神经免疫

p 　　近日，在北京举办的“国家神经系统疾病临床医学研究中心建设推进与战略研讨会”上，兰州大学第二医院神经内科成为全国首批29家“国家神经免疫与感染疾病研究分中心”之一，成为甘肃省唯一一家分中心单位。 /p p 　　兰大二院神经内科成为全国首批“国家神经免疫与感染疾病研究分中心”，标志着兰大二院神经免疫感染性疾病的诊治及科研与国内高水平和国际水平接轨。中心将致力于建设并完善我国神经免疫与感染疾病医疗与临床科研体系，在全国范围内整合神经免疫专科力量，通过高层次对话与合作搭建专家与政府、医院之间以及医患之间的沟通桥梁，为甘肃省神经内科事业的发展做出新的贡献。 /p

帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（AD）是由基因、环境和家族因素相互作用引起的神经退行性疾病。值得注意的是免疫系统对疾病发展的影响，脑部驻留的小胶质细胞的功能障碍，会导致神经元的丧失和症状加剧。研究人员通过神经免疫系统模型来更深入地了解这些神经退行性疾病的生理和生物学方面以及它们的发展过程。不列颠哥伦比亚大学的Stephanie M. Willerth教授团队和英国诺丁汉特伦特大学的Yvonne Reinwald教授团队于2024 年 1 月 23 日在《Journal of Neuroinflammation》（影响因子：9.3）杂志上发表了题为“Modeling the neuroimmune system in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases”的综述，介绍了神经免疫系统在三维模型和器官芯片系统方面取得的进展，以及模型在准确模拟复杂的体内环境方面的巨大潜力。 研究背景阿尔茨海默病（AD）是老年人中最常见的痴呆类型，与淀粉样斑块和磷酸化Tau蛋白的异常积累有关，虽具体原因尚不完全清楚，但与遗传和环境因素相关，诊断及早干预至关重要。帕金森病（PD）是一种神经系统疾病，主要表现为运动障碍，与聚集的α-突触核蛋白（α-syn）沉积物Lewy小体有关，相关基因变体也与其发病风险增加有关。尽管PD的确切原因尚不清楚，但其发病机制可能涉及多巴胺能神经元功能障碍以及氧化应激、线粒体功能受损、蛋白质代谢异常和神经炎症等多种因素。图1：阿尔茨海默病和帕金森病的病理生理学。 中枢神经系统（CNS）过度炎症的特征包括多种因素共同促进疾病进展，其中包括各种抗炎与促炎细胞因子的失调、CNS内小胶质细胞等免疫细胞的表型转化，以及外周细胞的巨噬细胞和淋巴细胞的招募，这些因素均导致突触丧失，成为随后认知功能障碍的最常见病理相关因素。图2：健康与病理神经免疫系统的比较:在健康的神经免疫系统中(1)小胶质细胞处于稳态和监视状态，(2)外周免疫细胞向中枢神经系统的浸润有限。在病理性神经免疫系统中：(3)小胶质细胞反应性增强，形态改变，(4)吞噬作用增加，(5)炎症标志物增加，(6)外周免疫细胞浸润增加。 研究进展1、目前阿尔茨海默病和帕金森病的治疗和临床试验针对AD，乙酰胆碱酯酶是一个常见的药物靶点，近期研究专注于开发单克隆抗体等药物以减少Aβ负荷，如lecanemab和aducanumab。此外，针对AD的临床试验正在进行中，旨在测试药物、设备和行为以改善患者认知和减缓疾病进展，而对于PD，则主要以药物和深部脑刺激为主要治疗手段，同时也在研究新的免疫调节治疗方法。 2、阿尔茨海默病、帕金森病和免疫系统的体外免疫系统模型癌症免疫系统的研究已经取得了许多成果，其中包括对3D模型的发展，这对于疾病建模和药物筛选至关重要，尤其是针对新的化疗药物和人工组织的开发。一种体外建模方案是使用细胞系，最常用的是SH-SY5Y人类神经母细胞瘤细胞系，模拟未成熟的儿茶酚胺能神经元，并可通过暴露于神经毒素或基因修饰来模拟AD或PD。然而，SH-SY5Y存在缺乏确立的培养维持程序、实验结果不一致和细胞生长的可变性等缺点，且不表现出成熟神经元的电生理和电化学特征。利用诱导多能干细胞（iPSC）创建基因准确的AD和PD模型，成为一个快速发展的研究领域，这些模型可以通过体细胞来源的iPSC诱导后，生成神经元与免疫细胞，用来构建AD和PD模型。图3：神经免疫系统的体内和体外模型的优缺点。 3、器官芯片模型在神经免疫系统研究中的新进展器官芯片平台的出现为建立体外模型提供了增强的设计和控制能力，能够模拟生物、生化、生理和机械现象，在活体器官系统中的发生。从血液-脑脊液屏障微流控模型到脑芯片模型，研究者们不断探索着复杂的生理学建模，为深入分析神经免疫相互作用提供了新的可能。这些模型不仅揭示了神经炎症在神经退行性疾病中的重要性，还为治疗干预提供了潜在途径，为了解AD和PD的潜在机制提供了宝贵的见解。同时，脑芯片模型被广泛应用于研究神经血管相互作用和神经退行性的不同方面。通过模拟神经-胶质-血管相互作用，研究人员发现了柴油排放颗粒等外源因素对AD类疾病病理特征的影响。这些研究不仅强调了神经免疫特异性行为的重要性，还突显了人类细胞模型在理解神经退行性疾病方面的关键作用。然而，尽管研究对细胞间相互作用和人类细胞模型的依赖日益增加，但对于AD和PD潜在机制的理解仍然相对有限。图4：芯片上器官的发展:示意图显示了开发和制造微流控芯片所需的步骤 先进的免疫细胞相互作用在AD和PD病理中至关重要，调节其功能可能为更有效的治疗提供希望；器官芯片模型具有模拟复杂细胞相互作用的优势，有助于深入了解AD和PD疾病机制并发现新的治疗策略。 文献索引：Balestri W, Sharma R, da Silva VA, Bobotis BC, Curle AJ, Kothakota V, Kalantarnia F, Hangad MV, Hoorfar M, Jones JL, Tremblay MÈ , El-Jawhari JJ, Willerth SM, Reinwald Y. Modeling the neuroimmune system in Alzheimer's and Parkinson's diseases. J Neuroinflammation. 2024 Jan 23 21(1):32. doi: 10.1186/s12974-024-03024-8. PMID: 38263227 PMCID: PMC10807115. 关于艾玮得生物作为一家专注于人体器官芯片及生命科学设备研发与生产的创新科技公司，艾玮得器官芯片应用全场景解决方案已能够全面覆盖新药研发评价、临床药敏检测、基础科学研究等应用领域，为科研、临床、药企等客户提供一站式解决方案。

7月20日，《柳叶刀-区域健康（西太平洋）》这一国际知名医学期刊发布了全球首个重症肌无力抗体诊断I级方法学推荐证据，证实了基于细胞的抗体检测新技术CBA在诊断可靠性方面优于放射免疫等传统诊断技术。这一突破性成果源自于“SCREAM”研究（NCT05219097），这项全国多中心、前瞻性和双盲试验由京津神免中心领导完成，得到金域医学和天海新域的诊断平台和试剂支持，为指导临床医生选择重症肌无力等神经免疫病的临床诊断提供了重要参考。重症肌无力（MG）是一种由自身抗体介导的神经免疫疾病，早期明确诊断对于患者的治疗和病情控制至关重要。MG患者血清中存在多种相关自身抗体，包括乙酰胆碱受体（AChR）抗体、肌肉特异性受体酪氨酸激酶（MuSK）抗体、连接素（titin）抗体、兰尼碱受体（RyR）抗体等，其中AChR和MuSK抗体是国内外MG诊治指南推荐的首选实验室诊断指标。MG自身抗体的检测方法包括放射免疫沉淀法（RIPA）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）和细胞免疫荧光法（CBA）等多种，然而这些方法的特异度和敏感度存在差异，选择不同的检测技术可能会影响自身抗体检测结果的准确性。目前缺乏针对不同检测技术敏感性和特异性的大样本多中心研究证据，无法满足神经免疫病的诊治、患者转诊抗体检测结果互认以及全球药物临床试验认可的技术需求。为解决这一难题，由天津医科大学总医院/北京天坛医院施教授团队领导，全国多家神经免疫中心共同发起了“SCREAM”研究，得到了金域医学和天海新域的CBA诊断平台和试剂支持，完成了这项前瞻性双盲研究（The Specificity, Sensitivity and Clinical Correlation of CBA, RIPA and ELISA Assay in Detecting AChR and MuSK-IgG, NCT05219097 “SCREAM”研究），为AChR和MuSK抗体检测方法学选择提供了指导性建议，将进一步推动MG自身抗体诊断的规范化。“SCREAM”研究是迄今纳入样本量最多的MG抗体诊断方法学大型队列研究，也是首个前瞻性、双盲研究。由此产生的循证医学证据达到I级推荐标准，为临床医生选择最佳实验室诊断方法提供了关键依据，同时对其他神经免疫病抗体检测及临床试验也具有重要参考价值。神经免疫疾病是全球青壮年致残的首要原因，包括多发性硬化、视神经脊髓炎和重症肌无力等。目前，金域医学联合京津神免中心、天海新域建立了神经免疫病诊断技术的创新研发、产品标准化和应用的联动体系。CBA+TBA诊断体系涵盖常见的重症肌无力、中枢神经系统炎性脱髓鞘、自身免疫性脑炎等疾病近百个抗体检测项目。同时，金域医学与天海新域共同参与神经免疫病大样本数据研究，为“重症肌无力及中枢神经免疫病抗体检测专家共识2022”、诊断方法学I级推荐证据研究等提供支持。从金域医学此次新动态可知，双方还为临床医生提供诊疗决策支持工具，帮助实现患者管理、减缓免疫损伤和疾病进展，助力提升神经免疫专业临床医生诊治水平，为我国神经免疫专科的高质量发展贡献力量。

9月5日，国际神经病学顶级期刊JAMA Neurology（影响因子29）在线发表了国际创新技术-免疫斑点法（IDoT）检测水通道蛋白（AQP4）抗体的研究论著，为快速诊断神经免疫疾病增添助力。这是目前国内神经免疫抗体检测领域首个发表于该期刊的研究，在国际神经免疫病研究领域发出了中国声音，也体现了国际同行对中国开展国际临床合作研究的认可。该研究由中山大学附属第三医院（以下简称“中山三院”）、福建医科大学附属第一医院、陕西师范大学联合组成的中国团队领衔，其中中山三院邱伟、韩国国立癌症中心（NCC）Ho Jin Kim为共同通讯作者，福建医科大学附属第一医院付莹、毕锦，陕西师范大学闫亚平以及中山三院孙晓渤为共同第一作者。视神经脊髓炎视谱疾病在亚洲多见视神经脊髓炎视谱疾病（NMOSD）是神经免疫病的一种，在亚洲女性中发病率较高。NMOSD会反复发作视神经炎和脊髓炎，最终造成神经功能障碍，给家庭、社会造成负担。目前，NMOSD诊断依赖外周血水通道蛋白4（AQP4-IgG）抗体检测，因此，基于细胞表达的抗体检测方法（CBA）于2015年被国际NMOSD诊断指南推荐，作为当今AQP4-IgG抗体检测的金标准。然而，CBA法耗时3-7天，且需要特殊实验室和技术人员等，大大限制了CBA法的广泛使用，尤其在一些NMOSD高发、但医疗条件欠发达的地域；并且，目前商品化的检测试剂盒仍依赖国外进口，检测成本极高。解决传统AQP4-IgG抗体检测的瓶颈，是全球神经免疫学者关注的重点，同时中国人作为NMOSD高发人群，我国需要具有自主知识产权的可靠检测方法。面对临床需求，中山三院、福建附一、陕西师大与国际学者组成联合攻关团队，从临床问题出发，依托中国南方NMOSD临床队列，开展基础-临床结合的转化研究，共同进行抗体检测新技术的研发与验证。研究过程中，陕西师大闫亚平团队首先利用表达AQP4的细胞提取的膜碎片（带有完整AQP4空间构象）作为抗原底物，创建一种高效、易操作的AQP4-IgG检测新技术--IDoT法。随后，邱伟、孙晓渤团队以及福建医科大学附属第一医院付莹团队，联合韩国国立癌症中心（NCC）Ho Jin Kim团队自主设计，开展为期3年（2020年5月-2023年2月）的前瞻性、病例-对照、国际多中心交叉验证研究。该研究在中国（广东、福建）和韩国共检测836例患者的血清样本。结果显示，与传统的金标准CBA法对比（活细胞CBA法或者固定CBA法等），IDoT法的抗体检测性能与CBA相当，诊断性研究结果Kappa系数为98.0%（400例患者）；436例验证者，包括275例其他疾病队列（风湿免疫疾病等）、57例NMOSD前瞻性随访队列、31例国内交叉验证队列、73例韩国神经免疫疾病队列交叉验证（NMOSD、MOGAD等），整体验证队列结果中，仅2例与CBA检测不一致。因此，IDoT总体敏感性为99.4%（95%CI:97.8%- 99.9%），特异性为99.2%（95%CI:98.0%- 99.8%）。新方法有望降低检测成本该研究证明，IDoT法与目前金标准CBA法具有相同检测效能。但IDoT法高效、易操作，可实现在普通实验室、一般技术人员、广泛人群中进行AQP4-IgG抗体检测，在快速筛查中具有更广泛的应用前景，可实现NMOSD患者早诊断早治疗，同时为资源较少和经验不足的基层医院以及其他经济欠发达国家提供一种可选择方法，最终实现提高AQP4-IgG抗体检测率。该研究成果是我国的自主研发成果，有效解决国内神经免疫抗体检测的“卡脖子”问题，也填补了国际上快速检测AQP4-IgG抗体领域的空白，对于推动全球NMOSD的早期精确诊断具有重要意义。同时，我国对该成果自主知识产权的拥有，未来将大大降低NMOSD诊断成本，促进患者群体早诊断早干预，减轻家庭与国家的经济负担。JMMA Neurology 在全球享有很高的声誉和影响力，研究论文得到了JMMA Neurology 杂志多个审稿人的高度评价，认为 “这项非常详实的研究将引起神经科医生的极大兴趣，克服在不同医疗条件下NMOSD抗体检测的障碍”、“该研究发现将对NMOSD抗体检测领域产生重大影响”、“该研究是神经免疫抗体检测技术的重大进步”。

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中枢神经系统的自身免疫性疾病，如多发性硬化、视神经脊髓炎谱系障碍，以慢性、进行性神经炎症、脱髓鞘和神经变性为特征。这些疾病在发病率和临床特征上都表现出强烈的女性倾向，其患者多为中青年女性。随着疾病的进展逐渐失去自主活动能力。已有的治疗药物多为对症治疗，选择品种有限且价格昂贵，无法得到根治，给家庭和社会带来巨大的负担。因此，迫切需要开发能够有效延缓这类疾病进展的药物，而目前对这类疾病认识有待更新，拓展研究思路是建立新的治疗方法的重要基础。　　2023年11月21日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)、神经科学国家重点实验室周嘉伟研究组、中国科学院分子细胞科学卓越创新中心宋昕阳研究组、中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心朱正江研究组与上海交通大学医学院附属瑞金医院神经内科陈晟团队合作在Immunity上发表了文章Intestinal epithelial dopamine receptor signaling drives sex-specific disease exacerbation in a mouse model of multiple sclerosis(肠道上皮细胞多巴胺受体信号驱动雌性多发性硬化小鼠疾病进展)，利用基因修饰小鼠和药理学实验方法以及多组学联合分析，他们发现，肠道上皮细胞多巴胺D2受体(IEC DRD2)过度激活可以选择性地在雌性小鼠中改变肠道菌群的组成及其代谢物水平，从而促进多发性硬化的发病。此研究聚焦中枢神经系统自身免疫性疾病研究前沿，独辟蹊径，通过跨系统研究，揭示了肠道远程调控中枢神经系统自身免疫性疾病易感性的新机制，为建立具有性别选择性的中枢神经系统自身免疫性疾病干预手段开辟了一条新途径。　　　　已知，肠道微生物群失调促进多发性硬化的发展。在多发性硬化动物模型中，肠道微生物群在疾病的起始阶段、效应阶段和调节阶段以及个体对药物治疗的反应中都起着关键作用。然而，由于个体之间，肠道微生物群组成的差异很大，迄今，国内外医学界未能建立起具有广泛代表性的“核心微生物群表型”。肠道上皮细胞为胃肠道构筑了一条防线，不仅可以隔绝肠腔及其内容物，还可以整合肠腔内的多种菌群信号，以维持胃肠道正常生理功能。据报道，有多种与多发性硬化相关的肠道细菌可以产生多巴胺受体激动剂，因此，作者设想，肠道上皮细胞多巴胺受体介导了菌群和宿主相互联系，并且这种联系在多发性硬化发病过程中发挥重要作用。　　为对上述设想予以验证，作者分别构建了在肠道上皮细胞分别特异性敲除多巴胺D2、D3、D4受体的小鼠，同时根据文献提供的肠道细菌产生大量的多巴胺受体激动剂苯乙胺这一线索，利用实验性自身免疫性脑脊髓炎作为多发性硬化动物模型，观察在上述基因缺失的情况下，小鼠行为学、病理学的变化，并作多组学分析，之后，使用小胶质细胞系和野生型小鼠对所发现的差异代谢物进行筛选，寻找和鉴定可以减轻动物模型发病严重程度的代谢物。同时收集多发性硬化患者和健康对照的粪便样品用于靶向代谢物检测，验证苯乙胺含量与多发性硬化发病之间的相关性及性别差异。　　首先，通过代谢组学检测，作者发现，多发性硬化患者粪便中苯乙胺含量显著高于健康对照，且存在性别差异。通过条件性基因敲除等实验方法，观察到只有肠道上皮细胞多巴胺受体D2，而不是D3和D4基因缺失，可显著缓解多发性硬化小鼠模型发病的严重程度。通过与野生型对照组转录组的对比，发现DRD2敲除的多发性硬化小鼠模型中，肠道溶菌酶等抗菌肽表达量显著减少 同时通过16s rRNA测序，发现在造模前和发病高峰期肠道菌群组成出现显著差异 通过同笼饲养和抗生素处理，发现DRD2在多发性硬化小鼠模型的作用是肠道菌群依赖的 通过非靶向代谢学检测和代谢精准分析术 MetDNA，鉴定了47种只在雌性小鼠脊髓中存在差异的代谢物。之后，利用小胶质细胞细胞系BV2细胞和野生型小鼠对这些差异代谢物进行筛选，确定了N-乙酰赖氨酸可以在整体动物和体外培养细胞水平显著抑制炎症反应，从而缓解自身免疫性脑脊髓炎的发病。　　为了进一步探究N-乙酰赖氨酸抑制炎症的分子机制，利用磁珠分选、流式细胞分选等方法，将脊髓中的小胶质细胞分离并进行转录组测序及单细胞测序。发现N-乙酰赖氨酸显著降低了多发性硬化相关小胶质细胞的比例，提高了增殖性小胶质细胞和稳态小胶质细胞的比例。表明N-乙酰赖氨酸有利于恢复多发性硬化小鼠模型失衡的中枢神经系统免疫稳态。　　传统观点认为，性激素等在中枢神经系统自身免疫性疾病发病过程中发挥重要作用。本研究显示，肠道的苯乙胺-多巴胺D2受体-溶菌酶信号轴是决定雌性动物或中青年女性群体对多发性硬化发病易感性的重要因素，这是对传统观点的新的延伸和拓展。作者还揭示了肠道—微生物群——脑的相互作用是如何调控中枢神经系统免疫稳态，这一调控方式突出了宿主肠道细胞本身对肠道菌群的核心作用，为发展基于肠道上皮细胞活动调控的脑疾病干预方法提供了新的分子和细胞基础。N-乙酰赖氨酸的抑炎作用的发现为研发适用于女性多发性硬化患者的神经炎症治疗方法提供了新的机会。　　该项工作由彭海蓉博士、邱佳倩、周勤明博士和博士研究生张彧锴在周嘉伟研究员、宋昕阳研究员、朱正江研究员和陈晟教授的指导下完成，课题组的其他成员积极参与，并得到了中国科学院上海营养与健康研究所肖意传、邱菊研究员的大力协助，因此，是众多课题组通力合作的结果。　　在雌性小鼠中，粪便中较高的苯乙胺浓度会引起肠道上皮细胞中的DRD2过度激活，促进溶菌酶和防御素表达量增加。这些过量的抗菌肽，对细菌的杀伤力增强，因此，乳酸杆菌等对溶菌酶敏感的菌种在雌性小鼠体内减少。而乳酸杆菌产生的N-乙酰赖氨酸对小胶质细胞介导的炎症具有很强的抑制作用，是缓解中枢神经系统自身免疫性疾病，如多发性硬化的物质基础之一。　　原文链接：https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.10.016

炎症是机体对抗感染及组织损伤反应的一个重要组成部分，但失控的炎症可导致各种疾病发生，并促进癌症形成。　　报道：炎症是机体对抗感染及组织损伤反应的一个重要组成部分，但失控的炎症可导致各种疾病发生，并促进癌症形成。由德克萨斯大学MD安德森癌症中心领导的一项新研究，有可能会让罹患多发性硬化症（MS）和其他炎症性疾病的患者受益。这项研究描述了一个叫做Trabid的蛋白质调控因子，是导致多发性硬化症患者中枢神经系统自身免疫性炎症这一谜团中一个重要的部分。研究结果发表在Nature Immunology杂志上。 文章作者，德克萨斯大学MD安德森癌症中心免疫学教授Shao-Cong Sun表示，“我们的研究结果阐明了调控细胞因子基因IL-12和IL-23的一个表观遗传机制，确定了Trabid是炎症性T细胞反应的一个免疫调控因子。Trabid似乎通过控制组蛋白去甲基化酶Jmjd2d的命运调控了组蛋白修饰。”细胞因子是一些对细胞信号传导极为重要的小蛋白，IL-12和IL-23是炎症介质，与一些炎症性疾病有关联。孙少聪认为，Trabid和Jmjd2d有可能是治疗多发性硬化症一类炎症性疾病的潜在治疗靶点。“由于慢性炎症是一个重要的癌症风险因子，未来的研究将会探究Trabid和Jmjd2d是否也在癌症形成中起作用。”研究人员说，IL-12和IL-23一类的促炎症细胞因子连接了一些先天反应和免疫反应，与一些自身免疫性疾病和炎症性疾病相关。先天免疫系统，也称作非特异性免疫系统，其包括一系列的细胞及相关机制，可以非特异性方式保护宿主抵御其他生物的感染。“包括树突状细胞和巨噬细胞在内先天免疫系统细胞，对适应性免疫反应的性质和强度起重要的调控作用。它们能够识别微生物组件，包括各种受体，这些受体可触发细胞内信号传导事件影响这些细胞的功能。先天免疫系统细胞异常生成促炎症细胞因子也可以导致一些自身免疫和炎症性疾病。”这一研究发现，删除树突状细胞中Trabid的蛋白质编码基因Zranb1，可抑制IL-12和IL-23表达，破坏炎症性T细胞分化。这一过程保护了研究小鼠免于自身免疫炎症。

2013 年，佛罗里达大学的研究团队曾经在《科学》（Science）杂志上发表文章，通过一种栉水母（Mnemiopsis leidyi）的基因组撼动了进化树的根基，那篇文章一经发表就引起了热议。现在，他们又在《自然》（Nature）杂志上发布了另一种栉水母的基因组草图，再次验证了自己的观点。论文资深作者、佛罗里达大学的神经科学家 Leonid Moroz 表示：“栉水母（ctenophore）就像是来到地球的外星人。”它们通过特殊的纤毛在海洋中游动，看起来就像是迪厅的球形灯。它们通过粘乎乎的触手捕获食物。Moroz 和他的团队对太平洋侧腕水母（Pleurobrachia bachei）进行了基因组测序，他们发现栉水母拥有独一无二的神经系统。其他动物共用许多与免疫、发育和神经功能有关的基因家族，但栉水母完全不具备这些基因。这不仅令栉水母更加神秘，也再次证实栉水母是独立演化出自己的神经系统。栉水母一直令分类学家们头疼不已。它们和水母看起来很相似，曾经被视为刺胞动物（包括水母）的姐妹群（Sister group）。也有人将栉水母放在缺乏神经系统的扁盘动物和海绵之后，因为栉水母具有能够检测光、感知猎物和移动肌肉组织的神经系统。Moroz 认为，栉水母与所有动物的共同祖先是近亲。他在 2013 年的《Science》论文中提出，神经系统出现了两次各自独立的演化，栉水母的神经系统演化与其他动物完全不同。现在，P. bachei 基因组分析为这一观点提供了有力的支持。研究显示，P. bachei 基因组不仅缺乏其他动物的共有基因，而且不具备调控基因表达的 microRNA。此外，栉水母的神经系统还缺乏普通神经系统中的标准组分。 其他动物的神经系统都使用同样的十种主要神经递质，而太平洋侧腕水母则只用了其中的一两个。 Moroz 推测，这种生物可能使用了其他未知分子来完善神经系统，例如特殊的蛋白激素等。栉水母的上述独特性质，让研究团队确信它的神经系统演化独立于其他动物，大约在五亿年前从进化树上分支开。Moroz 表示：“人们总认为复杂的神经系统不可能进化两次，但这一事件的确发生了。”神经系统在不同动物分支中演化两次的观点，一直令慕尼黑大学的进化生物学家 Gert W?rheide 着迷。不过他并不认同 Moroz 等人给栉水母安排的进化位置，他认为所有动物的共同祖先可能与栉水母没什么关系。P. bachei 的神经系统也可能是后来发生的某种适应性改变，他说。“我认为现在断言栉水母在进化树中的地位还为时过早。”

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，我们将分三期陆续介绍。本期介绍第一部分。1. 背景介绍成像技术是推动生命科学几乎所有学科基础研究的核心平台。在神经科学领域，近几十年来，共聚焦显微镜技术已成为分析神经组织的标准荧光成像技术。激光扫描共聚焦显微镜对固定的神经元样本进行观察，在扫描水平上提供了三维和多色图像并使单个细胞达到树突结构的分辨率。作为补充，电子显微镜（EM）用于获取神经元和亚区室超微结构的信息，并用于大脑的连通性分析。EM非常适合于神经元突触和囊泡、细胞器和膜构象的结构分析。然而，由于靶向特异性标记方法的局限性，基于EM的复杂样品中蛋白质和特定电子密度特征的识别受到限制。为了进一步理解神经元功能，包括双光子显微镜在内的几种活体视频显微镜应用的发展使神经元细胞培养的活细胞成像、器官型切片培养和动物模型的活体成像成为可能。同时，新的荧光染料、功能探针和荧光蛋白以及光遗传学方法和光驱动（如笼状化合物）不仅可以表征神经元，还可以操纵神经元及其从单分子水平到整个神经系统的相互作用。然而，荧光显微图像中可见细节的水平，即图像分辨率，仍然受到衍射极限的限制。一个多世纪以来，由λ/2NA定义的阿贝衍射极限（λ为波长，NA为显微镜物镜的数值孔径）决定了光学显微镜的分辨率极限，限制了两个位置小于200纳米的细节分辨。在过去的二十年中，超分辨显微镜（SRM）已经发展成为一种非常有效的亚细胞水平荧光成像和分辨细胞器结构的研究手段。SRM现在可以提供远低于常规光学显微镜衍射极限的空间分辨率，从而能够深入了解神经元细胞和组织中蛋白质的空间结构和相互作用。本文综述了超分辨显微镜和荧光标记方法及其在神经科学中的成功应用。我们将首先详细介绍各种SRM方法的基本原理、新的功能型荧光探针和标记技术。接着，我们将回顾SRM如何有助于我们理解神经元亚细胞结构和功能以及神经元−胶质细胞相互作用。此外，我们将概述超分辨率成像方法如何帮助研究自身免疫和神经退行性疾病的病理生理学。最后，我们将介绍这些新的成像方法是如何应用于神经精神疾病相关的人类样本的分析。由于该领域持续快速发展，我们最多只能代表一份中期报告。进一步的创新和新的显微镜方法的发展将使人们对神经系统功能有更详细的了解。 2. 神经科学中的超分辨率成像方法2.1. 光学衍射极限及其对神经科学的影响人类大脑包含超过800亿个神经元，每个神经元由数千个突触连接。因此，它构成了复杂神经元网络。这些网络的主要组成部分，例如突触神经末梢，显示的空间维度接近于光学衍射极限分辨率∼200 nm。释放递质的突触活性区（突触前细胞基质的特化区）的直径通常约为300±150 nm。突触小泡作为递质运输和释放的关键元件，其尺寸平均小10倍，直径为40−50nm。这些递质被释放到宽度为20-50nm的突触间隙中−再结合突触后受体。由于衍射极限的尺寸限制，胞吐机制和跨突触信号在传统的光学显微镜下基本上是无法观测到的，因此需要用提高10倍分辨率的方法进一步研究。（图1）。图1. 兴奋性突触结构组成。左图为兴奋性突触的油画示意图，右图为左图的灰度图像，其中浅紫色圆圈为衍射极限光斑；玫红色圆圈为兴奋性突触囊泡，约40-50nm；绿色为突触后膜AMPA受体，尺寸小于10nm；黄色部分为突触间隙，约20-30nm。 此外，大量参与突触信号传导的不同的分子，位于极小的突触内，造成很高的分子分布密度，这对微观研究具有挑战性。例如，对于较小的突触，兴奋性突触可以包含数百个小泡，对于大型苔藓纤维束突触，可以包含数千个小泡，每个小泡包含多达1万到10万个递质分子。在这些囊泡中，约有10±5个与释放部位对接，释放的递质平均与0−20 个NMDA受体和0−200个AMPA受体结合，而这些突触后受体又被320±130个突触后PSD-95密度蛋白分子环绕。由于加速电子的波长要短得多，因此EM是唯一能够解析突触纳米级结构的方法。然而，虽然传统的EM产生的电子密度图像具有极好的超微结构分辨率，但需要进行固定和靶向特异性标记的制样方法在很大程度上限制了蛋白质识别和神经元追踪。荧光显微镜可以很容易地对蛋白质进行选择性标记，但是受制于可见光的衍射（400−700 nm）使生成的图像无法实现对纳米结构的分析。 2.2.绕开光学衍射极限的光学显微镜方法 20世纪后期，人们开发了新的策略，通过利用物理或化学手段来区分不同荧光团的发射或减少同一时间荧光分子的数量，以尽量绕过衍射极限。减少荧光团的点扩散函数（PSF）的重叠可以通过生成光图案在集合级别以确定性方式进行，或者通过减少同一时间荧光团的数量在单分子水平上以随机方式进行。在下文中，我们将从确定性集合方法开始介绍，该方法将激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）的有效空间分辨率推到理论极限。2.2.1. 确定性集合超高分辨率成像方法（Deterministic Ensemble SR-Imaging Methods） CLSM用针孔探测器阵列替换单点探测器，空间分辨率可以提高√2倍。CLSM测量每个扫描位置探测器每个点的荧光信号。在应用适当的算法后，生成分辨率提升的图像。这些所谓的像素重分配方法包括图像扫描显微镜（ISM）、重扫描共聚焦（RSC）、光学光子重分配（OPRA）、AiryScan和即时结构照明显微镜（iSIM）。对于信号检测，使用了诸如CCD相机、光电倍增管阵列、单光子雪崩二极管阵列和六角光纤束等探测器阵列。结构照明显微镜（SIM）在光路中插入光栅，产生与样品干涉的相干光束，生成横向和轴向方向不同的新照明图案。然后可以使用傅里叶变换提取这种新照明图案的信息，从而在所有三维空间中实现空间频率分解和分辨率倍增。SIM对样品制备的要求最低，并且可使用所有常规荧光探针，这些探针具有最低的光稳定性，并且可以很容易地扩展到多色成像。然而，当记录三维或长时间成像时，强烈建议使用光稳定性更高的荧光团。此外，SIM使用更低的激发强度，因此是活细胞SR实验的理想选择。为了获得更高的分辨率，引入了通过图案化饱和或荧光激发或图案化耗损光开关染料的非线性SIM（NL-SIM）。然而对染料开关特性的苛刻要求限制了NL-SIM在常规生命科学实验中的适用性。非线性SIM单位时间内还需要采集更多的图像，因此实际上仅限于2D成像。另一方面，掠入射（GI）-SIM显示了高达每秒266帧的快速超分辨率成像以及100nm分辨率，揭示前所未有的细胞器动力学细节。结构照明的局限性在于其对波长的普遍依赖性、与其他SR成像技术相比的低分辨率以及对系统稳定校准的需要。最后，后处理需要进行先验质量检查以避免伪影,例如由于高背景信号或不充分标记产生的低对比度图像导致的人工蜂窝图案。通过受激发射耗损(STED)显微镜进行超分辨率成像是一种实现更高空间分辨率的成像方法。这里，高斯分布的激发激光束被中空的甜甜圈样的耗损激光束覆盖，使扫描点外围的荧光团返回基态，这导致纳米级焦点区的直径与耗损光束的强度成反比，耗损光束的强度直接转换为STED显微镜的分辨能力：上图公式中λ为波长，n为折射率，α为物镜的收集角，ISTED为STED光束的照射强度，IS为饱和强度。因此，可以通过改变损耗激光强度来调整分辨率，可定制设计分辨率达30−80nm 的显微镜。STED显微成像可通过连续或脉冲激光激发、门控检测。带有脉冲激光的STED显微镜会降低激发能量，从而减少实时成像中的光毒性效应。STED显微镜中的时间门控检测可以去除荧光团光子到达时间前的空间信息，并且可以在较低的平均功率下工作。商品化STED能提供用户友好的高分辨率成像，无需进一步的数据后处理。活体成像，例如活体树突棘动态成像已经很成熟，但快速动态成像仅限于小帧尺寸，因为它仍然是点扫描方法，高激光强度可能会导致光损伤。STED通过应用自适应照明方式Dymin和rescue技术，可以明显减少光损伤。在Dymin STED中，在共聚焦模式下扫描时确定最低可能的STED光束强度。根据样品的标记密度，这将使STED光束强度降低20到100倍。Rescue STED同样通过减少STED激光开放的区域，从而比普通STED减少光漂白接近8倍。STED的另一个限制是对荧光团光稳定性的依赖，因为在高激光强度下会发生明显的光漂白。这影响了动力学的研究和三维图像的获取。值得注意的是，最近通过使用荧光团标记的寡核苷酸（瞬时结合到连接靶蛋白结合探针的互补寡核苷酸）或非结合荧光团来进行细胞STED成像，从而绕过了STED光漂白问题。这两种方法中，基于DNA互补标记的STED成像和超分辨率阴影成像SUSHI分别通过荧光团标记的寡核苷酸和高浓度的非结合和自由扩散的荧光团不断交换来防止光漂白。SUSHI的方法已经成功地用于活体脑片中细胞外间隙和神经肽的结构解析及其动力学的STED成像。如果使用具有毫秒或更长寿命的两种稳定状态的可逆切换荧光团来代替标准荧光团，则STED强度可以显著降低。可逆饱和切换光学线性荧光转换方法（RESOLFT）已通过可逆可切换荧光蛋白（reFPs）实现，并成功应用于活体海马脑片树突棘的超分辨率成像。2.2.2. 随机单分子SR成像方法（Stochastic Single-Molecule SR-Imaging Methods）上述的确定性方法是通过改变激发模式或相位掩膜来暂时控制荧光发射达到超分辨成像，而基于单分子的定位SR显微镜则是随机地在时间上分离单个荧光团的发射。单分子定位显微镜（SMLM）基于单个荧光团的随机激活，使用配备高灵敏相机（EMCCD或sCMOS）的宽场荧光显微镜进行单分子检测，以及精确的位置测定。通过将理想PSF与实际测量的光子分布拟合来进行分子定位。只要信号来自单个发射区，且单个发射区之间的距离大于显微镜能分辨的最小距离，则通过收集更多光子和最小化噪声，定位的标准误差可以任意小。激活和定位过程重复多次，所有定位最终用于重建超分辨率图像。为了确保在成像的任何时候，只有稀疏的小荧光团以其活性荧光形式存在（开启状态），使用了光开关、光转换、光激活或自发闪烁的荧光团。由于定位精度和最终图像分辨率取决于每次检测到的光子数量，通常采用明亮且稳定的荧光团与1 kW/cm2的辐照强度相结合的方式。根据所使用的荧光团不同，SMLM可达到10−50 nm横向分辨率。光激活荧光蛋白（FPs），自2006年以来已用于光激活定位显微镜（PALM），例如在405 nm的激光照射下可从关闭状态不可逆地转换为打开状态的PA-GFP和PA-mCherry 以及可通过适当波长的激光照射从一种波长状态不可逆地转移到另一种波长状态的光转换FPs，例如MEO。此外，还成功地应用了诸如Dronpa之类的光开关FPs，其在不同激发波长的激光照射下可在非荧光和荧光状态之间可逆地切换。对于活细胞应用，使用荧光蛋白的PALM是首选方法。因为在理想情况下，每个感兴趣的蛋白质都可以用荧光蛋白进行计量标记。然而，荧光蛋白比有机染料表现出更低的光稳定性和光子计数，从而降低了定位精度，并且通常需要更长的采集时间。此外，对于PALM成像而言，融合蛋白通常会过度表达，这可能会导致不真实图像，而用转基因变体替代显示野生型表达和功能的自身蛋白仍然具有挑战性。对于细胞内源性蛋白质的标记，通常使用有机染料的免疫标记。SMLM适用的有机染料必须是光开关、光激活或自发闪烁的，以实现单个染料发射的时间分离，但化学计量标记要困难得多。有机染料通常表现出较高的光子计数和光稳定性，从而使定位精度达到5−10nm。花菁染料Cy5和Alexa Fluor 647可以在荧光开启状态（其典型寿命为10 ms）和非荧光关闭状态（寿命为几秒，利用光开关缓冲液，缓冲液包括PBS，10−100mM硫醇，如ß-巯基乙缅（MEA），酶促氧清除剂，可以有/没有激活染料）之间可逆切换，为随机光学重建显微镜（STORM）和直接型STORM（dSTORM）的发展铺平了道路。近年来，应用于（d）STORM的染料已大大扩展，除了菁染料外，还包括罗丹明和恶嗪染料。有趣的是，最近的研究表明，即使是多个标记的抗体在光开关缓冲液中也呈现出类似于单发射的表现，因此适用于dSTORM实验。光活化染料的作用与光活化荧光蛋白相似。也就是说，它们在被光照射或自发激活之前处于非荧光状态。罗丹明衍生物PA-JF549和PA-JF646以及桥环菁染料Cy5B是已成功用于SMLM的光活化染料。此外，在没有光开关缓冲液的水溶液中，硅罗丹明HMSiR等自发闪烁染料也能应用于SMLM。最近，通过图案化照明方式实现更高的定位精度，单个荧光发射区的定位得到了改进。定位精度取决于信号的大小和强度，可以通过测量的PSF标准偏差的平方除以收集的光子数来估计。然而，包括拟合性能、标记密度、标记误差和显微镜漂移在内的其它参数决定了高定位精度是否可以转化为低于10 nm的空间分辨率。此外，到目前为止，因为SMLM方法成像需要昂贵的仪器和成像者具备广泛的专业知识，这在一定程度上阻碍了其广泛应用。2.2.3. SMLM-点累计纳米成像技术（PAINT，Point Accumulation for Imaging Nanoscale Topography）第一代SMLM技术依赖于荧光团的光开关和光激活，其分辨率需要有效地利用荧光团发出的光子数，而PAINT(point accumulation for imaging nanoscale topography)方法使用活的，与目标区域结构短瞬结合的染料。在成像过程中，被漂白的荧光团可以被成像介质中充足的新鲜荧光团不断置换替补。由于游离染料在采集单个图像帧期间在多个像素上快速扩散，因此它们仅显示为模糊背景且不能准确定位，而结合染料显示为PSF且能准确定位。因此PAINT的第一种方法是将荧光染料（如尼罗红）与细胞膜进行非特异性结合，然后进行光漂白和新的结合。此外，基于蛋白质片段的探针被用于单分子定位标记。在最近的一个研究中，将这种方法与传统的基于phalloidin的肌动蛋白标记方法进行了比较。通过引入通用PAINT（uPAINT）使Ni-Tris-NTA与转基因蛋白质上表达的His-Tags更特异结合，并可用于突触间隙成像。uPAINT也可以应用于其它标记方法，如免疫标记（内源性蛋白抗体、纳米抗体如绿色荧光蛋白）或受体配体结合。为了提高PAINT的适用性和特异性，引入DNA-PAINT方法。它使用长度小于10个核苷酸的短的可控的寡核苷酸链（成像链）瞬时标记其靶结合互补寡核苷酸链（对接链）。成像链与对接链的瞬时结合产生明显的闪烁。因此，荧光团开-关状态之间的切换与其光物理性质不直接关联。DNA-PAINT首先在DNA折纸（DNA-origami）上得到验证。DNA折纸是一种自组装的DNA结构（具有已知的大小），通过侧链和荧光团进行结合，并通过宽场显微镜观察。总的来说，DNA-PAINT是一种易于实现的SR成像标记方法，无需特定光物理特性的荧光团。因为探针可以在一轮结合后，从成像介质中置换补充荧光团，从而避免了光漂白。DNA-PAINT的缺点是图像获取时间长，这是由成像链与对接链的结合和解离速率决定的，以及荧光成像链的纳摩尔浓度引起的背景信号。尽管通过使用优化的DNA序列和缓冲条件，以及使用串联的周期性DNA结构域或通过短肽的卷曲螺旋相互作用（称为“Peptide-PAINT”），可以加快采集速度，但还是要利用全内反射荧光（TIRF）（仅限于对靠近盖玻片结构进行成像的特点），才能更好地减少成像链的背景信号。另一方面，基于DNA的探针提供了序列成像复用的明显优势，如Exchange PAINT中所述，已成功用于小鼠视网膜切片中多个结构的成像（图2）。Exchange PAINT的概念也被推广到dSTORM、STED、SIM和更传统的衍射限制的宽场和共聚焦荧光显微镜。最近，通过一种称为PRISM(probe-based imaging for sequential multiplexing)的基于DNA-PAINT的成像方法，实现了高达10个神经元蛋白质的分辨率约为20nm的多通道成像。该方法使用了低亲和力成像探针，该探针与突触、肌动蛋白和微管一抗上的对接链结合。图2 原代神经元中多个神经元靶点的多标Exchange-PAINT成像。（A）DNA-PAINT顺序成像的四种突触蛋白的超分辨图像：圆圈表示漂移校正的基准点；（B）为（A）中不带*的感兴趣区域的高放大倍率图和超分辨图像。（C）为（A）中带*的感兴趣区域的超分辨结果及单通道图像。2.2.4. 定量SMLM如果每个目标分子都可以单独标记和定位的话，与所有其他超分辨率成像技术相比，SMLM还可以提供有关分子分布和分子绝对数的单分子信息。然而，内源性蛋白质的定量免疫标记仍然是一个挑战，并且多标记抗体的不同定位数目也会使数据解释复杂化。另一方面，达到内源性表达水平比较困难，另外FPs蛋白成熟缓慢也同样会令定量化困难。然而，可以通过设计专门的对照实验估计拷贝数，并提取出有关生物目标结构分子的真实信息。借助合适的算法，SMLM可以提供有关拷贝数、聚类、共定位和复杂化学计量的数据，用于定量模型的生成和模拟。此外，还可以通过将突触结构信息与其功能关联来实现量化，例如膜片钳神经元的生物细胞素标记。例如，通过对链霉亲和素标记后膜片钳神经元进行STORM成像，结合CB1受体的免疫标记，然后在GABA能的海马轴突终端内定量，研究了内源性大麻素信号。本研究发现，与树突投射型中间神经元相比，胞周投射型中间神经元具有更高的CB1受体密度和更复杂的活动区。通过免疫标记和dSTORM研究了黑腹果蝇神经肌肉连接处内源性Bruchpilot（Brp）分子的数量。利用抗体滴定实验，确定了野生型神经肌肉连接处活性区细胞基质中Brp蛋白的数量为137个，其中四分之三以约15个七聚体簇状排列结合从相同组织样本记录的电生理数据，研究Brp如何组织控制活动区功能。利用DNA纳米结构作为校准，每个活性区Brp蛋白的数量估计通过定量DNA-PAINT（qPAINT）实验证实。此外，定量dSTORM实验表明，每个活性区Brp蛋白的数量和分布受突触标记蛋白-1的影响，这说明突触活性区递质释放的复杂性。在最近的一项研究中，使用Alexa Fluor 532和Alexa Fluor 647免疫标记的双色dSTORM已用于小鼠小脑平行纤维活性区中代谢型谷氨酸受体4（mGluR4）的定量研究（图3）。该研究还使用抗体滴定实验估计每个活性区平均包含约35个mGluR4分子，并排列在小纳米结构中。此外，mGluR4通常在munc-18-1和CaV2.1通道附近被发现，这支持了mGluR4与这些蛋白质相互作用以调节突触传递的观点。图3小鼠脑片中代谢型mGluR4受体定位定量双色dSTORM。上图：mGluR4和Bassoon免疫染色的小脑冠状切片的dSTORM图像，作为活性区参考。与宽场显微镜结果的比较。（A）DBSCAN聚类算法定义了近距离的En face活性区表面积（灰色）和mGluR4信号（品红）。（B）活性区大小的频率分布直方图（C）mGluR4信号到突触和突触外区域的映射。（D）通过Ripley H函数分析评估Bassoon和mGluR4的聚集分布。与随机分布的分子（蓝色、灰色）进行比较。虚线表示Ripley分析的最大值。这些研究显示了定量SMLM在神经科学研究中的潜力。可以预见，定量SMLM的进一步发展将为突触前和突触后蛋白质的功能关系，及其组织和结构的研究提供更有价值的信息。2.2.5. 组织三维（3D）SMLM虽然SMLM方法实现了仅几纳米的非常高的水平定位精度，但它需要特殊的方法来打破图像平面上方和下方PSF的对称性，来实现高轴向定位精度。实现高轴向定位精度的两种方法是PSF重塑和多焦面检测，通常用于在3D中精确定位荧光团。在SMLM中最常用的方法是通过在成像路径中插入单个柱面透镜从而不对称地扭曲PSF，利用光学像散原理来实现三维定位。基于像散方法的3D dSTORM技术还可以与光谱拆分相结合，对COS-7细胞中的网格蛋白表面小窝成像。像散引起的畸变程度由荧光团的轴向位置决定，因此可用于轴向位置计算。例如，3D散光SMLM已用于确定抑制性突触后密度区gephyrin蛋白和受体复合物的分布和拷贝数，或突触前活动区和突触后密度区各种成分的空间关系。采用双物镜像散成像方案，通过3D SMLM研究组织中肌动蛋白、血影蛋白和其他相关蛋白的结构，发现这些蛋白在轴突中形成190nm的周期性环状结构。替代方法包括使用相位掩模、变形镜实现双螺旋、四足或鞍点PSF重塑，和双焦面成像方法实现更大的轴向范围，并已成功应用于不同的应用中。为了在2D和3D中定位单个荧光发射区，已经开发了不同的算法和软件工具。在最近的一次综述中，列出了不同3D SMLM方法获得的水平和轴向分辨率，以供比较高30倍。此外，使用NHS染料对所有蛋白进行标记，然后进行迭代ExM，可以对高蛋白密度的结构或细胞器（如线粒体），实现与EM相比具有更高对比度的超微结构细节。为了在分子尺度上进行成像，ExM与SMLM方法（如dSTORM）相结合是一个理想的选择。然而在含有硫醇和盐的传统光转换缓冲液中，会发生荷电氢凝胶收缩。可通过使用低离子强度缓冲液或加入中性溶液使凝胶稳定以避免收缩。另一种策略是使用自发闪烁的荧光团（如HMSiR）在水中进行SMLM。通过Ex-dSTORM实现分子分辨率的关键是膨胀后标记，这增加了表位可及性，从而提高了标记效率并减少了标记错误。Ex-dSTORM超分辨成像已成功应用于原代细胞和神经元中微管和中心粒结构的解析。

小鼠原代海马神经元细胞的分离培养方法！海马体主要负责记忆和学习，日常生活中的短期记忆都储存在海马体中。神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元具有长突起，由细胞体和细胞突起构成。小鼠海马神经元细胞的组织来源于实验小鼠的正常脑组织，因为海马神经元细胞类似于干细胞属于高分度分化的细胞特性，具有不能传代，不能增殖等特点，所有收到细胞后尽快使用。为了更好的服务于广大科研工作者，百欧博伟生物技术人员特提供了海马神经元细胞分离培养方法，技术因人而异仅供参考：1、试验所需仪器设备及试剂（1）仪器生物安全柜CO2细胞培养箱荧光倒置显微镜高速冷冻离心机电热恒温鼓风干燥箱（2）试剂耗材T25细胞培养瓶血球计数板细胞培养孔板红细胞裂解液神经元完全培养基0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）多聚甲醛（PFA）DAPITriton X-100山羊血清NSEGoat anti-Rabbit lgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary antibody，Alexa Fluor 594Fluoromount-G荧光封片剂2、分离培养方法1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡，2) 在冰浴的PBS中分离海马，PBS洗涤3次，剪碎，3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min，4) 用FBS终止消化，轻轻吹打，5) 过100 μm 滤网，6) 收集滤液，300 g离心5 min，7) 用完全培养基重悬沉淀，铺瓶。3、免疫荧光3.1.实验步骤（1）细胞爬片取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。（2）固定细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。（3）破膜封闭将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10% 血清，取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。（4）一抗孵育一抗配制：抗体与PBS 1:100（200）稀释破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（最多可放置一周）（5）二抗孵育室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。（6）包埋玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。鉴定细胞为P1代细胞3.2.检测结果（1）细胞免疫荧光鉴定照片阴性100X-DAPINSE100X-DAPI（2）检验基本情况：经免疫荧光鉴定，该细胞纯度达到90%以上。除了上述的细胞分离方法以外，百欧博伟还有很多关于其他细胞的分离方法，想要学习的小伙伴可以来百欧博伟进行现场学习，如果想要其他原代分离培养方法，可打电话或咨询相关技术人员哦。

专 业：神经与精神病学 会议类型：学术大会 会议日期： 2013-09-21 会议地点：奥地利--维也纳 主办单位：N/A 推荐等级： 会议费用： 元 会议介绍 首席医学会议频道（conference.shouxi.net）2012年10月22日报道，世界神经学联盟是一个由全球100多个国家和地区的神经专家组成的国际组织。世界神经学联盟是通过对整个神经系统疾病患者的治疗与预防以提高全球人类健康为宗旨的协会。预计本次会议将有5000多代表参加。 会议详情 　　I am honoured to invite you personally to the twenty-first World Congress of Neurology, which will take place in September 2013 in Vienna and which I am sure will leave a lasting impression on us all. 　　The congress theme is &ldquo Neurology in the age of globalization&rdquo . We will discuss the major breakthroughs and developments in the field of neurology &ndash from clinical practice to research and technology. In addition to a top-rate scientific program, there will be many opportunities for hands-on learning and networking as well as exciting social events. 　　As the chairman of the Austrian Society of Neurology, I am happy that the EFNS - The European Federation of Neurological Societies and the World Federation of Neurology (WFN) - are our partners in this important event. 　　I look forward to welcoming you to Vienna, a majestic capital, filled with beautiful architecture and cultural attractions. 　　The Austrian capital city can be considered an ideal location for an international medical congress of this dimension. Vienna is a city rich in culture and boasts an impressive history in the medical sciences with all the modern amenities. Vienna is located in the heart of Europe and is easy to reach by plane, train, car or boat. The city offers excellent conference infrastructure and the highly professional services required for the organization of the World Congress of Neurology. Vienna has successfully hosted large congresses in the past, with up to 30,000 delegates. 　　Vienna and its environments offer an exceptional range of accommodation &ndash from luxury 5 star to moderately priced and inexpensive hotels. Vienna has always been a magnet for the &ldquo new&rdquo EU countries and its long established traditional medical contacts extend beyond Europe into all parts of the world. Hence, the congress will be held in close collaboration with our neighboring countries. 　　The Austrian capital is famous for its hospitality and culture. We are confident that the social events and leisure activities will contribute to the success of the congress. 　　本次会议的目标是：为参会者提供一次高质量、原创科学研究及临床实践的平台 促进临床、实践、科学信息及想法交流的平台 为所有对神经科学感兴趣的医生学者提供一次学习的机会 为参会者提供与同行建立网络联系的机会 通过不断努力来扩大及加强世界神经学联盟的影响力 令参会者跟上最新工业设备研究与发展的节奏。 　　会议的题目有：癫痫/运动障碍 中风/感染 肌肉骨骼/肌肉 头痛/神经眼科。 　　论文提交的栏目有：痴呆 自主神经疾患 行为神经学 脑血管病(中风与神经超声) 儿科神经学/发育神经学 临床神经生理学 重症护理/急诊/外伤 癫痫 伦理学、疼痛学与姑息医学护理 普通神经学/神经系统病 头痛与疼痛 神经学历史 成像 感染 运动障碍 MS与相关疾病 肌肉病/神经肌肉接点 神经康复 神经肿瘤 神经眼科/视觉神经 神经流行病学/健康服务 神经基因学与基因治疗 神经代谢异常/神经毒性 神经学的教学与科研 神经免疫 失眠问题。

研究背景神经丝（NF: Neurofilaments）是神经细胞主要的细胞骨架成分，对于保持轴突口径和形态的完整十分重要，影响着神经传输的速率和准确性。神经丝根据其大小分为神经丝轻链 (NFL)、神经丝中链 (NFM)和神经丝重链 (NFH)。NFL已成为诊断和监测各种神经疾病进展的生物标志物，例如亨廷顿病（HD）、肌萎缩侧索硬化 (ALS)、阿尔茨海默病（AD）和多发性硬化症（MS）。血液和脑脊液中高水平的 NFL 表明轴突损伤，这是上述神经退行性疾病的标志。从样本来源的角度来看，量化血液中 NFL 的含量比采集脑脊液样本的损伤性更小，这也增加了研究工作材料的可用性，从而增加了 NFL 作为生物标志物的效用。然而，血液衍生物（如血浆和血清）中的 NFL 水平通常低至每毫升皮克级别，远低于脑脊液中的水平1。因此，需要一种灵敏、稳健且可重复的检测方法来提供高质量的数据，以表征和监测神经退行性疾病的进展并有效地治疗。Ella简介Ella是一种基于微流控免疫检测技术的全自动超灵敏的ELISA系统，其创新性将特异性捕获抗体包被在微流体玻璃反应管（Glass Nano Reactor，GNR）中，再将GNR嵌入全自动微流体免疫检测管。每个检测通道都含有三个包被有捕获抗体的 GNR，因此每个样品都会自动输出三个读值。其采用双抗体夹心，并利用生物素-链霉亲和素进行信号放大，最后利用检测器获取640nm下的荧光信号。整个流程无需人工干扰，操作简单，70min即可出结果。ALS患者样本中NFL水平升高以ALS患者样本作为模型系统来量化NFL水平，评估区分正常和疾病状态样本的能力及作为脑病理学生物标志物的适用性。结果表明，与健康对照样本相比，血清和CSF中NFL水平升高(如图)，这与已发表的文献一致2,3。Ella与其他平台测定NFL结果高度相关市售NFL免疫测定方法，例如Ella、基于bead、或者基于plate的 ELISA 试剂盒，采用的抗体对都来自于Uman Diagnostics 。因此分别利用Ella，bead-base assay，plate-based ELISA的检测方法，对比分析了健康和 ALS 患者的队列中的NFL水平。因血清血浆中的NFL比脑脊液中的NFL水平低很多，所以根据不同检测方法的灵敏度和检测范围来针对选择合适样本进行检测。例如一般bead-base assay用于检测NFL水平含量较低的血清和血浆样本；plate-based ELISA用于检测NFL水平含量较高的脑脊液样本。下图结果表明，Ella 和 bead-base assay测得的血浆和血清样品中NFL的相关系数R2为0.95；Ella和plate-based ELISA 测定脑脊液样品中NFL的相关系数R2为0.94。证明对于bead-base assay或plate-based ELISA检测技术而言，Ella无论是血清（或血浆）样本（NFL低水平）还是脑脊液样本（NFL高水平）都可以检测NFL。法国巴黎科学文学研究院Audrey等科学家也利用Ella和Simoa分别检测了203例多发性硬化（MS）患者和30例健康对照组血清中的NFL水平，并对这两个平台进行了充分的比较，证明二者结果高度相关。作者对Ella给予了高度评价：从数据上表明，Ella既可以检测健康人群的NFL水平，也可以检测病患的NFL水平，其灵敏度已同时满足NFL对于健康人和患者样本的检测水平。且Ella具有占地面积小、平台强大、价格便宜，更快更简单等优势，同时不影响结果准确性从而可以替代Simoa，用于临床NFL检测4。总结：NFL是一种很有前景的生物标志物，可用于诊断和监测各种神经系统疾病。Ella的NFL Assay具有测定血清、血浆和脑脊液样本类型中NFL所需的敏感性，具有高水平的重复性。Ella占地面积小，只需70分钟即可为您提供分析数据，在不牺牲时间和空间的情况下为您提供可操作的结果。这种检测性能、重现性和易用性的结合使Ella成为NFL研究实验室的完美选择。参考文献：1. Neurofilaments as biomarkers in neurological disorders, M Khalil, CE Teunissen, M Otto, F Piehl, MP Sormani, T Gattringer, C Barro, L Kappos, M Comabella, F Fazekas, A Petzold, K Blennow, H Zetterberg and J Kuhle, Nature Reviews Neurology, 2018 14:577-589.2. Neurofilamentlevels as biomarkers in asymptomatic and symptomatic familial amyotrophic lateral sclerosis, P Weydt, P Oeckl, A Huss, K Müller, AE Volk, J Kuhle, A Knehr, PM Andersen, J Prudlo, P Steinacker, JH Weishaupt, AC Ludolph, M Otto, Annals of Neurology, 2016 79:152-8.3. Neurofilament light chain: A prognostic biomarker in amyotrophic lateral sclerosis, CH Lu, C Macdonald-Wallis, E Gray, N Pearce, A Petzold, N Norgren, G Giovannoni, P Fratta, K Sidle, M Fish, R Orrell, R Howard, K Talbot, L Greensmith, J Kuhle, MR Turner, A Malaspina, Neurology, 2015 84:2247-57.4. Comparison of SimoaTM and EllaTM to assess serum neurofilament‐light chain in multiple sclerosis, G Audrey, V Sébastien, P Magali, B Guillaume, C Romain, L Christine, LC Sabine, D Marc, E Gilles, V Sandra, LF Christine, DS Jérôme, AL David, C Giovanni, G Olivier, R Aurélie, M Thibault, C Olivier, C Pierre, B Eric, Z Hélène, TA Sophie, Ann Clin Transl Neurol, 2021 8(5): 1141–1150.

8月4日，中国科学技术大学生命科学与医学部周荣斌、江维教授团队与转化医学与创新药物国家重点实验室唐任宏团队合作，在Science以“First Release”的形式在线发表题为“Pituitary hormone α-MSH promotes tumor-induced myelopoiesis and immunosuppression”的“Research Article”研究论文，报道了下丘脑-垂体轴及其产生的激素α-MSH在介导肿瘤诱导的髓系造血和免疫抑制中的关键作用。肿瘤诱导的免疫抑制是其逃避免疫监视和攻击的重要原因。靶向PD-1和CTLA-4等靶点的免疫检查点治疗（ICT）策略在一定程度上能够逆转肿瘤免疫抑制并取得了较好的治疗效果，但临床响应性还比较低，需要进一步揭示肿瘤免疫抑制机制并寻找新的免疫治疗靶点和策略。肿瘤患者经常遭受抑郁、恐惧、焦虑等精神或情感应激，且流行病学研究发现长期抑郁、压力会加速肿瘤的发展并削弱肿瘤免疫治疗的效果，表明神经系统及其介导的应激反应在肿瘤生长和免疫调控中发挥重要作用。下丘脑-垂体（HP）轴是神经内分泌系统的重要组成部分，也是机体感应应激反应的重要调节中枢。过去的研究发现HP可通过产生激素如促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素和催乳素调节免疫反应。此外，在肿瘤患者中HP产生的雌激素、孕激素和糖皮质激素等一些下游激素或效应物显著升高，提示神经内分泌系统和HP轴可能调节肿瘤免疫，但是HP轴在肿瘤免疫中的作用及免疫系统感应肿瘤诱导的神经应激的机制尚不清楚。在该项研究中，研究人员通过构建不同的肿瘤模型（ICT抵抗的LLC和B16F10-GMCSF肿瘤以及敏感的MC38和MCA205肿瘤）来研究下丘脑-垂体轴在肿瘤免疫中的作用，发现荷瘤小鼠血清中α-MSH浓度显著升高，但垂体产生的其他激素如内啡肽、促甲状腺激素、催乳素、卵泡刺激素、黄体生成素等无显著差异。与此同时，研究人员发现荷瘤小鼠下丘脑室旁核（PVH）神经元被激活，并且垂体中叶负责编码α-MSH合成的蛋白POMC的表达也显著增强，表明肿瘤可促进下丘脑活化和垂体α-MSH产生。为了进一步研究POMC及其产物α-MSH在肿瘤免疫中的作用，研究人员利用立体定位注射腺病毒载体的的方式敲低垂体Pomc基因的表达，随后进行荷瘤实验。结果显示敲低垂体Pomc的表达能够显著抑制不同皮下肿瘤的生长。同时，在B16F10肺转移模型和LLC原位肿瘤模型中，敲低垂体Pomc的表达也能够显著抑制肺部转移灶数目和肺部结节数量。进一步研究人员发现敲低垂体Pomc表达能够增强抗肿瘤免疫能力，同时抑制髓系造血和肿瘤相关髓系细胞（MDSCs和TAMs等）的聚集。这些结果表明垂体来源的α-MSH通过诱导髓系造血和免疫抑制促进肿瘤生长。为了探究α-MSH通过何种受体参与调控肿瘤诱导的髓系造血和免疫抑制，研究人员检测了α-MSH的受体的表达情况，发现MC5R在骨髓造血前体细胞高表达。通过构建Mc5r全身或条件型缺陷小鼠进行荷瘤实验，研究人员发现Mc5r缺陷可以显著地增强抗肿瘤免疫并抑制不同类型肿瘤的发生发展。此外，Mc5r缺陷可以抑制肿瘤诱导的髓系造血。更为重要的是，不管是ICT敏感还是抵抗的肿瘤模型中，利用多肽抑制剂阻断MC5R均可抑制肿瘤生长，且MC5R多肽抑制剂与抗PD-1抗体联合使用可提高ICT的效率。最后，研究人员探讨了上述研究的临床相关性，发现非小细胞肺癌（NSCLC）和恶性头颈癌（HNC）患者血清中α-MSH浓度显著升高并与外周血中的MDSCs比例呈正相关。论文链接：10.1126/science.abj2674

7月22日，开滦总医院河北省神经生物机能重点实验室建设项目，顺利通过由河北省科技厅、河北省发展和改革委员会、唐山市科技局等组成的专家组验收。　　开滦总医院神经内科为河北省医学重点学科及省临床重点专科，是集临床、科研、预防、医学生临床教学和硕士研究生培养为一体的体现当代医学发展方向的大型综合性学科。已发展成为神经生物学实验室、神经平衡机能实验室、神经电生理实验室、睡眠分析实验室、神经免疫学实验室等11个实验室单元。目前已确定“神经功能的调控和可塑性机制”和“脑血管病的分子流行病学及溶栓的分子生物学机制”为主要研究方向。　　截至目前，实验室已开展了大量的基础与临床科研工作，取得了38项科研成果，其中18项获得省、部级奖项。目前正在承担着科研课题15项，其中建设期内新承担国家级科研项目(包括作为研究分中心参加项目)4项。实验室已发表科研论文200余篇，出版专著9部，获国家实用新型专利1项 建设期内发表科研论文20篇，其中SCI收录6篇，出版专著2部。

阿尔茨海默病(AD)是老年人痴呆症的最常见原因， 然而依旧缺乏有效的治疗方法，需要对疾病机制有更多的了解。人类全基因组关联研究指出，除了β-淀粉样蛋白(Aβ)和tau蛋白之外，免疫反应和脂质代谢也是AD病因的主要途径。越来越多的证据表明，主要由小胶质细胞和星形胶质细胞介导的慢性神经炎症是AD神经退化中的原因之一。同时，大脑是脂质含量和多样性最丰富的器官，主要是由于富含脂质的髓鞘，但脂质与AD疾病的相关性和相关机制研究却非常缺乏。作者和其他人报告了脑硫苷脂(sulfatide)在AD 病人和AD相关动物模型中病症早期就开始的显著下降，并且，此脑硫苷脂下降是由AD最高风险基因ApoE亚型依赖的方式介导的。但迄今为止，特定脑脂质的变化是否足以驱动 AD 相关病程仍不清楚。　　2021年9月份，来自美国德州大学医学中心圣安东尼奥分校的邱淑兰和韩贤林等作者在Molecular Neurodegeneration上发表了题为“Adult-onset CNS myelin sulfatide deficiency is sufficient to cause Alzheimer’s disease-like neuroinflammation and cognitive impairment”的文章，发现中枢神经系统(CNS)中髓鞘的硫苷脂在成年后的丢失足以激活疾病相关的小胶质细胞和星形胶质细胞，增加了多个AD风险基因以及已确认的AD相关的免疫/小胶质细胞调控的关键调节因子的表达，最终导致AD 样慢性神经炎症和轻度认知障碍。同时神经炎症和轻度认知障碍表现出性别差异，雌性鼠比雄性鼠更明显。随后的机制研究揭示了CNS髓鞘硫苷脂丢失、大脑慢性炎症、星形胶质细胞和小胶质细胞的活化以及AD最高风险基因ApoE之间的关系和胶质细胞活化相关转录因子通路。　　脑苷脂磺基转移酶(CST，又名 Gal3st1)催化硫苷脂生物合成的最后一步。脂蛋白基因(Plp1)在CNS髓鞘形成细胞，即少突胶质细胞中大量表达，但在外周神经系统(PNS)的髓鞘形成细胞中的表达程度较低。　　在此，为了研究在AD病人和动物模型发病早期硫苷脂下降对脑稳态和认知功能的影响和相关分子机制，作者建立了CST基因Flox小鼠，简称CSTfl/fl小鼠。CSTfl/fl小鼠与Plp1-CreERT小鼠杂交后建立了CST条件敲除(简称CST cKO)小鼠，通过他莫昔芬(tamoxifen，TX)诱导敲除成年小鼠髓鞘形成细胞中的CST基因，从而模拟AD病人早期的硫苷脂下降(图1A)。　　作者通过Nanostring高通量mRNA检测方法，脂质组学和蛋白质水平检测确定了此小鼠在3月龄注射TX 4.5个月和9个月后均呈现CNS中CST基因表达(图1B)以及脑苷脂水平(图1C)的显著下调，但在PNS中脑苷脂下降不显著(图1C)。同时作者明确了不同于胚胎期就敲除脑苷脂的CST完全敲除(CST KO)小鼠, 在成年CST cKO小鼠12月龄时的CNS脑苷脂丢失并没有引起其他髓鞘脂质的丢失 同时少突胶质细胞的基因表达(图1D，E)或髓鞘结构蛋白水平(图1F)也没有改变。说明成年后开始的小鼠CNS髓鞘脑苷脂的下调并不破坏髓鞘稳态。同时脑苷脂丢失也未引起CNS中神经细胞或其他细胞的死亡。　　图1 一种新型的可诱导髓鞘形成的胶质细胞特异性条件敲除CST (CST cKO) 的小鼠模型，在不影响少突胶质细胞稳态的情况下模拟了CNS中成年后开始的AD 样髓鞘硫苷脂丢失(CRM：大脑，SC：脊髓，SN：坐骨神经)。　　(图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021 16: 64)　　接着，作者对通过神经功能相关行为初筛(图2A)的13月龄的CST cKO小鼠进行了莫里斯水迷宫(Morris water maze，MWM) 和新物体识别(novel object recognition，NOR)实验，结果表明，虽然CST cKO小鼠可能存在与肌肉功能无关(图2B)的游泳时间增加(图2C)、游泳速度下降(图2D)、漂浮时间增加(图2E)等跟认知或运动相关功能障碍，但与运动功能无关的MWM的第六天目标探索(probe)结果(图2F-I)以及NOR结果(图2J)均证明，CNS中成年开始的髓鞘硫苷脂丢失虽然没有引起髓鞘稳态的改变，却足以引起认知功能的损害，以及空间和非空间记忆相关功能的破坏。　　图2 成年后开始的硫苷脂丢失足以导致认知损害　　(图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021 16: 64)　　进一步地，作者研究了CNS中成年开始的硫苷脂丢失导致认知损害的具体细胞、分子机制。首先利用Nanostring小鼠AD相关试剂盒检测了TX注射后4.5个月和9个月后的大脑和脊髓样本的770个基因，发现CST cKO小鼠的硫苷脂丢失诱发了CNS中的免疫、炎症反应(图3A, B)。接着利用Nanostring小鼠神经炎症相关试剂盒进一步发现：在CST cKO小鼠CNS样本中mRNA水平发生显著上调变化的76个基因富集于小胶质细胞/星形胶质细胞/免疫激活功能。比较CST cKO和CST KO小鼠的Nanostring小鼠神经炎症相关基因表达变化的结果表明：虽然CST KO小鼠中硫苷脂缺失引起了CNS髓鞘损伤，而CST cKO小鼠中成年后硫苷脂丢失并未引起了明显的CNS髓鞘稳态变化(图1D, E)，但CNS硫苷脂的缺失都引起了类似的小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，并导致了慢性免疫、炎症反应(图3C-E)。通过基因富集分析发现：髓鞘硫苷脂缺失引起的基因表达变化指向最显著的相关疾病是AD(图4A)。被上调的基因中包括四个AD风险基因Apoe、Trem2、Cd33和Mmp12(图4B-E)，以及已被报导的AD关键调节基因Tyrobp、Dock 和Fcerg1(图4F-H)。结合已有的文献报道和作者的结果，进一步明确了硫苷脂缺陷激活的小胶质细胞和星形胶质细胞的基因表达也类似于AD疾病相关的小胶质细胞和星形胶质细胞(图4 I, J)。　　图3 CNS 硫苷脂丢失或缺失均诱导渐进的小胶质细胞和星形胶质细胞激活造成的神经慢性免疫、炎症。　　(图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021 16: 64)　　图4 CNS 硫脂缺乏导致 AD 样神经炎症，导致疾病相关的小胶质细胞和星形胶质细胞的特征。　　(图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021 16: 64)　　然后，作者通过硫苷脂在大脑中的质谱成像(图5A)、硫苷脂缺失引起的激活的星形胶质细胞和小胶质细胞的分布的比较(图5B-E)、激活的星形胶质细胞和髓鞘的共定位(图5F)、以及CST cKO小鼠脊髓中激活的星形胶质细胞与髓鞘的电镜观察(图5H)实验，明确了CST cKO 和CST KO小鼠中硫苷脂和胶质细胞激活存在空间上的关联：硫苷脂缺失引起的胶质细胞激活分布在富含髓鞘的区域。　　图5 髓鞘上的硫苷脂缺失导致富含髓鞘的大脑区域内显著的星形胶质细胞和小胶质细胞激活。　　(图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021 16: 64)　　ApoE是CNS中主要的细胞外脂质载体，运输多种脂质，包括硫苷脂。同时Apoe4是AD的最高风险基因，并且ApoE4 是降低脑硫苷脂水平所必需的。作者发现ApoE在 CST cKO 和KO的CNS中上调(图4B)，从而表明CNS髓鞘上硫苷脂缺失和ApoE上调形成正向反馈。接着作者使用ApoE 和CST双敲除(ApoE-/-/CST-/-)小鼠结合免疫荧光染色(图6A，B)和Nanostring神经炎症试剂盒(图6C-F)发现，ApoE的敲除并不能阻止和影响CST敲除引起的胶质细胞激活和相关的免疫、炎症激活，从而阐明了ApoE 虽然参与硫苷脂转运但并不直接影响髓鞘硫苷脂缺失诱导的胶质细胞激活和神经炎症，ApoE可能通过参与硫苷脂丢失从而引起AD相关慢性神经炎症。　　图6 髓鞘硫苷脂缺乏诱导的AD样神经炎症并不直接依赖于ApoE。　　(图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021 16: 64)　　已有研究结果表明星形胶质细胞和小胶质细胞的激活相互影响，并且ApoE主要由星形胶质细胞产生。接着作者利用一种集落刺激因子1受体(CSF1R)抑制剂，即PLX3397，消除全脑大部分小胶质细胞从而研究星形胶质细胞、小胶质细胞和ApoE的相互调节关系。有趣的是，虽然PLX3397消除了CST+/+小鼠大脑中的绝大多数以及CST-/- 小鼠大脑中的大部分小胶质细胞，但是免疫染色(图7A, E)和Nanostring神经炎症试剂盒(图7B-D)结果显示，小胶质细胞的消除完全不能影响硫苷脂缺失相关的星形胶质细胞的激活以及ApoE的表达上调。从而证明了硫苷脂缺失相关的星形胶质细胞和小胶质细胞的激活通过独立的途径存在，并且证明了硫苷脂缺失引起的ApoE上调存在于星形胶质细胞中。　　图7 CNS硫脂缺失引起的星形胶质细胞增生和ApoE上调不是继发于小胶质细胞活化。　　(图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021 16: 64)　　为了再进一步地研究CNS中髓鞘上的硫苷脂缺乏引起的神经炎症的分子机制，作者分析了转录因子评分， 主要目标包括 IRF8、STAT3、SPI1和C/EBPβ(图 8A)，已有的研究报道也显示它们参与小胶质细胞或星形胶质细胞的激活，同时Spi1 是一个富集于小胶质细胞的AD 风险基因。免疫印迹结果也验证了在CST cKO小鼠大脑和脊髓样本中STAT3和PU.1/Spi1的显著上调、以及其他转录因子C/EBPβ、IRF8的部分上调(图 8B, C)。此外，在PLX3397消除小胶质细胞的样本中，CST敲除鼠的大脑中的STAT3的磷酸化和蛋白水平上调并不受小胶质细胞丢失的影响，说明STAT3也许是星形胶质细胞活化特异的转录调控途径(图8D)。　　图8 髓鞘的硫苷脂缺失导致中枢神经系统中SPI1、STAT3 和 C/EBP转录因子的上调。　　(图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021 16: 64)　　这项研究的结论与讨论，启发与展望：　　1)首次建立了在成年后诱导的髓鞘上硫苷脂丢失的小鼠模型，并成功模拟AD病人脑中的硫苷脂下调，而且证明成年后诱导的髓鞘上硫苷脂丢失在检测的时间点并不影响髓鞘稳态 　　2)第一次阐明了一种脂质，即CNS髓鞘的硫苷脂，其在成年后的丢失足以激活小胶质细胞和星形胶质细胞，增加了多个AD风险基因以及已确认的AD相关的免疫/小胶质细胞调控的关键调节因子的表达，最终导致AD 样慢性神经炎症和轻度认知障碍 　　3)阐述了AD风险基因ApoE 虽然参与硫苷脂转运，但并不直接影响髓鞘上硫苷脂缺失诱导的胶质细胞激活和神经炎症，ApoE可能通过参与硫苷脂丢失从而引起AD相关慢性神经炎症 　　4)证明了硫苷脂缺失相关的星形胶质细胞和小胶质细胞的激活通过独立的途径存在，并且证明硫苷脂缺失引起的ApoE上调存在于星形胶质细胞中 　　5)阐明了髓鞘的硫苷脂缺失导致的小胶质细胞和星形胶质细胞激活主要分别由PU1/SPI1、STAT3转录因子调控。　　本文的结果强烈表明大脑中的特异性的脂质异常，例如髓鞘上的硫苷脂缺失也许也是AD 病理学中神经炎症和轻度认知障碍的重要驱动和促进因素，并且与 tau 蛋白病无关。但需要后续的研究继续阐明髓鞘的硫苷脂缺失如何分别激活了小胶质细胞和星形胶质细胞。　　原文链接：https://molecularneurodegeneration.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13024-021-00488-7　　邱淑兰(左，第一作者)，韩贤林(右，通讯作者)关于韩贤林教授课题组：　　美国德州大学圣安东尼奥医学研究中心 韩贤林教授　　韩贤林教授先后获浙江大学和美国华盛顿大学(圣路易斯)硕士和博士学位。现任美国德州大学圣安东尼奥医学研究中心杰出教授。浙江省千人，浙江中医药大学兼职教授。主要从事老年痴呆病、糖尿病诱发的综合症、和免疫性疾病等脂类代谢混乱的机制研究。韩教授是脂质组学的创始人之一，2003年他首次提出了“脂质组学”概念。他是该领域公认的杰出科学家，以发明多维质谱“鸟枪法”脂质组学分析技术而在该领域闻名全球。韩教授已在各种杂志上发表论文280多篇, H指数79, 总引用数达24,500次以上。2010年与英国爱丁堡皇家学会委员W.W. Christie合撰《Lipid Analysis: Isolation, Separation, Identification, and Lipidomic Analysis》论著。2016年他撰写了一部系统地阐述脂质组学的论著 -《Lipidomics: Comprehensive Mass Spectrometry of Lipids》。韩教授在国际上享有很高的学术威望，被聘为多种与脂类研究有关杂志的副主编或编委。韩教授现任美国卫生研究院、美国糖尿病协会、及香港研究资助局的基金会常任评审专家。曾任美国华人质谱学会主席，现为该学会终身理事。

当我们提到GABA（γ-氨基丁酸）的时候我们会想到什么？GABA是一种主要的抑制性神经递质，调节神经元间的通讯。在大脑之外，在肠道、脾脏、肝脏和胰腺中也检测到了GABA这种神经递质的存在【1,2】。但是GABA在免疫系统中是否会“跨界”发挥作用还不得而知。2021年11月3日，日本横滨理化研究所Sidonia Fagarasan研究组发文题为B cell-derived GABA elicits IL-10+ macrophages to limit anti-tumour immunity，发现B细胞来源的GABA诱导巨噬细胞从而限制抗肿瘤免疫反应，为免疫系统中除了细胞因子和膜蛋白之外的小分子代谢产物的免疫调节功能提供了新的见解。小分子水溶性代谢产物不仅是细胞内生物化学反应过程的重要中间产物，也是释放到细胞外环境中的“信号分子”，从而影响临近的细胞【3-5】。淋巴细胞受到多种受体和可溶性小分子代谢产物的调节，但是仍然有很多小分子代谢产物的功能尚未被了解清楚。因此，作者们希望能够找出其中发挥关键调节作用的水溶性代谢产物，该代谢产物可能作为环境线索发挥作用从而介导免疫细胞之间的相互作用。为了找出参与免疫系统的小分子水溶性物质，作者们对处于稳态以及激活状态淋巴细胞中进行水溶性代谢产物的分析。这两种淋巴细胞之间有200种左右的代谢产物存在显著的不同。其中主要涉及的代谢特征的不同是丙氨酸、天冬氨酸以及谷氨酸通路的差异，另外嘌呤和嘧啶代谢以及三羧酸环也与免疫激活密切相关。在这些代谢产物中，一个以前被广泛认为在神经系统中发挥作用的因子GABA引起了作者们的兴趣。先前并没有研究表明B细胞能够产生GABA，因此GABA在免疫系统中的作用也很不清楚。首先，作者们确认了免疫系统中的B细胞的确是GABA产生来源，并且通过对GABA合成的关键酶分析发现小鼠和人类B细胞中GAD67（Glutamate decarboxylase 67）而非GAD65的表达水平会上升。该结果说明无论是小鼠还是人类中谷氨酸的代谢的确能够刻画B细胞谱系的变化。那么B细胞中所产生的GABA是如何在免疫系统中发挥作用的呢？为此，作者们采用了MC38结肠癌模型，该模型中B细胞已经被证明通过抗原非特异性机制抑制抗肿瘤T细胞反应【6】。作者们发现B细胞缺乏的小鼠品系中肿瘤的生长比野生型的肿瘤控制的更好。另外，与接受安慰剂的小鼠相比，植入缓释GABA颗粒会导致B细胞去除的小鼠肿瘤生长显著增加。通过加入GABA受体激动剂木防己苦毒素，作者们发现会限制肿瘤的生长并提高肿瘤浸润性CD8+T细胞的细胞毒性活性。因此，作者们发现减少GABA或影响GABA受体信号通路会增强细胞毒性T细胞反应和抗肿瘤免疫，而分泌GABA使宿主对肿瘤生长产生免疫耐受。那么GABA影响免疫功能系统的细胞生物学机制是如何的呢？先前的研究表明肿瘤相关巨噬细胞（Tumour-associated macrophages，TAMs）可以抑制抗肿瘤免疫反应。作者们发现GABA影响巨噬细胞生理的过程，促进向抗炎表型极化的反应。进一步地，作者们想知道GABA如何调节巨噬细胞。研究表明TAMs起源于单核细胞（Monocytes），因此，作者们猜测GABA是通过影响单核细胞向巨噬细胞的分化来调节巨噬细胞的。为了验证这一假设，作者们将GABA加入到培养基中，发现会导致细胞数量增加、细胞存活增加同时也促进抗炎巨噬细胞特征因子FRβ（Folate receptor β）的表达。基因转录本分析也证明细胞周期相关以及叶酸代谢相关的基因出现了明显地上调。因此，作者们确认GABA促进具有抗炎特性的巨噬细胞的分化、扩张和存活。进一步地，为了确认B细胞中GABA的作用，作者们构建了特异性在B细胞中敲除GAD67的小鼠品系，发现条件性失活GAD67后会导致B细胞中GABA含量显著降低，而且发现B细胞产生的GABA会显著限制抗肿瘤T细胞反应。总的来说，该工作发现作为代谢产物以及神经递质的GABA会通过激活的B细胞被合成和分泌出来，作为细胞间相互交流的线索影响机体免疫系统的响应。该工作说明B细胞谱系产生的小分子代谢产物具有炎症调节的作用，可能会成为未来免疫反应调节的药物靶点。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04082-1

来自清华大学、中国科技大学等处的研究人员证实，自我特异性激活受体SLAM家族对于NK细胞驯化（Education）至关重要。这一研究发现发布在8月9日的《免疫》（Immunity）杂志上。 清华大学的董忠军（Zhongjun Dong）教授及中国科技大学的田志刚（Zhigang Tian）教授是这篇论文的共同通讯作者。前者的主要研究兴趣包括：NK细胞发育过程相关的信号途径； NK细胞是如何在分子和细胞水平功能获得成熟；驱动NK细胞分化和活化的分子基础。田志刚教授则主要从事天然免疫和肝脏免疫学研究。 NK细胞由造血干细胞发育而来，经历NK前体细胞、不成熟NK细胞等中间体后发育成熟。处于不同发育阶段的NK细胞具有特定的表型标志和表面受体，接受多种细胞因子和转录因子的协同调控。NK细胞抑制性受体与MHC I分子特异性结合使NK细胞获得成熟功能。NK细胞存在于骨髓、脾脏、外周血、肝脏、肺脏、蜕膜、淋巴结、胸腺、小肠及皮肤等组织器官中。不同组织中的NK细胞其造血细胞来源、发育途径、表型功能都表现出组织特异性。NK细胞亦被发现具有免疫记忆功能，可对机体产生长效的保护作用。NK细胞的活化受其表面活化性受体和抑制性受体调控。活化的NK细胞通过分泌细胞因子和细胞杀伤等方式发挥抗病毒、抗肿瘤和免疫调控的作用。 NK细胞发育过程中，其抑制性受体与特异性配体的相互作用使得NK细胞获得成熟功能的同时实现自身耐受，此过程被称为NK细胞驯化。科学家们通过不同的模型视图来解释其中的原理，但到目前为止其复杂的分子机制还未完全阐明，模型亦未得到统一。 SLAM家族受体(SFRs)是NK细胞表面一群重要的辅助受体,在NKG2D等受体的存在下,共同促进NK细胞的杀伤功能。在这篇新文章中，研究人员证实SFRs在造血细胞上丰富地表达，作为自我特异性激活受体对NK细胞驯化起至关重要的作用。 为了克服基因冗余，他们构建出了同时缺失7个SFRs的小鼠，揭示出NK细胞介导的对半同种异源造血干细胞的排斥主要取决于靶细胞上存在SFRs。这一刺激效应是由靶细胞上的SFR偶联适配器所决定。这些研究结果证实，SFRs赋予了NK细胞在效应阶段杀死造血细胞的能力；但在驯化过程中SFRs持续的结合可以减少NK细胞反应的敏感度。 因此，与诱导T细胞耐受的自身抗原相似，自我特异性激活配体有可能是NK细胞的“耐受原”（tolerogen）。 NK细胞是一类细胞毒性效应淋巴细胞，NK细胞显著表达IFN-γ是其激活的一个标志。目前对于在NK细胞天然激活过程中调控细胞因子刺激信号通路的表观遗传机制仍知之甚少。来自浙江大学医学院、第二军医大学、中国医学科学院证实，H3K4me3去甲基化酶Kdm5a通过结合p50来抑制SOCS1是自然杀伤（NK）细胞激活的必要条件。这一研究结果发表在2016年3月31日的《Cell Reports》杂志上。 NK细胞在早期免疫应答中发挥了关键作用，但人们对NK细胞的发育机制还知之甚少。中科院生物物理研究所的范祖森研究员领导团队对此进行了深入研究。他们发现，NK细胞发育和先天免疫需要FoxO1介导的自噬。这一成果发表在2016年3月的Nature Communications杂志上。 多发性硬化症是一种多灶性脱髓鞘和轴突损伤为主要特征的中枢神经系统疾病。来自天津医科大学、美国St. Joseph医院及医学中心等处的研究人员证实，在多发性硬化症的脑部炎症过程中神经干细胞(NSCs)维持了有功能活性的NK细胞。这一研究发现发布在2016年1月11日的Nature Neuroscience杂志上。

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，我们将分三期陆续介绍。本期接着上期的第一部分超高分辨率显微技术在神经科学中的应用（一） ，为第二部分内容。4.荧光标记与样品制备4.1. 荧光标记神经元和脑片的超分辨率成像是用适当的荧光团标记感兴趣的生物分子，理想情况下是以定量和化学计量的方式。虽然SIM和其他超分辨方法的成像质量取决于信号背景（S/B）比，但SIM对荧光团没有特殊要求。另一方面，STED显微镜可达到的分辨率在很大程度上取决于所用荧光团的光稳定性。RESOLFT显微镜使用可逆光开关FPs，具有两个稳定状态，因此可以使用较低的激光照射强度。所有SMLM方法的定位精度取决于每个事件检测到的光子数。dSTORM需要光开关有机荧光团，包括菁、罗丹明和恶嗪染；而PALM则需要使用光开关、光转换和光激活FPs。与此相反，DNA-PAINT理论上适用于所有荧光团，因为开/关速率由对接链和成像链序列和缓冲条件决定，而其中 Cy3B和ATTO 643效果最好。、为了获得一张好的超分辨率图像，除了成像方法以外，样品制备也非常关键。使用荧光探针进行高效和特异的标记，并且使标记误差（荧光团和目标之间的距离）达到最小。为了通过荧光成像进行结构解析，标记密度（即荧光探针之间的距离）必须显著高于所需的分辨率。另一方面，特别是对于接近几乎分子分辨率的超分辨率成像方法，标记误差必须尽可能小，以达到高精度成像。对于活细胞标记而言，在合适的表达载体中融合感兴趣的蛋白质的基因编码FPs无疑成为首选。然而，FPs的亮度较低，与有机染料相比，其图像分辨率较低。理想的标记方法是使用荧光染料标记基因编码的蛋白质、肽标签或单一氨基酸。在模式生物如果蝇或秀丽隐杆线虫的应用得益于基因编码工具，通过转座子、操纵二分体Gal4/UAS表达系统或Crispr/Cas9方法引入或去除突触蛋白和荧光蛋白。由于瞬时转染的细胞表现出不同的蛋白质表达水平，蛋白质的分布和功能不一定反映野生型的情况。图5 通过单体链霉亲和素结合AP标记的突触蛋白成像结果显示Nlg1和LRRTM2的差异分布（dSTORM成像）。上排：Homer 1c GFP作为突触后室的参考。第二排：Nlg1和LRRTM2（dSTORM成像）。左下：频率分布直方图，用于显示相对于Homer 1位置中心的信号分散情况。右下：列出比较两种蛋白质的突触结构域数量的直方图。然而，通过构建优化表达，稳定表达的细胞或CRISPR基因敲入等方法可以产生从内源性到强过表达的蛋白质表达水平。根据不同的转染策略，可以采用不同的方法转染神经元。传统的磷酸钙共沉淀法和脂质体法在大多数实验室都可实施，但这两种技术的转染效率很低。而病毒转染的效率比较高，允许注射到大脑区域，但需要实验者具备病毒生产方面的专业知识，并需要考虑生物安全问题。此外，还必须考虑病毒类型、插入片段大小、毒性和差异表达等因素。要达到高转染效率，可以使用高压脉冲将核酸直接输送到细胞核，进行核转染。然而其缺点是，当这种方法应用于小鼠原代神经元时，会导致细胞存活率较低，并且实验设备昂贵，还需要根据神经元密度和物种对脉冲参数进行多次测试。另外，也可以使用细胞附着式高电阻管，在完整神经元网络（如器官型切片）中进行单细胞电穿孔。利用这种方式，结合CRISPR基因敲入获得了接近内源性的蛋白质表达水平。基于CRISPR基因敲入，在神经元发育的不同时间点通过脂质感染、核感染或病毒转染在神经元中实现。如前所述，FPs光稳定性和荧光光子输出较低，这降低了图像质量。另外，连接大小为2−5nm的FP后,蛋白质功能可能会受到影响。因此,首先必须清楚感兴趣的蛋白质在野生型的功能表现。而有机染料比FPs小得多，有更高的光子产率和光稳定性，但需要与其它能与感兴趣分子结合的分子进行连接耦合。对于固定细胞，使用一抗和二抗进行免疫染色仍然是标记内源性蛋白质的首选方法。缺点是由两个大小17.5 nm左右的IG抗体间接免疫标记有可能导致标记误差。使用直接法免疫荧光或Fab片段可以减少标记误差。另外针对GFP或转基因短肽标签的更小（1.5×2.5 nm）的骆驼“纳米抗体”已应用于dSTORM成像。此外，耦合了链霉亲和素的荧光染料可用于神经元和器官型组织中靶蛋白的特异性标记。使用这种标记方法，研究了神经氨酸酶-1ß、神经肽原-1和富含亮氨酸的重复跨膜蛋白2的动力学和纳米级结构，并揭示了跨突触粘附结构的形成（图5）。另外可以使用生物正交肽或自标记蛋白质标签，例如FlAsH tags, SNAP-tags, and Halo-tags。这些标签蛋白与目标蛋白共表达，并以共价和特异性结合其各自的荧光标记试剂或配体。对于肌动蛋白和微管的标记，可以使用小肽药物，如双环七肽-鬼笔环肽和紫杉烷类药物，如紫杉醇。膜和细胞器的标记可以通过荧光脂质和细胞器的追踪试剂来实现。此外，小肽或配体可以直接用荧光团标记，并特异性结合生物分子，例如，显示抑制性突触后位点的超结合肽。要达到最小的标记误差，可以通过单个非天然氨基酸的特定位点标记实现。通过基因编码导入设计的非天然氨基酸，并用四嗪染料进行生物正交点击化学标记。显然，神经元和组织切片必须根据要成像的结构进行透膜和固定。与所使用的标记方法无关，特别注意所用的试剂必须能保留自然细胞环境中生物分子的超微结构。通过化学试剂固定交联蛋白质，可能会影响结合亲和力，也可能削弱分子间的相互作用。在大多数情况下，多聚甲醛（PFA）和戊二醛已成功用于神经科学的超分辨率成像。此外，还引入了乙二醛等新型固定剂。膜分子应始终使用4%的PFA和0.2%戊二醛固定，以尽量减少残余流动性并避免伪影，例如抗体结合诱导的簇形成。4.2. 神经元的多色遗传标记荧光蛋白彻底改变了神经元的活细胞成像方式，因为荧光蛋白可以与感兴趣的蛋白质融合，并且在假定不影响野生型功能的前提下，用于双色和三色成像。神经系统具有非常高密度的轴突和树突相互作用结构，需要使用更多不同颜色的标记来区分不同的神经元连接。2007年，随着一种名为Brainbow的转基因方案的开发，这一问题得到了解决，该策略能够对神经元进行多色标记。结合单细胞分辨率成像技术，Brainbow技术可以用来创建大脑图谱，详细描述神经元如何形成回路，其连接体以及它们投射到何处。Brainbow利用了三原色，即可见光谱的所有颜色都可以由三种原色的不同混合物生成，即红色、绿色、蓝色（RGB）或转化为荧光蛋白，例如RFP、YFP和CFP。为了实现这一想法，应用了Cre/lox重组系统，该系统可以通过DNA切除、反转或染色体重组启动基因表达，使三个荧光蛋白基因中的一个在转基因中随机表达。转基因盒的多个拷贝的引入导致三个不同拷贝数的基因在每个细胞中组合表达，从而产生几十种颜色，使相邻神经元分化并观察其相互作用。Brainbow技术非常适合绘制不同神经元类型之间的连接模式，追踪轴突，并识别大脑中远距离的神经元连接。此外，已经证明Brainbow表达可以成功地用于研究周围神经损伤后的轴突再生，并检测大脑发育过程中的重要阶段。为了进一步改进Brainbow在包括突触蛋白在内的大脑和连接图谱中的应用，SRM的应用是显而易见的。最近通过结合Brainbow、顺序免疫染色和ExM同时研究同一脑切片上的形态、分子标记和连接，成功地证明了这一点（图6）。将这项技术应用到全脑研究一直是一个挑战，直到最近才成功应用。图6 结合Brainbow和ExM的多轮免疫染色和ExM(miriEx)成像。(A) 实验方案：在Parvalbumin cre/+ 小鼠的脑切片中，Parvalbumin蛋白阳性中间神经元通过Brainbow进行观察，并在下一轮应用4倍ExM成像。使用EYFP信号对Homer1和Gephyrin进行免疫染色来观察突触。(B) Brainbow 信号的免疫染色。(C) 分别通过突触后标记homer1和Gephyrin的免疫染色来区分抑制性和兴奋性突触。插图(D)−(F)和(G)−(I) 显示图像的更多细节图。(J)和(K)神经元的形态重建(使用ImageJ软件插件nTracer)，包括其各自传入的特征。虚线框表示(B)和(C)中所示的区域。重建的神经元按顺序编号。标尺(膨胀前的)：10μm(B/C)、2.5μm(I)、20μm(J/K)。4.3. 神经科学中的光电联合显微镜电子显微镜(EM)和电子断层扫描具有光学显微镜无法达到的空间分辨率，可以获得细胞和细胞器的超微结构信息。然而，EM和电子断层扫描不能标记特定的分子，因此难以识别未知的细胞结构或具有相似形态特征的结构。用胶体金标记结合抗体可以实现蛋白质的纳米级定位，但抗原的标记效率低下，这意味着胶体金颗粒的数量仅占抗原总数量的1%到20%。而另一方面，荧光显微镜虽然分辨率较低，但可以进行大视场成像和对活细胞中蛋白质进行定位。对固定样本细胞中的各种分子进行高效和特异的分子标记后，结合超分辨率荧光显微镜方法，达到的空间分辨率可以远低于衍射极限。因此，光电联合显微镜（CLEM）作为一种通用的方法，在电子显微镜提供的细胞超微结构背景下，通过超分辨率成像来可视化蛋白质的定位和相互作用。然而，将超分辨率成像与EM结合起来更为困难，因为乍一看，这主要是由于两种方法的样品制备流程不同且不兼容。例如，EM中保存超微结构所需的固定和染色会引入很强的自发荧光。而且荧光蛋白还会在固定和聚合物包埋所需的脱水和氧化条件下淬灭。此外，这两幅图像必须在纳米精度下精确叠加，首先需要使用在荧光成像和EM中都表现出极好的对比度的固定对准标记物，如裸金微球。 另外，样品脱水引起的结构变形会严重破坏两幅图像的正确叠加。所以必须在超微结构和荧光保存之间找到折衷方案。例如，已经证明，对于某些周期性分子结构，如核孔复合体，无需使用对准标记，dSTORM和EM扫描图像可以以20 nm的精度叠加。光电联合显微镜的流程是先对轴突和树突进行荧光实时成像后，再使用透射电镜观察。例如，表达GFP的脑组织在荧光成像后进行化学固定，再使用电子密度标记进行免疫标记，例如EM金。或者采用更成熟的方法，如过氧化物酶或胶体金标记。最后，可以通过光转化在荧光团处局部生成二氨基联苯胺（DAB）聚合物。为了克服标记问题并确保超微结构的保存，已经开发了用于EM (NATIVE)的纳米体辅助组织免疫染色。NATIVE能够高效标记蛋白质，无需苛刻的渗透步骤、特殊树脂、锇替代物或透明化试剂。随着方法的改进和技术的发展，光电联合显微镜已被证明是研究不同种类突触和定位突触蛋白的理想选择。5.超分辨显微镜观察神经元隔室/突触以及神经元−胶质细胞相互作用下面我们将展示通过超高技术获得的有关细胞骨架组成和动力学、突触前室和突触后室对神经传递准确性至关重要的分子组装，以及形成神经元功能的星形细胞结构的调节和构建的最新数据。5.1. 细胞骨架神经元的极化性质以及树突和轴突的长度都需要结构和功能性支架来支持它们的稳定性、适应可塑性和物质运输，这些特性对神经元的存活和信号传递是必不可少的。因此，神经细胞骨架的结构在过去几十年中引起了神经科学家的注意，并在其它文献中进行了详细的回顾。20世纪70年代的电镜研究表明，神经细胞骨架由三种主要类型的神经纤维组成：大小约为20−30 nm的微管，直径为10 nm的神经纤维和5−10 nm大小的肌动蛋白丝。微管是由异二聚体在GTP依赖性组装过程中结合α和β微管蛋白单体组装而成的圆柱体，称为原丝，再由13个这样的原丝形成一个微管单元。轴突的微管成束状组织，并根据其相对于神经元胞体的位置显示不同的方向。它们的极化通过快速增长的正端和缓慢增长的负端体现。STED显微镜揭示了快速生长极依赖钙锚定在肌动蛋白皮质上。使用dSTORM对发育中的神经元进行活细胞成像证明了神经元极性和轴突具有方向一致的、平行的由TRIM46驱动的微管束，而树突微管的特征是混合极性。用Motor-PAINT方法进行纳米跟踪发现稳定和乙酰化的微管显示负端向外的方向，而动态和酪氨酸酶化的微管则显示相反的方向（图7）。例如轴突起始节中微管密集地聚集在束簇中，由于密集的重叠定位，使用SMLM方法具有挑战性。这个问题可以通过两种实验方法来解决：第一，设计更小的标记探针，如微管蛋白纳米抗体，这不需对神经元微管更详细的观察。第二，一种降低群聚密度的超分辨率方法，如ExM，可用于胞体和树突中微管亚群的可视化。神经纤维是在轴突中形成的广泛平行网络的异质聚合物，它为轴突提供稳定性并调节轴突直径和传导速度，其组成包括低、中、高分子量神经纤维、中间蛋白和外周蛋白的三联体。它们的自组装首先形成平行的异二聚体，然后半交错地结合成反平行的四聚体。最后，八个四聚体横向聚集成单位长度的神经纤维，进一步拉长并径向压缩至最终的神经纤维外观。用电镜观察到在神经纤维之间的交界面，形成3−5 nm大小的交叉桥，但对其功能及其与神经纤维的分子相互作用仍不清楚。在这里，ExM与SMLM的结合或DNA-PAINT的应用可能有助于研究密集神经纤维中的这种相互作用。神经纤维动力学已经通过光转换和光活化SRM实验进行了研究，显示了端到端蛋白合成中的退火和切断过程。肌动蛋白最初被认为与一组更集中的短肌动蛋白丝结合在一起，在轴浆中形成斑点状的膜下层。在原代神经元和脑切片中使用phalloidin Alexa Fluor 647进行STORM成像，揭示了轴突肌动蛋白的新的组成原理。这些实验揭示了轴突中存在圆周式肌动蛋白环，每190 nm固定重复间隔绕一圈，并进一步表征了轴突中具有类似尺寸的ßII血影蛋白和钠通道的周期性条带，而树突状腔室内显示出更细长的肌动蛋白组织。此外，通过STORM成像发现，并通过STED显微镜的研究得到证实，这种肌动蛋白组织模式的普遍性也存在于树突中。进一步的报告发现，尽管树突中也存在基于肌动蛋白血影蛋白的周期性膜骨架，树突中这种结构的形成倾向和发育速度低于轴突。此外，本文还显示了肌动蛋白和血影蛋白在胞体和部分树突中的二维多边形晶格结构，类似于红细胞中的膜骨架结构。此外，使用SiR-actin，可通过STED显微镜在活的原代神经元中观察到这种周期性结构。最后，最近的CLEM方法结合铂金复原电镜（PREM）和STORM研究了无顶轴突中的肌动蛋白组织，并提供了轴突编织状肌动蛋白结构与周期性肌动蛋白超微结构相关的证据（图8）。图8。原代神经元无顶轴突（unroofed axons）的CLEM成像（结合铂复型电子显微镜和STORM的光电联合成像）。用铂复型电镜（PREM）（灰色）显示的轴突辫状条带（箭头）被叠加到大鼠原代神经元的超分辨肌动蛋白环（伪彩）上，比例尺=2, 1, 0.2μm（从左到右）。中间：轴突辫状条带间距测量后显示出与周期肌动蛋白间距相似的尺寸。右图：在铂复型电镜（PREM）中记录的神经纤维厚度，未分裂（交织在一起）和分裂（分裂开）的轴突肌动蛋白辫状条带为蓝色，树突中的单个肌动蛋白神经纤维为紫色，微管为灰色参考。采用平均值和标准误显示数据。Copyright 2019 Springer Nature.ßII 血影蛋白基因敲除导致周期性肌动蛋白环结构破坏，同时细胞器的双向轴突运输受损。SMLM结果显示，与轴突相比，轴突起始节中的分子组织其特征是轴突起始节（AIS）蛋白ankyrin-G和ßIV-血影蛋白，这种基于肌动蛋白-血影蛋白的细胞骨架与远端轴突相似。此外，在AIS中存在ßIV-血影蛋白和Ankyrin G，而在远端轴突中存在ßi--血影蛋白和Ankyrin B。SMLM显示与肌动蛋白环相连的纵向头对头ßIV血影蛋白和Ankyrin的二价取向有助于建立紧凑的AIS超微结构，该超微结构甚至对针对肌动蛋白和微管的药物治疗具有抵抗力。进一步显示Ankyrin-G会聚集到亚结构域，增强神经元活性，而成为精神疾病的主要风险基因。随后的SMLM研究还阐明了αII血影蛋白与ßIV血影蛋白共同在AIS提供强健的周期性细胞骨架组织以及防止AIS装配不完全和神经变性的重要性。一份相关报告显示，αII 血影蛋白丰度随有髓鞘轴突直径的增加而增加，表明大直径轴突更容易发生神经退行性病变。在免疫标记II血影蛋白后，将其连接到一种可膨胀的聚合物，并在水中膨胀后，通过ExM研究ßII spectrin沿轴突的周期性模式。这一新方法证实了如前所述的细胞骨架内部的组织原理。不幸的是，在ExM过程中，phalloidin探针在膨胀过程中被冲掉。有两种策略解决这一问题：一方面，携带甲基丙烯酸基团的phalloidin三功能抗体被设计用于与凝胶的有效标记；另一方面，最近的一份报告使用荧光团结合抗体，类似于常规免疫染色，将荧光团靶向phalloidin探针与凝胶连接。在中枢神经系统的几种神经细胞类型和动物物种中，肌动蛋白和附属蛋白的强大超微结构组织也得到了证实。外周神经系统（PNS）中，STED显微镜也显示在梳理的神经纤维样本上有重复的细胞骨架成分。最后，SMLM揭示了肌动蛋白-血影蛋白骨架的一个重要生物学功能：它可以作为一个信号平台，通过组织跨膜信号蛋白，包括G蛋白偶联受体（GPCR）、细胞粘附分子（CAM）和受体酪氨酸激酶（RTK），在神经元中进行信号转导从而实现GPCR-和CAM介导的RTK信号。5.2. 突触前室为了确保有效的神经化学传递，突触前膨大参与突触囊泡循环、神经递质填充以及与突触前膜在活性区（特殊蛋白质密集分布的纳米隔室）的融合，以最终释放神经递质。在这里，我们关注SRM如何扩展我们对突触前功能的理解。早期只能使用EM对化学固定神经元里的小直径突触小泡进行研究，但随着SRM的出现，应用快速STED显微镜，通过免疫标记位于突触前室突触小泡上的钙传感器突触标记蛋白1（SYT1）来观察突触小泡的活动。STED显微镜进一步显示，突触小泡融合后Syt1分子似乎驻留在突触膜上，也支持胞吐后突触小泡蛋白的清除过程。此外，在突触小泡融合过程中，当暴露于细胞外空间时，靶向Synaptobevin 2 pHluorin的荧光团结合纳米体后，亚衍射追踪显示了突触小泡的异质性迁移。一种类似的方法使用vGlut1 pHluorin在原代神经元中的表达来观察单个神经元突触小泡，定位精度为27 nm，并揭示了突触小泡的多个不同释放位点。作为一项方法学的进步，为了对主动循环的小泡成像，设计了一种名为mCLING的亲脂膜探针，该探针可对突触膜进行染色，通过内吞作用和固定，可以进行免疫标记，且和SRM相结合。突触小泡的胞吐过程需要一组属于突触前细胞基质的突触前蛋白质的高度可靠的相互作用，使突触小泡接近和暂时驻留在所谓活动区的膜上，并最终释放突触小泡。黑腹果蝇易于遗传，有助于精确定位果蝇幼虫神经肌肉接头（NMJ）活动区的第一个重要蛋白质。Bruchpilot（Brp）是一种必不可少的活性区成分，是一种大的、卷曲的螺旋蛋白，对于钙通道聚集和突触囊泡定位到突触释放位点至关重要。除了通过Brp研究钙通道聚集外，STED显微镜还证明了该蛋白细长的组织结构，并揭示了与Brp相互作用的蛋白（如syd-1α、liprin和rim结合蛋白（RBP））的定位。定量dSTORM方法研究了果蝇活动区Brp丝的数量，并显示了Brp的结构组织与其功能之间的强相关性。接下来的研究通过dSTORM评估Syt1敲除后的活动区（CAZ）电生理学和细胞基质参数。这项研究表明，在果蝇NMJs 1b型突触膨胀中，Syt1基因的敲除导致更高的Brp计数和簇内Brp图谱的改变。在哺乳动物突触中，突触前支架蛋白bassoon 和 piccolo参与突触囊泡释放的调节。据报道，bassoon蛋白通过与RBP的相互作用来控制CaV2.1型钙通道的定位。此外bassoon蛋白能加速囊泡释放，因为其丢失导致小脑苔藓纤维到颗粒细胞突触中的突触囊泡数量显著减少和突触抑制。STED显微镜显示bassoon 和 piccolo蛋白是一个夹心三明治结构，两侧为piccolo蛋白，bassoon蛋白居中。STORM成像通过距离测量显示bassoon蛋白相对于突触前和突触后室中其他相关突触蛋白质的方向。囊泡胞吐过程由一组可溶性ethylmaleimide敏感因子附着受体（SNARE）蛋白质进一步协调。位于突触膜上的囊泡SNAREs (v-SNAREs) 蛋白和 t-SNARES蛋白的复杂形成导致突触囊泡成功融合。在质膜上的突触体相关蛋白25（SNAP-25）和突触融合蛋白聚集首先通过STED显微镜进行研究。这项研究表明，大约75个突触融合蛋白分子被堆积成50- 60 nm大小的纳米团簇。在之后的研究中，SMLM以更高的精度对SNAP-25和突触融合蛋白的分布进行成像。在这里，描述了Syntaxin簇内的分子密度梯度。dSTORM成像显示，未聚集的分子紧密地定位于聚集区域。最近的一项研究显示了一种以syntaxin或SNAP-25为靶点的像。研究表明，集中在突触前部位的60%的通道是可变的。此外，通过应用BAPTA钙缓冲降低了钙通道的扩散。结果表明，突触小泡和钙通道之间的纳米域偶联保证了神经传递的精确度，并可根据需要通过突触前钙通道的扩散进行精细调节。 在融合和递质释放后，内吞机制诱导循环产生新的囊泡，从而重建可释放的囊泡池并为持续的神经传递提供基础。囊泡循环的主要机制由网格蛋白介导的内吞作用组成。使用光遗传学和”闪光冷冻”电镜的研究也报道了比超快的内吞快200倍的过程。如双色iso-STED显微镜所示，通过摄取针对囊泡内膜结合位点的Syt 1抗体，将内吞位点定位到活性区外周。此外，在神经内分泌细胞中，STED显微镜也揭示了囊泡只能部分与突触前膜融合释放递质，形成一个“Ω”形状的结构，而没有完全融入膜中，因此有利于“接触后即脱离”（kiss and run）的模式。与网格蛋白介导的内吞作用相比，它会产生更快囊泡再循环率的递质释放模型。依赖于活性的大量内吞作用进一步增加了可能涉及的机制的复杂性，有人提出，根据突触类型和活动，多种内吞模式可能并行运作。本文由超高显微技术应用工程师郭连峰、黄梓彤编译

由SARS-CoV-2冠状病毒引起的Covid-19影响了世界的方方面面。免疫和治疗方法等抗病毒方向的研究在2020年具有高优先级，显微镜在这类研究中起着举足轻重的作用。了解受体结合、基因组释放、复制、组装和病毒出芽的基本原理及免疫应答，可以使用不同的方法和显微镜。鉴于显微镜在感染生物学中的重要作用，我们举例阐述不同的显微技术及其在这些研究领域中的应用。 研究背景人类出生后胃肠道立刻被复杂的微生物群落定植（1000余种，且数量100万亿），而这些肠道微生物群落影响宿主生理的多个方面，包括代谢、免疫反应、行为和昼夜节律等等。先前的研究认为肠道微生物群落主要是共生菌，共生菌可控制病原菌数量，而黏膜屏障免疫对于维持共生菌群和抵抗侵入性细菌感染至关重要。微生物-肠-脑轴是将大脑和肠道功能整合的双向信息交流系统，并涉及神经、免疫和内分泌机制。除了神经内分泌系统和神经免疫系统之外，该轴还包括了中枢神经系统（CNS）、自主神经系统（ANS）的交感神经和副交感神经分支以及肠道神经系统（ENS）。从肠道到CNS的传入纤维（如大脑、扣带回、小脑扁桃体和扁桃体皮质）以及肠道平滑肌的效应纤维是沿着微生物-肠-脑轴进行双向信息交流的主要途径。图1 微生物-肠-脑轴肠道神经系统（ENS）遍布肠道组织的每个角落，将收集到的信息迅速地传递到自体或非自体类型的细胞，织就一个庞大又复杂的网络系统。新涌现的多个研究报道发现ENS可以作为免疫系统的感应平台，但对ENS与上皮细胞的互作机制还知之甚少。 2019年12月，Jarret等人在Cell发表了题为Enteric Nervous System-Derived IL-18 Orchestrates Mucosal Barrier Immunity的文章。借助单分子mRNA荧光原位杂交（smFISH THUNDER Imager 3D Live Cell），研究发现ENS神经元分泌IL-18作用于肠道上皮细胞中的杯状细胞，促进杯状细胞抗菌蛋白（AMP）的表达，在肠道免疫中起着重要作用。研究过程鉴于大脑中神经元会分泌IL-18，而大量研究表明ENS可能在调节粘膜屏障免疫中发挥关键作用，因此研究人员大胆猜测肠道神经元也会分泌IL-18。接下来作者构建ENS特异性敲除IL-18小鼠和多种细胞类型特异性敲除IL-18R小鼠，并分别用鼠伤寒沙门氏菌(S.t)感染。之后作者通过共聚焦观察发现不携带ENS所产生的IL-18的小鼠则更容易受到感染。为了证实这一发现，研究人员使用了IL18 mRNA探针在小鼠中进行了单分子mRNA荧光原位杂交（smFISH），结果显示在IL-18-/-小鼠结肠中IL18 mRNA探针的信号丢失。图3 THUNDER验证结果与Confocal观察结果一致A）用于分析IL-18+神经元的Confocal正交视图。IL-18（红色），Tubb3（绿色）。 B）通过smFISH观察野生型与IL18-/-小鼠结肠中的IL18 mRNA（白色）和DAPI（蓝色）。同时通过smFISH检测小鼠肠组织中IL18与Tubb3的表达，观察到IL18 mRNA探针与神经元特异性Tubb3 mRNA探针共定位。图4 smFISH检测小鼠肠组织中IL18（红色）、Tubb3（白色）表达；DAPI（蓝色）表示细胞核总之，这些数据表明肠神经元是结肠中IL-18的新产生者。研究还结合了单细胞转录组技术来探究ENS来源IL-18的功能以及作用方式。 实验方法1. 处死小鼠，移出结肠并用冷PBS冲洗。纵向剖开结肠组织平铺于滤纸。2. 用4％多聚甲醛PBS溶液固定3小时，后置于30％蔗糖、4％PFA的PBS溶液中4℃过夜。3. 包埋，制成将7mm厚切片，并用于smFISH染色。4. 设计的探针库与Cy5（IL-18）、TMR（Tubb3）结合，将切片与smFISH探针库杂交。5. 封片前去除ENS内的自发荧光信号。6. 在Leica THUNDER Imager 3D Live Cell上进行smFISH成像，使用自带的THUNDER Computational Clearing设置。 看到这里大家可能会有一个疑问：为什么不用共聚焦做smFISH而是选择徕卡THUNDER？对，为什么？小编也提出过这个问题，但是下面这段话做出了很好地解释。smFISH的实验过程中探针会发出大量光子，而共聚焦则会显著限制光子收集的数量，为了最大限度回收这些光子，更建议使用宽场技术。 徕卡THUNDER凭借其高分辨、快速、大视野的特点，可大限度回收实验中smFISH探针发出的大量光子，减少光损耗，更适用于smFISH成像。不仅可以获得清晰锐利的图像，实验结果更便于统计分析且重复性高，是您进行组织大视野快扫的不二之选。 参考文献1、 Jarret et al., 2020, Cell 180, 50–632、 Brain Res. 2018 August 15 1693(Pt B): 128–1333、 Jung, Y. J.,et al., 2017, Sci Rep 7(1):173604、 Zhang, H., et al. 2018, Synth Syst Biotechnol 3(2): 113-120

肿瘤免疫治疗的策略之一就是使免疫系统特异性靶向肿瘤细胞而不是正常细胞。而突变相关的新抗原（neoantigen）正是这样的靶标，肿瘤细胞中体细胞突变产生的序列改变的肽段被细胞处理，被主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）呈递至细胞表面，进而被T细胞识别，对肿瘤细胞进行杀伤。由于新抗原只在肿瘤细胞中存在，其成为肿瘤免疫治疗的热门靶标之一【1】。但是大部分肿瘤只有有限的肿瘤突变荷载并不能够产生新抗原相关的反应，同时只有5%的新抗原能被MHC分子提呈，而能激活有效的杀伤性T细胞的新抗原更少【2】。同时，肿瘤细胞中大部分的促癌因子和蛋白都是胞内蛋白，这也限制它们作为新抗原被人白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA, 人MHC分子）呈递作为肿瘤治疗的靶标【1】。神经母细胞瘤（Neuroblastoma）是儿童中常见的一种恶性肿瘤，其具有很少的肿瘤突变，相反其是由于转录调控网络表观遗传学上的失调而引起的【3】。在实体瘤，尤其是肿瘤突变荷载少的实体瘤中发现特异性以及免疫原性都较好的肿瘤免疫治疗新靶标，一直以来是肿瘤免疫治疗存在的挑战。2021年11月3日，来自美国宾夕法尼亚儿童医学院的John M. Maris团队在Nature上发表题为Cross-HLA targeting of intracellular oncoproteins with peptide-centric CARs的文章。团队分析神经母细胞瘤的免疫肽组，在HLA-A*24:02上发现来自神经母细胞瘤主要促癌转录因子PHOX2B的未突变肽段QYNPIRTTF具有很好的肿瘤特异性，以该肽为中心设计的CARs能识别多种不同HLA呈递的QYNPIRTTF，且在体外和小鼠模型中具有不错的效果。高度多态性的人白细胞抗原（HLA-A,-B,-C）基因编码的MHCI分子能够将来自于细胞内蛋白质组的一段8-14个氨基酸长度肽段提呈至细胞表面，这些肽段为免疫肽组（immunopeptidome），随后T细胞识别监视这些肽-MHC复合体（pMHC），发现来自于外来病原的抗原。研究团队假设肿瘤细胞的免疫肽组中存着在一部分来自于肿瘤发生必须的促癌因子的特异性的肽，针对这些肽便可设计出以肽为中心的嵌合抗原受体（peptide-centric CARs, PC-CARs）来特异性靶向肿瘤细胞。首先，研究团队对8个神经母细胞瘤细胞来源的异种移植物和病人来源的异种移植物（cell-derived xenografts (CDX), patient-derived xenografts PDX）进行免疫肽组的检测，通过MHC的捕获，肽段洗脱以及后续LC-MS/MS质谱等一共发现了7608个肽段。筛选这些肽段和HLA的结合力，筛选到2286个强亲和力的肽段。随后分析肿瘤组织和正常组织的RNA-Seq数据，研究团队筛选到61个肽段，其来源的母基因在肿瘤组织中高表达。最后研究团队分析正常组织中MHC肽组，进一步把可能在正常组织中提呈的肽段筛选掉。最后得到13个肽段，其来自于9个特异在神经母细胞瘤中表达的基因。同时研究团队在原代神经母细胞瘤中也进行同样的免疫肽组筛选，发现56个肽段。CDX和PDX筛选的13个肽有7个在原代肿瘤细胞中也被筛选到。随后，根据pMHC结合力，HLA等位基因频率，母基因表达情况以及神经母细胞瘤生物学信息对这些肽进行排序，6条分别来自来自CHRNA3, GFRA2, HMX1, IGFBPL1, PHOX2B 和TH的肽段被选择继续研究。分析不同发育时期的转录组学数据，研究团队发现PHOX2B只在胎儿发育过程中表达而在出生前的正常组织中PHOX2B完全被沉默。PHOX2B也是神经母细胞瘤发生的主要调控因子，PHOX2B的表达也是神经母细胞瘤诊断检测的手段之一。这表明，PHOX2B是神经母细胞瘤高度特异性的肿瘤抗原且是免疫治疗的理想靶标。由于自身抗原的免疫原性较弱，研究团队决定设计基于scFv-CARs而不是TCRs来靶向PHOX2B。随后研究团队筛选sc-Fvs库，寻找能结合PHOX2B肽的特异性克隆，并通过sCRAP算法预测排除其抗原交叉反应。研究团队筛选到10LH克隆并进一步研究，scFv 10LH和PHOX2B具有很强的亲和力，KD为13 nM，kd是 7.6 × 10-4 s-1。据此，研究团队设计出识别在HLA-A*24:02上提呈的PHOX2B 9氨基酸肽QYNPIRTTF的PC-CARs。发现PHOX2B 9氨基酸肽QYNPIRTTF也可被其他类型的HLA-A提呈，而10LH PC-CARs能打破传统的HLA限制和不同种类pMHC识别结合。随后在体外细胞模型以及体内PDX模型中证明了PHOX2B特异性的PC-CAR T细胞的跨HLA肿瘤杀伤能力。图1 肿瘤抗原的发现以及PC-CARs设计工作流程本文利用多种技术手段从非突变的促癌蛋白中发现神经母细胞瘤的肿瘤特异性抗原，并靶向这些肿瘤自身肽段设计出了PC-CARs，具有较好的肿瘤杀伤能力以及跨HLA的反应活性。该方法将非免疫原性的胞内促癌蛋白纳入到选择中，极大扩大了肿瘤免疫治疗的候选靶标，有助于神经母细胞瘤以及其他肿瘤的免疫疗法的发展。同时打破传统的HLA限制，也会扩大肿瘤免疫治疗的受益人群。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04061-6

SMCTM单分子免疫检测技术(Single Molecule Counting)是蛋白生物标志物检测领域的突破性新技术。利用激光聚焦于爱里斑中单个荧光标记分子，人类首次实现了在单分子水平对蛋白进行计量，并造就了1000倍于ELISA技术的超高检测灵敏度。SMCTM单分子免疫检测技术具备宽至4个log的大动态检测范围， 可根据靶标丰度和成本灵活选择实验方案，便于自行开发检测试剂盒，接近于ELISA的易用性等特征。该技术已被广泛应用于多种疾病生物标志物的检测，包括心血管疾病，炎症，糖尿病，神经疾病，癌症等等，使研究者对生物标志物的应用和认识达到了全新的高度。更重要的是，针对创新性生物标志物的研究，Erenna免疫检测系统提供工具，帮助研究者便捷地自行开发和优化检测试剂盒，实现全新生物标志物的高效率检测。讲座主题：“见微知著”，Erenna SMCTM技术创领生物标志物全新发现演讲者：默克生命科学 应用科学家 秦昶博士讲座语言：中文讲座时间：26分钟精彩内容预告:下载讲座PPT查看Erenna单分子免疫检测平台默克生命科学Tel: 400-889-1988转2Email: china.marketing.online@merckgroup.com

瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）研究人员在诊断帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病（NDD）方面取得了重大进展。他们开发了一种名为“ImmunoSEIRA”的新型生物传感器，能够检测和识别与NDD相关的错误折叠的蛋白质生物标记物。　　12日发表在《科学进展》杂志上的这项研究还利用了人工智能（AI）技术，使用神经网络来量化疾病的阶段和进展。为了创建这种先进的NDD生物标志物传感器，研究人员将蛋白质生物化学、光流变学、纳米技术和AI等多个学科和多种技术整合在一起。　　ImmunoSEIRA传感器采用了表面增强红外吸收（SEIRA）光谱技术，使科学家能检测和分析与NDD相关的生物标志物的形式。该传感器配备了独特的免疫分析，就像分子探测器一样，能高精度地识别和捕获这些生物标志物。　　ImmunoSEIRA的特点是采用金纳米棒阵列，带有可检测特定蛋白质的抗体，能够对极小样本中的目标生物标志物进行实时特异性捕获和结构分析。而AI算法的子集神经网络可识别特定错误折叠蛋白形式、寡聚体和纤维状聚集体的存在，可跟踪疾病的进展，实现了前所未有的检测精度。　　研究进一步证明，ImmunoSEIRA可在生物体液等实际临床环境中使用，即使在人脑脊液这样的复杂液体中，该传感器的检测也同样准确。

【科学背景】量子霍尔效应的发现由德国科学家克劳斯冯克利钦于1980年提出，并因此在1985年获得诺贝尔物理学奖，标志着凝聚态物理学发展史上的重要里程碑。量子霍尔效应及其后续的拓扑量子物态，如量子反常霍尔效应、量子自旋霍尔效应和陈绝缘态等，因其拓扑保护的边界态传输特性，被认为有潜力成为低功耗量子电子器件的新型信息载体，能够克服传统电子器件在面对外界干扰时的问题。然而，利用拓扑量子物态构建量子电子器件仍面临诸多挑战。其中包括如何实现选择性和准连续的量子态切换以及如何在器件中稳定实现多个量子态的共存和操作。为应对这些挑战，南京大学物理学院的梁世军和缪峰教授团队与南京理工大学的程斌教授合作，通过构建双侧对齐的魔角石墨烯器件，成功观测到了电子型铁电性与陈绝缘体的共存，并提出并验证了噪声免疫的类脑计算方案。研究团队通过精确控制栅压脉冲的幅值，实现了在同一器件中1280个准连续的铁电态，进一步利用陈绝缘态的量子化电导作为权重，成功展示了铁电陈绝缘体器件在具有噪声免疫特性的卷积神经网络中的潜力。这些研究成果为基于拓扑边界态的新型低功耗电子器件的发展提供了实验验证，为未来量子电子技术的应用和进一步优化提供了有力支持。【科学亮点】（1）实验首次展示了拓扑Chern绝缘体器件中的选择性和准连续铁电切换，这是一项重要的创新。研究团队通过双侧对齐的魔角石墨烯器件构建，成功观测到了电子型铁电性与陈绝缘体的共存。（2）实验通过精确控制栅压脉冲的幅值，实现了在有限磁场下，任意一对Chern绝缘态之间的选择性非易失切换。在同一器件中，团队成功实现了1280个准连续的铁电态，这为量子电子器件的多态性能提供了新的可能性。（3）进一步的研究展示，利用陈绝缘态的量子化电导作为权重，首次在卷积神经网络中展示了铁电陈绝缘体器件的应用潜力。这一发现为开发具有噪声免疫特性的新型低功耗电子器件奠定了技术基础。【科学图文】图1：DA-MATBG器件的电学表征。图2. 面内磁电耦合效应。图3. 铁电陈绝缘体态和选择性开关。图4. 准连续铁电开关。图5：准连续铁电态的选择性开关与噪声免疫神经形态计算方案。【科学结论】本文的科学在于探索拓扑量子材料与铁电效应的结合，特别是在DA-MATBG材料中观测到的范德华界面铁电性与拓扑边缘态的共存。这不仅在量子材料研究中开辟了新的可能性，还首次展示了在莫尔异质结构中实现的正交磁电效应。通过精确控制栅压脉冲的幅度，研究团队实现了在有限磁场条件下Chern绝缘态的选择性和确定性切换，以及准连续的霍尔电阻水平。这种创新不仅为量子电子器件设计提供了新的思路，还在神经形态计算中展示了拓扑量子材料作为信息载体的潜力。尽管目前的设备需要外部磁场以破坏时间反演对称性，但这项研究的控制方法和噪声免疫神经网络的应用具有广泛的适用性，可以推广到其他Chern绝缘体系统，甚至是零场条件下的情况。未来的研究将集中于在无外部磁场的环境中实现拓扑量子材料的选择性铁电切换，这将为开发高容错性和低能耗的新型电子器件打开全新的可能性。原文详情：Chen, M., Xie, Y., Cheng, B. et al. Selective and quasi-continuous switching of ferroelectric Chern insulator devices for neuromorphic computing. Nat. Nanotechnol. (2024). https://doi.org/10.1038/s41565-024-01698-y

肿瘤免疫是利用免疫学的理论和方法研究肿瘤的抗原性、机体的免疫功能与肿瘤发生/发展的相互关系、机体对肿瘤的免疫应答及其抗肿瘤免疫的机制、肿瘤的免疫诊断和免疫防治的科学，与肿瘤代谢特性及微环境重建有着十分密切的关系，其对研究肿瘤的发病机制、预防、诊断和治疗具有重要意义。能量代谢是生命体最基本的特征之一，代谢的重编程与癌症、免疫、神经退行性疾病、肥胖、糖尿病等息息相关。为此，从细胞能量代谢着手，探索生命现象的奥秘，寻找重大疾病的新疗法，已成为目前的热门研究领域。一文带你解读近期2场会议报告亮点，揭密那些隐藏的小细节！ 6月15日—肿瘤免疫与代谢（点击日程即可报名参会）1.针对肿瘤和自身免疫性疾病等重大疾病，围绕树突状细胞囊泡转运相关分子和T细胞特异性抗原受体库开展系统免疫学研究2.针对肿瘤个体差异和肿瘤空间异质性的问题，发展的代谢组分子分型-代谢物异质分布空间可视化-精准粒子治疗策略，最大化的减少副作用，并达到更好的肿瘤抑制效果3.专注肿瘤免疫生物治疗以及相关代谢机制，在微小囊泡研究领域有一系列的原创性发现。4.安捷伦重磅新品在线赏，能量代谢分析技术强应用6月24日—转化医学之肿瘤免疫学（点击日程即可报名参会）1.重点介绍FOXP3+调节性T细胞功能可塑性及稳定性分子机制研究新进展，以及组织特异性Treg, 特别是自身免疫病，肥胖及衰老相关糖尿病以及肿瘤微环境中FOXP3+Treg功能与免疫疗法相关新进展2.通过研究免疫系统和肿瘤之间的相互作用，鉴定肿瘤特异的免疫细胞，尤其是识别肿瘤抗原的T细胞，以及肿瘤细胞抵抗免疫攻击的逃逸机制，从中发现新的治疗靶标，建立高效的肿瘤免疫治疗新方法3.肿瘤浸润淋巴细胞TIL疗法的进展与挑战4.Cytiva层析技术助力肿瘤免疫学研究 ♥更多精彩尽在网络讲堂：https://www.instrument.com.cn/webinar/

肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一，已发展成为继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗模式。肿瘤免疫学治疗的方法种类繁多，目前各大医药研发企业的关注焦点主要包括：免疫检查点抗体药物，CAR-T疗法，溶瘤病毒等等，但新型的免疫疗法如何进行可靠有效的临床前效果评估，是推进肿瘤免疫疗法的一关键节点。百奥赛图自主研发了一系列免疫检查点人源化小鼠，为免疫检查点抗体药物筛选提供了可靠的体内药效模型，此外基于重度免疫缺陷B-NDG小鼠建立的免疫系统人源化小鼠模型也为药物验证提供了更多的选择。本期转化医学系列webinar邀请到的是百奥赛图药理药效事业部总监郭雅南博士，郭博士将给大家介绍：1. 免疫检查点抗体单用或联用在体内药效筛选的策略2. 利用免疫重建小鼠和B-hCD3e人源化小鼠进行双特异性抗体的体内药效评估与毒性检测3. 利用重度免疫缺陷小鼠B-NDG小鼠对CAR-T药物进行体内药效评估与毒性检测转化医学系列网络讲座第五期讲座题目：人源化模式小鼠在肿瘤免疫药物研究中的应用讲座时间：7月25日下午14:00-15:00主讲人：郭雅南 博士（百奥赛图）讲座形式：网络讲座，手机或PC即可参与（会议链接和如下报名链接相同）即刻报名扫描下方二维码主讲人简介郭雅南 博士百奥赛图 药理药效事业部总监清华大学生物科学与技术系本科；美国罗切斯特大学神经生物学/药理学博士学位；2009-2013年，在哈佛大学医学院伯明翰妇女医院转化医学系从事博士后研究工作；2014年回国，担任百奥赛图基因生物技术有限公司研发部副总监。拥有10多年癌症生物学和神经生物学的研究经验，现担任药理药效事业部总监。更多转化医学系列网络讲座安排，具体时间以珀金埃尔默微信推送时间为准。敬请关注！主题预计时间高内涵筛选助力个性化癌症医疗8月小分子激酶抑制剂研究最新进展9/19/2019使用Alpha技术研究RNA甲基化“橡皮擦” （ALKBH5）10/24/2019研究蛋白相互作用就是这么简单11/7/2019细胞成像分析前沿应用案例心得分享11/28/2019原来药物研发还可以这样做——基于表型筛选的药物研发11月小动物活体成像技术助力脑靶向载体的研究12/19/2019关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

7月7日，记者从广东工业大学获悉，该校生物医药学院教授赵肃清团队与美国加州大学戴维斯分校合作，首次制备出高亲和力的可溶性环氧化物水解酶抑制剂（EC5026和TPPU）纳米抗体，并用于开发灵敏的间接竞争性免疫分析传感器。相关研究论文发表于《药物分析学报》（Journal of Pharmaceutical Analysis）。该论文第一作者为杨慧怡，通讯作者为赵肃清和Bruce D. Hammock。　　该研究以可溶性环氧化物水解酶抑制剂（EC5026和TPPU）为分析物，报道了一种基于纳米抗体的酶联免疫分析传感器的构建与应用，该传感器能够实现灵敏地、准确地对抑制剂给药后临床人体样品中抑制剂含量的监测。可溶性环氧化物水解酶抑制剂在各种动物模型中都是有效的神经性疼痛镇痛药，其中EC5026已成功通过美国FDA人体1a期试验，TPPU因其优异的药代动力学特征、靶效和体内生物活性被广泛应用于研究。　　该研究首次制备了高亲和力的EC5026和TPPU纳米抗体，并用于开发灵敏的间接竞争性免疫分析传感器。该传感器具备较高的精密度和准确度。研究表明，纳米抗体为小分子药物的临床开发和治疗过程中的监测提供了质谱法的替代和补充分析工具。

维生素B12（Vitamin B12）是唯一一种含主要矿物质钴的维生素，故又称钴胺素。维生素B12需要肠道分泌物的帮助才能够被吸收，主要的生理功能是参与制造骨髓红细胞，以及防止大脑神经受到破坏，严重缺乏可导致恶性贫血。本报告参考GB/T 5009.217-2008第二法-免疫亲和法，与直接提取法相比，免疫亲和法的检测限较低，可达到0.026 μg/g，比直接提取法低10倍左右。应用Primaide 系统，采用免疫亲和法进行样品前处理，对保健食品中的维生素B12进行了测定。样品中成功检测到维生素B12，且在样品中加入维生素B12标准品进行了加标回收率的测定。 标准样品测定例仪器配置 : Primaide 1110 泵，1210 自动进样器，1310 柱温箱，1410 紫外检测器。n 精密度GB/T 5009.217-2008中规定，重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对值不得超过算术平均值的20%。我们这里采用了计算相对标准偏差的方法，PM的重复性结果如上图所示，6次重复性实验，保留时间重现性RSD是0.07%，峰面积重现性RSD是0.26%，结果要优于标准规定。n 线性结果维生素B12在0.5 ~ 50.0 mg/L标准溶液的浓度范围R2 = 1.0000，线性关系良好。样品测定例n 样品前处理方法n 测定结果对维生素饮料和多维元素片中的维生素B12进行了测定，检测到两种样品中均含有维生素B12。为了验证准确性，进行加标回收率测定，在两种样品中加入维生素B12标准样品，进行回收率的测定，回收率分别为102%和87%，测定结果准确可靠。

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，分四期介绍。本期为第三部分内容。5.3. 突触后室突触受体位于突触后室，负责传递来自突触前末端的信号。它包含支架蛋白--负责锚定突触后受体的专门用于信号整合的信号分子。在神经元树突中，从主要树突轴起源并突起的小体积树突棘提供分区功能，并根据突触活动和发育阶段显示大小和形状的动态变化。树突棘是突触长时程增强（LTP）的结构相关物，因此与学习和记忆有关。要想准确观察树突棘的小尺寸、不同形状和动力学，一般要求采用超过衍射极限的分辨率并有可能进行活体成像的光学显微镜方法。第一个将活细胞SMLM应用于原代神经元的研究之一是使用碳菁染料（如Dil）可视化脊髓和丝状足。对于突触后膜结构的可视化，已经发现了一个新的膜标记试剂系列，该系列可实现神经元追踪和树突棘的可视化。最近，通过快速SIM和增强共聚焦显微成像研究了树突棘上微小突起（称为小刺）的动力学。通过将SIM成像与计算方法相结合，进一步评估了树突棘的几何结构，证实凹面对于棘结构稳定的重要性。在树突棘中，F-肌动蛋白高度定位富集在突触后密度区（PSD）和树突棘膜上。肌动蛋白的分子速度升高已让其扩散到除棘尖外整个棘的亚区。为了分析脊髓中肌动蛋白的动力学，我们设计了一种低亲和力的光转换肌动蛋白探针，并利用像差校正光学系统对活体脑切片动力学进行了表征。通过STED显微镜观察对phalloidin-ATTO647N标记的原代神经元，可以在树突棘颈和丝状棘中观察到F-肌动蛋白的周期性片段。同年，STORM成像也显示树突棘颈和丝状棘中存在以肌动蛋白为基础的周期性膜骨架。在树突棘中，分支的F-肌动蛋白在PSD附近聚集，而延伸仅限于指状突起的尖端，并为棘突提供了基础。通过基于监督学习的模式识别进行图像分割，可以对树突肌动蛋白组成异质性做自动分析。用SMLM也对树突F-肌动蛋白进行了同样的分析，并使用树突铂复原电镜进行了验证。使用STED显微镜在活体小鼠脑切片海马CA1神经元上进行延时拍照并结合FRAP及电生理学检查，证明在神经递质释放诱导的长时程增强（LTP)时树突棘颈部具有可塑性（宽度增加并长度减少）。使用正置STED显微镜实现了活体小鼠树突棘动力学的首次超高分辨率成像。在这里Thy1 EYFP小鼠体感皮层中的树突棘在其头部和颈部表现出形态可塑性。另外使用双光子STED成像对活体小鼠的海马树突棘动力学进行了研究，树突棘密度与早期报告相比高出2倍，并能测算几天内的树突棘蛋白周转率（图10）。图10 体内长时程双光子STED成像--海马CA1锥体神经元树突棘蛋白周转。左上图：使用长工作距离物镜的实验方法和CA1锥体神经元的双光子整体图像。右上图：传统的双光子成像与双光子STED成像的比较，显示了总体上更高的棘突密度和更详细的形态，特别是在轴和棘突中。空的箭头标志着常规双光子成像不能显示的棘突，而填充的箭头表示双光子STED报告的棘突数量更多、形态更复杂。底部图像：在海马CA1区基底树突的一个选定区域内，连续几天（第0天、第2天和第4天）成像的树突棘周转。树突棘被连续编号。AB=接近树突的轴突（缩回的棘突用红色标记；新的棘突用绿色标记）。转载自原文参考文献 273。此外，sptPALM揭示了富集在突触棘的突触后激酶CaMKII的空间和动力学亚群，该激酶介导钙依赖性可塑性机制。这些动力学似乎由棘肌动蛋白调节，因为Latrunculin A导致棘内CaMKII扩散显著改变。在PSD内的棘头，一个密集的蛋白质复合物含有不同的突触后支架蛋白，如PSD-95、homer1和shank3，它们排列在大小为∼80纳米的亚突触域中。根据不同的突触类型，PSD-95被动态组织为单个单元或多个纳米簇的形式。STED显微镜揭示了突触后支架蛋白负责将离子受体锚定到突触后膜上，SMLM观察到的活体原代神经元也是一样。在这里，活细胞单分子成像结合定量分析揭示了含有GluA2的AMPA-Rs（优先聚集在突触下的PSD-95簇中）的稳态调节。而PSD-95的uPAINT成像和AMPA-Rs的spt PALM报告在70 nm大小的PSD-95纳米域内平均聚集了20个AMPA-Rs，进一步证实了上面提到的这个发现。AMPA-Rs形成纳米颗粒，并能在几分钟内动态改变其大小和形状。与突触可塑性匹配的是：动态变化是通过突触内和突触外隔室之间的AMPA-Rs在时间维度交换，通过横向扩散来实现的。这些过程通过以微球标记抗体为靶点的内源性受体的单分子追踪实验得到证实。受体运动的类型被认为是布朗扩散，与突触后元件发生短暂的、低亲和力的相互作用。单分子追踪实验中使用Atto 647N修饰的抗体揭示了谷氨酸诱导的脱敏AMPA-Rs的侧向扩散增加导致的短期可塑性。AMPA-Rs的侧向扩散也与突触的短时程增强和长时程增强（分别为STP和LTP）有关。例如，已经证明，为了从突触抑制中恢复，脱敏受体通过侧向扩散被功能受体替换。此外，追踪实验表明，在CaMKII激活诱导LTP后，AMPA-Rs扩散到突触部位。这一过程由钙浓度升高触发，它导致CaMKII介导的stargazin（它与PSD-95一起能够调节AMPA-R的迁移率）磷酸化。进一步的研究报道，AMPA-Rs的交联导致膜上受体制动，它阻止了成功的LTP诱导。这一机制也可能导致由AMPA的致病性抗体介导的自身免疫性CNS疾病的病理生理学。与NMDA-R和mGluR5代谢受体的GluN1亚单位相比，AMPA-Rs的纳米级结构以不同的簇大小为特征。令人惊讶的是，突触前mGluR5受体表现出更均匀的分布，没有聚集行为。通过一种新的基于敲入的基因组编辑方法观察到，代表NMDA-R总库的内源性GluN1亚单位受体被证明聚集在一个由单个受体包围的主要单簇中。在关注NMDA-R细分的NR2A和NR2B亚型时，SMLM表明，在突触发育过程中，这些亚型被分割成纳米结构域，并根据其突触比率进行重塑。关于谷氨酸受体的活动性，单分子追踪实验揭示，神经元活动优先影响AMPA-R的活动性，而NMDA-R的活动是由蛋白激酶C活动触发的，而不是由钾升高触发的。此外，dSTORM成像表明，不同的NR2亚单位定位于不同的纳米结构域，这些纳米结构域在神经元发育过程中表现出灵活性。根据NR2A和NR2B的纳米结构，LTP的表达可以双向调节。kainate受体的单分子追踪实验也表明，突触捕获紧随着突触活性增加后发生。这里，突触激活导致的kainate受体与突触β-连环蛋白/N-钙粘蛋白复合物结合，形成短期可塑性。作为抑制性突触的对应物，gephyrin是将GABAA（GABA-a R）或甘氨酸受体（GlyR）并入突触后膜所必需的关键锚定分子。通过对突触中gephyrin分子的PALM/dSTORM成像发现：抑制性PSD（iPSD）体积为0.01至0.1μm3，并且每个iPSD中有200−250个gephyrin分子。单分子成像进一步揭示了gephyrin分子与受体结合位点的化学计量比约为1:1.96。类似于兴奋性突触，抑制性PSD（IPSD）根据突触活动动态调节其大小。通过NMDA-R激活形成的抑制性突触LTP加剧突触gephyrin积累，从而以CaMKII依赖的方式增加GABA-AR聚集，从而诱导GABA能突触后电流的增强。相反，抑制gephyrin向突触区的募集导致GABA-AR迁移率降低，并阻止iLTP的诱导。iLTP诱导后，gephyrin片段化为纳米结构域。gephyrin的重组降低了抑制性突触后电流的振幅变异性，证明了GABA-AR准确定位对于iLTP的真正表达非常重要。有趣的是，单粒子追踪显示，脱敏的GABA-AR甚至可以通过侧向扩散在并列的GABA能突触之间交换，为控制GABA能电流提供了另一种机制。此外，为了阐明多巴胺能突触的超微结构布局，dSTORM成像将多巴胺转运体映射到胆固醇依赖性纳米结构域，从而为更好地理解多巴胺能神经传递的病理生理过程奠定基础。5.4.亚突触结构域中的跨突触排列早期电生理学实验中已经发现，突触强度取决于突触前融合位点和突触后受体组织之间的空间关系，突触释放由释放位点的数量，突触小泡的释放概率，以及受体提供的突触后基本反应来决定。首先观测到的亚结构域的跨突触组织是突触粘附分子SynCAM 1位于边缘，EphB2位于PSD的中央。SynCam1在PSD中形成突触下云，可被长期抑郁症模式重塑。SMLM观察链霉亲和素的新单体变体（设计用于减少突触区域的交联和空间位阻），表明跨突触伙伴神经肽原1和神经纤维素1ß在突触处扩散受阻，形成相反的簇。这项研究还表明，另一种粘附分子LRRTM2的流动性不如神经肽1，并形成更密集、更稳定的簇。最近揭示了兴奋性突触上活性区的细胞基质和突触后受体支架的跨突触排列，它与提供高保真突触传递的靶向神经递质释放有关。在这里，释放位点定位是通过一种基于融合到突触囊泡蛋白Vglut1的pHluorin标记和RIM1/2纳米簇的超分辨检测的新方法实现的。多色3D定位显微镜显示RIM1/2和突触后PSD-95形成相反的纳米簇。LTP诱导导致PSD-95密度断裂增加，同时增强了纳米柱的排列，而LTD导致突触后柱的紊乱。突触前和突触后关键分子的这种纳米级排列主要由于neuroligin 1。此外，在应用STED显微镜的实时成像实验中，已经报道了树突棘体积增加和排列的纳米模块数量之间的紧密相关性。还报道了抑制性突触的亚突触结构域的纳米级排列。在这里，STED和SIM阐明了gephyrin和GABA-AR突触前亚区域的紧密联系。此外，突触后GABA-A 受体云显示与突触前边缘结构域结合（图11）。在小鼠神经肌肉连接处，带连接褶开口的突触后乙酰胆碱受体和突触前活动区的排列已通过应用SIM成像可视化。图11. 抑制性突触上的突触亚结构域。突触前的RIM元素与突触后的gephyrin支架分子以及抑制性突触的GABA-A R的突触下结构域的排列。PSD的体积和突触下域的数量随着活动相关的突触大小的变化而变化。转载自原文参考文献302。5.5. 三联突触星形胶质细胞是神经传递的基本调节者，神经元突触周围突触前星形细胞突起（PAPs）的吞噬产生了三联突触这一术语。PAPs能够通过传递调节分子来改变和控制突触的传递。通过dSTORM重建星形细胞突起，可以通过标记胶质酸性纤维蛋白（GFAP）和谷氨酰胺合成酶和S100b的成像来实现星形细胞的纳米级可视化。最近的一份报告应用ExM来观察脑片中突触周围的星形胶质细胞谷氨酸转运体显示，在与这些棘附近的GLT-1水平较高有关的较大的神经元树突棘中，谷氨酸的摄取效率降低（图12）。图12. 海马大脑切片中CA 1锥体神经元周围的星形细胞突起。锥体神经元的树突在Thy1-YFP小鼠系标记（绿色）；星形胶质细胞则是在海马脑片上的GLT-1免疫染色显示（红色）。蓝色信号代表树突区和星形细胞突起的共同定位。更高的放大率插图见右图。左下：大棘和小棘的分类。底部中间和右侧：GLT-1和神经元YFP的共定位像素的量化。请注意右图树突棘体积归一化后的变化；红点表示平均数和SEM，p = 0.0220 (绝对GLT-1覆盖率），p = 0.00223（相对GLT-1覆盖率）。转载自原文参考文献307。EM和STORM发现，PAPs也配备了局部翻译位点，以避免星形细胞体细胞中合成的蛋白质的长距离运输路线。最近在器官型切片中进行的3D STED显微镜研究揭示了星形细胞钙信号的结构前提。在星形细胞内检测到了海绵状结构，它包含了接近突触部位的节点和轴。钙离子瞬变的共聚焦成像与星形细胞结构的STED显微镜相结合，显示自发的钙离子瞬变紧密地映射到这些结点。因此，这些结点被认为是类似于树突棘的空间分隔作用。胶质传导物质的外渗需要提供胶质囊泡。通过将电容测量与葡聚糖摄取后星形胶质细胞内的囊泡的SIM图像相关联，发现了外吞和内吞之间的Dynamin依赖性膜中间物。通过STED显微镜和SIM分析单个胶质小泡的特征，在星形胶质细胞中有两个小泡群，其大小和融合能力不同。Phluorin实验结合SIM确定星形胶质细胞囊泡上Syb2分子的拷贝数为25∼。此外，应用STED和TIRF显微镜对培养的星形胶质细胞中的VAMP3阳性囊泡进行了单囊水平的分析。测量结果显示VAMP3覆盖的囊泡大小约为80纳米，并提供证据表明这些囊泡参与了钙依赖性的囊泡循环。SIM成像还可以发现，突触蛋白中一种已知的参与神经元外排的v-SNARE蛋白，也普遍存在并组织在单个星形胶质细胞的囊泡上，以实现高效的外排。星形胶质细胞还通过回收proBDNF到BDNF参与促进兴奋性LTP。这里，SIM成像显示，proBDNF在体细胞区域位于囊泡大小的集群中，而沿星形胶质细胞末梢的点状模式占主导地位，以扩大BDNF对记忆的作用。为了最大限度地减少激发光的散射，通过应用被动CLARITY进行组织透明化和多光子显微镜，改善了组织深处的星形细胞成像。通过使用SiR-actin和SiR-tublulin探针的STED显微镜和原子力显微镜（AFM）的相关方法来测量膜的拓扑结构和硬度，将星形细胞的细胞骨架和膜的生物物理特性联系起来。（未完待续）本文由超高显微技术应用工程师郭连峰、黄梓彤编译（受篇幅限制，未将参考文献列出）相关阅读：超高分辨率显微技术在神经科学中的应用（一）超高分辨率显微技术在神经科学中的应用（二）

p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 神经细胞.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/noimg/5ea1ac41-e831-42dc-ab38-5e418c9181f5.jpg" / 　 /p p 　世界上没有两片完全相同的叶子，细胞也是。然而，科学家们在进行现代生物学研究时，大多时候都考察的是细胞群体，而忽略了细胞异质性。 /p p 　　就拿神经细胞来说，大脑中有亿万个神经细胞，这些神经细胞在细胞形态，突触连结，细胞结构，电生理以及生理功能上具有高度的多样性。不同种类的神经细胞中，其基因组、蛋白组、化学分子组成、含量、代谢也都有着很大的差别。在直径不到1毫米的一个很小的脑区，可能就存在几十种甚至上百种完全不同的神经元以及胶质细胞类型。甚至很多情况下，即使物理距离上相邻的两个神经元也可能是两个不同的神经元类型。因此，对脑内单个神经元的基因组、蛋白质组以及代谢组进行分析，具有重要的生物学价值。 /p p 　　单细胞技术在近年发展非常迅速，比如单细胞测序，已经广泛应用于各种生命学科的研究。2014年1月Nature Methods上发表的年度特别报道，将“单细胞测序”(Singled out for sequencing)的应用列为2013年度最重要的方法学进展。 /p p 　　单细胞技术不仅在测序方面取得了极大进展，单细胞质谱分析也正在逐渐得到更多的关注。与用于分析单个细胞基因组的单细胞测序不同，单细胞质谱主要是研究单个细胞内的代谢物情况，例如化学小分子的组成、含量和代谢等等。单细胞质谱的优势在于可以高通量检测目前其它单细胞技术无法检测的小分子化合物，以及它们的代谢过程。同时，由于质谱本身的优势，不需要采取测序或者特异性抗体等外部手段，就可以精确分析检测到的化学物质信息，可以说是“物美价廉”。 不过，由于质谱技术本身的局限性，目前还无法做到类似单细胞测序那样的大规模测量。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　　　多学科交叉合作，开发单神经细胞质谱 /p p 　　2013年，熊伟教授结束了在美国国立卫生研究院的博士后研究工作，回国后加入了中国科学技术大学生命科学学院。在申请中组部“青年千人计划”时，熊伟教授认识了另一位中科大化学学院的“青千”黄光明教授，当时，黄光明教授课题组正在发展一种小样品(pL级别)质谱测量技术。经过多次讨论，他们决定将两个实验室的优势技术进行结合，开发单神经细胞质谱这一新技术。 /p p 　　目前质谱技术在神经科学中的应用，主要还是采用对大量组织细胞匀浆后的样品进行分析。在单细胞检测中，质谱分析因为具有高灵敏度，大的线性范围以及高通量分析化学分子的特点，逐渐被用于单细胞的细胞代谢分析。但目前的方法需要使用大量有机试剂对细胞进行处理，无法保持采样时细胞的活性 冗长的处理和分离过程也导致较慢的分析速度，无法短时间内完成大量单细胞分析 并缺乏来自同一细胞的电生理信号 最终导致单细胞代谢物的质谱分析无法大规模用于神经细胞的分析。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　新技术让质谱分析活体单个神经元成为现实 /p p 　　2017年1月26日，熊伟教授与黄光明教授等人在PNAS上发表了一项题为“Single-neuron identification of chemical constituents, physiological changes, and metabolism using mass spectrometry”的研究。在这项新研究中，研究团队依托电生理膜片钳以及电喷雾离子源技术建立了一种稳定的单神经元胞内组分取样和质谱组分分析技术。 /p p 　　 img title=" 神经细胞2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/noimg/6e5915a4-ec84-4cb3-b4c3-d7724a1fc4d3.jpg" / /p p & nbsp /p p style=" TEXT-ALIGN: center" & nbsp 　 span style=" FONT-SIZE: 14px" 膜片钳与单细胞质谱分析联用技术分析单个神经细胞示意图 /span /p p 　　电生理膜片钳能将玻璃微电极接触并吸附在细胞膜上，高阻抗封接后将膜打穿成孔，记录膜片以外部位的全细胞膜的离子电流。而电喷雾技术主要是利用一个高压交流电使分析物被离子化然后被质谱检测，该离子源具有较强的抗干扰能力。与传统的质谱方法相比，这一新方法最大的优势是可以原位对活细胞进行取样，并且同时采集细胞位置、电生理活动以及细胞内化学成分等多方面的信息。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　质谱分析让神经化学研究进入单细胞水平 /p p 　　研究人员利用这一方法对小鼠海马、前额叶、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元内的数千种化学小分子进行了快速质谱检测，并同步采集了电生理信号。 /p p 　　海马、前额叶、杏仁核、纹状体这四个核团无论是在人类还是低等动物中都非常重要，与学习、记忆和情绪等行为以及相关疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等有着密切的联系。这些核团内的神经元种类繁多，目前国内外有多个课题组正在从单细胞测序的角度解析这些核团的神经元分类及对其功能进行鉴定。熊伟教授表示，他们对这四个核团神经元进行质谱研究，也正是想从单细胞水平全面分析这些核团神经元的代谢组学情况，以及这些代谢通路和代谢组在学习、记忆和情绪等行为及其相关疾病中的作用机制。 /p p 　　在这项研究中，研究人员主要对不同年龄段的小鼠海马、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元中的谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)以及GABA等化学小分子进行定性、定量分析并对其进行神经元分类。 /p p 　　Glu和GABA是中枢神经系统两大类神经递质(兴奋性或抑制性)的代表性分子。早期人们认为一个神经元内只存在一种递质，其全部末梢只能释放同一种递质，这被称之为戴尔原则(Dale& #39 s principle)。然而随着科学技术的发展，人们逐渐认识到两种或两种以上递质(包括调质)可存在于同一神经元内，在适当的刺激下可经突触前膜共同释放。这种新的观点得到了众多电生理及免疫组化等实验的证明。然而这些证据大部分都是间接的证据，尚无直接证据表明二者的共存。这项研究首次在单细胞水平，通过质谱分析给出了二者共存于同一神经元内的直接证据。同时，研究人员还发现了一些尚未在神经系统中被发现的小分子，他们正在努力研究其作用和分子机制。 /p p 　　此外，研究还鉴定了单个神经元内谷氨酰胺的代谢路径。Gln-Glu-GABA通路是谷氨酸和GABA代谢的经典通路，尤其是谷氨酸，它不仅仅作为兴奋性神经递质存在于神经元内，还大量参与到蛋白质的合成代谢以及细胞能量供应体系中。而GABA是中枢神经系统的抑制性递质，可以防止神经细胞过度兴奋。二者与各种脑疾病都有着密切的关系，如自闭症、阿尔茨海默病、帕金森病等。该通路在大脑的发育和衰老中扮演着非常重要的角色。对单个神经元内谷氨酰胺的代谢路径的鉴定对于深入理解这条代谢通路以及与之相关的疾病机制具有重要意义。 /p p 　　这项研究首次利用化学质谱方法直接无稀释地检测单个神经元中多种神经递质、代谢物、脂质等化学小分子，对单个神经元化学成分及代谢物进行了即时分析，并将目前神经细胞成分分析的研究推向了一个活细胞及单细胞水平。这一技术在将来或许能够帮助科学家们在单细胞层次上去研究神经生物学、代谢组学、毒理学等生命科学的重大问题。 /p p 　　谈到临床应用前景时，熊伟教授的态度也十分肯定。他表示，该技术允许研究人员对血液、脑脊液等样品中的单个细胞进行质谱检测，结合相应的生物标记物，完全有可能对阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等神经精神疾病的早期诊断提供帮助。 /p p 　　　熊伟教授从事神经科学研究，他认为现代神经科学研究需要技术的快速研发以及多领域多学科的交叉合作，必须发展包括显微成像、分子示踪、质谱分析、光遗传学以及转基因操作等最新的生物、物理、化学与工程材料等多学科交叉技术。熊伟教授表示，对他而言，科研不仅仅是工作，也是兴趣，尤其是对新技术的热切追求，驱动着他不断前行。熊伟教授及其研究团队也正在和中国科大的其它实验室展开合作，和不同的领域的科学家交流和分享科研心得是一种享受。 /p p 　　该项工作由中科大生命学院博士后朱洪影、生命学院博士研究生邹桂昌、王宁在熊伟教授和黄光明教授的共同指导下完成。该研究工作得到了国家自然科学基金委重大研究计划、科技部、中科院战略性先导科技专项(B类)以及国家青年千人计划等的资助。该工作还得到中国科学技术大学同步辐射实验室光电离质谱线站的仪器与技术支持。　 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" & nbsp img title=" 熊伟.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/noimg/2a3b00c2-8807-4156-a379-59653af1915d.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　熊伟 教授 /p p 　　熊伟教授是国家中组部“青年千人计划”获得者，2001年毕业于北京大学生命科学学院，获理学学士学位。2006年毕业于北京大学生命科学学院，获理学博士学位。2006至2013年，在美国国立卫生研究院(NIH)酒精滥用与酒精中毒研究所(NIAAA)做博士后研究工作。2013年3月加入中国科学技术大学生命科学学院。中科院脑科学与智能技术卓越创新中心骨干成员。中科大神经退行性疾病研究中心暨脑资源库核心成员。长期从事与神经化学、药理学、小分子药物研发相关的神经科学研究，运用多种先进的实验技术从分子、细胞水平、到动物行为进行了深入系统的研究，并取得了系列重要成果。研究工作发表在Nature Neuroscience, Nature Chemical Biology, Journal of Experimental Medicine, PNAS, Journal of Neuroscience, Molecular Pharmacology等国际学术期刊上。获得过多项国家级基金资助。 /p

p strong 仪器信息网、中国电子显微镜学会、中国电镜网联合报导 /strong strong ： /strong 2015年10月18日第四届全国激光共聚焦显微技术理论与应用学术交流研讨会圆满闭幕。 /p p 　　在14日下午的会议中，有一个特邀报告格外地引起了笔者的注意，来自西北农林科技大学动物医学院的赵善廷教授提到他曾与高压冷冻固定技术的发明者瑞士科学家Studer博士合作，将该技术与器官型脑片培养技术(organotypic slice culture)相结合，成功地研究了与学习和记忆密切有关的长时程效应(long-term potentiation, LTP)对突触的影响。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" dir=" ltr" img style=" WIDTH: 450px HEIGHT: 300px" title=" 00.jpg" border=" 0" hspace=" 0" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201510/insimg/2f90df00-d7ca-416b-bd07-44431d4c22cd.jpg" width=" 450" height=" 300" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" strong 西北农林科技大学动物医学院的赵善廷教授 /strong /p p 　　据了解，以往的常规 a href=" http://www.instrument.com.cn/zc/1139.html" target=" _self" title=" " style=" color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 电镜 /span /a 技术需要先用甲醛、戊二醛等化学试剂对样品进行化学固定，但这种固定方法有三个缺点包括： /p p 　　一、无法扑捉短暂生理过程的形态变化和特征，如神经元突触小泡内神经递质的释放；二、脱水过程用酒精等有机溶剂会造成细胞和组织皱缩，使其形态和大小发生改变；三、化学固定剂特别是戊二醛可引起蛋白质变性，使其与相应抗体结合能力下降甚至丧失，导致电镜免疫组化染色失败。 /p p 　　为克服化学固定的这些缺点，上世纪九十年代末，瑞士科学家Studer博士发明了一种新的物理性电镜固定技术，即高压冷冻电镜固定技术，该技术可以在不使用任何化学固定剂的条件下五十毫秒以内将组织和细胞完全固定。 /p p 　　虽然高压冷冻技术克服了化学固定的三大缺点，但它本身也有一个不足之处：固定的样品非常小，直径不能超过1mm，厚度不能超过& amp #956 m，从而限制了它在神经生物学研究中的应用。 /p p 　　为了克服高压冷冻固定技术的缺点，将其应用到神经生物学研究中，2002年，该技术发明者Studer博士与当时正在德国弗莱堡大学医学院做博士后的赵善廷博士合作，将器官型脑片培养技术和高压冷冻固定技术相结合固定神经纤维，历时五年的不断摸索，到2007年两种技术终于完美地结合在一起。赵教授在接受本网记者采访时表示，希望能够与国内相关课题组合作，为这种样品制备方法寻找更多的应用领域。 /p p style=" TEXT-ALIGN: right" 撰稿：史秀明 /p