（[/font][font=Calibri]monoclonal antibody[/font][font=宋体]），简称单抗。单克隆抗体具有高度专一性，一种单克隆抗体只能识别一种特定的抗原决定簇。正是由于其特异性强，因此被广泛应用于生物学，药学，医学等领域，具有极其远大的应用前景，因此用于制备单克隆抗体的杂交瘤技术也变得越来越重要。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术原理：[/font][/font][font=宋体]杂交瘤技术基于三种关键技术。[/font][font=宋体][b]一、动物免疫[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将特定的抗原注射到哺乳动物（如小鼠）体内，在外来抗原刺激下，被免疫动物脾脏内的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞大量增殖并且分泌针对于该抗原的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外来抗原对动物进行免疫，以刺激能分泌特异性抗体的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞大量增殖。 [/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][b]二、细胞融合[/b][/font] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间（两周）便死亡[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]短命细胞；而骨髓瘤细胞不分泌抗体，却能在体外无限增殖存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞，细胞融合杂交瘤细胞中非常关键的一个步骤。 [/font][/font][font=宋体][font=宋体]通常使用的细胞融合技术有生物方法如仙台病毒，化学方法如聚乙二醇（[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]），物理方法如电融合。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合脾细胞，未融合骨髓瘤细胞，脾细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]脾细胞融合体，骨髓瘤细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞融合体，脾细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞杂合体（杂交瘤细胞）。其中，我们需要利用另一个关键技术[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]杂交瘤细胞筛选[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]将所需的杂交瘤细胞分离出来。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][b]三、杂交瘤细胞筛选[/b][/font] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]筛选杂交瘤细胞一般使用[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基筛选方法基本原理：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基成分：含有次黄嘌呤[/font][font=Calibri](H)[/font][font=宋体]、氨基喋呤[/font][font=Calibri](A)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶[/font][font=Calibri](T)[/font][font=宋体]三种成分。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成途径：主要合成和补救合成途径两种方式。主要合成就是利用糖和氨基酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]；而补救合成途径则是通过次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶[/font][font=Calibri](Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase[/font][font=宋体]， [/font][font=Calibri]HGPRT)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶激酶[/font][font=Calibri](thymidine kinase[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]TK)[/font][font=宋体]将核苷酸前体合成核苷酸以供[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成原料。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成的内源性途径。融合前的骨髓瘤细胞不能产生抗体，并且缺乏次黄嘌呤 – 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]）基因，使得它们对[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基敏感，阻断了[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]补救合成途径。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将融合的细胞在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基中孵育大约[/font][font=Calibri]10[/font][font=宋体]至[/font][font=Calibri]14[/font][font=宋体]天，未融合的以及自身融合的骨髓瘤细胞死亡。这是因为[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基阻断了骨髓瘤细胞两大[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成途径。未融合的以及自身融合的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞虽然能够合成[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]酶，但其是正常细胞，存活一段时间（两周）也死亡。因此，在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]养基中，只有[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤杂合体存活，因为杂交瘤细胞继承了[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]酶和[/font][font=Calibri]TK[/font][font=宋体]酶。这些杂交瘤细胞能够分泌抗体（[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞特性）并且无限增殖（骨髓瘤细胞特性）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]然后将培养基稀释到多孔板中，使得每个孔仅含有一个杂交瘤细胞。再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株。由于孔中的抗体由相同的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞产生，针对相同的抗原表位，所以产生的抗体又被称之为单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]接下来采用体内或者体外方式对筛选的能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养，最后收集提纯获取单抗。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]杂交瘤技术的优缺点介绍：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、优点：与传统的免疫动物方法制备抗体相比，利用杂交瘤技术可以制备出高纯度的单抗，并且可以进行单克隆抗体的大量生产。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、缺点：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]a.[/font][font=宋体]操作步骤繁琐。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]利用杂交瘤技术生产出的单克隆抗体多为鼠源性，而鼠源性抗体在应用中有诸多问题，例如被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体[/font][font=Calibri](HAMA[/font][font=宋体]）反应、在人体循环系统中很快被清除等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service][b]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务[/b][/url]，服务内容从细胞复苏[/font][font=宋体]→细胞驯化→生产及纯化→[/font][font=Calibri]QC[/font][font=宋体]分析→交付内容 义翘神州都有严格的质量把控，更多详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service[/font][/font]

【序号】：1【作者】：张宁李小佩肖倩茹【题名】：梯度交联水凝胶用于骨髓间充质干细胞的三维培养与分化【期刊】：东南大学学报(医学版). 【年、卷、期、起止页码】：2018,37(04)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7i0-kJR0HYBJ80QN9L51zrPykMtHqC9zZyLumdUzSnd49uxratj2CePE0w9L8JUMwY&uniplatform=NZKPT

【序号】：3【作者】：张宁李小佩肖倩茹【题名】：梯度交联水凝胶用于骨髓间充质干细胞的三维培养与分化【期刊】：东南大学学报(医学版). 【年、卷、期、起止页码】：2018,37(04)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7i0-kJR0HYBJ80QN9L51zrPykMtHqC9zZyLumdUzSnd4-Vv49Lrf5qmxCA42hyYsyg&uniplatform=NZKPT

【序号】：4【作者】： 郝岱峰冯光李涛【题名】：富血小板血浆联合负压伤口疗法治疗患者开胸术后胸骨骨髓炎和窦道的效果【期刊】：中华烧伤杂志. 【年、卷、期、起止页码】：2016,32(06)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CJFD&dbname=CJFDZHYX&filename=ZHSA201606010&uniplatform=NZKPT&v=M41kjjBFUdTL_s1rn1OsuaeHGlRGKJEwEvJienO5sI-neSh3Zj-X6BX6l-09Uvas

【序号】：2【作者】：李军张鹏卢雪玲【题名】：壳聚糖负载原代培养自体骨髓间充质干细胞修复全层关节软骨缺损实验研究【期刊】：潍坊医学院学报. 【年、卷、期、起止页码】：2019,41(05)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iLik5jEcCI09uHa3oBxtWoFvEHGTUVWmEdg45V5dosGvy6fb7mrvKACrbEH0OKOFk&uniplatform=NZKPT

【序号】：2【作者】：朱晓宇【题名】：人骨髓间充质干细胞成脂分化的体外优化培养体系研究【期刊】：上海交通大学【年、卷、期、起止页码】：2016【全文链接】：https://kns.cnki.net/kns8/DefaultResult/Index?dbcode=SCDB&crossDbcodes=CJFQ%2CCDMD%2CCIPD%2CCCND%2CCISD%2CSNAD%2CBDZK%2CCCJD%2CCCVD%2CCJFN&korder=SU&kw=%E4%B8%89%E7%BB%B4%E5%9F%B9%E5%85%BB%20%E7%BB%86%E8%83%9E%20%E5%87%9D%E8%83%B6

【序号】：1【作者】：杨涛【题名】：不同层软骨细胞与骨髓间充质干细胞在体内外三维共培养时细胞外基质特点的实验研究【期刊】：大连医科大学【年、卷、期、起止页码】：2017【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C447WN1SO36whLpCgh0R0Z-ifBI1L3ks338rpyhinzvy7Kt4RMGSMaxxH2WkQVeTlx_sUqdJWIk0PB_cP8FsBxdg&uniplatform=NZKPT

鉴于本人还是零蛋一个,特发此贴,虽然得分不是最主要目的,但零分确实很让人难受啊!单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。二、杂交瘤技术（一） 杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。（二） 基本程序和方法杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。1、动物免疫(1) 抗原制备 制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。(2) 免疫动物的选择 根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。(3) 免疫程序的确定 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。

【序号】：1【作者】：范谊【题名】：搭载骨髓间充质干细胞的可注射水凝胶促进临界性骨缺损修复的研究【期刊】：吉林大学【年、卷、期、起止页码】：2023【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=GARc9QQj0GUGt7oTxWCcNiNLWNEqhogDOrAClcQUs6s-PgpOuE8G_usmhF5mRGRgawugNtgN0jeGmVA7mchcs4Eleqh2D0Ky2LWUuGSo1MnHIOWgme-guhT4HAbd1jBHbOgmHme8nJ37V0Z8aHvDqg==&uniplatform=NZKPT&language=CHS