生物样本

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是20世纪80年代发展起来的一种新型软电离有机质谱, 作为一种新兴的蛋白质组学检测技术, 现已广泛应用于生命科学及相关领域。同时作为一项新兴的微生物鉴定技术, 受到了国内外的广泛关注。与传统的生化表型鉴定方法和分子生物学方法相比, MALDI-TOF MS具有操作简单、快速、准确和经济的特点。早在1975年, ANHALT等[1]利用质谱仪结合高温裂解技术第1次完成了细菌的鉴定, 从此拉开了质谱鉴定细菌的“ 序幕” 。随着质谱检测技术的不断完善和发展, 近年来, MALDI-TOF MS已经成功应用于微生物的鉴定, 显示了其在细菌、酵母菌等鉴定方面均具有良好的应用价值。众多的研究表明, MALDI-TOF MS技术对培养出的纯菌落进行菌种鉴定具有很高的稳定性及准确性, 对常见细菌和酵母菌的属的鉴定率能达到97%~99%, 种的鉴定率也能达到85%~97% 另外, MALDI-TOF MS大大缩短了细菌鉴定的时间, 而且其成本也较常规鉴定方法低[2, 3]。除此之外, MALDI-TOF MS已经能够成功地用于部分微生物亚种水平的鉴定和细菌耐药性的检测, 但这种方法在大多数情况下是应用于培养出的纯菌落的鉴定[3]。　　如果能够从临床样本中直接检测细菌/真菌, 突破细菌/真菌培养阳性率低、培养时间长的瓶颈, 为细菌/真菌感染性疾病的诊疗提供更快、更准确的病原学依据, 将对临床及时控制细菌/真菌感染性疾病起到更大的作用。国内外学者已尝试将质谱技术应用于临床样本的直接检测, 并取得了显著的进展。本文就MALDI-TOF MS技术在临床样本的直接检测应用作一综述。一、MALDI-TOF MS检测原理　　MALDI-TOF MS技术用于微生物鉴定的实质就是检测具有属、种或亚型特异性的生物标志的质量信号, 主要是微生物菌体内高丰度、表达稳定和进化保守的核糖体蛋白。MALDI-TOF MS 仪器主要由基质辅助激光解吸离子源(MALDI)和飞行时间质量检测器(TOF)两部分组成。MALDI的原理是用一定强度的激光照射样本与基质形成的共结晶薄膜, 基质从激光中吸收能量而汽化, 并迅速降解, 使样本分解吸附, 基质和样本之间发生电荷转移从而使样本分子发生电离 TOF的原理是带有电荷的样本分子在电场作用下加速飞过飞行管道, 因为离子的质荷比与离子的飞行时间呈正比, 所以不同质量的离子因达到检测器的飞行时间不同而被检测, 以离子峰为纵坐标、离子质荷比为横坐标形成特征性的质量图谱。将不同种属微生物经MALDI-TOF分析所形成的质量图谱与数据库中的参考图谱进行比较, 从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定[2]。二、MALDI-TOF MS直接检测临床样本的流程　　临床样本直接检测的流程主要包括3个部分:临床样本的预处理、样本上机检测和对比蛋白质指纹图谱数据库得出鉴定结果。由于目前报道最多的临床样本是阳性血培养瓶和中段尿样本, 下面将以这二者为例介绍其直接检测的流程, 其它临床样本的检测流程与之类似。(一)临床样本预处理　　MALDI-TOF MS直接用于临床样本的检测有2个基本的要求:(1)临床样本中细菌的量。为了得到准确的鉴定图谱, MALDI-TOF MS技术对置于靶板上的细菌的最低检测限约为(1× 104)~(1× 106)cfu/mL。若要直接检测拟似血流感染的血液样本以及拟似泌尿系统感染的中段尿等临床样本中的病原菌, 首先必须富集细菌 (2)临床样本的质。由于血液和血培养瓶中的大分子成分如血红蛋白和其它蛋白成分、尿液中的白细胞等有机成分会干扰细菌的谱峰, 所以直接检测前需要采取预处理措施去除这些干扰因素。1.阳性血培养瓶直接检测 直接检测阳性血培养瓶的细菌浓度常常需要1× 107 cfu/mL[2, 4]。由于在血流感染患者血液中的细菌量常常很低(最低可 1~10 cfu/mL), 因此对血样本的直接检测需要一个增菌的过程, 即采用血培养瓶增菌。目前已报道的阳性血培养病原菌预处理程序各不相同, 但预处理过程主要包含了以下2个步骤:(1)将细菌从血细胞中分离出来。先应用温和去污剂(如吐温-80、十二磺基硫酸钠、皂素等)将血液中的血细胞溶解, 然后通过不同的流程(离心、洗涤)去除其它的干扰因素, 纯化要鉴定的细菌样本 (2)将菌体中的蛋白质抽提出来。最常用的是混合溶剂处理法, 使用甲酸/乙腈溶液对样本进行处理来抽提蛋白, 利用2种溶剂的混合作用将菌体表面的蛋白和存在于细胞内的低相对分子质量的高丰度蛋白提取出来, 实现对菌株的鉴定。虽然至今尚没有规范化的处理程序, 不过目前市场上已有商品化的阳性血培养瓶预处理试剂盒Sepsityper kit(Bruker)可以提高鉴定分数和鉴定准确率, 但是花费比较高, 处理程序也费时较长[5]。另外, HAMMARSTR? M等[6]建立了一种基于声学捕捉和集成选择性富集目标(integrated selective enrichment target, ISET)的新方法用于富集样本中的细菌, 快速、准确并且简化了人工操作, 有望替代传统的以离心为基础的分离方法。2.中段尿样本 要取得一个较高的鉴定成功率, 直接检测中段尿样本中病原菌至少需要的细菌数量是1× 105 cfu/mL[7, 8]。对尿样本的预处理程序较为简单, 主要有下面几个步骤:低速离心去除白细胞, 高速离心收集细菌, 沉淀, 经过洗涤、离心之后进行蛋白质的提取(常用的是甲酸、乙腈), 经高速离心后取1 μ L上清涂布到MALDI的靶板上, 在室温下干燥后即可进行检测。

尿液是监测人体OPs暴露最常用的生物样本，优点为样本易于收集，缺点是无法通过尿液中的代谢物推断出特定母体农药的信息。通过检测血液或血液制品可以直接监测血液中的OPs母体化合物，而不是代谢物。但是，血液样本不易收集，样本量有限且血液中农药浓度水平低，对分析技术的灵敏度要求更高。除了常用的尿液、血液样本外，其他样本如胎粪、脐带血、羊水等也在暴露评估中起着重要作用。胎粪可反映妊娠16周到分娩前的污染物长期累计暴露水平，是胎儿宫内暴露评估的良好基质。脐带血可以不用静脉穿刺即可得到相对较大的样本量 (30mL)。与胎粪只能检测妊娠期第16周到分娩这段时间的婴儿暴露剂量相比，测量羊水(妊娠12~20周期间)可以了解胎儿早期暴露情况。其他可用于暴露评估的生物样本如唾液、头发等在人体OPs生物监测与暴露评估研究中报道较少。

生物样本分析岛津自动前处理系统（Co-Sense for BA [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LCMS[/color][/url] ）[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=24242]生物样本分析PPT[/url]

最近在研究生物样本库相关资料，CNAS正式开展从去年开始，虽然之前国内也有陆陆续续开展，但整个行业还是做的太少了。 在国际和我国国内，对生物样本库存在许多不同称呼，例如Biobank BiologicalResource Center (BRC)、生物银行、组织样本库、肿瘤库、菌毒种保藏中心等等。无论何种习惯称法，以研究和开发、教学研究和创造产业价值为目的，用以接收、储存、处理及提供生物样本及其相关数据的实体(包含这些实体所处地理位置及与其运行有关的所有活动)，均适用于本准则所规范的生物样本库。 目前，执行的标准主要是GB/T 37864-2019 生物样本库质量和能力通用要求（(IDT ISO 20387：2018《Biotechnology-Biobanking-General requirements for biobanking》)。CNAS在去年开始对评审员 内审员 CL10进行宣贯。 不知道大家有谁有这方面的专长，可以分享一下。

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液相质谱生物样本响应低怎么办

关于LA-ICP-MS （LA=激光烧蚀） 用来做地质样本大家都早就听说熟悉了，那么对于做生物样本呢？国外有相关文章，国内有那个实验室做的比较好么？我们想给 CyTOF陪一个LA上样，最近在找这个。相关的大侠欢迎讨论，用什么牌子的LA，上样条件。我们现在的想法是把细胞或者组织切片，先用金属元素标记后，用LA烧蚀上样，希望能做到1um的光斑（烧蚀坑）。厂家提供的样本池很大，由于气体扩散及运输，icp信号持续时间较长，信号降低到1%的清洗时间约250ms。有没有大侠做LA上样，自己开发样本池的？下面是现在用的样本池：

(二)泌尿系统感染病原菌的快速检测　　因泌尿系统感染的中段尿样本中的细菌量相对很高, 中段尿样本也是MALDI-TOF MS直接检测的理想选择[30], 并且常常是单一菌种感染, 避免了MALDI-TOF MS在鉴定混合菌样本的不足[31]。泌尿系统感染是人类常见的感染性疾病, 临床泌尿系统感染最常见的病原菌为大肠埃希菌(70%~95%)、腐生葡萄球菌(5%~10%)以及其它肠杆菌科细菌, 如奇异变形杆菌和肺炎克雷伯菌。有研究表明MALDI-TOF MS对尿液样本中这些细菌的鉴定效率和准确率要优于传统鉴定方法和其他鉴定系统[7, 32, 33]。1.鉴定效能 FERREIRA等[7]选取尿液中细菌大于1× 105 cfu/mL的样本进行直接的MALDI-TOF MS鉴定, 结果显示尿液样本经过差速离心法处理后, 可将91.8%的菌株鉴定到种、92.7%的菌株鉴定到属的水平。　　杨溪等[33]使用MALDI-TOF MS技术对临床收集到的1 040份尿液样本进行直接快速检测, 共鉴定出含细菌的样本526份, 其中尿细菌培养菌落数≥ 1× 105 cfu/mL, 培养出1种/2种菌的尿液样本MALDI-TOF MS的直接鉴定率分别为92.7%(430/464)和75%(96/128)。MALDI-TOF MS直接检测法的鉴定结果与尿细菌培养法鉴定出的细菌菌种一致, 符合率为100%。2.与流式细胞术联用 怀疑泌尿系统感染的尿液样本一般经离心后取沉淀直接进行检测, 但考虑到临床上有60%~80%的尿液样本是阴性的, 为了减少分析的时间和人工的工作量, 有学者将MALDI-TOF MS与流式细胞术联用检测, 用流式细胞术筛除细菌数量不足的尿液样本, 而MALDI-TOF MS用来检测筛选结果为阳性的尿液样本, 取得了良好的鉴定效果[34, 35]。MARCH ROSSELLó 等[34]建立了这样一种微生物鉴定程序:先用流式细胞仪进行菌落计数筛查出单一细菌阳性的尿液样本, 然后再进行MALDI-TOF MS检测, 发现细菌数在1× 107 cfu/mL时是足够的细菌浓度, 有87.5%的敏感性, 而细菌数在(1× 105)~(1× 107)cfu/mL之间的样本经过4 h的预增菌, 得到用于分析的足够的细菌数量后, 可以达到91.7%的敏感性。3.细菌含量对鉴定结果的影响 由于中段尿中病原菌数 2.0), 而随着样本中细菌数的降低, 鉴定成功的比例和鉴定分数也在下降, 当菌落数 1× 104 cfu/mL的中段尿样本, 应用MALDI-TOF MS直接检测即可取得满意的鉴定效果。4.中段尿样本直接检测的新方法 DEMARCO等[31]近期描述了一种透析过滤的方法, 通过脱盐、分馏、富集等步骤对100例阳性尿液样本在MALDI-TOF MS分析前进行了预处理, 实验结果表明这种预处理方法能够正确地鉴定阳性尿液样本, 并且正确分类了所有临床相关菌尿症的阴性尿液样本, 包括一组污染的尿液样本和一组临床上无关紧要的定植菌。敏感性和特异性分别是67%和100%。5.中段尿样本直接检测的不足之处 与直接检测培养阳性的血样本一样, 对于含有2种或2种以上细菌感染的中段尿样本, MALDI-TOF MS常常表现为鉴定能力不足[33, 35] 尿液蛋白质如α -防御素[8]会造成鉴定结果不能正确匹配数据库 对酵母菌的鉴定能力也有待于进一步提高 对于核糖体蛋白序列差异很小的菌种也常常不能区分。(三)其它无菌体液　　MALDI-TOF MS直接检测和鉴定其它无菌体液样本如脑脊液、胸腹水和关节液等中细菌的报道尚不多。NYVANG HARTMEYER等[37]首次报道了通过直接将脑脊液样本离心取上清直接进行MALDI-TOF MS分析, 肺炎链球菌性脑膜炎可以在30 min内做出诊断, 为后续治疗方案的选择和结果的解释提供了重要的参考依据。SEGAWA等[38]也用同样的方法对一例肺炎克雷伯菌引起的脑膜炎做出了诊断, 但同时也指出在实际应用中能获得的样本量少, 细菌数少可能会限制它的应用。另外, 还可将无菌体液样本转移到血培养瓶中进行孵育, 待报阳后进行检测也是可行的。有研究应用MALDI-TOF MS检测了46份液体, 包括移植养护液、关节液、深部脓疱样本、骨小孔样本用血培养基孵育, 发现44/46(96%)能鉴定到种的水平, 余下的2份被鉴定到属的水平[18]。四、总结与展望　　MALDI-TOF MS是一种简单、快速、高通量和高效的微生物鉴定手段, 在临床样本直接检测方面较传统的鉴定方法具有更大的优势, 能显著降低样本检测的周转时间和成本, 但尚存在着一些不足之处, 主要表现在:(1)MALDI-TOF MS在检测和鉴定细菌方面的敏感性还不高, 不能直接鉴定患者血样本中的病原菌(细菌数量太少) (2)对于一些核糖体蛋白差异较小的细菌用其辨别有较大的困难 (3)目前的研究都有各自不同的操作过程, 在样本处理、质谱图采集和分析等方面没有统一的标准, 可能会影响分析结果在实验室内和实验室间的可重复性 (4)标准的鉴定参考图谱数据库尚不够完善, 需要进一步拓展 (5)对一些细胞壁难以破坏的细菌(如革兰阳性菌、酵母菌)和混合菌等的鉴定能力还不够高。但是相信随着更加有效的样本预处理方法、更加严格的检测过程控制和更高分辨率的图像处理技术的实现, MALDI-TOF MS用于直接检测临床样本中的微生物会有更广阔的前景。

避光生物样本处理过程及分析过程

预BE,生物样本检测方法学验证是否一定要做专属性

(二)MALDI-TOF MS分析　　目前主要有4种MALDI-TOF MS系统[9]:MALDI Biotyper系统 (Bruker Daltonics, 德国), VITEK MS系统 (BioMé rieux, Marcy l’ Etoile, 法国), the AXIMA@SARAMIS 数据库 (AnagnosTec, 德国)和the Andromas (Andromas, 法国), 其中前2种质谱系统已获得中国食品和药品监督管理局许可证, 可以用于临床样本的检测。　　在进行质谱分析前, 应根据不同的检测对象和使用的激光类型选择合适的基质。基质由基质复合物和基质溶剂组成。常用溶剂有:乙醇、乙腈和一种强酸如三氟乙酸、甲酸等。常用的基质是2, 5-二羟基苯甲酸(2, 5-dihydroxybenzoic acid, DHB)、ɑ -氰基-4-羟基肉桂酸(ɑ -cyano-4-hydroxycinnamic acid, ɑ -CHCA)、3, 5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(sinapinic acid, SA)等。将经过提取的微生物样本细胞内容物与等量的基质溶液(通常是1 μ L)混合或分别点加在样本靶板上, 待室温条件下干燥后(使得样本与基质共结晶)上机检测即可。(三)鉴定结果分析　　将质谱检测得到的谱峰与数据库进行模式匹配, 得到一个鉴定分数。基于软件给出的在列表中第1种微生物的鉴定分数, 根据各自质谱分析系统的判断标准得出检测结果。目前文献报道有2种判断标准:第1种是由STEVENSON等[10]提出的, 鉴定结果按照匹配程度进行打分, 分值在0~3之间。当得到的鉴定分数≥ 2.0时, 表示待测菌株有较大的把握被鉴定到种的水平 鉴定分数在1.7和2.0之间时, 表示菌株被鉴定到属的水平, 分值 1.7表示产生的鉴定结果不可信。第2种标准是LA SCOLA等[11]提出的, 当一个样本经过4次点样鉴定, 当列表中第1种微生物的鉴定结果均一致, 并且至少2次的鉴定结果鉴定分数≥ 1.900, 或者4次的鉴定分数均≥ 1.200, 表明微生物能被正确鉴定。有学者发现通过改进上述的鉴定标准可以得到更好的鉴定效果, ROSSELLó 等[12]认为在临床样本直接鉴定时, 鉴定分数要比直接纯培养的低, 可能会对分析结果造成干扰, 而厂商推荐的鉴定标准有些严格, 只有得到很高的鉴定分数结果才是被接受的。因此提出新的标准增加可接受的准确鉴定数:当一个样本4次点样中至少有2次的鉴定结果一致, 并且对列表中的第1个微生物种的鉴定分数均≥ 1.4时, 即表示能够准确鉴定, 这种标准与纯培养的鉴定结果有100%的符合率。NONNEMANN等[5]、GORTON等[13]将种的鉴定分数降到1.5, 可以将种的鉴定率从56%提升到76%、54%提升到63%。以上均提示了厂商推荐的cut-off值比较保守, 使得鉴定的敏感性降低。此外, 由于目前的数据库尚不完善, 对于部分菌株可能会出现鉴定失误的情况, 实验室工作人员应在商品数据库的基础上建立和丰富自己的参考数据库, 以提升鉴定的准确率。三、MALDI-TOF MS在临床样本直接检测中的应用　　从临床样本直接检测微生物可以节省转种培养的时间。目前已取得显著进展的是从血培养阳性样本中直接检测细菌和酵母样真菌, 而从中段尿和其他无菌体液样本中的直接检测也在快速发展。(一)血流感染病原菌的快速检测　　血流感染的发病率和死亡率都相当高, 快速准确的血流感染病原菌鉴定对于临床抗菌药物的合理使用和病愈率的提高至关重要。直接检测能显著减少鉴定时间( 29 h), 使得在血培养阳性的第1个24 h内接受适当抗菌药物治疗的患者增加11%[14]。CLERC等[15]认为基于MALDI-TOF MS 对血培养阳性样本的检测可能会成为血培养阳性患者管理中除了革兰染色报告之外的第2个关键步骤。近年来, 有不少的研究应用MALDI-TOF MS直接鉴定临床微生物样本, 取得明显进展的是从血培养阳性样本中直接鉴定细菌和酵母样真菌[5, 10, 16], 而混合菌和厌氧菌等的鉴定还有待更多的研究。1.鉴定效能 (1)细菌:在引起血流感染常见菌的鉴定方面, MALDI-TOF MS技术已经在肠杆菌科细菌、葡萄球菌等病原菌的直接鉴定方面取得了很好的鉴定结果。大量的研究评估了MALDI-TOF MS用于直接鉴定阳性血培养瓶的表现, 不同文献报道的种水平的鉴定率在54%~99%不等[5, 10, 11, 17, 18, 19], 主要是由于所鉴定细菌种类/数量的不同, 或是运用了不同的预处理/提取方法, 或是定义了不同的cut-off值。SCHMIDT等[19]、SCHUBERT等[20]应用不同的操作程序直接鉴定阳性血培养瓶样本, 结果显示103株代表临床最常见的13个属24个种的样本中, MALDI-TOF MS准确鉴定其中的72%(86.6%革兰阴性菌, 60.0%革兰阳性菌) 500例样本中, 其中革兰阳性菌358例, 革兰阴性菌98例, 总体种的鉴定率达到了86.5%, 其中革兰阳性菌是89.8%, 革兰阴性菌是86.3%。国内最新的研究也显示, 陈峰等[21]运用分离胶促凝管联合MALDI-TOF MS直接检测, 革兰阴性菌和革兰阳性菌中有84.0%和75.0%能被准确鉴定到种的水平 对于血流感染中最常见的病原菌的菌种鉴定符合率达到83.3%~96.9%。以上研究均显示了MALDI-TOF MS在血流感染直接鉴定方面的良好表现, 并呈现出了如下特点:对革兰阴性菌的鉴定率比革兰阳性菌高 无荚膜的细菌较有荚膜的细菌(细胞壁难以破坏提取到足够的菌体蛋白)的鉴定率高 混合细菌感染时鉴定能力有限, 多数情况下只能鉴定出其中一种优势细菌 对草绿色链球菌的鉴定效果较差(鉴定不出, 或将缓症链球菌鉴定为肺炎链球菌)[10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20], 需要进行另外的确证试验 (2)真菌:MALDI-TOF MS在鉴定酵母菌方面有较高的鉴定率。FERRONI等[18]、YAN等[16]的研究表明酵母菌鉴定的正确率可达91%~100%。但是也有学者得到了相反的结果, GORTON等[13]和PAOLUCCI等[22]直接鉴定的正确率只有56%和41%, 可能是因为鉴定使用的血量过少(1.5 mL), 或是在处理样本的过程中样本的丢失导致了低鉴定率 (3)其它细菌:目前关于厌氧菌的直接鉴定的报道较少, 并且显示了鉴定成功率并不理想, 可能是因为厌氧菌对生长条件的要求较为苛刻, 导致增菌的数量达不到要求, 还需要更多的研究来优化其鉴定条件。2.不同的检测方法 上述结果均是MALDI-TOF MS直接检测报阳血培养瓶的样本所得到的。有研究表明报阳血培养瓶的样本也可以转种到固体培养基上进行短暂孵育(如2~4 h)后再进行鉴定, 则具有更大的优势。KROUMOVA等[23]在质谱法分析实施蛋白提取程序之前, 将样本富集到一个增菌培养基中孵育大约2 h后再进行质谱分析, 同时达到增菌和减少血液成分干扰的目的, 提升了鉴定分数, 使鉴定结果更可信 IDELEVICH等[24]将血培养阳性的样本转种到血平板孵育1.5、2、3、4、5、6、7、8、12和 24 h(对照), 分别直接进行MALDI-TOF MS检测, 直到有可靠的到种水平的鉴定结果出现(鉴定分数≥ 2.0), 结果发现革兰阳性球菌平均鉴定到种所需要的孵育时间是5.9 h, 革兰阴性杆菌平均鉴定到种所需要的孵育时间是2 h。如果增加了蛋白提取程序, 革兰阳性球菌的孵育时间将缩短至3.1 h, 但对革兰阴性杆菌的影响不明显。这种方法可以有效地减少额外的人工操作时间和费用。HONG等[25]的研究也表明, 这种方法能得到可靠的鉴定结果(与传统生化方法的属水平的一致率是98.9%), 并且这种方法不会受血培养系统的影响, 成本低, 易于操作。3.与药物敏感性联合检测 为了克服MALDI-TOF MS不能做体外药物敏感性试验的不足, MALDI-TOF MS已经开始与药物敏感性试验联合用来直接检测阳性血培养瓶的样本[26], 用不含活性炭的血培养基在过滤和洗涤之前用溶解细胞的缓冲液进行孵育, 然后将从过滤膜上收集的微生物直接进行MALDI-TOF MS分析, 剩下的样本用VITEK 2系统孵育并进行药物敏感性试验, 将94.0%的样本鉴定到了种的水平, 药物敏感性试验与传统方法相比有93.5%的一致率, 并且相较于传统的56.3 h, 新方法鉴定和药物敏感性试验所用的时间缩短到了11.4 h。证明了在一天内完成微生物鉴定和药物敏感性试验的可行性。为获得更好的治疗争取了时间并且减少了住院的费用[27]。4.检测结果的影响因素 有研究指出不同的血培养瓶和血培养系统可能会产生鉴定结果的差异[19, 28, 29]:使用含有活性炭的血培养瓶和BacT/ALERT血培养系统的鉴定率较低, 使用含有树脂的血培养瓶和BACTECTM血培养系统鉴定率较高。其中一项研究比较了含有活性炭的和不含活性炭的血培养瓶在BacT/ALERT血培养系统下的鉴定表现, 发现使用不含活性炭的血培养瓶的MALDI-TOF MS的鉴定率为30%, 而含有活性炭的血培养瓶的鉴定率只有8%[28]。而另一项研究比较了3种不同的血培养系统— — BACTECTM, VERSATREK和BacT/ALERT对鉴定率的影响, 经这些鉴定系统培养的阳性血培养瓶的鉴定成功率分别是76%、69%和62%[29]。此外, 使用不同的细菌蛋白提取程序也会影响鉴定成功率[11]。

[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=29772]菌毒种、传染病生物样本管理制度[/url]

生物样本检测用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]检测在一个分析批一头一尾进同一条标曲重合性不好，做方法学验证时精密度准确度始终做不过。但是单独做基质效应和提取回收率时，同样是一头一尾进同一条标曲，标曲重合性就很好，请问是什么原因啊

谁有细菌内毒素 微生物限度检查 检验记录样本有的话,能共享下吗!谢谢

[color=gray]都说“生物是新世纪的朝阳行业”，不知道有多少人和我一样，因此在高考时奋不顾身的报考了生物专业，从此开始了朝（an）气（wu）蓬（tian）勃（ri）的科研狗生涯… 也不知道有多少人在毕业后依然选择了这个方向从业？从毕业到工作十年，时间过的如此之快，让人不禁感慨——我们这些人虽然天天浸泡在EB、聚丙稀酰胺里，五毒不侵，但也天天又是液氮又是干冰，绝对“冻龄”有方…[/color][color=gray]在这里我想简单小结一下“冻龄”的秘密… 其实这也是这些年自己感触最深的一些经验教训，那就是对于每天相处的E.coli也好、Hela细胞也好、果蝇也好、小白鼠也好… 多种多样的生物样本，要想分析过程省力、省心，那提取基因组DNA时的前处理真的是不能小觑。[/color][color=gray]提取的时候，样本所处的环境温度应该尽量低，以保证DNA完整，这样才能确保下游的实验操作的稳定性，例如PCR扩增、限制性酶切等等，免得天天提心吊胆，怕PCR条带不好，酶切切出杂带等等，倒不是怕凝胶回收的麻烦，而是这种品质的DNA往往还会出别的“幺蛾子”，那时候真的叫天天不应叫地地不灵… 老板就算再有钱也是连吃了你的心都有。[/color][color=gray]但矛盾的是，以我们现有的方法去做样本破碎，这个破碎过程本身，无论是研磨还是匀浆，都会因为高速的处理过程而产生热量，导致样本温度升高。那么下面在这里分享一下以往做实验的小结，看看能不能帮到更多人？如果大家有更好的方法也欢迎拍砖：）[/color][b][color=gray]（一） [/color][color=gray]实验室常年备有干冰或液氮：[/color][color=gray]使用液氮：[/color][/b][color=gray]传统方法是使用陶瓷研钵，清洗干净之后灭菌、烘干、冷却，然后倒入液氮先预冷研钵和研磨杵，再放入剪切好的动物或植物组织，补充一些液氮，进行手工研磨。补充液氮后动植物组织内的水分会迅速成冰，如果想研磨成粉，女生会感觉比较费力，所以作者本人已经开始使用仪器的方法研磨，成本很低，也不需要方法验证，如果一个批次要处理很多个体的话会更高效、在提取基因组的时候也可以让第一个样品与最后一个样品的处理结果更加一致。[/color][img=,262,400]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142130_01_3141229_3.png[/img][color=gray]这种小研磨机实验室有好多，主要因为研磨杯和刀头的材质可以耐受液氮的温度，另外主机的马达有防护隔板，可以用酒精擦拭清洁，就能满足基因组提取的要求了。[/color][color=gray] [/color][b][color=gray]使用干冰：[/color][/b][color=gray]干冰的话也是比较方便的，因为不想液氮那样要稍微等待挥发，干冰是可以伴随样品一起研磨的。如果用研钵的话就会很费力了，依然可以采用仪器的方法——[/color][img=,690,611]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142131_01_3141229_3.png[/img][color=gray]这台研磨机我们实验室现在只有一台，一般都是拿来做野外回来的比较珍贵的样品。因为研磨杯有一次性的，这样不用担心样品间有痕量的交叉污染，还可以作为容器把剩下来的样本保存在冰箱里。如果需要提RNA，也可以用DEPC浸泡之后上高温蒸汽然灭菌后再烘干。[/color][color=gray] [/color][b][color=gray]（二）[/color][color=gray]不使用干冰或液氮，低温破碎：[/color][color=gray]低温下的匀浆：[/color][/b][color=gray]① [/color][color=gray]可以在样品容器外加上冰水浴，保持样品的低温。[/color][color=gray]② [/color][color=gray] [/color][color=gray]对于温度敏感的样品，在匀浆过程中，建议采用与分散时间（30秒~1分钟）等长的冷却时间，这样可以极为显著地控制液体温度，然后视样品特性，可重复1次或多次；例如：样品保存温度在6~7℃以下，匀浆破碎使用10000 rpm ，1 min，冷却 1 min，此时样品已得到充分分散，同时样品温度几乎维持不变。[/color][color=gray]③ [/color][color=gray]常见样品分散时间无需过长，匀浆后继续分散对大部分样品来说没有帮助。[/color][b][color=gray]低温下的研磨：[/color][/b][color=gray]可以选择机身带有夹层的分析研磨机，研磨室不需要很大，以免浪费样品。开始处理样本前就可先通入3℃冷却水，这样在没有其它物质接触样品的情况下同样可以维持研磨室内的低温环境。[/color][color=gray] [/color][b][color=gray]（三） [/color][color=gray]不使用干冰或液氮，常温裂解液裂解：[/color][/b][color=gray]有裂解液的情况下，一般用恒温水浴孵育就可以了，中间间歇振荡一下，帮助样本裂解，但消化时间一般也比较长。有一段时间我天天做小白鼠的“大屠杀”，对比不同组织用同一种试剂盒的提取效果，但小白鼠只有肝脏是比较好做的，脾脏、心脏多筋膜，脑部组织又多油脂，需要不同的手法来处理，孵育时间不一样，但又要尽量统筹所有样品在一个时间段内完成，避免步骤之间的时间差影响结果，所以就借用了师姐她们的“神器”，预设几个程序，免得出错，对于有筋膜的就用正反转，对于有油脂的就用低转速的方法，拿来塞上玻璃球做球墨也是好的，总之黑猫白猫能解决问题就是好猫了。[/color][color=#008000][img=,600,600]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142132_01_3141229_3.png[/img][/color]

国食药监注482号各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局（药品监督管理局），总后卫生部药品监督管理局： 为加强药物临床试验生物样本分析实验室的管理，提高生物样本分析数据的质量和管理水平，根据《药品注册管理办法》、《药物临床试验质量管理规范》、《药物非临床研究质量管理规范》，参照国际规范，国家局组织制定了《药物临床试验生物样本分析实验室管理指南（试行）》，现予印发。请你局组织本行政区域内有关单位学习，参照执行。 附件：《药物临床试验生物样本分析实验室管理指南（试行）》起草说明 国家食品药品监督管理局 二O一一年十二月二日药物临床试验生物样本分析实验室管理指南（试行）第一章 总 则 第一条 为加强药物临床试验生物样本分析实验室的管理，提高生物样本分析数据的质量和管理水平。根据《药品注册管理办法》、《药物临床试验质量管理规范》、《药物非临床研究质量管理规范》，参照国际规范，制定本指南。 第二条 药物临床试验生物样本（以下简称生物样本）是指按照药物临床试验方案的要求、从临床试验受试者采集的需要进行分析的材料（如血浆、血清、尿液、粪便、组织和细胞等）。药物临床试验生物样本分析实验室（以下简称实验室）是指对生物样本中药物、药物代谢物及生物标志物等进行分析，为药品注册申请提供数据支持的机构。 第三条 凡为提交药品监督管理部门作为药品注册数据而进行生物样本分析的实验室，均须遵循本指南，并接受药品监督管理部门的监督检查。第二章 组织机构和人员 第四条 实验室应建立完善的组织管理体系，任命实验室负责人和项目负责人，并配备相应的实验人员。隶属于药物I期临床试验研究室（以下简称研究室）的实验室，应纳入研究室的质量保证体系；独立的实验室应建立质量保证部门，并任命质量保证部门负责人。 第五条 实验室负责人应具备相关专业本科以上学历，熟悉业务，能有效组织、指导和开展实验室业务工作。对分析工作的实施和结果负责。其职责包括： （一）全面负责实验室的建设，确保实验室具有满足工作要求的各项条件。 （二）组织制定和修改管理制度、技术规范和标准操作规程；定期审阅所有管理制度、技术规范和标准操作规程文件，确保所有文件适时更新。 （三）制定主计划表，掌握各项分析工作的进展。 （四）确保质量保证工作的开展。 （五）建立有效的沟通交流机制，以保证与申办者、药物临床试验机构及研究者之间可以及时、有效地沟通。 （六）建立完善的教育培训和考核制度。 （七）在每项实验开始前，指定项目负责人，试验过程中确需更换项目负责人时，应记录更换的原因和时间，并保留相关记录。 （八）审查、批准实验方案、标准操作规程、结果或报告。 （九）指定专人负责档案资料与生物样本的管理。 第六条 质量保证部门应配备与其开展的工作相适应的人员。质量保证部门负责人的职责为： （一）负责质量保证部门的工作安排和运行； （二）审核分析实验方案、实验记录、结果或报告； （三）根据每项工作的内容和持续时间制订稽查计划并实施稽查，详细记录稽查的内容、发现的问题、采取的措施等，并向实验室负责人和项目负责人报告； （四）检查实验室环境、设施、仪器设备和档案管理等； （五）参与标准操作规程的制订和审核，并保存标准操作规程的副本。 第七条 项目负责人具体负责某项临床试验生物样本的分析工作，具备相应专业本科或以上学历，两年以上生物样本分析工作经验，能够独立进行生物样本分析方法的建立和验证，并对所承担项目的分析方法、分析结果和分析报告负直接责任。项目负责人的职责包括： （一）制订该项目的实验方案； （二）全面负责该项目的运行管理、组织实施； （三）建立并验证分析方法，撰写验证分析报告； （四）确保所有参与该项目的实验人员明确各自所承担的工作，并掌握和执行相关的标准操作规程； （五）掌握工作进展，确保实验记录及时、完整、准确和清晰； （六）确保实验中偏离方案的情况及采取的措施均有详细记录； （七）整理、分析实验数据和结果，撰写分析报告； （八）及时处理质量保证部门的报告。 第八条 实验室工作人员应符合以下要求： （一）具备严谨的科学作风和良好的职业道德以及相应的学历，经过专业培训与考核，并保存个人的培训与考核记录，具备相应的经验和能力并取得上岗资格； （二）熟悉本指南要求，掌握并严格执行相关的标准操作规程； （三）及时、完整、准确和清晰地进行实验记录，对实验中发生的可能影响实验结果的任何情况应及时报告给项目负责人； （四）对涉及保密的技术资料、受试者信息等履行其保密责任； （五）根据工作岗位的需要着装，保持工作环境正常有序，遵守健康检查制度，确保实验样本不受污染。

想问一下用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质[/color][/url]定量生物样本内源性的物质，怎么选择空白基质？基质加标做标曲

请教各位,１．用质谱做生物等效性实验,测定药物的血样浓度,每个样本需要进几针?２．实验是测定阿齐霉素含量,提取过程是血浆,加乙腈,加0.2ｍｏｌ碳酸钠，加　乙酸乙酯－异丙醇（９５：５），上清液空气泵吹干，加流动相超声溶解，涡旋，离心．但用２００００ｒｐｍ，１０分钟，仍有悬浮物，该如何处理　？３．实验精密度差．我应在哪方面多注意？

药物临床试验生物样本分析实验室管理规定（征求意见稿）第一章 总 则第一条 为提高临床试验生物样本分析实验室的分析质量，确保所产生的数据和结果的可靠性、完整性和科学性，根据《药品注册管理办法》、《药物临床试验质量管理规范》、《药物非临床研究质量管理规范》，参照国际通则，制定本规定。第二条 临床试验生物样本是指按照临床试验方案的要求、从临床试验受试者采集的需要加以分析的材料（如血浆、血清、尿液、粪便、组织和细胞等）。临床试验生物样本分析实验室（以下简称“实验室”）是指对临床试验生物样本中药物及其代谢物分析，以及对临床试验生物样本进行血液学、生物化学、生物物理学等学科的检测或评估，为药品注册申请提供数据支持的机构。第三条 所有经过国家食品药品监督管理局批准进行临床试验生物样本分析的实验室，均须遵循本规定。第二章 组织机构和人员第四条 实验室应建立完善的组织管理体系，任命负责人、质量保证部门负责人、分析负责人，并配备相应的实验人员。第五条 所有人员应符合以下要求：（一）具备严谨的科学作风和良好的职业道德以及相应的学历，经过专业培训，具备所承担的工作需要的理论知识、工作经验和业务能力；（二）严格履行职责，熟练掌握并严格执行与所承担工作有关的标准操作规程；（三）及时、完整、准确和清晰地进行实验记录，对实验中发生的可能影响实验结果的任何情况应及时报告；（四）对涉及保密的技术资料、受试者信息等履行其保密责任；（五）根据工作岗位的需要着装，遵守健康检查制度。第六条 实验室负责人应具备相应专业的理论知识，具备有效组织、指导和开展实验室业务工作的能力。实验室负责人的职责为：（一）负责或协调所在机构法人与申办者签订书面合同；（二）建立有效的联系机制，以保证与申办者、药物临床试验机构之间可以及时、有效地沟通；（三）建立完善的教育培训和考核制度，确保实验人员具有相应专业的理论知识、技能和经验，保存实验人员的学历资质、工作经历、专业培训以及工作性质描述等材料； （四）全面负责实验室的建设，确保实验室具有满足工作要求的各项条件；（五）组织制定和修改管理制度、技术规范和标准操作规程；（六）制定主计划表，掌握各项分析工作的进展；（七）聘任质量保证部门负责人；（八）在每项实验开始前，指定分析负责人，试验过程中确需更换时，应记录更换的原因和时间，并保留相关记录；（九）审查、批准实施方案、分析结果或分析报告；（十）指定专人负责档案资料的管理。第七条 实验室应设立独立的质量保证部门，其人员的数量应与其开展的分析工作相适应。质量保证负责人的职责为：（一）负责质量保证部门的工作安排和运行；（二）审核实施方案、实验记录、分析结果或分析报告；（三）根据每项分析工作的内容和持续时间制定稽查计划并实施稽查，详细记录稽查的内容、发现的问题、采取的措施等，并向实验室负责人和/或分析负责人报告；（四）定期或不定期检查实验室环境、设施、仪器设备和档案管理等；（五）参与标准操作规程的制定、审核标准操作规程，并保存标准操作规程的副本；第八条 每项分析工作必须指定分析负责人。分析负责人的职责包括：（一）制定该项目的实施方案；（二）全面负责该项目的运行管理、组织实施；（三）建立并验证分析方法；（四）确保所有参与该项目的实验人员明确各自所承担的工作，并掌握和执行相关的标准操作规程；（五）掌握工作进展，确保实验记录及时、完整、准确和清晰； （六）确保实验中偏离试验方案的情况及采取的措施均有详细记录；（七）整理、分析实验数据和结果，撰写分析报告；（八）及时处理质量保证部门的报告。

能实时监控样本的当前状态，大家有没有好点的软件推荐

[font=宋体][/font][font=宋体][/font][size=5][b][font=黑体]样本前处理在样本分析中的地位[/font][/b][/size][size=3][font=宋体]在分析化学发展的过程中，样本前处理技术一直没有受到重视，相对与现代分析技术的快速发展，样本前处理技术以及仪器的发展滞后并制约了分析化学的发展，在过去的很多年中，分析化学的发展集中在研究分析方法的本身：如何提高灵敏度、选择性以及分析速度；如何应用物理、化学、生物学等方面的理论来发展新的分析方法与技术，以满足新技术对分析化学提出的新目标与高要求；如何采用新技术的成果改进分析仪器的性能、速度、以及自动化的程度。长期以来忽视对前处理方法与技术的研究，是样本前处理技术成为制约分析化学发展的瓶颈。[/font][/size][size=3][/size][size=3][font=宋体]现代分析化学所面临的样本性质的复杂程度是前所未有的，分析的对象不仅包括气、液、固相中的所有物质，而且往往以多相形式存在；其组成不但复杂，而且测定的时往往相互干扰；同时被检测物的浓度要求越来越低，稳定性随时变化，因而给分析带来了一系列困难，尤其是各种环境与生物样本采集后直接进行的可能性很小，一般都要经过样本制备与前处理以后才能测定[/font][/size][size=3][/size][size=5][b][font=黑体]样本前处理的目的[/font][/b][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=宋体]一个完整的样本分析过程，从采样开始到写出分析报告，大致可以分为[/font][/size][size=3][font=Times New Roman]4[/font][/size][size=3][font=宋体]个步骤：[/font][/size][size=3][font=Times New Roman]1[/font][/size][size=3][font=宋体]、样本采集、样本前处理、分析检测；数据处理与报告结果。统计结果表明，这个步骤中样本前处理占用了相当多的时间，有的甚至可以占有全程时间的[/font][/size][size=3][font=Times New Roman]70%[/font][/size][size=3][font=宋体]，甚至更多；比样本本身的检测分析多近一半的时间。因此近些年来样本前处理方法和技术的研究引起了分析学家的关注。各种新技术与新方法的探索与研究已经成为当代分析化学的重要课题与发展方向之一，快速、简便、自动化的前处理技术不仅省时、省力，而且可以减少由于不同人员操作以及样本多次转移带来的误差，同时可以避免使用大量有机溶剂并减少对环境的污染，样本前处理技术的深入研究必将对分析化学的发展起到积极的推动作用。[/font][/size][size=3][/size]

最近新开发项目：全血DBS样本，20-2000ng/mL做了很多次都是标曲最高点偏高，外标法、内标法定量都是如此，前几个点都成线性。查询到标准物质证书：化合物，内标纯度都为95.0%。难道跟纯度有关系？化合物对内标响应贡献为1/50，但为什么会偏高呢，怎么解释呢或者基质效应影响？但自己简单做的基质效应实验，基质效应可被内标消除。求助各位专家，谢谢

一． 取材和编号/标签部分 在本环节进行组织和血液的取材，并制作条形码标签，将样本进行分装。1. 取材单：手术医生根据临床病例情况在术前一日通知样本库次日取样本，同时在医嘱中注明需要抽取血样数量、种类。样本库根据次日样本情况预先准备样本提取单，并预先定义好流水编号。样本提取单上的信息可包含并不仅限于以下内容中的一部分：A. 个体流水编号B. 个体基本信息：如住院号，病理号，手术科室，手术医生，病人姓名，性别等C. 样本特征信息：如脏器名称，样本类型（肿瘤，癌旁，正常，淋巴结，息肉，囊壁），样本性质（原发/复发/转移）等D. 样本采集信息：如样本份量，体积，分管数，术前/术后等E. 诊断信息：如临床诊断，病理诊断，分化程度，UICC 分期，ICD10/ICDO-3 代码等F. 治疗信息：如放疗，化疗，手术等G. 生物安全信息：有/无传染性H. 时间信息：采集时间，样本离体时间，低温时间，等I. 工作人员信息：取材员，记录员等J. 以及备注信息。2. 组织样本：从手术室收集组织样本，填写取材表。在组织库冻存管理软件上登记部分栏目，如通过输入住院号码，软件从HIS 中自动调入该病例的个体信息（基本信息、临床信息等）。如果输入部分信息，由系统自动生成连续于上次的个体编号，如选择脏器名，样本类型，样本保存方式，以及分管数，软件按照规则生成样本编号，如1012345D19TF1~1012345D19TF4，在对应的样本信息栏中输入各分管的样本采集信息等特性，点击保存将所有信息存入数据库，同时自动在手术室的耐液氮的条形码标签上生成样本条形码信息。将离体的组织样本存入耐液氮冻存管，贴好标签后，在30分钟内浸入液氮。当天样本采集完成后，使用小型液氮转移罐或者冰盒将样本转移到实验室。【组织样本的编号命名1012345D19TF1，代表该1012345 号病收集的D19 脏器的癌旁样本（T肿瘤，P 癌旁，N 正常，L 淋巴结，Y 息肉，C 囊壁）用F 方式（Frozen Tissues/OCT/RNAlater/DNA/Paraffin embedding 等）保存的第一份。】

请教一下大侠，有没有简单便宜的扫描电镜微生物处理方法呢？多谢！

目前要开发新的项目，文献报道有的要做血细胞破碎，先溶血。不知是什么原因，很多生物分析方法不是说要防止溶血的吗？