脱靶效应

p style=" text-align: center " 　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/22506cf5-5909-4022-83a3-3fd7e13aec9a.jpg" title=" 00.jpg" alt=" 00.jpg" style=" text-align: center " / /p p style=" text-align: center " 研究人员在观察胚胎培养情况。中科院神经科学研究所供图 br/ /p p 　　“渐冻人”(运动神经元症)、“玻璃娃娃”(成骨不全症 )、“月亮孩子”(白化病)、地中海贫血……各种各样的罕见病一直因发病率低而缺乏有效的治疗方案，给患者和家庭带来无限的痛苦。 /p p 　　据统计，全球有7000多种罕见病，其中80%的罕见病是单基因遗传病。近年来，随着基因编辑技术的逐渐成熟，基因治疗被人们寄予厚望。 /p p 　　然而，基因治疗的风险不可低估，其中“脱靶效应”是基因编辑技术最大的风险来源。 /p p 　　近日，中科院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉研究组与中科院马普计算生物学研究所、中国农科院深圳农业基因组研究所及美国斯坦福大学团队合作，开发出一种名为GOTI的全新的检测基因编辑工具脱靶技术。该技术可精准客观地评估基因编辑工具的脱靶率。该研究于3月1日在线发表于《科学》。 /p p 　 strong 　难题： /strong /p p strong 　　如何有效检测基因编辑工具的安全性 /strong /p p 　　CRISPR/Cas9是广受关注的新一代基因编辑工具。学术界普遍认为，基于CRISPR/Cas9及其衍生工具的临床技术将为人类的健康作出巨大贡献。然而，基因编辑工具“脱靶”风险也一直备受关注。若将其应用于临床，“脱靶效应”可能会引起包括癌症在内的很多种副作用。 /p p 　　中科院神经科学研究所研究员杨辉在接受《中国科学报》采访时表示，临床技术对于潜在风险和副作用的容忍度极低，因此一种能突破之前限制的脱靶检测技术，将成为CRISPR/Cas9及其衍生工具能否最终走上临床的关键。 /p p 　　“其实，过去人们推出过多种检测脱靶的方案，但这些方法都存在局限性。传统上，对脱靶的检测依赖于算法预测，靠不靠谱无人得知 或依赖于体外扩增，但这个会引入大量的噪音，会导致检测的精确度大打折扣。”杨辉说。 /p p 　　由于不能高灵敏度地检测到脱靶突变，尤其是单核苷酸突变，因此关于CRISPR/Cas9及其衍生工具的真实脱靶率一直存在争议。 /p p 　　然而，任何科学技术归根结底都需要服务于全人类，尤其像基因编辑这样的神奇技术。想要有效地操纵这把“上帝的手术刀”，还得给它做个全方面的体检。 /p p 　　 strong 突破： /strong /p p strong 　　GOTI技术精准捕捉“脱靶”逃兵 /strong /p p 　　要提升检测脱靶效应的精度，就必须彻底颠覆原有的脱靶检测手段。 /p p 　　为实现这一目标，实验人员建立了一种名叫GOTI的脱靶检测技术。“我们在小鼠受精卵分裂到二细胞期时，编辑一个卵裂球，并使用红色荧光蛋白标记。小鼠胚胎发育到14.5天时，将整个小鼠胚胎消化成为单细胞，利用流式细胞分选技术并基于红色荧光蛋白，分选出基因编辑细胞和没有基因编辑的细胞，然后通过全基因组测序比较两组差异。这样就避免了单细胞体外扩增带来的噪音问题。”中国农科院深圳农业基因组研究所研究员左二伟告诉《中国科学报》。 /p p 　　同时，由于实验组和对照组来自同一枚受精卵，理论上基因背景完全一致，因此直接比对两组细胞的基因组，其中的差异基本就可以认为是基因编辑工具造成的。这样便能发现此前脱靶检测手段无法发现的完全随机的脱靶位点。 /p p 　　随后，该团队将成功建立的GOTI投入基因编辑技术脱靶检测。 /p p 　　实验人员先是检测了最经典的CRISPR/Cas9系统。结果发现，设计良好的CRISPR/Cas9并没有明显的脱靶效应。但是，同样被寄予厚望的CRISPR/Cas9衍生技术BE3则存在非常严重的脱靶，而且这些脱靶大多出现在传统脱靶预测认为不太可能出现脱靶的位点。 /p p 　　杨辉建议，人们应冷静地分析一些新兴技术的安全性。这些脱靶位点有部分出现在抑癌基因上，因此经典版本的BE3有着很大的隐患，目前不适合作为临床技术。 /p p 　　 strong 未来： /strong /p p strong 　　完善基因编辑治疗手段、建立行业标准 /strong /p p 　　杨辉告诉记者，团队接下来将进一步检测BE3除导致异常基因突变外还可能存在的其他问题，并在此基础上，设法改进这个系统，从而建立一种不会脱靶，也没有其他风险的单碱基突变技术。 /p p 　　中科院马普计算生物学研究所研究员李亦学表示，最新工作建立了一种在精度、广度和准确性上远超之前的基因编辑脱靶检测技术，显著提高了基因编辑技术的脱靶检测敏感性，有望借此开发出精度更高、安全性更好的新一代基因编辑工具。 /p p 　　“我们希望未来可基于这项新技术，制定一些行业标准。凡是进入临床的基因编辑技术，必须经过这套系统的检验才能证明其安全性，以便让这个领域有序、健康地发展下去。”他说。 /p p 　　中科院院士、中科院神经科学研究所所长蒲慕明认为，该技术针对基因编辑的安全性问题，“有了它，便可以更加客观、可靠地评估基因编辑工具的脱靶率”。 /p p 　　针对该技术在单碱基编辑工具BE3中发现的重大“安全隐患”，蒲慕明表示：“这能让我们重新审视基因编辑技术的安全性，但不是说这项技术不能再开展基因治疗了。正是因为已经建立新的检测技术，我们才知道如何去修正、改善BE3，从而开发安全性更高的新一代基因编辑工具，造福患者。” /p

p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 基因编辑的“子弹”如果没有命中目标，就会产生脱靶效应，可能会导致诸如癌症等不良的基因变异。这种风险让人们对这种新的技术手段望而却步。近日，中国科学院神经科学研究所与国内外研究机构的研究者们合作开发了一种被命名为GOTI的技术，能够准确、灵敏地检测到基因编辑方法是否会产生脱靶效应，使基因编辑技术向安全地带迈进了一步。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 此前，人们推出过多种检测脱靶的方案。但小鼠或者人类个体间基因存在很大差异，基因编辑所产生的脱靶效应会被淹没在这些差异之中。以往的检测方法很难从这些差异中分辨出哪些是基因编辑所造成的脱靶，哪些是个体本身的差异，因此无法有效判别基因编辑工具的安全性。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " GOTI颠覆了原有的脱靶检测手段。实验的精妙之处是利用小鼠胚胎做实验。在受精卵分裂成两个时，基因编辑其中的一个，并用红色荧光蛋白进行标记。编辑之后，让两个细胞继续分裂，等小鼠胚胎发育到14.5天时，基于红色荧光蛋白筛选出基因编辑细胞和没有基因编辑的对照细胞。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 由于这两组细胞基因背景完全一致，且无需基因组体外扩增，避免了遗传背景的干扰，同时还可以清楚地展现单个碱基的突变，GOTI因此展现出强大的灵敏性，对数量极少的基因编辑脱靶也可感知。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 此外，研究人员使用GOTI技术发现BE3单碱基编辑会产生大量脱靶突变。这一发现使人们重新审视原本认为“特别安全、几乎不会有脱靶”的单碱基突变技术，并为基因编辑工具的安全性评估带来了突破性的新技术，有望成为新的行业检测标准。相关研究结果于3月1日发表在《科学》上。 /p p br style=" text-indent: 2em text-align: left " / /p

CRISPR-Cas9技术彻底改变了基础生物研究和应用生物技术的许多领域。但在临床基因治疗实施中脱靶效应的检测仍然存在难题。德国汉堡大学-艾本多夫医学中心（UKE）干细胞移植、细胞和基因治疗研究所的学者们近日在知名杂志《Molecular Therapy》上发表“LATE–a novel sensitive cell-based assay for the study of CRISPR/Cas9-related long-term adverse treatment effects”的文章，建立了称为LATE（长期不良治疗效果鉴定检测）的新型检测方法，该方法使用Stilla naica® 微滴芯片数字PCR系统检测低频的脱靶事件，且有助于分析Cas9脱靶切割效应的影响，并可在单细胞层面进行评估。为了证明LATE方法有助于检测Cas9脱靶切割后的功能影响，研究人员进行了小规模的原理验证实验：明星基因TP53基因敲除后会导致细胞表现出相对生长优势，这是主要的致瘤性标志之一，因此可以作为验证“LATE”检测脱靶能力的指示。本文选取TP53进行CRISPR靶向实验，并转染到有限稀释后的原代人类新生儿包皮成纤维NUFF细胞中，通过“LATE”方法重复检测到低频(图 1. LATE检测原理LATE检测的原理包括 (1)用编码荧光蛋白、设计的核酸酶(Cas9)和gRNA的慢病毒载体转导原代人类新生儿包皮成纤维细胞 (NUFF)，(2) 使用流式细胞术分析转导率并连续监控长达10周，(3)读取结果，随着转导细胞数量的增加，作为基因组编辑效应的细胞获得生长优势在这一过程中，“LATE”读取到的阳性结果（获得生长优势的细胞）会不会由TP53以外的基因被“脱靶敲除”引起，或者是序列存在其他的突变，例如插入诱变从而导致细胞获得生长优势呢?为了研究“LATE”检测的阳性结果与TP53插入缺失之间的联系，研究人员设计了GEF-dPCR（gene-editing frequency digital PCR）实验，即Drop-Off分析方法，该方法可以量化gRNA结合位点以及脱靶位点的插入缺失频率。图2. NUFF细胞获得的生长优势与TP53中的插入/缺失频率相关 (A)TP53外显子4片段和GEF-dPCR中使用的FAM、HEX标记探针的示意图。(B) TP53插入/缺失频率，数据由GFR-dPCR测量获得。(C) 脱靶TP53插入/缺失频率，由GEF-dPCR测量获得。对于TP53 gRNA结合位点的检测，GEF-dPCR使用两个双标记水解探针，一个HEX标记探针与远离gRNA识别序列的区域结合，易发生插入缺失的位点设计FAM标记的探针（图2A）。文中使用Stilla naica® 微滴芯片数字PCR系统进行GFR-dPCR方法检测，实验方法详见原文第12页。随后进行Stilla naica® 微滴芯片数字PCR系统检测，结果显示随着时间的推移，TP53插入缺失的频率随之增加，转导后第7天插入缺失率为1%–22%，在52天后达到44%–85%的峰值，该变化趋势和细胞获得生长优势的趋势一致。（图2B）研究人员还对TP53脱靶位点的插入缺失频率进行了检测（图2C）。上述dPCR检测结果也与NGS测序方法和RGB荧光标记方法一致，从而说明“LATE”能够检测TP53介导的gRNA的不良脱靶效应，但这些gRNA并没有被常用的在线预测工具标记为“危险信号”。随后，作者还验证了“LATE”可用于任何类型的设计核酸酶以及不同的CRISPR/Cas变体，并且可以扩展用于其他细胞类型，尤其是高度相关的原代hMSC。因此，“LATE”实验方案可用于验证特定细胞类型中特定设计核酸酶的脱靶效应的影响。图3：LATE检测可应用于hMSCs和h-TERT永生化细胞综上，“LATE”可以作为一种简单、快速和经济的技术手段，用来评估CRISPR/Cas系统带来的生理“副作用”影响，辅助临床前的安全性研究，是对基于NGS的全基因组脱靶检测方法的有效补充，特别是补充了流式和数字PCR的检测结果。原文:https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.07.004期刊介绍：《Molecular Therapy》是美国基因治疗学会(ASGT)的月刊，是基因转导、载体开发与设计、干细胞制造、基因、肽、蛋白、寡核苷酸的开发、细胞疗法、疫苗开发、临床前目标验证、安全性/有效性研究和临床试验等领域的领先期刊。《Molecular Therapy》致力于促进遗传学、医学和生物技术的科学发展，影响因子为6.698。

使用序列特异性的CAS内切酶进行精确性敲除，敲入，替换等已成为一种常用的分子生物学手段。但是，为了识别所需的基因修饰，排除脱靶克隆，仍然需要筛选几百个单克隆细胞系。而大量克隆的维护和筛选是一个费力、耗时、容易出错的过程。欧洲分子生物学实验室（EMBL）研究人员Moritz Kueblbeck, Andrea Callegari等分享了一种快速验证基因编辑效果的实验方案。该方案使用naica® 微滴芯片数字PCR系统（Crystal Digital PCR™ ）实现了一次三色分析就可完成目标拷贝数的评估和脱靶事件的检测。且基于数字PCR (dPCR)的高敏感性，无需大量的样品，因此，在早期就可以完成筛选试验。Crystal Digital PCR™ 一次实验3个小时内就可完成，对于编辑错误的克隆当天就可终止培养。那么这个实验具体是怎么设计的？就让我们一起来看看吧。应用亮点：▶ naica® 微滴芯片数字PCR系统一次三色分析同时完成目标拷贝数的评估和脱靶事件的检测，是非常强大的绝对定量工具。▶ naica® 微滴芯片数字PCR系统对长插入片段(如mEGFP)拷贝数提供稳健的检测方法。▶ naica® 微滴芯片数字PCR系统只需少量生物样本，可以在早期完成检测，快速完成CRISPR筛选，节省时间。Single-step 3-color Crystal Digital PCR™ 实验设计：该实验共设计了三个探针：1.“total tag”（HEX基团标记）检测mEGFP转基因；2.“on-target tag”（FAM基团标记）检测内源NUP93编辑位点的最后一个外显子与整合的mEGFP转基因(标签)的5' 序列之间的连接；3.reference(CY5基团标记)作为内参，对“total tag”和“on-target tag”进行归一化。“total tag”归一化获得整合的mEGFP拷贝数和“on-target tag”获得靶标上整合的mEGFP拷贝数。实验使用U-2 OS细胞作为基因编辑对象，其具有3个NUP93等位基因。结果分析：如图B所示，对多个U-2 OS细胞系的基因编辑效果进行分析，naica® 微滴芯片式数字PCR系统结果显示克隆35，52和247的U-2 OS细胞mEGFP总拷贝数和靶标拷贝数都为3，这表明这三个细胞系的所有3个NUP93等位基因都成功编辑，没有脱靶，这个结果与检测金标准的Southern blot的结果一致（图C），而克隆5虽然mEGFP总拷贝数和靶标拷贝数一致，但与NUP93位点的预期数量不匹配。这表明其可能发生基因组的重排，而Southern blot结果也验证了这一现象，其出现了一个小于正常NUP93的拷贝条带。对于克隆25和246，虽然其靶标拷贝数符合预期，但是其总拷贝数大于3，这表明其可能存在脱靶整合或者不完全HDR（homology-directed repair）现象，而Southern blot结果显示其存在一个过大的整合条带，表示其可能存在基因重排。上述这些结果表明基于naica® 微滴芯片式数字PCR系统（3-color Crystal Digital PCR™ ）的基因编辑脱靶检测的三色数字PCR检测方法，是一种快速简便的一步检测方法，其结果与耗时更长的Southern blot技术完全一致，可以用来快速评估基因编辑效果，筛选适合的基因编辑细胞株系。

脂质体及聚合物作为纳米药物的常用载体，在药物合成方面已取得了巨大的成功，但在靶向递送方面，仍存在着诸多挑战，纳米药物该如何实现靶向递送呢？在谈论靶向之前，先要了解一个关键的药理学概念，以器官靶向为例：器官靶向药物输送不是将所有给药剂量都输送到目标器官，而是提供足够的剂量以达到所需的生物效果，同时限制脱靶积累的毒性；即使大部分注射剂量没有到达目标器官，也应该足以引起生理效应并为患者提供益处。靶向方式分类纳米药物靶向的方式多种多样，总的来讲，可以分为三大类（如图1）。图1. 靶向方式归类图被动靶向被动靶向依赖于调整纳米颗粒的物理性质，如大小、形状、硬度和表面电荷，使其与解剖学及生理学相结合。例如，调节纳米颗粒的大小可以确定纳米颗粒从不连续的血管（如肝脏和脾脏中的血管）外渗的趋势。主动靶向主动靶向包括用化学或生物的方法修饰纳米颗粒的表面，使其特异性地与靶器官高度表达的受体或其他细胞因子相结合。例如，用单克隆抗体修饰纳米颗粒，以使核酸传递到难以转染的免疫细胞中。内源性靶向内源性靶向包括设计纳米颗粒的组成，使其在注射时与血浆蛋白的一个不同的亚群结合，从而将其引导到目标器官并促进特定细胞的摄取。例如，参与体内胆固醇运输的蛋白质已被证明是脂质纳米颗粒有效的肝细胞传递所必需的。对比而言，被动靶向和内源性靶向的设计度与可控性相对较低，主动靶向自然成为了靶向递送的研究焦点。在肝外靶向的研究中，就涉及了较多的主动性靶向，表1也列出了多种肝外给药的纳米颗粒组合物。表1. 用于肝外给药的纳米颗粒组合物靶向修饰方法药物靶向本质上为官能团之间的相互作用，即纳米药物表面的核心基团与受体部位的基团进行化学结合。以脂质纳米颗粒为例，载体组分中的PEG脂质多位于颗粒表面且本身易于修饰，因此，可以在PEG脂质上加载受体部位的结合基团以实现靶向目的。以下列举了几种常见的PEG脂质修饰方法。马来酰亚胺修饰使用DSPE-PEG2000-马来酰亚胺作为功能化PEG脂质，替换LNP中一定摩尔量的聚乙二醇脂质，通过其取代的羧基端半胱氨酸直接与肽偶联，可以形成肽靶向的纳米粒子。再如SS-31，一种线粒体靶向的四肽，具有巯基，只需与马来酰亚胺标记的脂质纳米颗粒孵育，即可进行硫酰马来酰亚胺偶联。NHS修饰NHS酯通常用于标记胺基生物分子。NHS酯与胺基的反应具有pH依赖性，结合的较佳pH值与生理环境的pH值相同。使用DMG-PEG-COOH-NHS作为功能化PEG脂质，替换LNP中一定摩尔量的聚乙二醇脂质，通过在C端添加赖氨酸修饰MH42，并通过其侧链的伯胺偶联，可以形成肽靶向的纳米粒子。同样，许多具有胺基的抗体和靶向肽也可通过该反应偶联到脂质纳米颗粒上：乳铁蛋白可特异性结合活化的结肠巨噬细胞上的LRP-1，实现细胞靶向抗炎治疗；还有较为熟知的程序性死亡配体1单克隆抗体的应用。氨基修饰氨基有利于醛酮分子的化学选择性附着。甘露聚糖还原端醛基与氨基羧基修饰的脂质之间肟偶联反应的正交特性保证了脂质纳米颗粒表面多糖分子的取向。甘露聚糖受体靶向脂质体既可以作为抗菌药物递送的载体，也可以作为用于免疫治疗的重组疫苗的载体。DBCO修饰DBCO标记可促进巯基-炔反应，并可选择性偶联荧光探针、亲和标记和细胞毒性药物分子。例如，抗体scFv-N3可被有效地偶联到DBCO修饰的脂质纳米颗粒上。研究发现，抗体修饰的脂质纳米颗粒可穿越血脑屏障，并诱导脑特异性积累，以治疗中枢神经系统疾病。结论：人体复杂的生化环境给纳米药物的靶向递送制造了诸多阻力。在实际探索中，被动靶向，主动靶向和内源性靶向，可作为靶向设计的联合工具，在寻找绝对的靶向位点、真实的靶向机理与达到实际的靶向效果之间寻求平衡。在此当中，主动性靶向的尝试值得支持，正如文中所讲PEG脂质的各种修饰方式，大量的设计性尝试定能排除越来越多的靶向干扰因素，朝靶向机理的挖掘处更深一步。参考文献：1. Menon, Ipshita et al. “Fabrication of active targeting lipid nanoparticles: Challenges and perspectives.” Materials Today Advances (2022): n. pag.2. Dilliard, S.A., Siegwart, D.J. Passive, active and endogenous organ-targeted lipid and polymer nanoparticles for delivery of genetic drugs. Nat Rev Mater (2023).3. Herrera-Barrera, Marco et al. “Peptide-guided lipid nanoparticles deliver mRNA to the neural retina of rodents and nonhuman primates.” Science Advances 9 (2023): n. pag.应用范围:纳米药物制备系统:

中国科学技术大学教授曾长淦、副研究员李林研究团队与北京大学教授冯济课题组合作，通过构筑氮化硼绝缘层间隔的多种石墨烯基电双层结构，首次揭示了在层间拖拽这一复杂的多粒子输运过程中存在显著的量子干涉效应。相关研究成果日前在线发表于《自然-通讯》。量子干涉效应是量子力学中波粒二象性的直接体现。在固体材料中，弱局域化、普适电导涨落和Aharonov-Bohm效应等独特量子输运现象，都源于载流子扩散路径之间的量子干涉。然而这些量子干涉行为均发生在单一导体内的载流子输运过程，可以在非相互作用的单粒子框架下很好地解释。与之相比，诸如层间拖拽效应这种路径更为复杂的多粒子耦合输运中是否会展现出类似的量子力学行为，是一个重要的基础科学问题。所谓拖拽效应，是指对于两个空间相近但彼此绝缘的导电层构成的电双层结构，在其中一层（主动层）施加驱动电流，层间载流子之间的动量/能量转移会诱导另一层（被动层）载流子移动，从而在被动层产生一个开路电压或闭路电流。此前，拖拽效应被广泛用于研究载流子长程耦合特性，发现如间接激子波色爱因斯坦凝聚等层间关联量子态。然而，对这一独特输运过程本身的外场响应特性及可能的量子效应研究还十分缺乏。石墨烯基二维电双层结构为在二维极限下深入相关研究提供了很好的平台，作为天然且理想的二维电子气，石墨烯本身载流子类型和浓度均高度可调，且利用氮化硼作为绝缘层，两层石墨烯之间的间距可以低至数纳米，从而使得在更广阔参数空间内表征层间拖拽特性成为可能。此次研究中，研究团队构筑了双层石墨烯/氮化硼/双层石墨烯（以下称双层/双层）、单层/单层以及单层/双层等多个石墨烯基电双层结构。通过系统的外磁场下拖拽响应特性测试，研究团队发现在很大的温度/载流子浓度范围内，低磁场区间内拖拽磁电阻均会明显偏离经典库伦拖拽行为，并且这种偏离的符号直接取决于石墨烯层的能带拓扑性。如对于双层/双层和单层/单层体系，拖拽电阻在电子-电子区间的修正均表现为低场的电阻峰，而对于双层/单层体系，则为电阻谷。通过对拖拽输运过程的系统性分析，研究团队发现观察到的低场修正可以很好地归因于由时间反演和镜面对称联系起来的两个层间拖拽过程之间的量子干涉，而其干涉路径则由空间分隔的两个石墨烯层层内载流子扩散路径共同组成。这种层间量子干涉的产生依赖于两层石墨烯中空间重叠的扩散路径的形成，其中中间绝缘层的杂质势散射起到至关重要的作用。研究人员认为，这一新型量子干涉效应的发现，将固体材料中的量子干涉行为，从单一导体内单一粒子输运行为，拓展到多个导体间多粒子耦合输运过程，进一步丰富了量子干涉的物理内涵。此外，相比于传统层内量子干涉导致的磁阻修正，层间量子干涉导致的拖拽磁电阻的修正显著增大，从而有望为发展新原理存储器件提供新的思路。

药品与我们的生活密不可分。新药研发一方面关系着全人类的健康需求，另一方面也关系着国家经济与社会的发展需求。 据权威统计，单一药物上市的成本超过十亿美元，整个过程花费约十年的时间，药物筛选的失败率高达97%。但药物筛选是新药研发中至关重要的一步，确定靶标分子及筛选模型是现代新药开发的基础。它主要有两种方式，表型筛选（Phenotypic drug discovery, PDD）和靶点筛选（Target-based drug discovery，TDD）。PDD的起点是一个化合物库或抗体库，用一个和疾病高度相关的临床前模型或者实验来筛选库中的药效，找到达到期望药效的分子再进一步优化和开发。经典的药物表型筛选更多的是基于动物疾病模型的筛选，实验选择遗传背景明确或者来源清楚的动物，例如鸡、猪、狗、猫、鼠、蛙、蛇、猴子、鱼、果蝇、线虫等。TDD则是基于对疾病和靶点机理的理解，针对某一个和疾病机理高度相关的特定的靶点，从而有针对性的设计大分子或小分子药物的研发方式。由于表型筛选无法提供活性化合物作用靶标信息, 因此需要利用化学蛋白组学回溯鉴定那些因与小分子药物直接发生作用而引起功能改变的蛋白质，在分子水平上系统揭示特定蛋白质的功能以及蛋白质与化学小分子的相互作用, 从而准确找到药物的作用靶点。旨在建立药物活性与细胞表型之间的联系，阐明药物的作用机理，一方面探究药物的脱靶效应和耐药性机制, 提高药物发现的效率；另一方面在药物研发的早期阶段预测潜在的副作用和毒性, 从而降低药物研发失败的风险。　化学蛋白质组学研究方法的一般流程是, 先将化学探针或小分子化合物与蛋白质提取液进行共孵育,然后利用亲和层析等方法将这些蛋白质分离,再通过高灵敏度的质谱鉴定, 最后对它们做进一步的生物信息学分析。1. 基于活性的蛋白质谱分析 (activity-based protein profiling, ABPP)ABPP利用基于靶酶活性的特异化学小分子探针 (activity-based probes, ABPs) 来探测功能蛋白质组, 利用活性小分子探针来识别蛋白质靶点。分子探针是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用并能被特殊方法所检测的分子。ABP 的设计通常包括两个基本组成部分:“反应基团”和“报告基团” , 一般通过碳链或者聚乙二醇链将二者连接在一起. 反应基团通常是具有独特化学结构的亲电性化学小分子, 能够选择性地与蛋白质组中某一类蛋白酶的活性中心结合, 并与其中执行重要催化功能的亲核性氨基酸发生反应, 从而将探针分子共价地标记在靶标蛋白上。活性分子探针结构示意图2. 药物亲和致靶点稳定性（drug affinity responsive target stability，DARTS）DARTS通过对比药物处理组与DMSO对照组蛋白质酶解片段的差异，找出酶解情况不同的蛋白质，再进行结合特异性分析，找出特异结合的靶标。DARTS实验步骤这种方法的优点是, 仅依靠药物和蛋白直接结合而并不需要对小分子化合物进行修饰, 从而确定出小分子的任意靶点。因此, 可采用小分子稳定其靶蛋白的结构从而导致蛋白酶抵抗, 结合质谱分析法发现未知靶点。DARTS 可将具有生物活性的天然产物提取物在分离之前就用于靶点发现,多用来研究多靶点药理学以及复方中成药物。3.细胞热转变分析（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）CETSA是一种检测细胞内药物与靶蛋白结合效率的实验，其原理是靶蛋白与药物分子结合时通常会变得稳定。即随着温度的升高，蛋白会发生降解；当蛋白结合药物后，相同温度下，未降解蛋白的量会提高，该复合蛋白的热熔曲线会右移。用溶解蛋白质的量作温度的函数可以得到蛋白质的变性曲线，由此可以确定蛋白质的变性温度点或蛋白质的熔点。CETSA实验的样品来源，可以是细胞，也可以是组织样本，检测方法主要有Western blot和MS。该技术能在天然的细胞环境中进行，也无需对目标分子和蛋白进行任何修饰以及标记。CETSA实验步骤目前已证实该技术能识别许多已知的抗癌试剂的靶点，如在细胞裂解液、完整细胞或组织样本中均鉴定出多个药物的作用靶标。然而，CETSA方法不适用于高度不均匀的蛋白质或蛋白质配体结合域的结构展开，并不会诱导蛋白的聚集和变性的情况，如DNA和伴侣蛋白质的结合。有研究将cellular thermal shift assay与质谱联用（MS-CETSA），可以同时监测整个蛋白质组在药物作用下蛋白质稳定性的变化，因此可以鉴定出与药物相互作用的蛋白质，而不需要预先知道药物的作用通路或机制。MS-CETSA流程图4. 有限蛋白水解质谱（Limited Proteolysis-Mass Spectrometry，LiP-MS）LiP-MS不需要对配体进行化学修饰，就可以实现在复杂的生物环境中鉴定药物靶标。实验步骤是用低浓度的非选择性蛋白酶K进行有限的蛋白水解，优先切割蛋白质暴露在外的柔性部分(环或者未折叠部分)， 经过变性和胰蛋白酶消化后，通过LC-MS分析肽混合物。基于LiP-MS的小分子图谱靶点的发现在整个药物研发过程中起着至关重要的作用。随着现代分子生物学技术的发展和人类基因组计划的完成，出现了大量可供治疗干预的新型分子靶点，但并不是所有的靶点都能够成为与疾病有关的有效靶点，因此对新型靶点进行发现和验证便成为非常重要的工作。

近十年来，以 CRISPR 系统为代表的基因编辑技术迅猛发展，在包括农业、畜牧业和生物医药等各个领域的基础科研和应用中不断涌现出耀眼成果。2020年 CRISPR 技术因其强大的功能和影响力摘得诺贝尔化学奖。然而，随着研究的深入，其引起的 DNA 双链断裂和高脱靶效应等一系列副反应也逐渐走入人们的视野，CRISPR 技术的安全性开始备受关注。单碱基编辑技术以其高效和精确的基因编辑能力，成为目前最有希望治愈各种遗传疾病的明星工具。由 gRNA 与 Cas9-脱氨酶形成 RNP 复合物，gRNA 引导复合物结合在基因组目标位点，Cas9 负责解开 DNA 双链，并将靶向链切断，脱氨酶对非靶向单链 DNA（ssDNA）上的碱基进行脱氨，细胞修复过程中实现碱基转换。然而，单碱基编辑工具被发现具有明显的脱靶编辑效应，主要包括 Cas9 非依赖的 DNA 和 RNA 脱靶效应和 Cas9 依赖的 DNA 脱靶效应。通过对脱氨酶的修饰可大大降低蛋白对核酸链的非特异结合，从而最大限度地减少 Cas9 非依赖的脱靶效应。但由于 Cas9 蛋白本身存在的 Cas9 依赖性脱靶，人们依然对其临床应用的安全性表示担忧。尽管目前已有多种方法尝试解决这一问题，但都无法在保持目标效率的同时解决 Cas9 依赖性脱靶问题。2022年3月，中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员与五邑大学邹庆剑副教授团队合作，首次将腺苷脱氨酶与转录激活因子样效应子（TALE）融合，开发了一种新型腺嘌呤碱基编辑系统——TaC9-ABE。该新型碱基编辑系统可以完全消除Cas9依赖性脱靶，而不影响任何靶向编辑效率。相关成果以：Elimination of Cas9-dependent off-targeting of adenine base editor by using TALE to separately guide deaminase to the target site 为题在线发表在 Cell Discovery 期刊上。TaC9-ABE单碱基编辑技术原理近日，该团队再次证实将 TALE 技术与 Cas9 技术结合起来，同样可以实现更加安全高效的胞嘧啶碱基编辑系统——TaC9-CBE。相关成果以：Eliminating predictable DNA off-target effects of cytosine base editor by using dual guiders including sgRNA and TALE 为题于在线发表在 Molecular Therapy 期刊上。TaC9-CBE单碱基编辑技术原理在 TaC9-ABE 和 TaC9-CBE 碱基编辑系统中，研究人员将脱氨酶与 nCas9 分离，脱氨酶与 TALE 连接，nCas9 与 gRNA 结合，由 TALE 和 gRNA 分别将两个效应器引导到 DNA 靶位点，同时发挥作用，实现靶位点的 A to G 或 C to T 的突变。如果 nCas9 被 gRNA 带到错误的位点，由于没有脱氨酶的存在，碱基转换就不能发生；同理，如果脱氨酶被 TALE 引导至错误的位点，由于没有 nCas9 的存在，不能形成单链 DNA，脱氨酶发挥不了作用，碱基转换也不能发生，这样就彻底地排除了发生 Cas9 依赖性脱靶的可能性。研究结果证实，TaC9-碱基编辑系统在保证高效但碱基编辑的同时，对 gRNA 依赖的脱靶位点以及 TALE 依赖的脱靶位点进行深度测序均未检测到脱靶现象。图3.各种CBE编辑器的Cas9依赖脱靶测试这项研究为基因编辑动植物的培育和人类遗传性疾病的基因治疗提供了一个安全的单碱基编辑工具。TaC9-ABE 论文中，中国科学院广州生物医药与健康研究院博士研究生刘洋和蓝婷、五邑大学周小青博士和广东工业大学博士研究生周继曾为论文共同第一作者。中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员和五邑大学邹庆剑副教授为论文的共同通讯作者。TaC9-CBE 论文中，广东工业大学博士生周继曾、中国科学院广州生物医药与健康研究院博士生刘洋、硕士生魏愈惠和五邑大学硕士生郑淑文为论文共同第一作者。中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员、五邑大学张焜教授和邹庆剑副教授为论文的共同通讯作者。论文链接：https://www.nature.com/articles/s41421-022-00384-4https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2022.04.010

p 　　据《新科学家》杂志网站5月30日报道，美国科学家通过全基因组测序发现，CRISPR基因编辑技术能引起基因组内大量非靶标区内的基因发生突变，包括1500多种单核苷酸突变和100多种大片段序列的敲入和敲除。发表在《自然· 方法学》杂志上的这一论文表明，CRISPR的脱靶效应可能远超人们此前的估计。 /p p 　　CRISPR基因编辑技术因其快速和高精准等特点，成为研究基因与疾病关系的热门之选，并因其能敲入新基因、敲除或修复受损基因，为基因疗法带来了更大希望。但最新论文共同作者、哥伦比亚大学医学中心病理学和细胞生物学副教授斯蒂芬· 曾认为，随着临床试验的相继展开，科学界是时候慎重考虑CRISPR技术脱靶效应的潜在风险了。 /p p 　　之前对CRISPR脱靶效应的研究，主要通过计算机模型先识别最可能受到影响的非靶标区，再详细研究这些位点是否发生过基因敲入或敲除现象，但这些研究只能对培养皿的细胞或组织展开，而斯蒂芬团队首次通过全基因组测序对活体动物内CRISPR技术的全部脱靶效应进行了研究。 /p p 　　他们对两只经过CRISPR基因编辑的小鼠进行了全基因组测序，并与未编辑小鼠进行对照后发现，虽然CRISPR成功修复了导致小鼠失明的基因，但这两只小鼠基因组内不但出现了1500多种单核苷酸突变，而且其100多种非编码区内还出现了基因敲入和敲除现象，而这些变异都是之前计算机模拟未发现的脱靶效应。 /p p 　　斯蒂芬表示，如果不用全基因组测序方法，研究人员就会“忽略”这些具有潜在威胁的突变，而其实哪怕只出现一种单核苷酸变异，也有可能造成致癌性等严重副作用。他指出：“希望其他团队利用我们的方法对CRISPR的脱靶效应进行研究，不断改进CRISPR系统，进一步提高其精确性和安全性。” /p

一个世纪之前，诺贝尔奖得主、德国化学家Paul Ehrlich 曾经说过：如果我们可以设计出特异性靶向某个病原体的化合物，那么，我们就可以在不伤害宿主的基础上杀死这一病原体【1】。多年过去了，尽管Ehrlich尝试了多种方法来寻找特异性肿瘤靶点，但精准抗癌，也就是在不伤害机体的情况下靶向杀伤肿瘤细胞这一概念，似乎仍停留在概念阶段【2】。时隔多年，以免疫细胞修饰为基础的免疫治疗，包括抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugates，简称ADCs）、双特异性T细胞衔接器（bispecific T cell engagers，简称BiTEs）和嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cells，简称CAR-T）似乎是现今的新方向。有报道指出，靶向CD19的CAR-T疗法，可以将一些B细胞淋巴瘤的治愈率提高至43%～71%【3】，但是，有40%患者出现一定程度的神经损伤。这一“脱靶效应”很可能是由其他表达CD19的细胞类型引起的【4】。事实上，作者通过提取数目稀少的血脑屏障壁细胞，并进行全基因组单细胞测序确定，上述CAR-T疗法靶向B细胞淋巴肿瘤的同时，也会靶向这些壁细胞。这也说明，单细胞全基因组测序这一方法，不但可以预测免疫治疗的脱靶效应，还可以以数据为基础分析出特异的靶标。2021年12月13日，来自美国斯坦福大学Caleb A. Lareau，Ansuman T. Satpathy和来自Cartography 公司的Kevin R. Parker 在Cancer cell上发表题为Charting the tumor antigen maps drawn by single-cell genomics的评论性文章，全面展示了这一研究方法。在概念上，作者认为，寻找和确定免疫治疗的靶点应该基于数据。下图展示了通过结合大尺度但细胞图谱和特定肿瘤分析来确定抗原靶点。高通量的单细胞全基因组测序数据库可以提供肿瘤细胞抗原的潜在靶点以及这些靶点是否存在于其他细胞上。接下来，作者阐述了目前精准抗癌的现状和存在的问题。首先，目前在临床上精准抗癌的靶点主要有三类：一是在肿瘤细胞和正常体细胞上同时表达的细胞特异性标签，比如上述针对B细胞的CD19。这一类目前应用最为广泛，并且，如果其对应的体细胞不算十分重要的话，这一诊疗方案可以说是行之有效；二是与正常体细胞相比，在肿瘤细胞上过表达的分子，比如HER2。靶向这类分子可以使得杀伤作用更为精准和强大，并且，其过表达程度，还可以表征肿瘤发展水平；三是特异性表达在肿瘤细胞上的分子，比如1997年发现的NY-ESO-1【5】。当然，高通量基因组学数据库显示这一分子还表达在免疫豁免器官和组织，比如睾丸和胎盘。这也就是说，仅通过传统手段来确定表达靶标分子的细胞类型不够精确，还需要高通量单细胞基因组数据库来进行有力补充。其次，上述数据库可以用来预测和减低免疫治疗的脱靶效应所带来的细胞毒性。如上述靶向CD19治疗B细胞淋巴瘤案例所示，免疫治疗常常会出现脱靶效应。虽然研究脱靶效应对病人的副作用这方面至关重要，但是从单细胞基因组学分析来确定特定免疫疗法对正常体细胞的影响也十分必要。接下来，作者表明，单细胞全基因组测序这一方法也适用于表达量十分稀少的细胞类型，比如CD4+T细胞，CD4的RNA水平很低，但是蛋白质水平却很高，这一类分子需要高通量数据库进行修正。最后，作者提出了单细胞全基因组测序所面临的挑战：一是如何界定某一类型细胞重要与否，并且，随年龄、性别等影响，其重要性是否有所区别。二是如何确定一标准，使得某分子在肿瘤细胞与体细胞的表达量超过这一标准，才可以认定为是潜在靶标。三是影响抗原表达水平的因素都有什么。最后，理论上可行的靶标在临床上也可能出现各类未知问题。综上所述，作者给出了有别于组织学水平和单一突变水平研究肿瘤以及肿瘤治疗的方法，也就是基于高通量单细胞全基因组测序和图谱数据分析方法。并预测，这一方法可以在预测免疫治疗靶标和临床精准抗癌方面发挥重要作用。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.11.005

15日，记者从中国科学技术大学获悉，该校曾长淦教授、李林副研究员研究团队与北京量子信息科学研究院解宏毅副研究员等合作，通过构筑石墨烯与氧化物界面超导体系的复合结构，揭示了二维半金属和二维超导体之间由于量子涨落诱导的巨幅超流拖拽效应。相关成果日前在线发表于《自然物理》。对于两个空间相近但彼此绝缘的导电层构成的电双层结构，在其中一层（主动层）施加驱动电流，层间载流子之间的耦合会在另一层（被动层）中诱导产生一个开路电压或闭路电流，即产生层间拖拽效应。基于二维电子气之间的拖拽效应，可以探索准粒子的层间长程相互作用，发现如激子超流体等新颖层间关联量子态。由于较强的介电屏蔽效应，拖拽电流耦合比远远小于1。而将其中一层或两层替换成超导材料，将有望产生耦合比显著增强的超流拖拽效应。研究团队构筑了石墨烯与氧化物异质界面组成的二维半金属—超导体电双层结构，并对其层间拖拽行为进行了系统研究。他们发现，在氧化物界面超导转变区间，石墨烯层中施加驱动电流可以在氧化物界面诱导出巨幅拖拽电流，且强度可以通过栅压/外磁场等进行有效调控。特别是在界面超导最优掺杂附近，拖拽电流耦合比达到0.3，即所产生的拖拽电流大小与驱动电流相当。与此前传统普通金属/超导金属体系相比，耦合比提高了两个量级以上。这一结果揭示了宏观量子涨落对于层间准粒子相互作用的显著调制。在应用层面，基于该复合结构将有望制备新型电流或电压高效转换器件，包括超导二极管等量子器件，将推动具有丰富量子物相的更广泛二维电子体系的拖拽效应研究，并发现更多基于层间长程耦合的新颖量子多体效应。

p 　　以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术在艾滋病、血液病、肿瘤等多种遗传性疾病的基因治疗领域中展现出极大的应用前景。杜氏肌营养不良是一种X染色体隐性遗传疾病，医学界尚无有效疗法。近日，有研究人员指出，CRISPR/Cas9可用于杜氏肌营养不良症的基因治疗，打破该病无药可治无法可医的局面。 /p p 　　杜氏肌营养不良是一种X染色体隐性遗传疾病，主要发生于男孩。据统计，全球平均每3500个新生男婴中就有一人罹患此病。患者在学龄前就会因骨骼肌不断退化出现肌肉无力或萎缩，导致不便行走。大概在7岁到12岁时，会彻底丧失行走能力，通常到20多岁就会因为心肌、肺肌无力而死亡。针对该病，医学界尚无有效疗法。 /p p 　　近日，德克萨斯大学西南医学中心的研究人员发现，CRISPR/Cas9可用于杜氏肌营养不良症的基因治疗，并进行了概念实验验证。该研究结果以《Correction of diverse muscular dystrophy mutations in human engineered heart muscle by single-site genome editing》为题发表在1月31日的《Science Advances》上。 /p p style=" text-align: center " img title=" 1.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/162c23ca-d6f3-45d9-8a7c-c19595ae3ccc.jpg" / /p p 　　造成杜氏肌营养不良(DMD)的X-连锁肌营养不良蛋白基因(DMD)能发生3000种不同突变，这些突变大部分与心脏和骨骼肌坏死有关。研究人员利用CRISPR 在DMD发生突变或缺失的患者的诱导多能干细胞中进行了编辑，成功使衍生心肌细胞的肌养蛋白恢复了表达。在三维设计的心肌模型(EHM)中，CRISPR 的编辑使DMD突变的肌动蛋白修复，肌养蛋白重新表达，还使肌肉的机械收缩力恢复，纠正DMD后的EHM收缩功能得到了恢复。他们发现，仅纠正一小部分心肌细胞(30-50%)就足以将突变的EHM表型恢复至正常水平。 /p p style=" text-align: center " img title=" 2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/2c6e648e-b84b-4f09-8276-6807fb20066d.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong CRISPR使DMD突变的衍生心肌细胞肌养蛋白mRNA重新表达 /strong /p p style=" text-align: center " img title=" 3.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/daa01aff-a063-4bec-80a5-8d9bf0dc7139.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 免疫组化和蛋白印迹分析显示肌养蛋白重新表达 /strong /p p 　　研究团队通过CRISPR / Cas9的基因组编辑，利用同源性定向修复法(HDR)修复了肌营养不良症模型鼠(mdx小鼠)的生殖系统及肌肉干细胞中的DMD点突变，并通过末端连接(MMEJ)修饰了该小鼠的肌肉组织，最终，小鼠的肌营养不良症状显著改善。然而，大多数DMD患者存在一个或多个外显子的缺失，仅有5-9%的DMD患者具有点突变，因此，仅仅修正这点突变并不能直接说明CRISPR / Cas9基因组编辑适用于人类的DMD异质性突变。 /p p style=" text-align: center " img title=" 4.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/fade9543-959d-4ccc-9195-c5aeb255fc35.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 改善后的DMD心肌细胞所衍生出的EHM显示收缩力得到增强 /strong /p p 　　随后研究人员发现，DMD突变聚集在基因特定的“热点”区域(外显子45-55和外显子2-10)，因此，只要绕过“热点”附近的12个外显子重建基因框架就可以挽救大部分DMD患者(约60%)的肌蛋白功能。他们使用带有引导RNA的CRISPR / Cas9，破坏DMD突变的保守剪接受体和供体位点，使周围外显子绕过“热点”区域重建框架，从而使DMD突变得到修复。因此，研究人员认为CRISPR / Cas9的基因组编辑技术能成为纠正DMD相关的肌肉和心脏异常的有力手段。研究数据进一步表明，EHM作为是一个合适的临床前工具，可有效提高基因编辑的效率。 /p p style=" text-align: center " img title=" 5.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/c01da22f-8502-4af0-9147-c70d97f53087.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 可绕过“热点”附近12个外显子的引导RNA /strong /p p 　　目前，人体CRISPR临床试验已经在中国和美国获得批准。但是，由于脱靶效应可能使基因组产生突变，因此，CRISPR / Cas9系统的一个关键问题是解决引导RNA的特异性，现已开发了评估可能的脱靶效应的方法。另外，也已报道了能够使潜在的脱靶效应改善的新方法。但是，全面广泛的脱靶效应分已经超出了此研究的范围，因此，此项疗法在进行临床治疗之前，应对各个引导RNA可能的脱靶效应进行彻底的评估。(转化医学网360zhyx.com) /p p 　　参考资料：Correction of diverse muscular dystrophy mutations in human engineered heart muscle by single-site genome editing /p

p 　　新华社华盛顿4月6日电(记者 周舟)来自南京大学、厦门大学和南京工业大学的科研人员日前在新一期美国《科学进展》杂志上发表论文说，他们开发出一种“基因剪刀”工具的新型载体，可实现基因编辑可控，在癌症等重大疾病治疗方面具有广阔的应用前景。 /p p 　　被誉为“基因剪刀”的CRISPR基因编辑技术能精确定位并切断DNA(脱氧核糖核酸)上的基因位点，可以关闭某个基因或引入新的基因片段,从而达到治病目的。但脱靶效应一直是阻碍其应用的关键障碍之一。 /p p 　　论文通讯作者、南京大学现代工程与应用科学学院教授宋玉君对新华社记者说，目前的CRISPR-Cas9技术本身具有脱靶效应，给精准治疗带来挑战，且这种技术主要以病毒为载体，还可能导致细胞癌化。 /p p 　　据介绍，研究人员新开发的方法采用了一种名叫“上转换纳米粒子”的非病毒载体。这些被“锁”在“基因剪刀”CRISPR-Cas9体系上的纳米粒子可被细胞大量内吞。由于 strong 这些纳米粒子具有光催化性，在无创的近红外光照射下，纳米粒子可发射出紫外光，打开纳米粒子和Cas9蛋白之间的“锁”，使Cas9蛋白进入细胞核，从而实现精准的基因剪切 /strong 。研究显示， strong 这种方法的有效性已在体外细胞和小鼠活体肿瘤实验中得到验证。 /strong /p p 　　宋玉君说，红外光具有强大的组织穿透性，这为在人体深层组织中安全、精准地应用基因编辑技术提供了可能。 /p

p & nbsp & nbsp & nbsp CRISPR具有改变DNA的力量。 /p p 　　CRISPR基因编辑技术会导致上千个不想要的突变吗?这是一项小鼠研究提出的问题。 /p p 　　基因编辑的想法是改变细胞基因组中某个单一的DNA序列，而不触及其他的基因组序列。然而，实际上，每个基因编辑方法有时候都会导致不希望的改变。 /p p 　　如果不希望改变的基因比率较低，这并不是什么问题，因为大多数突变都没有影响。但一些特定的基因变异却会导致癌症，因此，CRIPSR技术的安全性取决于它产生的脱靶变异宾律有多高。 /p p 　　如果说CRISPR技术存在不希望的突变，大多数研究发现的突变都很少。然而，几乎所有这些研究都是通过预测它们可能会是什么来寻找脱靶变异，然后了解是否能够找到变异。 /p p 　　美国哥伦比亚大学医学中心的Stephen Tsang和团队现在利用一个更加广泛的方法，测序两只经过CRISPR技术编辑的小鼠的基因，并将其与未经过基因编辑的控制组进行对照。他们通过这种方法在两只基因修饰小鼠中鉴定出超过1000个普通基因突变，并认为这是由CRISPR技术导致的。 /p p 　　Tang表示，这是一项极小的研究，他们尚不知晓其他的团队如果用同样的技术是否能够得到类似的结果。 /p p 　　即便这些结果可以重复，问题是还要利用这一案例中采用的具体的CRISPR技术。即便进一步实验表明利用CRISPR技术大体上存在问题，这应该仍然是可以解决的。其他团队已经改变了CRISPR/Cas9系统以减少脱靶变异的风险，此外还有很多潜在的选择性蛋白在利用CRISPR时可能会产生更少的不希望的效应。 /p p 　　尽管Tsang和同事表示，他们依然对CRISPR技术表示乐观，他们还是希望其他研究人员利用自己的方法确保脱靶变异被找到，如果可能的话采用一些方法避免过多的突变。 /p p 　　“这将会进入临床试验，并且正在被应用到作物上。”Tsang说，“或许美国农业部和食药监局应该在批准人类和食品CRISPR指导规范之前先获得我们的方法。” /p p /p p /p

p 　　今天是第二届人类基因组编辑峰会的第二天。往常，李兆基会议中心作为香港大学的一个学术会议和报告场地，出入的都是轻声细语、缓缓而行的学者与学生。而今晨8点起，大量挂着中外媒体名牌，手持照相机、摄像机、录音笔的记者在会议中心内外快节奏地涌动，表面仍然平静的会场也令人感觉凝重起来。 /p p 　　毫无疑问，基因编辑婴儿事件的主角贺建奎的出席已经将这个小规模学术聚会卷入了一场横扫全球的风暴。连贺建奎本人在中午 12 时 40 分提着一个浅棕色公文包上场开始英文演讲时，也略显结巴。不过，随着他说到露露和娜娜，说到自己团队完成的世界首例基因编辑婴儿实验的几个关键数据，似乎恢复了一点自信。 /p p 　　经历了临时议程更改、原定记者会取消、只提供书面提问等一系列“序曲”之后，整个生命科学领域乃至全人类都格外关注的大量重要信息终于公布。 /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/4f49ccc5-8a89-47ca-83b9-9152e64a0399.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" style=" text-align: center " / /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 上午大会前主办方工作人员被媒体簇拥(来源：DT 君) /span /strong /p p 　　12 点 40 分左右，主持人Robin Lovell-Badge 在贺建奎教授发言之前特地表示，“大会之前我们并不知道基因编辑婴儿这件事，但我们还是决定给他一个发声的机会”。 /p p 　　贺建奎开启一个多小时的演讲及问答环节的第一句话是，“对于这个研究结果非预期的泄露出来，我感到抱歉”。另外，“这项研究也提交给了一些学术期刊，虽然我所在的南方科技大对我的研究并不知情，但我还是要感谢学校”。 /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/82de0817-f3f2-4559-a328-b5e80a87263c.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" style=" text-align: center " / /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 贺建奎演讲中(来源：DT 君) /span /strong /p p 　　演讲中，贺建奎首先介绍了对 CCR5 和 HIV 的了解、在小鼠模型中验证 CCR5 基因敲除对发育的影响、设计根据人类基因优化的 sgRNA、在非组蛋白水平发展更好的注射方法、把同样的方法应用于人类胚胎细胞+建立评价胚胎细胞健康水平的人类胚胎干细胞系等几个方向的技术内容。 br/ /p p 　　在研究脱靶效应上，贺建奎的 PPT 提出了两个问题：单细胞测序真的能够对 CRISPR-Cas9 的脱靶效应进行无偏移的评价吗?这个 sgRNA 在人类胚胎中能够造成怎样的脱靶效应?方法是建立生殖细胞专属的单细胞测序方法学，用全基因组测序和靶向基因深度测序来考察人类胚胎细胞。 /p p 　　根据介绍，团队目前已经在脐带血水平、脐带组织水平和胎盘水平进行了检测，未来将在组织水平(足跟血、唾液和毛囊)和细胞水平(外周血细胞)进行脱靶效应和嵌合效应的检测。 /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/10df4050-dab0-4a58-a1ed-5ce572d58739.jpg" title=" 3.jpg" alt=" 3.jpg" style=" text-align: center " / /p p 　　那么，两个婴儿出生的具体过程又是什么?招募志愿者的标准是父亲单阳性，总共招募了 8 组，其中一组退出，最后只剩 7 组。PPT 显示，整体的流程是先获取父母亲的外周血基因，例如 HIV 携带的父亲和 HIV 阴性的母亲，进行 Sanger 测序，这一步可以从父母的基因组检测到全新的插入缺失标记(indels)，并且单模标本能提高灵敏度，目的在于建立个体化的脱靶高危位点库。接下来通过卵胞浆内单精子显微注射技术把 Cas9 和 sgRNA 注射到受精卵中，并在体外培养成囊胚，从中获取 3-5 个细胞进行胚胎种植前基因诊断。 /p p 　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/81161e57-1f8a-4b99-a503-cb774259a9a6.jpg" title=" 4.jpg" alt=" 4.jpg" style=" text-align: center " / /p p 　　　诊断方式依然为 Sanger 测序，以检测全基因组的靶效应和脱靶效应以及大的缺失位点。接着把受精卵种植到母亲子宫中，分别在 12 周，19 周和 24 周从母亲身上获取游离 DNA，对 609 个已知癌症基因进行 MiSeq 靶向测序，深度为 40000x，目的在于评价脱靶效应，原癌基因状态，CCR5编辑状态。最后，胎儿出生后，收集脐带血、脐带组织以及胎盘，再次进行 Sanger 测序，目的在于评价不同样本的编辑效果。 /p p 　　出生后，Sanger 测序和深度测序均未检测到 PGD 期间观察到的基因间脱靶。对于脐带血的全基因组测序，没有观察到脱靶，也没有观察到大的基因缺失。 /p p 　　演讲结束后，大会主席、诺贝尔医学奖得主 David Baltimore 现身舞台，首先代表大会提出了一定的“指控”。他表示，上次大会结束的时候大家都同意了不要做人类胚胎研究，但是贺并没有遵守，科学社区自我管理的过程已被证明失效了，整个大会的组办机构明天会发一个声明。　　 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/870d7865-85f4-4246-a3cb-deb68f16f63f.jpg" title=" 5.jpg" alt=" 5.jpg" width=" 380" height=" 568" style=" width: 380px height: 568px " / /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 贺建奎回答问题中(来源：DT 君) /span /strong /p p 　　而在提问环节，哈佛大学化学与化学生物系教授的 David Liu 表示，父亲阳性，经过“洗精” (sperm washing)，完全没有医疗需求和必要进行这样的研究，这些女孩在医疗上的价值到底是什么? /p p 　　贺建奎的回答是，对全球众多受 HIV 影响的人群来说，这是很有必要的。“我曾经去过一个村子，那里有 30% 的人都感染了 HIV。对这个项目来说，我对我们所做的感到骄傲。孩子的父亲曾一度对生活失去了信心，但现在，他告诉我今后会好好工作，努力挣钱，好好照顾他的妻子和两个女儿”，他说。在另一个问题的回答上，他表示，我会对她们视若己出。 /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/52890fb6-33af-4900-aaee-b3d4476bbae4.jpg" title=" 6.jpg" alt=" 6.jpg" style=" text-align: center " / /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 贺建奎回答问题中(来源：DT 君) /span /strong /p p 　　对于贺建奎提到在知道有一个孩子可能脱靶后，志愿者夫妻仍然坚持受孕，对此 David Liu 表示十分质疑。但面对 David Liu 的第二个提问——如果患者可以决定，一个医生或者科学家向公众解释或者引导公众的责任究竟在哪，贺建奎并没有回答这个问题。 /p p 　　在提问环节，贺建奎也回应了关于此次实验相关的 HIV 志愿者夫妻的问题。他透露，志愿者有良好的教育背景，知道 HIV 目前的治疗手段，也清楚这个治疗手段的优势和风险，也向志愿者讲清楚了风险。他曾与这对夫妻有过深入交流，谈话持续了 1 小时 10 分钟，准备了详细的文件并打印出来。在同一会议室内还有两位观察员，夫妻受过良好的教育，能理解文本的内容，他本人从 1-20 页每段跟他们解释，他们完全知晓关于研究的一切。而且，参与实验的志愿者父母在被告知受精卵测序存在一个脱靶后，仍坚持受孕。 /p p 　　他表示，不能对外公布任何 HIV 感染者的信息，对于这对夫妻，会持续监控他们的健康状况。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/dfbfb8c6-72a1-43c4-9e7a-27a645f848dc.jpg" title=" 7.jpg" alt=" 7.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 著名学者张锋正在台下等待提问机会，但是并没有等到(来源：DT 君) /span /strong /p p 　　在实验的资金来源上，贺建奎说，只有最开始的时候，试剂经费是来自南科大的后期临床费用是贺建奎自己负责的，测序费用是来自于自己的科研启动资金，和名下的公司完全无关。 /p p 　　在讨论环节的最后，主持人问了这样一个问题：“如果是你的孩子，你会怎么做?” /p p 　　贺建奎表示：“这是个好问题，如果是我的孩子，有同样的处境，我会首先尝试。”( That& #39 s a good question. If it was my baby, with the same situation, yes I would try first.) /p p 　　最后，来自斯隆凯特琳癌症中心的 Maria Jasin 问到，这对双胞胎孩子在 18 岁之前，有独立性之前，因为一个被编辑，一个没被编辑，无论从基因型、家庭、社会到成长的方方面面，孩子都可能被区别对待，从而影响到他们的成长过程，他们还如何选择自由的人生? /p p 　　贺建奎回复：“我现在还无法回答你这个问题。” /p p 　　真正“暴风”才刚开始 /p p style=" text-indent: 2em " 实际上，整个学术界的大讨论其实才刚刚开始。DT 君了解到的情况是，许多基因编辑学术界的学者都在等待核心数据的公开，其中就包括 CRISPR 技术先驱者、MIT 教授张锋，以及他当时的博士生、现任斯坦福大学医学院的助理教授丛乐。 /p p 　　张锋教授在贺建奎演讲结束后接受采访时表示，目前已经有非常安全的方法来防止病毒在父母和婴儿之间传播，所以根本没有必要做这种试验。关于脱靶问题，张锋教授认为，今天的演讲速度较快，有些细节并不清楚，贺建奎提到可能有一个脱靶的点位，但可能没太大影响，这还需要了解其操作方法和更多的数据才能得出进一步结论。 /p p 　　“我认为他不应该做这个试验，我未来不会做胚胎，以及用它来影响新生婴儿的基因”，张锋教授说到。 /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/3fe3c353-65d2-47d2-a6db-a1d58944c3e0.jpg" title=" 8.jpg" alt=" 8.jpg" style=" text-align: center " / /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 斯坦福大学医学院助理教授丛乐(来源：DT 君) /span /strong br/ /p p 　　作为 2017 年《麻省理工科技评论》中国区 35 岁以下科技创新者，丛乐教授是将 CRISPR 技术带到人类基因世界的青年科学家之一。2013 年，Science发表了麻省理工学院张锋教授作为通讯作者、丛乐博士作为第一作者的论文，首次将 CRISPR-Cas9 基因编辑系统作用于人类和鼠类细胞，并揭示了相关技术在基因治疗，特别是心脑血管疾病和癌症治疗中的应用潜力。 /p p 　　他在今天大会开始之前通过邮件对 DT 君表示：“我觉得国内开展了世界上最早的基因编辑婴儿工作，在我的意料之中，但是我个人对于这次的工作没有通过学术渠道，用更为严谨的方式来公布信息感到不是非常理解，尤其是在相关人员的身份似乎是学校的科研人员而不是企业中的商业雇员的情况下。这个案例目前公开信息较少，所以我觉得需要等香港会议及之后我们大家才可以更为全面的做出评价。” /p p 　　丛乐表示，他个人支持并且也在参与基因编辑工具的研究和临床应用，不过相关的伦理社会问题应该在一个更为科学、严谨、公开的环境中让大家理解和讨论。“希望这次是一个很好的机会来让我们推进这个事情”，他说。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/63aac783-8000-4bbc-9bbd-a95b2b0db373.jpg" title=" 9.jpg" alt=" 9.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 第二届人类基因组编辑峰会 /span /strong /p p 　　昨天的大会上，张锋、Jennifer Doudna 两位 CRISPR 权威人物罕见同台，而在今天的大会议程，我们更是看到全球已有的几例胚胎编辑实验中的两位中国领军科学家现身，他们分别是来自中山大学的黄军就教授、上海科技大学的黄行许教授。 /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/a3905f89-aace-4a12-ada9-3ad1353639d9.jpg" title=" 10.jpg" alt=" 10.jpg" style=" text-align: center " / /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 黄军就在第二届人类基因组编辑峰会演讲 /span /strong /p p 　　2015 年，来自中山大学的黄军就教授带领团队首次发表编辑人类胚胎的相关论文，宣布他们在实验室中使用 CRISPR-Cas9 系统，将胚胎中地中海贫血症相关基因敲除，完成世界上“首例胚胎编辑”实验。但事实上由于镶嵌现象和脱靶效应，整个胚胎井没有被完全编辑，同时以此种方式出生的孩子可能面临未知或是无法承受的风险，因而，严格意义上来讲，这次胚胎编辑并不能算是成功。 /p p 　　在上午的演讲中，黄军就表示，虽然在小鼠胚胎模型中能够实现对β地中海贫血基因编辑，并诞生健康的小鼠，但这项研究很难获得人类健康的胚胎，并且具有很大的风险。在演讲的最后，他特别强调，自己所有的实验都基于中国的胚胎基因编辑指导原则。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/c1e2bb46-81d4-4aa5-a934-687c96ecf174.jpg" title=" 11.jpg" alt=" 11.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 黄军就的演讲 /span /strong /p p 　　黄行许教授则是在 2018 年 9 月带领团队率先将单碱基编辑技术应用于可发育的人类胚胎的遗传疾病修复中。此次接受 CRISPR 治疗的胚胎所患上的疾病——马凡氏综合征——正是一种罕见病。 /p p 　　在此前接受 DT 君采访时，黄行许就表示，胚胎的基因编辑影响深远，因此科学家必须要严格遵循伦理和按照国际规则开展好研究工作。“我们的合作伙伴申请获批了医院伦理委员会的许可，开展了本研究。研究的初步结果是成功的。尽管如此，把胚胎基因治疗应用到临床，需要大量的实验验证可靠性。需要逐步的临床前实验和临床实验验证，仍然有很长的路要走”，他说。 /p p 　　 strong 同一事件，不尽相同的各方反应 /strong /p p style=" text-indent: 2em " 目前，包括深圳市卫生计生委医学伦理委员会、南科大在内的中国多家机构均表示，将因此次实验调查贺建奎及涉及的单位。广东省卫生健康委也被国家卫健委要求进行调查。 /p p 　　而以“贺建奎”为关键词查阅中国临床试验注册中心能发现，以其为临床试验研究负责人的两个注册题目之一的《HIV 免疫基因 CCR5 胚胎基因编辑安全性和有效性评估》，正是 11 月 26 日曝出的 2 名基因编辑婴儿诞生的临床试验项目。该项目“干预措施”项显示，对 CCR5 基因进行编辑的样本量为 20，即除了上述 2 名婴儿，还对其他 18 个胚胎进行了基因编辑。该项目注册号状态为补注册，注册日期为 2018 年 11 月 8 日，更新日期为 2018 年 11 月 26 日。 /p p 　　整个事件的一大关键问题，谁有权对基因编辑婴儿说是或否? /p p 　　根据贺建奎在他撰写的伦理审查申请书中，声称他是尝试成功利用基因编辑工具 CRISPR 来编辑胚胎并诞生婴儿的第一人，尽管那时他们还只是实验室里的受精卵。在他的伦理声明中，他向审稿人保证所有事情都没问题。目前，深圳和美医院表示对这份伦理审查书表示不知情。 /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/a152f4a9-0062-4ac1-9efd-a7b23a4f38cf.jpg" title=" 12.jpg" alt=" 12.jpg" style=" text-align: center " / /p p 　　 strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 贺建奎在 2017 年 3 月撰写的伦理声明中曾引用了一份美国报告作为其开始研究基因编辑婴儿的依据(来源：麻省理工科技评论) /span /strong /p p 　　而在国外，这份伦理申请书的一个细节引发了另一个维度的讨论。伦理申请书特地提到，仅在一个月前，也就是在 2017 年 2 月，美国国家科学院、工程院和医学院“首次”批准用于重大疾病治疗的胚胎编辑实验研究的伦理申请。 /p p 　　也正是这样的结论，就在第二届国际人类基因组编辑峰会召开的前夕，不但贺建奎的惊人之举受到了激烈批评，受到批评的还包括很多撰写那份美国国家学院报告的人。 /p p 　　这份报告在 2017 年推出时就已掀起过一轮大讨论。尽管其中有很多注意事项，但这份报告所传达的信息是明确的。报告没有像一些人所希望的那样，批准暂停 CRISPR 婴儿，相反，报告中写道：“如果目的是治疗或预防严重疾病，基因编辑婴儿最终是被允许的。” /p p style=" text-align: center " 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/9c9207b5-4f4d-4a2a-b214-33f0137f8ec3.jpg" title=" 13.jpg" alt=" 13.jpg" style=" text-align: center " / /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 麻省理工科技评论 /span /strong /p p 　　对于亚利桑那州立大学的伦理学家 Benjamin Hurlbut 来说，科学家们在新发现上的竞赛是不可避免的问题，“即使还不确定是否应该使用这项技术。” /p p 　　“研究人员可以继续声称他们的‘基础’科研与临床应用无关，但这基本都只是权宜之计，”他说，“几十年来，这项研究一直向着科学竞赛的方向发展，先去做，然后再去质疑。这种情况是我们自己造成的，但想逆转是很难的事情。” /p p 　　“多米诺骨牌正朝着一系列人们觉得不负责和令人反感的方向倾倒，”Hurlbut 说，“正如人类辅助生殖技术的历史所表明的那样，即使是在仍存在严重未知的情况下，从实验室开发技术到将它用来生育孩子也只是很短暂的过程。” /p p 　　某种程度上，胚胎基因编辑领域、生命科学领域、整个科学界、HIV 患者群体乃至全球公众，各个群体之间对于贺建奎基因编辑婴儿的态度和关注点都不尽相同，群体内部也存在着一些微妙的分歧。预料此事的最终结局将会是多方群体共同博弈平衡的一个结果。 /p p 　　贺建奎其人：加入南科大同年开始创办公司，被视为学校创新典范 /p p style=" text-indent: 2em " 相信关注此次事件的各位读者都已经知道，此次事件的主人公贺建奎现为南方科技大学副教授，也是一家名为“瀚海基因”的创业公司的创始人。 /p p 　　根据南方科技大学官网显示，贺建奎 2006 年获得中国科学技术大学近代物理学学士学位，2010 年获得美国莱斯大学生物物理学博士学位，在美国斯坦福大学任博士后。其在斯坦福期间，师从微流控基因芯片鼻祖斯蒂文· 奎克。 /p p 　　贺建奎本人拥有多学科交叉的背景，在基因测序仪研究、CRISPR 基因编辑，生物信息学等领域都有硏究成果。在美国斯坦福大学斯蒂文· 奎克实验室从事博士后研究期间，他曾研发出免疫组库基因检测技术，并发表在国际顶尖学术杂志 Science 杂志的 Science Translational Medicin 上。 /p p 　　2012 年，贺建奎经深圳市“孔雀计划”海外高层次人才计划引进回国，在南方科学技术大学建立个人实验室进行基因测序方向的研究。据天眼查资料显示，也正是在这一年的 7 月，贺建奎创办了瀚海基因。 /p p 　　资料显示，到了 2015 年 10 月，中国第一台自主知识产权第三代基因测序仪在瀚海基因诞生，2016 年 2 月，Nature 杂志报道瀚海基因三代测序技术。到了 2017 年，瀚海基因宣布成功研发出亚洲第一台具有世界领先水平的第三代基因测序仪样机 GenoCare。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/c9904b67-08b4-4a00-b108-558a2283d830.jpg" title=" 14.jpg" alt=" 14.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 贺建奎和 GenoCare 测序仪(来源：南方科技大学) /span /strong /p p 　　Genocare 的上市，贺建奎和他的团队开始以行业黑马的形象走到众人面前。2018 年 4 月，瀚海基因完成 2.18 亿元人民币的 A 轮融资，下一个阶段是迈向大批量投产。根据南科大官方公众号发布过的媒体报道《1 所大学和它的 25 家高科技公司：给教授放假的南方科技大学》，南科大为此专门允许贺建奎停薪留职、全力发展自己的事业。 br/ /p p 　　而在南方科技大学的官方微信发布以及转发的报道中，不难看出这位 80 后海归教授的受重视程度：例如，在《北京日报》一篇名为《回国，到深圳去》的报道中，涉及的南科大创业创新政策以及高质量人才队伍中，就有贺建奎教授的身影。学校刊发的一篇文章中如此写道：“2017 年 7 月，生物系副教授贺建奎经过五年的研发，推出自主研发的第三代基因测序仪，成为深圳乃至全国创新创业的典范”。 /p p 　　除了瀚海基因，他名下还拥有多家企业股权。天眼查数据显示，贺建奎是 7 家公司的股东、6 家公司的法定代表人，并且是其中 5 家公司的实际控制人。这 7 家公司的总注册资本为 1.51 亿元。 /p p 　　特别需要注意的是，根据中国临床试验注册中心的信息显示，相关基因编辑婴儿实验的 Primary sponsor(研究实施负责组长单位)为南方科技大学，而非贺建奎创立的瀚海基因及其入股的任何一家公司，而 Secondary sponsor(试验主办单位，项目批准或申办者) 则为深圳和美妇儿科医院(Shenzhen HarMoniCare Women & amp Children& #39 s Hospital)。 /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/e9a1bb3f-5b94-4bba-a7d9-39586caed469.jpg" title=" 15.jpg" alt=" 15.jpg" style=" text-align: center " / /p p 　　目前，两家单位都已对此次事件作出回复。南方科技大学声明如下： /p p 　　今日，有媒体报道贺建奎副教授(已于 2018 年 2 月 1 日停薪留职，离职期为 2018 年 2 月—2021 年 1 月)对人体胚胎进行了基因编辑研究，我校深表震惊。在关注到相关报道后，学校第一时间联系贺建奎副教授了解情况，贺建奎副教授所在生物系随即召开学术委员会，对此研究行为进行讨论。根据目前了解到的情况，我校形成如下意见： /p p 　　一、此项研究工作为贺建奎副教授在校外开展，未向学校和所在生物系报告，学校和生物系对此不知情。 /p p 　　二、对于贺建奎副教授将基因编辑技术用于人体胚胎研究，生物系学术委员会认为其严重违背了学术伦理和学术规范。 /p p 　　三、南方科技大学严格要求科学研究遵照国家法律法规，尊重和遵守国际学术伦理、学术规范。我校将立即聘请权威专家成立独立委员会，进行深入调查，待调查之后公布相关信息。 /p p 　　而深圳和美妇儿科医院下午也回应，否认该院和此事有关“这件事不属实，我们没有接受过相关信息，不知道这件事为什么会上热搜，正在调查。”而至于贺建奎是否有挂靠深圳和美进行相关研究，深圳和美方面表示“不了解情况”。 /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/071e520d-12a8-4bd9-a5c4-539192d759a5.jpg" title=" 16.jpg" alt=" 16.jpg" style=" text-align: center " / /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 来源：南方科技大学 /span /strong /p p 　　深圳卫计委也发布关于《世界首例免疫艾滋病的基因编辑婴儿在中国诞生》声明称，根据“医疗卫生机构应当在伦理委员会设立之日起 3 个月内向本机构的执业登记机关备案”，经查，深圳和美妇儿科医院医学伦理委员会这一机构未按要求进行备案。深圳市医学伦理专家委员会已于 11 月 26 日启动对该事件涉及伦理问题的调查，对媒体报道的该研究项目的伦理审查书真实性进行核实，有关调查结果将及时向公众进行公布。 /p

祁连山脉位于青藏高原北部、河西走廊南侧，由多条平行的山脉组成，呈西北向东南延伸。石羊河流域上游是重点研究区域，海拔西南高、东北低，发源于祁连山脉北坡的冷龙岭，流经青藏高原，由西南向东北流动。该地区年降水量200~700 mm，月平均降水量24~51 mm，属于大陆性高山气候，受东亚季风、高原季风和西风影响。不同海拔对气候影响显著，山区年平均气温低于6℃，随海拔升高而降低。相对湿度随海拔增加而增加，反映了多种水汽来源的影响。图1 西北地区北麓的位置，(a)研究区采样点位置，图(a)左上：研究区水分来源（箭头大小表示重要性）；(b)山区采样点位置；(c)祁连山北坡降水量与气温月平均变化。来自西北师范大学的研究团队在祁连山北坡6个采样点共采集降水样品863个，其中雪样出现在冬季（1月、2月、12月），雨样出现在3月至11月，采样期间共采集雪样61个、雨样802个（表1）。在研究区5个采样点共采集地表水（河水）样品372个，在研究区5个采样点共采集植物水样品92个，采样时间为2016年10月至2020年9月。每次降水事件后，用雨量计采集降雨样品并立即放入50 ml聚乙烯采样瓶中，同时记录降水量，最后用封口膜盖紧封口并冷藏保存。地表水样品每次采集后也立即密封冷藏。同时利用自动气象观测仪器记录气温、降水、相对湿度、大气压等气象要素。分析时，植物水由LI-2100 全自动真空冷凝抽提系统（北京理加联合科技有限公司）提取。δ2H和δ18O测定在西北师范大学同位素实验室进行，每个水样和同位素标准样品连续进样6次。表1 采样点基本信息 通过对2016年10月至2020年9月降水稳定同位素分析，确定祁连山水线（LMWL）为：δ² H = (7.78±0.05)δ¹ ⁸ O+ (10.97±0.52) (R² =0.97, n=863, p图5 气象水文过程对祁连山北坡降水稳定同位素海拔效应的影响。（a）降水稳定同位素海拔效应的月变化，图中连线表示海拔梯度及误差的月变化。（b）降水中循环水比例及相对湿度的月变化。（c）降水量和气温的月平均变化。（d）雨滴蒸发残留率的月变化。石羊河上游位于青藏高原北部的祁连山北坡，降水除受当地气象水文过程影响外，还受到平流水汽的影响。祁连山北坡当地大气降水线（LMWL）为：δ2H =（7.78±0.05）δ18O +（10.97±0.52）（R2 = 0.97，n = 863，p 0.05），表明夏半年当地大气降水线的斜率小于冬半年。祁连山北坡降水稳定同位素的海拔效应在各季节的变化顺序为冬季秋季春季夏季，表明海拔效应受当地气象水文过程的显著影响。研究区水汽主要来源于四个方向：西部、东北部、东南部和高原南部。来自东北和东南方向的水分具有较短的传输路径和较慢的速度，而来自西北和西南方向的水分具有较长的迁移路径和较快的速度。降水中稳定同位素的海拔效应变化在很大程度上取决于水分方向和气团特征，表现为四种不同的情况：1、平流水分垂直于山脉，气团迁移速度较慢，加剧了海拔效应。2、当平流水分（主要来源）与山脉方向平行，气团移动距离长且速度快时，海拔效应变得不那么明显。3、尽管平流水分占主导地位，但相当一部分地表蒸发水会削弱观察到的海拔效应。4、主要来源是平流水分，表现为沿斜坡向下的反向气流，在研究区域引入了反海拔现象。

2022年12月14日，北京大学伊成器课题组在Molecular Cell杂志在线发表了题为CRISPR-free, programmable RNA pseudouridylation to suppress premature termination codons的研究论文，首次报道了名为RESTART（RNA Editing to Specific Transcripts for Pseudouridine-mediAted PTC-ReadThrough）的新型RNA单碱基编辑技术。该技术利用改造的guide snoRNA，招募细胞内源的假尿苷合成酶复合物，在RNA特定位点处实现高效、准确地尿苷（U）到假尿苷（Ψ）的编辑。在mRNA的无义突变位点精准引入假尿苷修饰，将提前终止密码子转换成ΨAA、ΨAG或ΨGA，以实现提前终止密码子的通读及功能蛋白的全长表达。无义突变（Nonsense mutation）是基因序列中编码氨基酸的密码子突变成终止密码子（TAA，TAG，TGA）的单碱基突变。无义突变产生提前终止密码子（Premature termination codon，PTC），导致翻译提前终止，产生较小、不具功能的蛋白产物。根据人类基因突变数据库（Human Gene Mutation Database, www.hgmd.org）的统计，无义突变占据了超过20%的疾病相关单碱基突变。目前有多种潜在的技术可用于治疗无义突变疾病，但仍存在局限性。例如：（1）CRISPR/Cas9依赖的DNA碱基编辑技术可实现精准的碱基修复，但是仍存在安全性问题。细菌来源的Cas蛋白可能会引发人体免疫反应；并且一旦出现基因组水平上的脱靶，将会是永久性的。此外编辑元件尺寸较大，使药物的体内递送受到限制。（2）RNA碱基编辑技术是在RNA水平上进行的，不会对基因组序列进行永久改变，因此安全性较高。但是，RNA编辑工具的脱靶效应仍存在安全隐患。因此，领域内亟需拓展新型RNA编辑工具，开发更加特异和安全的RNA编辑器。图一、RESTART技术原理研究表明，RESTART技术具有广泛的适用性。在多种不同组织来源的细胞系以及人的原代细胞——例如支气管上皮细胞和皮肤成纤维细胞中，RESTART都可以介导高效和精准的编辑。在对疾病无义突变修复和蛋白功能恢复的诸多应用尝试中，RESTART的高效性均得到了充分验证，反映了该技术在疾病治疗中的巨大潜力。例如，RESTART成功恢复了来源于Hurler综合征小鼠的α-L-艾杜糖醛酸酶缺陷细胞中IDUA蛋白的功能。该技术为无义突变疾病的治疗和RNA假尿苷修饰的基础研究都提供了一种全新的工具。传统的RNA编辑技术主要是通过脱氨反应（如A-to-I或者C-to-U）实现碱基编辑，其产生的脱靶会在RNA上引入突变，从而存在安全隐患。与这些技术不同，假尿苷修饰不会改变碱基互补配对，不会影响密码子的编码信息；RESTART产生的少量脱靶也不会影响RNA的稳定性和蛋白的翻译。此外，RESTART系统是由人源的snoRNA和修饰酶衍生而来的，理论上可以避免免疫原性。因此RESTART是一个高效且安全的潜在治疗技术。综上，RESTART技术作为一种可编程的不依赖CRISPR的RNA假尿苷编辑技术，拓展了RNA编辑的策略，可通过高效编辑mRNA上的无义突变位点介导翻译通读和蛋白功能的恢复，并且具有较好的安全性，展现了良好的疾病应用前景。在递送方面，RESTART适用于装载至腺相关病毒（AAV）等载体中进行递送；并且guide snoRNA可以通过体外转录和体外合成等多种方式制备，未来也可以与小RNA递送体系，例如GalNAc3进行偶联。除此之外，RESTART技术也将推动假尿苷修饰领域的研究，为该领域基础研究和无义突变疾病治疗领域都提供有利的工具。北京大学生命科学学院伊成器教授为该论文的通讯作者，课题组博士后宋靖慧（已出站）、博士生董利婷、孙含笑、罗楠、博士后黄强为共同第一作者。该工作得到农业部项目、科技部重点研发计划、国家自然科学基金等项目资助以及北大-清华生命联合中心、蛋白质与植物基因研究国家重点实验室等的支持。北京大学高性能计算平台，生命科学学院仪器中心及凤凰工程等多个平台对本项目提供了重要的技术支撑。原文链接：https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(22)01100-5

美国Intellia Therapeutics公司（NTLA）和再生元公司的科学家在最新一期《新英格兰医学杂志》上撰文称，治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性多发性神经病（ATTR）的CRISPR基因编辑疗法NTLA-2001在Ⅰ期临床试验中取得积极结果：单剂NTLA-2001导致血清中的转甲状腺素蛋白（TTR）水平平均下降87%，最大可达96%。这是首批支持体内CRISPR疗法安全性和效果的临床数据，有望开启医学新时代。　　由于TTR基因发生特定突变，ATTR患者的神经和心脏等组织内会产生错误折叠的TTR并不断积聚，危及生命。而NTLA-2001是一款在体内进行基因编辑的创新疗法，利用非病毒脂质纳米颗粒（LNP）递送，通过降低血清中TTR的浓度来治疗ATTR。　　经过体内外研究后，NTLA-2001首次被用于ATTR患者的体内基因编辑。在Ⅰ期临床试验中，有6名ATTR患者接受了这一基因编辑疗法，其中3名接受剂量为0.1mg/kg的NTLA-2001治疗，另外3名接受剂量为0.3mg/kg的NTLA-2001的治疗。　　接受治疗第28天的检测显示，NTLA-2001能够降低患者血清中的TTR水平，而且，剂量越高效果越明显：0.1mg/kg剂量组TTR平均下降52%（47%—56%）；0.3mg/kg剂量组平均下降87%（80%—96%）。而且，NTLA-2001表现出良好的安全性，没有发现严重不良事件和肝脏问题。　　研究人员指出，与之形成对比的是，目前治疗伴有多发性神经病的ATTR患者的标准疗法通常只能将TTR水平降低80%，而且患者需要长期接受治疗。　　此外，研究人员表示，体内CRISPR基因编辑系统令人担心的一点是，基因编辑系统可能会对靶点序列以外的基因组序列进行编辑，从而引入有害突变——所谓“脱靶效应”，但实验结果显示，治疗剂量的NTLA-2001并未产生“脱靶效应”。　　NTLA总裁兼首席执行官约翰雷纳德博士说：“这些临床数据首次表明，我们可能通过单次静脉注射CRISPR系统，在患者体内精准编辑靶细胞，从而治疗遗传疾病，为使用这一疗法治疗其他遗传疾病打开了大门。”　　美国生物制药网站指出，尽管这是一个令人鼓舞的证明，但这些初步数据还没有回答CRISPR面临的许多最紧迫的问题：目前尚不清楚研究人员观察到的效果会持续多久，也不清楚随着更多患者接受治疗，效果是否会有所不同，此外，基因编辑的长期安全后果也不得而知。　　总编辑圈点　　这是一个里程碑式的事件——首个人体内CRISPR基因编辑临床试验结果公布，而且疗法安全有效。文中开展这项研究的公司之一Intellia Therapeutics就是诺奖得主詹妮弗杜德娜创办的。NTLA-2001通过非病毒脂质纳米颗粒递送，可以特异性敲除TTR基因，从而降低TTR蛋白的表达。试验结果令人振奋，但也不能因此就过于乐观。毕竟受试病人并不多，而且长期效果还有待观察。不过，至少试验证明，NTLA-2001具有在短期给药情况下中止和逆转ATTR的潜力。对患者来说，“潜力”二字，就已经足够珍贵。

2019年10月12-14日，细胞命运决定与人类疾病国际研讨会在上海交通大学医学院东院懿德楼顺利召开, 本次会议由上海交通大学医学院联合上海交通大学医学院联合细胞分化与凋亡教育部重点实验室、癌基因与相关基因国家重点实验室和《NEJM医学前沿》(《新英格兰医学杂志》中文版)共同主办。大会现场细胞命运决定是生命个体的生死决定，对所有的生命个体都至关重要。神经细胞的过早衰亡导致神经退化性疾病，肿瘤细胞的死亡逃逸奠定了肿瘤的发生发展。研究细胞的生死决定几乎涵盖了所有的重要生命活动和人类重大疾病。为进一步凝练科研方向，聚焦国际前沿科学问题，本届会议邀请了国内外顶尖的大咖学者们齐聚一堂，共襄盛会。会议期间，珀金埃尔默的市场开发经理张薇做了题为“Help you to understand cell destiny more deeply in phenotypics 3.0 era ”的精彩报告，她介绍了与大会主题非常相关的细胞和3D细胞，细胞的研究要借助于更先进的技术，如高内涵显微成像分析仪器。只有利用更先进的技术，才能看的更深，了解到更多的信息，有更多的科研突破。她在报告期间展现了多个从基因型到表型在细胞水平进行功能性验证的实例，都是用标记的方法或者是间接的方法进行成像或检测，从而会产生脱靶效应。而脱靶效应无论对基础研究，还是药物研发都会产生非常负面的影响。新的无标记检测方法CETSA，可以在无标记的状态下研究细胞内蛋白和小分子的相互作用。小分子会帮助蛋白稳定其构象，在通过Alpha检测方法检测区别正常构象蛋白和变性蛋白。最后，她提到珀金埃尔默还有定制化的细胞自动化实验室可用作靶点筛选、细胞株筛选和表型筛选。可以根据具体的实验需求，配置高内涵，酶标仪，移液工作站，机械手臂，样本储存和处理系统等。我们希望可以帮您在Phenotypics 3.0 时代，更快更深入发现细胞秘密。珀金埃尔默市场开发经理张薇关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn。

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2月23日，国家药品监督管理局药品审评中心发布关于公开征求《基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则》（试行）意见的通知，全文如下：为更好引导和促进基因修饰细胞治疗产品开发，药品审评中心通过对行业调研、文献收集和专家咨询讨论会等工作，在已有《细胞制品研究与评价技术指导原则》（试行）的基础上，根据目前对基因修饰细胞治疗产品的科学认知，经中心内部讨论形成《基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则》（试行）征求意见稿，现公开征求意见和建议。 我们诚挚地期待社会各界对征求意见稿提出宝贵意见并及时反馈给我们。征求意见时限为自发布之日起1个月。 您的反馈意见请发到以下联系人的邮箱： 联系人：戴学栋 联系方式：daixuedong@cde.org.cn 联系人：张旻 联系方式：zhangmin@cde.org.cn 感谢您的参与和大力支持! 国家药品监督管理局药品审评中心 2021年2月23日《基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则》（试行）一、前言 ................................................................................... 1 二、适用范围 ........................................................................... 1 三、总体考虑 ........................................................................... 1 四、受试物 ............................................................................... 2 五、动物种属/模型选择 .......................................................... 3 六、概念验证 ........................................................................... 4 七、药代动力学 ....................................................................... 5 八、非临床安全性 ................................................................... 6 （一）总体安全性考虑 ...................................................... 6 （二）基因表达产物的风险评估 ...................................... 6 （三）插入突变风险评估 .................................................. 7 （四）载体动员（Vector mobilisation）和重组风险评估 8 九、对特定类型基因修饰细胞产品的特殊考虑 .................... 8 （一）基因修饰的免疫细胞（CAR或TCR修饰的T细胞 /NK细胞） .......................................................................... 8 （二）诱导多能干细胞（iPS）来源的细胞产品 ............ 10 （三）基因编辑的细胞产品 ............................................ 10 一、前言 近年来，随着基因修饰技术的迅速发展，基因修饰细胞 治疗产品已成为医药领域的研究热点。由于基因修饰细胞治 疗产品物质组成和作用方式与一般的化学药品和生物制品 有明显不同，传统的标准非临床研究策略和方法通常并不适 用于基因修饰细胞治疗产品。为规范和指导基因修饰细胞治 疗产品非临床研究和评价，在《细胞制品研究与评价技术指 导原则》基础上，根据目前对基因修饰细胞治疗产品的科学 认识，制定了本指导原则，提出了对基因修饰细胞治疗产品 非临床研究和评价的特殊考虑和要求。随着技术的发展、认 知程度的深入和相关研究数据的积累，本指导原则将不断完 善和适时更新。 二、适用范围 本指导原则适用于基因修饰细胞治疗产品。基因修饰细 胞治疗产品是指经过基因修饰（如调节、修复、替换、添加 或删除等）以改变其生物学特性、拟用于治疗人类疾病的活 细胞产品，如基因修饰的免疫细胞（如T细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞等）和基因修饰的干细胞（如造血干 细胞、多能诱导干细胞等）等。 三、总体考虑 非临床研究是药物开发的重要环节之一。对于基因修饰 细胞治疗产品，充分的非临床研究是为了：1）阐明基因修饰 的目的、功能以及产品的作用机制，明确其在拟定患者人群 中使用的生物学合理性；2）为临床试验的给药途径、给药程 序、给药剂量的选择提供支持性依据；3）根据潜在风险因素， 阐明毒性反应特征，预测人体可能出现的不良反应，确定不 良反应的临床监测指标，为制定临床风险控制措施提供参考 依据。因此，应充分开展非临床研究，收集用于风险获益评 估的信息，以确立拟开发产品在目标患者人群中预期具有合 理的、可接受的风险获益比，同时为临床试验的设计和风险 控制策略的制定提供支持性依据。 由于不同基因修饰细胞治疗产品的细胞的来源、类型、 生物学特性、基因修饰方式/技术、生物学功能/作用方式、生 产工艺、非细胞组分等各不相同。在制定非临床研究计划时， 除参考《细胞制品研究与评价技术指导原则》中的对细胞制 品的一般要求外，还应具体问题具体分析，基于产品特点和 目前已有的科学认知，结合拟定适应症、患者人群、给药途 径和给药方案等方面的考虑，科学合理的设计和实施非临床 试验，充分表征产品的药理学、毒理学和药代动力学特征。 在进行风险获益评估时，还应重点关注由非临床向临床过渡 时非临床研究的局限性和风险预测的不确定性。 四、受试物 非临床试验所用受试物应可充分代表临床拟用样品的 质量和安全性，确证性非临床试验应尽可能采用临床拟用 基因修饰细胞治疗产品作为受试物。体外、体内非临床试 验所使用的样品均应符合相应开发阶段的质量标准要求。 应阐明非临床使用样品与临床拟用样品的异同及其对人体 有效性和安全性的可能影响。 在某些情况下，受种属特异性的限制，可考虑采用替 代产品（表达动物同源基因的人源细胞产品或动物源替代 细胞产品）。替代产品应与临床拟用产品采用相似的生产工艺，并对可能影响有效性和安全性的关键质量参数进行对 比研究，以评估替代产品与临床拟用产品的质量相似性及 其对非临床数据预测性的影响。 五、动物种属/模型选择 进行非临床体内试验时，应选择相关的动物种属/模型。理想状态下，基因修饰细胞应能以其预期的作用方式在所选 择的动物中表现出在拟用患者人群中所期望的功能活性。因 此，选择相关动物时需要考虑产品的特性以及临床拟用情况， 包括但不限于以下因素：1）动物病理生理学特征与拟用患者 人群的相似性；2）动物对基因修饰细胞及导入基因表达产物 （若有）的生物学反应与预期的人体反应的相似性；3）动物 对异种来源的基因修饰细胞的免疫耐受性；4）临床拟用递送 /给药方式的可行性。 由于免疫排斥反应以及细胞和/或导入基因的种属特异性，常规标准实验动物很可能并不适用，而免疫缺陷动物、 转基因动物或采用同源替代产品作为受试物可能会更合适。 对于某些作用机制涉及与疾病环境相互作用的基因修饰细 胞（例如CAR-T细胞），可能需要采用疾病模型动物。采用疾病模型动物进行的非临床研究可提供活性和毒性的剂量 关系信息，可更好的评估基因修饰细胞产品的风险获益比。每一种动物种属/模型均有其优点和不足，没有一种模型可完美预测基因修饰细胞在患者人群中的有效性和安全性， 应评估并阐明非临床研究所采用的动物种属/模型与人体的 相关性和局限性，建议采用多种动物/模型开展研究。当缺少 相关动物模型时，可采用基于细胞和组织的模型（如2D和 3D组织模型、类器官和微流体模型），这些模拟人体内环境 的模型也可为有效性和安全性的评估提供有用的补充信息。 六、概念验证 对于基因修饰细胞治疗产品，除应参照《细胞制品研究 与评价技术指导原则》的要求进行药效学研究外，还应进行 概念验证试验，阐明对细胞进行基因修饰的理由和可行性。通常，对细胞进行基因修饰的理由可能包括但不限于：1）引 入突变基因的功能拷贝以纠正遗传性疾病；2）改变/增强细 胞的生物学功能；3）引入一个安全开关，以在必要时能够清除细胞。应根据基因修饰的目的，进行相应的体外和体内验 证试验，证明可达到基因修饰的目的。 概念验证试验评估终点可能包括：1）对细胞基因组修饰的特异性；2）引入的外源调控序列对内源基因表达的影响， 或转基因的表达及功能活性；3）基因修饰对细胞正常行为和 生理功能的影响（如对扩增、分化能力的影响，对T细胞激活 和杀伤活性的影响等）。设计概念验证试验时，应考虑设置合 适的平行对照（如未修饰的细胞）。 虽然体外试验可在一定程度上验证基因修饰细胞的设 计理念和拟定作用方式，但对于功能复杂的活细胞，仅依靠 体外试验并不足以预测基因修饰细胞的体内行为和功能。因 此，除非有充分的理由，均应尽可能考虑进行体内概念验证 试验。在设计体内概念验证试验时，建议采用疾病模型动物。对于预期在人体内会长期存续或长期发挥功能的基因修饰 细胞，如果缺乏相关的动物模型，建议采用替代产品进行体 内概念验证试验，在足够的、可行的时间窗内评估基因修饰 细胞的长期效应。 七、药代动力学 参考《细胞制品研究与评价技术指导原则》中的对细胞 制品药代动力学的一般要求，采用相关动物模型开展药代动 力学试验以阐明基因修饰细胞在体内的命运和行为（包括生 物分布、归巢、定植、增殖、分化和持续性）。这些试验可以 单独开展，也可以整合到概念验证试验和/或毒理学试验中。若基因修饰细胞表达的转基因产物可分泌到细胞外，应 阐明其在局部和/或全身的暴露特征。 八、非临床安全性（一）总体安全性考虑 在评估产品的整体风险时，除参考《细胞制品研究与评 价技术指导原则》中对细胞制品的一般要求外，还应重点关 注基因修饰所可能带来的风险，如表达转基因的风险、基因 编辑脱靶风险、载体插入突变风险、载体重组风险等。在制 定非临床安全性评价策略时，应基于每个产品的特点，具体 问题具体分析考虑因素包括但不限于：1）临床拟用适应症、 目标患者人群和临床给药方案；2）细胞的来源、类型及其在 体内的细胞命运；3）基因修饰目的、方式及技术；4）作用 方式/机制或预期的功能活性；5）激起免疫应答能力/免疫耐 受能力；6）产品的质量因素；7）已有的非临床/临床数据；8）类似产品的已知有效性和安全性信息。 （二）基因表达产物的风险评估 通常，导入基因会随基因修饰细胞的存在而持续表达， 对于有复制能力的细胞，导入基因还可能会随细胞的增殖而 过度表达，导致基因表达产物的蓄积，进而导致毒性。因此， 若基因修饰细胞编码导入基因，应在体内试验中评估导入基 因表达产物的毒性风险。在设计试验时，应根据导入基因的 表达情况和功能活性设计试验期限和必要的终点指标，考虑 因素包括：1）基因表达水平和持续时间；2）基因表达产物 的分布部位；3）基因表达产物的功能活性。一些转基因（如生长因子、生长因子受体、免疫调节物等）若长期持续表达， 可能会导致长期安全性风险担忧，如导致细胞非受控的生长、 恶性转化等不良反应。因此，对于长期持续表达或具有长期 效应的转基因修饰细胞，非临床安全性研究的期限应足以评 估其长期安全性风险。为确定基因表达产物的量效关系，解 释预期和非预期的试验结果，建议在试验中伴随对导入基因 表达水平的定量检测（如采用Q-PCR或ELISA法）以及免疫 原性（ADA）检测。 （三）插入突变风险评估 一些整合性载体（如逆转录病毒、慢病毒、转座子）可 将外源基因插入整合到细胞基因组中，这可能会导致关键基 因突变或激活原癌基因，从而导致恶性肿瘤风险增加。 影响插入突变的关键风险因素包括：1）载体的整合特征， 即插入位点的偏好性；2）载体的设计，如增强子、启动子等构建元件的活性，反式激活邻近基因的潜力；产生剪接突变 体的潜在剪接位点或多聚腺苷酸信号等；3）载体剂量；4）导入基因表达产物的功能活性（如与细胞生长调控相关）和 表达水平；5）靶细胞群的转化可能性，这可能与细胞的分化 状态、增殖潜力、体外培养条件和体内植入环境等有关。 基于已有科学经验和既往非临床/临床研究结果，如果认为基因修饰细胞所采用的载体系统可将外源基因整合到细 胞基因组中并可在体内长期存续，需综合分析以上风险因素， 评估潜在的插入突变风险和致癌性风险。非临床方面，应采 用具有代表性的基因转导细胞进行基因整合位点分析，分析 细胞的克隆组成以及在关注基因（如肿瘤相关调控基因）附 近有无优先整合迹象，含有关注整合位点的细胞有无优先异 常增殖。此外，还应在临床试验中频繁检测转导细胞的基因 插入位点和克隆性来监测和减轻与基因插入突变相关的致 癌性风险。 （四）载体动员（Vector mobilisation）和重组风险评估 应基于载体的选择、载体的设计、目标转导细胞群以及 目标患者人群评估载体与内源性病毒重组和动员的风险。如 果有证据显示此类风险增加，应开展相应的非临床试验评估 载体动员和重组的风险。 九、对特定类型基因修饰细胞产品的特殊考虑 （一）基因修饰的免疫细胞（CAR或TCR修饰的T细胞/NK细胞） 对于CAR或TCR修饰的免疫细胞，应尽可能采用多种方法评估其靶点相关毒性和脱靶毒性风险，如采用合适的动物 模型或体外方法、计算机预测等。 应采用体外方法深入分析靶抗原在人体器官、组织和细 胞中的表达分布情况，基因表达分析库和文献调研也可能会 有助于阐明靶抗原在不同病理生理状态下的表达是否存在 差异。应采用表达和不表达靶抗原的细胞作为靶细胞进行体 外试验，确认CAR或TCR修饰的免疫细胞可特异性的识别和 杀伤靶细胞。 对于CAR修饰的免疫细胞，应采用体外方法（如人质膜蛋白阵列技术等）评估其胞外抗原识别区（一般为抗体的单 链可变区片段）与人体膜蛋白的脱靶结合风险。 TCR修饰免疫细胞的脱靶毒性可通过评估TCR与人体自身抗原肽的交叉识别能力来评估。首先，应采用体外试验测 定TCR修饰的免疫细胞与人自身抗原肽-HLA（与递呈靶抗原 肽的HLA等位基因相同）复合物的亲和力，并说明抗原肽的 选择依据及选择范围。此外，还应研究其他相关或不相关的 蛋白中是否含有靶抗原肽序列。如果TCR与人自身抗原肽有 交叉反应可能，应确定靶抗原肽的最小识别基序（motif），并 采用计算机预测分析评估交叉反应性。如果计算机预测可识 别出具有潜在交叉反应性的抗原肽，应在体外测定TCR修饰 免疫细胞对表达相应蛋白或递呈相应抗原肽的的细胞的识 别能力。如果不能排除交叉反应性，应基于含有潜在交叉反 应性抗原肽的蛋白的表达模式以及TCR与潜在交叉反应性抗 原肽的亲和力来进行风险评估。为获得TCR与其他等位HLA 潜在交叉反应性的信息，应进行足够的HLA交叉反应性筛选。对于TCR修饰的T细胞，还应关注引入TCR链和内源性 TCR之间的错配可能性，应描述和说明旨在降低错配可能性 的TCR设计策略。 （二）诱导多能干细胞（iPS）来源的细胞产品 iPS细胞自身具有致瘤性风险，在体内可形成畸胎瘤。因此，非临床试验中应考虑进行致瘤性试验。体内致瘤性试验 建议采用掺入未分化iPS细胞的细胞产品作为阳性对照，以确 认实验系统的灵敏度。如果iPS细胞设计了自杀机制，应在体 内试验中确认/验证这种自杀机制的功能。 重编程可能会诱导细胞的表观遗传学改变，其后果尚不 完全清楚。为评估iPS细胞衍生细胞的表观遗传学改变所引起 的潜在异常特征，应采用体外和/或体内非临床试验来阐明细胞具有适当的行为和生理功能，毒理学试验还应评估细胞异 常行为引起的不良反应。应结合质量表征数据、非临床安全 性数据以及文献数据进行深入的风险评估，并就旨在保护患 者安全的风险减轻措施进行讨论。如果发现遗传学和/或表观 遗传学改变，应解决相应的安全性问题。 （三）基因编辑的细胞产品 对于基因编辑的细胞产品，应采用相关细胞进行体外在 靶和脱靶活性评估，以确认修饰酶或向导RNA对靶基因序列的特异性。虽然计算机分析可用于预测基因编辑的脱靶风险， 但选择的评价策略仍应包含体外全基因组测序比对，以证明 潜在脱靶位点未出现脱靶。应说明所选择的评价策略的合理 性和敏感性。此外，在评估脱靶活性时，还应评估种属特异 性的差异、细胞（病理）生理状态的差异或细胞类型的差异 对非临床数据预测性的影响。必要时，还应分析基因编辑对 细胞表型和生理功能的潜在影响。 参考文献 1. 细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行），NMPA， 2017年. 2. Quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing geneticallymodified cells. EMA, 2020. 3. Preclinical Assessment of Investigational Cellular and Gene Therapy Products. FDA, 2013. 4. Guideline on Quality, Non-clinical and Clinical Requirements for Investigational Advanced Therapy Medicinal Products in Clinical Trials. EMA, 2019. 5. Long Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products. FDA, 2020. 6. Guideline on the Non-Clinical Studies Required Before First Clinical Use of Gene Therapy Medical Products, EMA, 2008. 基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）.pdf征求意见反馈表.docx

医学领域是否为临床crispr基因编辑的到来做好了准备？ crispr-cas9能够以多个重要的方式来潜在地转化医学，首先该技术能够帮助科学家们对多种哺乳动物机体中的基因进行“裁剪”来产生用于研究人类健康和疾病发生的模型，此前科学家仅能够在小鼠机体中使用该技术，但基因编辑技术使得他们能够更加精准地修饰几乎所有哺乳动物机体的基因组。由于猪的心脏或者猴子的大脑更类似于人类机体中相应的器官，这或许就能够帮助研究者通过研究来理解心脏病和多种精神疾病发生背后的遗传基础和分子机制，但这往往也是具有一定的争议性，因为很多人反对对灵长类动物进行实验操作。基因编辑影响医学进展的另一种方式就是通过促进对人类细胞生理学和病理学过程的研究，利用基因编辑技术在体外准确地操作人类细胞的基因组，就能够帮助我们鉴别出参与参与正常人类生理学过程以及多种人类疾病发生的关键基因，笔者在他最近新出版的一本名为“redesigning life： how genome editing will transform the world”的书中探讨了crispr-cas9基因编辑技术的应用和转化。当然一项让科学家们非常感兴趣的发展就是基因编辑技术和干细胞技术的合集，多潜能干细胞(pluripotent stem cells)有潜力发育为任何类型的细胞，其能够以胚胎干细胞（es）的方式从人类胚胎中分离出来，或者通过激活成体细胞的特殊基因来产生诱导多能干细胞（ipscs）。 近日有科学家诱导胚胎干细胞和诱导多能干细胞使其发育成为类器官，类器官是一种类似机体组织的结构，比如类似于机体眼睛、肠道、肾脏、胰腺、前列腺、肺部、乳腺，甚至大脑等组织，而基因编辑技术就使得科学家们对类器官操作成为了可能，这就能够帮助研究者更加深入地理解人类胚胎发育的奥秘，并且也能够帮助研究者开发研究疾病的模型以及药物筛选平台。来自威斯康星大学麦迪逊分校的研究人员su-chun zhang今年夏天就在一份声明中指出，人类干细胞和基因编辑技术联姻将能够给科学界带来革命性的变革；而来自加利福尼亚大学的科学界pablo ross带领的研究团队通过研究则发现，利用crispr-cas9技术就能够对猪胚胎进行编辑从而使猪长出胰腺。将人类诱导多能干细胞注入胚胎中就能够促进这种初步人类胰腺组织的生长，ross告诉bbc，我们希望这种猪的胚胎能够正常发育，但胰腺几乎完全由人类细胞产生，而且其也能够很好地应用于患者的胰腺移植。 对干细胞进行工程化操作来产生能够用作器官移植的人类器官是基因编辑的一个潜在方向，另外一个方向就是利用该技术来纠正隐藏在多种人类疾病背后的遗传缺失；近日就有研究表明，利用基因编辑技术就能够修复编码肌营养不良蛋白和亨廷顿蛋白基因的缺失，而这两种蛋白往往能够诱发杜氏肌营养不良和亨廷顿氏症；基于能够对动物进行成功研究和试验，美国监管机构就为临床试验亮了绿灯，鼓励科学家们利用基因编辑技术来治疗癌症，同时科学家们也考虑利用基于crispr的疗法来治疗一系列的遗传性失明。目前部分crispr应用进入到临床仍然存在一定的争议，当然就有科学家们对于基因疗法的潜在风险展开了激烈地辩论，美国西北大学的生物论理学家laurie zoloth近日就告诉nature杂志，任何在人类中第一次使用的方法我们都必须格外小心，当然科学家们非常关心的问题就是是否基因编辑能够足够准确地靶向作用基因缺失位置，同时还不会产生对基因组其它位置的不利脱靶效应，是否引入人类细胞，比如将诱导多能干细胞引入到猪体内，能够影响宿主的大脑发育或者产生其它副作用，抑或者是在受体动物体内产生脱靶效应；来自斯坦福大学的研究者mildred cho则认为，对动物的研究截止到目前为止仅仅需要进行临床研究即可，当然通常情况下我们都很想为了我们的信仰大干一场。

生物技术重大发现的历史时间表。图片来源：韩国基础科学研究所　　科技创新世界潮韩国基础科学研究所（IBS）基因组工程中心研究人员开发了一种新的基因编辑平台，称为类转录激活因子效应相关脱氨酶（TALED）。TALED是能够在线粒体中进行A到G碱基转换的碱基编辑器。这一发现是长达数十年治愈人类遗传疾病之旅的结晶，而TALED，也被认为是基因编辑技术中最后缺失的一块拼图。研究成果发表在最新一期《细胞》杂志上。“基因剪刀”的魔力与缺憾从1968年第一个限制性内切酶的发现、1985年聚合酶链式反应的发明到2013年CRISPR介导的基因组编辑的示范，生物技术的每一个新突破发现都进一步提高了操纵DNA的能力。特别是，新近开发的CRISPR—Cas系统（“基因剪刀”）允许对活细胞进行全面的基因组编辑。这为通过编辑人类基因组中的突变来治疗以前无法治愈的遗传疾病开辟了新的可能性。虽然基因编辑在细胞的核基因组中取得了很大的成功，然而，科学家们在编辑拥有自己基因组的线粒体方面并不成功。线粒体，即所谓的“细胞的动力室”，是细胞中的微小细胞器，充当能量产生工厂。由于它是能量代谢的重要细胞器，如果基因发生突变，则会导致与能量代谢相关的严重遗传疾病。韩国IBS基因组工程中心主任金镇秀解释说：“由于线粒体DNA缺陷，出现了一些非常严重的遗传性疾病。例如，导致双眼突然失明的Leber遗传性视神经病变是由线粒体DNA中的简单单点突变引起的。”另一种线粒体基因相关疾病包括伴有乳酸性酸中毒和卒中样发作的线粒体脑肌病，它会缓慢破坏患者的大脑。一些研究甚至表明，线粒体DNA异常也可能是阿尔茨海默病和肌肉萎缩症等退行性疾病的原因。线粒体DNA可以编辑了线粒体基因组遗传自母系。线粒体DNA中有90个已知的致病点突变，总共影响至少5000人中的1人。由于向线粒体递送方法的限制，许多现有基因组编辑工具无法使用。例如，CRISPR—Cas平台不适用于编辑线粒体中的这些突变，因为引导RNA无法进入细胞器本身。另一个问题是缺乏这些线粒体疾病的动物模型。这是因为目前不可能设计出创建动物模型所需的线粒体突变。”金镇秀补充道，“缺乏动物模型使得开发和测试这些疾病的治疗方法变得非常困难。”因此，编辑线粒体DNA的可靠技术是基因组工程的前沿领域之一，为了征服所有已知的遗传疾病，必须探索这一前沿领域，世界上最优秀的科学家多年来一直在努力使其成为现实。2020年，由美国哈佛大学博德研究所和麻省理工学院刘如谦领导的研究团队创建了一种新的碱基编辑器，名为DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器，可从线粒体中的DNA进行C到T转换。这是通过创造一种称为碱基编辑的新基因编辑技术来实现的，该技术将单个核苷酸碱基转化为另一个碱基而不会破坏DNA。但是，这种技术也有其局限性。它不仅仅限于C到T转换，而且主要限于TC基序，使其成为有效的TC-TT转换器。这意味着它只能纠正90个已确认的致病性线粒体点突变中的9个，也就是10%。长期以来，线粒体DNA的A到G转换被认为是不可能的。研究第一作者赵兴义说：“我们开始思考克服这些限制的方法。因此，我们创建了一个名为TALED的新型基因编辑平台，可实现A到G的转换。我们的新碱基编辑器极大地扩展了线粒体基因组编辑的范围。这不仅可为建立疾病模型作出巨大贡献，还可为开发治疗方法作出巨大贡献。值得注意的是，其在人类mtDNA中能够进行A到G的转化可纠正90种已知致病性突变中的39种，约为43%。”研究人员通过融合三种不同的成分创造了TALED。第一个组分是转录激活子样效应子，它能够靶向DNA序列。第二个组分是TadA8e，一种用于促进A到G转化的腺嘌呤脱氨酶。第三个组分DddAtox，是一种使DNA更容易被TadA8e获取的胞嘧啶脱氨酶。TALED的一个有趣的方面是TadA8e在具有双链DNA的线粒体中执行A到G编辑的能力。这是一种神秘的现象，因为TadA8e是一种已知仅对单链DNA具有特异性的蛋白质。金镇秀说：“以前没有人想过使用TadA8e在线粒体中进行碱基编辑，因为它应该只对单链DNA具有特异性。正是这种跳出框框的思维方法真正帮助我们发明了TALED。”诺贝尔奖级别的成果研究人员推测，DddA tox允许通过瞬时解开双链来访问双链DNA。这个转瞬即逝的临时时间窗口允许TadA8e作为一种超快作用的酶，快速进行必要的编辑。除了调整TALED的组件外，研究人员还开发了一种能够同时进行A到G和C到T碱基编辑以及仅进行A到G碱基编辑的技术。研究团队通过创建包含所需mtDNA编辑的单个细胞衍生克隆来展示这项新技术。他们发现TALED既不具有细胞毒性，也不会导致mtDNA不稳定。此外，核DNA中没有不良的脱靶编辑，mtDNA中的脱靶效应也很少。研究人员现在的目标是通过提高编辑效率和特异性来进一步改善TALED，最终为纠正胚胎、胎儿、新生儿或成年患者中的致病mtDNA突变铺平道路。研究团队还专注于开发适用于叶绿体DNA中A到G碱基编辑的TALED，叶绿体DNA编码植物光合作用中的必需基因。基础科学研究所科学传播者苏威廉称赞道：“我相信这一发现的意义可与2014年获得诺贝尔奖的蓝色LED的发明相媲美。就像蓝色LED是让我们拥有高能效白光LED光源的最后一块拼图一样，预计TALED将迎来基因组工程的新时代。”

p style=" text-align: center " img title=" 001.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/c0290159-fbc4-4ab5-91e7-f62c88308bf5.jpg" / /p p 　 strong 　新闻事件 /strong /p p 　　昨天基因泰克宣布将与DiCE Molecules合作开发小分子药物。DiCE的技术平台是DNA编码化合物库(DEL)合成、指导演化、组合化学的复合体，从几亿到上十亿的化合物开始、利用独特优化系统号称可以为任何靶点找到类药配体。这个合作主要研究现在公认的非成药靶点。根据协议，DiCE将获得一定首付和各种里程金，但具体金额都没有公开。 /p p 　　 strong 药源解析 /strong /p p 　　DiCE 是斯坦福大学Pehr Harbury教授于2013年创建的新技术公司，主要利用DEL技术搜索化学空间，为困难靶点寻找小分子配体。去年已经与赛诺菲签订了5年、最多12个靶点的合作计划，获得5000万首付和潜在每个靶点1.8亿各种里程金(总额可达23亿)。昨天是第二次与大药厂合作。 /p p 　　第一代DEL只是用DNA作为一个条形码记录每个化合物的合成历史。这与其它条形码、如不同长度的烷烃没有本质区别，但因为DNA可以通过PCR放大所以反应可以用很少量反应物、因此DEL库可以非常大，上10亿的库并不困难。后来David Liu等人利用DNA的互补双链不仅标记反应物、还可以作为模板控制哪些反应物参加反应。Liu创建了Ensemble并与多家大药厂合作开发困难靶点药物，但今年宣布解散。DEL到目前为止最大的成功据我所知是葛兰素的RIP抑制剂。这个发现不仅利用了DEL，而且还有很多其它最前沿的药物化学技术，值得大家学习一下(这里)。找到的RIP抑制剂选择性和其它性质在激酶抑制剂里确实非常优秀。 /p p 　　DiCE的平台虽然细节很少，但号称是加上筛选压力和遗传变异机制。选择压力比较容易想象，所有筛选平台都要找到个别“适者”、多数情况下就是与靶标蛋白结合的化合物，然后淘汰绝大多数不合时宜的化合物。DiCE的平台是多轮DEL合成。所谓遗传大概是指保留苗头化合物的需要性质，变异则应该是改变分子的某个模块。和天然蛋白只有20个氨基酸不同，DEL的模块可以远远多于20个。这个过程也可能重复合成第一代化合物库里面已经包括的化合物，但更系统的SAR可以增加筛选准确性(去除假阳性、回收假阴性)。 /p p 　　DEL可以在更广阔化学空间更高效筛选先导物，但适合DEL的化学反应是有限的、每个化学反应可以买到的起始原料是有限的。DEL涵盖的空间很大、但对寻找新药不一定最重要。虽然很多技术号称可以合成天然产物类似物，但多数只能合成简单的分子类型，DiCE似乎还只能合成多肽类似物。当然更重要的障碍是筛选压力(即优化系统)。优化指标现在还基本是一本糊涂账，我们即不知道哪些性质候选药物需要有、也不知这些万里挑一的化合物有哪些致命隐私。对于抗体药物选择性可以比较可靠地假设已经合格，但小分子药物城府要深得多，经常在关键时刻才交代脱靶活性。虽然GSK的RIP1抑制剂说明DEL可能非常有用，但Ensemble的倒闭也说明DEL也只是诸多技术中的一个。 /p p /p

干细胞中胰岛素分泌细胞只占0.1%一0.5%，这远远不能满足糖尿病移植的需。获得的脱靶细胞越多，治疗上相关的细胞就越少，潜在风险性越大。干细胞治疗不存在短期危害，但容易导致胰腺癌，肝细胞癌的潜在风险性增高☆1，难以达到临床标准或满足临床需求。干细胞异群miRNA可通过时空隧道技术，通过分子之间耦合作用，快速传递给采集到的缺陷胰岛分泌细胞上，帮助其修复，并通过时间机器里微环境作用快速使胰岛α细胞向β细胞转化，促进胰岛β细胞的修复。干细胞时空隧道技术突破糖尿病瓶颈，为彻底治愈糖尿病提供了新方法。1. 干细胞治疗的未来前景近年来，糖尿病发病率“爆炸式”增长，并呈年轻化趋势。糖尿病并发症造成心、脑、肾、血管、神经等多脏器损害，已成为危害人民群众生命健康的第三号杀手。但随着基因技术、细胞技术和材料技术的进步，干细胞在治疗糖尿病显示了灿烂的前景，为糖尿病患者治疗提供了新的可期待的治疗途径。美国《时代》杂志把干细胞治疗糖尿病列为改变未来十年医疗的12大创新发明之一。在治疗糖尿病的领域里，干细胞的潜力得到充分认可。人类有望在不久的将来突破干细胞治疗糖尿病瓶颈，彻底治愈糖尿病。2.干细胞治疗糖尿病存的问题与挑战干细胞治疗糖尿病，目前主要有三种方法：自体骨髓干细胞移植、自体血液干细胞移植和脐血干细胞移植。干细胞技术的发展，组织工程的进步，再加上生物材料的发展，使得其离临床转化越来越近，成为最有潜力的糖尿病替代治疗策略。然而，干细胞治疗糖尿病关键技术和核心问题仍有待深入研究。第一，干细胞分化为胰岛细胞所使用的方法相当复杂，存在其分泌胰岛素的能力较低的现象。如需达到良好的降糖效果，需要的细胞数量非常庞大。实验证明， 人胚胎干细胞（ESC）在体外培养自发分化形成的细胞中胰岛素分泌细胞只占0 . 1%一0 . 5%。这远远不能满足糖尿病移植的需求，需要大约十亿个β细胞才能治愈一个糖尿病人。但是，如果制造的细胞中有四分之一实际上是肝细胞或其他胰腺细胞，而不是需要十亿个细胞，那么将需要12.5亿个细胞，这使治愈该疾病的难度提高了25％。获得的脱靶细胞越多，治疗上相关的细胞就越少☆2。第二，诱导后的胰岛细胞在体内能否长期存活，仍是未知数。第三，干细胞诱导后的胰岛细胞如何与体内原有的胰岛细胞协同工作，都是目前尚未解决的难题。相关文献也报道过干细胞治疗可能会导致肿瘤的发生发展。因此干细胞治疗糖尿病面临着许多困难和障碍。间充质干细胞外泌体，体外胰岛β细胞培育法或直接输入注射疗法治疗糖尿病技术，获得的脱靶细胞太多，如果不改变传统过旧的操作模式，以及干细胞过度治疗，则容易导致胰腺癌、肝细胞癌的潜在风险性，是难以达到临床标准或满足临床需求的。3.干细胞时空隧道技术我们研究发现虽然间充质干细胞是不同的细胞群，分泌不同的细胞外泌体miRNA等，但它们个个都具有强大的细胞生长因子。虽然胰岛素分泌细胞只能占0.1%一0.5%，但我们可以用一种独特形式方法，使所有不同细胞群体的miRNA快速转化成为同一胰岛细胞的方法。利用超滤膜可以从中筛选出专一人体内采集的β细胞及其分泌体miRNA；其它不同群细胞miRNA可在时间机器里，通过分子之间耦合作用，快速传递给采集到的缺陷胰岛素分泌细胞上,帮助其修复，并通过胰岛局部微环境作用诱导胰岛α细胞向β细胞转化，促进胰岛β细胞的修复。诸多研究表明，干细胞时空隧道技术能将2型糖尿病胰岛受损的功能性治疗提高到80%左右。生命时空隧道技术为干细胞治疗糖尿病临床应用打开了一扇新的窗口。生物时间机器一细胞时间隧道透析机，大体可以分为时间透析膜隧道系统、时间透析柱内外系统、细胞时间监测系统(DNA蛋白质能量监测仪系统)、自动温度控制系统、时间透析机机械系统等五个部分组成。将间充质干细胞、外泌体加进在生物时间机器透析外柱內，对透析柱內的人体内采集的缺陷胰岛素分泌细胞，通过溶液及半透膜在时间机器中进行生长因子、激发态物质交换，然后再回输到人体内修复改造胰岛β细胞的方法。将部分干细胞诱导分化，形成初级胰岛β细胞，然后在C臂监控下用导管经腹腔动脉送抵达患者胰腺，或微创手术与胰腺中部位建立起时空隧道技术，或将时空隧道技术改造的β细胞，自体干细胞移植于患者胰腺。人体内采集的细胞与时间机器交换后可监测安全有效性，生成胰岛增强β细胞后可再进一步纯化分离，然后再安全回输到患者胰岛细胞上,帮助其修复。利用细胞时间隧道透析机与胰岛组织缺陷β细胞进行胞质效应交换，能生产出强大的胰岛素分泌细胞，是干细胞再生医学崭新的方法。本文作者：严银芳 武大医学部病毒学研究所武汉市武昌东湖路115号联系电话 15927431505参考资料☆1人脐带间充质干细胞治疗乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的危险因素分析 http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-XDKF201809009.htm☆ 2多能干细胞转化为胰岛素的β细胞“治愈”1型糖尿病的小鼠https://k.sina.com.cn/article_5895622040_15f680d9802000v9bn.html

单细胞测序被评为2013年年度技术 　　单细胞测序 　　近几年来，基于单细胞测序技术的科学研究取得了突飞猛进的发展，其成果有望为一些重要的医学问题提供新的解决方案。文章总结了2013年单细胞测序技术对于人类早期发育、癌症以及神经科学研究等几个重点领域的最新应用成果。文章特别指出，来自中国北京大学的一些研究团队在这方面完成了许多优秀的工作，做出了突出的贡献。 　　单细胞基因组扩增新技术(MALBAC)最早由哈佛大学谢晓亮教授发明，相关论文2012年发表于《科学》 (Science)杂志。该方法通过形成闭合环来抑制DNA片段被重复地复制，以保持DNA扩增的均匀性，解决了传统方法对单细胞基因组扩增的强烈偏好性的问题。这项突破在单个细胞水平实现了全基因组93%的高覆盖率，同时也能准确检测单个肿瘤细胞中的染色体拷贝数异常。 　　2013年是单细胞基因组学突飞猛进的一年。由谢晓亮教授创建的北京大学生物动态光学成像中心(BIOPIC)在这一领域做出了重要贡献。2013年谢晓亮教授哈佛大学课题组与北京大学BIOPIC李瑞强研究员小组合作，将MALBAC技术应用于人类单个精子基因组的测序研究中。他们对一个亚洲男性的99个精子进行了单细胞全基因组DNA扩增，并且利用高通量测序技术对每个精子分别进行了一倍深度的测序。这项工作首次实现了高覆盖度的单个精子的全基因组测序，构建了高精度的男性个人遗传图谱，相关论文发表在《科学》杂志上。 　　美国科学院院士、斯坦福大学教授Stephen Quake评价说：&ldquo 从PCR技术被发明的那天起，人们就在尝试将其应用于分析单个细胞的基因组和转录组，但是直到今天单细胞测序才开始迅速发展。&rdquo 　　单细胞检测技术在癌症研究中也开始发挥重要的作用。2013年12月， BIOPIC白凡研究员和谢晓亮教授团队与北京大学肿瘤医院的王洁教授团队合作共同在《美国科学院院刊》(PNAS)上发表文章，对于癌症病人单个外周血循环肿瘤细胞(CTC)的全基因组、外显子组进行了高通量测序，发现在某一类肺癌患者的所有循环肿瘤细胞中存在着一种特定的基因拷贝数变异(CNV)模式，而不同癌种CTC细胞的基因组拷贝数变异模式不同，为癌症的早期诊断提供了全新的契机。这也是国际上首次实现对外周血循环肿瘤细胞基因组的高通量测序，标志着利用循环肿瘤细胞基因组测序信息进行肿瘤无创诊断时代的到来。 　　由于人类早期胚胎中的细胞数目非常稀少而且很难获得，所以单细胞测序技术无疑对早期胚胎发育研究有着无可替代的重要意义。2013年12月，谢晓亮教授BIOPIC小组和汤富酬研究员小组以及北医三院的乔杰教授小组共同在《细胞》(Cell)上发表文章，对人类单个卵细胞进行了高精度全基因组测序研究。该研究首次详细描绘了人类单个卵子的基因组，建立了人类女性的个人遗传图谱。这一工作可以有效地帮助接受辅助生殖的女性同时检测并排除染色体数目异常的胚胎以及携带单基因突变的胚胎，从而在大幅度提高辅助生殖成功率的同时、降低严重先天性遗传缺陷婴儿的出生率，提高人口素质。目前，该研究团队正在尝试将这项技术应用于胚胎植入前遗传学诊断的临床试验中，获益于这一技术的第一个婴儿将在2014年出生，为这一技术途径的广泛应用带来了希望。 　　2013年，汤富酬研究组、李瑞强研究组与北医三院的乔杰教授合作，利用单细胞转录组测序技术，分析了不同时期的人类早期胚胎细胞的基因表达情况，这一研究发现了两千多个全新的可能参与早期胚胎基因表达调控的长非编码RNA。该项工作发表在《自然&mdash 结构与分子生物学》杂志上。基因的表达模式与DNA 的表观修饰有着密切的关系，因此，单细胞的DNA甲基化组分析可以用于研究癌症细胞的特异性机理，但是此前的标准方法只能做到同时分析50-100个细胞。而同样也在2013年，汤富酬课题组首次成功实现了单个细胞DNA甲基化组的测序分析。 　　表观遗传学专家Wolf Reik对单细胞测序分析的意义做出了充分肯定，他在2013年单细胞大会上说：&ldquo 我之前还不是单细胞团队中的一员，但是我很高兴看到各个领域被单细胞技术推动的如此之快，有了新的技术，我们将会解决更加激动人心的生物学问题&rdquo 。 　　文章指出，单细胞测序技术仍然在快速发展过程中，相信不久的将来将出现新一代更好的技术。科学家们期待在新技术的推动下，癌症、生殖发育、神经科学、免疫等领域能够有所突破。 　　CRISPR和基因组编辑 　　早在两年前，《Nature Methods》就将年度技术颁给了基因组编辑技术，理由是这种技术能通过在某些物种基因组中进行靶向特异性的突变，从而解答并提出更多精确的生物学问题。CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复)无疑是这一领域的新生力量，也再次掀起了基因组编辑的热潮。 　　向导RNA/Cas9核酸酶复合物克服了以往工具的某些限制。向导RNA很容易设计，让Cas9蛋白靶定基因组中几乎任何想要的区域。Cas9作为核酸酶或切口酶，在DNA上诱导断裂，随后用于基因敲除、标签插入或基因替换。事实上，Cas9的潜力远远不止DNA切割。 　　在《Nature Methods》10月刊上，哈佛大学的研究人员发表文章称，作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是目前已知的第一个统一因子(unifying factor)，能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。1 在他们看来，这种工具有望扩展，在复杂的表观基因组上引入定制变化。 　　两个研究小组最近也利用更为成熟的TALE来修饰表观基因组。霍华德?休斯医学研究所的Bradley Bernstein及其同事就利用去甲基化酶/去乙酰化酶复合物来靶定增强子中的组蛋白标记，以探索它们在转录中的作用。2 而麻省理工学院的Feng Zhang博士则将TALE与光诱导系统相融合，来靶定组蛋白修饰酶，以改变表观遗传修饰。3 　　尽管这些方法很有前途，但TALE的定位比CRISPR/Cas9系统更为繁琐。将Cas9与任何选定的酶相融合，我们不仅可改变组蛋白修饰，从而改变染色质状态，还能影响DNA甲基化，实现全新的细胞功能调控。 　　然而，CRISPR/Cas9系统的特异性仍存在问题。向导RNA序列比ZFN或TALEN所靶定的大部分序列更短，这意味着脱靶效应的几率更高。近期发表的一些文章也证明了脱靶效应是真实存在的。 　　《Nature Methods》编辑Nicole Rusk认为，CRISPR是否能被精心打造成编辑表观基因组的手术刀，而不必担心脱靶效应，这在不久的将来就会清楚。 　　原位测序 　　新一代测序技术在RNA测序上的应用已带来RNA内容的更全面了解。然而，现有的RNA测序技术是基于纯化好的核酸，却丢失了序列的空间背景。原位测序(In situ sequencing)有望更深入地了解细胞的基因表达程序及形态与局部环境之间的关系。《Nature Methods》编辑Tal Nawy认为，尽管预测这一技术的最终形式和潜力还为时过早，但目前已开始朝这一方向努力。 　　原位杂交等方法一直用于定位完整细胞和组织中的序列，但其限制在于必须清楚目标序列。在测序方面，许多技术都利用基于光的读取，这表明它们可能与完整组织的成像相兼容。但扩增和测序反应需要特殊的底物，或需要在乳液中彼此分离。 　　去年10月，瑞典斯德哥尔摩大学的研究人员在《Nature Methods》上发表了一种新策略：滚环扩增(rolling circle amplification)。这种方法依赖一种锁式(padlock)探针，它与目标序列的任一侧杂交，以形成环状模板，进行复制。由于产物是拴在模板上的，这提供了可靠定位，并可通过连续的寡核苷酸探针掺入，实现原位测序。 　　这是第一次实现了在细胞或者组织中对目的RNA分子进行测序，极大地保留了RNA分子的位置信息。也就是说，得到序列的同时，我们还能够知道这些序列来自哪些细胞或者组织的哪个部位。 　　目前，这种技术仍处于原理验证的阶段。虽然测序长度只有4个碱基，但已经可用来检测基因组中一些存在突变的短序列。研究人员以HER2转录本阳性的人乳腺癌组织为样本，证明了转录本片段的测序可在组织切片中直接开展。 　　今后，有必要增加单细胞中可被拷问的转录本数量和序列长度，以及平衡图像分辨率和组织范围的成像能力。在这一放大过程中，图像配准方法是关键要素，而定量与形态关联的工具也是必要的。 　　这一技术的最终目标是测序多个位点，甚至是转录组或基因组中大的片段，但这仍需要解决信号密度的问题：在如此狭小的空间内，细胞包含了太多可被成像的信息。未来，我们有望看到测序与生物学背景的更紧密连接。 　　迷你胞内探针 　　追踪小的分子并干扰其活性对了解活细胞如何工作很有用。随着显微镜分辨率的提高，更多细胞进入到我们的视线。在这一背景下，选择合适的探针就更为关键。于是，《Nature Methods》将目光投向一些细胞内的迷你粘合剂(mini-binders)，认为它们值得关注。 　　对于细胞内蛋白的探针而言，什么最关键?首先，它们应当是目标特异的。其次，不干扰蛋白的功能、定位或表达。此外，它们还应该足够小，这样才能接近角落中的蛋白。研究人员认为，遗传编码的探针是首选，因为它们能轻松导入特定细胞或靶定细胞器。 　　针对这些要求，研究人员开始将注意力转向胞内抗体和适体。胞内抗体(intrabody)是指在细胞内表达并作用于细胞内组分的抗体。它们可从一些天然产生极小抗体的动物(如骆驼或鲨鱼)中获得，也可经大的哺乳动物抗体改造而来。适体(aptamer)是指与特定的目标分子结合的寡聚核酸或是肽链。适体常常从大量的随机序列被挑选出来，但天然的适体依旧存在如核糖开关中。 　　编码这些迷你粘合剂的基因可与其他遗传编码的元件或蛋白相融合，以监控或扰乱细胞内的组分和过程。美国南加州大学的研究人员就在《Neuron》报道了这样的成果。他们将胞内抗体与神经突触蛋白相结合，实时观察活神经元的突触。这使得研究人员首次观察到兴奋性和抑制性的突触。 　　瑞士巴塞尔大学的研究人员也开发出一种遗传编码的方法，来快速去除真核生物遗传体系中的绿色荧光蛋白(GFP)。这种基于纳米抗体的方法是通用的，因为它依赖进化上高度保守的真核功能-泛素通路。纳米抗体也被加州大学的研究人员所采用，来分析G蛋白偶联受体(GPCR)的动态构象变化。 　　此外，哈佛大学医学院的研究人员还以GFP为支架，将不同的分子组件组合在一起，驱动基因表达。他们以结合GFP的纳米抗体为基础，构建出一系列嵌合蛋白或融合蛋白结构域。当两种这样的融合蛋白被导入到细胞时，GFP将它们结合在一起，从而触发这些融合蛋白的相互依赖的活性。 　　《Nature Methods》编辑Erika Pastrana认为，这些探针的进一步优化将使其应用更方便、更广泛。鉴于它们的独特性质，这些迷你粘合剂无疑是生物学实验中大有前途的工具。 　　低温电子显微镜 　　低温电子显微镜(cryo-EM)虽然是结构生物学研究中的重要工具，但其潜力还未充分发挥出来。近期的技术进步大大提高了cryo-EM的分辨率，正在重振这一领域。 　　在单粒子cryo-EM实验中，大分子集合体被冷冻在一层薄薄的冰中，并用电子显微镜成像。单个集合体的数千至数百万幅图像必须经过计算机比对和合并，以获得一个三维结构。 　　与X射线晶体衍射相比，cryo-EM的一个明显优势就是不需要结晶，这大大拓宽了其研究领域，使生物大分子及其复合物的构象研究成为可能。运用这种方法，一些生物样品如病毒和大肠杆菌70S核糖体的三维重构图已经得到，但分辨率不是很高。 　　尽管人们早已认识到，cryo-EM有潜力达到原子级别的分辨率，但目前仍存在一些技术限制。它们包括难以产生足够量的样品，结构异质性，辐射损伤，电子束诱导的样品移动以及相机效率低。 　　不久之前，cryo-EM的用户只有两种选择来捕获电子显微镜的图像：低效的数字CCD照相机或不方便的照相胶卷。而直接检测电子的新型照相机实现了更快速、更高效的图像采集，解决了上述的一些限制。这些照相机记录了样品暴露于电子束过程中的一段视频，可通过帧同步进行校正。 　　2013年发表的两篇文章使用了这一策略。美国加州大学旧金山分校的研究人员利用一种新开发的单电子计数探测器，证实了电子束诱导的移动会大幅降低分辨率，并且，他们发现，快速读取与几乎无噪音的电子计数的组合使图像模糊得以校正，将图像信息恢复到高分辨率。这种方法大大提高了cryo-EM的图像质量和数据采集效率，实现了接近原子的分辨率。 　　英国医学研究委员会的研究人员也评估了新一代的直接电子探测器在cryo-EM结构测定上的潜力。利用一种新开发的statistical movie processing方法来补偿电子束诱导的移动，他们发现核糖体结构可达到接近原子的分辨率，而粒子比之前少了两个数量级。 　　结合快速改进的样品制备方法、繁重任务的自动化以及数据分析的新算法，单粒子低温电子显微镜有望为大分子集合体带来新的见解，而这正是结构鉴定上极具挑战性的一面。

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近年来，CRISPR被认为是最简单高效的基因编辑方式，也成为了生物技术发展史上进展最为迅猛的新兴技术之一。2022年6月，正值CRISPR发文十周年，Nature Biotechnology 同步发表了一篇名为《Knock-in on CRISPR' s door》的Reviw，梳理了10年来科学家们对CRISPR基因编辑技术不断探索突破的成果[1]。图1. 2022年6月Nature Biotechnology 发文基于CRISPR的基因疗法如火如荼基因治疗（Gene Therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。基因治疗以其一次给药终生治愈遗传疾病的独特潜力让一切不可能变为有可能。截止今日，通过对clinicaltrials.gov检索，全球已有56项基于CRISPR的临床试验正在进行，中国就有21项，占到3成以上。目前大部分的基因疗法为体外疗法（ex vivo），即细胞在体外通过CRISPR编辑后再输注到体内发挥功能，常见疾病如肿瘤免疫疗法CAR-T，遗传性疾病如地中海贫血，镰刀状贫血症血红蛋白遗传病等在内的各种血液病。与之相对的即体内疗法（in vivo）则是直接将治疗基因递送到患者病患部位，从而治疗疾病，目前已在先天性黑蒙、遗传性甲状腺转淀粉样变性和遗传性血管性水肿等疾病表现出巨大潜力。图2. 全球CRISPR临床试验分布热点图图源：clinicaltrials.gov基因编辑的发展历程早期基因编辑--ZFN和TALEN基因编辑技术主要发展了三代，早期的两代基因编辑主要以ZFN和TALEN为主，这两种基因编辑技术相对简单，可以理解为“基因剪刀”——切割特定 DNA 序列的限制酶。但ZFN技术存在很明显的缺点，如容易脱靶，且可能产生一系列不可预测的基因突变，引发细胞毒性。TALEN技术的出现，在一定程度上优化了ZFN技术存在的脱靶问题，具有设计简单，特异性和活性更高的优点，因此成为基因功能研究和基因治疗研究中有力的工具。美中不足的是，由于TALEN针对不同靶点，每次都需重复构建融合蛋白，因此会造成一定的工作繁琐。第三代基因编辑--CRISPRCRISPR/Cas9是继ZFN、TALEN之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。CRISPR/Cas9 系统由两部分组成，分别是Cas9 蛋白和guide RNA（single-guide RNA，sgRNA）。Cas9蛋白具有解旋酶活性，可以将DNA链解旋，同时具有核酸内切酶活性，可以切割DNA链。其原理是核酸内切酶 Cas9 蛋白通过向导 RNA （guide RNA, gRNA）识别特定基因组位点，并对双链 DNA 进行切割造成 DSB后，通过HDR和NHEJ实现基因的定向敲除或插入。图3. CRISPR/Cas9 示意图[2]相比于传统的ZFN和TALEN技术，CRISPR/Cas9技术更为简单，只需要构建针对特定位点的sgRNA，而且效率也比前面几种技术更高，在疾病治疗研究中发挥越来越重要的作用。然而，CRISPR/Cas9系统仍然存在着一定的局限性，这种局限性主要体现在功能发挥时系统对DNA上PAM序列的依赖性以及切割时潜在的脱靶效应。因此科学家们在CRISPR/Cas9的基础上开发了更加高效且广谱的精准基因编辑工具—单碱基编辑技术BE（Base Editor）和精准基因编辑工具PE（Prime Editors）。单碱基编辑技术BE（Base Editor）单碱基编辑技术是一种基于脱氨酶与CRISPR/Cas9系统融合形成的技术。2016年哈佛大学David Liu实验室首次报道开发出CBE单碱基编辑工具，通过将SpCas9与胞嘧啶脱氨酶（cytidine deaminase, CyD, 如APOBEC1）融合，可以在一定的突变窗口内实现胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）的单碱基转换（图4）[3]。2017年10月底，该实验室进一步开发出ABE单碱基编辑工具，实现了从腺嘌呤（A）到鸟嘌呤（G）的精确转换（图5），为基因编辑提供了新的研究工具[4]。图4. CBE示意图[3]图5. ABE示意图[4]相比于CRISPR/Cas9技术，BE技术可以既不引入DNA双链断裂，又不需要重组修复模板，整体提高了编辑的安全性和精准性，而且其效率远远高于由发生DSB引起的HDR和NHEJ修复方式，对于许多点突变造成的遗传疾病具有很大的应用潜能。近年来，多个实验室也发表了类似的工具，并在这些工具的基础上进行了更为深入的改造与优化。邦耀生物科学家团队以不同单链DNA脱氨酶结构域与Cas9切口酶相结合为基础，开发全新一代的DNA碱基编辑工具—超高活性的HyCBEs和双碱基编辑器A&C-BEmax以及等多种碱基编辑新工具，提高了编辑活性并拓宽靶点范围，以实现更广泛、更精确的基因编辑，相关研究成果也发表在Nature Cell Biology、Nature biotechnology等国际著名期刊[5]。图6. 超高精度碱基编辑器HyCBE示意图图7. 双碱基编辑器示意图精准基因编辑工具PE（Prime Editors）2019年10月21日，哈佛大学David Liu实验室开发出了全新的精准基因编辑工具PE （Prime Editors）[6]，PE是以CRISPR/Cas9系统为基础，在两方面加以优化：1. pegRNA：pegRNA（prime editingguide RNA）是一段改造后的sgRNA，它在传统sgRNA的3' 末端增加了一段RNA序列。这个RNA序列包括一段引物结合位点（Primer-binding site, PBS），用于与被切割的目标DNA链互补；还包括一段进行逆转录的模板（RT template）的序列，它与切口下游的DNA序列同源，且在RT序列上存在有相应的编辑突变（如点突变或插入缺失突变）。图8. pegRNA的改造[4]2.融合蛋白：将nCas9（H840A）与M-MLV逆转录酶融合。图9. PE结构示意图[4]在pegRNA的引导下，融合蛋白会到达基因组上的目的序列，并对含PAM的靶DNA链进行切割（pegRNA的非互补链）。此后，PBS序列与被切割的目标DNA链互补配对，逆转录酶即从端口空缺处启示逆转录。逆转录产物（DNA）即包含我们所期待的编辑突变。这段逆转录DNA会入侵并进入基因组DNA，发生整合，并进行切口的修复。只要RT序列允许，那么就可以采用此原理完成碱基的点突变（任意转换或颠换）以及片段的插入和缺失。图10. PE原理示意图[4]相比于其它基因编辑工具（采用ZFN，TALEN，CRIPSR/Cas9等产生DSB进行HDR或NHEJ修复或通过base editing系统进行单碱基编辑），PE的优势在于可以在不依赖DSB的前提下，能够实现更精准的编辑，更广的试用范围。但同时相比CBE和ABE，PE的劣势也随之体现，编辑效率不如前者，并且产生随机Indels的可能也会随之提高。图11. PE与ABE、CBE的效率比较[6]最后，除了上述几种基因编辑工具以外，科学家们还发现了除Cas9外的Cas家族的其它一系列蛋白，如 Cas12、Cas13、CasX等。这些新的发现有望使基因疗法能够解决更广泛的遗传疾病，推动生物医学的基础研究和临床基因治疗研究。

河北科技大学生物科学与工程学院副教授韩春雨近日找到基因编辑新工具，他和研究团队利用格氏嗜盐碱杆菌的Argonaute(一类庞大的蛋白质家族)来实现DNA引导的基因组编辑，真正实现了对基因组的任意位置进行切割。这一被称为NgAgo的技术将基因编辑的可能性推入了更广泛的境地。此项研究成果刊发在5月2日的顶级学术杂志《自然生物技术》上。　　“基因剪刀”技术的出现，让基因编辑技术实现精准、简单操作，大幅降低了基因编辑门槛。人类操纵基因的梦想因此成为现实。韩春雨和团队的新技术公布前，RNA引导的核酸内切酶Cas9是全球范围内最常用的基因组编辑工具。　　Cas9的“取材”范围有限，NgAgo的优势之一，就是大大扩充了基因编辑的取材范围。在新技术帮助下，地球上大部分生物的基因都可成为基因编辑工具，这意味着基因编辑技术受限更小，便利性更大。　　韩春雨和团队发表的这篇题为《NgAgo DNA单链引导的基因编辑工具》中，还阐明了这一新技术的其他优势：向导设计制作简便，可以合成短链单链DNA向导。向导可直接转染细胞和组织而无需构建向导表达载体。可编辑基因组内任何位置，对靶点选择没有限制。由于向导核酸是DNA而非RNA，因此避免了RNA易于形成复杂的二级结构而带来的失效或者脱靶效应。对游离于细胞核的DNA具有更高的切割效率。　　专家普遍认为，该技术可用于微生物、植物和动物的精准基因改造，以及乙肝、艾滋病或者一些遗传性疾病的基因治疗，在人类血液、器官的编辑和再造等方面具有重要意义，在医药、农业、畜牧等产业领域具有重要应用价值。