神经化学

p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 神经细胞.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/noimg/5ea1ac41-e831-42dc-ab38-5e418c9181f5.jpg" / 　 /p p 　世界上没有两片完全相同的叶子，细胞也是。然而，科学家们在进行现代生物学研究时，大多时候都考察的是细胞群体，而忽略了细胞异质性。 /p p 　　就拿神经细胞来说，大脑中有亿万个神经细胞，这些神经细胞在细胞形态，突触连结，细胞结构，电生理以及生理功能上具有高度的多样性。不同种类的神经细胞中，其基因组、蛋白组、化学分子组成、含量、代谢也都有着很大的差别。在直径不到1毫米的一个很小的脑区，可能就存在几十种甚至上百种完全不同的神经元以及胶质细胞类型。甚至很多情况下，即使物理距离上相邻的两个神经元也可能是两个不同的神经元类型。因此，对脑内单个神经元的基因组、蛋白质组以及代谢组进行分析，具有重要的生物学价值。 /p p 　　单细胞技术在近年发展非常迅速，比如单细胞测序，已经广泛应用于各种生命学科的研究。2014年1月Nature Methods上发表的年度特别报道，将“单细胞测序”(Singled out for sequencing)的应用列为2013年度最重要的方法学进展。 /p p 　　单细胞技术不仅在测序方面取得了极大进展，单细胞质谱分析也正在逐渐得到更多的关注。与用于分析单个细胞基因组的单细胞测序不同，单细胞质谱主要是研究单个细胞内的代谢物情况，例如化学小分子的组成、含量和代谢等等。单细胞质谱的优势在于可以高通量检测目前其它单细胞技术无法检测的小分子化合物，以及它们的代谢过程。同时，由于质谱本身的优势，不需要采取测序或者特异性抗体等外部手段，就可以精确分析检测到的化学物质信息，可以说是“物美价廉”。 不过，由于质谱技术本身的局限性，目前还无法做到类似单细胞测序那样的大规模测量。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　　　多学科交叉合作，开发单神经细胞质谱 /p p 　　2013年，熊伟教授结束了在美国国立卫生研究院的博士后研究工作，回国后加入了中国科学技术大学生命科学学院。在申请中组部“青年千人计划”时，熊伟教授认识了另一位中科大化学学院的“青千”黄光明教授，当时，黄光明教授课题组正在发展一种小样品(pL级别)质谱测量技术。经过多次讨论，他们决定将两个实验室的优势技术进行结合，开发单神经细胞质谱这一新技术。 /p p 　　目前质谱技术在神经科学中的应用，主要还是采用对大量组织细胞匀浆后的样品进行分析。在单细胞检测中，质谱分析因为具有高灵敏度，大的线性范围以及高通量分析化学分子的特点，逐渐被用于单细胞的细胞代谢分析。但目前的方法需要使用大量有机试剂对细胞进行处理，无法保持采样时细胞的活性 冗长的处理和分离过程也导致较慢的分析速度，无法短时间内完成大量单细胞分析 并缺乏来自同一细胞的电生理信号 最终导致单细胞代谢物的质谱分析无法大规模用于神经细胞的分析。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　新技术让质谱分析活体单个神经元成为现实 /p p 　　2017年1月26日，熊伟教授与黄光明教授等人在PNAS上发表了一项题为“Single-neuron identification of chemical constituents, physiological changes, and metabolism using mass spectrometry”的研究。在这项新研究中，研究团队依托电生理膜片钳以及电喷雾离子源技术建立了一种稳定的单神经元胞内组分取样和质谱组分分析技术。 /p p 　　 img title=" 神经细胞2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/noimg/6e5915a4-ec84-4cb3-b4c3-d7724a1fc4d3.jpg" / /p p & nbsp /p p style=" TEXT-ALIGN: center" & nbsp 　 span style=" FONT-SIZE: 14px" 膜片钳与单细胞质谱分析联用技术分析单个神经细胞示意图 /span /p p 　　电生理膜片钳能将玻璃微电极接触并吸附在细胞膜上，高阻抗封接后将膜打穿成孔，记录膜片以外部位的全细胞膜的离子电流。而电喷雾技术主要是利用一个高压交流电使分析物被离子化然后被质谱检测，该离子源具有较强的抗干扰能力。与传统的质谱方法相比，这一新方法最大的优势是可以原位对活细胞进行取样，并且同时采集细胞位置、电生理活动以及细胞内化学成分等多方面的信息。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　质谱分析让神经化学研究进入单细胞水平 /p p 　　研究人员利用这一方法对小鼠海马、前额叶、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元内的数千种化学小分子进行了快速质谱检测，并同步采集了电生理信号。 /p p 　　海马、前额叶、杏仁核、纹状体这四个核团无论是在人类还是低等动物中都非常重要，与学习、记忆和情绪等行为以及相关疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等有着密切的联系。这些核团内的神经元种类繁多，目前国内外有多个课题组正在从单细胞测序的角度解析这些核团的神经元分类及对其功能进行鉴定。熊伟教授表示，他们对这四个核团神经元进行质谱研究，也正是想从单细胞水平全面分析这些核团神经元的代谢组学情况，以及这些代谢通路和代谢组在学习、记忆和情绪等行为及其相关疾病中的作用机制。 /p p 　　在这项研究中，研究人员主要对不同年龄段的小鼠海马、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元中的谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)以及GABA等化学小分子进行定性、定量分析并对其进行神经元分类。 /p p 　　Glu和GABA是中枢神经系统两大类神经递质(兴奋性或抑制性)的代表性分子。早期人们认为一个神经元内只存在一种递质，其全部末梢只能释放同一种递质，这被称之为戴尔原则(Dale& #39 s principle)。然而随着科学技术的发展，人们逐渐认识到两种或两种以上递质(包括调质)可存在于同一神经元内，在适当的刺激下可经突触前膜共同释放。这种新的观点得到了众多电生理及免疫组化等实验的证明。然而这些证据大部分都是间接的证据，尚无直接证据表明二者的共存。这项研究首次在单细胞水平，通过质谱分析给出了二者共存于同一神经元内的直接证据。同时，研究人员还发现了一些尚未在神经系统中被发现的小分子，他们正在努力研究其作用和分子机制。 /p p 　　此外，研究还鉴定了单个神经元内谷氨酰胺的代谢路径。Gln-Glu-GABA通路是谷氨酸和GABA代谢的经典通路，尤其是谷氨酸，它不仅仅作为兴奋性神经递质存在于神经元内，还大量参与到蛋白质的合成代谢以及细胞能量供应体系中。而GABA是中枢神经系统的抑制性递质，可以防止神经细胞过度兴奋。二者与各种脑疾病都有着密切的关系，如自闭症、阿尔茨海默病、帕金森病等。该通路在大脑的发育和衰老中扮演着非常重要的角色。对单个神经元内谷氨酰胺的代谢路径的鉴定对于深入理解这条代谢通路以及与之相关的疾病机制具有重要意义。 /p p 　　这项研究首次利用化学质谱方法直接无稀释地检测单个神经元中多种神经递质、代谢物、脂质等化学小分子，对单个神经元化学成分及代谢物进行了即时分析，并将目前神经细胞成分分析的研究推向了一个活细胞及单细胞水平。这一技术在将来或许能够帮助科学家们在单细胞层次上去研究神经生物学、代谢组学、毒理学等生命科学的重大问题。 /p p 　　谈到临床应用前景时，熊伟教授的态度也十分肯定。他表示，该技术允许研究人员对血液、脑脊液等样品中的单个细胞进行质谱检测，结合相应的生物标记物，完全有可能对阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等神经精神疾病的早期诊断提供帮助。 /p p 　　　熊伟教授从事神经科学研究，他认为现代神经科学研究需要技术的快速研发以及多领域多学科的交叉合作，必须发展包括显微成像、分子示踪、质谱分析、光遗传学以及转基因操作等最新的生物、物理、化学与工程材料等多学科交叉技术。熊伟教授表示，对他而言，科研不仅仅是工作，也是兴趣，尤其是对新技术的热切追求，驱动着他不断前行。熊伟教授及其研究团队也正在和中国科大的其它实验室展开合作，和不同的领域的科学家交流和分享科研心得是一种享受。 /p p 　　该项工作由中科大生命学院博士后朱洪影、生命学院博士研究生邹桂昌、王宁在熊伟教授和黄光明教授的共同指导下完成。该研究工作得到了国家自然科学基金委重大研究计划、科技部、中科院战略性先导科技专项(B类)以及国家青年千人计划等的资助。该工作还得到中国科学技术大学同步辐射实验室光电离质谱线站的仪器与技术支持。　 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" & nbsp img title=" 熊伟.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/noimg/2a3b00c2-8807-4156-a379-59653af1915d.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　熊伟 教授 /p p 　　熊伟教授是国家中组部“青年千人计划”获得者，2001年毕业于北京大学生命科学学院，获理学学士学位。2006年毕业于北京大学生命科学学院，获理学博士学位。2006至2013年，在美国国立卫生研究院(NIH)酒精滥用与酒精中毒研究所(NIAAA)做博士后研究工作。2013年3月加入中国科学技术大学生命科学学院。中科院脑科学与智能技术卓越创新中心骨干成员。中科大神经退行性疾病研究中心暨脑资源库核心成员。长期从事与神经化学、药理学、小分子药物研发相关的神经科学研究，运用多种先进的实验技术从分子、细胞水平、到动物行为进行了深入系统的研究，并取得了系列重要成果。研究工作发表在Nature Neuroscience, Nature Chemical Biology, Journal of Experimental Medicine, PNAS, Journal of Neuroscience, Molecular Pharmacology等国际学术期刊上。获得过多项国家级基金资助。 /p

p style=" text-align: center " img title=" 1.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/0bb94937-6370-4e0c-8471-e1a4f208f43b.jpg" / /p p 　　采访嘉宾：熊伟 (中国科学技术大学生命科学学院教授，博士生导师) /p p 　　世界上没有两片完全相同的叶子，细胞也是。然而，科学家们在进行现代生物学研究时，大多时候都考察的是细胞群体，而忽略了细胞异质性。 /p p 　　就拿神经细胞来说，大脑中有亿万个神经细胞，这些神经细胞在细胞形态，突触连结，细胞结构，电生理以及生理功能上具有高度的多样性。不同种类的神经细胞中，其基因组、蛋白组、化学分子组成、含量、代谢也都有着很大的差别。在直径不到1毫米的一个很小的脑区，可能就存在几十种甚至上百种完全不同的神经元以及胶质细胞类型。甚至很多情况下，即使物理距离上相邻的两个神经元也可能是两个不同的神经元类型。因此，对脑内单个神经元的基因组、蛋白质组以及代谢组进行分析，具有重要的生物学价值。 /p p 　　单细胞技术在近年发展非常迅速，比如单细胞测序，已经广泛应用于各种生命学科的研究。2014年1月Nature Methods上发表的年度特别报道，将“单细胞测序”(Singled out for sequencing)的应用列为2013年度最重要的方法学进展。 /p p 　　单细胞技术不仅在测序方面取得了极大进展，单细胞质谱分析也正在逐渐得到更多的关注。与用于分析单个细胞基因组的单细胞测序不同，单细胞质谱主要是研究单个细胞内的代谢物情况，例如化学小分子的组成、含量和代谢等等。单细胞质谱的优势在于可以高通量检测目前其它单细胞技术无法检测的小分子化合物，以及它们的代谢过程。同时，由于质谱本身的优势，不需要采取测序或者特异性抗体等外部手段，就可以精确分析检测到的化学物质信息，可以说是“物美价廉”。 不过，由于质谱技术本身的局限性，目前还无法做到类似单细胞测序那样的大规模测量。 /p p 　　 strong 1. 多学科交叉合作，开发单神经细胞质谱 /strong /p p 　　2013年，熊伟教授结束了在美国国立卫生研究院的博士后研究工作，回国后加入了中国科学技术大学生命科学学院。在申请中组部“青年千人计划”时，熊伟教授认识了另一位中科大化学学院的“青千”黄光明教授，当时，黄光明教授课题组正在发展一种小样品(pL级别)质谱测量技术。经过多次讨论，他们决定将两个实验室的优势技术进行结合，开发单神经细胞质谱这一新技术。 /p p 　　目前质谱技术在神经科学中的应用，主要还是采用对大量组织细胞匀浆后的样品进行分析。在单细胞检测中，质谱分析因为具有高灵敏度，大的线性范围以及高通量分析化学分子的特点，逐渐被用于单细胞的细胞代谢分析。但目前的方法需要使用大量有机试剂对细胞进行处理，无法保持采样时细胞的活性 冗长的处理和分离过程也导致较慢的分析速度，无法短时间内完成大量单细胞分析 并缺乏来自同一细胞的电生理信号 最终导致单细胞代谢物的质谱分析无法大规模用于神经细胞的分析。 /p p 　　 strong 2. 新技术让质谱分析活体单个神经元成为现实 /strong /p p 　　2017年1月26日，熊伟教授与黄光明教授等人在PNAS上发表了一项题为“Single-neuron identification of chemical constituents, physiological changes, and metabolism using mass spectrometry”的研究。在这项新研究中，研究团队依托电生理膜片钳以及电喷雾离子源技术建立了一种稳定的单神经元胞内组分取样和质谱组分分析技术。 /p p style=" text-align: center " img title=" 2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/705ccfee-dabe-4de5-8fa8-1bde4c73181d.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 膜片钳与单细胞质谱分析联用技术分析单个神经细胞示意图 /strong /p p 　　电生理膜片钳能将玻璃微电极接触并吸附在细胞膜上，高阻抗封接后将膜打穿成孔，记录膜片以外部位的全细胞膜的离子电流。而电喷雾技术主要是利用一个高压交流电使分析物被离子化然后被质谱检测，该离子源具有较强的抗干扰能力。与传统的质谱方法相比，这一新方法最大的优势是可以原位对活细胞进行取样，并且同时采集细胞位置、电生理活动以及细胞内化学成分等多方面的信息。 /p p 　　 strong 3. 质谱分析让神经化学研究进入单细胞水平 /strong /p p 　　研究人员利用这一方法对小鼠海马、前额叶、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元内的数千种化学小分子进行了快速质谱检测，并同步采集了电生理信号。 /p p 　　海马、前额叶、杏仁核、纹状体这四个核团无论是在人类还是低等动物中都非常重要，与学习、记忆和情绪等行为以及相关疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等有着密切的联系。这些核团内的神经元种类繁多，目前国内外有多个课题组正在从单细胞测序的角度解析这些核团的神经元分类及对其功能进行鉴定。熊伟教授表示，他们对这四个核团神经元进行质谱研究，也正是想从单细胞水平全面分析这些核团神经元的代谢组学情况，以及这些代谢通路和代谢组在学习、记忆和情绪等行为及其相关疾病中的作用机制。 /p p 　　在这项研究中，研究人员主要对不同年龄段的小鼠海马、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元中的谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)以及GABA等化学小分子进行定性、定量分析并对其进行神经元分类。 /p p 　　Glu和GABA是中枢神经系统两大类神经递质(兴奋性或抑制性)的代表性分子。早期人们认为一个神经元内只存在一种递质，其全部末梢只能释放同一种递质，这被称之为戴尔原则(Dale& #39 s principle)。然而随着科学技术的发展，人们逐渐认识到两种或两种以上递质(包括调质)可存在于同一神经元内，在适当的刺激下可经突触前膜共同释放。这种新的观点得到了众多电生理及免疫组化等实验的证明。然而这些证据大部分都是间接的证据，尚无直接证据表明二者的共存。这项研究首次在单细胞水平，通过质谱分析给出了二者共存于同一神经元内的直接证据。同时，研究人员还发现了一些尚未在神经系统中被发现的小分子，他们正在努力研究其作用和分子机制。 /p p 　　此外，研究还鉴定了单个神经元内谷氨酰胺的代谢路径。Gln-Glu-GABA通路是谷氨酸和GABA代谢的经典通路，尤其是谷氨酸，它不仅仅作为兴奋性神经递质存在于神经元内，还大量参与到蛋白质的合成代谢以及细胞能量供应体系中。而GABA是中枢神经系统的抑制性递质，可以防止神经细胞过度兴奋。二者与各种脑疾病都有着密切的关系，如自闭症、阿尔茨海默病、帕金森病等。该通路在大脑的发育和衰老中扮演着非常重要的角色。对单个神经元内谷氨酰胺的代谢路径的鉴定对于深入理解这条代谢通路以及与之相关的疾病机制具有重要意义。 /p p 　　这项研究首次利用化学质谱方法直接无稀释地检测单个神经元中多种神经递质、代谢物、脂质等化学小分子，对单个神经元化学成分及代谢物进行了即时分析，并将目前神经细胞成分分析的研究推向了一个活细胞及单细胞水平。这一技术在将来或许能够帮助科学家们在单细胞层次上去研究神经生物学、代谢组学、毒理学等生命科学的重大问题。 /p p 　　谈到临床应用前景时，熊伟教授的态度也十分肯定。他表示，该技术允许研究人员对血液、脑脊液等样品中的单个细胞进行质谱检测，结合相应的生物标记物，完全有可能对阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等神经精神疾病的早期诊断提供帮助。 /p p 　　 strong 4. 后记 /strong /p p 　　熊伟教授从事神经科学研究，他认为现代神经科学研究需要技术的快速研发以及多领域多学科的交叉合作，必须发展包括显微成像、分子示踪、质谱分析、光遗传学以及转基因操作等最新的生物、物理、化学与工程材料等多学科交叉技术。熊伟教授表示，对他而言，科研不仅仅是工作，也是兴趣，尤其是对新技术的热切追求，驱动着他不断前行。熊伟教授及其研究团队也正在和中国科大的其它实验室展开合作，和不同的领域的科学家交流和分享科研心得是一种享受。 /p p 　　 strong 关于研究人员 /strong /p p 　　该项工作由中科大生命学院博士后朱洪影、生命学院博士研究生邹桂昌、王宁在熊伟教授和黄光明教授的共同指导下完成。该研究工作得到了国家自然科学基金委重大研究计划、科技部、中科院战略性先导科技专项(B类)以及国家青年千人计划等的资助。该工作还得到中国科学技术大学同步辐射实验室光电离质谱线站的仪器与技术支持。 /p p 　　 strong 关于熊伟教授 /strong /p p style=" text-align: center " img title=" 3.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/feba38ed-9bd1-4fc4-9016-bb72aef280df.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 熊伟 教授 /strong /p p 　　国家中组部“青年千人计划”获得者，2001年毕业于北京大学生命科学学院，获理学学士学位。2006年毕业于北京大学生命科学学院，获理学博士学位。2006至2013年，在美国国立卫生研究院(NIH)酒精滥用与酒精中毒研究所(NIAAA)做博士后研究工作。2013年3月加入中国科学技术大学生命科学学院。中科院脑科学与智能技术卓越创新中心骨干成员。中科大神经退行性疾病研究中心暨脑资源库核心成员。长期从事与神经化学、药理学、小分子药物研发相关的神经科学研究，运用多种先进的实验技术从分子、细胞水平、到动物行为进行了深入系统的研究，并取得了系列重要成果。研究工作发表在Nature Neuroscience, Nature Chemical Biology, Journal of Experimental Medicine, PNAS, Journal of Neuroscience, Molecular Pharmacology等国际学术期刊上。获得过多项国家级基金资助。 /p p 　　 strong 参考文献： /strong /p p 　　Single-neuron identification of chemical constituents, physiological changes, and metabolism using mass spectrometry /p p & nbsp /p

日前，安徽合肥一位读者爆料称，现在的火锅多是“化学锅”。“不仅很多涮品用了添加剂，火锅底里更是包含了多种化学添加剂。 ”曾是合肥一家火锅店大厨的王先生表示，“现在市场上80%多的火锅，都包含这样的化学底料。”(12月15日《安徽商报》) 　　相关人士介绍，添加了化学添加剂的火锅底料，经加热后会产生大量对人体有害的化学物质。虽然目前业界就这些底料对人体具体危害，还没有形成量化共识，但可以肯定的是，这些化学物质进入人体后，会慢慢累积，损伤内脏，严重的还可能致癌。这一情况不仅仅是在合肥，在南京，媒体也报道：火锅飘香剂、辣椒精和火锅红在市场上几近“泛滥”。公然危害人们身体健康的“化学锅”，已在全国呈泛滥之势。 　　更令公众郁闷的是，这两个地方的相关监管部门不是称“食品添加剂的种类太多，无法明确告知这些产品究竟能否食用”，就是说“检测食品添加剂成分的硬件要求过高，检查这一项一直以来都是个难题”，有些甚至是直接踢皮球，监管部门的如此做法，是在放任 “化学锅”一天天毒害众多无辜及对此并不知情的消费者。 　　与此相反，敢于公然曝出火锅成为“化学锅”的行业潜规则的“业内人士”，却都是因为出于内心的良知：在安徽合肥，曾在火锅店当大厨而最终改行经商的安徽合肥王先生，认为长时间吃这些化学原料“对人体非常有害”，因此觉得“太昧良心”而改行 而江苏南京的许先生，之所以由火锅店老板改行，也是因为“这钱赚得不安稳”，“有点愧疚和担心”，尽管他不能清楚知道那些添加剂究竟对人的身体是不是有害，但“他和家里人从来不吃店里的火锅。” 　　公众不知道火锅中的添加剂“对人的身体有多大危害”，说明了国家相关检测机构对于像火锅飘香剂、辣椒精和火锅红等“新生事物”的技术滞后，但是这并不等于说监管部门已经对此做到了尽职尽责。举个例子，市场上有些本该由12位数组成的“飘香剂、火锅红、辣椒精”等产品的QS号码，却由10位组成，监管部门总该知情并查处吧?在相关业内人士都因“良知”而主动站出来揭火锅已泛滥为“化学锅”时，相关监管部门却如此被动和漠然，他们迟钝的神经依然无法被刺痛。 　　一起又一起发生在我们身边的食品安全事故，促使国家相关部门的安全监管法规越来越完善和严格，但是，当遇到如此漠视职责的监管部门，即使相关法规再完善再严格，又有何用?

确认化学武器袭击很复杂自2011年叙利亚内战爆发以来，叙利亚使用化学武器一直是一个主要问题。2013年，有关于叙利亚古塔地区使用沙林毒气的广泛报道，随后得到了联合国的证实。很难证明化学武器的使用，因为必须首先从怀疑发生袭击的地方收集样本。这些样本可能来自空气、土壤或水中，甚至来自受害者的尸体，但在战区很难获得。样品可以使用离子迁移率光谱法等技术进行现场分析，也可以在实验室进行分析，通常使用GC-MS或LC-MS。国防大学（捷克共和国）核、生物和化学防御研究所的Tomas Rozsypal观察到，橡胶手套往往是化学袭击医疗响应人员佩戴的唯一一种个人防护装备，通常在现场处理。这种手套对化学制剂没有太大的保护作用，但它们可能是使用化学武器的证据来源。因此，Rozsyal开发了一种检测一次性橡胶手套上G型神经毒剂的GC-FID方法，可供军事法医团队在移动和传统实验室使用，并调查了攻击后能检测到神经毒剂的时间。安全第一本研究采用气相色谱-火焰离子化检测器对一次性丁腈、乳胶和乙烯基手套上的代表性神经毒剂沙林、梭曼和环沙林进行了检测。在使用这些危险的神经毒剂时，必须严格遵守安全规程，包括使用合适的通风柜、穿戴合适的个人防护装备、严格的去污程序和适当的废物处理。Rozsypal试验使用军事实验室常见的六种溶剂（己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈和甲醇）从手套中提取掺入的神经毒剂，并比较了握手10分钟、涡旋0.5～5分钟和超声5或10分钟，最终选择涡旋1分钟。比较色谱背景，用己烷或乙腈提取得到最干净的痕量，几乎没有干扰峰。离心后，使用Thermo Trace 1310和TG-5MS柱（30 米 × 0.32 毫米 × 0.50 μm，也来自Thermo）和氦气（1.5 mL min-1）作为载气。在80°C下开始运行2分钟，在20°C min-1下升至130°C，然后在5°C min-2下升至150°C，最后在20°C.min-1下降至280°C，并保持2分钟。使用1µL的注射体积，注射口设置为250°C。FID检测器设置为280°，使用氮气（30 mL min-1）作为补充气体，空气和氢气分别设置为350 mL min-1和40 mL min-1。对手套上神经毒剂的稳定性进行了评估，以了解攻击后手套可以作为证据使用多长时间。寿命受到分析物的挥发性和与手套材料的结合的影响，乳胶手套的寿命最短。当然，这可能因不同制造商或材料的手套而异。从化学攻击现场收集样本既困难又危险，因此对类似于现场使用的样本处理程序进行了评估，对结果没有太大影响。使用开发的方法，可以在一次性橡胶手套上检测到化学武器的痕迹，这表明如果在化学武器袭击现场发现的手套在袭击后不久被收集起来，就可以作为证据。分析人员应注意，一些溶剂会破坏橡胶手套样品，因此在选择提取溶剂时需要小心。相关链接Rozsypal T. Contaminated disposable rubber gloves as evidence samples after a chemical attack with nerve agents. Drug Test Anal. 2023. https://doi.org/10.1002/dta.3468De Vooght-Johnson R. Detecting biomarkers of chemical weapons in hair with μLC-MS/MS. Wiley Analytical Science. 8 March 2023 (https://analyticalscience.wiley.com/do/10.1002/was.0090284 accessed 31 March 2023).UN investigation of chemical weapons use in Ghouta, Wikipedia (https://en.wikipedia.org/wiki/UN investigation of chemical weapons use in Ghouta accessed 31 March 2023).作者简介•Ryan De Vooght JohnsonRyan是一名自由科学作家和编辑。在获得仪器和分析方法硕士学位后，他在制药行业担任过各种分析开发职务，之后担任编辑职务。作为委托编辑，他创办了两本与分析化学和药物相关的期刊，《生物分析》和《治疗药物》，并管理了许多其他期刊。他现在是一名自由科学作家和编辑，以便有更多的时间与家人、自行车和分配物在一起。来源：GC-FID can detect chemical weapons on disposable rubber gloves——Sensitive, rapid detection of G-type nerve agentsSeparationGCDetectors，2023/3/30供稿：符 斌，北京中实国金国际实验室能力验证研究有限公司

近日，中国科学技术大学化学与材料科学学院黄光明教授与生命科学学院熊伟教授开展紧密合作，基于自行开发的单细胞电生理与质谱联合检测平台，对小鼠大脑中单个神经元开展了多种化学成分的快速质谱检测，并且可以做到同步采集电生理信号，在单细胞层次上成功完成了对神经元功能、代谢物组成及其代谢通路的研究。相关研究成果以“Single-Neuron Identification Of Chemical Constituents,Physiological Changes, And Metabolism Using Mass Spectrometry”为题，于2月21日在线发表在国际权威综合学术期刊《美国科学院院报》(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, PNAS)上。　　脑内神经细胞在细胞形态、突触连结、细胞结构、电生理以及生理功能上具有高度的多样性。不同种类的神经细胞中，其化学分子组成、含量、代谢也都有着很大的差别。因此，对脑内单个神经元的化学成分进行分析，具有重要的生物学价值。质谱分析因为具有高灵敏度、大的线性范围以及高通量分析化学分子的特点，逐渐被用于单细胞的细胞代谢分析。但目前的方法需要使用大量有机试剂对细胞进行处理，无法保持采样时细胞的活性 冗长的处理和分离过程也导致较慢的分析速度，无法短时间内完成大量单细胞分析，并缺乏来自同一细胞的电生理信号，最终导致单细胞代谢物的质谱分析无法大规模用于神经细胞的分析。近年来，中国科大黄光明教授实验室与熊伟教授实验室紧密合作，开发了能用于复杂样品的原位质谱分析方法，大大提高了分析速度，并于近期实现了针对细胞内蛋白质的直接分析(Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50:2503 Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50:9907 Anal. Chem. 2016,88:10860)，同时通过电生理膜片钳技术开展了对小鼠脑内单个神经元的功能鉴定与解析(Nat. Chem. Biol., 2011 J. Exp. Med., 2012 Nat. Neurosci., 2014)。这些研究为实现单个神经细胞的高通量质谱分析、代谢物鉴定和代谢通路研究提供了重要的工作基础。膜片钳与单细胞质谱分析联用技术分析单个神经细胞示意图　　该工作实现了单个神经元化学成分及代谢物的即时分析，该技术将目前神经细胞成分分析的研究推向了一个活细胞及单细胞水平，有望在单细胞层次上去研究神经生物学、代谢组学、毒理学等生命科学的重大问题，具有非常重要的应用前景。　　中国科大生命学院与化学院联合培养博士后朱洪影、生命学院博士研究生邹桂昌、王宁为该文章的共同第一作者，黄光明教授和熊伟教授为共同通讯作者。该研究工作得到了科技部、国家自然科学基金委、中科院先导专项以及国家青年千人计划等资助，以及中国科大国家同步辐射实验室光电离质谱线站的仪器与技术支持。

&bull 采访布鲁克BioSpin的生物安全负责人MRI技术在临床前神经科学研究中的重要性神经科学研究如何帮助我们进一步了解脑机能我们可以使用核磁共振成像（MRI）提供大脑的二维或三维图像，用于研究其解剖构造、功能或分子机制……或这三者的结合。MRI的好处在于，研究人员可以选择把重点放在解剖兼功能层面或是分子层面。体内神经影像学能给我们提供关于大脑功能和代谢的哪些信息？使用一种称为扩散MRI的技术，我们能够以非侵入性和非破坏性的方式，追踪整个大脑的轴突方向，并创建大脑的连接图。在功能性方面，我们有多种选择。功能MRI（fMRI）使我们能够在大脑思考时观察它。这项技术属于临床标准，在过去十多年里，我们已经能够将其应用于包括大鼠和小鼠在内的动物。fMRI不需要造影剂。我们只需监测由于氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白转换而产生的细微信号变化，即可清楚地检测大脑活动。此外，我们还能监测脑血流的变化，这是一个重要的标志。在中风研究中，我们可以看到受影响的大脑区域，其精确度可能比大多数其他非破坏性方法更高。活体波谱可以研究体内的代谢物。借此，我们可以获得大脑区域的化学“指纹”。这些区域的大小通常为几毫米立方，定域活体波谱使我们能够识别和量化其中的数十种代谢物，包括与大脑能量通路有关的主要神经递质和分子。并非所有生物学家都了解MRI技术，为什么？MRI通常不属于生物学课程范畴。医学博士会接受关于MRI的基本培训，如果最终成为放射科医生，还会接受进一步的相关训练。但对于生物学家而言，他们与MRI的接触始于将其用于解决生物学问题。我以前兼修生物学和化学课程，而关于NMR和MRI的所有基础知识，我是在化学课程中学到的。如果我只学习生物学，我将对MRI的巨大潜力一无所知。每个生物学家都会学习如何使用光学显微镜，但除非所在大学配备有临床前MRI扫描仪，他们很难对MRI技术有所了解。布鲁克的MRI应用专家已经将他们的知识融入到预先优化的协议中，即使用户对MRI不甚了解，也能快速解答生物学相关问题。请概述MRI和PET/MRI在基础神经科学研究中的应用和重要性。PET缺乏解剖学信息。一般来说，使用PET，您可以追踪示踪剂在体内的任何位置，而您最终看到的只是功能化示踪剂所在的区域。如果您单独使用PET，则无法确定这些活动区域在体内的位置，因为没有解剖学相关参照。而使用PET/MRI组合，通过在灰度高分辨率MRI图像上的彩色PET图像，您可以高精度地看到示踪剂的确切位置。PET和MRI结合的重要性和美妙之处在于，您可以同时执行这两种操作，并从MRI中获得出色的软组织对比。与其他方法相比，这些成像技术有什么优势？除了非破坏性之外，还有一个事实是，我们可以使用更少的动物获得更多的信息。您可以实现更大的统计相关性，因为您可以使用扫描仪在数周或数月内反复研究同一只动物。在每个研究时点后，动物不会被处置。相反，我们扫描整个队列，从所有动物那里获取全部信息。每只动物都作为自己的对照。这减少了许多临床前研究固有的生物散射问题。我认为这是一个经常被忽视的巨大优势。临床前研究的发现能完全转化为临床应用吗？临床前脑成像能做到临床上不可能做到的事情吗？是的，可以转化。对动物使用PET和MRI成像与在医院对患者使用临床仪器进行的操作相同。当然，临床前成像也有好处，比如在进入临床前测试新的疾病治疗方法。您还可以使用基因剔除模型来研究疾病进展的机制。请介绍用于临床前神经科学研究的布鲁克仪器吧：早在40多年前，我们就推出了一系列临床前MRI扫描仪，在市场上处于领先地位。布鲁克的临床前MRI扫描仪品牌称为BioSpecs，有各种不同的版本。您可以从一系列磁场中进行选择。磁场越强，通常成像效果越好。您还需要确定孔径，也就是磁体内部的小通道， 动物在检查时就躺在里面。小孔径扫描仪只能容纳一只小鼠，而其他较大孔径扫描仪可以容纳大鼠甚至更大的动物。我们的PET扫描仪也设有供大鼠和小鼠使用的小通道。我们还提供PET和MRI的组合。在其中一款PET/MR设计中，PET通道设在MRI通道的前面，所以这两台机器是相邻的。动物安置在一种类似单轨的轨道上，首先进入PET通道进行快速扫描。然后将其向前移动约20英寸，在 MRI扫描仪中定位，执行MRI扫描。在另一款PET/MR设计中，小型PET环直接安装在MRI通道中，使动物能够直接进入MRI扫描仪的中心，这也是PET扫描仪的中心，可以实现同时扫描。这种仪器已用于研究哪些临床前疾病模型？是否能够帮助确定任何潜在的治疗方法？嗯，应用非常广泛，从阿尔茨海默氏症和帕金森氏症模型到记忆、衰老和认知衰退模型等等。这种仪器也用于中风研究。通过在啮齿类动物中人为地诱发中风，我们可以对受影响的大脑区域进行量化，这可能比任何其他不涉及解剖大脑的方法都更有效。许多制药公司在药物研发中使用布鲁克扫描仪。

科技日报北京4月26日电 （记者刘霞）英国科学家首次在实验室制造出了由生物相容性材料制成的人工神经细胞，这项创新有朝一日可能会被用于合成组织，以修复心脏或眼睛等器官。相关研究发表于近日出版的《自然化学》杂志。神经元细胞是神经系统最基本的结构和功能单位，基本功能是通过接受、整合、传导和输出信息实现信息交换。在最新研究中，牛津大学哈根贝利团队设计出了一种合成材料，其作用方式与人类的神经细胞类似。这种人工神经细胞由水凝胶制成，直径约为0.7毫米，比人类神经细胞宽约700倍，但与鱿鱼体内的巨大轴突相当。它们的长度也可以达到25毫米，与从眼睛到大脑的人类视神经的长度相似。研究人员称，当光照在这种合成神经细胞上时，会激活蛋白质，将氢离子泵入细胞。这些带正电荷的氢离子随后通过神经细胞，携带电信号。当正电荷到达神经细胞顶端时，它会使神经递质化学物质三磷酸腺苷（ATP）从一个水滴移动到另一个水滴。在未来的研究中，研究人员希望能让合成神经细胞通过ATP信号与另一个神经细胞相互作用，就像神经细胞在突触上相互连接一样。随后，该团队将7个神经细胞捆绑在一起，作为一个合成神经并行工作。贝利说：“这使我们能够同时发送多个信号，它们的频率各不相同。这样做的主要目的是通过同一途径发送不同的信息。”巴斯大学的阿兰诺加雷特表示，这项创新将在本世纪末改善人工视网膜等神经植入物方面发挥重要作用，“在软材料中模拟神经活动是朝着开发出无创脑机接口和解决神经退行性疾病新疗法迈出的重要一步”。贝利希望最终能利用这些合成神经细胞同时输送不同类型的药物，以更快、更精确地治疗伤口，“利用光，我们可能会以一种特定模式释放药物分子”。不过，贝利团队也指出，与真正的神经细胞不同，新合成系统中没有循环和创造新神经递质的机制，因此这个神经细胞只能工作几个小时，人工神经细胞还有很长的路要走。总编辑圈点神经元细胞损伤后，不可再生，虽然可以修复，但难度也不低，且需要时间。这次，科学家首次在实验室制造出了由生物相容性材料制成的人工神经细胞，它能部分发挥真正神经细胞的作用，能传递信息，但只能工作几个小时。需要注意的是，研究人员自己也给出了一个时间表，他们说，这项创新或将在本世纪末在改善人工视网膜等方面发挥重要作用。本世纪末！看来，要从实验室成果变成真正能用于临床的医疗手段，还需要艰苦卓绝的努力。

新华社天津8月19日电 两天来，一则关于天津港爆炸核心区检测出神经性毒气的新闻受到了广泛关注。正在天津爆炸现场执行救援指导任务的军事医学科学院化武专家组指出，爆炸现场根本不可能产生神经性毒气，所谓“神经性毒气”之说属“重大误判”。　　17日晚，一则媒体报道称，天津港爆炸现场检测出神经性毒气，指标达到了最高值，甚至认为爆炸区内的多种危化品都可能产生这类物质。国家神性经毒剂中毒救治标准的起草者，国际同类标准的主要参与人员之一的军事医学科学院王永安研究员说，神经性毒气的标准说法应该是神经性毒剂，是毒性极强的化学物质，其毒性比氰化物高几十倍，合成极为复杂，而从爆炸现场探明化学原料，结合神经性毒剂的核心原料和生产条件来看，事故现场根本没有产生神经性毒剂的可能。　　军事医学科学院专家、联合国禁止化学武器组织专家丁日高认同王永安的观点：“只要具备专业常识，就知道这绝不可能。”　　同在现场执行任务的总参谋部防化指挥学院专家王宁也持同样观点：“我们看到这则报道时都很吃惊。”　　“一般的测量仪器出现误报很常见。”王永安说，从电视来看，现场使用的仪器并非行业中认定的可以准确确定检测结果的“金标准”仪器。　　军事科学院毒物药物研究所研究员聂志勇、全军中毒救治中心王汉斌主任医师同时介绍，到目前为止，专家组并没有听说有神经性毒剂中毒病例。王汉斌认为，危险化学品检测及判读应当依据科学程序来进行。“此次重大误判，源自于对仪器检测的结果没有进行常识性分析解读。”　　王永安介绍，一般来说，对于这种容易发生误判的一般仪器检测出的结果，应当首先进行基于专业常识的分析判断，其次应与其他仪器检测出数据进行综合比对，如果仍有疑问，就应该用质谱等高级的“金标准”仪器进行确认，特别是神经性毒剂这种毒极性大、极易引发恐慌的化学品，尤其应该谨慎确认。　　“现在民众的关注点多集中在大量危化品的危害上，应强化监测数据的实时发布，让公众能动态得知环境情况和数据。”王永安说，但监测数据必须准确可靠，建议媒体在采访时，应选择真正从事该领域研究的专家，避免因为不当解读而引发不必要的恐慌。

约翰霍普金斯大学的研究者开发出了一种方法，能将人体干细胞转变为视网膜神经细胞，这是一种位于视网膜内能将视觉信号传递给大脑的神经细胞。这类细胞的死亡或者紊乱能引起视力丧失，譬如青光眼和多发性硬化症（MS）。“我们的研究不仅让人们更深入的了解了视神经的生物学功能，也为开发防治视力疾病的药物提供了细胞模型，”研究者Donald Zack博士表示，他是约翰霍普金斯大学医学院的眼科教授。“并且，这也有利于开发细胞移植方法来来恢复青光眼或者MS患者的视力。”整个实验的详细过程发表于《科技报告》杂志上，通过修饰一系列的人体胚胎干细胞使其具有荧光特性，以区别视网膜神经细胞，然后使用此类细胞来区分生成的细胞。研究者们使用一种叫做CRISPR-Cas9的基因组编辑技术，向干细胞DNA中插入了荧光蛋白基因。这种红色的荧光蛋白只有在另一个基因BRN3B (POU4F2)表达的情况下才会表达。BRN3B通过成熟的视网膜神经细胞表达，所以一旦干细胞变成了视网膜神经细胞，它就会在显微镜下显红色。接下来，他们运用荧光激活细胞筛选法来分离纯化新生成的视网膜神经细胞。Zack表示，新生成的细胞表现出了与自然生成的视网膜神经细胞一样的生物学和物理特性。研究者也发现，在实验的第一天添加一种叫做毛喉素的化学物质，有助于提高视网膜神经细胞的生成效率。研究者提醒到，毛喉素广泛用于减肥和肌肉塑形，也常作为中药治疗各种紊乱，但是对于防治视力损失和其它一些紊乱并不一定安全有效。“在培养的第30天，显微镜下能看到明显的成簇的荧光细胞，”首席研究者Valentin Sluch博士表示，他以前是霍普金斯大学生物化学、细胞分子生物系的学生，现在任职于诺华公司。Sluch在加入诺华之前就完成了该研究。“第一次成功的时候我很高兴，”Sluch说道。“我几乎跳了起来，然后跑去告诉我一个同事。就好像马上就能分离出细胞进行研究一样，这在以前是不可能的。”“我们知道，这仅仅是个开始，”Zack补充道。在随后的研究中，他的实验室旨在找出其它与视神经细胞生存和功能相关的基因。“我们希望这些细胞能为治疗青光眼和其它类型的视神经疾病提供新的方法。”为了能够利用这些细胞治疗MS，Zack正与Peter Calabresi合作，他是霍普金斯大学多发性硬化症研究中心的主管、神经病学教授。

近日，中科院大连化学物理研究所研究员卢宪波和研究员陈吉平团队在电化学生物传感器的研发中取得新进展。团队设计合成了一系列二维导电金属有机框架（cMOFs），在此基础上制备的生物传感器展现出优异的电化学性能，实现了多种介质中神经毒剂的超灵敏抗干扰快速检测。相关成果发表在《分析化学》上。由于MOFs超高的孔隙率、巨大的比表面积以及可调整的结构和性能，各个领域已经对其展开了广泛的研究。然而，绝大多数MOFs的固有绝缘特性，阻碍了其在电子器件中的应用。卢宪波和陈吉平团队一直致力于新型纳米传感器在环境污染物快速检测上的应用研究。神经毒剂的急性毒性可致人、动物等死亡，其在化学中毒性疾病发病占比最高，亟需发展快速、廉价的检测方法满足应急检测需求。该工作中，团队合成了一系列基于不同金属中心和共轭有机配体的cMOFs，其良好的导电性和稳定性以及纳米尺度上活性位点的有序排列展现出对提高传感器关键性能的优异协同效应，而良好的导电性源自于金属中心和共轭配体之间的面内扩展d-π共轭。研究人员通过对cMOFs结构的原子级调整，发现了金属中心的种类以及孔径大小在电化学性能中的决定性作用。超小的羟基苯醌配体（THQ）具有明显的二维螯合效应，进一步提高了cMOF的导电性和稳定性。团队开发了基于cMOFs的电化学生物传感器，发现基于Cu3(THQ)2的传感器性能优异，通过显著降低信号底物的氧化电位提高了传感器的抗干扰能力，同时传感器灵敏度提高达到一个数量级。研究进一步证明了Cu3(THQ)2上密集的混合价铜和分析物之间电荷转移的重要作用，实现了多种介质中神经毒剂的超灵敏抗干扰快速检测。这项研究展示了cMOFs作为新型电极材料在电化学传感上的巨大潜力。

p strong 仪器信息网、中国电子显微镜学会、中国电镜网联合报导 /strong strong ： /strong 2015年10月18日第四届全国激光共聚焦显微技术理论与应用学术交流研讨会圆满闭幕。 /p p 　　在14日下午的会议中，有一个特邀报告格外地引起了笔者的注意，来自西北农林科技大学动物医学院的赵善廷教授提到他曾与高压冷冻固定技术的发明者瑞士科学家Studer博士合作，将该技术与器官型脑片培养技术(organotypic slice culture)相结合，成功地研究了与学习和记忆密切有关的长时程效应(long-term potentiation, LTP)对突触的影响。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" dir=" ltr" img style=" WIDTH: 450px HEIGHT: 300px" title=" 00.jpg" border=" 0" hspace=" 0" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201510/insimg/2f90df00-d7ca-416b-bd07-44431d4c22cd.jpg" width=" 450" height=" 300" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" strong 西北农林科技大学动物医学院的赵善廷教授 /strong /p p 　　据了解，以往的常规 a href=" http://www.instrument.com.cn/zc/1139.html" target=" _self" title=" " style=" color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 电镜 /span /a 技术需要先用甲醛、戊二醛等化学试剂对样品进行化学固定，但这种固定方法有三个缺点包括： /p p 　　一、无法扑捉短暂生理过程的形态变化和特征，如神经元突触小泡内神经递质的释放；二、脱水过程用酒精等有机溶剂会造成细胞和组织皱缩，使其形态和大小发生改变；三、化学固定剂特别是戊二醛可引起蛋白质变性，使其与相应抗体结合能力下降甚至丧失，导致电镜免疫组化染色失败。 /p p 　　为克服化学固定的这些缺点，上世纪九十年代末，瑞士科学家Studer博士发明了一种新的物理性电镜固定技术，即高压冷冻电镜固定技术，该技术可以在不使用任何化学固定剂的条件下五十毫秒以内将组织和细胞完全固定。 /p p 　　虽然高压冷冻技术克服了化学固定的三大缺点，但它本身也有一个不足之处：固定的样品非常小，直径不能超过1mm，厚度不能超过& amp #956 m，从而限制了它在神经生物学研究中的应用。 /p p 　　为了克服高压冷冻固定技术的缺点，将其应用到神经生物学研究中，2002年，该技术发明者Studer博士与当时正在德国弗莱堡大学医学院做博士后的赵善廷博士合作，将器官型脑片培养技术和高压冷冻固定技术相结合固定神经纤维，历时五年的不断摸索，到2007年两种技术终于完美地结合在一起。赵教授在接受本网记者采访时表示，希望能够与国内相关课题组合作，为这种样品制备方法寻找更多的应用领域。 /p p style=" TEXT-ALIGN: right" 撰稿：史秀明 /p

p 　　近日，国际综合研究权威期刊《美国国家科学院院报》(PNAS)发表了题为《Single-Neuron Identification Of Chemical Constituents， Physiological Changes， And Metabolism Using Mass Spectrometry》的研究论文。该研究由中国科学技术大学生命学院神经退行性疾病研究中心暨中国科学技术大学脑资源库熊伟教授研究组与中科大化学学院黄光明教授研究组合作完成。该研究依托电生理膜片钳以及电喷雾离子源技术建立的稳定的单神经元胞内组分取样和质谱组分分析技术，对小鼠海马、前额叶、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元内的数千种化学小分子进行了快速质谱检测，并且可以做到同步采集电生理信号，在单细胞层次上成功地完成了对神经元功能、代谢物组成及其代谢通路的研究。这项研究首次利用化学质谱方法直接无稀释的检测单个神经元中多种神经递质、代谢物、脂质等化学小分子，实现了单个神经元化学成分及代谢物的即时分析，该技术将目前神经细胞成分分析的研究推向了一个活细胞及单细胞水平，有望在单细胞层次上去研究神经生物学、代谢组学、毒理学等生命科学的重大问题，具有非常重要的应用前景。 /p p 　　大脑中有亿万个神经细胞，这些神经细胞在细胞形态，突触连结，细胞结构，电生理以及生理功能上具有高度的多样性。不同种类的神经细胞中，其化学分子组成、含量、代谢也都有着很大的差别。因此，对脑内单个神经元的化学成分进行分析，则具有重要的生物学价值。质谱分析因为具有高灵敏度，大的线性范围以及高通量分析化学分子的特点，逐渐被用于单细胞的细胞代谢分析。但目前的方法需要使用大量有机试剂对细胞进行处理，无法保持采样时细胞的活性 冗长的处理和分离过程也导致较慢的分析速度，无法短时间内完成大量单细胞分析 并缺乏来自同一细胞的电生理信号 最终导致单细胞代谢物的质谱分析无法大规模用于神经细胞的分析。 /p p 　　此研究成功建立了一套稳定的单细胞质谱分析技术，并对不同年龄段的小鼠海马、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元中的谷氨酰胺、谷氨酸以及GABA等化学小分子进行定性、定量分析并对其进行神经元分类，最后利用该技术成功鉴定单个神经元内谷氨酰胺的代谢路径。这项方法的成熟与普及，必会为后续单个神经元组分分析、神经元分类以及病理状态下单个神经元中组分变化分析提供强有力的手段。 /p p 　　该项工作由中科大生命学院博士后朱洪影、生命学院博士研究生邹桂昌、王宁在熊伟教授和黄光明教授的共同指导下完成。该研究工作得到了国家自然科学基金委重大研究计划、科技部、中科院战略性先导科技专项(B类)以及国家青年千人计划等的资助。该工作还得到中国科学技术大学同步辐射实验室光电离质谱线站的仪器与技术支持。 /p

对栖息于这颗蓝色星球上的生命而言，光是一切生命产生的源动力，也是生命体最重要的感知觉输入之一。同时生命体根据外界环境条件控制体内营养物质的代谢平衡是生存的必须，而代谢紊乱会产生严重疾病，哺乳动物已经进化出了精确和复杂的调控网络用于持续动态调控血糖代谢。大量公共卫生调查显示夜间过多光源暴露显著增加肥胖和糖尿病等代谢疾病风险，那么光作为最重要的外部环境因素，其是否直接调控血糖代谢？其中涉及哪类感光的细胞、何种神经环路以及外周靶器官，这些方面的问题一直没有得到解答。 　　1月20日，中国科学技术大学生命科学与医学部教授薛天研究团队在《细胞》(Cell)上，在线发表了题为Light modulates glucose metabolism by a retina-hypothalamus-brown adipose tissue axis的研究成果。该工作发现了光直接通过激活视网膜上特殊的感光细胞，经视神经至下丘脑和延髓的系列神经核团传递信号，最终通过交感神经作用于外周的棕色脂肪组织，直接压抑了机体的血糖代谢能力。值得指出的是，这项工作不但在小鼠动物模型上系统回答了光调节血糖代谢的生物学机理，在人体试验上也发现了同样的现象，显示光调节血糖代谢可能广泛存在于哺乳动物界。 　　研究人员首先对小鼠和人执行葡萄糖耐受性检测(GTT)，发现数个小时的光暴露显著降低了人和鼠的血糖耐受性。哺乳动物光感受主要依赖于视网膜上的各类感光细胞。除了经典的视锥(Cones)视杆(Rods)细胞介导图像视觉感知之外，光也能直接激活视网膜上的第三类感光细胞视网膜自感光神经节细胞(ipRGC)，它依靠自身表达的视黑素(Melanopsin)对波长靠近480nm的短波长蓝光敏感。ipRGC支配诸多下游脑区进而调控如瞳孔对光反射、昼夜节律、睡眠和情绪认知功能。光降低血糖耐受性通过何种感光细胞介导？通过基因工程手段，研究人员逐一使视网膜各类感光细胞丧失感光能力，发现光诱发血糖不耐受由ipRGC感光独立介导(图1)。 　　接着研究人员进一步探究视网膜至脑内的哪些核团参与光调节糖代谢。下丘脑是调控机体代谢的重要区域，其中与ipRGC有较密集连接的是下丘脑视交叉上核SCN和视上核SON核团。已知数周异常光照模式能够通过影响节律中枢SCN，造成生物钟节律失调，进而间接影响到血糖代谢功能。研究人员分别损毁或利用化学遗传手段操控ipRGC投射的SCN和SON核团，发现了光急性降低血糖耐受性这一过程独立于生物钟节律系统，而由ipRGC-SON的神经环路直接介导(图1)。 　　结合大量神经环路示踪和操控手段，研究人员进一步发现ipRGC→SONOXT(视上核内催产素(Oxytocin)能神经元)→SONAVP(SON内抗利尿激素(Vasopressin)能神经元)→PVN(下丘脑室旁核)→NTSVgat(孤束核的GABA能抑制性神经元)→RPa(中缝苍白核)这样一条脑内六级长程神经环路介导光降低血糖耐受性(图1)。 　　光影响血糖代谢必然通过外周血糖代谢的器官来执行，考虑到在环路水平上光降低血糖耐受通过中缝苍白核RPa，该核团是调节棕色脂肪组织(BAT)活性的交感前运动神经的主要部位。因此研究人员将研究锁定在棕色脂肪组织，而棕色脂肪组织的重要作用之一是代谢葡萄糖或脂肪，直接产热以维持体温稳态。研究人员发现光能显著压抑棕色脂肪组织的温度，进一步通过阻断交感神经对棕色脂肪组织的投射、以及利用热中性环境温度压抑棕色脂肪组织活性的手段，确定了光降低血糖耐受性是通过压抑脂肪组织消耗血糖的产热所导致(图1)。 　　夜行性的小鼠和昼行性的人类在诸多光调控的生理过程中表现既有相反也有相同的效应。光是否同样降低人的血糖耐受？研究人员分别使用ipRGC敏感的蓝光与ipRGC不敏感的红光，测试人在不同波长光线照射下的血糖耐受性。结果显示在蓝光照射下人的血糖耐受性显著下降。进一步研究人员将被试者处于热中性温度环境中(热中性温度下棕色脂肪组织活性被压抑)进行了血糖耐受性测试，结果显示光不再压抑血糖耐受。上述实验提示光降低人的血糖耐受性可能也是由ipRGC感知光线且通过影响棕色脂肪组织的活性所介导(图2)。 　　对这项工作的几点启示： 　　Nothing in biology makes sense except in the light of evolution，光压抑血糖代谢这一神经生理功能可能用于动物快速响应不同太阳辐照条件，以维持体温稳态。在户外环境中太阳光可以为动物提供大量的热辐射，这可以满足部分的体温维持需求，而在动物进入洞穴或树荫等诸多太阳光辐照显著降低的环境中时，机体就需要迅速响应这种辐照减少带来的热量输入损失。光通过这条“眼-脑-棕色脂肪”通路快速减低脂肪对葡萄糖的利用以降低产热，在光辐照减少的时候，棕色脂肪不再被光压抑，快速代谢血糖来维持体温稳态。 　　冷暖光也许并非单纯心理作用，可能存在生理基础。日常生活中短波光环境(蓝)让人感觉到凉爽，而长波光环境(红)让人觉得温暖，因此它们才被赋予了冷暖光的定义。冷暖色一直被定义为心理上的冷热感受。这项研究发现对短波长光敏感的ipRGC在蓝光下压抑脂肪组织产热，而在红光下脂肪组织处于活跃状态。因此我们在进入蓝光环境下产生的那种“冷”的感觉，有可能是由于脂肪产热被压抑而产生的真实感受。 这条光调控脂肪组织活性的环路可能是心理上冷暖光的生理结构基础。 　　工业化时代的代谢疾病—人造光源增加机体代谢负担。该项工作在人体的研究结果显示，昼夜节律会造成夜间人体的糖代谢能力相较白天更低，而光压抑血糖代谢是直接叠加在节律造成的夜间血糖代谢能力下降之上的(图2)。因此在夜间同时有光暴露的条件下，人体血糖代谢能力最差。工业化社会中，人类长时间的在夜间暴露于人造光源之下，加上现代人夜间饮食习惯给机体带来双重代谢负担进而可能诱发代谢疾病。大量公卫卫生学证据已经证实了这一点，最近瑞金医院宁光院士团队涉及近10万人的研究显示，夜间长期暴露于人造光下会增加血糖紊乱及糖尿病的患病风险。 　　这项光调节血糖代谢的机制研究，提示现代人健康生活应关注光线环境的健康，针对夜间光污染造成的罹患代谢疾病风险提高，应考虑生活环境中夜间人造光线的波长、强度和暴露时长。这项工作发现的感光细胞、神经环路和外周靶器官可为将来干预此过程提供潜在靶点。 　　研究工作得到国家自然科学基金、科技部、科学探索奖、中科院稳定支持基础研究领域青年团队项目、中国科大等的支持。合肥学院科研人员参与研究。图1.在小鼠上，光激活ipRGC-SONOXT-SONAVP-PVN-NTSVgat，压抑RPa和支配脂肪的交感神经，进而压抑棕色脂肪产热降低血糖耐受性。图2.在人上，光可能通过同样的神经环路机制压抑棕色脂肪产热降低血糖耐受性。相较于白天，夜晚人的血糖耐受性更低。

瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）研究人员在诊断帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病（NDD）方面取得了重大进展。他们开发了一种名为“ImmunoSEIRA”的新型生物传感器，能够检测和识别与NDD相关的错误折叠的蛋白质生物标记物。　　12日发表在《科学进展》杂志上的这项研究还利用了人工智能（AI）技术，使用神经网络来量化疾病的阶段和进展。为了创建这种先进的NDD生物标志物传感器，研究人员将蛋白质生物化学、光流变学、纳米技术和AI等多个学科和多种技术整合在一起。　　ImmunoSEIRA传感器采用了表面增强红外吸收（SEIRA）光谱技术，使科学家能检测和分析与NDD相关的生物标志物的形式。该传感器配备了独特的免疫分析，就像分子探测器一样，能高精度地识别和捕获这些生物标志物。　　ImmunoSEIRA的特点是采用金纳米棒阵列，带有可检测特定蛋白质的抗体，能够对极小样本中的目标生物标志物进行实时特异性捕获和结构分析。而AI算法的子集神经网络可识别特定错误折叠蛋白形式、寡聚体和纤维状聚集体的存在，可跟踪疾病的进展，实现了前所未有的检测精度。　　研究进一步证明，ImmunoSEIRA可在生物体液等实际临床环境中使用，即使在人脑脊液这样的复杂液体中，该传感器的检测也同样准确。

2009 年神经生物学奖颁奖仪式已落下帷幕，此项由Eppendorf和Science 杂志共同合作的大奖授予瑞士洛桑大学整合基因组中心的教授助理Richard Benton博士。在10 月19 日芝加哥举办的全球神经生物学年会的庆祝晚宴颁奖礼上，这位科学新星同时获得了25,000 美金的奖金。 　　Richard Benton 博士的研究揭示了昆虫对气味物质感受机制的奥秘。若通过加入特定的化学抑制剂的方式来研究这些分子，有可能控制气味偏好的昆虫传播诸如疟疾等疾病的行为。 　　欲了解本次颁奖盛典和RichardBenton 博士的个人事迹，敬请登录 　　www.eppendorf.com/award

帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（AD）是由基因、环境和家族因素相互作用引起的神经退行性疾病。值得注意的是免疫系统对疾病发展的影响，脑部驻留的小胶质细胞的功能障碍，会导致神经元的丧失和症状加剧。研究人员通过神经免疫系统模型来更深入地了解这些神经退行性疾病的生理和生物学方面以及它们的发展过程。不列颠哥伦比亚大学的Stephanie M. Willerth教授团队和英国诺丁汉特伦特大学的Yvonne Reinwald教授团队于2024 年 1 月 23 日在《Journal of Neuroinflammation》（影响因子：9.3）杂志上发表了题为“Modeling the neuroimmune system in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases”的综述，介绍了神经免疫系统在三维模型和器官芯片系统方面取得的进展，以及模型在准确模拟复杂的体内环境方面的巨大潜力。 研究背景阿尔茨海默病（AD）是老年人中最常见的痴呆类型，与淀粉样斑块和磷酸化Tau蛋白的异常积累有关，虽具体原因尚不完全清楚，但与遗传和环境因素相关，诊断及早干预至关重要。帕金森病（PD）是一种神经系统疾病，主要表现为运动障碍，与聚集的α-突触核蛋白（α-syn）沉积物Lewy小体有关，相关基因变体也与其发病风险增加有关。尽管PD的确切原因尚不清楚，但其发病机制可能涉及多巴胺能神经元功能障碍以及氧化应激、线粒体功能受损、蛋白质代谢异常和神经炎症等多种因素。图1：阿尔茨海默病和帕金森病的病理生理学。 中枢神经系统（CNS）过度炎症的特征包括多种因素共同促进疾病进展，其中包括各种抗炎与促炎细胞因子的失调、CNS内小胶质细胞等免疫细胞的表型转化，以及外周细胞的巨噬细胞和淋巴细胞的招募，这些因素均导致突触丧失，成为随后认知功能障碍的最常见病理相关因素。图2：健康与病理神经免疫系统的比较:在健康的神经免疫系统中(1)小胶质细胞处于稳态和监视状态，(2)外周免疫细胞向中枢神经系统的浸润有限。在病理性神经免疫系统中：(3)小胶质细胞反应性增强，形态改变，(4)吞噬作用增加，(5)炎症标志物增加，(6)外周免疫细胞浸润增加。 研究进展1、目前阿尔茨海默病和帕金森病的治疗和临床试验针对AD，乙酰胆碱酯酶是一个常见的药物靶点，近期研究专注于开发单克隆抗体等药物以减少Aβ负荷，如lecanemab和aducanumab。此外，针对AD的临床试验正在进行中，旨在测试药物、设备和行为以改善患者认知和减缓疾病进展，而对于PD，则主要以药物和深部脑刺激为主要治疗手段，同时也在研究新的免疫调节治疗方法。 2、阿尔茨海默病、帕金森病和免疫系统的体外免疫系统模型癌症免疫系统的研究已经取得了许多成果，其中包括对3D模型的发展，这对于疾病建模和药物筛选至关重要，尤其是针对新的化疗药物和人工组织的开发。一种体外建模方案是使用细胞系，最常用的是SH-SY5Y人类神经母细胞瘤细胞系，模拟未成熟的儿茶酚胺能神经元，并可通过暴露于神经毒素或基因修饰来模拟AD或PD。然而，SH-SY5Y存在缺乏确立的培养维持程序、实验结果不一致和细胞生长的可变性等缺点，且不表现出成熟神经元的电生理和电化学特征。利用诱导多能干细胞（iPSC）创建基因准确的AD和PD模型，成为一个快速发展的研究领域，这些模型可以通过体细胞来源的iPSC诱导后，生成神经元与免疫细胞，用来构建AD和PD模型。图3：神经免疫系统的体内和体外模型的优缺点。 3、器官芯片模型在神经免疫系统研究中的新进展器官芯片平台的出现为建立体外模型提供了增强的设计和控制能力，能够模拟生物、生化、生理和机械现象，在活体器官系统中的发生。从血液-脑脊液屏障微流控模型到脑芯片模型，研究者们不断探索着复杂的生理学建模，为深入分析神经免疫相互作用提供了新的可能。这些模型不仅揭示了神经炎症在神经退行性疾病中的重要性，还为治疗干预提供了潜在途径，为了解AD和PD的潜在机制提供了宝贵的见解。同时，脑芯片模型被广泛应用于研究神经血管相互作用和神经退行性的不同方面。通过模拟神经-胶质-血管相互作用，研究人员发现了柴油排放颗粒等外源因素对AD类疾病病理特征的影响。这些研究不仅强调了神经免疫特异性行为的重要性，还突显了人类细胞模型在理解神经退行性疾病方面的关键作用。然而，尽管研究对细胞间相互作用和人类细胞模型的依赖日益增加，但对于AD和PD潜在机制的理解仍然相对有限。图4：芯片上器官的发展:示意图显示了开发和制造微流控芯片所需的步骤 先进的免疫细胞相互作用在AD和PD病理中至关重要，调节其功能可能为更有效的治疗提供希望；器官芯片模型具有模拟复杂细胞相互作用的优势，有助于深入了解AD和PD疾病机制并发现新的治疗策略。 文献索引：Balestri W, Sharma R, da Silva VA, Bobotis BC, Curle AJ, Kothakota V, Kalantarnia F, Hangad MV, Hoorfar M, Jones JL, Tremblay MÈ , El-Jawhari JJ, Willerth SM, Reinwald Y. Modeling the neuroimmune system in Alzheimer's and Parkinson's diseases. J Neuroinflammation. 2024 Jan 23 21(1):32. doi: 10.1186/s12974-024-03024-8. PMID: 38263227 PMCID: PMC10807115. 关于艾玮得生物作为一家专注于人体器官芯片及生命科学设备研发与生产的创新科技公司，艾玮得器官芯片应用全场景解决方案已能够全面覆盖新药研发评价、临床药敏检测、基础科学研究等应用领域，为科研、临床、药企等客户提供一站式解决方案。

安捷伦科技公司与大邱庆北科学技术院合作进行神经代谢组学研究 2013 年 10 月 25 日，北京 &mdash 安捷伦科技公司（纽约证交所：A）和大邱庆北科学技术院 (DGIST) 今日宣布通过开设新的 DGIST 神经代谢组学卓越研究中心，两者将建立战略合作关系。中心将在其生物标记物的神经代谢组学研究中使用安捷伦生物分析仪，以更早地检测和诊断大脑疾病。 DGIST 是韩国顶尖的大学和研究机构之一。 神经代谢组学研究的是依靠氧气和葡萄糖来维持大脑运转的一系列生化反应。在新中心，科学家和研究者将分析大脑细胞代谢物质的变化，并研究这些变化对人体生理功能和行为的影响。 今日开幕的研究中心将作为专业知识共享中心，涵盖了美国约翰斯霍普金斯大学代谢与肥胖研究中心和大邱主要的医疗机构和医院的科研能力。 DGIST 研究中心主任 Eun-Kyoung Kim 教授说道：&ldquo 神经代谢组学卓越研究中心将有助于韩国增强在大脑科学领域的实力，使得 DGIST 能对世界领先的研究做出重要贡献。通过与安捷伦合作，我们可以继续作为大脑科学发展和研究的先锋。&rdquo 安捷伦生命科学业务部韩国和南亚太地区总经理 Rod Minett 表示：&ldquo 大脑可以说是人体最重要的器官，安捷伦支持对其的探索，以帮助科学家和医疗机构为了全人类的利益进一步推动神经科学的发展。&rdquo 该中心位于大邱，计划开展神经代谢组学研究项目，该项目也涉及到其他的研究领域，如医学、神经生物学、统计学、计算机科学和系统生物学。中心可能还将会与韩国、新加坡和澳大利亚的其他主要教育和医疗机构开展联合研究工作。同时还将训练和培养科学家、研究者和化学家，以满足神经系统科学研究领域对高技能人才的需要。 安捷伦和 DGIST 从 2012 年年底便开始合作，DGIST 通过安捷伦更早地接触到研究所需的新技术和软件开发。 关于 DGIST 大邱庆北科学技术院 (DGIST) 是大邱和庆尚北道地区第一个由政府资助的研究所，有着行业领域同大邱研究开发特区相一致的全球基础设施。 拥有世界一流的师资和校园设施，并开设有各种创新课程以培养高素质的人才，他们将会在高技术研究领域、教育机构和商业风险投资企业中扮演重要角色。该机构与大邱庆北尖端医疗综合园区通力合作，致力于医疗领域的融会贯通，包括大脑相关行业、医疗和机器人行业等。DGIST 的目标是打造成为世界一流的研究型综合性大学，旨在培养从事科学和技术的优秀人才。 关于安捷伦科技公司 安捷伦科技（NYSE 代码：A) 是全球领先的测试测量公司，同时也是化学分析、生命科学、诊断、电子和通信领域的技术领导者。公司拥有 20500 名员工，遍及全球 100 多个国家，为客户提供卓越服务。在 2012 财政年度，安捷伦的业务净收入为 69 亿美元。有关安捷伦科技的更多信息，请访问：www.agilent.com.cn。 编者注：更多有关安捷伦科技公司的技术、企业社会责任和行政新闻，请访问安捷伦新闻网站：www.agilent.com.cn/go/news。

沃的研究所这是一档关注“生命科学行业变化”的专题栏目。我们将从合作伙伴入手，每一期研究和解读一家科研机构或科研课题组、实验室的背后故事、相关方法论、使用的工具等等，帮助科研从业者获得启发和思考。本期【沃的研究所】对话主人公：尚蔚，博士研究生，华东师范大学生命科学学院袁小兵/潘逸萱课题组重要成员，本篇论文第一作者。恐高，其实跟我们每个人都息息相关。恐高反应会发生在每一个人身上，而恐高症患者会表现出对高度的非理性恐惧，即使暴露在很低的高处或者仅联想到高处时都会表现出对高度的非理性恐惧，这可能会对日常工作及生活带来一定的影响。那恐高反应究竟是如何产生的？科学界是如何解释这一现象？又该如何克服呢？2024年5月3日，华东师范大学生命科学学院袁小兵/潘逸萱团队在国际权威学术期刊Nature Communications 发表题为 A non-image-forming visual circuit mediates the innate fear of heights in male mice 的研究论文，他们对先天恐高反应开展研究，意外发现小鼠大脑中的非成像视觉系统诱发了恐高反应。 本期【沃的研究所】，我们将对话文章的第一作者尚蔚博士，一起深入了解小鼠先天恐高反应背后的神经机制。 逐层攻破技术瓶颈为探索恐高神经机理寻找靶点 尚蔚博士所在的课题组选择了广泛存在的生理视觉高度失衡的恐高来开展，他们首先建立行为学范式，细致观察小鼠在高台上的表现。曾有心理物理学家提出过这样一个假说，认为当人在高处时，随着人体与最近的静止物体之间的距离不断地增加，此时视觉提供的平衡信息会与前庭和躯体感觉系统提供的信息发生冲突，个体就容易出现晕眩的感觉，同时此时身体摆动幅度的增大，个体也会更容易感受到坠落，而这种对坠落的害怕会诱发个体的恐高情绪。根据心理物理学家的假说，尚博所在的课题组对视觉前庭和躯体感觉系统的作用进行了探究，发现视觉在恐高反应中发挥了主导作用。小鼠在高台上会出现类似于人类的恐高反应 课题组又参考了与视觉相关的先天恐惧行为学范式，通过视觉刺激（Looming Visual Stimuli ）来寻找可能参与调控恐高的核团。最后通过光纤记录和化学遗传等手段来调控目标核团和神经环路连接，观察小鼠在行为学实验中的表现是否会有所不同，进一步发现小鼠大脑中存在两条神经环路，在调控先天恐高反应中发挥相反的作用。这项研究成果的发表有利于帮助人们理解人类的恐高现象，并为后续恐高反应的神经机制研究提供了思路，也为后续药物开发提供了一些帮助。但由于目前神经科学领域对“恐高”的研究还十分有限，已有的研究主要集中在流行病学调查和影像学方面。尚博介绍道：“刚开始的时候我们完全不知道到底要怎么来研究恐高，以及如何建立一个比较可靠的行为学范式，而且提出评估恐高程度的指标也是经历了不断的修改，基本一切都是未知的；另一方面，我们组确实不是做行为和神经环路机制的，所以对技术和思路也不熟，包括研究过程中有一部分是需要去做前庭系统，我对前庭系统非常陌生。”为了观察小鼠的恐高表现，他们需要多次制作高台，尚博笑着说：“那段时间我们不是在买亚克力，就是在买亚克力的路上，淘宝的订单截图可以拉很长。”为了了解前庭系统，尚博甚至鼓起勇气联系了交大六院耳鼻喉科的师兄，后又经过导师的介绍，到上海交大交流学习了一段时间，才慢慢克服了这些技术难题。“在我看来，合作真的是非常重要，这项研究也是大家共同努力的结果！”尚博说。截至目前，这项研究还在继续。 无心插柳，顺应偶然性机遇蕴含在变化之中 谈及当时是怎么想到要研究这个课题，尚博笑言：“这还真的挺有趣的，确实是无心插柳柳成荫的故事。”说起来，尚博所在的课题组主要的研究方向其实是孤独症谱系障碍以及神经发育。尚博最开始加入团队的时候，主要对孤独症谱系障碍风险基因的神经机制展开研究。可是当时的课题进展并不顺利，实验结果也不稳定。但也正是在这一次次的挫败中，课题组偶然间发现，实验小鼠在旷场实验中的自发运动量和焦虑水平都没什么变化，在高架O迷宫中却表现得特别焦虑，对高度的刺激非常敏感。他们又开始查阅文献、探究基因突变小鼠异常恐高的原因……“确实没想到当初那个课题能发展到现在这样。”尚博说。一次偶然，课题组开始了对恐高症的研究；又一次机缘巧合，课题组开始了与瑞沃德的合作。“其实在第一轮投稿的时候，我们已经通过化学遗传的方法发现了腹侧外侧膝状核（vLGN），特别是其中的抑制性 GABA 能神经元，还有 vLGN 到下游中央导水管周围灰质（Periaqueductal gray, PAG）参与调控恐高。但因为化学遗传没能实时观察到神经元对高度刺激的响应，所以审稿人明确提出希望我们可以补充光纤记录的实验。”说来也巧，刚好在补实验阶段，实验室就有一台瑞沃德的光纤记录系统。尚博所在实验室里的瑞沃德光纤记录系统 “我们用瑞沃德光纤记录系统做了对照实验，发现确实取得了很好的结果。而且我们原来第一轮投出的内容，它使用到的技术其实比较单一，在后面补实验增加了光纤记录这样在神经环路领域比较常用的技术，得到了导师的认可，这也对于我们这一项成果的发表有很大的帮助。”尚博在交谈中也对瑞沃德光纤记录系统表达了认可：“瑞沃德的光纤系统操作简单，使用方法也比较容易学习，分析软件也十分方便，可以快速给出想要的图，同时还可以计算线下面积、叠加不同个体的数据，对我们的实验有很大的帮助。”“在我看来瑞沃德是国内做得很好的品牌了，我也很开心看到国产的仪器近年来做得越来越好了，大家就有更多的选择。”该研究使用光纤记录检测了腹侧外侧膝状核（vLGN）脑区GABA能神经元和外侧/腹外侧导水管周围灰质（l/vlPAG）脑区谷氨酸能神经元的钙信号变化 “其实我们还挺幸运的，文章只返修了一轮。”尚博感慨道。采访过程中，尚博不止一次说起：“我认为自己一直都是一个比较幸运的人。”在尚博的自述中，她说到，高考、考研都比较顺利，父母愿意支持自己的选择，师兄会手把手带着她做实验、交流科研思路，师妹们会鼎力支持课题的进展，导师们也会在大家做实验情绪爆炸的时候给予足够的鼓励……“所以我真的觉得自己是很幸运的人。”尚博课题组合照（从左到右依次为尚蔚、袁小兵教授、谢双翼、潘逸萱副研究员、冯文博） 发现了吗？伟大的成就，其实并没有所谓的可复制的成功脚本，它们往往没有经过周密的计划便诞生。不管是做实验，还是生活，我们不时地顺应偶然性，也不见得是坏事。就像尚博所说的：“意外真的常有发生，一切都在你的计划之内，是非常小概率的事件，所以你要时刻地根据实际情况来灵活调整自己的方案或者计划，多一些Plan B。”不管是“无心插柳”，还是“有心栽树”，幸运会不断出现在你努力的路上！我们也祝福尚蔚博士及团队在自己热爱的领域里勤耕不辍！ 如果您想了解尚蔚博士课题组同款瑞沃德多通道光纤记录系统长按识别下方二维码进行预约我们将会有专业人员与您联系▽

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，我们将分三期陆续介绍。本期接着上期的第一部分超高分辨率显微技术在神经科学中的应用（一） ，为第二部分内容。4.荧光标记与样品制备4.1. 荧光标记神经元和脑片的超分辨率成像是用适当的荧光团标记感兴趣的生物分子，理想情况下是以定量和化学计量的方式。虽然SIM和其他超分辨方法的成像质量取决于信号背景（S/B）比，但SIM对荧光团没有特殊要求。另一方面，STED显微镜可达到的分辨率在很大程度上取决于所用荧光团的光稳定性。RESOLFT显微镜使用可逆光开关FPs，具有两个稳定状态，因此可以使用较低的激光照射强度。所有SMLM方法的定位精度取决于每个事件检测到的光子数。dSTORM需要光开关有机荧光团，包括菁、罗丹明和恶嗪染；而PALM则需要使用光开关、光转换和光激活FPs。与此相反，DNA-PAINT理论上适用于所有荧光团，因为开/关速率由对接链和成像链序列和缓冲条件决定，而其中 Cy3B和ATTO 643效果最好。、为了获得一张好的超分辨率图像，除了成像方法以外，样品制备也非常关键。使用荧光探针进行高效和特异的标记，并且使标记误差（荧光团和目标之间的距离）达到最小。为了通过荧光成像进行结构解析，标记密度（即荧光探针之间的距离）必须显著高于所需的分辨率。另一方面，特别是对于接近几乎分子分辨率的超分辨率成像方法，标记误差必须尽可能小，以达到高精度成像。对于活细胞标记而言，在合适的表达载体中融合感兴趣的蛋白质的基因编码FPs无疑成为首选。然而，FPs的亮度较低，与有机染料相比，其图像分辨率较低。理想的标记方法是使用荧光染料标记基因编码的蛋白质、肽标签或单一氨基酸。在模式生物如果蝇或秀丽隐杆线虫的应用得益于基因编码工具，通过转座子、操纵二分体Gal4/UAS表达系统或Crispr/Cas9方法引入或去除突触蛋白和荧光蛋白。由于瞬时转染的细胞表现出不同的蛋白质表达水平，蛋白质的分布和功能不一定反映野生型的情况。图5 通过单体链霉亲和素结合AP标记的突触蛋白成像结果显示Nlg1和LRRTM2的差异分布（dSTORM成像）。上排：Homer 1c GFP作为突触后室的参考。第二排：Nlg1和LRRTM2（dSTORM成像）。左下：频率分布直方图，用于显示相对于Homer 1位置中心的信号分散情况。右下：列出比较两种蛋白质的突触结构域数量的直方图。然而，通过构建优化表达，稳定表达的细胞或CRISPR基因敲入等方法可以产生从内源性到强过表达的蛋白质表达水平。根据不同的转染策略，可以采用不同的方法转染神经元。传统的磷酸钙共沉淀法和脂质体法在大多数实验室都可实施，但这两种技术的转染效率很低。而病毒转染的效率比较高，允许注射到大脑区域，但需要实验者具备病毒生产方面的专业知识，并需要考虑生物安全问题。此外，还必须考虑病毒类型、插入片段大小、毒性和差异表达等因素。要达到高转染效率，可以使用高压脉冲将核酸直接输送到细胞核，进行核转染。然而其缺点是，当这种方法应用于小鼠原代神经元时，会导致细胞存活率较低，并且实验设备昂贵，还需要根据神经元密度和物种对脉冲参数进行多次测试。另外，也可以使用细胞附着式高电阻管，在完整神经元网络（如器官型切片）中进行单细胞电穿孔。利用这种方式，结合CRISPR基因敲入获得了接近内源性的蛋白质表达水平。基于CRISPR基因敲入，在神经元发育的不同时间点通过脂质感染、核感染或病毒转染在神经元中实现。如前所述，FPs光稳定性和荧光光子输出较低，这降低了图像质量。另外，连接大小为2−5nm的FP后,蛋白质功能可能会受到影响。因此,首先必须清楚感兴趣的蛋白质在野生型的功能表现。而有机染料比FPs小得多，有更高的光子产率和光稳定性，但需要与其它能与感兴趣分子结合的分子进行连接耦合。对于固定细胞，使用一抗和二抗进行免疫染色仍然是标记内源性蛋白质的首选方法。缺点是由两个大小17.5 nm左右的IG抗体间接免疫标记有可能导致标记误差。使用直接法免疫荧光或Fab片段可以减少标记误差。另外针对GFP或转基因短肽标签的更小（1.5×2.5 nm）的骆驼“纳米抗体”已应用于dSTORM成像。此外，耦合了链霉亲和素的荧光染料可用于神经元和器官型组织中靶蛋白的特异性标记。使用这种标记方法，研究了神经氨酸酶-1ß、神经肽原-1和富含亮氨酸的重复跨膜蛋白2的动力学和纳米级结构，并揭示了跨突触粘附结构的形成（图5）。另外可以使用生物正交肽或自标记蛋白质标签，例如FlAsH tags, SNAP-tags, and Halo-tags。这些标签蛋白与目标蛋白共表达，并以共价和特异性结合其各自的荧光标记试剂或配体。对于肌动蛋白和微管的标记，可以使用小肽药物，如双环七肽-鬼笔环肽和紫杉烷类药物，如紫杉醇。膜和细胞器的标记可以通过荧光脂质和细胞器的追踪试剂来实现。此外，小肽或配体可以直接用荧光团标记，并特异性结合生物分子，例如，显示抑制性突触后位点的超结合肽。要达到最小的标记误差，可以通过单个非天然氨基酸的特定位点标记实现。通过基因编码导入设计的非天然氨基酸，并用四嗪染料进行生物正交点击化学标记。显然，神经元和组织切片必须根据要成像的结构进行透膜和固定。与所使用的标记方法无关，特别注意所用的试剂必须能保留自然细胞环境中生物分子的超微结构。通过化学试剂固定交联蛋白质，可能会影响结合亲和力，也可能削弱分子间的相互作用。在大多数情况下，多聚甲醛（PFA）和戊二醛已成功用于神经科学的超分辨率成像。此外，还引入了乙二醛等新型固定剂。膜分子应始终使用4%的PFA和0.2%戊二醛固定，以尽量减少残余流动性并避免伪影，例如抗体结合诱导的簇形成。4.2. 神经元的多色遗传标记荧光蛋白彻底改变了神经元的活细胞成像方式，因为荧光蛋白可以与感兴趣的蛋白质融合，并且在假定不影响野生型功能的前提下，用于双色和三色成像。神经系统具有非常高密度的轴突和树突相互作用结构，需要使用更多不同颜色的标记来区分不同的神经元连接。2007年，随着一种名为Brainbow的转基因方案的开发，这一问题得到了解决，该策略能够对神经元进行多色标记。结合单细胞分辨率成像技术，Brainbow技术可以用来创建大脑图谱，详细描述神经元如何形成回路，其连接体以及它们投射到何处。Brainbow利用了三原色，即可见光谱的所有颜色都可以由三种原色的不同混合物生成，即红色、绿色、蓝色（RGB）或转化为荧光蛋白，例如RFP、YFP和CFP。为了实现这一想法，应用了Cre/lox重组系统，该系统可以通过DNA切除、反转或染色体重组启动基因表达，使三个荧光蛋白基因中的一个在转基因中随机表达。转基因盒的多个拷贝的引入导致三个不同拷贝数的基因在每个细胞中组合表达，从而产生几十种颜色，使相邻神经元分化并观察其相互作用。Brainbow技术非常适合绘制不同神经元类型之间的连接模式，追踪轴突，并识别大脑中远距离的神经元连接。此外，已经证明Brainbow表达可以成功地用于研究周围神经损伤后的轴突再生，并检测大脑发育过程中的重要阶段。为了进一步改进Brainbow在包括突触蛋白在内的大脑和连接图谱中的应用，SRM的应用是显而易见的。最近通过结合Brainbow、顺序免疫染色和ExM同时研究同一脑切片上的形态、分子标记和连接，成功地证明了这一点（图6）。将这项技术应用到全脑研究一直是一个挑战，直到最近才成功应用。图6 结合Brainbow和ExM的多轮免疫染色和ExM(miriEx)成像。(A) 实验方案：在Parvalbumin cre/+ 小鼠的脑切片中，Parvalbumin蛋白阳性中间神经元通过Brainbow进行观察，并在下一轮应用4倍ExM成像。使用EYFP信号对Homer1和Gephyrin进行免疫染色来观察突触。(B) Brainbow 信号的免疫染色。(C) 分别通过突触后标记homer1和Gephyrin的免疫染色来区分抑制性和兴奋性突触。插图(D)−(F)和(G)−(I) 显示图像的更多细节图。(J)和(K)神经元的形态重建(使用ImageJ软件插件nTracer)，包括其各自传入的特征。虚线框表示(B)和(C)中所示的区域。重建的神经元按顺序编号。标尺(膨胀前的)：10μm(B/C)、2.5μm(I)、20μm(J/K)。4.3. 神经科学中的光电联合显微镜电子显微镜(EM)和电子断层扫描具有光学显微镜无法达到的空间分辨率，可以获得细胞和细胞器的超微结构信息。然而，EM和电子断层扫描不能标记特定的分子，因此难以识别未知的细胞结构或具有相似形态特征的结构。用胶体金标记结合抗体可以实现蛋白质的纳米级定位，但抗原的标记效率低下，这意味着胶体金颗粒的数量仅占抗原总数量的1%到20%。而另一方面，荧光显微镜虽然分辨率较低，但可以进行大视场成像和对活细胞中蛋白质进行定位。对固定样本细胞中的各种分子进行高效和特异的分子标记后，结合超分辨率荧光显微镜方法，达到的空间分辨率可以远低于衍射极限。因此，光电联合显微镜（CLEM）作为一种通用的方法，在电子显微镜提供的细胞超微结构背景下，通过超分辨率成像来可视化蛋白质的定位和相互作用。然而，将超分辨率成像与EM结合起来更为困难，因为乍一看，这主要是由于两种方法的样品制备流程不同且不兼容。例如，EM中保存超微结构所需的固定和染色会引入很强的自发荧光。而且荧光蛋白还会在固定和聚合物包埋所需的脱水和氧化条件下淬灭。此外，这两幅图像必须在纳米精度下精确叠加，首先需要使用在荧光成像和EM中都表现出极好的对比度的固定对准标记物，如裸金微球。 另外，样品脱水引起的结构变形会严重破坏两幅图像的正确叠加。所以必须在超微结构和荧光保存之间找到折衷方案。例如，已经证明，对于某些周期性分子结构，如核孔复合体，无需使用对准标记，dSTORM和EM扫描图像可以以20 nm的精度叠加。光电联合显微镜的流程是先对轴突和树突进行荧光实时成像后，再使用透射电镜观察。例如，表达GFP的脑组织在荧光成像后进行化学固定，再使用电子密度标记进行免疫标记，例如EM金。或者采用更成熟的方法，如过氧化物酶或胶体金标记。最后，可以通过光转化在荧光团处局部生成二氨基联苯胺（DAB）聚合物。为了克服标记问题并确保超微结构的保存，已经开发了用于EM (NATIVE)的纳米体辅助组织免疫染色。NATIVE能够高效标记蛋白质，无需苛刻的渗透步骤、特殊树脂、锇替代物或透明化试剂。随着方法的改进和技术的发展，光电联合显微镜已被证明是研究不同种类突触和定位突触蛋白的理想选择。5.超分辨显微镜观察神经元隔室/突触以及神经元−胶质细胞相互作用下面我们将展示通过超高技术获得的有关细胞骨架组成和动力学、突触前室和突触后室对神经传递准确性至关重要的分子组装，以及形成神经元功能的星形细胞结构的调节和构建的最新数据。5.1. 细胞骨架神经元的极化性质以及树突和轴突的长度都需要结构和功能性支架来支持它们的稳定性、适应可塑性和物质运输，这些特性对神经元的存活和信号传递是必不可少的。因此，神经细胞骨架的结构在过去几十年中引起了神经科学家的注意，并在其它文献中进行了详细的回顾。20世纪70年代的电镜研究表明，神经细胞骨架由三种主要类型的神经纤维组成：大小约为20−30 nm的微管，直径为10 nm的神经纤维和5−10 nm大小的肌动蛋白丝。微管是由异二聚体在GTP依赖性组装过程中结合α和β微管蛋白单体组装而成的圆柱体，称为原丝，再由13个这样的原丝形成一个微管单元。轴突的微管成束状组织，并根据其相对于神经元胞体的位置显示不同的方向。它们的极化通过快速增长的正端和缓慢增长的负端体现。STED显微镜揭示了快速生长极依赖钙锚定在肌动蛋白皮质上。使用dSTORM对发育中的神经元进行活细胞成像证明了神经元极性和轴突具有方向一致的、平行的由TRIM46驱动的微管束，而树突微管的特征是混合极性。用Motor-PAINT方法进行纳米跟踪发现稳定和乙酰化的微管显示负端向外的方向，而动态和酪氨酸酶化的微管则显示相反的方向（图7）。例如轴突起始节中微管密集地聚集在束簇中，由于密集的重叠定位，使用SMLM方法具有挑战性。这个问题可以通过两种实验方法来解决：第一，设计更小的标记探针，如微管蛋白纳米抗体，这不需对神经元微管更详细的观察。第二，一种降低群聚密度的超分辨率方法，如ExM，可用于胞体和树突中微管亚群的可视化。神经纤维是在轴突中形成的广泛平行网络的异质聚合物，它为轴突提供稳定性并调节轴突直径和传导速度，其组成包括低、中、高分子量神经纤维、中间蛋白和外周蛋白的三联体。它们的自组装首先形成平行的异二聚体，然后半交错地结合成反平行的四聚体。最后，八个四聚体横向聚集成单位长度的神经纤维，进一步拉长并径向压缩至最终的神经纤维外观。用电镜观察到在神经纤维之间的交界面，形成3−5 nm大小的交叉桥，但对其功能及其与神经纤维的分子相互作用仍不清楚。在这里，ExM与SMLM的结合或DNA-PAINT的应用可能有助于研究密集神经纤维中的这种相互作用。神经纤维动力学已经通过光转换和光活化SRM实验进行了研究，显示了端到端蛋白合成中的退火和切断过程。肌动蛋白最初被认为与一组更集中的短肌动蛋白丝结合在一起，在轴浆中形成斑点状的膜下层。在原代神经元和脑切片中使用phalloidin Alexa Fluor 647进行STORM成像，揭示了轴突肌动蛋白的新的组成原理。这些实验揭示了轴突中存在圆周式肌动蛋白环，每190 nm固定重复间隔绕一圈，并进一步表征了轴突中具有类似尺寸的ßII血影蛋白和钠通道的周期性条带，而树突状腔室内显示出更细长的肌动蛋白组织。此外，通过STORM成像发现，并通过STED显微镜的研究得到证实，这种肌动蛋白组织模式的普遍性也存在于树突中。进一步的报告发现，尽管树突中也存在基于肌动蛋白血影蛋白的周期性膜骨架，树突中这种结构的形成倾向和发育速度低于轴突。此外，本文还显示了肌动蛋白和血影蛋白在胞体和部分树突中的二维多边形晶格结构，类似于红细胞中的膜骨架结构。此外，使用SiR-actin，可通过STED显微镜在活的原代神经元中观察到这种周期性结构。最后，最近的CLEM方法结合铂金复原电镜（PREM）和STORM研究了无顶轴突中的肌动蛋白组织，并提供了轴突编织状肌动蛋白结构与周期性肌动蛋白超微结构相关的证据（图8）。图8。原代神经元无顶轴突（unroofed axons）的CLEM成像（结合铂复型电子显微镜和STORM的光电联合成像）。用铂复型电镜（PREM）（灰色）显示的轴突辫状条带（箭头）被叠加到大鼠原代神经元的超分辨肌动蛋白环（伪彩）上，比例尺=2, 1, 0.2μm（从左到右）。中间：轴突辫状条带间距测量后显示出与周期肌动蛋白间距相似的尺寸。右图：在铂复型电镜（PREM）中记录的神经纤维厚度，未分裂（交织在一起）和分裂（分裂开）的轴突肌动蛋白辫状条带为蓝色，树突中的单个肌动蛋白神经纤维为紫色，微管为灰色参考。采用平均值和标准误显示数据。Copyright 2019 Springer Nature.ßII 血影蛋白基因敲除导致周期性肌动蛋白环结构破坏，同时细胞器的双向轴突运输受损。SMLM结果显示，与轴突相比，轴突起始节中的分子组织其特征是轴突起始节（AIS）蛋白ankyrin-G和ßIV-血影蛋白，这种基于肌动蛋白-血影蛋白的细胞骨架与远端轴突相似。此外，在AIS中存在ßIV-血影蛋白和Ankyrin G，而在远端轴突中存在ßi--血影蛋白和Ankyrin B。SMLM显示与肌动蛋白环相连的纵向头对头ßIV血影蛋白和Ankyrin的二价取向有助于建立紧凑的AIS超微结构，该超微结构甚至对针对肌动蛋白和微管的药物治疗具有抵抗力。进一步显示Ankyrin-G会聚集到亚结构域，增强神经元活性，而成为精神疾病的主要风险基因。随后的SMLM研究还阐明了αII血影蛋白与ßIV血影蛋白共同在AIS提供强健的周期性细胞骨架组织以及防止AIS装配不完全和神经变性的重要性。一份相关报告显示，αII 血影蛋白丰度随有髓鞘轴突直径的增加而增加，表明大直径轴突更容易发生神经退行性病变。在免疫标记II血影蛋白后，将其连接到一种可膨胀的聚合物，并在水中膨胀后，通过ExM研究ßII spectrin沿轴突的周期性模式。这一新方法证实了如前所述的细胞骨架内部的组织原理。不幸的是，在ExM过程中，phalloidin探针在膨胀过程中被冲掉。有两种策略解决这一问题：一方面，携带甲基丙烯酸基团的phalloidin三功能抗体被设计用于与凝胶的有效标记；另一方面，最近的一份报告使用荧光团结合抗体，类似于常规免疫染色，将荧光团靶向phalloidin探针与凝胶连接。在中枢神经系统的几种神经细胞类型和动物物种中，肌动蛋白和附属蛋白的强大超微结构组织也得到了证实。外周神经系统（PNS）中，STED显微镜也显示在梳理的神经纤维样本上有重复的细胞骨架成分。最后，SMLM揭示了肌动蛋白-血影蛋白骨架的一个重要生物学功能：它可以作为一个信号平台，通过组织跨膜信号蛋白，包括G蛋白偶联受体（GPCR）、细胞粘附分子（CAM）和受体酪氨酸激酶（RTK），在神经元中进行信号转导从而实现GPCR-和CAM介导的RTK信号。5.2. 突触前室为了确保有效的神经化学传递，突触前膨大参与突触囊泡循环、神经递质填充以及与突触前膜在活性区（特殊蛋白质密集分布的纳米隔室）的融合，以最终释放神经递质。在这里，我们关注SRM如何扩展我们对突触前功能的理解。早期只能使用EM对化学固定神经元里的小直径突触小泡进行研究，但随着SRM的出现，应用快速STED显微镜，通过免疫标记位于突触前室突触小泡上的钙传感器突触标记蛋白1（SYT1）来观察突触小泡的活动。STED显微镜进一步显示，突触小泡融合后Syt1分子似乎驻留在突触膜上，也支持胞吐后突触小泡蛋白的清除过程。此外，在突触小泡融合过程中，当暴露于细胞外空间时，靶向Synaptobevin 2 pHluorin的荧光团结合纳米体后，亚衍射追踪显示了突触小泡的异质性迁移。一种类似的方法使用vGlut1 pHluorin在原代神经元中的表达来观察单个神经元突触小泡，定位精度为27 nm，并揭示了突触小泡的多个不同释放位点。作为一项方法学的进步，为了对主动循环的小泡成像，设计了一种名为mCLING的亲脂膜探针，该探针可对突触膜进行染色，通过内吞作用和固定，可以进行免疫标记，且和SRM相结合。突触小泡的胞吐过程需要一组属于突触前细胞基质的突触前蛋白质的高度可靠的相互作用，使突触小泡接近和暂时驻留在所谓活动区的膜上，并最终释放突触小泡。黑腹果蝇易于遗传，有助于精确定位果蝇幼虫神经肌肉接头（NMJ）活动区的第一个重要蛋白质。Bruchpilot（Brp）是一种必不可少的活性区成分，是一种大的、卷曲的螺旋蛋白，对于钙通道聚集和突触囊泡定位到突触释放位点至关重要。除了通过Brp研究钙通道聚集外，STED显微镜还证明了该蛋白细长的组织结构，并揭示了与Brp相互作用的蛋白（如syd-1α、liprin和rim结合蛋白（RBP））的定位。定量dSTORM方法研究了果蝇活动区Brp丝的数量，并显示了Brp的结构组织与其功能之间的强相关性。接下来的研究通过dSTORM评估Syt1敲除后的活动区（CAZ）电生理学和细胞基质参数。这项研究表明，在果蝇NMJs 1b型突触膨胀中，Syt1基因的敲除导致更高的Brp计数和簇内Brp图谱的改变。在哺乳动物突触中，突触前支架蛋白bassoon 和 piccolo参与突触囊泡释放的调节。据报道，bassoon蛋白通过与RBP的相互作用来控制CaV2.1型钙通道的定位。此外bassoon蛋白能加速囊泡释放，因为其丢失导致小脑苔藓纤维到颗粒细胞突触中的突触囊泡数量显著减少和突触抑制。STED显微镜显示bassoon 和 piccolo蛋白是一个夹心三明治结构，两侧为piccolo蛋白，bassoon蛋白居中。STORM成像通过距离测量显示bassoon蛋白相对于突触前和突触后室中其他相关突触蛋白质的方向。囊泡胞吐过程由一组可溶性ethylmaleimide敏感因子附着受体（SNARE）蛋白质进一步协调。位于突触膜上的囊泡SNAREs (v-SNAREs) 蛋白和 t-SNARES蛋白的复杂形成导致突触囊泡成功融合。在质膜上的突触体相关蛋白25（SNAP-25）和突触融合蛋白聚集首先通过STED显微镜进行研究。这项研究表明，大约75个突触融合蛋白分子被堆积成50- 60 nm大小的纳米团簇。在之后的研究中，SMLM以更高的精度对SNAP-25和突触融合蛋白的分布进行成像。在这里，描述了Syntaxin簇内的分子密度梯度。dSTORM成像显示，未聚集的分子紧密地定位于聚集区域。最近的一项研究显示了一种以syntaxin或SNAP-25为靶点的像。研究表明，集中在突触前部位的60%的通道是可变的。此外，通过应用BAPTA钙缓冲降低了钙通道的扩散。结果表明，突触小泡和钙通道之间的纳米域偶联保证了神经传递的精确度，并可根据需要通过突触前钙通道的扩散进行精细调节。 在融合和递质释放后，内吞机制诱导循环产生新的囊泡，从而重建可释放的囊泡池并为持续的神经传递提供基础。囊泡循环的主要机制由网格蛋白介导的内吞作用组成。使用光遗传学和”闪光冷冻”电镜的研究也报道了比超快的内吞快200倍的过程。如双色iso-STED显微镜所示，通过摄取针对囊泡内膜结合位点的Syt 1抗体，将内吞位点定位到活性区外周。此外，在神经内分泌细胞中，STED显微镜也揭示了囊泡只能部分与突触前膜融合释放递质，形成一个“Ω”形状的结构，而没有完全融入膜中，因此有利于“接触后即脱离”（kiss and run）的模式。与网格蛋白介导的内吞作用相比，它会产生更快囊泡再循环率的递质释放模型。依赖于活性的大量内吞作用进一步增加了可能涉及的机制的复杂性，有人提出，根据突触类型和活动，多种内吞模式可能并行运作。本文由超高显微技术应用工程师郭连峰、黄梓彤编译

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安捷伦科技公司宣布与弗洛里神经学和心理健康研究所合作 此次合作将开发蛋白质中痕量金属检测技术，首次使科学家能够直接从神经退行性疾病的组织中检测金属蛋白 2013 年 9 月 19 日，北京 &mdash 安捷伦科技公司（纽约证交所： A）今日宣布与弗洛里神经学和心理健康研究所合作，这将使科研人员能够在直接从神经退行性疾病（例如运动神经元病、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病）的组织中检测和测量蛋白质水平的金属。 对于科学家和科研人员来说，监测和测量一系列具有金属结合能力的蛋白质（金属蛋白）可能会使他们对疾病机制和正常生理过程的认识取得重大进展。 揭示金属蛋白的作用将能够更全面地反映疾病发展过程中人体组织出现的问题， 从而可以为开发针对具体金属蛋白功能障碍的治疗方法带来新的契机。 弗洛里神经学和心里健康研究所的高级研究科学家 Blaine Roberts 博士谈到：&ldquo 这是科学界的一项重要突破，推动了对一系列神经和精神疾病的更有效的治疗方法的研究。&rdquo 科研人员已经明确金属在神经退行性疾病中存在一定作用，然而金属（例如铜、铁或锌）含量变化如何转化为变异的细胞功能和疾病，人们对蛋白质水平上的分子特征却知之甚少。 韩国和南亚太地区的安捷伦生命科学部总经理 Rod Minett 说：&ldquo 我们对这次合作非常期待，因为它结合了弗洛里顶尖的大脑研究和安捷伦的尖端技术， 金属蛋白的新兴领域有助于我们更好的认识人类的大脑，并有望改善患者的临床治疗效果。&rdquo 弗洛里的金属蛋白实验室专门研究通过液相色谱与Agilent 7700 ICP-MS（电感耦合等离子体质谱法）联用技术，直接从生物材料中定量分析金属蛋白的变化。 这些技术使科研人员能够迅速对金属蛋白进行直接比较，获得详细的金属蛋白图谱，更为重要的是，揭示了存在于生物样品中的金属蛋白的范围和复杂性。 安捷伦科学和技术主管以及亚太地区合作部经理 Rudolf Grimm 博士说：&ldquo 金属-蛋白质的相互作用以及金属蛋白生物活性的研究对认识生物系统的工作机理至关重要，此次合作将会夯实安捷伦在学术研究领域的领导地位。&rdquo 关于弗洛里神经学和心理健康研究所 弗洛里研究所是世界最大的大脑研究机构之一，拥有 450 名神经学家以及两个最先进的研究场所。 该研究所还与 32 个国家和地区的研究人员合作，其发表的论文被引用的次数居全球第三。 弗洛里研究所关注多种疾病和疾病状态，例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癫痫、中风、多发性硬化症、亨廷顿氏病、运动神经元疾病、脑外伤和脊髓损伤、抑郁症和癖嗜。 关于安捷伦科技公司 安捷伦科技（NYSE 代码： A）是全球领先的测试测量公司，同时也是化学分析、生命科学、诊断、电子和通信领域的技术领导者。 公司拥有 20500 名员工，遍及全球 100 多个国家，为客户提供卓越服务。 在 2012 财政年度，安捷伦的业务净收入为69 亿美元。要了解安捷伦科技的信息，请访问：www.agilent.com。 更多关于安捷伦科技公司的技术、企业社会责任和行政新闻，请访问安捷伦新闻网站：www.agilent.com/go/news。

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，我们将分三期陆续介绍。本期介绍第一部分。1. 背景介绍成像技术是推动生命科学几乎所有学科基础研究的核心平台。在神经科学领域，近几十年来，共聚焦显微镜技术已成为分析神经组织的标准荧光成像技术。激光扫描共聚焦显微镜对固定的神经元样本进行观察，在扫描水平上提供了三维和多色图像并使单个细胞达到树突结构的分辨率。作为补充，电子显微镜（EM）用于获取神经元和亚区室超微结构的信息，并用于大脑的连通性分析。EM非常适合于神经元突触和囊泡、细胞器和膜构象的结构分析。然而，由于靶向特异性标记方法的局限性，基于EM的复杂样品中蛋白质和特定电子密度特征的识别受到限制。为了进一步理解神经元功能，包括双光子显微镜在内的几种活体视频显微镜应用的发展使神经元细胞培养的活细胞成像、器官型切片培养和动物模型的活体成像成为可能。同时，新的荧光染料、功能探针和荧光蛋白以及光遗传学方法和光驱动（如笼状化合物）不仅可以表征神经元，还可以操纵神经元及其从单分子水平到整个神经系统的相互作用。然而，荧光显微图像中可见细节的水平，即图像分辨率，仍然受到衍射极限的限制。一个多世纪以来，由λ/2NA定义的阿贝衍射极限（λ为波长，NA为显微镜物镜的数值孔径）决定了光学显微镜的分辨率极限，限制了两个位置小于200纳米的细节分辨。在过去的二十年中，超分辨显微镜（SRM）已经发展成为一种非常有效的亚细胞水平荧光成像和分辨细胞器结构的研究手段。SRM现在可以提供远低于常规光学显微镜衍射极限的空间分辨率，从而能够深入了解神经元细胞和组织中蛋白质的空间结构和相互作用。本文综述了超分辨显微镜和荧光标记方法及其在神经科学中的成功应用。我们将首先详细介绍各种SRM方法的基本原理、新的功能型荧光探针和标记技术。接着，我们将回顾SRM如何有助于我们理解神经元亚细胞结构和功能以及神经元−胶质细胞相互作用。此外，我们将概述超分辨率成像方法如何帮助研究自身免疫和神经退行性疾病的病理生理学。最后，我们将介绍这些新的成像方法是如何应用于神经精神疾病相关的人类样本的分析。由于该领域持续快速发展，我们最多只能代表一份中期报告。进一步的创新和新的显微镜方法的发展将使人们对神经系统功能有更详细的了解。 2. 神经科学中的超分辨率成像方法2.1. 光学衍射极限及其对神经科学的影响人类大脑包含超过800亿个神经元，每个神经元由数千个突触连接。因此，它构成了复杂神经元网络。这些网络的主要组成部分，例如突触神经末梢，显示的空间维度接近于光学衍射极限分辨率∼200 nm。释放递质的突触活性区（突触前细胞基质的特化区）的直径通常约为300±150 nm。突触小泡作为递质运输和释放的关键元件，其尺寸平均小10倍，直径为40−50nm。这些递质被释放到宽度为20-50nm的突触间隙中−再结合突触后受体。由于衍射极限的尺寸限制，胞吐机制和跨突触信号在传统的光学显微镜下基本上是无法观测到的，因此需要用提高10倍分辨率的方法进一步研究。（图1）。图1. 兴奋性突触结构组成。左图为兴奋性突触的油画示意图，右图为左图的灰度图像，其中浅紫色圆圈为衍射极限光斑；玫红色圆圈为兴奋性突触囊泡，约40-50nm；绿色为突触后膜AMPA受体，尺寸小于10nm；黄色部分为突触间隙，约20-30nm。 此外，大量参与突触信号传导的不同的分子，位于极小的突触内，造成很高的分子分布密度，这对微观研究具有挑战性。例如，对于较小的突触，兴奋性突触可以包含数百个小泡，对于大型苔藓纤维束突触，可以包含数千个小泡，每个小泡包含多达1万到10万个递质分子。在这些囊泡中，约有10±5个与释放部位对接，释放的递质平均与0−20 个NMDA受体和0−200个AMPA受体结合，而这些突触后受体又被320±130个突触后PSD-95密度蛋白分子环绕。由于加速电子的波长要短得多，因此EM是唯一能够解析突触纳米级结构的方法。然而，虽然传统的EM产生的电子密度图像具有极好的超微结构分辨率，但需要进行固定和靶向特异性标记的制样方法在很大程度上限制了蛋白质识别和神经元追踪。荧光显微镜可以很容易地对蛋白质进行选择性标记，但是受制于可见光的衍射（400−700 nm）使生成的图像无法实现对纳米结构的分析。 2.2.绕开光学衍射极限的光学显微镜方法 20世纪后期，人们开发了新的策略，通过利用物理或化学手段来区分不同荧光团的发射或减少同一时间荧光分子的数量，以尽量绕过衍射极限。减少荧光团的点扩散函数（PSF）的重叠可以通过生成光图案在集合级别以确定性方式进行，或者通过减少同一时间荧光团的数量在单分子水平上以随机方式进行。在下文中，我们将从确定性集合方法开始介绍，该方法将激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）的有效空间分辨率推到理论极限。2.2.1. 确定性集合超高分辨率成像方法（Deterministic Ensemble SR-Imaging Methods） CLSM用针孔探测器阵列替换单点探测器，空间分辨率可以提高√2倍。CLSM测量每个扫描位置探测器每个点的荧光信号。在应用适当的算法后，生成分辨率提升的图像。这些所谓的像素重分配方法包括图像扫描显微镜（ISM）、重扫描共聚焦（RSC）、光学光子重分配（OPRA）、AiryScan和即时结构照明显微镜（iSIM）。对于信号检测，使用了诸如CCD相机、光电倍增管阵列、单光子雪崩二极管阵列和六角光纤束等探测器阵列。结构照明显微镜（SIM）在光路中插入光栅，产生与样品干涉的相干光束，生成横向和轴向方向不同的新照明图案。然后可以使用傅里叶变换提取这种新照明图案的信息，从而在所有三维空间中实现空间频率分解和分辨率倍增。SIM对样品制备的要求最低，并且可使用所有常规荧光探针，这些探针具有最低的光稳定性，并且可以很容易地扩展到多色成像。然而，当记录三维或长时间成像时，强烈建议使用光稳定性更高的荧光团。此外，SIM使用更低的激发强度，因此是活细胞SR实验的理想选择。为了获得更高的分辨率，引入了通过图案化饱和或荧光激发或图案化耗损光开关染料的非线性SIM（NL-SIM）。然而对染料开关特性的苛刻要求限制了NL-SIM在常规生命科学实验中的适用性。非线性SIM单位时间内还需要采集更多的图像，因此实际上仅限于2D成像。另一方面，掠入射（GI）-SIM显示了高达每秒266帧的快速超分辨率成像以及100nm分辨率，揭示前所未有的细胞器动力学细节。结构照明的局限性在于其对波长的普遍依赖性、与其他SR成像技术相比的低分辨率以及对系统稳定校准的需要。最后，后处理需要进行先验质量检查以避免伪影,例如由于高背景信号或不充分标记产生的低对比度图像导致的人工蜂窝图案。通过受激发射耗损(STED)显微镜进行超分辨率成像是一种实现更高空间分辨率的成像方法。这里，高斯分布的激发激光束被中空的甜甜圈样的耗损激光束覆盖，使扫描点外围的荧光团返回基态，这导致纳米级焦点区的直径与耗损光束的强度成反比，耗损光束的强度直接转换为STED显微镜的分辨能力：上图公式中λ为波长，n为折射率，α为物镜的收集角，ISTED为STED光束的照射强度，IS为饱和强度。因此，可以通过改变损耗激光强度来调整分辨率，可定制设计分辨率达30−80nm 的显微镜。STED显微成像可通过连续或脉冲激光激发、门控检测。带有脉冲激光的STED显微镜会降低激发能量，从而减少实时成像中的光毒性效应。STED显微镜中的时间门控检测可以去除荧光团光子到达时间前的空间信息，并且可以在较低的平均功率下工作。商品化STED能提供用户友好的高分辨率成像，无需进一步的数据后处理。活体成像，例如活体树突棘动态成像已经很成熟，但快速动态成像仅限于小帧尺寸，因为它仍然是点扫描方法，高激光强度可能会导致光损伤。STED通过应用自适应照明方式Dymin和rescue技术，可以明显减少光损伤。在Dymin STED中，在共聚焦模式下扫描时确定最低可能的STED光束强度。根据样品的标记密度，这将使STED光束强度降低20到100倍。Rescue STED同样通过减少STED激光开放的区域，从而比普通STED减少光漂白接近8倍。STED的另一个限制是对荧光团光稳定性的依赖，因为在高激光强度下会发生明显的光漂白。这影响了动力学的研究和三维图像的获取。值得注意的是，最近通过使用荧光团标记的寡核苷酸（瞬时结合到连接靶蛋白结合探针的互补寡核苷酸）或非结合荧光团来进行细胞STED成像，从而绕过了STED光漂白问题。这两种方法中，基于DNA互补标记的STED成像和超分辨率阴影成像SUSHI分别通过荧光团标记的寡核苷酸和高浓度的非结合和自由扩散的荧光团不断交换来防止光漂白。SUSHI的方法已经成功地用于活体脑片中细胞外间隙和神经肽的结构解析及其动力学的STED成像。如果使用具有毫秒或更长寿命的两种稳定状态的可逆切换荧光团来代替标准荧光团，则STED强度可以显著降低。可逆饱和切换光学线性荧光转换方法（RESOLFT）已通过可逆可切换荧光蛋白（reFPs）实现，并成功应用于活体海马脑片树突棘的超分辨率成像。2.2.2. 随机单分子SR成像方法（Stochastic Single-Molecule SR-Imaging Methods）上述的确定性方法是通过改变激发模式或相位掩膜来暂时控制荧光发射达到超分辨成像，而基于单分子的定位SR显微镜则是随机地在时间上分离单个荧光团的发射。单分子定位显微镜（SMLM）基于单个荧光团的随机激活，使用配备高灵敏相机（EMCCD或sCMOS）的宽场荧光显微镜进行单分子检测，以及精确的位置测定。通过将理想PSF与实际测量的光子分布拟合来进行分子定位。只要信号来自单个发射区，且单个发射区之间的距离大于显微镜能分辨的最小距离，则通过收集更多光子和最小化噪声，定位的标准误差可以任意小。激活和定位过程重复多次，所有定位最终用于重建超分辨率图像。为了确保在成像的任何时候，只有稀疏的小荧光团以其活性荧光形式存在（开启状态），使用了光开关、光转换、光激活或自发闪烁的荧光团。由于定位精度和最终图像分辨率取决于每次检测到的光子数量，通常采用明亮且稳定的荧光团与1 kW/cm2的辐照强度相结合的方式。根据所使用的荧光团不同，SMLM可达到10−50 nm横向分辨率。光激活荧光蛋白（FPs），自2006年以来已用于光激活定位显微镜（PALM），例如在405 nm的激光照射下可从关闭状态不可逆地转换为打开状态的PA-GFP和PA-mCherry 以及可通过适当波长的激光照射从一种波长状态不可逆地转移到另一种波长状态的光转换FPs，例如MEO。此外，还成功地应用了诸如Dronpa之类的光开关FPs，其在不同激发波长的激光照射下可在非荧光和荧光状态之间可逆地切换。对于活细胞应用，使用荧光蛋白的PALM是首选方法。因为在理想情况下，每个感兴趣的蛋白质都可以用荧光蛋白进行计量标记。然而，荧光蛋白比有机染料表现出更低的光稳定性和光子计数，从而降低了定位精度，并且通常需要更长的采集时间。此外，对于PALM成像而言，融合蛋白通常会过度表达，这可能会导致不真实图像，而用转基因变体替代显示野生型表达和功能的自身蛋白仍然具有挑战性。对于细胞内源性蛋白质的标记，通常使用有机染料的免疫标记。SMLM适用的有机染料必须是光开关、光激活或自发闪烁的，以实现单个染料发射的时间分离，但化学计量标记要困难得多。有机染料通常表现出较高的光子计数和光稳定性，从而使定位精度达到5−10nm。花菁染料Cy5和Alexa Fluor 647可以在荧光开启状态（其典型寿命为10 ms）和非荧光关闭状态（寿命为几秒，利用光开关缓冲液，缓冲液包括PBS，10−100mM硫醇，如ß-巯基乙缅（MEA），酶促氧清除剂，可以有/没有激活染料）之间可逆切换，为随机光学重建显微镜（STORM）和直接型STORM（dSTORM）的发展铺平了道路。近年来，应用于（d）STORM的染料已大大扩展，除了菁染料外，还包括罗丹明和恶嗪染料。有趣的是，最近的研究表明，即使是多个标记的抗体在光开关缓冲液中也呈现出类似于单发射的表现，因此适用于dSTORM实验。光活化染料的作用与光活化荧光蛋白相似。也就是说，它们在被光照射或自发激活之前处于非荧光状态。罗丹明衍生物PA-JF549和PA-JF646以及桥环菁染料Cy5B是已成功用于SMLM的光活化染料。此外，在没有光开关缓冲液的水溶液中，硅罗丹明HMSiR等自发闪烁染料也能应用于SMLM。最近，通过图案化照明方式实现更高的定位精度，单个荧光发射区的定位得到了改进。定位精度取决于信号的大小和强度，可以通过测量的PSF标准偏差的平方除以收集的光子数来估计。然而，包括拟合性能、标记密度、标记误差和显微镜漂移在内的其它参数决定了高定位精度是否可以转化为低于10 nm的空间分辨率。此外，到目前为止，因为SMLM方法成像需要昂贵的仪器和成像者具备广泛的专业知识，这在一定程度上阻碍了其广泛应用。2.2.3. SMLM-点累计纳米成像技术（PAINT，Point Accumulation for Imaging Nanoscale Topography）第一代SMLM技术依赖于荧光团的光开关和光激活，其分辨率需要有效地利用荧光团发出的光子数，而PAINT(point accumulation for imaging nanoscale topography)方法使用活的，与目标区域结构短瞬结合的染料。在成像过程中，被漂白的荧光团可以被成像介质中充足的新鲜荧光团不断置换替补。由于游离染料在采集单个图像帧期间在多个像素上快速扩散，因此它们仅显示为模糊背景且不能准确定位，而结合染料显示为PSF且能准确定位。因此PAINT的第一种方法是将荧光染料（如尼罗红）与细胞膜进行非特异性结合，然后进行光漂白和新的结合。此外，基于蛋白质片段的探针被用于单分子定位标记。在最近的一个研究中，将这种方法与传统的基于phalloidin的肌动蛋白标记方法进行了比较。通过引入通用PAINT（uPAINT）使Ni-Tris-NTA与转基因蛋白质上表达的His-Tags更特异结合，并可用于突触间隙成像。uPAINT也可以应用于其它标记方法，如免疫标记（内源性蛋白抗体、纳米抗体如绿色荧光蛋白）或受体配体结合。为了提高PAINT的适用性和特异性，引入DNA-PAINT方法。它使用长度小于10个核苷酸的短的可控的寡核苷酸链（成像链）瞬时标记其靶结合互补寡核苷酸链（对接链）。成像链与对接链的瞬时结合产生明显的闪烁。因此，荧光团开-关状态之间的切换与其光物理性质不直接关联。DNA-PAINT首先在DNA折纸（DNA-origami）上得到验证。DNA折纸是一种自组装的DNA结构（具有已知的大小），通过侧链和荧光团进行结合，并通过宽场显微镜观察。总的来说，DNA-PAINT是一种易于实现的SR成像标记方法，无需特定光物理特性的荧光团。因为探针可以在一轮结合后，从成像介质中置换补充荧光团，从而避免了光漂白。DNA-PAINT的缺点是图像获取时间长，这是由成像链与对接链的结合和解离速率决定的，以及荧光成像链的纳摩尔浓度引起的背景信号。尽管通过使用优化的DNA序列和缓冲条件，以及使用串联的周期性DNA结构域或通过短肽的卷曲螺旋相互作用（称为“Peptide-PAINT”），可以加快采集速度，但还是要利用全内反射荧光（TIRF）（仅限于对靠近盖玻片结构进行成像的特点），才能更好地减少成像链的背景信号。另一方面，基于DNA的探针提供了序列成像复用的明显优势，如Exchange PAINT中所述，已成功用于小鼠视网膜切片中多个结构的成像（图2）。Exchange PAINT的概念也被推广到dSTORM、STED、SIM和更传统的衍射限制的宽场和共聚焦荧光显微镜。最近，通过一种称为PRISM(probe-based imaging for sequential multiplexing)的基于DNA-PAINT的成像方法，实现了高达10个神经元蛋白质的分辨率约为20nm的多通道成像。该方法使用了低亲和力成像探针，该探针与突触、肌动蛋白和微管一抗上的对接链结合。图2 原代神经元中多个神经元靶点的多标Exchange-PAINT成像。（A）DNA-PAINT顺序成像的四种突触蛋白的超分辨图像：圆圈表示漂移校正的基准点；（B）为（A）中不带*的感兴趣区域的高放大倍率图和超分辨图像。（C）为（A）中带*的感兴趣区域的超分辨结果及单通道图像。2.2.4. 定量SMLM如果每个目标分子都可以单独标记和定位的话，与所有其他超分辨率成像技术相比，SMLM还可以提供有关分子分布和分子绝对数的单分子信息。然而，内源性蛋白质的定量免疫标记仍然是一个挑战，并且多标记抗体的不同定位数目也会使数据解释复杂化。另一方面，达到内源性表达水平比较困难，另外FPs蛋白成熟缓慢也同样会令定量化困难。然而，可以通过设计专门的对照实验估计拷贝数，并提取出有关生物目标结构分子的真实信息。借助合适的算法，SMLM可以提供有关拷贝数、聚类、共定位和复杂化学计量的数据，用于定量模型的生成和模拟。此外，还可以通过将突触结构信息与其功能关联来实现量化，例如膜片钳神经元的生物细胞素标记。例如，通过对链霉亲和素标记后膜片钳神经元进行STORM成像，结合CB1受体的免疫标记，然后在GABA能的海马轴突终端内定量，研究了内源性大麻素信号。本研究发现，与树突投射型中间神经元相比，胞周投射型中间神经元具有更高的CB1受体密度和更复杂的活动区。通过免疫标记和dSTORM研究了黑腹果蝇神经肌肉连接处内源性Bruchpilot（Brp）分子的数量。利用抗体滴定实验，确定了野生型神经肌肉连接处活性区细胞基质中Brp蛋白的数量为137个，其中四分之三以约15个七聚体簇状排列结合从相同组织样本记录的电生理数据，研究Brp如何组织控制活动区功能。利用DNA纳米结构作为校准，每个活性区Brp蛋白的数量估计通过定量DNA-PAINT（qPAINT）实验证实。此外，定量dSTORM实验表明，每个活性区Brp蛋白的数量和分布受突触标记蛋白-1的影响，这说明突触活性区递质释放的复杂性。在最近的一项研究中，使用Alexa Fluor 532和Alexa Fluor 647免疫标记的双色dSTORM已用于小鼠小脑平行纤维活性区中代谢型谷氨酸受体4（mGluR4）的定量研究（图3）。该研究还使用抗体滴定实验估计每个活性区平均包含约35个mGluR4分子，并排列在小纳米结构中。此外，mGluR4通常在munc-18-1和CaV2.1通道附近被发现，这支持了mGluR4与这些蛋白质相互作用以调节突触传递的观点。图3小鼠脑片中代谢型mGluR4受体定位定量双色dSTORM。上图：mGluR4和Bassoon免疫染色的小脑冠状切片的dSTORM图像，作为活性区参考。与宽场显微镜结果的比较。（A）DBSCAN聚类算法定义了近距离的En face活性区表面积（灰色）和mGluR4信号（品红）。（B）活性区大小的频率分布直方图（C）mGluR4信号到突触和突触外区域的映射。（D）通过Ripley H函数分析评估Bassoon和mGluR4的聚集分布。与随机分布的分子（蓝色、灰色）进行比较。虚线表示Ripley分析的最大值。这些研究显示了定量SMLM在神经科学研究中的潜力。可以预见，定量SMLM的进一步发展将为突触前和突触后蛋白质的功能关系，及其组织和结构的研究提供更有价值的信息。2.2.5. 组织三维（3D）SMLM虽然SMLM方法实现了仅几纳米的非常高的水平定位精度，但它需要特殊的方法来打破图像平面上方和下方PSF的对称性，来实现高轴向定位精度。实现高轴向定位精度的两种方法是PSF重塑和多焦面检测，通常用于在3D中精确定位荧光团。在SMLM中最常用的方法是通过在成像路径中插入单个柱面透镜从而不对称地扭曲PSF，利用光学像散原理来实现三维定位。基于像散方法的3D dSTORM技术还可以与光谱拆分相结合，对COS-7细胞中的网格蛋白表面小窝成像。像散引起的畸变程度由荧光团的轴向位置决定，因此可用于轴向位置计算。例如，3D散光SMLM已用于确定抑制性突触后密度区gephyrin蛋白和受体复合物的分布和拷贝数，或突触前活动区和突触后密度区各种成分的空间关系。采用双物镜像散成像方案，通过3D SMLM研究组织中肌动蛋白、血影蛋白和其他相关蛋白的结构，发现这些蛋白在轴突中形成190nm的周期性环状结构。替代方法包括使用相位掩模、变形镜实现双螺旋、四足或鞍点PSF重塑，和双焦面成像方法实现更大的轴向范围，并已成功应用于不同的应用中。为了在2D和3D中定位单个荧光发射区，已经开发了不同的算法和软件工具。在最近的一次综述中，列出了不同3D SMLM方法获得的水平和轴向分辨率，以供比较高30倍。此外，使用NHS染料对所有蛋白进行标记，然后进行迭代ExM，可以对高蛋白密度的结构或细胞器（如线粒体），实现与EM相比具有更高对比度的超微结构细节。为了在分子尺度上进行成像，ExM与SMLM方法（如dSTORM）相结合是一个理想的选择。然而在含有硫醇和盐的传统光转换缓冲液中，会发生荷电氢凝胶收缩。可通过使用低离子强度缓冲液或加入中性溶液使凝胶稳定以避免收缩。另一种策略是使用自发闪烁的荧光团（如HMSiR）在水中进行SMLM。通过Ex-dSTORM实现分子分辨率的关键是膨胀后标记，这增加了表位可及性，从而提高了标记效率并减少了标记错误。Ex-dSTORM超分辨成像已成功应用于原代细胞和神经元中微管和中心粒结构的解析。

p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 神经递质，大脑中在突触传递中担当“信使”的特定化学物质，称作神经递质，简称递质。图1、图2为其示意图。随着神经生物学的发展，陆续在神经系统中发现了大量神经活性物质。在中枢神经系统（CNS）中，突触传递最重要的方式是神经化学传递。神经递质由突触前膜释放后立即与相应的突触后膜受体结合，产生突触去极化电位或超极化电位，导致突触后神经兴奋性升高或降低。神经递质组成复杂，包括多种生化物质。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201905/uepic/fbdc9fad-1519-44e3-a655-6b3885113b87.jpg" title=" 图片 1.png" alt=" 图片 1.png" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em " 图1 神经递质示意图 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201905/uepic/0c74c60c-889b-43a7-9e53-78cd8567cd74.jpg" title=" 图片 2.png" alt=" 图片 2.png" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em " 图2 大脑中的“神经递质”， span style=" text-align: justify text-indent: 2em " 黑质就被称为“神经递质” /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 要对神经递质进行分析，必须首先从活脑中提取神经递质，然后用HPLC-MS / MS进行分析，这实在有点匪夷所思，令人难以置信。然而，加拿大滑铁卢大学雅努什· 波利西恩（Janusz Pawliszyn）领导的团队成功了。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 从活脑中提取神经递质，本质上是侵入性的。但是，他们通过利用固相微萃取（SPME）技术，已设法使其成为非侵入性的。他们的方法是将涂有某种形式的吸收性SPME材料的细不锈钢丝插入活体的大脑中。由于钢丝较细，对大脑造成的干扰较小，雅努什的团队使用150μm粗的不锈钢丝。他们首先用酸蚀刻了不锈钢丝的下端部分，直到它只有100μm粗。然后，他们将SPME涂在蚀刻部分，将其直径又增加至150μm。最后，又在涂层部分再添加了50μm厚的覆盖层。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 该团队在特制的神经递质混合物（包括去甲肾上腺素，乙酰胆碱和5-羟色胺）上测试了各种不同的市售聚合物SPME材料，但没有一种被证明是理想的。问题在于性能最好的SPME材料是以相对较大的颗粒形式出现的，尺寸可达60μm，需要将其研磨成细粉末涂在钢丝上。但这种研磨导致材料失去了一些官能团，使其在吸收神经递质方面的效率降低。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 所以波利西恩和他的团队选择使用来自沃特世的一种名为HLB（亲水 - 亲脂平衡）的SPME材料，这种材料在吸收神经递质方面不如其他一些材料有效，但其颗粒直径却只有5μm，可直接应用于钢丝。然后，他们在颗粒表面添加了强阳离子交换（SCX）基团，提高了材料对神经递质的有效性。在吸收神经递质混合物方面时，HLB-SCX材料被证明优于任何其他测试的SPME材料。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " SPME材料确定后，他们用提取的脑组织和琼脂凝胶的混合物制成了人造大脑材料，以方便研究。在人造大脑材料中，加入了另一种神经递质混合物。他们发现，将HLB-SCX涂层的钢丝插入人造大脑，20min后，足以使HLB-SCX材料吸收令人满意的神经递质。将HLB-SCX涂层的钢丝取出，浸泡在水、乙腈和甲醇的混合物中，释放神经递质，然后以高效液相色谱 - 串联质谱（HPLC-MS / MS）仪进行分析。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 实验表明HLB-SCX材料可以从脑材料中提取几种加标的神经递质，包括去甲肾上腺素、乙酰胆碱和5-羟色胺，用于通过HPLC-MS / MS在低于生理水平进行鉴定。然而，其他神经递质，包括牛磺酸，谷氨酸和γ-氨基丁酸，只能在高于正常生理水平的浓度下检测到。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 最后，他们在活恒河猴猕猴的大脑上测试了他们的SPME方法。这包括在三个不同的场合同时将HLB-SCX涂层的钢丝插入猴脑的三个不同区域。当科学家用HPLC-MS / MS分析提取的物质时，能够检测到多种不同的神经递质，包括多巴胺、谷氨酸和色氨酸。他们用人工脑材料进行测试，甚至能够检测到牛磺酸，这是用生理检测方法检测不到的。他们还测量了大脑不同区域的不同浓度的神经递质，其中，在某区域发现的神经递质，在其它区域可能根本没有发现，即使在同一区域内，场合不同其神经递质也不同。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 在此成功之后，波利西恩及其团队正在计划使用他们的SPME方法对活恒河猴猕猴大脑中神经递质的分布进行详细研究。他们还在考虑进一步提高方法提取效率的方法，以便它可以解释可能存在的所有神经递质。 /p p style=" text-align: right text-indent: 2em " （编译：符斌 北京中实国金国际实验室能力验证研究中心研究员） /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 根据Brain extraction: A novel method for extracting neurotransmitters from live brains编写 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " Published: Apr 15, 2019 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" text-indent: 2em " Author: Jon Evans /span /p p style=" text-indent: 2em " SeparationsNOW.com& nbsp & nbsp sample Preparation Newsletter /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " br/ /p p br/ /p

中国医学科学院北京协和医学院药物研究所贺玖明研究员团队以封底文章在《药学学报》英文刊（APSB）2022年第8期（IF：14.903）发表了题为“A temporo-spatial pharmacometabolomics method to characterize pharmacokinetics and pharmacodynamics in the brain microregions by using ambient mass spectrometry imaging”的研究论文，建立了一种时空分辨的代谢组学方法（基于AFADESI-MSI的时空药物代谢组学），可全景式描绘脑中药物代谢和效应的时空特征，为中枢神经系统作用新药研发提供了一种有力的可视化工具和新的视角。　　封底图 | 表征鼠脑中中枢神经药物的微区域药代动力学和药效学的时空代谢组学方法策略和工作流程　　研究背景　　中枢神经系统（CNS）具有复杂而脆弱的结构，在大脑的许多微区域之间具有高度的互连性和相互作用。大脑是人体复杂的器官，可以细分为许多微区域。脑中多种内源性功能代谢物在不同的微区分布不均匀。脑微区的代谢酶、受体、配体、蛋白和血流的功能差异也会导致药物的空间分布和疗效差异。大脑是中枢神经系统疾病的靶点，大多数中枢神经系统药品只有在进入大脑后才会发挥作用。因此了解药物及相关内源代谢物在大脑中的原位分布的信息对于评估药物疗效、毒理学和药代动力学具有重要意义。　　目前研究大脑的常用功能性脑成像技术（包括组织化学标记、免疫荧光、MRI、PET、全身放射自显影等），仅提供脑组织结构的图像，不能在分子水平上进行分析，可监测的物质种类也有限。另一方面，脑内药物分析通常使用的基于组织匀浆或微透析采样的高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）技术获得的结果仅能反映采样微区的平均代谢水平，而缺乏分子在整个大脑中的空间分布的信息。质谱成像技术（MSI）不需要复杂的预处理和特殊的化学标记，具有高通量、高灵敏度和高分辨率的特点，可检测已知或未知小分子代谢物的定性、定量和空间分布信息。　　本研究使用AFADESI-MSI空间代谢组学研究表征了临床中枢神经系统药物奥氮平（OLZ）和大鼠脑内内源性代谢物，并进行了给药期间的时空变化以及脑微区药物动力学和药效学研究，成功地展示了OLZ及其作用相关代谢物的时空特征，并为中枢神经系统药物作用的分子机制提供了新的见解。　　研究思路　　研究方法　　1. 实验分组/研究材料：饲养一周的雄性 Sprague-Dawley 大鼠　　（1） 实验组：4组（3只/组），口服OLZ溶液（50mg/mL）后 20 分钟、50 分钟、3 小时和 12 小时用高浓度乙醚。　　（2） 对照组：1组，3只/组　　2.技术路线　　2.1. 鼠脑的微区划分：15个微区，包括尾状壳核（CP）、大脑皮质（CTX）、海马（HP）、下丘脑（HY）、丘脑（TH）、小脑皮质（CBC）、小脑髓质(CM)、髓质 (MD)、脑桥 (PN)、大脑导水管 (CA)、中脑 (MB)、穹窿 (FN)、梨状皮质 (PC)、嗅球 (OB) 和胼胝体 (CC)。　　2.2 质谱成像：AFADESI-MSI分析（全扫描及MS2扫描）　　2.3代谢物定性：人类代谢组数据库 (www.hmdb.ca)、Metlin、MassBank和LIPID MAPS　　研究结果　　1.通过AFADESI-MSI绘制大鼠大脑中的内源性代谢物和药物图谱　　无论是正离子模式还是负离子模式，使用AFADESI-MSI空间代谢组学均可从治疗组和对照组脑组织切片中获得内源性代谢物信息。在100-500 Da的低质量范围内，可以检测到氨基酸、核苷、核苷酸、有机酸、脂肪酸等极性小分子代谢物和γ-氨基丁酸 (GABA)、肌酸、肉碱、乙酰肉碱和磷脂酰胆碱等神经递质类代谢物；在500-1000 Da的高质量范围内，可以检测到一些脂质，包括鞘磷脂（SM）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）、溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）和磷脂酰肌醇 (PI) 等。原型药物 OLZ 及其代谢物 2-羟甲基 OLZ 在正离子模式下被检测，结果如图1C1和D1所示。这些结果表明，非靶向质谱成像的方法可以在一次实验中同时绘制外源性药物和内源性代谢物的图谱，并可以获得它们的空间分布特征和微区域丰度变化。　　图1 | 使用 AFADESI-MSI 从脑组织切片获得的外源性药物和内源性代谢物的质谱成像结果　　2.鼠脑中奥氮平（OLZ）及其代谢物的时空变化　　OLZ是一种用治疗精神分裂症的药物，大脑是其主要靶器官。本实验为探究给药时间药物在大脑各功能微区的分布情况，分别在给药后20 min、50 min、3 h和12 h收集治疗组和对照组大鼠脑组织进行MSI分析。OLZ 及其代谢物 2-羟甲基 OLZ 的在鼠脑分布结果如图2A所示。　　这些结果表明，OLZ 可以很容易地穿透脑血屏障，主要分散在脑室和脑实质组织中，但并不是均匀分布在大脑的所有微区域中。给药后20分钟发现OLZ主要分布在大脑皮质中。50分钟后，OLZ的水平显著增加。随着时间的推移，大脑中的药物信号迅速下降到成像检测限以下。同时作者发现，2-羟甲基OLZ主要分布在穹窿中，其在各个微区的分布格局与OLZ不同。　　这些结果表明，OLZ药物的吸收、分布和代谢的速率在大脑的不同微区不同，表明微区对药代动力学有影响。它还证明了所提出的基于AFADESI-MSI 的时空药物代谢组学方法能够同时说明药物及其代谢物在大脑复杂微区域中的水平和空间分布的变化。　　图2 | 脑微区OLZ和其代谢产物2-羟甲基OLZ的时空变化　　3.OLZ 对神经递质类代谢物的的微区调控　　OLZ药物治疗精神分裂的作用机制是阻断多巴胺 D2 受体或血清素 2A 受体调节神经递质类代谢物（NTs）。然而OLZ的微区效应和分子作用机制仍不清楚。因此作者分析了与OLZ生理活动密切相关的NTs的时空变化，包括GABA、Glu、谷氨酰胺 (Gln) 和腺苷。NTs的AUC变化率如图3B1-B7所示。　　GABA（γ-氨基丁酸）是中枢神经中的一种神经递质，可抑制神经中枢。空间代谢组检测结果显示GABA（m/z 104.0706）主要分布在下丘脑中，药物干预后下丘脑的 GABA 受到轻微调节。但同时在梨状皮质和嗅球中观察到药物干预后GABA显著上调。Glu 是中枢神经中的一种主要神经递质，对神经细胞具有兴奋作用。在药物干预后，Glu及其代谢物Gln的时空动态模式在脑部微区中呈现出相对一致的变化趋势。腺苷广泛分布在中枢神经系统中，是大脑中的一种兴奋性和抑制性神经递质，并在脑中不均匀分布。并且在给药3小时后海马和下丘脑中的高水平腺苷显著增加，表明当药物积累时腺苷的上调会更加明显。组胺、乙酰胆碱（Ach）、牛磺酸等神经递质类物质都有各自特征的微区分布，以及在给药后具有上调的趋势。　　上述神经递质类物质的靶向成像分析结果表明，该方法可以检测到与中枢神经药物作用机制相关的大量原型药物及其代谢物和内源性代谢物的空间分布和变化。这对于阐明中枢神经系统药物的作用机制和了解精神分裂症及相关疾病具有重要意义。　　　图3 | 药物对脑内NTs分布和AUC变化率的影响　　4. OLZ 药物干预的微区代谢调控　　组织和器官的内源性代谢变化可以反映药物刺激的效果。为探索药物干预后的微区代谢效应，通过药物代谢组学测试研究了内源性代谢物的分子谱及其动态变化的分布信息。分别在OLZ和生理盐水给药后 50分钟采集每组治疗和对照大鼠的三个脑组织样本进行微区域分析。　　OPLS-DA结果表明，基于正离子模式和负离子模式下脑微区的定量分析，对照组和治疗组分别明显分开。总共筛选和鉴定了 90 种差异内源性代谢物，作为药物作用相关效应物,它们在大脑微区域中发挥了巨大作用。其中81种被MS2鉴定，9 种被同位素模式鉴定。差异代谢物包含了很多种类型的代谢物，包括氨基酸、脂肪酸、甘油磷脂、有机酸、多胺和酰基肉碱。　　经过分析确定了治疗组和对照组之间显著差异的七种代谢途径，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、甘油磷脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸生物合成、嘌呤代谢和柠檬酸循环（TCA循环）。下面对影响较大的丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和甘油磷脂代谢的异常代谢途径进行重点分析。　　图4 | 对照组和治疗组中鉴定的差异代谢物的层次聚类分析 (HCA)　　4.1 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢紊乱　　异常的Glu-Gln循环在精神分裂症的病理生理过程中起重要作用。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径代谢物在老鼠脑的时空分布如图5所示。柠檬酸在大脑大部分微区分布均匀；与对照组相比，表达显著提高，结果提示药物干预加速了TCA循环的代谢，为机体提供了更多能量。Glu也均匀分布在各个微区，药物干预后呈下调趋势。它的代谢物Gln 和 GABA，主要在下丘脑和的多个微区中上调。　　根据通路分析和代谢谷氨酸脱羧酶（GAD）酶反应，推测OLZ直接激活GAD促进GABA合成。GABA可增加糖酵解中己糖激酶的活性，从而加速葡萄糖的代谢。空间分布结果表明葡萄糖分布在大脑的所有微区，但给药后主要分布在梨状皮质和嗅球中，给药后20分钟血糖水平显著升高。　　图5 | 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径代谢物的时空分布　　4.2.甘油磷脂代谢途径的紊乱　　甘油磷脂有助于控制肝脏脂质代谢，促进记忆力，增强免疫力，延缓衰老。甘油磷脂代谢途径代谢物的时空分布如图6。这项研究的结果表明，在给药后，大多数脂质在大多数微区域中显示出上调。OLZ在临床应用中具有代谢副作用，如体重增加、血脂异常、高甘油三酯血症和胰岛素抵抗。实验结果证明，脂质代谢的上调可能导致OLZ治疗期间的副作用。　　图6 | 甘油磷脂代谢途径代谢物的时空分布　　相关讨论　　作者开发的时空药物代谢组学方法，使用质谱成像技术MSI来表征大脑中枢神经药物的药代动力学和药效学。结果表明，该方法可有效识别与药物作用相关的内源性分子效应物。评估OLZ药物对脑组织的微区域效应，并证明其穿过血脑屏障后的微区域药代动力学和药效学方面的有效性。该方法清楚地展示了原型药物及其代谢物 2-羟甲基OLZ在大鼠大脑不同微区的药代动力学。也在脑部微区现一些神经递质类物质和其它小分子极性代谢物，并显示出与药物干预相关的多种代谢途径。发现天冬氨酸、谷氨酸和甘油磷脂代谢途径的调节可能与 OLZ 临床使用观察到的治疗和不良反应有关，为了解其作用的分子机制提供了关键信息。　　小鹿　　与基于LC-MS的常规药物代谢组学分析手段相比，基于AFADESI-MSI的时空药物代谢组学技术具有同时检测内源性和外源性物质的静态水平变化，并提供大脑不同微区的动态时间依赖性趋势和空间分布信息的优势，能够非常准确地呈现原位和微区域分子变化规律。在此基础上将药代动力学和药效学与代谢途径相关联，有利于获得关键信息，从而更深入地了解药物作用的分子机制。基于AFADESI-MSI 的时空药物代谢组学技术不仅是阐述中枢神经系统药物的原位药代动力学和药效学全面有效的工具，也可为脑组织内源性代谢物的变化以及其它动物组织的原位代谢研究提供重要信息。　　该研究工作，药物所2017级硕士研究生刘丹为作者，贺玖明研究员为独立通讯作者。工作得到国家自然科学基金和医科院创新工程项目的资金资助。

“新材料之 王”是什么？ 石墨是的一种同素异形体，质软，黑灰色，有油腻感。高定向热解石墨(highly oriented pyrolytic graphite)是指热解石墨，经高温处理使性能接近单晶石墨的一种新型石墨，简称HOPG。在2004年来自英国曼彻斯特大学的科学家们从高定向热解石墨中剥离出石墨片，然后将薄片的两面粘在一种特殊的胶带上，撕开胶带，把石墨片一分为二，不断重复操作，于是薄片越来越薄，最 后，他们得到了仅由一层碳原子构成的薄片，这就是石墨烯。（▲三层碳原子构成的石墨结构分子示意图）在分离出单层石墨烯之前，大多数物理学家认为，热力学涨落不允许任何二维晶体在有限温度下存在。所以，石墨烯的发现立即震撼了凝聚体物理学界。但是实际上石墨烯本来就存在于自然界，只是难以剥离出单层结构。石墨烯一层层叠起来就是石墨，厚1毫米的石墨大约包含300万层石墨烯。铅笔在纸上轻轻划过，留下的痕迹就可能是一层甚至几层石墨烯。（▲由石墨烯构成的铅笔芯，图片取自央广网科普|习主席访英为何青睐&ldquo 奇迹材料&rdquo 石墨烯？2015-10-23） 石墨烯结构特点碳原子有4个价电子，石墨烯内部碳原子的3个电子生成sp2键，即每个碳原子都贡献一个位于pz轨道上的未成键电子，近邻原子的pz轨道与平面成垂直方向可形成&pi 键，新形成的&pi 键呈半填满状态。形成的石墨烯为复式六角形晶格，每个元胞中有两个碳原子，每个原子与最近邻的 3个原子间形成3个&sigma 键，剩余的一个p电子垂直于石墨烯平面，与周围原子形成&pi 键。（▲石墨烯结构示意图，石墨烯的蜂窝状晶格包括两层互相透入的三角形晶格，每个子晶格A的格点都位于其他子晶格B确定的三角形中央，共同形成石墨烯的蜂窝状晶格）（▲石墨烯结构的波失空间，石墨烯的晶体结构与倒格子，所谓倒格子是与晶格空间相对应傅里叶变换出来的波矢空间，或称动量空间）（▲石墨烯能带结构图）我们可以看出在 K 和 K&rsquo 点附近，费米面附近的电子能量E与波矢 k成线性的关系，E= F|hk|v , 其中k为准粒子动量，Vf =106 m/s，为费米速度。色散关系是近似线性的，这等效于动量与能量的关系为线性，这也就表明电子的速度为常量，并不受动量与动能的影响。在这种情况下，薛定谔方程来描述粒子的运动已经无效了，我们需要运用引入了相对论效应的狄拉克方程来描述。关于石墨烯非常高的电子迁移率的原因也是由于狄拉克点的存在，由于量子隧穿效应的影响，电子有概率穿过高于自身能量的势场。石墨烯的优势有什么？由于存在这样的特殊结构，石墨烯具备了超高的载流子迁移性，也就具备了良好的导电性和极高的信噪比以及时间分辨率。所有性能都基于结构，所以，石墨烯同样还具备轻盈，高导热性，做同样的功所消耗电力少，化学反应性强，强度高，比表面积大，高弹性高硬度等特点，发热少等优点。这么多优点又如此应用广泛，难怪石墨烯被称为&ldquo 黑金&rdquo ，是&ldquo 新材料之 王&rdquo ！2004年被发现，发现者2010年就获得了诺贝尔物理学奖，连我们的习大大都去参观了曼彻斯特大学的石墨烯研究所呢！在笔者看来最重要的一个特点是，单层的石墨烯近乎透明，对于应用场景的限制大大减少了。石墨烯如何制备？石墨烯之父采用的是机械剥离法，这个方法较为简便，将天然石墨块放在干净的二氧化硅SiO2上，上方用透明胶带反复剥离，从而得到石墨薄片。根据菲涅尔定律，在外部光源照射下，石墨烯与SiO2基底之间会因反射光强不同呈现光学反差，并且这种光学反差随着石墨样品厚度增加有着明显改变，借此办法来确定石墨烯是否为单层或多层。这个方法虽然简便，但不适合大规模生产。除此之外还有氧化还原法, 取向附生法, 碳化硅外延法, 赫默法以及化学气相沉积法(CVD)。CVD法简单说来就是用含碳有机气体为原料进行气相沉积制得石墨烯薄膜的方法，这也是目前科研机构制备石墨烯常用的方法。（▲化学气相沉积法CVD示意图）例如以铜Cu或镍Ni为基底，高温加热，并辅以甲烷作为碳源补充，使甲烷中的碳原子脱去氢，在基底上形成石墨烯。不同材质的基底对于碳原子溶解性不同，所以会产生&ldquo 石墨烯岛&rdquo 或&ldquo 石墨烯膜&rdquo ，通过控制气压高低可以获得单层石墨烯或多层石墨烯。 石墨烯的应用极高的信噪比和时间分辨率让石墨烯在生物电信号采集时具有极大的优势。目前的生物电传感器主要集中在膜片钳和微电极阵列，前者具备较高的空间分辨率，信噪比较好，但对生物体有损伤；后者没有损伤且可长时间记录生物体膜外信号，但是信噪比和空间分辨率相对较低。场效应晶体管是一种很好的代替微电极阵列的记录工具，利用场效应晶体管可以很好的记录小鼠大脑皮层或者海马区的神经电生理信号，也可以将其刺穿细胞膜来记录膜内电势差。这种技术信噪比较高，集成度也不错。石墨烯场效应晶体管和传统的场效应晶体管类似，但需要在石墨烯的表面做相应的修饰，使其能特异性识别某种分子或物质这样就既可以提高生物相容性和灵敏度，又能把石墨烯载流子迁移率高和载流子浓度高的特点发挥得淋漓尽致。上图为60通道石墨烯微电极阵列示意图，PI：1-&mu m-thick light-sensitive polyimide，即1微米厚光敏聚酰亚胺1，以此装置记录大鼠胚胎分离的神经细胞电生理活动。上图为石墨烯晶体管进行细胞电信号记录示意图，在柔性聚酰亚胺基底和透明基底(蓝宝石，玻璃，SiO2 /Si) 上制备了石墨烯液栅晶体管器件如上图所示，并用其记录小鼠初级海马神经元的神经信号2，因石墨烯材料透明的特点，同时结合倒置光学显微镜，观察细胞的光学特征。上图是石墨烯晶体管上培养的神经元细胞图，培养21天后的神经元进行免疫荧光染色2，DAPI(红色)和anti-Synapsin(绿色)染色，分别胞体和突触囊泡）机械剥离的石墨烯对心肌细胞电生理信号的记录3，A：在不同water gate potentias下记录的数据。蓝色、绿色和红色分别代表在 +0.05、+0.10 和 +0.15 V 下所记录。相应的灵敏度分别为 2020、398 和 2290 &mu S/V。B：所选栅极电位的代表性扩展峰值。蓝色类似于在石墨烯 FET 的 p 型器件极性处记录的结果，红色峰代表在n型器件极性处记录的结果，绿色峰代表在Gra-FET的狄拉克点附近记录的结果。上图为16通道石墨烯晶体管阵列记录HL-1细胞电生理信号4， 比例尺为100 &mu m。一个石墨烯场效应晶体管阵列中8个晶体管在数十秒（h）和数百秒(i)内同时记录电流的情况。图：细胞相容性测试，37摄氏度下，不同浓度纯石墨烯（上）和氧化石墨烯（下）处理Vero细胞后的存活率情况5。 石墨烯最 新应用研究近日，来自曼彻斯特大学的纳米医学实验室的研究者们利用利用石墨烯近乎透明的特点，监测脑缺血小鼠大脑皮层的电信号，并同时监测皮层血流灌注量变化情况，因为石墨烯近乎透明的性质，在激光成像下不会产生激光伪影（如下图所示）。（▲利用石墨烯透明的特点，监测脑缺血小鼠大脑皮层的电信号，并同时监测皮层血流灌注量变化情况，由RWD RFLSI Ⅲ激光散斑血流成像系统采集）总结石墨烯具备了许多神经电极活性材料的特性，如良好的相容性、化学稳定性、柔韧性、光学透明性和高导电性等，为更精 准的神经电生理研究提供了新的选择。识别下方二维码快来免费申请试用吧* 敬请期待下期内容，脑卒模型下的神经电生理相关特点。【参考文献】1：Du X, Wu L, Cheng J, Huang S, Cai Q, Jin Q, Zhao J. Graphene microelectrode arrays for neural activity detection. J Biol Phys. 2015 Sep 41(4):339-47.2. Veliev F, Han Z, Kalita D, Brianç on-Marjollet A, Bouchiat V, Delacour C. Recording Spikes Activity in Cultured Hippocampal Neurons Using Flexible or Transparent Graphene Transistors. Front Neurosci. 2017 11:466.3. Cohen-Karni T, Qing Q, Li Q, Fang Y, Lieber CM. Graphene and nanowire transistors for cellular interfaces and electrical recording. Nano Lett. 2010 Mar 10 10(3):1098-102.4. Hess LH, Jansen M, Maybeck V, Hauf MV, Seifert M, Stutzmann M, Sharp ID, Offenhä usser A, Garrido JA. Graphene transistor arrays for recording action potentials from electrogenic cells. Adv Mater. 2011 Nov 16 23(43):5045-9, 4968. 5. Sasidharan A, Panchakarla LS, Chandran P, Menon D, Nair S, Rao CN, Koyakutty M. Differential nano-bio interactions and toxicity effects of pristine versus functionalized graphene. Nanoscale. 2011 Jun 3(6):2461-4.

专 业：神经与精神病学 会议类型：学术大会 会议日期： 2013-09-21 会议地点：奥地利--维也纳 主办单位：N/A 推荐等级： 会议费用： 元 会议介绍 首席医学会议频道（conference.shouxi.net）2012年10月22日报道，世界神经学联盟是一个由全球100多个国家和地区的神经专家组成的国际组织。世界神经学联盟是通过对整个神经系统疾病患者的治疗与预防以提高全球人类健康为宗旨的协会。预计本次会议将有5000多代表参加。 会议详情 　　I am honoured to invite you personally to the twenty-first World Congress of Neurology, which will take place in September 2013 in Vienna and which I am sure will leave a lasting impression on us all. 　　The congress theme is &ldquo Neurology in the age of globalization&rdquo . We will discuss the major breakthroughs and developments in the field of neurology &ndash from clinical practice to research and technology. In addition to a top-rate scientific program, there will be many opportunities for hands-on learning and networking as well as exciting social events. 　　As the chairman of the Austrian Society of Neurology, I am happy that the EFNS - The European Federation of Neurological Societies and the World Federation of Neurology (WFN) - are our partners in this important event. 　　I look forward to welcoming you to Vienna, a majestic capital, filled with beautiful architecture and cultural attractions. 　　The Austrian capital city can be considered an ideal location for an international medical congress of this dimension. Vienna is a city rich in culture and boasts an impressive history in the medical sciences with all the modern amenities. Vienna is located in the heart of Europe and is easy to reach by plane, train, car or boat. The city offers excellent conference infrastructure and the highly professional services required for the organization of the World Congress of Neurology. Vienna has successfully hosted large congresses in the past, with up to 30,000 delegates. 　　Vienna and its environments offer an exceptional range of accommodation &ndash from luxury 5 star to moderately priced and inexpensive hotels. Vienna has always been a magnet for the &ldquo new&rdquo EU countries and its long established traditional medical contacts extend beyond Europe into all parts of the world. Hence, the congress will be held in close collaboration with our neighboring countries. 　　The Austrian capital is famous for its hospitality and culture. We are confident that the social events and leisure activities will contribute to the success of the congress. 　　本次会议的目标是：为参会者提供一次高质量、原创科学研究及临床实践的平台 促进临床、实践、科学信息及想法交流的平台 为所有对神经科学感兴趣的医生学者提供一次学习的机会 为参会者提供与同行建立网络联系的机会 通过不断努力来扩大及加强世界神经学联盟的影响力 令参会者跟上最新工业设备研究与发展的节奏。 　　会议的题目有：癫痫/运动障碍 中风/感染 肌肉骨骼/肌肉 头痛/神经眼科。 　　论文提交的栏目有：痴呆 自主神经疾患 行为神经学 脑血管病(中风与神经超声) 儿科神经学/发育神经学 临床神经生理学 重症护理/急诊/外伤 癫痫 伦理学、疼痛学与姑息医学护理 普通神经学/神经系统病 头痛与疼痛 神经学历史 成像 感染 运动障碍 MS与相关疾病 肌肉病/神经肌肉接点 神经康复 神经肿瘤 神经眼科/视觉神经 神经流行病学/健康服务 神经基因学与基因治疗 神经代谢异常/神经毒性 神经学的教学与科研 神经免疫 失眠问题。

David Schaffer是加州大学伯克利分校(University of California, Berkeley)的化学和生物分子工程、生物工程和神经科学教授，在那里他还担任伯克利干细胞中心(Berkeley Stem Cell Center)主任和QB3-Berkeley主任。David实验室致力于了解生物学和探索干细胞的治疗潜力，尝试用组织工程学控制干细胞的能力并用于疾病治疗。他们致力于发现新的信号通路，并解释和实现这些信号的生物网络的计算和实验分析，最终将这些信号整合到生物材料微环境中以实现最优的干细胞控制。多能干细胞的可扩展和分化可以极大地受益于许多生物学应用，包括细胞替代治疗、疾病建模、体外器官形成和药物筛选。David实验室是PerkinElmer高内涵的老用户，自2018年开始，陆续基于PerkinElmer的高内涵系统发表了5篇文章，包括一篇Cell Report，一篇Science Advances。在6月份的推送《就发了5篇SCI！老凡尔赛如何用高内涵阐明神经细胞分化机制（上）》中，我们已经分享了David实验室建立的2D神经分化体系，此次，我们来分享3D神经干细胞研究体系。《High-throughput 3D screening for differentiation of hPSC-derived cell therapy candidates》于2020年8月发表于Science Advanced杂志，该工作系统性的构建了3D神经分化研究方法，建立高通量3D培养平台，用于系统地筛选1200种不同剂量、持续时间、动力学和信号组合的培养条件，寻找能从人多能干细胞(hPSCs)分化出少突胶质细胞祖细胞和中脑多巴胺能神经元的条件并确定关键因子。该研究揭示了以前未被发现的， Wnt、维甲酸和sonic hedgehog信号对细胞分化的复杂作用，这可能揭示了人类中枢神经系统发育中新的关键机制。该研究的发现有助于一些神经类疾病的细胞替代疗法（cell replacement therapies (CRTs)）的优化。首先，少突胶质前体细胞OPC的体外分化过程见上图，在3D培养条件下，要经过复杂的诱导过程，PSC细胞才能够分化成为OPC细胞，而这一过程如何规范化如何可控，正是神经系统类基本细胞替代疗法最关心的问题，作者就针对这一过程展开了筛选。上图为作者筛选体系示意图，该体系将细胞悬浮在3D水凝胶中的微柱芯片压印到含有隔离介质条件的互补微孔芯片上，然后芯片被悬空培养在800nl培养介质的微孔中，经过一段时间的培养，该微流控板直接用PerkinElmer高内涵系统进行成像和分析。这样，在培养基中加入不同成分，就能够筛选不同剂量和时间的组合。作者共筛选了1200个组合培养条件，共计4800个独立样本，同时消耗的试剂体积不到相应96孔板格式的0.2%。这是一个非常高效的筛选体系。接下来，作者进行了各个关键因素多维度的筛选，筛选的表型为各个分化时期OPC的不同标记物，如Olig2、Tuj1、Nkx2.2等，这些标记物的成像和定量都是通过PerkinElmer高内涵系统完成的。这些多维度筛选的关键因素包括：接种细胞密度对早期分化过程的影响RA，SHH和 Wnt三个信号通路的组合效应3种信号通路抑制剂和拮抗剂的组合效应，IWP-2（Wnt通路抑制剂）、GANTT61（SHH通路拮抗剂）、DAPT（Notch通路拮抗剂）RA和SAG处理不同时间的影响之后，作者拟合了广义线性模型，将Olig2、Nxk2.2和Tuj1的表达和共表达与本研究涉及的12个培养参数中的单个输入参数以及它们之间的132个成对相互作用关联起来。并发现，RA是对Olig2和Nkx2.2表达影响最大的参数之一，特别是第0天和第1天和第4天和第10天剂量控制至关重要。此外，该分析确定了两种培养参数（第0-2天高剂量的RA+第4-10天高剂量的SAG，GANT剂量的增加+CHIR持续时间的延长）以协同方式相互作用以促进OPC分化的情况。最后，作者还用该模型筛选了hPSC细胞分化成tyrosine hydroxylase+mDA神经细胞的过程，也找到了该过程的重要调控因素，描述了该过程的可控性操作方法。这部分内容由于篇幅不再展开，感兴趣的同学请阅读原文。综上本文建立了一个很好的3D神经细胞分化研究体系，该体系基于高内涵成像与分析系统，能够在作者设计的微芯片上，同时分析神经细胞分化过程中诸多因子的作用。作者也借助该体系，详细的分析了两种神经细胞分化过程中关键因子是如何作用的，这些发现对于神经系统疾病的细胞替代疗法的过程设计尤其重要。在本文中，PerkinElmer高内涵系统包揽了所有的成像和分析工作，在作者自行设计的微芯片上灵活自如，对各种芯片和孔板有极强的包容性，实在是不可缺少的筛选小助手啊！参考文献Riya Muckom , XiaopingBao, et al, High-throughput 3D screening for differentiation of hPSC-derived cell therapy candidates. Sci Adv. 2020 Aug 7 6(32): eaaz1457.

近日，中国科学院深圳先进技术研究院生物医学与健康工程研究所微纳中心研究员吴天准团队研发出一种普适于神经界面、水氧化及抗生物污染的功能化电极材料。相关研究成果以Platinum Nanocrystal Assisted by Low-Content Iridium for High-Performance Flexible Electrode: Applications on Neural Interface, Water Oxidation and Anti-Microbial Contamination为题在线发表于Advanced Materials Interfaces上，并被选为封面文章。　　近年来，侵入式和植入式器件已广泛应用于人造耳蜗、人造视网膜、深脑刺激器等神经假体，以便治疗和诊断神经疾病。其中神经电极作为连接内部组织与外部设备之间的桥梁，正朝着微型化和集成化的方向发展，这将为临床提供更高的电刺激/记录效率。然而，电极尺寸的大幅度缩小会造成极大的界面阻抗，严重降低了其电荷存储和注入能力等性能，从而限制了其临床应用。基于上述考虑，研究人员在前期工作中已研发出铂、铱纳米修饰材料（Electrochim. Acta, 2017, 237, 152-159 Adv. Mater. Interfaces, 2019, 6, 1900356 ACS Appl. Mater. Interfaces, 2020, 12, 14495-14506 IEEE Sens. J. 2021, 21. 22868-22877），有效改善了神经电极的电学性能和刺激效率。　　在前期基础上，研究人员进一步开发出了具有极大表面积的3D铂纳米枝晶，同时利用极慢速扫描沉积的方法将低含量的氧化铱纳米颗粒（＜3 wt% Ir）较好地附着于铂纳米枝晶结构上。研究结果表明，在微电极表面（电极直径：200 mm）修饰铂纳米枝晶材料后，电化学阻抗相比未修饰电极降低了94%以上，阴极电荷存储能力增大了30倍。继续修饰低含量的氧化铱纳米颗粒，可使上述性能迅速翻倍，这是由于该复合材料表面通过可逆法拉第过程注入电荷时，有相应的氧化还原反应发生，此时电极/组织界面可以容纳更多的电荷。该复合材料修饰的电极在经过1亿多次的连续电脉冲刺激后，氧化铱薄层仍然牢固附着在铂枝晶结构上，电性能无显著下降，稳定性优异。　　此外，铂和铱具有优异的催化性能，常作为析氢反应（HER）和析氧反应（OER）的电催化剂。该团队在前期已通过电沉积手段制备了一种铂纳米材料，在HER中表现出巨大潜力（Chin. Chem. Lett. 2020, 31, 2478）。然而，水的电解效率往往受限于OER的高过电位。基于此，团队将修饰有上述低含量氧化铱的铂纳米枝晶电极用于OER，发现在0.5M H2SO4中仅需150 mV的低过电位，即可达到10 mA×cm-2的电流密度；氧化铱的加入使铂纳米枝晶的Tafel斜率降低了75%（~41 mV×dec-1）。在该电流密度下经过12h的恒电流测试后，电极表面的微观结构和催化性能未发生明显变化，表现出优异的催化稳定性。此外，考虑到微生物粘附引起的生物污染会限制植入器件的服务周期，团队进一步探索了该电极的抗微生物污染能力。研究发现，经培养48h后，大肠杆菌在具有铂铱纳米复合枝晶结构的电极表面覆盖率远远低于平面铂电极，证实了其潜在的抗菌能力。　　上述研究成果有效解决了现有的技术短板，可操作性强，能批量生产，可普适于神经界面、水氧化、抗生物污染等方面，有望广泛应用于神经假体、高效刺激/记录电极、生物传感等柔性生物电子，以及能量存储等实际应用领域。该研究得到了国家自然科学基金、广东省自然科学基金、深圳市科创委等项目的资助。　　论文链接

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，分四期介绍。本期为第三部分内容。5.3. 突触后室突触受体位于突触后室，负责传递来自突触前末端的信号。它包含支架蛋白--负责锚定突触后受体的专门用于信号整合的信号分子。在神经元树突中，从主要树突轴起源并突起的小体积树突棘提供分区功能，并根据突触活动和发育阶段显示大小和形状的动态变化。树突棘是突触长时程增强（LTP）的结构相关物，因此与学习和记忆有关。要想准确观察树突棘的小尺寸、不同形状和动力学，一般要求采用超过衍射极限的分辨率并有可能进行活体成像的光学显微镜方法。第一个将活细胞SMLM应用于原代神经元的研究之一是使用碳菁染料（如Dil）可视化脊髓和丝状足。对于突触后膜结构的可视化，已经发现了一个新的膜标记试剂系列，该系列可实现神经元追踪和树突棘的可视化。最近，通过快速SIM和增强共聚焦显微成像研究了树突棘上微小突起（称为小刺）的动力学。通过将SIM成像与计算方法相结合，进一步评估了树突棘的几何结构，证实凹面对于棘结构稳定的重要性。在树突棘中，F-肌动蛋白高度定位富集在突触后密度区（PSD）和树突棘膜上。肌动蛋白的分子速度升高已让其扩散到除棘尖外整个棘的亚区。为了分析脊髓中肌动蛋白的动力学，我们设计了一种低亲和力的光转换肌动蛋白探针，并利用像差校正光学系统对活体脑切片动力学进行了表征。通过STED显微镜观察对phalloidin-ATTO647N标记的原代神经元，可以在树突棘颈和丝状棘中观察到F-肌动蛋白的周期性片段。同年，STORM成像也显示树突棘颈和丝状棘中存在以肌动蛋白为基础的周期性膜骨架。在树突棘中，分支的F-肌动蛋白在PSD附近聚集，而延伸仅限于指状突起的尖端，并为棘突提供了基础。通过基于监督学习的模式识别进行图像分割，可以对树突肌动蛋白组成异质性做自动分析。用SMLM也对树突F-肌动蛋白进行了同样的分析，并使用树突铂复原电镜进行了验证。使用STED显微镜在活体小鼠脑切片海马CA1神经元上进行延时拍照并结合FRAP及电生理学检查，证明在神经递质释放诱导的长时程增强（LTP)时树突棘颈部具有可塑性（宽度增加并长度减少）。使用正置STED显微镜实现了活体小鼠树突棘动力学的首次超高分辨率成像。在这里Thy1 EYFP小鼠体感皮层中的树突棘在其头部和颈部表现出形态可塑性。另外使用双光子STED成像对活体小鼠的海马树突棘动力学进行了研究，树突棘密度与早期报告相比高出2倍，并能测算几天内的树突棘蛋白周转率（图10）。图10 体内长时程双光子STED成像--海马CA1锥体神经元树突棘蛋白周转。左上图：使用长工作距离物镜的实验方法和CA1锥体神经元的双光子整体图像。右上图：传统的双光子成像与双光子STED成像的比较，显示了总体上更高的棘突密度和更详细的形态，特别是在轴和棘突中。空的箭头标志着常规双光子成像不能显示的棘突，而填充的箭头表示双光子STED报告的棘突数量更多、形态更复杂。底部图像：在海马CA1区基底树突的一个选定区域内，连续几天（第0天、第2天和第4天）成像的树突棘周转。树突棘被连续编号。AB=接近树突的轴突（缩回的棘突用红色标记；新的棘突用绿色标记）。转载自原文参考文献 273。此外，sptPALM揭示了富集在突触棘的突触后激酶CaMKII的空间和动力学亚群，该激酶介导钙依赖性可塑性机制。这些动力学似乎由棘肌动蛋白调节，因为Latrunculin A导致棘内CaMKII扩散显著改变。在PSD内的棘头，一个密集的蛋白质复合物含有不同的突触后支架蛋白，如PSD-95、homer1和shank3，它们排列在大小为∼80纳米的亚突触域中。根据不同的突触类型，PSD-95被动态组织为单个单元或多个纳米簇的形式。STED显微镜揭示了突触后支架蛋白负责将离子受体锚定到突触后膜上，SMLM观察到的活体原代神经元也是一样。在这里，活细胞单分子成像结合定量分析揭示了含有GluA2的AMPA-Rs（优先聚集在突触下的PSD-95簇中）的稳态调节。而PSD-95的uPAINT成像和AMPA-Rs的spt PALM报告在70 nm大小的PSD-95纳米域内平均聚集了20个AMPA-Rs，进一步证实了上面提到的这个发现。AMPA-Rs形成纳米颗粒，并能在几分钟内动态改变其大小和形状。与突触可塑性匹配的是：动态变化是通过突触内和突触外隔室之间的AMPA-Rs在时间维度交换，通过横向扩散来实现的。这些过程通过以微球标记抗体为靶点的内源性受体的单分子追踪实验得到证实。受体运动的类型被认为是布朗扩散，与突触后元件发生短暂的、低亲和力的相互作用。单分子追踪实验中使用Atto 647N修饰的抗体揭示了谷氨酸诱导的脱敏AMPA-Rs的侧向扩散增加导致的短期可塑性。AMPA-Rs的侧向扩散也与突触的短时程增强和长时程增强（分别为STP和LTP）有关。例如，已经证明，为了从突触抑制中恢复，脱敏受体通过侧向扩散被功能受体替换。此外，追踪实验表明，在CaMKII激活诱导LTP后，AMPA-Rs扩散到突触部位。这一过程由钙浓度升高触发，它导致CaMKII介导的stargazin（它与PSD-95一起能够调节AMPA-R的迁移率）磷酸化。进一步的研究报道，AMPA-Rs的交联导致膜上受体制动，它阻止了成功的LTP诱导。这一机制也可能导致由AMPA的致病性抗体介导的自身免疫性CNS疾病的病理生理学。与NMDA-R和mGluR5代谢受体的GluN1亚单位相比，AMPA-Rs的纳米级结构以不同的簇大小为特征。令人惊讶的是，突触前mGluR5受体表现出更均匀的分布，没有聚集行为。通过一种新的基于敲入的基因组编辑方法观察到，代表NMDA-R总库的内源性GluN1亚单位受体被证明聚集在一个由单个受体包围的主要单簇中。在关注NMDA-R细分的NR2A和NR2B亚型时，SMLM表明，在突触发育过程中，这些亚型被分割成纳米结构域，并根据其突触比率进行重塑。关于谷氨酸受体的活动性，单分子追踪实验揭示，神经元活动优先影响AMPA-R的活动性，而NMDA-R的活动是由蛋白激酶C活动触发的，而不是由钾升高触发的。此外，dSTORM成像表明，不同的NR2亚单位定位于不同的纳米结构域，这些纳米结构域在神经元发育过程中表现出灵活性。根据NR2A和NR2B的纳米结构，LTP的表达可以双向调节。kainate受体的单分子追踪实验也表明，突触捕获紧随着突触活性增加后发生。这里，突触激活导致的kainate受体与突触β-连环蛋白/N-钙粘蛋白复合物结合，形成短期可塑性。作为抑制性突触的对应物，gephyrin是将GABAA（GABA-a R）或甘氨酸受体（GlyR）并入突触后膜所必需的关键锚定分子。通过对突触中gephyrin分子的PALM/dSTORM成像发现：抑制性PSD（iPSD）体积为0.01至0.1μm3，并且每个iPSD中有200−250个gephyrin分子。单分子成像进一步揭示了gephyrin分子与受体结合位点的化学计量比约为1:1.96。类似于兴奋性突触，抑制性PSD（IPSD）根据突触活动动态调节其大小。通过NMDA-R激活形成的抑制性突触LTP加剧突触gephyrin积累，从而以CaMKII依赖的方式增加GABA-AR聚集，从而诱导GABA能突触后电流的增强。相反，抑制gephyrin向突触区的募集导致GABA-AR迁移率降低，并阻止iLTP的诱导。iLTP诱导后，gephyrin片段化为纳米结构域。gephyrin的重组降低了抑制性突触后电流的振幅变异性，证明了GABA-AR准确定位对于iLTP的真正表达非常重要。有趣的是，单粒子追踪显示，脱敏的GABA-AR甚至可以通过侧向扩散在并列的GABA能突触之间交换，为控制GABA能电流提供了另一种机制。此外，为了阐明多巴胺能突触的超微结构布局，dSTORM成像将多巴胺转运体映射到胆固醇依赖性纳米结构域，从而为更好地理解多巴胺能神经传递的病理生理过程奠定基础。5.4.亚突触结构域中的跨突触排列早期电生理学实验中已经发现，突触强度取决于突触前融合位点和突触后受体组织之间的空间关系，突触释放由释放位点的数量，突触小泡的释放概率，以及受体提供的突触后基本反应来决定。首先观测到的亚结构域的跨突触组织是突触粘附分子SynCAM 1位于边缘，EphB2位于PSD的中央。SynCam1在PSD中形成突触下云，可被长期抑郁症模式重塑。SMLM观察链霉亲和素的新单体变体（设计用于减少突触区域的交联和空间位阻），表明跨突触伙伴神经肽原1和神经纤维素1ß在突触处扩散受阻，形成相反的簇。这项研究还表明，另一种粘附分子LRRTM2的流动性不如神经肽1，并形成更密集、更稳定的簇。最近揭示了兴奋性突触上活性区的细胞基质和突触后受体支架的跨突触排列，它与提供高保真突触传递的靶向神经递质释放有关。在这里，释放位点定位是通过一种基于融合到突触囊泡蛋白Vglut1的pHluorin标记和RIM1/2纳米簇的超分辨检测的新方法实现的。多色3D定位显微镜显示RIM1/2和突触后PSD-95形成相反的纳米簇。LTP诱导导致PSD-95密度断裂增加，同时增强了纳米柱的排列，而LTD导致突触后柱的紊乱。突触前和突触后关键分子的这种纳米级排列主要由于neuroligin 1。此外，在应用STED显微镜的实时成像实验中，已经报道了树突棘体积增加和排列的纳米模块数量之间的紧密相关性。还报道了抑制性突触的亚突触结构域的纳米级排列。在这里，STED和SIM阐明了gephyrin和GABA-AR突触前亚区域的紧密联系。此外，突触后GABA-A 受体云显示与突触前边缘结构域结合（图11）。在小鼠神经肌肉连接处，带连接褶开口的突触后乙酰胆碱受体和突触前活动区的排列已通过应用SIM成像可视化。图11. 抑制性突触上的突触亚结构域。突触前的RIM元素与突触后的gephyrin支架分子以及抑制性突触的GABA-A R的突触下结构域的排列。PSD的体积和突触下域的数量随着活动相关的突触大小的变化而变化。转载自原文参考文献302。5.5. 三联突触星形胶质细胞是神经传递的基本调节者，神经元突触周围突触前星形细胞突起（PAPs）的吞噬产生了三联突触这一术语。PAPs能够通过传递调节分子来改变和控制突触的传递。通过dSTORM重建星形细胞突起，可以通过标记胶质酸性纤维蛋白（GFAP）和谷氨酰胺合成酶和S100b的成像来实现星形细胞的纳米级可视化。最近的一份报告应用ExM来观察脑片中突触周围的星形胶质细胞谷氨酸转运体显示，在与这些棘附近的GLT-1水平较高有关的较大的神经元树突棘中，谷氨酸的摄取效率降低（图12）。图12. 海马大脑切片中CA 1锥体神经元周围的星形细胞突起。锥体神经元的树突在Thy1-YFP小鼠系标记（绿色）；星形胶质细胞则是在海马脑片上的GLT-1免疫染色显示（红色）。蓝色信号代表树突区和星形细胞突起的共同定位。更高的放大率插图见右图。左下：大棘和小棘的分类。底部中间和右侧：GLT-1和神经元YFP的共定位像素的量化。请注意右图树突棘体积归一化后的变化；红点表示平均数和SEM，p = 0.0220 (绝对GLT-1覆盖率），p = 0.00223（相对GLT-1覆盖率）。转载自原文参考文献307。EM和STORM发现，PAPs也配备了局部翻译位点，以避免星形细胞体细胞中合成的蛋白质的长距离运输路线。最近在器官型切片中进行的3D STED显微镜研究揭示了星形细胞钙信号的结构前提。在星形细胞内检测到了海绵状结构，它包含了接近突触部位的节点和轴。钙离子瞬变的共聚焦成像与星形细胞结构的STED显微镜相结合，显示自发的钙离子瞬变紧密地映射到这些结点。因此，这些结点被认为是类似于树突棘的空间分隔作用。胶质传导物质的外渗需要提供胶质囊泡。通过将电容测量与葡聚糖摄取后星形胶质细胞内的囊泡的SIM图像相关联，发现了外吞和内吞之间的Dynamin依赖性膜中间物。通过STED显微镜和SIM分析单个胶质小泡的特征，在星形胶质细胞中有两个小泡群，其大小和融合能力不同。Phluorin实验结合SIM确定星形胶质细胞囊泡上Syb2分子的拷贝数为25∼。此外，应用STED和TIRF显微镜对培养的星形胶质细胞中的VAMP3阳性囊泡进行了单囊水平的分析。测量结果显示VAMP3覆盖的囊泡大小约为80纳米，并提供证据表明这些囊泡参与了钙依赖性的囊泡循环。SIM成像还可以发现，突触蛋白中一种已知的参与神经元外排的v-SNARE蛋白，也普遍存在并组织在单个星形胶质细胞的囊泡上，以实现高效的外排。星形胶质细胞还通过回收proBDNF到BDNF参与促进兴奋性LTP。这里，SIM成像显示，proBDNF在体细胞区域位于囊泡大小的集群中，而沿星形胶质细胞末梢的点状模式占主导地位，以扩大BDNF对记忆的作用。为了最大限度地减少激发光的散射，通过应用被动CLARITY进行组织透明化和多光子显微镜，改善了组织深处的星形细胞成像。通过使用SiR-actin和SiR-tublulin探针的STED显微镜和原子力显微镜（AFM）的相关方法来测量膜的拓扑结构和硬度，将星形细胞的细胞骨架和膜的生物物理特性联系起来。（未完待续）本文由超高显微技术应用工程师郭连峰、黄梓彤编译（受篇幅限制，未将参考文献列出）相关阅读：超高分辨率显微技术在神经科学中的应用（一）超高分辨率显微技术在神经科学中的应用（二）

新型芯片复制神经肌肉接头有助于为神经肌病测试药物麻省理工学院（MIT）工程师们开发出一种复制神经肌肉接头（神经和肌肉之间至关重要的连接）的微流控设备（microfluidic device）。该设备约有25美分硬币大小，包含单个肌条和一小组运动神经元。研究人员能够在逼真（现实）的三维基质中影响和观察两者之间的相互作用。研究人员对该设备中的神经元进行基因改造，使其对光照做出反应。通过将光照之间投射到（这些）神经元上，他们能够精确刺激这些细胞，发送信号激发肌肉纤维。研究人员还测量了设备内肌肉在被激发后抽搐或收缩的力量。该研究结果2016年8月3日在线发表于《Science Advances》期刊，可能帮助科学家们理解并识别药物以治疗肌萎缩侧索硬化（ALS，即卢伽雷氏症）和其他神经肌肉相关疾病。“神经肌肉接头涉及许多失能性疾病，其中有些是残酷而致命的，还有很多尚未被发现”领导该研究的MIT机械工程系研究生Sebastien Uzel说，“我们希望能够在体外形成神经肌肉接头，从而帮助我们理解某些疾病活动”。Sebastien Uzel现在是哈佛大学Wyss研究所博士后。自1970年代以来，科学家们已经提出了大量方法在实验室中模拟神经肌肉接头。大部分这些实验涉及在培养皿或小玻璃基板上生长肌肉和神经细胞。但这样的环境与（动物）体内状态相去甚远，在动物体内，肌肉和神经细胞存活于复杂的三维环境中，并且通常距离较远。“想想长颈鹿”Uzel说，“脊髓神经元所发出的轴突需要跨越非常大的距离才能与腿部肌肉连接。”为了在体外重建更逼真的神经肌肉接头，Uzel和同事们构造了一种微流控设备，该设备具有两个重要特性：1. 三维环境；2. 隔离肌肉和神经的隔间，从而模拟两者在人体内的自然分离状态。研究人员将肌肉和神经元细胞悬浮于隔间中，然后充满凝胶以模拟三维环境。为了生长肌肉纤维，研究团队使用了获得自小鼠的肌肉前体细胞，随后将其分化成肌肉细胞。他们将细胞注入微流控隔间，细胞会在隔间内生长并融合形成单个肌条。同样的，他们从干细胞分化出运动神经元，然后将所获得的神经细胞聚合体放置在第二个隔间中。在分化两种细胞之前，研究人员使用光遗传学（optogenetics）技术对神经细胞进行了基因改造。该研究共同作者、MIT机械和生物工程Cecil and Ida Green特聘教授Roger Kamm说：光“能够让你精确控制你想要激活的细胞”。在这样的狭小空间里，电极无法实现这一点。最后，研究人员为该设备添加了另一个特性：力传感。为了测量肌肉收缩，他们在肌肉细胞隔间内构造了两个微小的弹性支柱，位于肌肉纤维周围并能够被生长的肌肉纤维所包裹。随着肌肉收缩，支柱会被挤压在一起，形成位移，研究人员能够测量这些位移并转换为机械力。在测试该设备的实验中，Uzel和同事们首次观察到神经元在三维区域内向肌肉纤维伸展轴突。在观察到轴突建立连接时，他们用微小的蓝光激射刺激神经元，并立即观察到肌肉收缩。“发射闪光，就能观察到抽搐”Kamm说道。根据这些实验，Kamm说，这种微流控设备可能作为神经肌病药物测试卓有成效的试验场，甚至可以根据个体患者进行定制。“你可能从ALS患者获得多能细胞，将它们分化成肌肉和神经细胞，并且为特定患者制造整个系统”Kamm说，“然后你能够根据需要多次复制，同时测试不同的药物或疗法的组合，查看哪种疗法能够最有效地改善神经和肌肉之间的连接。”另一方面，他说，该设备在“建模操作协议（modeling exercise protocols）”中可能是有用的。例如，通过以不同的频率刺激肌肉纤维，科学家们能够研究重复压力如何影响肌肉的性能。“现在，随着所有这些新型微流控方法的开发，你能够开始建立神经元和肌肉的更复杂的模型”Kamm说，“神经肌肉接头是另一个现在可以被纳入测试模式的单位”。