细胞筛选

在单克隆抗体药物的初期研发阶段中，需要对细胞株进行筛选，选出能产生滴度较高、ADCC活性较高的细胞株。东曹公司推出的新型亲和色谱柱FcR-IIIA-NPR能?够基于抗体糖链结构的差异，对细胞培养液中的抗体进行HPLC分析，将繁琐的抗体生物学活性测定法化繁为简，获得重复性良好的分析结果。

● 全流程应用与整合解决方案● 背景介绍和应用实例集锦● iPSC基因重编程应用解决方案● 细胞克隆筛选应用解决方案● 化繁为简，合而不同

轻柔分选：鞘液压力2psi，提高分选细胞活性灵活分选：可根据荧光信号筛选，也可以不染色直接铺板无菌分选：一次性芯片，保证样本之间完全隔离；仪器体积小巧，可置于超净台中高效分选：96孔板分选不到1min，384孔板4min以内，单克隆率超过95%轻松分选：仪器操作简单，无需专人操作维护

优势：1.简易、快速的通过检测细胞贴壁面积进行96或384孔板细胞毒性筛选2.按照一般微孔读板机的简单流程3.具有细胞影像数据，增加数据可信性

ClonePix 2是最新一代的高效细胞克隆筛选系统(图 1)，主要用于抗体和蛋白类药物研发，适用于杂交瘤细胞的筛选，以及稳定高表达细胞株的筛选。ClonePix系统的全球装机量已经超过300套，其中排名前十的生物制药企业都是ClonePix系统的用户。相比涉及大量手工操作的有限稀释法，ClonePix 2系统利而更快速地获得优质克隆。在争分夺秒的抗体药物研发竞赛中，ClonePix 2系统可以帮助获得更多的时间和生产成本优势，最终获得更大的市场。用半固体培养基和荧光原位成像技术允许对更多克隆进行筛选，从

双链DNA病毒引起人类大多数疾病。疱疹病毒和腺病毒家族和乳头瘤病毒在人体中会产生相似的症状。而且，由于病毒抗原基因组的保守，对于特殊病毒的血清学和蛋白诊断确认是非常复杂的。高度的蛋白同源性和血清交叉反应导致双链DNA病毒物种之间区分是非常困难的。本研究的目的是发现识别最优的分泌高度特异性、无交叉反应的单克隆抗体的细胞系，用于生物治疗的开发。ClonePix系统用来高通量从母本的杂交瘤细胞中（历史数据表明母本的细胞系产量少于1mg/L的单抗）筛选数以百计的亚克隆。分泌高IgG的活细胞进一步用客观评价细胞生长的CloneSelect Imager系统来评估。高效自动化克隆选择技术旨在挽回高滴度的杂交瘤细胞系，这些细胞系能生产抗原高特异性的抗体。ClonePix和CloneSelect Imager配套技术为免疫诊断技术发展提供了足够的病毒抗原的特异性抗体。优势：1.相比传统方法，能够筛选更多克隆，增加发现稀有、高产分泌子的可能性2.独特的流程生产高滴度的杂交瘤细胞3.增加发现最优细胞生产器的可能性

瑞孚迪作为高通量筛选整体解决方案（包括自动化液体处理、检测方法和试剂、成像和检测系统、信息学）的供应商领导者，一直致力于为全球药企、生物技术公司、科研院所和政府实验室的药物研发提供更简化的工作流程。瑞孚迪自动化细胞学与药筛解决方案能保证结果的一致性和精确性，并以简单易得的数据解析，加速药物研发的进程。瑞孚迪基于explorer G3平台搭建定制化的自动化整合系统，此平台可通过快速鉴别表征安全有效的候选药物来提高实验室效率，并提供更真实且可重复的实验结果。通过条码追踪与溯源，数据自动化处理与分析，数据信息管理等，能够在药物的各个阶级，实现更智能、更有效的标准化实验数据管理，加快药物研发进程。

细胞凋亡和细胞坏死的本质均为细胞死亡，但我们可以通过其发生机制和病理形态学方面所表现出的特征加以区别。细胞凋亡指的是细胞程序性的死亡，不会发生细胞膜损伤；细胞坏死则被认为是因病理而产生的被动死亡，会伴随发生细胞膜损伤，导致细胞质因子的释放并引起炎症反应。进行抗肿瘤药物筛选过程中，区分引起的是细胞调亡和细胞坏死变得非常重要，因为后者的主要副作用是引起细胞的炎症反应。这里我们介绍了利用SpectraMax Paradigm（Molecular Devices）和 Vybrant 凋亡检测试剂盒（Invitrogen）进行这方面的研究。

细胞凋亡和细胞坏死的本质均为细胞死亡，但我们可以通过其发生机制和病理形态学方面所表现出的特征加以区别。细胞凋亡指的是细胞程序性的死亡，不会发生细胞膜损伤，细胞坏死则被认为是因病理而产生的被动死亡，会伴随发生细胞膜损伤，导致细胞质因子的释放并引起炎症反应。进行抗肿瘤药物筛选过程中，区分引起的是细胞调亡和细胞坏死变得非常重要，因为后者的主要副作用是引起细胞的炎症反应。这里我们介绍了利用SeptraMax Paradigm（MolecularDevices）和 Vybrant 凋亡检测试剂盒（Invitrogen）进行这方面的研究。

细胞迁移是一个活的生物生长和维持生命过程中不可缺少的的关键过程。为了完成相应的功能，体内的细胞经常会以特定的方向迁移到特定的位置。迁移是一个循环的过程，细胞向前端伸出突触，缩回其尾端。动物组织中的细胞发生迁移主要是为了响应特定的外部信号。 细胞迁移对于胚胎发育、伤口愈合、分化以及免疫应答等都是非常重要的过程。细胞迁移是血管疾病，慢性炎症疾病以及肿瘤形成等疾病的致病机理。因此，对那些具有促进（伤口愈合）或者抑制（肿瘤形成）细胞迁移作用的化合物的研究就具有非常重要的治疗意义。我们已经建立了一个使用Molecular Devices公司的SpectraMax paradigm多功能检测平台进行标准化的，自动化的高通量细胞迁移分析新方法。相对于划痕分析或者其他的2D伤口闭合实验，这个分析方法更加简单，更具可重复性。

利用岛津现有的“细胞培养上清液分析方法包“直接分析监测细胞上清液中组分变化，无需方法优化，并可快速实现方法拓展，前处理方便，数据分析结果直观。

生物创新药的开发是一个复杂的过程，而构建一个适合于生产的高表达稳定细胞株是第一步，也是关键的一步。挑选到理想的高表达克隆后，就要开始选择商业化培养基或者定制培养基进行细胞培养优化。高通量、标准化、自动化的细胞培养和工艺优化能帮助我们在获得更准确结果的同时加速细胞株开发进度。本应用中，介绍了如何使用Ambr® 15高通量全自动细胞培养系统和Octet® 非标记分子互作分析系统联合进行培养基筛选和工艺优化，加速细胞株开发工作流程，以超快速度筛选出高产量高质量的单克隆细胞株。

对于药物研发早期先导化合物寻找和确认，配有发光蛋白检测应用的FLIPRTETR是简便且可信赖的高通量筛选系统。发光蛋白检测部件包含了增强型CCD (ICCD) 相机和悬浮细胞系统。ICCD相机的增益可调节功能使得高通量FLIPRTETRA系统既可以适应基于染料的明亮的荧光实验，也可以记录信号强度较弱的化学发光蛋白实验。本篇应用文章描述了贴壁CHO Mito-Photina./H3发光蛋白细胞在高通量FLIPRTETRA系统中的实验结果和表现。

流式细胞术作为当代最先进的细胞定量分析技术之一，其工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。默克密理博旗下Guava微毛细管细胞分析平台系列，可在短时间内迅速完成上百个样本的检测；在精确完成细胞活力计数的同时，还可实现细胞凋亡检测、分期；抗体工程细胞株的高效筛选；单抗生物学活性如EC50、ED50指标测定等功能。在高通量检测的基础上，维护成本几乎为零，大大提高了企业的生产效率，降低了生产风险。为高端现代化企业研发、生产、质控提供了全套解决方案！

广东某生物医药企业需要培养多批抗药性细胞用于实验，为了获得背景更一致的耐药株，需要将细胞单克隆化，以徒手挑单克隆法做细胞分选筛选出满足要求的细胞。Mshot明美推荐了活细胞成像仪MCS21，支持明场、相衬和荧光观察，尺寸小巧节省空间，可以连接到手机、平板或电脑流畅成像，方便易用，操作舒适，效果得到用户认可。

近期，约翰霍普金斯大学医学院的研究人员在Science期刊发表研究成果[1]。他们发现了靶向TP53突变的新抗原，筛选出一种抗体片段（H2-scFv）特异性识别灭活的肿瘤抑制基因的蛋白质产物，通过实时监测T细胞杀伤效应，证实了该抗体片段的有效性，开创了靶向疗法的新领域。此研究中，Incucyte® 被选择并应用于免疫细胞肿瘤杀伤活性的实时动态分析。

FLIPRTETRA系统可用于完成多数细胞基础的实验研究。本篇应用研究推荐了细胞内PH值检测实验在FLIPR上运行的基础方案。实验在贴别细胞上完成，同时还讨论了一些重要参数的优化。因为每种细胞系都有其独有的特性，每个研究人员在进行自己的实验时都需要进行单独的优化。

ClonePixTM 2系统提供了一种全新、快速评估哺乳细胞系GPCR靶蛋白表达水平的方法1. 用哺乳表达系统快速评估GPCR靶蛋白的內源表达水平2. 增加发现最优细胞反应器的可能性3. 减少细胞系/抗体开发的时间—避免有限稀释法

药物靶点识别在药物发现价值链中起到关键作用。药物开发的关键步骤是识别潜在候选药物的直接靶点并区分任何继发或脱靶效应。药物靶点识别的方法之一是表型筛选，涉及向细胞（或较小的模型生物）中添加化合物并测量对目标表型或细胞活性的影响1。对于对表型或细胞功能具有所期望的影响的化合物，必须识别活性化合物直接扰乱的基因或基因产物（即，靶点）。因此，药物开发的关键步骤是识别活性化合物的直接靶点以及该化合物可能影响进一步开发的任何继发或脱靶效应。

肿瘤干细胞分选后进行新抗癌药物的研究是当今研究最前沿的领域。筛选获得的肿瘤干细胞数量极其少，对其进行信号通路蛋白翻译后修饰分析是全球该领域内的难点。本篇Nature protocol提供了肿瘤干细胞信号通路蛋白翻译后修饰完整解决方案。

二氧化碳培养箱，又称细胞培养箱，喆图ZCQ、ZCW系列二氧化碳培养箱是通过在培养箱箱体内模拟形成类似细胞/组织在生物体内的生长环境，要求稳定的温度37℃、稳定的CO2水平5%、较高的相对饱和湿度（95%）来对细胞/组织进行体外培养的一种仪器。二氧化碳培养箱是开展免疫学、肿瘤学、遗传学及生物工程所必需的关键设备，广泛应用于细胞、组织培养和某些特殊微生物的培养，常见于细胞动力学研究、哺乳动物细胞分泌物的收集、各种物理、化学因素的致癌或毒理效应、抗原的研究和生产、培养杂交瘤细胞生产抗体、体外授精（IVF）、干细胞、组织工程、药物筛选等研究领域。

二氧化碳培养箱，又称细胞培养箱，通过在培养箱箱体内模拟形成类似细胞/组织在生物体内的生长环境，要求稳定的温度37°C、稳定的COz水平5%、较高的相对饱和湿度（95%）来对细胞/组织进行体外培养的一种仪器。二氧化碳培养箱是开展免疫学、肿瘤学、遗传学及生物工程所必需的关键设备，广泛应用于细胞、组织培养和某些特微生物的培养，常见于细胞动力学研究、哺乳动物细胞分泌物的收集、各种物理、化学因素的致癌或毒理效应、抗原的研究和生产、培养杂交瘤细胞生产抗体、体外授精（IVF）、干细胞、组织工程、药物筛选等研究领域。

作为菌种筛选的有力工具，CGQ系统可以对同一培养条件下，或不同培养条件下的生物量进行实时监控，根据生物量的监测数据对菌种筛选提供数据支持。

介绍：CyBi-SELMA（CyBio品牌，德国耶拿公司）半自动移液工作站以其体积小、操作界面友好、兼容96或384孔板的特点，在低通量液体处理操作中非常适用。由于便于放入组织培养生物安全柜中，此设备非常适合在基于细胞的研究实验中应用，例如培养基更换、化合物浓度梯度筛选。iPSC制备的心肌细胞（iCell Cardiomyocytes）被《科学家》网站评选为2010年度生命科学领域的十大创新产品。位于美国威斯康星州麦迪逊市的Cellular Dynamics International (CDI)公司的研究人员将人类纤维细胞诱导生成多功能干细胞(iPSC)后，进一步对iPSC细胞进行重编程获得了人类心肌细胞产品iCell Cardiomyocytes，该细胞显示了活的心脏典型的电生理特征。这是目前第一个商业化的人类干细胞分化细胞系。iCell Cardiomyocytes为研究人员提供了最方便的细胞类型进行相关的特异性研究。此产品的主要目的是用于药物发现。药物毒性是药物研发中的一个严重问题，是药物退出市场的第二大原因。如何使药物更安全，甚至保全生命，是药物研发领域的很大机遇。 Chris Kendrick-Parker还介绍说，CDI公司每天都会制造、销售出数十亿的心肌细胞产品，在全球顶尖的20家制药公司中已经有一半的公司都成为了CDI公司的客户。这类人心肌细胞具有广泛用途，包括用于药物活性成分的心脏毒性研究。这种检测中的移液操作包括梯度稀释、化合物添加、细胞液添加，都是乏味、耗时，并且受到不同操作者在技术水平、准确度、重现性差异的影响。本实验采用Promega公司的CellTiter-Glo® Luminescent Cell ViabilityAssay(CellTiter-Glo® 发光法细胞活力检测试剂盒)。是通过对ATP 进行定量测定来检测培养物中活细胞数目的一种均质检测方法。ATP是活细胞新陈代谢的一个指标。CellTiter-Glo® 检测试剂盒为多孔板而设计，是进行自动化高通量筛选(HTS)、细胞增殖和毒性分析的理想选择。均质检测步骤就是将单一试剂(CellTiter-Glo® 试剂) 直接加入含有血清的培养细胞中，无需洗涤细胞、去除培养基或进行多步加样操作。在384 孔板上，加入试剂并混合后，10分钟内，该系统可检测到的每个孔内的细胞数最低为15 个。CyBi-SELMA用于一系列化合物的心脏毒性研究实验。对于SELMA自动化设备相比人工移液的操作友好性、快速、数据一致性进行评估。

虽然对于如何利用高内涵进行药物筛选已经有了很多标准的程序，但是对于如何通过图像分析评估不同毒性却仍然非常复杂且大多依靠经验。本文中阐述了如何利用ImageXpress. Micro XL系统对多参数肝毒性进行分析。每一个孔或者细胞都会产生多种化合物诱导的细胞反应，而这些反应可以用MetaXpress. 5软件的自定义模块进行分析。

二、实验原理：重组子的建立：采用双酶切 质粒 载体pBR322和pUC18,酶切后产生了互补的粘性末端,在T4 DNA 连接酶的作用下,两个质粒片段连接.感受态细胞(Competent cells)：受体细胞经过一些特殊方法(如：CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后, 细胞膜 的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) .转化(transformation)：是将异源DNA分子引入一 细胞株 系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术.电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞.克隆的筛选：主要用不同 抗生素 基因筛选.常用的 抗生素 有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；重组质粒克隆的鉴定：鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有α -互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法.最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析,对于带有LacZ基因的载体还可以结合α -互补现象来筛选.

二氧化碳培养箱，又称细胞培养箱，喆图ZCQ、ZCW系列二氧化碳培养箱是通过在培养箱箱体内模拟形成类似细胞/组织在生物体内的生长环境，要求稳定的温度37℃、稳定的CO2水平5%、较高的相对饱和湿度（95%）来对细胞/组织进行体外培养的一种仪器。二氧化碳培养箱是开展免疫学、肿瘤学、遗传学及生物工程所必需的关键设备，广泛应用于细胞、组织培养和某些特殊微生物的培养，常见于细胞动力学研究、哺乳动物细胞分泌物的收集、各种物理、化学因素的致癌或毒理效应、抗原的研究和生产、培养杂交瘤细胞生产抗体、体外授精（IVF）、干细胞、组织工程、药物筛选等研究领域。

众所周知，单克隆抗体在科研、疾病诊断以及治疗等方面具有非常重要的作用。单克隆抗体药物具有靶向性明确、低毒性和不良反应少等优点，在肿瘤的生物治疗及靶向治疗中发挥重要作用。目前，抗体药物市场前景广阔，已成为制药行业中发展最快、活力最强和技术含量最高的领域。为了获得具有特异性的抗体，首先需要筛选能够表达分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系。实验室常规的方法就是通过小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞的融合，获得杂交瘤细胞。通过在培养基里加入筛选压力，只有脾细胞和瘤细胞成功融合的杂交瘤能够存活。筛选杂交瘤的主要挑战在于如何快速、高效地从成千上万的杂交瘤细胞里面找到生长良好、能够分泌特异性抗体的克隆，并且尽可能确保为单克隆。Molecular Devices为杂交瘤的筛选提供了全方位的高通量解决方案，能够最大化提高筛选特异性杂交瘤的效率，并且节省筛选时间。ClonePix2是一个哺乳动物细胞筛选系统，通过在培养基中加入荧光标记检测试剂，能够通过荧光筛选并自动化挑取表达分泌特异性抗体的杂交瘤克隆。CloneSelect Imager是一个无标记活细胞成像系统，能够客观、快速检测细胞在孔板里的生长情况，并提供克隆单细胞来源证明，确保筛选稳定的单克隆用于下游进一步研究。此外，为了优化细胞的生长，MolecularDevices提供了CloneMedia和CloneMatrix两种型号半固体培养基用于支持杂交瘤细胞生长形成独立单个的克隆。

干细胞移植对于白血病等多种疾病的治疗具有重要意义，而准确的干细胞绝对计数对于干细胞移植的成败又十分重要。流式细胞仪结合荧光单抗计数为干细胞绝对计数提供了一种快速、定量、重复性好的方法。细胞表型是细胞基本生物学性质之一。在细胞生物学的研究中，细胞表型反应出细胞群均质程度、细胞生物学功能、细胞分化程度、细胞衰老程度，是细胞产品的最为重要的质量标准。流式细胞术是检测细胞表型的通用技术。

利用 Agilent Seahorse XF 技术直接测量活细胞线粒体功能的特点，可对中药配方颗粒的药物安全性进行评估，例如筛选具有潜在线粒体毒性的药物并进行毒理机制研究，对有毒性嫌疑的药物进行确认和验证，多味药配伍后进行线粒体毒性检测，比较单煎和合煎的线粒体毒性差异等。