免疫细胞

在细胞治疗过程中，评价免疫细胞的增殖能力，以其对靶细胞的杀伤能力是细胞治疗过程中非常关键的环节。其中DELFIA® EuTDA细胞毒法和DELFIA® BrdU细胞增殖方法，凭借其高灵敏度、易操作性性等诸多优势，已逐渐成为主流的检测技术。在此，通过以下一系列的应用案例，我们将向大家展示DELFIA® EuTDA、DELFIA® BrdU、活体影像及放射性检测等方法如何助力免疫细胞杀伤研究。 一，CAR-T细胞杀伤毫无疑问，CAR-T疗法已成为当下最火的肿瘤细胞疗法之一。同样作为CAR-T大国，中国多数CAR-T疗法已进入临床研究，并且产业化发展迅速，而美国则还集中在临床前研发[1]。安全性是CAR-T疗法的一大挑战。除了细胞因子风暴外，CAR-T疗法还会诱发移植物抗宿主反应 （graft versus host disease GVHD）等安全隐患。鉴于选择性去除CD45RA阳性细胞能有效抑制GVHD发生[2]，研究利用CD45RA阴性T细胞群体开展靶向CD19的 CAR-T疗法，来提高治疗安全性。结合DELFIA的细胞杀伤检测法和基于Calcein-AM标记的流式法，研究证明CD45RA阴性 CAR-T细胞能有效杀伤CD19阳性肿瘤细胞系，并能作用于原代NK细胞杀伤耐受的MLL重排白血病原始细胞SJ4-11（K562为敏感细胞对照，RS4 11为耐受细胞对照）[3]。由于CD45RA-细胞主要为CD3+CD45O+记忆T细胞，因此针对常见的病原体和疫苗应有更好的回忆应答（Recall response）。通过使用DELFIA Cell Proliferation Assay 检测掺入的BrdU，研究确认CD45RA- T细胞对人CMV、Epstein–Barr 病毒、 herpes simplex 病毒和tetanustoxoid有更为显著的免疫反应（下图a，增殖指标）。基于同样的增殖检测平台，研究利用PBMC开展Mixed lymphocyte reaction (MLR)，对比不同细胞亚群的同种异体反应。相较于CDRA-效应细胞群体，CD45RA+细胞在MLR实验中具有更高的增殖能力（下图b）和IFN-γ分泌能力（下图c）[3]。 进一步的体内实验研究继续利用了PerkinElmer IVIS活体成像平台，在白血病小鼠模型的基础上，研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法在不诱导GVHD的同时，发挥强效的抗癌效果[3]。借助活体成像的优势，研究追踪CD19+ SEM细胞在小鼠体内的扩增情况，确认在接种18天后肿瘤的信号强度足以模拟顽固性白血病小鼠模型。在此模型的基础上CD45RA-的 CAR-T疗法同样能迅速发挥作用，两周内强力抑制生物发光信号至检测限以下。最后，基于同样的检测平台结合重复接种肿瘤细胞，研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法还能作用于复发白血病小鼠模型。 二，CAR-NK细胞杀伤CAR-T细胞疗法的成功和兴起也推动了其他类型的CAR研究，其中就包括针对实体瘤的CAR-NK疗法。相较于T细胞，NK细胞可以在没有抗体和MHC的帮助下靶向疾病细胞，因此能发动更为快速的免疫反应并能有效针对无MHC I表达的肿瘤细胞。同时, NK细胞更为安全，支持“Off-the-Shelf”的大规模生产和直接异体治疗。目前在国内已有多家医疗企业推动CAR-NK治疗，如博生吉的CD7 CAR-NK。在6月份的Molecular Therapy期刊上，广州医科大学附属第三医院的研究向我们展示了最新的CAR-NK临床应用。为了特异靶向肿瘤细胞表面抗原NKG2DLs，研究在NKG2D受体的胞外结构域基础上融合参与NK细胞活化的核心分子DAP12，并进一步通过RNA转染途径提升CAR-NK安全性。基于DELFIA的细胞杀伤检测法，研究证明NKG2D-DAP12 (NKG2Dp)能有效的裂解多种肿瘤细胞系，优于对照NK和NKG2D-CD3z(NKG2Dz)[4]。借助Perkinelmer提供的HCT116-luc报告细胞系，研究通过活体成像方法，在体内水平证明CAR-NK能有效控制肿瘤发展。进一步的临床研究证明CAR-NK的引入能迅速引起肿瘤退缩和肿瘤细胞减少，强调NKG2D CAR是一种很有前景的细胞治疗方案[4]。 三，T细胞杀伤T细胞不仅是免疫系统的核心成员，也是适应性免疫反应的基石。因此，T细胞功能的全面评价在肿瘤免疫疗法的开发过程中至关重要，其中就包括肿瘤疫苗的研发。早期基于经典肿瘤相关抗原gp100的研究证明细胞因子RANTES的引入能显著提升小鼠脾脏细胞的杀伤能力。同时，RANTES表达的时间点非常关键。疫苗引入前12和24小时表达RANTES能有效提升T细胞的杀伤能力，而48小时则没有这个现象。基于动物实验，研究推测多种细胞参与杀伤，包括CD8+，NK细胞和CD4+细胞群体。进一步基于DELFIA细胞毒法研究证明TRAIL和FasL参与了杀伤过程[5]。 除了传统T细胞杀伤外，DELFIA细胞毒法还可以被用于检测靶向T细胞的新型免疫治疗分子，如双特异抗体(BiTE)等的细胞杀伤功能[6]。 四，NK细胞杀伤鉴于NK细胞在天然免疫系统的重要性，其活力检测也是免疫检查点抑制剂研发过程中的核心项目。此外，NK细胞活力检测还可以用于衡量用于免疫疗法开发的新型小鼠模型。在2016年发表的一份研究中，基于DELFIA的细胞杀伤检测法证明PD-1抗体可以显著提升NOG-MHC Double Knockout小鼠脾中NK细胞靶向K562的杀伤活力。靶向免疫治疗的新小鼠模型不仅能加速新型免疫检查点药物（组合）研发，同时可以协助发现新的标志物预测疗效[7]。 除了直接杀伤靶细胞外，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）也是评价NK细胞功能的一个关键指标。在今年的一份研究中，DELFIA细胞毒法被用于衡量静脉注射免疫球蛋白( intravenous immunoglobulin, IVIG)对NK细胞功能的影响。从结果可以看出，除了阻断NK细胞的直接杀伤能力外，IVIG几乎完全抑制ADCC活力（下图上）[8]。在该研究中，除了ADCC检测外，Perkinelmer的放射检测解决方案（3 [H]-Thymidine和MicroBeta 2）也被用于衡量IVIG和免疫抑制药物对NK细胞增殖的影响。H3-掺入法证明相较于IVIG，免疫抑制药物能有效抑制NK细胞增殖（下图下），而IVIG则特异作用于T细胞活力。鉴于ADCC是单抗药物发挥临床效果的核心机制之一，其活力检测也成为大分子药物研发的必须环节[9]。 欢迎扫码登录珀金埃尔默生命科学试剂耗材平台，点击进入car-t细胞治疗应用专题关注二维码：进入试剂耗材平台：参考资料：[1] Jia Xin Yu, et al. The global pipeline of cell therapies for cancer. https://www.nature.com/articles/d41573-019-00090-z[2] Triplett BM, et al. Rapid Memory T-cell Reconstitution Recapitulating CD45RA-depleted Haploidentical Transplant Graft Content in Patients with Hematologic Malignancies. Bone Marrow Transplant. 2015 Jul 50(7): 968–977.[3] Chan WK, et al. Chimeric antigen receptor-redirected CD45RA-negative T cells have potent antileukemia and pathogen memory responsewithout graft-versus-host activity. Leukemia. 2015 Feb 29(2):387-95.[4] Xiao L, et al. Adoptive Transfer of NKG2D CAR mRNA-Engineered Natural Killer Cells in Colorectal Cancer Patients. Mol Ther. 2019 Jun 5 27(6):1114-1125.[5] Aravindaram K, et al. Transgenic expression of human gp100 and RANTES at specific time points for suppression of melanoma. Gene Ther. 2009 Nov 16(11):1329-39.[6] Lewis SM, et al. Generation of bispecific igG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat Biotechnol. 2014 Feb 32(2):191-8.[7] Ashizawa T, et al. Antitumor Effect of Programmed Death-1 (PD-1) Blockade in Humanized the NOG-MHC Double Knockout Mouse. Clin Cancer Res. 2017 Jan 1 23(1):149-158.[8] Pradier A, et al. Small-Molecule Immunosuppressive Drugs and Therapeutic Immunoglobulins Differentially Inhibit NK Cell Effector Functions in vitro. Front Immunol. 2019 Mar 27 10:556. [9] DELFIA经典技术应用于单抗研发及细胞治疗——AD0116细胞杀伤专题之ADCC https://mp.weixin.qq.com/s/0lkBdDHL5MFIyoeoFV4wWQ关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)导致的新冠肺炎（COVID-19）自2019年至今仍然在全球蔓延，其变异株Omicron由于高传播率目前已取代其它毒株成为全球新冠的主要流行毒株。各国已采取大规模疫苗接种，通过其产生的中和抗体和抗病毒T细胞来缓解和对抗新冠肺炎。有研究报道，病毒特异性T细胞在病毒清除（即SARS-CoV-1感染后17年）和在抗体滴度减弱的COVID-19患者中检测到SARS-CoV-2特异性T细胞会持续很长时间。因此需要充分了解新冠肺炎中T细胞免疫过程，对疫苗开发和免疫治疗具有重要意义。COVID-19患者中的T细胞免疫反应T细胞免疫反应是高度特异性的，在引发有效的抗病毒反应方面具有不可或缺的作用。在SARS-CoV-2感染的早期阶段，树突状细胞(DC)和巨噬细胞可以吞噬病毒感染的细胞，通过抗原呈递启动T细胞反应。随后，CD4+T细胞刺激B细胞产生病毒特异性抗体，细胞毒性CD8+T细胞靶向病毒感染的细胞。有研究报道，SARS-CoV-2特异性CD4+和CD8+T细胞在COVID-19症状发作后的前2周内的外周血中很明显。大多数SARS-CoV-2特异性CD4+T细胞表现出中枢记忆表型，主要产生Th1细胞因子，而CD8+T细胞具有更高水平的穿孔素表达的效应表型。另外有研究报道COVID-19患者T细胞活化的异质性，并提供证据表明CD4+和CD8+T细胞都能够产生有效的免疫反应，并出现受损或过度的T细胞反应。轻度COVID-19患者的T细胞升高，产生强大的抗病毒免疫反应。特别是CD8+T细胞表达更高水平的细胞毒性分子，例如颗粒酶A和FAS配体，它们有利于消除病毒感染的细胞。然而，在严重疾病病例中，CTL（Cytotoxic T cells，细胞毒性T细胞）比例减少，同时幼稚和中枢记忆CD8+T细胞的百分比也均较低。此外，与健康对照组相比，COVID-19患者的终末分化效应CD4+和CD8+T细胞的百分比更高。且重症COVID-19患者的调节性T细胞(Tregs)水平低于轻症患者。总之，T细胞亚群（包括Treg、Th1、幼稚和记忆T细胞）平衡中的这些失调可能导致严重的炎症状况，并可能导致COVID-19复发。尽管由CD4+和CD8+T细胞介导的早期抗病毒反应最有可能具有保护作用，但SARS-CoV-2有效的先天免疫逃避能力使T细胞难以通过限制I型和III型干扰素反应来产生有效的抗病毒反应。COVID-19恢复期患者和健康人中的T细胞免疫反应恢复康复患者的T细胞计数可以为T细胞在抗病毒反应中的作用提供重要参考。有研究报道，超过70%的COVID-19恢复期患者存在SARS-CoV-2特异性T细胞。100% CD4+T细胞和70% CD8+T细胞在康复患者中具有SARS-CoV-2 Spike特异性反应。功能测定证实CD4+T细胞表现为Th1表型并产生大量IFN-γ，和针对S蛋白较低水平的IL-4、IL-13、IL-5或IL-17A。同样，大多数SARS-CoV-2刺突特异性CD8+T细胞产生IFN-γ，绝大多数IFN-γ+CD8+T细胞也共表达颗粒酶B和肿瘤坏死因子α (TNFα)。这些数据表明，康复患者中的大多数CD4+和CD8+T细胞产生了针对S蛋白的大量抗病毒免疫反应，说明功能性T细胞在病毒清除和恢复中的重要性。此外，这些数据也说明利用SARS-CoV-2的S蛋白作为疫苗生产关键候选者的重要性。T细胞反应在无症状和未接触过的个体中观察到的T细胞反应最低。但是即使没有并发的体液反应，无症状/轻度恢复期的COVID-19患者也可以产生强大而持久的记忆T细胞反应来预防复发性感染。有研究报道，与有症状的个体相比，无症状患者的免疫反应较弱，并且相当一部分有症状的患者在恢复期早期表现出中和抗体量减少。COVID-19恢复期患者在出院后2周内也显示出与针对人ACE2的中和抗体滴度和病毒特异性T细胞计数的强相关性。细胞因子风暴细胞因子风暴是指在各种病理条件下检测到的大量促炎细胞因子和趋化因子，是在SARS-CoV-2感染患者中观察到的关键病理特征之一。在重症COVID-19患者中记录到高细胞因子水平。各种免疫细胞类型，包括巨噬细胞、中性粒细胞、DC，以及NK、B和T细胞，可导致COVID-19患者的细胞因子风暴和炎症反应的过度激活状态。由先天免疫细胞释放的TNFα、IL-6和IL-1β可能是SARS-CoV-2感染晚期患者发生细胞因子释放综合征和严重全身炎症反应的主要驱动力之一，其中一些可能是导致这些患者淋巴细胞减少或Th1反应不足的潜在机制之一。另据报道，在COVID-19重症病例中，血清TNFα和IL-6水平升高与总T细胞计数呈负相关，表明这些细胞因子可能参与淋巴细胞减少和T细胞丢失。相反，处于恢复期的患者上述细胞因子的血清水平显著降低，并显示T细胞计数恢复。鉴于这些发现，有人提出IL-6阻滞剂，如sarilumab、siltuximab和tocilizumab，以及IL-1β受体阻滞剂用于治疗重症COVID-19患者以解决过度炎症和控制炎症的传播。趋化因子和细胞因子水平升高，例如CCL2/3/5、CXCL8/9/10和IFN-γ、TNFα、IL-1β、IL-1RA、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12 、IL-33、粒细胞/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（G-CSF和GM-CSF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）和血小板衍生生长因子亚基B（PDGFB），促进其它白细胞向组织的募集，导致组织损伤。基于T细胞反应的疫苗研究SARS-CoV-2完整基因组的快速可用性可用于开发多种疫苗，使其在刺激幼稚T细胞后产生效应和记忆T细胞，发挥免疫保护。成功的SARS-CoV-2疫苗应该产生对有效免疫反应具有高度特异性的SARS-CoV-2反应性T细胞，而不会产生炎症或疾病开始的不良影响。SARS-CoV-2的蛋白被确定为最适合疫苗开发的靶标，以触发病毒特异性T细胞反应和体液免疫反应。表达S蛋白的腺病毒病毒载体疫苗，即5型腺病毒(Ad5-nCoV)，在健康个体(NCT04313127)中检测其疫苗的安全性和耐受性，观察到2周后成功产生特异性抗病毒T细胞和体液免疫反应。Moderna开发了基于mRNA的疫苗，编码SARS-CoV-2抗原（S蛋白），通过脂质体递送系统给药。因mRNA疫苗可以模拟天然病毒感染，并仅编码抗原蛋白并且不能整合到宿主染色体中。因此，基于mRNA的疫苗更能发挥细胞免疫和体液免疫。T细胞免疫检测---细胞因子释放检测（CRA）疫苗中的抗体测试是常规进行的，但因为特异性病原体的T细胞在血液中存在的总T细胞（通常小于1-3%）中只占很小的一部分，需要在从全血中纯化的细胞中进行。而这些检测都需要复杂的设备和高度专业化的人员，这可能不是每个常规实验室都可以使用的。杜克-新加坡国立大学Antonio Bertoletti教授团队采用了一种快速和简单的替代方法，即基于Ella微流控ELISA技术的全血细胞因子释放测定(Cytokine release assay, CRA)实验：直接将刺激性抗原或肽添加到全血中，导致血浆中细胞因子（通常是IFN-γ）的分泌，然后进行定量。该检测方法通过简单地将Spike肽库添加到全血中，可以轻松快速地检测和相对定量接种疫苗个体中的Spike特异性T细胞反应。此方法检测时间比常规方法缩减了7个小时，总时间缩短了12个小时。总结因T细胞免疫反应在疾病的早期阶段表现出保护作用，也可能导致致命症的发生，因此COVID-19的治疗和预防中需要深入地了解疾病过程中的免疫反应。特别是在症状轻微的患者中阻断促炎细胞因子的早期治疗干预可能会产生有害影响，并导致免疫反应不足和病毒清除受损。在危重COVID-19患者中恢复T细胞耗竭和改善过度炎症反应的晚期治疗干预可能具有更好的临床结果。在疫苗开发中，也要充分考虑其是否可以增强抗病毒免疫和特定T细胞反应从而加强疫苗保护的持久性。参考文献Robust T Cell Immunity in ConvalescentIndividuals with Asymptomatic or Mild COVID‐19.Highly functional virus‐specific cellular immune response in asymptomatic SARS-CoV‐2 infection.T‐cell responses and therapies against SARS‐CoV‐2 infection.Rapid determination of the wide dynamicrange of SARS‐CoV‐2 Spike T cell responses in whole blood of vaccinated andnaturally infected.T cell immunity to SARS-CoV-2 followingnatural infection and vaccination.关于我们ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室 电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com

CAR-T细胞免疫治疗技术自2017年10月，美国政府批准第二种基于改造患者自身免疫细胞的疗法以来，在治疗癌症方面效果显著。CAR-T治疗全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，指的是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。CAR-T技术已经出现了很多年，基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞，但是不同的是，这是一种细胞疗法，而不是一种药。CAR-T治疗的机理，我们进行简单的介绍。人体内有一系列的细胞，构成了人体内免疫系统，包括产生抗体的B细胞，吞噬异物的巨噬细胞，直接杀灭有害病毒或有害细胞的T细胞等，其中T细胞，也叫T淋巴细胞。T细胞如同一支守护健康的卫队在人体内巡逻，遇到对人体健康不利的病毒，细胞等就会进行消灭和清除。癌细胞有着很好的伪装能力，伪装成人体正常细胞。T细胞会将这些癌症细胞认为是人体自身健康细胞，并不对齐其进行攻击。科学家从病人体内取出一定数量的T细胞，对T细胞的抗原受体进行修饰，经过修饰的T细胞，能够识别特定的癌细胞。科学家对经过修饰的T细胞，在体外通过仪器设备进行扩大培养。大量培养经过修饰后的T细胞，再注入病人体内。注入病人体内的经过修饰和扩大培养的T细胞，相当于给人体提供了一支可以识别并杀死癌细胞的T细胞军队。这些强化后的T细胞卫队在体内巡逻，癌症细胞的伪装在这些强化后的T细胞面前失去作用。T细胞会像杀死普通入侵异物一样，将癌症细胞杀死并清除，从而达到治愈癌症的疗效。INFORS的细胞培养专用摇床、细胞生物反应器，WIGGENS二氧化碳振荡培养箱，广泛用于CAR-T细胞免疫治疗领域。在业内获得了客户极高的评价，为医疗健康领域做出了应有贡献。 INFORS的细胞培养专用摇床WIGGENS二氧化碳振荡培养箱

p 　　华中科技大学科研团队揭示了肿瘤微环境中肿瘤细胞与免疫细胞相互调节机制。《临床研究杂志》近日在线发表了该成果。 /p p 　　近年来，随着肿瘤免疫治疗，特别是Car-T细胞免疫治疗技术和免疫节点治疗在临床上的成功，深入研究肿瘤微环境对免疫细胞功能的调节机制具有重要的基础研究意义。 /p p 　　华中科技大学基础医学院免疫学系杨想平团队的研究发现，在小鼠模型中，皮下移植的肿瘤细胞在小鼠中生长更快，尾静脉注射的肺腺癌肿瘤细胞向肺转移结节在小鼠中明显增多，血管增多，巨噬细胞向促肿瘤表型极化增强。 /p p 　　杨想平团队和病理系王国平团队合作发现，在人的临床肺腺癌患者组织中，肿瘤细胞能通过其代谢产物调控巨噬细胞囊泡水解酶表达，从而使肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤微环境中编程重组为促进肿瘤生长的免疫细胞。 /p p 　　该研究还发现囊泡水解酶表达高低可作为肺腺癌重要的预后标志，因此具有重要的临床意义。 /p p /p

课程主题：【小贝开讲】免疫细胞和功能介绍课程时间：2021-3-23 14:00课程简介：免疫系统在抗肿瘤、抗感染中发挥着决定性的作用，其中各免疫细胞为发挥作用的主体部分，本次课程主要介绍免疫系统中的各群免疫细胞及功能，流式细胞术作为细胞研究中必不可少的检测手段，在感染后的机制研究以及指导治疗方面有重要的应用价值。陈丽容 贝克曼库尔特生命科学高级流式技术专家，从事流式产品应用及临床项目工作已十余年。主要负责广东、广西等地区各医院临床项目的技术支持、推广以及流式检测术结果判读指导，对于流式在白血病/淋巴瘤免疫分型，微小残留监测，机体免疫功能监测等临床工作具备丰富的经验。

分享：基因编辑技术能否有助于将细胞疗法用于治疗实体瘤？珀金埃尔默旗下Horizon Discovery的乔纳森弗兰普顿 (Jonathan Frampton) 在给Laboratory News的一篇撰文中，介绍了如何利用碱基编辑技术来降低当前昂贵的治疗成本，使其成为治疗癌症的主流方法。开发同种异体细胞疗法还需解决一些挑战，包括如何避免破坏患者的免疫系统。目前有两种有效的细胞疗法能治疗“液体肿瘤”（白血病和淋巴瘤）。诺华研发的Kymriah和吉利德科学研发的Yescarta两种药物使用的细胞均属于嵌合抗原受体(CAR) T细胞——两者最初均表现出高反应率，这种高反应率会在部分患者中形成持久的临床反应。虽然这些疗法的前期效果良好，但如何让下一代细胞疗法能够有效治疗实体瘤，仍面临不少问题。2019年，美国新增约176,000名液体肿瘤患者，而实体瘤新增患者约为160万（几乎增长10倍）。此外，由于Kymriah和Yescarta 均属于自体疗法（使用患者体内的细胞用于药物生产），这种个体的治疗成本很高，分别为475,000美元（Kymriah）和373,000美元（Yescarta），这远远超出了大众可以承受的医疗预算范围。相比之下，如使用一般抗癌药物，患者每月的花费约为10,000 美元。这种情况下，需要作出哪些改变，才能让细胞疗法成为治疗癌症的主要方法呢？基因编辑技术—能否将细胞疗法用于治疗实体瘤？尽管细胞疗法是一种复杂的癌症治疗形式，但它可以直接靶向液体肿瘤。细胞疗法可以通过血液进入白血病和淋巴瘤细胞，从而不需要靶向特定的组织或器官，也无需在杂乱无章的毛细血管网络中进行导航以及长时间驻留在免疫抑制和缺氧的实体瘤微环境中。人们普遍认为，需要进一步完善细胞疗法才能应对和克服这些挑战，从而提高患者的生存率。 避免出现脱靶染色体易位要增加存活率、增殖率和持久性，需要精确调节治疗细胞，这可能涉及对多个基因进行编辑。虽然普遍使用的基因编辑器CRISPR-Cas 在改变单个遗传信息时具有很强的稳健性，但这一过程会使得DNA双链产生断裂 (DSB) ，导致细胞出现脱靶染色体易位。借助单编辑或双编辑技术，在正确的指引和谨慎使用下，就很少会出现遗传信息的改变；不过，如需要编辑多个基因，产生染色体易位和其他遗传畸变的风险就会增加，这种风险可能会引起致癌细胞的产生，对于患者来说这无疑是一种潜在的灾难。在需要对一个或两个基因进行编辑，如果可以精确地识别出用于患者治疗的已编辑过细胞，就可避免易位现象。然而，当需要编辑的细胞较多时，很难精确识别已编辑细胞，进而导致致癌易位风险的增加。碱基编辑器：避免出现双链断裂碱基编辑作为基因编辑领域一项相对较新的技术，正在受到人们的关注。碱基编辑器可以在不使用核酸酶来导入DNA 双链断裂的情况下，持续高效地在原代细胞中进行基因编辑。利用碱基编辑在DNA中形成一个缺口（或单链断裂）并借助脱氨酶改变特定的碱基对，这样就可以通过在早期编码外显子中引入终止密码子来实现高效的基因敲除。未来几年，碱基编辑会对细胞疗法的发展产生更明显的影响，尤其是对同种异体细胞、非自体细胞治疗的发展的影响。通用型同种异体细胞疗法？借助同种异体细胞疗法，可以将健康供体转换为通用型治疗细胞，可以大规模生产治疗细胞并集中储存，在治疗需要时可以随时获取。但要开发同种异体细胞疗法会面临一些挑战，包括如何才能避免破坏患者的免疫系统。为了克服这个问题，就必须改造现行的同种异体细胞疗法，使其具有隐身模式，在这种模式下，患者的免疫系统将它视为“自我”的一部分。要开发出这样的细胞，需要修改多个基因，而且这些基因很可能会被敲除。碱基编辑器将在编辑多个基因方面发挥关键作用，这样能够在不使用免疫抑制药物的情况下，延长同种异体治疗细胞在患者体内的存活时间。同种异体细胞疗法的供应链简单、易大规模生产，成本上比自体细胞疗法更低。相关医疗经济研究结果表明，如果能够实现规模经济，同种异体细胞疗法的费用可以降到每剂7500美元，毫无疑问这将有助于进一步推广细胞疗法，使其成为主流疗法。推广细胞疗法持久临床反应的高效细胞疗法是另一个可以实现的目标。它需要将免疫细胞的疗法在治疗液体肿瘤中的成功经验转应用于治疗实体瘤，它需要修改免疫细胞，使其能够适应更为复杂的实体瘤微环境，同时降低此类疗法的成本。这两个目标都可以通过应用高效的基因编辑技术开发同种异体细胞疗法来实现。目前人们正利用CRISPR-Cas进行细胞开发，随着安全性不断提高，未来的同种异体细胞疗法利用碱基编辑器来改变基因信息，将为真正的细胞疗法治疗肿瘤带来雨霖。作者: Jonathan Frampton，珀金埃尔默旗下Horizon Discovery业务发展合伙人（Corporate Development Partner）

就像外来非洲杀人蜂(Africanized honey bees)，工蜂像大多数肿瘤细胞，而蜂王是癌症干细胞。蜂王可以重新再生整个杀人蜂群体，但其生存依赖蜂王浆。如果去除蜂王浆，蜂王死亡和整个杀人蜂群也会被杀死，而研究发现Th22源性IL-22就是蜂王浆。HZA007Po ELISA Kit for Angiogenin (ANG) 猪血管生长素(ANG)检测试剂盒 HZA147Po ELISA Kit for Adiponectin Receptor 1 (ADIPOR1) 猪脂联素受体1(ADIPOR1)检测试剂盒 HZA153Po ELISA Kit for Alpha-Fetoprotein (aFP) 猪甲胎蛋白(αFP)检测试剂盒 HZA062Po ELISA Kit for Interleukin 16 (IL16) 猪白介素16(IL16)检测试剂盒 HZB650Po ELISA Kit for Major Basic Protein (MBP) 猪主要碱性蛋白(MBP)检测试剂盒 HZA225Po ELISA Kit for Atrial Natriuretic Peptide (ANP) 猪心钠肽(ANP)检测试剂盒 HZA172Po ELISA Kit for Platelet Factor 4 (PF4) 猪血小板因子4(PF4)检测试剂盒 HZA164Po ELISA Kit for Ubiquitin (Ub) 猪泛素(Ub)检测试剂盒 HZA164Si ELISA Kit for Ubiquitin (Ub) 猴泛素(Ub)检测试剂盒 CEA968Po ELISA Kit for Aprotinin (AP) 猪抑肽酶(AP)检测试剂盒 HZA263Po ELISA Kit for Creatine Kinase, Mitochondrial 1A (CKMT1A) 猪线粒体肌酸激酶1A(CKMT1A)检测试剂盒 HZA083Po ELISA Kit for Leptin Receptor (LEPR) 猪瘦素受体(LEPR)检测试剂盒 HZA085Po ELISA Kit for Leukemia Inhibitory Factor (LIF) 猪白血病抑制因子(LIF)检测试剂盒 HZA088Po ELISA Kit for Monocyte Chemotactic Protein 2 (MCP2) 猪单核细胞趋化蛋白2(MCP2)检测试剂盒 HZA267Po ELISA Kit for Cathepsin K (CTSK) 猪组织蛋白酶K(CTSK)检测试剂盒 HZA274Po ELISA Kit for Insulin Like Growth Factor Binding Protein 6 猪胰岛素样生长因子结合蛋白6(IGFBP6)检测试剂盒 (IGFBP6) HZA093Po ELISA Kit for Macrophage Inflammatory Protein 1 Beta (MIP1b) 猪巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1β)检测试剂盒 HZA095Po ELISA Kit for Macrophage Inflammatory Protein 3 Alpha (MIP3a) 猪巨噬细胞炎性蛋白3α(MIP3α)检测试剂盒 HZA096Po ELISA Kit for Macrophage Inflammatory Protein 3 Beta (MIP3b) 猪巨噬细胞炎性蛋白3β(MIP3β)检测试剂盒 CEA097Po ELISA Kit for Matrix Metalloproteinase 1 (MMP1) 猪基质金属蛋白酶1(MMP1)检测试剂盒 HZA098Po ELISA Kit for Matrix Metalloproteinase 10 (MMP10) 猪基质金属蛋白酶10(MMP10)检测试剂盒 HZA277Po ELISA Kit for Connexin 43 (CX43) 猪间隙连接蛋白43(CX43)检测试剂盒 HZA099Po ELISA Kit for Matrix Metalloproteinase 13 (MMP13) 猪基质金属蛋白酶13(MMP13)检测试剂盒 HZA302Po ELISA Kit for Galectin 2 (GAL2) 猪半乳糖凝集素2(GAL2)检测试剂盒 HZA304Po ELISA Kit for Galectin 4 (GAL4) 猪半乳糖凝集素4(GAL4)检测试剂盒 Th22是一种免疫细胞类型T细胞的子集，通常情况下，T细胞是免疫系统的“士兵”，杀死肿瘤细胞。在结肠癌的情况下，研究人员发现，Th22作为肿瘤的辅助，实际上支持细胞变得能够再生（肿瘤干细胞的标志之一）。

T 细胞可以保护人体免受病原体侵害，但一项在小鼠身上进行的研究表明，T 细胞也可能是加速衰老的元凶。而通过阻断细胞引起的炎症或增加关键代谢分子的供应，可以减轻小鼠体内一些与衰老相关的症状，该研究思路可能使老年人受益。该研究是 “把代谢、炎症和衰老直接联系在一起的绝佳结果”。澳大利亚墨尔本皇家理工大学免疫学家凯丽 奎恩表示 “他们做的工作非常彻底”，足以证明小鼠迅速老化是 T 细胞导致的。T 细胞会随年龄增长而表现不佳，人的抵抗力也会因此变得越来越弱，这是老年人更易受感染、对疫苗反应更差的原因。T 细胞表现不佳的原因之一是其内部 “发电厂”——线粒体因年龄渐长而出现故障。但 T 细胞不只是反映衰老，还可能正是衰老的成因。老年人出现的全身慢性炎症就是例子。研究人员指出，炎症会刺激衰老，而 T 细胞会释放炎症因子，触发炎症。为了验证这一假设，西班牙马德里自治大学分子生物学中心的玛利亚 米特尔布伦和同事通过基因编辑方法对小鼠进行处理，使其 T 细胞线粒体中的蛋白质缺失。这一改变会迫使 T 细胞采用效率较低的代谢机制。研究小组发现，出生后 7 个月本应是小鼠的壮年期，但基因编辑小鼠已经比普通小鼠显得更老。它们迟缓、笨拙、肌肉萎缩、虚弱，对感染的抵抗力也更弱。正如许多老年人一般，这些小鼠的心脏都很虚弱，且体内脂肪大量减少。此外，经编辑的小鼠 T 细胞释放出大量炎症因子，这可能是造成动物身体退化的部分原因。其结果表明，免疫系统的确在加快衰老进程中发挥了作用。那么，衰老的时钟有可能往回拨吗？研究者给小鼠服用了一种阻断肿瘤坏死因子 TNF-α（该因子可诱导炎症出现，且由 T 细胞释放）的药物，结果发现小鼠的抓地力有好转，且在迷宫中表现得更敏捷，心脏也更有活力。米特尔布伦等人还提供了另一种化合物，可提升高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）水平，NAD + 对代谢反应至关重要。通过这一分子，代谢系统可利用细胞从食物中获得能量。通常，随着年龄增长，NAD + 细胞浓度会下降。研究人员发现，采用新方法后，老鼠体内的 NAD + 浓度有所增加，且心脏功能更活跃。面对类风湿关节炎和克罗恩病等，抑制 TNF-α的药物是标准治疗手段。目前，市面上有一些公司出售能提高 NAD + 水平的药物。研究者表示，对这一新方法进行临床试验，可确定靶向 TNF-α或 NAD + 是否能减少衰老带来的负面影响。也有人质疑该研究与正常衰老的相关性。美国西北大学芬伯格医学院生物学家纳夫迪普 钱德尔指出，转基因鼠的线粒体受损程度比老年人更严重，“对大多数人而言，我敢打赌 T 细胞的负面作用没那么大”。但钱德尔也指出，线粒体功能异常的 T 细胞会导致某些人早衰，其在相对年轻时就出现老龄化疾病。巴克老龄化研究所分子细胞生物学家朱迪斯 坎皮西对此表示同意。她说，这项新研究可以帮助人们更好理解免疫系统如何随年龄变化而变化，但 “不知道它在多大程度上模仿了自然衰老”。

随着电视剧《心术》的热播，让医院再度成为人们关注的热点。25日，记者随医生走进了山西医科大学第二医院进行探访，实拍这些用于为肿瘤患者培养免疫细胞，治疗肿瘤的专用的生物免疫细胞实验室以及医务人员的工作流程。 图为无菌生物治疗实验室 　　图为细胞培养箱 　　图为医务人员在进行细胞分离 　　图为郑博士在显微镜下观察DC细胞培养情况 　　图为通过显微镜进行观测 　　图为低温离心机

一、炒作导火线来源于瑞银证券日前的一篇报告 　　瑞银证券日前发布研报认为，免疫治疗产品有望成为肿瘤领域的下一座金矿。临床实验结果显示了肿瘤免疫治疗的良好应用前景：利用人体自身的免疫系统治疗肿瘤，即肿瘤免疫治疗，已成为国际药企的研发热点。肿瘤免疫治疗主要包括：非特异性免疫刺激、免疫检验点单克隆抗体、过继T细胞疗法、肿瘤疫苗等方法。肿瘤的免疫治疗方法有望治疗60%以上肿瘤种类，有望带来250亿美元以上的市场机遇，或是肿瘤治疗领域的下一座金矿。 　　瑞银证券认为，过继T细胞疗法(ACT疗法)是肿瘤免疫疗法的一种，现有的临床实验结果均显示了其难以比拟的优势：治愈多例晚期黑色素瘤患者，而不仅仅是延长生存期。在ACT疗法中，嵌合抗原受体修饰的T细胞疗法(CAR)由于具备更好的特异性，前景最为看好。诺华开发的CART-19，已完成临床2期试验。研报认为CART-19产品理论市场规模能够达到80-100亿美元。(注意这仅仅是一家公司的产品所达到的市场规模人民币几百亿，并不是整个行业的市场估值) 　　我国细胞免疫治疗目前还在以&ldquo 第三类医疗技术&rdquo 的名义进行。我国每年新诊断癌症病例约307万人，细胞治疗潜在市场广阔，但由于目前监管缺位，略显混乱。同时，我国细胞免疫治疗在技术上，也与海外领先公司有一定差距。但是，我们仍对这一市场的前景持乐观态度，因为国内技术进步很快，随着监管成熟，我国细胞治疗产业将进入良性快速发展时期，甚至可能出现以药品形式获批的产品。 　　二、笔者百科&ldquo 细胞免疫治疗&rdquo 后，确认此市场前景不亚于基因测序 　　细胞免疫治疗是肿瘤康复医学一种新兴的、具有显著疗效的全新的抗肿瘤治疗方法，弥补了传统的手术、放疗、副作用、化疗的弊端，已经被公认为二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有发展前途的一种治疗手段。也是世界目前唯一有希望完全消灭肿瘤细胞的治疗手段。(注意了这里说的是完全消灭肿瘤细胞、此技术将给才是彻底治疗癌症的根本) 　　细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。(简单说步骤就是：采集你身上的细胞，然后拿出来培育变强变大之后，在放回到你身体杀灭癌细胞) 　　美国医药巨头辉瑞公司也看好此技术，近日宣布投资3.7亿元与法国生物科技公司Cellectis联合研发癌症免疫治疗药物。。肿瘤免疫治疗技术开发企业凯德药业上周五登陆纳斯达克后，上市首日股价飙涨逾70%。 　　三、相关上市公司(按市场由低到高排序) 　　1.开能环保：公司公告拟以自有资金1亿元认缴出资设立上海原能细胞科技有限公司建免疫细胞项目，主要是免疫细胞的存储和应用， 预计毛利率约为40%-50%，目前一字涨停，流通盘最小。 　　2.中珠控股携手美国TNITNI生物技术有限公司公司研发抗癌药物 免疫疗法和瑞银报告中诺华公司一样已完成二期临床试验。 　　笔者发现在6月21日中珠控股在重组公告中显示，中珠控制旗下全资子公司湖北潜江制药股份有限公司拥有多家医药制药公司股权(新疆新特药民族药业有限公司36%股权及14%股权托管受益权、陕西济生制药有限公司50%股权托管受益权和湖北东盛制药有限公司98.68%股权)。 　　目前看中珠控股在医药行业中市值远远低于同行业，细胞免疫治疗概念板块中流通盘与开能环保接近同在20亿下(其中还包括大股东持有近50%流通股)。 　　3.冠昊生物与台湾鑫品生医科技股份有限公司(鑫品生医)签订有关免疫细胞储存技术《技术授权合同书》,以1200万元的价格获得鑫品生医免疫细胞存储技术在中国大陆地区使用的独家授权。 　　台湾鑫品生医是一家在免疫细胞治疗领域技术领先的上市公司,,鑫品生医的&ldquo 优化免疫细胞银行&rdquo 在2011年获得SNQ品质(SymbolofNationalQuality-SNQ)标章,是全台湾第一家获得该标章认证的公司。鑫品生医拥有自主研发的T细胞制备技术为核心的免疫细胞治疗品台技术,在免疫细胞的提娶存储、复苏和治疗领域占据优势(比如细胞复苏后的存活率能达到95%以上)。 　　冠昊生物流通盘也较小40亿(其中包括大股东持有近40%流通股)。 　　4.海欣股份控股子公司海欣生物技术与上海第二军医大学合作研发的"抗原致敏的人树突状细胞(APDC)&rdquo 是我国首个自主研发的获得CFDA批准的、针对晚期大肠癌的治疗性疫苗。该项目负责人、二军大免疫学研究所曹雪涛院士介绍，这项研究突出的特点是，采用化疗去除部分免疫抑制因素，利用抗原致敏的树突状细胞激发肿瘤特异性免疫，从而杀伤肿瘤细胞，已取得了较好的临床疗效，是目前最为有效的肿瘤免疫疗法之一。 　　值得一提的是：上市公司中仅中珠控股和海欣股份完成了免疫疗法II期临床试验。 　　5.和佳股份：2013年4月17日至20日，第69届中国国际医疗器械博览会(CMEF)在深圳会展中心隆重举行。和佳股份携众多升级新品亮相展会，内容涵盖肿瘤微创治疗、医用气体及净化工程、医学影像、生物电子、DC-CIK生物细胞治疗、常规诊疗、血液净化系统、医院信息化系统及医院整体建设等多个领域，引起了各方广泛关注，展示了和佳股份在医疗设备领域的全新魅力及在医疗领域快速发展的良好势态。 　　6.中源协和曾2012年公告，公司子公司和泽生物科技有限公司决定与英国细胞治疗有限公司(CTL)签订《专利技术独占许可协议》，CTL同意将其拥有的自体中胚层基质细胞治疗心脏衰竭临床应用专利技术，以及与技术临床应用相关的专有技术授予和泽生物控股子公司。 　　中源协和近期收购上海执诚生物有限公司的议案以99.88%的赞成率获表决通过，中源协和未来在干细胞与基因技术业务上双向发展的态势逐步清晰。中源协和同时涉及细胞治疗和基因测序。 　　7.香雪制药已经开始进军TCR免疫疗法研究 　　公司与解放军第458医院签署了《第458医院与香雪制药(300147)联合建立特异性T细胞治疗新技术临床研究中心技术合作项目协议书》,合作期限为8年,自2014年3月31日至2022年3月30日。特异性T细胞治疗是可能治愈肿瘤的先进技术,长期看本次合作可能成为公司发展的新一极。 　　8.康恩贝目前已与美国凯德药业签订《AFP项目战略合作框架协议书》，合作开发&alpha 胎蛋白(AFP)项目。根据协议，双方将成立注册资本为800万元人民币的合资公司，康恩贝以现金入股，持股70%，凯德药业以技术入股，持股30%，并将授予合资公司AFP项目在中国大陆地区的全部独占许可，包括专利及其他保密技术。合资公司将以AFP项目在中国大陆上市为长期目标。 　　6月14日ar公司公告以3600万元收购受让北京华商盈通投资有限公司持有的北京嘉林药业股份有限公司33.55万股股份,占股1.1%。嘉林药业拥有嘉林肿瘤免疫疗法阿托伐他汀钙片DC-CIK阿乐。 　　补充：姚记扑克 　　姚记扑克公司近日宣布，拟采用增资的方式，支付对价1.3亿元，最终持有上海细胞治疗工程技术研究中心有限公司22%的股权。上海细胞治疗成立于2013年11月，注册资本为9000万元。公司主要从事细胞治疗技术领域内的技术开发、服务、咨询等。未来业务将以癌症的细胞免疫治疗、癌症的基因检测、细胞保存及医疗大数据为主。 　　姚记扑克流通盘也不大，但受前期彩票概念大炒后上方套牢盘较多影响，盘面较重。

肿瘤异质性对癌症预后和治疗反应有显著影响。传统的基因组和转录组分析被广泛用于研究不同的癌症类型，在预测预后和对不同治疗的反应以及为癌症治疗提供靶点方面具有潜在作用。不同癌症类型的单细胞分析表明，肿瘤免疫微环境的详细信息在多种癌症类型之间共享。目前，自从发现检查点抑制剂以来，免疫治疗彻底改变了癌症治疗并引起了越来越多的关注。肿瘤免疫微环境由非细胞成分(血管、细胞外基质、信号分子等)和细胞成分(T细胞、髓细胞、成纤维细胞等)组成。尽管传统的基因组和转录组学分析，也强调免疫相关途径和计算方法，并已应用于预测免疫细胞成分，但技术限制阻碍了时间的精确表征。传统的批量基因组和转录组分析获得的信号均来自不同细胞，掩盖了特定细胞类型和状态的识别。原位杂交和免疫组织化学已被用于探索单个细胞的基因组、转录组和蛋白质组学特征，但其产量相对较低。流式细胞术能够分析数千或数百万个单细胞蛋白质组学图谱；然而，这些方法需要事先选择感兴趣的抗体。随着细胞分离和测序技术的突破，单细胞转录组测序已经能够在单次运行中在单细胞水平上对许多细胞进行无偏好的全基因组分析。单细胞转录组测序已被用于分析单个细胞的转录组学，用于解析细胞间的异质性。肿瘤免疫微环境在诊断、治疗和预测不同类型癌症的预后方面显示出了潜力。与传统方法相比，scRNA-seq可用于识别新的细胞类型和相应的细胞状态，加深了我们对肿瘤免疫微环境的理解。1.介绍了scRNA-seq的原理，并比较了不同的测序方法。2.根据肿瘤免疫微环境中新的细胞类型、持续的过渡状态以及肿瘤免疫微环境成分之间的相互通讯网络找到了癌症的预后预测和治疗的潜在靶点。3.总结出在肿瘤免疫微环境中应用scRNA-seq后发现的由癌症相关成纤维细胞、T细胞、肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞组成的新型细胞簇。4.提出了肿瘤相关巨噬细胞和耗尽的T细胞的发生机制，以及中断这一过程的可能靶点。5.对肿瘤免疫微环境中细胞相互作用的干预治疗进行了总结。几十年来，肿瘤免疫微环境中的细胞成分定量分析已被应用于临床实践，预测患者生存率和治疗反应，并有望在癌症的精确治疗中发挥重要作用。总结目前的研究结果，我们认为单细胞技术的进步和单细胞分析的广泛应用可以导致发现癌症治疗的新观点，并应用于临床。最后，作者提出了肿瘤免疫微环境研究领域的一些未来方向，并认为通过scRNA-seq对这些方向进行辅助。相关会议预告：8.30召开，点击报名scRNA-seq在刻画肿瘤免疫微环境中的应用scRNA-seq技术进展scRNA-seq程序主要包括单细胞的分离和提取、cDNA合成、核酸扩增、测序和数据分析。与传统的批量测序相比，scRNA-seq单个细胞中的RNA量相对较少。因此，需要更有效的扩增方法。研究人员已经成功建立了稳定的单细胞文库构建过程，以产生足够的cDNA用于测序。单细胞分离和捕获是scRNA-seq在不同方法中的基本程序。目前单细胞分离和捕获的常用方法。这些程序分为四大类：激光捕获微切割、油滴包裹技术、流式细胞荧光分选技术和微流控微孔技术。scRNA-seq技术的未来发展可能会降低成本并增加细胞产量，使scRNA-seq成为研究单个细胞转录组的标准工具。肿瘤免疫微环境的细胞成分肿瘤免疫微环境的细胞成分包括淋巴细胞(T和NK细胞)、髓细胞(巨噬细胞和树突状细胞)、成纤维细胞和其他免疫细胞。成纤维细胞传统上被归类为基质细胞，因为它们在构建细胞外基质中发挥着重要作用。在这里，作者将肿瘤免疫微环境的癌相关成纤维细胞包括在内，因为它们分泌丰富的促炎和抗炎因子来重塑免疫微环境。细胞毒性CD8+T细胞识别肿瘤细胞上的特异性抗原并随后消除它们，是免疫微环境最常见和最有效的免疫细胞。CD8+T细胞的细胞毒性功能依赖于CD4+T Th1细胞。其他CD4+T细胞，包括Th2细胞和Th17细胞，也促进肿瘤微环境中的免疫反应。调节性T细胞抑制肿瘤免疫微环境并加剧肿瘤进展。自然杀伤T细胞和自然杀伤细胞也参与其中。它们的受体识别肿瘤细胞，从而激活其他免疫细胞。作为先天免疫的重要组成部分，骨髓细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞，在肿瘤免疫微环境中发挥着重要作用。巨噬细胞通常分为促炎M1和抗炎M2表型。肿瘤相关巨噬细胞主要由M2巨噬细胞组成，通过产生生长因子和细胞因子促进肿瘤生长、肿瘤存活和血管生成。DC对于T细胞的抗原呈递至关重要，连接先天免疫和适应性免疫。癌症相关成纤维细胞在肿瘤免疫微环境中维持增殖和分泌调节因子，可分为炎症性CAF和肌纤维母细胞CAF。炎症性CAF具有较高的细胞因子和趋化因子分泌，而肌纤维母细胞CAF高度表达收缩蛋白，成纤维细胞对免疫微环境起相互抑制作用。研究表明，成纤维细胞募集M2巨噬细胞和调节性T细胞，抑制肿瘤微环境中的免疫反应。肿瘤相关成纤维细胞也被发现在某些情况下会支持抗肿瘤免疫。除了分泌抗体，B细胞还通过产生与T细胞相互作用的细胞因子参与细胞免疫。研究表明，B细胞抑制细胞毒性T细胞并诱导CD4+T细胞分化为调节性T细胞。B细胞也是最近引入的三级淋巴结构的重要组成部分，富含B细胞的三级淋巴结构与各种肿瘤的生存和免疫治疗反应有关。先前的研究强调了细胞成分在时间中的重要作用。然而，免疫细胞的鉴定常基于有限的细胞标记，并借助免疫组织化学。个体免疫细胞的转录组图谱是探索不同免疫细胞及其相应功能所必需的。为了理解细胞进化过程及其决定因素，有必要应用scRNA-seq观察每个细胞的转录动态。利用scRNA-seq探索免疫微环境的新发现聚类和注释对于解释scRNA-seq数据探索至关重要。根据细胞相似性对数据进行划分，挑战在于在不提供先验知识的情况下估计固有的簇数或密度。可能的解决方案是采用分层聚类方法来揭示细胞的分层结构，这也与细胞本体相一致。给定聚类方法产生的数据划分结果，需要细胞类型注释来提供生物学意义。注释的主要挑战是确定每个聚类中存在多少细胞类型，以及是否存在当前未发现的细胞类型。在实践中，研究人员通常首先识别每个聚类的标记基因，然后根据专业知识和文献对其进行注释。scRNA-seq使研究人员能够以更高的分辨率将免疫细胞分类为具有不同功能的亚群，描述了免疫细胞的常规亚型。利用scRNA-seq发现的淋巴细胞(T和NK细胞)、髓细胞(巨噬细胞和树突状细胞)和成纤维细胞的组成(图2)。人和小鼠样本的scRNA-seq表明，成纤维细胞可分为抗原呈递CAFs、癌症相关成纤维细胞或肌成纤维细胞。抗原提呈CAFs独特地表达主要组织相容性复合体(MHC)II类基因，包括激活CD4+T细胞的CD74。在结直肠癌中也观察到类似的抗原提呈CAFs亚群。乳腺癌症基因工程小鼠模型中成纤维细胞的scRNA-seq进一步鉴定了血管CAF、基质CAF、发育CAF和循环CAF。血管CAF、基质CAF和发育CAF似乎起源于固有成纤维细胞和恶性细胞发生上皮-间充质转化时的血管周围位置。循环CAF是血管CAF群体中增殖的部分。在其他小鼠模型中也发现了血管CAF和基质CAF，它们在患者乳腺肿瘤样本中是保守的，并且发现它们会增加乳腺癌症细胞的转移。提高CAF的分辨率为开发精确靶向CAF的药物提供了生物标志物。另一项关于乳腺癌症的scRNA-seq研究将调节性T细胞分为五类：共表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4的调节性T细胞、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体，以及相互或仅表达相同基因的GITR和其他调节性T细胞，它们具有不同的功能。不同预后的患者具有不同比例的调节性T细胞簇，为个性化治疗提供了靶点。免疫微环境对T细胞和髓细胞进行了更详细的泛癌研究，发现存在颗粒酶K+T细胞、干扰素刺激基因+T细胞、杀伤细胞免疫球蛋白样受体在记忆性T细胞和NK细胞上表达、转录因子7+CD8+T细胞，ficolin 1+常规DC2、分泌性磷酸蛋白1+TAM，以及肿瘤微环境中的叶酸受体β+TAMs。基于scRNA-seq数据，免疫微环境还发现了新的免疫细胞亚群。葡萄膜黑色素瘤的scRNA-seq鉴定了以前未识别的细胞类型，包括主要表达检查点标记LAG3而不是程序性死亡-1或CTLA-4的CD8+T细胞。同时，在肝细胞癌中发现浸润耗尽的CD8+T细胞和具有高表达layilin的记忆T细胞的克隆富集，这些研究为癌症免疫治疗提供了新的靶点。因为CD8+T细胞是参与消除恶性细胞的主要成分。大肠癌CXC基序趋化因子的scRNA-seq鉴定配体BHLHE40+Th1样细胞与干扰素-γ调节转录因子BHLHE40。在不稳定肿瘤中，这些细胞对免疫检查点阻断有良好的反应，可能会提高免疫疗法的疗效。树突状细胞对于呈递抗原以激活肿瘤免疫微环境中的T细胞是必不可少的。胃癌的scRNA-seq揭示了一个新的树突状细胞簇，表达吲哚胺2,3-双加氧酶1和趋化因子C–C基序趋化因子配体(CCL)22、CCL17、CCL19和白细胞介素-32，它们参与T细胞的募集。胰腺导管腺癌的scRNA-seq还鉴定了除了常规细胞标记物之外还高表达吲哚胺2,3-双加氧酶1的树突状细胞簇。吲哚胺2,3-双加氧酶1对于催化色氨酸消耗和犬尿氨酸产生、抑制T细胞增殖和细胞毒性至关重要，这揭示了树突状细胞和T细胞之间的密切相互作用。此外，通过scRNA-seq鉴定了溶酶体相关膜蛋白3+树突状细胞，并且似乎是经典树突状细胞族的成熟形式。溶酶体相关膜蛋白3+DC可以迁移到淋巴结，并高度表达与T细胞相互作用的配体。这些表达特异性标记物的新型树突状细胞簇的发现为癌症免疫治疗提供了一个新的视角。使用scRNA-seq在肺腺癌中发现了肿瘤相关巨噬细胞的新特征基因，包括髓系细胞触发受体2、CD81、具有胶原结构的巨噬细胞受体和载脂蛋白E。此外，乳腺癌症的scRNA-seq表明，除了M2型基因如CD163、跨膜4域A6A和转化生长因子β1外，血管生成因子纤溶酶原激活剂、尿激酶受体和IL-8也在肿瘤相关巨噬细胞中表达。肿瘤相关巨噬细胞中这些新的基因特征图谱与患者生存相关，并为癌症治疗提供了新的潜在靶点。肿瘤样本scRNA-seq显示，一个肿瘤相关巨噬细胞亚群呈现出SPP1、巨噬细胞清除剂受体MARCO和MHC II类基因的高表达。MARCO和SPP1是巨噬细胞激活中的抗炎和免疫抑制信号，而MHC II类基因与促炎功能有关。其他scRNA-seq研究表明，肿瘤相关巨噬细胞经常同时具有促炎和抗炎特征。这一现象表明，肿瘤微环境中的巨噬细胞活化与传统的M1/M2极化不一致。图2：利用scRNA-seq揭示免疫微环境中的新的免疫亚群单细胞数据揭示免疫细胞进化大多数免疫细胞都处于细胞发育过程中。大量的免疫细胞处于发育轨迹的瞬态状态，而不是分化良好的细胞的离散状态。借助scRNA-seq和深入分析，研究人员可以探索分化细胞的特征、特定细胞类型的转变及其可能的机制。最常用的计算方法是拟时序分析。轨迹描述了细胞的发育过程，其特征是基因表达的级联变化。分支点代表细胞分化的显著差异。各种机器学习计算方法已被用于构建轨迹，包括Monocle3、DTFLOW、DPT、SCORPIUS和TSCAN，这些方法已在单独的综述中进行了评估和比较。由于肿瘤相关巨噬细胞和T细胞代表了免疫微环境中最丰富的免疫细胞类型，这里主要关注这两种细胞类型。scRNA-seq显示，TAMs经常共表达M1基因，包括TNF-α和M2基因，如IL-10，并且肿瘤相关巨噬细胞的分化和状态与其抗肿瘤作用直接相关。拟时序轨迹分析证实，肿瘤相关巨噬细胞在M1和M2表型之间连续转换。转录因子IRF2、IRF7、IRF9、STAT2和IRF8似乎在决定TAMs分化中很重要，并可作为表观遗传学靶点诱导肿瘤相关巨噬细胞的M1极化，从而产生促炎和抗肿瘤的微环境。使用环境刺激和抗原T细胞受体(TCR)刺激测定T细胞表型。不同状态的细胞之间TCR库的重叠，即TCR共享，也可用于研究T细胞的进化。结合scRNA-seq和TCR追踪在结直肠癌中发现20个具有不同功能的T细胞亚群。在黑色素瘤肿瘤的耗竭T细胞中发现了28个基因的耗竭特征，包括TIGIT、TNFRSF9/4-1BB和CD27，并且在大多数肿瘤的高耗竭细胞中也被发现上调。另一项关于T细胞的研究进一步鉴定了CD8+T细胞中的其他耗竭标记物，如LAYN、普列可底物蛋白同源物样结构域家族A成员1和突触体相关蛋白47。拟时序轨迹分析表明，T细胞在时间上处于连续激活和终末分化(衰竭)状态(图3)。已经进行了额外的研究来研究耗尽的T细胞的进化和逆转T细胞耗尽的潜在靶点。scRNA-seq与TCR分析相结合表明，功能失调的衰竭T细胞和细胞毒性T细胞可能在时间上与发育有关。因此，研究集中在CD8+T细胞从效应细胞到衰竭T细胞的过渡过程。scRNA-seq鉴定出两个CD8+T细胞簇为非小细胞肺癌中预先耗尽的T细胞。在肺腺癌中，预先耗尽与耗尽的T细胞比率与更好的预后相关。因此，在耗尽前中断预先耗尽的T细胞可能对癌症免疫治疗至关重要。由于免疫细胞和恶性细胞之间的密切相互作用，恶性细胞的进化在免疫细胞进化中也起着至关重要的作用。拟时序轨迹分析表明，转移性肺腺癌的轨迹分支不同于向纤毛细胞和肺泡型细胞的正常分化。受恶性细胞进化的影响，正常的骨髓细胞群体被单核细胞衍生的巨噬细胞和新型树突状细胞取代。T细胞也被发现会衰竭，从而构建免疫抑制的肿瘤微环境。同样，另一项研究表明甲状腺癌症细胞来源于乳头状甲状腺癌症细胞亚簇，其中构建了不同的肿瘤免疫微环境，导致预后显著恶化。图3：肿瘤相关T细胞和巨噬细胞的进化过程免疫微环境中不同细胞间的通讯网络免疫微环境上的细胞通讯与肿瘤进展有关。配体-受体相互作用是一种重要的细胞通讯类型，对于构建免疫微环境和识别潜在的治疗靶点至关重要。scRNA-seq是在细胞基础上进行的，这使得研究未发现的细胞相互作用变得可行。已经开发了许多基于scRNA-seq数据研究配体-受体相互作用的分析工具，包括iTALK、CellTalker和CellPhoneDB。这些工具利用了已知配体-受体对相互作用的数据库。其中，CellTalker利用差异表达的基因，而CellPhoneDB包括配体和受体的亚基结构。其他工具，如NicheNet，也考虑了受体细胞下游通路的变化。在肿瘤进展过程中，恶性细胞导致免疫细胞的募集和功能障碍，从而相互影响肿瘤的发生和恶性细胞的进化，形成恶性循环(图4)。发现TAMs通过表皮生长因子受体-双调节蛋白配体受体对与恶性细胞相互作用。在基底样乳腺癌细胞系中AREG的调节导致抗炎TAMs的招募。同时，基于scRNA-seq，发现了一种EGFR相关的反馈回路可促进胰腺腺鳞癌的进展。来源于TAMs的抑瘤素M也与其在恶性细胞上的受体相互作用，以激活信号转导子和转录激活子3。研究人员通过整合素受体与胶原蛋白、纤维连接蛋白、血小板反应蛋白1配体和富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4-R-反应蛋白3的相互作用，发现CAF与胃癌细胞之间的通信，这些配体调节干细胞。此外，胰腺导管腺癌的scRNA-seq揭示了TIGIT与T细胞和NK细胞中的甲型肝炎病毒细胞受体2之间的相互作用，以及它们在恶性细胞中的相应配体PVR和LGALS9，导致免疫细胞功能障碍和胰腺癌症进展。因此，基于单细胞数据探索免疫细胞和恶性细胞之间的细胞相互作用提供了可能治疗靶点，以打破肿瘤进展的恶性循环。除了恶性细胞外，scRNA-seq和随后的分析还预测了免疫细胞之间在时间上的相互作用，这表现出相反的功能(图3)。例如，研究发现TAM降低了CXCL12-C-X-C基序趋化因子受体3和CXCL12-CXCR4的相互作用，增强了鼻咽癌细胞毒性T细胞和Tregs之间的CD86-CTLA-4相互作用，导致肿瘤免疫微环境加重癌症进展。此外，CAFs通过分泌CXCL12募集Tregs，并通过periostin与M2巨噬细胞相关。图4：免疫微环境中的细胞通讯网络基于scRNA-seq的肿瘤免疫微环境的临床应用和潜在靶点几十年来，临床实践中一直采用时间的量化来预测患者的生存率和对治疗的反应。利用免疫组化分析的免疫评分，量化肿瘤中的原位免疫细胞浸润。与传统的免疫评分相比，scRNA-seq在免疫微环境上提供了前所未有的渗透免疫细胞分辨率。已经鉴定出与预后相关的新的免疫细胞簇。例如，在早期复发的肝细胞癌中发现了一种独特的低细胞毒性先天性样CD8+T细胞表型。这些T细胞过表达KLRB1，同时下调共刺激和耗竭相关分子，包括肿瘤坏死因子受体超家族、成员9、CD28、诱导型T细胞共刺激因子、TIGIT、CTLA-4和HAVCR2。这种T细胞簇的浸润与癌症的不良预后相关。此外，基于scRNA-seq的细胞相互作用也被计算在预测模型中。基于细胞间通讯相关基因构建了机器学习模型，以预测肺腺癌的复发。将八个细胞间通讯相关基因和患者的临床信息相结合，获得了0.841的受试者-操作者特征曲线下面积。除了预后预测外，肿瘤免疫微环境中独特的细胞相互作用也与免疫疗法的反应有关。scRNA-seq分析发现，抗PD-1治疗的应答者和非应答者之间存在不同的细胞-细胞通信网络，有可能预测患者对抗PD-1疗法的反应。因此，在scRNA-seq的帮助下，可以更准确地预测患者的预后和对免疫疗法的反应。利用scRNA-seq在精准医学中具有启发性，例如帮助靶向治疗克服耐药性。例如，医生在使用替比法尼治疗的非CR肌肉浸润性膀胱癌症患者治疗前后应用患者衍生异种移植物的scRNA-seq。在治疗后的PDX中发现PD-L1的上调，并降低了免疫细胞的抗肿瘤作用。因此，选择了用PD-L1抑制剂进行额外治疗。随后，患者获得了良好的反应。此外，在单药耐药性肿瘤中，通过scRNA-seq鉴定了新的免疫亚型。用抗集落刺激因子1受体阻断TAMs不能减少胆管癌的肿瘤进展。scRNAs-eq鉴定了表达APOE的粒细胞髓系衍生抑制细胞的补偿富集，其介导T细胞抑制。TAMs和粒细胞性骨髓源性抑制细胞的双重抑制与抗CSF1R和抗淋巴细胞抗原6复合物、基因座G治疗联合增强了小鼠的免疫检查点阻断效果小鼠模型，这在临床实践中很有前景。除了治疗耐药肿瘤外，scRNA-seq在免疫微环境上的应用也突出了需要进一步研究的潜在新靶点。T细胞是免疫微环境中去除恶性细胞最重要的免疫细胞。然而，在不同的肿瘤中，耗尽的CD8+T细胞会导致不利的预后。除了众所周知的免疫抑制检查点外，scRNA-seq还鉴定了高表达内皮前体蛋白、酪氨酸酶相关蛋白1和内皮素受体B型的耗尽CD8+T细胞，这些细胞可以作为新的潜在靶点。髓细胞是免疫微环境招募免疫细胞所必需的。通过scRNA-seq鉴定TREM2/APOE/补体组分1，q亚组分阳性巨噬细胞浸润为透明细胞肾癌复发的预后生物标志物。另一项研究证实，小鼠中靶向TREM2的抗体与缺乏MRC1+和CX3CR1+巨噬细胞以及表达免疫刺激分子的髓系簇的扩增有关，这促进了T细胞反应并导致更好的预后。细胞相互作用也可以用作治疗靶点。肝内胆管癌的scRNA-seq揭示了血管CAFs与肝内胆管细胞之间的串扰。血管CAFs分泌的IL-6诱导Cajal间质细胞细胞的表观遗传学改变，从而增强恶性肿瘤。因此，IL-6信号在Cajal间质细胞的中断变得非常有趣。表1总结了scRNA-seq显示的癌症治疗的潜在靶点。表1：scRNA-seq显示的癌症治疗的潜在靶点总结scRNA-seq可以绘制全面的肿瘤免疫微环境细胞图谱，为各种肿瘤的临床应用提供了新的视角。此外，免疫微环境的细胞成分和通讯为癌症治疗提供了潜在靶点，并有助于精确医学的发展。技术的进步和单细胞分析的广泛应用可以发现癌症治疗的新观点，助力临床研究。作为突破性的新技术，单细胞分析技术有望逐渐取代传统的整体样本二代测序。单细胞分析技术在临床和药物开发方面的应用前景更为广阔，可以代替或补充分子、细胞和组织病理检测的现有技术，也可以用于新兴的细胞治疗。

p 　　白血病是一种极难治疗的致命癌症，大量的白细胞在血液中四处游荡，随着时间的推移慢慢的杀死我们的身体。但这个“杀人凶手”并不是毫无弱点。许多的白细胞表面都有一个称之为“CD19”的分子。当CD19被激活后，它所附属的白细胞就会被我们杀死。 /p p 　　CD19对于癌症生化学家来说，就像是一个向世界广播的小型无线电信号，不断的说着“这是白血病，快来杀它。”而当白血病患者体内具备了可以接受CD19信号的特异性免疫细胞时，特异性免疫细胞就能追踪并杀死带有CD19的白血病细胞。 /p p 　　斯坦福大学生物工程和生物化学系的助理教授Stanley Qi和他的团队就使用了CRISPR基因编辑技术为免疫细胞配备了一个导航系统来追踪白血病细胞。 /p p 　　目前这项研究以“Engineering cell sensing and responses using a GPCR-coupled CRISPR-Cas system, Nature Communications”为名发表在了《Nature Communications》上。 /p p style=" text-align: center " img title=" 1.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/59d1d5b3-b33a-40ef-8700-26b3d13a885b.jpg" / 　　 /p p 　　 strong 生化通讯中“黑客”GPCR /strong /p p 　　G偶联蛋白受体(GPCR)是人类生理学中最大和最重要的化学受体家族之一，它可以感知各种各样的配体，包括内源激素，生长因子和天然或合成的小分子等。 /p p 　　GPCR就像细胞触角一样，不断寻找生物化学信号，使细胞能够相互沟通，并作为组织一起发挥作用。当触角分子识别特定的信号(例如像CD19这样的分子)时，他们就会启动一系列的细胞与细胞核的通讯，从而引发一系列的遗传结果，从免疫反应到化学生成再到细胞繁殖。目前我们已经在人类基因组中鉴定出了至少800个GPCR。而市场上40%左右的药物都是与GCRP有关。 /p p 　　而先前对于GPCR工程的研究主要是用蛋白水解可切割的人工转录因子(例如GAL4，rtTA)取代胞内结构域，并创建一个受体活性的遗传报道分子，称为Tango系统。但这样的操作往往限制了对内源性靶点的调节，同时一个“一个配体在一个转录因子中”的模式也使得效率非常低。 /p p 　　Qi和他的团队则专注于利用GPCRs作为一个普通的合成装置，这弥补了先前内源性基因无法表达的缺陷，可以响应不同的配体。在本次实验中，研究人员通过CRISPR-dCas9技术利用GPCR来将细胞外信号感测转换为程序化的转录反应。 /p p 　　 strong CRISPR ChaCha /strong /p p 　　实验设计了两个函数：GRCP Tango和GRCP ChaCha。通过对这两个的测试，结果显示 ChaCha优于 Tango，它不仅能有效的激活内源性基因，还能激活多个基因。随后研究人员测试了ChaCha设计的通用性，发现它能感应多个不同的GRCPs，其中包括涉及到的血管加压素，促甲状腺激素释放激素等配体。 /p p style=" text-align: center " img title=" 2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/2dbefc2e-42e8-416a-a092-6d6aaf150dd4.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong GRCP ChaCha优于Tango /strong /p p style=" text-align: center " img title=" 3.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/990bd6ef-30eb-4055-839d-f56a4efea0aa.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong ChaCha系统支持个体和多种基因的激活 /strong /p p 　　Qi及其团队的早期的临床试验具有不错的前景，并且引导了新的白血病疗法。然而，最具革命性的是使用活细胞作为治疗方法，它开启了一个超越传统化学疗法的世界。在未来，不仅仅是白血病，从血液癌症到实体瘤到神经系统疾病，我们都可以期待CRISPR能为我们带来新的疗法。(转化医学网360zhyx.com) /p p 　　参考文献： /p p 　　1.New kind of homing beacon targets cancerous cells and other diseases /p p 　　2.Nathan H. Kipniss, P. C. Dave P. Dingal, Timothy R. Abbott, et al. Engineering cell sensing and responses using a GPCR-coupled CRISPR-Cas system, Nature Communications, 20 December 2017. /p

科学家越来越多地尝试利用人体自身的免疫系统来对抗癌症。波恩大学和澳大利亚和瑞士的研究机构进行的一项新研究现在显示了肿瘤细胞用于逃避这种攻击的策略。为这项工作开发的方法有助于更好地理解免疫防御与疾病之间的“军备竞赛”。结果可能有助于改善现代治疗方法。它们已经发表在《免疫》杂志上。癌细胞与健康的人体细胞不同-外观，行为和其中活跃的基因。通常，这并不容易被忽视：免疫系统会记录到某些错误，并派遣其部队与肿瘤作斗争。但是，这种反应通常太弱，无法长期控制甚至破坏癌症。因此，研究人员多年来一直在努力增强免疫系统的防御反应。他们这样做的方式与警察将他的狗放在逃脱的罪路上的警察类似。在这种情况下，嗅探犬的作用被细胞毒性T细胞所取代：它们可以检测并杀死患病或有缺陷的细胞。每个T细胞针对特定特征，也称为抗原。因此，对于癌症疗法，研究人员正在寻找可检测肿瘤抗原的患者中的T细胞。然后，他们可以例如将它们相乘并将它们重新注入患者体内。通过这种方式，它们可以增强患者对癌症的免疫反应。然而，不幸的是，许多肿瘤已发展出使它们能够逃避免疫系统的策略。波恩大学医院实验肿瘤研究所的迈克埃弗恩博士解释说：“在我们的研究中，我们研究了这些策略的长处以及所依赖的策略。”“我们专注于皮肤癌，即黑色素瘤细胞。”黑素瘤在几个方面与健康细胞不同。例如，各种不同的基因在其中均具有活性。这些都是T细胞的潜在抗原。但是，哪一种特别适合触发强烈而持久的免疫反应?为了回答这个问题，研究人员在他们的实验模型中发明了一种聪明的方法：他们将一种标记物附着在活跃于黑素瘤细胞发育中的各种基因上，并利用它们产生抗原。然后，他们释放了一组针对肿瘤细胞的T细胞，后者将这一分子标记准确地识别为疾病标记。然后，研究人员使用这种策略来研究癌细胞对免疫系统所追寻的反应。根据标记有这种标签的基因，他们发现了显着差异。癌细胞隐藏在免疫系统之外。Effern的同事Nicole Glodde博士解释说：“当T细胞针对负责黑色素瘤典型特征的基因时，我们观察到癌细胞会随着时间的推移改变其外观并抑制这些基因。”“所以这就是他们躲避免疫系统的方式。”相反，该研究中研究的另一种基因对于肿瘤的生存至关重要。这使得下调从而隐藏起来并不那么容易。Effern强调说：“因此，我们认为该基因具有诱导非常有效的T细胞反应的潜力。”波恩大学医院实验肿瘤学研究所所长，波恩大学卓越免疫免疫集群成员MichaelHölzel教授希望：“我们的工作可能为更有效的免疫疗法扫清道路。”“我们开发的方法还可以更好地了解癌细胞在免疫系统的监视下滑动的过程。”

魏则西事件持续发酵,百度、莆田系等成了最直接的众矢之的，但或许不久之后，另一个与之相关的产业会迎来最重要的转折点。　　“我很担心和细胞免疫治疗相关临床进展会全部停掉。”一个从事细胞免疫治疗的研究人员天晴(化名)说，几个月前，他正准备依靠自己在此方面的专利开一家相关的第三方公司，彼时正是国内相关领域投资最火爆的时候。　　从DC-CIK到NK、LAK、CAR-T，这些烦杂的名字让受众疑惑，但对于非专业人士来说，他们都有一个统称，叫做细胞免疫治疗。魏则西事件的爆发，让这一还没得到临床应用允许的技术再次备受质疑。　　　　无望中的希望　　和魏则西不同，对于很多患有白血病的儿童还有他们的家长来说，细胞免疫疗法却被认为是一种已经被少数幸运的病友验证为有效的治疗方式。这种治疗手段叫做CAR-T肿瘤细胞免疫治疗。　　已经有医院在临床机构的协助下对其中复发多次治疗无效的患者进行了CAR-T细胞免疫治疗临床试验，并且效果显著，在上海、徐州、浙江，这样的案例正在不断的发生。　　“都是已经是白血病晚期、复发过的病人，你不治疗，很多人的生存期可能都不到一个礼拜。所以你可以当成是‘死马当作活马医’的治疗方式。”一家与医院合作提供CAR-T治疗的第三方机构负责人透露。　　但与魏则西不同的是，这些患者并未交付给医院任何费用，他们是以临床研究者的身份完成这次治疗的。　　“其实很多患者在知道了CAR-T细胞治疗技术之后是求着医生、医院来做这种治疗的。”该负责人说，“所以我们会有一个规定，在进行治疗前不得接触患者，因为这会对他到底能不能做CAR-T治疗的判断造成影响，大多数时候都是很可怜的病人，我们没有办法拒绝，但事实上，他们的病情可能是不适合做的。”　　据了解，目前做这种临床试验需要经过非常严格的伦理认证，“绝对不是来了病人就做，必须是两次治疗无效再次复发的病人，穷尽了所有治疗手段都没有效果的情况下，签署了知情同意书才可以做，整个过程是全部免费的。”一位有过CAR-T治疗临床经验的医生对笔者说，你可以简单理解为，能做的第一个标准就是“常规方式下这个病人根本治不好”。　　喜忧掺半的真相　　事实上，真正的癌症免疫疗法在医学界还是颇受推崇，尤其是对血液肿瘤的治疗上可以说有“奇效”，在魏则西事件发生后，很多专家的第一反应是，“如果因为‘李鬼’而坏了名声，那将是件极为可惜的事情。”　　专家们所说的真正有效的疗法就包括应用在血液肿瘤领域的CAR-T细胞免疫治疗。　　　　早在上世纪80年代，科学家就提出是否有可能通过转基因的方法使得体内的T细胞识别肿瘤细胞：作为人体内原生的细胞，癌细胞很容易逃过免疫系统的监控和杀伤，但是一旦具有了识别功能，T细胞就可以分清敌我，进行有效的癌细胞杀除。　　30年后，这一技术终于在2011年于美国宾州大学实验室获得了成功：3名白血病患者中有2名得到完全缓解。到2014年10月份，复发难治的白血病30名中有27名得到完全缓解，完全缓解率达到90%。　　这是肿瘤领域革命性的进展，之所以说是革命性进展，原因之一是一旦临床医生确定病人是复发难治白血病，病人面对的情况是3个月的死亡率为50%，3年的死亡率基本为100%，所有的药物基本上都失败了，而CAR-T技术能使过去无药可救的病人90%得到缓解。　　但在实际应用上，哪怕是在美国目前也仅完成了200例左右的治疗，要想成为一个成熟的可应用的技术，这个样本容量还是远远不够的。另一方面，目前CAR-T治疗成功的案例也仅仅在血液肿瘤领域，诸如乳腺癌、肺癌这样的实体瘤仍在初期的研究阶段。　　在去年下半年，记者曾经前往上海同济大学附属同济医院，那里是另一个正在收费进行细胞免疫治疗的医疗机构，在过去的这段时间里，这家医院的血液部门曾接待了数百名进行细胞免疫治疗尝试的患者。彼时，他们的收费标准是每个疗程3万元，一次进行3个疗程，总花费十万元左右。　　有业者认为，如果说CAR-T治疗是具有“敌我”识别功能的细胞免疫治疗技术，DC-CIK就好比一颗“原子弹”，不管是正常细胞还是癌细胞，只要注射了就给你杀个精光。这类技术在应用时就需要特别谨慎了，特别是对待化疗过的病人，机体自身是否还有应对与之带来的系列强烈反应都是值得考量的因素。　　也正因此，在所有的免疫细胞治疗采用之前都必须对患者进行各方面的考量：所谓“精准”的个体化治疗技术，在可能会带来意外的治疗效果之外，还有另一层含义，救得了一个人，并不代表还能同样救得了另一个人。　　再说魏则西的死　　魏则西的死让受众感到悲悯和愤怒的一个最主要原因，是他在百度和莆田系的误导之下尝试了看来并不适合于他的技术，并为此付出了宝贵的生命和大量的金钱。　　事实上，在目前国内不少医院中患者或多或少都可以找寻到进行细胞免疫治疗的途径，百度是最主要的方式之一。“有效提高五年生存率近一倍”、“恶瘤控制率达80%”等一些诱惑的广告语对癌症患者及家属来说有着相当的吸引力。而在收费上，也多维持在十万以上一个疗程的水准。你不能说这些方式都是淘汰、落后的，因为事实上在国内也存在应用包括DIK、NK治疗癌症非常有效的例子，哪怕是在美国，这一技术也并没有被淘汰，只是没有被大规模推广。　　比如在引发此次关注的“有槽”公号所发的文中很明确的说明，上海可莱逊生物技术有限公司其实是照抄，但是抄的怎样会直接影响治疗的结果。　　巧合的是，就在数月之前此次魏则西事件的技术提供方上海可莱逊生物技术有限公司被中源协和(600645.SH)披露，拟出资11亿元收购其100%的股权。根据公开资料，作为目前国内最大的免疫细胞治疗企业，可莱逊为国内近30家医院长期提供免疫细胞治疗技术服务，2015年，该公司的营业收入达到了2.96亿元，净利润为4000万人民币。并且在最近的三年，公司规模依旧呈现直线上升的态势。　　这可以从某个侧面反映出目前国内细胞免疫治疗投资的火爆，哪怕是在二级市场，它也是一个很理想的炒作标的： 根据统计，此前在短短两年时间内，已经有多达八家以上的国内上市公司竞相布局“细胞免疫”相关领域，其中不乏“开能环保”、“姚记扑克”这样的非医学领域上市公司。　　根据CIC灼识咨询的数据，截止至2016年4月，在Clinicaltrials.gov登记的正在中国开展研究的CAR-T临床试验数目仅次于美国，为37个，占全球注册的CAR-T临床总数的25%。在这其中包括中国解放区总院、仁济医院、第二军医大学、上海长海医院在内的13家医院组织以及包括科技生物医药、上海吉凯基因化学技术有限公司在内的6家第三方技术服务机构。　　哪怕是目前全球范围内最知名的Juno Therapeutics,这家美国最著名的T细胞疗法上市公司也试图进入中国市场：今年4月，Juno和药明康德在上海宣布成立合资公司药明巨诺，共同开展CAR-T和TCR疗法的研发和生产。　　　　但事实是，这一技术目前还根本得不到国家的临床应用准许，事实上，也正是良莠不齐的大大小小的第三方治疗机构让国家至今对放开细胞免疫治疗的口子存有疑虑，尽管目前的监管仍然是以一种相对宽松的形态存在。　　“细胞免疫治疗未被放开主要原因有几个，首先，某些肿瘤人群在使用治疗后生存期并未得到大幅延长，其次，免疫细胞的来源成问题，再加上国外的保险公司对细胞免疫治疗技术并不认可，不肯为此买单。”上海长海医院胸外科的一位专家此前表示，实际上在2011年，FDA曾经批准过一项名为PROVENGE的用于治疗前列腺癌的免疫治疗药物，但截至目前得到的治疗数据并不理想，临床实验表明这项治疗仅可以延长患者生命4个月。　　在去年5月，国家下发了《国务院关于取消非行政许可审批事项的决定》，其中第三十一条指出，第三类医疗技术临床应用准入审批可被取消，细胞免疫治疗作为第三类医疗技术的典型代表，被不少行业内人士认为已经被放开。然而，记者通过了解国家相关部门工作人员得知，细胞免疫治疗被放开，实际仍是误解。　　“目前这块并没有放开，所有市场上收费治疗的细胞免疫应该都属于违规，(2015年)5月份我国第三类医疗技术放开审批，改成设置限制类和禁止类，但是细胞免疫治疗并没有放入限制性放开的名单，目前这项技术只能进行临床研究。”上海市卫计委一位工作人员表示。

p 　　2017年7月31日，清华大学生命学院刘万里研究组在《eLife》期刊在线发表了名为《蛋白激酶Cβ(PKCβ)和黏着斑激酶协同调控B淋巴细胞的免疫活化对呈递抗原的基质硬度的敏感性》(Substrate stiffness governs the initiation of B cell activation by the concerted signaling of PKCβ and focal adhesion kinase)的研究论文，报道了机械力感知能力调控B淋巴细胞免疫活化的精细分子机制。清华大学生命学院巴基斯坦籍博士生萨明娜(Samina Shaheen)，北京大学、清华大学和北京生命科学研究所联合培养博士研究生项目博士生万政鹏和生命科学学院本科生李宗昱是本文的共同第一作者，刘万里研究员为本文的通讯作者。 br/ /p p 　　本研究需要大力整合分子免疫学、细胞生物学、生物化学、新型材料科学、高精度活细胞成像和生物物理学等不同学科的交叉优势，涉及基因修饰小鼠脾脏B细胞和自身免疫疾病病人外周血B细胞等实验材料的广泛使用，在研究过程中得到了国内外同行的大力支持。 /p p 　　B淋巴细胞作为抗体免疫应答过程中的重要参与者，维系着人类的健康，B淋巴细胞的免疫活化进程在其质膜表面的B细胞受体(BCR)识别外来病原体抗原后启动。该课题组之前的工作揭示B淋巴细胞具有灵敏的机械力感知功能，利用B细胞受体(BCR)来精确地识别抗原的理化性状。该论文结合不同刚性抗原呈递基质系统和基于全内反射、共聚焦荧光显微镜的高速高分辨率成像系统，对机械力感知调控B淋巴细胞免疫活化的分子机制进行系统而全面的研究。该论文发现B淋巴细胞感受机械力调控其活化依赖于B细胞受体(BCR)下游信号分子。由佛波酯(PMA)诱导的蛋白激酶Cβ(PKCβ)激活可以绕过B细胞通常需要的酪氨酸激酶(Btk)和磷脂酶Cγ2(PLCγ2)信号分子来区分底物刚度。然而，这一过程依赖于由蛋白激酶Cβ(PKCβ)介导的黏着斑激酶(FAK)激活，进而表现出黏着斑激酶(FAK)介导的B细胞扩散和粘附反应的增强。黏着斑激酶(FAK)失活或缺陷将导致B细胞丧失鉴别基底刚性的能力，而粘附分子可以大大增强B细胞的这种能力。最后，该研究利用类风湿性关节炎患者的样品进行研究，发现与健康人相比，类风湿性关节炎患者的B细胞对基底刚度表现出不同的活化反应。这些发现更系统的提供了B细胞如何通过蛋白激酶Cβ(PKCβ)介导黏着斑激酶(FAK)激活的方式区分底物刚度并作出不同活化反应的分子解释。这些研究成果为B淋巴细胞的免疫识别、免疫活化和免疫调节研究提供了新的研究思路，帮助人们进一步理解自身免疫疾病，从而对探索相关疾病的致病机理、以及药物疫苗研发等重要工作提供新的理论依据。 /p p 　　刘万里研究员课题组一直致力于使用新型的高速高分辨率的活细胞单分子荧光成像技术结合传统的分子免疫学、生物化学和生物物理学研究手段，对B淋巴细胞的免疫活化及相关疾病的分子机制进行研究。继2013年在《免疫学杂志》(Journal of Immunology)，2015年在《欧洲免疫学杂志》(European Journal of Immunology)和《eLife》上发表B淋巴细胞的免疫活化受到机械力调控的相关论文后，这一新成果是他对该领域的又一贡献。该研究由国家自然科学基金委、科技部和青年千人计划提供经费支持。萨明娜(Samina Shaheen)受到中国政府奖学金项目的支持。(来源：清华大学生命科学学院) /p p 　　论文链接： a href=" https://elifesciences.org/articles/23060" _src=" https://elifesciences.org/articles/23060" https://elifesciences.org/articles/23060 /a /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201708/noimg/e71fa001-dac6-4706-bca7-5f946b9f1f18.jpg" title=" 1.jpg" / /p p 　　蛋白激酶Cβ(PKCβ)和黏着斑激酶(FAK)协同调控B淋巴细胞的免疫活化对呈递抗原基质硬度的敏感性 /p p br/ /p

p style=" text-align: justify " 　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 　 span style=" text-indent: 2em " 前言：质谱流式细胞仪（CyTOF） /span /strong /span /p p style=" text-indent: 2em " 质谱流式细胞技术的核心融合了流式细胞技术与质谱技术。目前质谱流式细胞技术采用的仪器是CyTOF（Cytometry by & nbsp Time-Of-Flight），其原理简单来说是利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术，既继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力。 span style=" text-indent: 2em " 传统流式细胞技术和质谱流式细胞技术相比，主要有两点不同：1.标签系统的不同，前者主要使用各种 span style=" text-indent: 2em color: rgb(0, 112, 192) " strong 荧光基团作为抗体的标签 /strong /span ， span style=" text-indent: 2em color: rgb(0, 112, 192) " strong 后者则使用各种金属元素作为标签 /strong /span ；2.检测系统的不同， strong span style=" text-indent: 2em color: rgb(0, 112, 192) " 前者使用激光器和光电倍增管作为检测手段 /span /strong ，而 span style=" text-indent: 2em color: rgb(0, 112, 192) " strong 后者使用ICP质谱技术 /strong /span 作为检测手段。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 近日，浙江大学医学院欧阳宏伟教授课题组在 strong 《Applied Materials Today》在线发表最新论文“Single-cell mass cytometry reveals in vivo immunological response to surgical biomaterials” /strong 。该研究运用 strong 单细胞质谱流式技术 /strong 分析了两种生物材料(聚丙烯补片和丝素补片)在软组织修复过程中的系统性免疫反应特征，比较了两组外周血免疫细胞的比例以及与免疫细胞中激活、迁移相关的功能标志物表达情况，显示丝素补片具有更好的生物相容性。 /p p style=" text-align: justify " 　　生物材料已经在临床被广泛应用，如腹部疝修复使用的补片，软骨修复中使用的支架，肌腱重建中使用的人工韧带等等。然而， strong 生物材料植入体内后会引起体内的免疫应答，严重的免疫反应(异物反应)会造成一系列的并发症：疼痛、感染、组织粘连等，使得治疗失败甚至需要二次手术。 /strong 2016年，业界某巨头公司大量疝修复补片产品因考虑到复发率或再次手术率高等因素被其安全团队召回1。因此， strong 生物材料的临床前安全评估和临床监测非常重要 /strong 。但是，目前检测生物材料的检测方法大多是体外实验不能精准模拟体内复杂的环境 或是聚焦于局部免疫反应而缺乏对全身系统性免疫的评估，因此未能准确评估生物材料的安全性，不能有效预测和规避不良后果。 /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 单细胞质谱流式是一项通过使用金属标记抗体，质谱检测信号的新型流式技术，近年来已经被广泛应用于细胞分化、肿瘤检测、药物筛选等多个研究领域。 /strong 它具有高通量、高分辨率的特点：在单细胞水平上可同时分析超过40种细胞标志物，可同时检测上百个通道，可用来分析评估复杂细胞系统中细胞亚群和功能标志物表达情况。因此，单细胞质谱流式技术可以作为深度解析生物材料体内免疫应答的“利器”。 /p p style=" text-align: justify " 　　该研究以外科常见疝修复手术应用的聚丙烯补片和丝素补片为例，首次利用单细胞质谱流式技术评估了这两种生物材料在小鼠腹部缺损模型中引起的系统免疫反应(图1)。结果显示：与聚丙烯补片相比，丝素补片组的外周血中巨噬细胞，单核细胞，中性粒细胞，CD4+ T 细胞，以及CD8+ T 细胞比例更低，免疫细胞比例更接近于对照组 并且免疫细胞激活、迁移相关的功能性标志物 (CD115, CD27, and CD62L)也相对低表达。同时，丝素补片组材料植入处的免疫细胞(巨噬细胞和中性粒细胞)浸润要显著性低于聚丙烯补片组。此外，作者还发现丝素补片组具有较轻的组织粘连和更好的组织修复效果(图2)。这表明系统性免疫应答特征(免疫细胞比例和功能标志物表达情况)可以体现生物材料在体内异物反应的程度，或可作为预测并发症发生和组织修复情况的依据。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 340px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/8feb1c54-1ba4-4f70-8807-a919671ac9d8.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" width=" 600" height=" 340" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　图1：运用单细胞质谱流式技术解析材料植入体内后的系统性免疫反应 /p p style=" text-align: justify " 　　 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/0a7c1d2f-8d2f-4680-8a85-2d2d5bacfee4.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" / /p p style=" text-align: center " 图2：两种生物材料植入后的组织粘连和组织修复情况 /p p style=" text-align: justify " 　　该研究提出了基于单细胞质谱流式的一种高通量高分辨率的生物材料体内系统性免疫应答评估策略，这可为生物材料的临床前安全评估和临床应用监测提供有效手段，为进一步筛选和开发免疫调控性生物材料提供新思路和新方法。 /p p style=" text-align: justify " 　　植入性医疗器械的快速发展促进人们对医疗服务的要求日益提高，生物材料的安全问题越来越受到重视。生物材料的成分、磨损、代谢、降解产物等带来的风险可以通过不断发展的新型高通量检测技术进行评估。 /p p style=" text-align: justify " 　　近期浙江大学医学院欧阳宏伟教授实验室基于单细胞质谱流式技术，结合HLLA-seq及生物材料-基因作用图谱策略(NGA)，将从单细胞水平、整个机体水平建立起一套完善、系统的评价系统，为生物材料的临床使用保驾护航。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 567px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/c95b96ea-40c8-4450-a6cf-4bffc9db1862.jpg" title=" 3.jpg" alt=" 3.jpg" width=" 600" height=" 567" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify " 　　 /p p style=" font-size: inherit font-weight: normal padding: 0px margin: 0px font-family: & #39 Microsoft YaHei& #39 line-height: 40px white-space: normal text-align: center background-color: rgb(255, 255, 255) " a href=" https://www.instrument.com.cn/netshow/SH104342/C325581.htm" target=" _blank" style=" color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong Helios& reg 质谱流式细胞仪系统 /strong /span /a /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " Helios& #8482 质谱流式系统具有高效简洁的工作流程以及广泛的适用性，通过独创的金属标签抗体技术，标记细胞表面及胞内蛋白，实现单细胞的多参数检测，可以对单细胞进行全面的表型、信号通路及功能研究。 /p p br/ /p

这是第一个将微生物群与人类免疫系统动态联系起来的研究。报道依旧来自纪念斯隆-凯特琳癌症中心，他们首次拿到了肠道微生物群直接塑造人类免疫系统构成的证据。这项研究采集了2000多名患者长达十年的跟踪数据。“科学界已经接受了肠道微生物对人类免疫系统健康很重要的观点，但这种假设的数据来自动物研究，”纪念斯隆-凯特琳癌症中心系统生物学家Joao Xavier说。“而我们有一个非常好的机会了解接受血癌治疗的人群的微生物群组成变化。”研究中使用的数据来自接受异基因干细胞和骨髓移植（BMT）的人。在强烈的化疗或放疗被用来破坏癌细胞后，病人的造血系统被供体的干细胞所取代。在捐献者的血细胞（包括构成免疫系统的白血球）建立自己之前的几个星期里，病人极易受到感染。在这段时间里，为了保护他们，病人被给予抗生素。但这些抗生素中的许多都有有害的副作用，即破坏肠道内健康的微生物群，让危险的菌株占据上风。当病人的免疫系统重建后，抗生素停止使用，肠道微生物群开始慢慢恢复生长。这两个免疫系统的修复给了我们一个独特的机会来分析这两个受损的免疫系统之间的联系。十多年来，MSK的BMT服务人员在整个BMT过程中定期收集和分析患者的血液和粪便样本。MSK的Lucille Castori微生物、炎症和癌症中心的工作人员对细菌DNA进行了处理，该中心在创建大量微生物群数据集方面发挥了关键作用。“我们每天都收集样本，这样我们就能真正看到每天发生的事情。微生物群的变化是迅速和戏剧性的，几乎没有其他环境可以让你看到它们，” Marcel van den Brink博士说。MSK团队创建的数据库包含了不同时期病人肠道中微生物种类的详细信息。随后，包括Jonas Schluter博士和Xavier在内的计算团队使用机器学习算法来挖掘电子健康记录中有意义的数据。健康记录中的数据包括血液中存在的免疫细胞类型、患者服用药物的信息以及患者所经历的副作用。分析这么多数据是一项艰巨的任务。Schluter博士当时是Xavier博士实验室的博士后研究员，他为此开发了新的统计技术。“这项研究的目的并不是说某些微生物对免疫系统是‘好的’还是‘坏的’，”Xavier博士解释说。“这是一段复杂的关系。我们想要增加或减少的免疫细胞的亚型每天都在变化，这取决于身体里发生了什么。重要的是，现在我们有了研究这个复杂生态系统的方法。”研究人员说，他们还计划将他们的数据应用于研究接受其他癌症治疗的患者的免疫系统。他们以前的研究使用了从这项工作中收集的样本，研究了在骨髓移植过程中肠道微生物群如何影响患者的健康。一项发表于2020年2月的研究报告称，肠道微生物群中物种的多样性更大，与BMT后的死亡风险较低相关。研究还发现，移植前微生物群的多样性较低，导致移植物抗宿主病的发生率较高，这是供体免疫细胞攻击健康组织的潜在致命并发症。

癌症仍然是威胁人类健康最大的敌人之一，虽然目前针对癌症的治疗方案有了很大的发展，但是癌症治愈难并且治疗费用高的现状仍然不会在短时间内得到改善。因此，除了在治疗阶段应对癌症外，早期的诊断检出仍然是降低肿瘤死亡率的重要手段。除常规筛查外，内源性肿瘤标志物的检测成为当前发展的新兴技术，其中包括CTC，ctDNA以及肿瘤外泌体等的检测。内源性标志物检测的难点在于体内标志物会快速清除且检测背景高以及体内无法富集都是导致它们应用难以推广的重要原因。为解决这个难题，美国斯坦福大学医学院的Sanjiv Gambhir博士团队对免疫细胞中的巨噬细胞进行改造，成功在小鼠肿瘤模型中实现肿瘤细胞的早期检测和跟踪标记。其主要策略是：通过对巨噬细胞进行改造，在肿瘤诱导产生的M2型巨噬细胞的启动子后面标记上生物发光的标记。当在肿瘤环境中，可以更加诱导巨噬细胞向M2型分化，并启动荧光素酶基因的表达。利用该策略可以检测出转移瘤以及皮下瘤的发生。目前，这项技术可用于检测直径小至4毫米大小的肿瘤，不仅更加优于常规肿瘤体积检测，而且与常见生物标志物检测相比，如体外RLU方案，CEA指标检测方案 ，ctDNA，qtPCR方案等检测，表现出更高的灵敏度。参考文献Sanjiv S. Gambhir et al. Engineered immune cells as highly sensitive cancer diagnostics. Nature Biotechnology (2019).

“细胞因子风暴”一般情况下叫“细胞因子释放综合症（cytokine release syndrome, crs）。细胞因子风暴通常指大量的细胞因子在短时间内释放，造成人体过度的炎症反应，进而引起机体多器官衰竭，造成严重的不良反应。包括car-t在内免疫细胞治疗是近年兴起的肿瘤免疫治疗的重要方法，将病人免疫细胞体外改造活化后，回输人体，利用免疫反应杀伤肿瘤细胞。因为免疫细胞治疗，会将数以亿计的免疫细胞回输机体，活化的免疫细胞短时间内会释放大量细胞因子，如果不能很好监控，并及采取医疗措施平衡细胞因子水平，将会引起极大的副作用。近年出现的免疫细胞治疗病人死亡案例， 多与此有关。监测crs相关细胞因子crs , 比如gm-csf ,ifn-gamma ,il-1b ,il-2ra/cd25 , il-6 ,il-6ra ,il-10 , il-17a ,mcp-1 ,tnf-alpha，vegf-a，是免疫治疗的重要环节。对于crs细胞因子监测，传统方法为elisa法，存在者众多问题，其中最是：灵敏度不够。 例如作为crs核心调控的细胞因子il-6（emerging evidence implicates il-6 as a central mediator of toxicity in crs，blood, 10 july 2014）.传统elisa的灵敏度大概在15pg/ml。cell 2016年发表文章，20岁-60岁 534个健康人 il-6的表达水平主要分布在0.2pg/ml至2pg/ml，远低于elisa检测水平。而使用il-6抑制剂tocilizuma 是目前临床对于crs病人救治的主要办法。measurement of resting levels of low abundance cytokines such as il-1b, il-6,il-18, and vegf are below the lower limit of quantification by standard elisas in a healthy cohort therefore, the ella microfluidic analyzer was used to assess cytokine concentrations in the fg/ml to low pg/ml range.cell 167, 1111–1124, november 3, 2016proteinsimple ella超灵敏全自动elisa系统可以很好解决传统elisa存在的灵敏度和一致性差的问题。 alexion pharmaceuticals 2017年也发表了使用ella检测elisa无法检测的临床试验样品。在28例elisa无法获取理想结果的人血清样本中，ella全部获取理想结果。proteinsimple 针对免疫细胞治疗细胞因子风暴检测灵敏度不足问题，基于ella平台推出全套细胞因子检测产品：crp，gm-csf ,ifn-gamma ,il-1b ,il-2ra/cd25 , il-6 ,il-6ra ,il-10 , il-17a ,mcp-1 ,tnf-alpha，vegf-a。产品有三种规格：单因子x 72样本， 4因子x16样本，4因子x32样本。更多资料请联系proteinsimple中国热线： 4000-863-973

时间：2018年6月28日 19:30 - 20:30内容简介：免疫系统作为人体抵御细菌病毒等外敌侵害的重要防御系统，当其自生产生异常或缺陷时就会产生诸如类风湿性关节炎，强直，系统性红斑狼疮等自生免疫型疾病，流式细胞仪可以快速准确地获取免疫细胞亚群的各类信息，能有效地帮助我们进行疾病诊断和疾病状态评估，指导治疗。本次讲座将针对流式在风湿免疫疾病中的应用进行讲解。主讲人简介：何燕厦门大学附属第一医院，风湿免疫科，主管技师厦门大学附属第一医院风湿免疫科实验室主管技师，具有丰富的风湿疾病检验经验和科研水平；同时主持参与多个风湿免疫类疾病相关科研项目。如需报名或索取相关资料，请在线留言，告知需要参加的讲座名称。

单细胞转录组以及蛋白质组分析为获得健康和疾病相关细胞图谱提供了技术支持，也彻底的改变了对多种生物现象的解释。单细胞技术能够在高精度和高分辨率的水平上分析细胞状态。但是当前技术还不能够在动态的场景中捕捉细胞状态的转变。每个细胞的行为改变是遗传和信号网络共同作用的结果，因组织和细胞类型而异。2022年1月5日，来自西班牙国家心血管研究中心的Andrés Hidalgo 团队在Nature上发表题为Behavioural immune landscapes of inflammation 的文章。作者利用成像技术结合机器学习开发出实时细胞行为分析体系。作者首先使用CD11c-YFP小鼠，过继回输CFP+中性粒细胞，并用流感病毒PR8感染小鼠，对气管进行成像。作者总共提取了118个参数进行分析，这118个参数描述了单细胞的运动和性状特征。过滤处理后，生成了一个可视化网络图。通过筛选最能代表细胞行为的参数，作者选定了31个参数，包括19个动力学参数和12个形态参数。作者用31个参数生成了t-SNE图，显示了基于细胞行为的两个主要细胞群。作者进一步在多维度分析基础上确定最能区分各细胞群的特定参数。如细胞运动变化的速度比绝对细胞大小的参数更能预测细胞身份，这也表明行为变化中包含生物信息。作者用每个参数的可预测性强度改进了细胞预测网络，来推断在病毒感染模型中气管中特定的生物学特征。如中性粒细胞在DC附近移动较慢，而DC则表现出较高的同质行为。作者又利用皮肤缺血再灌注和激光烧伤模型测试了这些基于行为的分析模式。在缺血再灌注损伤模型中，三个细胞簇可以匹配三种细胞类型：中性粒细胞、DC和巨噬细胞。进一步子聚类分析可以识别两种中性粒细胞、两种类型DC和三种巨噬细胞。而在激光损伤模型中，作者能够利用参数分析模式更加精准区分中性粒细胞和DC。作者还发现了中性粒细胞以不同的行为模式涌向损伤部位。作者利用每个细胞数据中包含的位置信息将细胞投影到实际位置，以此构建行为图，试图实现个体特征与复杂行为模式的关联。这样的分析能够实现不同细胞分布可视化，同时能够通过实时成像捕获细胞行为，可以在其原生环境中分析细胞特征。炎症与中性粒细胞等细胞亚群特别相关，其中蛋白质或转录组变化都会影响炎症的结果。而细胞状态是细胞动态变化的基础。所以作者接下来用lyzM-GFP小鼠构建TNF诱导的血管炎模型，以此模型分析中性粒细胞状态变化。为了提高形态测量、动力学特征以及与血管壁距离测定的准确性，作者开发了一个基于机器学习的定制分析工具，它可以产生73个参数，准确描述血管内粘附细胞状态。作者总共发现了血管内三种细胞簇。分析发现第一和第三代表一个连续体的两个极端，第二种细胞簇代表血管内中性粒细胞的过渡状态。接下来作者使用24种突变小鼠。并利用以上分析模式对细胞状态进行分析。结果发现其中五种品系小鼠会出现抗炎表型，血管中中性粒细胞行为状态转换会出现不同变化。这表明细胞的状态调控开关主要由特定的信号通路组成，提高了靶向治疗以保护机体免受血管损伤的可能性。作者最后利用肾小球肾炎模型重点分析了Fgr这一分子对中性粒状态的调控。结果发现Fgr可以介导血管中中性粒细胞向致病方向转变。本文利用机器学习结合成像生成的数百种参数分析细胞行为状态变化，可以实现实时捕捉在原生环境中的细胞行为变化，并利用这一体系分析发现靶向特定免疫行为特征，具有治疗价值。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04263-y

文章来源：中华检验医学杂志, 2022,45(8) : 790-801作者：中国中西医结合学会检验医学专业委员会摘要嵌合抗原受体（CAR）-T细胞免疫治疗是近年来肿瘤治疗领域一个举世瞩目的重大成果。流式细胞术（FCM）在CAR-T细胞免疫治疗相关检验的每一个步骤中都起到非常重要的作用，包括靶点筛查、CAR-T细胞产品成分鉴定、毒性预估、微小残留病（MRD）检测、免疫功能评价、免疫微环境研究等。为了深刻认识FCM在CAR-T细胞免疫治疗这一新兴领域的作用，规范每一项应用中的操作，进一步促进其在CAR-T细胞免疫治疗中的应用，中国中西医结合学会检验医学专业委员会制定了此专家共识。嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）-T细胞免疫治疗是近年来肿瘤治疗领域一个举世瞩目的重大成果［1, 2, 3, 4, 5, 6, 7］，尤其是CD19-CAR-T细胞免疫治疗难治复发B细胞急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）获得了90%左右的缓解率［1, 2, 3］，单独使用或者桥接异基因造血干细胞移植均极大程度地提高了患者的完全缓解率和生存率；CAR-T细胞免疫治疗其他类型白血病、淋巴瘤、骨髓瘤以及实体瘤也在不断探索并取得巨大进步［4, 5, 6, 7］。流式细胞术（flow cytometry，FCM）在CAR-T细胞免疫治疗相关检验的每个步骤中都起到非常重要的作用 ［1, 2, 3, 4, 5, 6, 7］。作为一项免疫治疗，CAR-T细胞免疫治疗相关检验中涉及的FCM与临床常规不同，体现在靶点评估需要精确设门并且同时关注正常细胞的表达，CAR-T细胞免疫治疗后微小残留病（minimal/measurable residual disease，MRD）需要考虑靶点丢失以及输入的CAR-T细胞影响，而CAR表达细胞比例和数量的检测以及免疫相关检测均缺乏规范化，给临床工作带来不确定性等。为了能使更多相关领域的科研、临床和实验室检测人员认识FCM在CAR-T细胞免疫治疗中的作用和注意事项，规范在每项检验中的实验方案和技术操作，进一步促进其在CAR-T细胞免疫治疗中的应用，中国中西医结合学会检验医学专业委员会组织专家结合文献学习和多家医疗机构的临床工作实践制定了本专家共识。适用范围、术语和定义一、适用范围各类医疗机构临床实验室、商业化实验室和科研单位在使用FCM进行CAR-T细胞免疫治疗相关临床检验时，均可采用或参照使用本专家共识。鉴于CAR-T细胞生产过程中的创新性和复杂性，并且该步骤极少在临床诊断实验室中进行，本共识不涉及此研发过程。二、术语和定义1.多参数流式细胞术（multiparametric flow cytometry，MFC）：虽然MFC的术语出现于20世纪80年代，当初指代两色以上FCM，后期对此也没有明确定义，但是现在普遍建议采用三激光八色或者以上机型。2.CAR-T细胞免疫治疗：人体免疫细胞（来自自体或异体均可），在体外经过基因修饰后具备了特异性识别和杀伤表达特定抗原的肿瘤细胞的能力，输入患者体内以实现清除肿瘤细胞或者其他病态细胞的免疫治疗方法［1, 2, 3, 4, 5, 6, 7］。CAR-T细胞免疫治疗技术包括几个步骤：（1）从患者或者供者血液中分离出自体或者异体T淋巴细胞；（2）用CAR编码的病毒载体进行体外修饰、培养；（3）最后输入患者体内。近年来为了增强治疗效果降低副作用，已发展到第4代CAR-T细胞免疫治疗技术。3.细胞因子：细胞因子是由多种免疫细胞分泌的一类小分子蛋白质，具有介导和调节免疫过程等作用。目前已经发现的人类细胞因子有200多种。根据结构和功能一般可分为白细胞介素（interleukin，IL）、干扰素（interferon，IFN）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、集落刺激因子、趋化因子和生长因子等。4.细胞因子释放综合征：细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）是一种发生在任何免疫治疗后，由于内源性或者输注的T细胞和/或其他免疫效应细胞活化或者聚集导致的超生理反应。症状多样，但是必须包括初发时发热，可能伴有低血压、毛细管渗漏（低氧）和终末器官衰竭。尽管没有将细胞因子检测纳入定义，而CRS分级也主要是根据临床表现，但是鼓励进行C反应蛋白、细胞因子、铁蛋白等相关检测，便于为将来的研究提供依据［8］。5.趋化因子及其配体：趋化因子是能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子，其配体很多是免疫功能检测中区分淋巴细胞亚群的重要标志物，例如半胱氨酸-半胱氨酸基序趋化因子受体（cysteine-cysteine motif chemokine receptor，CCR）系列，半胱氨酸-氨基酸-半胱氨酸基序趋化因子受体（cysteine-X-cysteine motif chemokine receptor，CXCR）系列［9］。6.抗原表达率：精确设门后，特定细胞上抗原表达的百分比。临床工作中由于受到抗体和荧光素选择、抗原抗体结合过程、温度光照和放置时间导致荧光信号改变、仪器设置、设门精确度、个体差异、细胞异质性、对照细胞群、检测目的等多种因素影响，以诊断为目标的临床实验室，一般由流式操作人员排除各种影响因素后，按照表达、部分表达、不表达进行定性描述［10］，以方便临床和实验室对目的细胞群进行简单直观的性质判断。7.抗原表达强度：与某种抗原分子在细胞上表达量的多少有关，FCM的直观体现为荧光强度。根据抗原表达强度将阳性细胞表达分为强表达（bright，bri）、中等强度表达、弱表达（dim）和异质性表达［10］，可能会随着治疗和疾病或者活化状态发生改变。8.单链可变区片段（single-chain variable fragment，scFv）：构建CAR-T细胞需要将CAR基因通过病毒载体或非病毒系统转染并整合到T细胞基因组上。CAR基因正常表达时，形成跨膜的CAR结构，细胞外域的重链可变区和轻链可变区通过15~20个氨基酸短肽连接而成的部分即为scFv。编码的scFv元件既是CAR-T细胞识别肿瘤抗原的重要成分，也可作为FCM评价CAR表达情况的检测靶点之一。9.同型阴性对照：用于检测抗体与细胞表面可结晶段受体非特异性结合导致背景信号的阴性对照。应该用与检测抗体相同标记、同种属来源、相同亚型、相同浓度的免疫球蛋白进行染色，如果是间接标记抗体，还需要做二抗的荧光素背景对照，其作用是设置仪器条件，消除背景染色。对于正常标本中不存在的未知标志或者与阴性细胞界限不清的标志，或者标本中比例极低需要精确检测的标志，同型阴性对照是普遍采用的对照。CAR-T细胞免疫治疗相关检验中的FCM项目CAR-T细胞的生产研发、临床治疗每个环节都与FCM检测密不可分，包括靶点筛查、患者选择、CAR-T细胞成分鉴定、毒性预估、MRD检测、回输物和患者标本免疫功能评价、免疫微环境和复发机制研究等。鉴于CAR-T细胞治疗这一全新领域集合了肿瘤细胞和正常细胞免疫表型、肿瘤干细胞免疫表型、免疫细胞亚群、细胞因子检测、CAR-T细胞检测、因部分病例靶点丢失甚至系别转变导致需要调整方案的FCM MRD检测、肿瘤异质性和免疫微环境检测等（表1），以及CAR-T细胞治疗设计的多样性和复杂性、临床工作中使用不同靶点或者联合靶点CAR-T细胞治疗、使用其他细胞因子或者信号分子靶向药物控制副作用等，这些都对FCM检测提出更高的要求。因此深入了解每个环节需要使用的标本类型、检测方案以及最低检测要求，将有助于进一步规范检测流程，提高检测水平，保证检测质量。FCM在CAR-T细胞免疫治疗靶点筛查中的应用随着CAR-T细胞治疗技术的不断完善，CAR-T细胞的功能和治疗的安全性都有了很大提升，并有CAR-自然杀伤（natural killer，NK）细胞、双特异性靶点CAR-T细胞等类似靶向细胞免疫治疗产品出现。但是作为特异性免疫治疗，胞外抗原识别区的设计，尤其是有效靶点的选择始终是每一种CAR-T细胞治疗相关产品的关键环节。理想的靶点应该满足下述要求：高覆盖率（某种疾病的群体中，肿瘤细胞表达该抗原的患者比例高）、高表达率（阳性个体中几乎所有肿瘤细胞都表达）、高表达强度（在肿瘤细胞表面抗原分子数量多，表现为同一种荧光标记时，荧光强度高）、高特异性（在正常细胞中不表达或者少表达，对患者不会造成严重影响）［11］。FCM作为一项快速、简便、直观、定性定量的技术，是目前实现这一目的的重要检测手段，而CAR-T细胞治疗靶点的选择虽然都是在免疫分型或者MRD的基础上进行，但是比常规临床诊断有更严格的特殊注意事项［12, 13］。共识2：为了尽可能给CAR-T细胞免疫治疗提供客观评价，建议一项研究或治疗过程中尽量采用相同的方案，至少是关键抗体和组合相似的方案。同一患者的随访监测尽量在同一台仪器上进行，且尽量仪器条件（包括补偿）相同，或者进行仪器间条件比对。推荐强度：建议执行。）专家组成员（按姓名字母顺序排列

作为免疫、基因及细胞治疗领域产学研医转化影响力最高的年度品牌盛会之一，IGC 2022第六届免疫基因及细胞治疗大会将于8月30-31日在北京盛大召开。• 对于前沿疗法的申报、技术评价、伦理遗传资源的政策与监管有哪些最新要求？• 基因治疗细胞治疗的非临床药理毒理、CMC该如何评价？动物及替代模型该如何选择？• 推进临床，IIT/IND该如何满足申报要求？首次人体试验我们该怎么进行剂量的爬坡、试验的设计？• 国内不同载体递送（AAV及其他病毒、纳米颗粒LNP-mRNA、外泌体等）技术、基因编辑技术、通用型细胞治疗技术、iPSC干细胞技术、再生医学基因治疗等的前沿研发与药物转化将有哪些突破与融合？如何应对CMC产业化挑战？• 应对实体瘤挑战，细胞免疫联合治疗将有哪些布局以及组合可能？临床前与临床进展几何？• … … 面对前沿创新疗法的成药性与监管挑战，IGC 2022全新升级启航！IGC将从4大会场14大细分专题出发，解析国内外免疫细胞治疗、基因治疗、干细胞治疗最新的政策与监管趋势，探讨国内外AAV及其他病毒载体基因治疗、非病毒载体基因治疗（纳米颗粒核酸递送、外泌体等）、体内基因编辑治疗、通用型细胞免疫治疗、实体瘤细胞免疫治疗与联合、干细胞基因治疗、iPSC与MSC干细胞治疗等的新研究、新技术、新产品的领先突破，促进国家产学研医的深入交流与合作，加快中国免疫基因及细胞治疗的产业转化！感恩回馈！老客户专享！6月17日前，5人组团注册报名，立减￥1380 起！更有限时早早鸟特惠！为感谢行业同仁对IGC一直以来的大力支持，特面向IGC的往届参会嘉宾与参展企业，开放惊喜参会/参展折扣！详情欢迎联系组委咨询：180 1793 9885（同微信）全新升级 | 大会结构百家争鸣：基因治疗技术创新与研发• 专题：基于病毒载体的下一代基因治疗研发• AAV 基因治疗• 其他病毒载体下的基因治疗• 专题：基因编辑疗法与新型非病毒递送下的基因疗法• 体内基因编辑技术与疗法研发• 新型非病毒递送系统下的基因疗法-纳米颗粒、外泌体等• 专题：基因治疗热点聚焦• 基因治疗IIT/IND申报与非临床评价• 基因治疗临床需求、申报及研发领先实践强强联合：下一代细胞免疫治疗与联合治疗• 异体通用型细胞免疫治疗监管与评价• 通用型细胞免疫治疗创新研发• 实体瘤免疫细胞治疗及联合治疗• 非肿瘤细胞免疫治疗时代已来：干细胞治疗研发与产业化• 干细胞治疗监管与评价• 再生医学干细胞基因治疗前沿• iPSC诱导多功能干细胞治疗研发• 下一代MSC干细胞治疗研发-外泌体、同种异体等精英荟萃 | 谁将参加？工业界药物发现、研发、药理毒理、临床部1. 细胞免疫治疗2. AAV及其他病毒载体基因治疗3. 基因编辑治疗4. 非病毒载体基因治疗、核酸疗法5. 干细胞治疗、干细胞基因治疗6. 从事肿瘤联合治疗：免疫检查点抗体/溶瘤病毒/肿瘤疫苗科研院校研究员/学者医学院、生命科学、药学院、免疫所医院临床医生/研究员肿瘤科血液科生物治疗科眼科神经科其他上游供应商原料、耗材、仪器、设备、软件解决方案CRO/CDMO/法规/市场服务提供商政府/监管机构… … 百家争鸣 | 往届嘉宾盛况（列举）高福，中国科学院院士、中国疾病预防控制中心主任Jonathan Sprent，美国科学院、澳大利亚科学院双院士罗建辉，国家药审中心生物制品药学部部长宾夕法尼亚大学细胞免疫治疗产品开发实验室Joseph Melenhorst，宾夕法尼亚大学细胞免疫治疗产品开发实验室主任袁宝珠，前中国食品药品检定研究院细胞资源储藏及研究中心主任Michael G. Covington，Juno首席CMC法规政策和战略负责人颜光美，中山大学药理学教授，中山大学原副校长石远凯，国家癌症中心副主任，中国医学科学院肿瘤医院副院长韩为东，解放军总医院分子免疫学研究室主任蒋海燕，Editas Medicine临床前科学副总裁田志刚，中国工程院院士，医学免疫学家，中国科学技术大学生命科学学院教授，免疫学研究所所长Saar Gill，宾夕法尼亚大学医学助理教授、Carisma Therapeutics联合创始人饶春明，前中检院生验所重组药物室主任，国家药典执行委员孟淑芳，中国食品药品检定研院生物制品检定所细胞室研究员张叔人，中国医学科学院肿瘤医院教授高光坪，美国麻省大学医学院医学院终身讲席教授、美国国家发明家科学院院士和美国微生物科学院院士于雷，中国食品药品检定研究院重组药物室副研究员Sol Ruiz，EMA生物制品工作组主席、EMA CAT前沿治疗委员会西班牙主席、西班牙药监局生物药与前沿疗法负责人Mark A. Kay，斯坦福大学医学院人类基因治疗学系主任，前美国基因与细胞治疗学会顾问委员会主席王建祥，中国医学科学院血液学研究所血液病医院副所长林欣，清华大学医学院教授，基础医学系系主任Joe Fraietta，宾夕法尼亚大学助理教授与科学总监、DeCART Therapeutics联合创始人范勇，科济生物全球注册事务高级副总裁，前FDA、CBER药学审评员，国际细胞与基因治疗学会（ISCT）孔祥银，安达生物首席科学家，中科院肿瘤与微环境重点实验室主任、分子遗传学课题组组长李秋棠，纽福斯CSO、美国路易斯维尔大学医学院眼科和视觉科学系终身教授刘卫平，北京大学肿瘤医院移植与免疫治疗病区副主任… … *更多往届嘉宾阵容及会后报告，欢迎联系组委：180 1793 9885（同微信）6月17日前，5人组团注册报名，立减￥1380 起！更有限时早早鸟特惠！扫码咨询共促发展 | 招展/论坛组织工作全面启动IGC 2022第六届免疫基因及细胞治疗大会的招展/论坛组织工作现已全面启动。• 多种合作形式火热开放中！基于IGC在业界的品牌影响和优质口碑，现已与30余家免疫基因及细胞治疗领军供应商企业达成参展意向。🔥主题演讲、包袋赞助、独家冠名等多种合作形式火热开放中！名额有限，详情咨询：180 1793 9885（同微信）• IGC 2022 演讲嘉宾火热征集中！演讲摘要/论文投稿，经组委评估并确认的嘉宾将享受以下福利：• 获得一张免费全程参会证；• 会议期间午餐券、嘉宾招待晚宴；• 在会议期间专享演讲嘉宾休息室；• 组委会官方宣传与推广。投稿邮箱：igc@bmapglobal.com 扫码查看官网赞助 / 演讲 / 媒体合作事宜，欢迎联系组委会电话：+86 180 1793 9885邮箱：igc@bmapglobal.com网址： www.bmapglobal.com/igc2022

自然杀伤细胞（Natural Killer, NK）是先天淋巴细胞的亚群之一，但缺少抗原特异性。NK细胞的效应功能和靶细胞的识别是由对NK细胞表面受体的激活和抑制来平衡调节的，这些表面受体可以区分“自身”抗原、“改变的自身”抗原和“缺失的或非自身”抗原，因此，在消灭异常细胞的同时，可以避免攻击正常的细胞。1-3（图1）图1 – NK细胞识别自身/缺失的/非自身抗原细胞示意图NK细胞在抗肿瘤和抗病毒反应中起关键作用4-6。目前，各种转化研究和临床试验正在利用NK细胞独特的信号通路及其强大的抗肿瘤活性，通过多种手段比如CAR-NK细胞，来治疗血液和实体肿瘤。6研究显示，NK细胞表达的NK细胞受体和其他标记物种类繁多，因此，高参数流式细胞术对于全面的NK细胞表型分析是很有必要的。考虑到越来越多的NK细胞研究需求，Cytek推出了一款 16色 （18标记）NK 细胞免疫分型试剂，该试剂可在3激光以上配置的Cytek® 全光谱流式细胞分析系统上使用，仅需一管样本，研究者即可方便快捷的对人NK细胞免疫表型进行全面深入的分析。（图2）图2- Cytek® 16色人NK细胞免疫分型试剂Cytek® 16色人NK细胞免疫分型方案可识别和表征三种主要的人类NK细胞亚群：早期NK细胞（CD16- CD56bright），成熟NK细胞（CD16+CD56dim）和晚期NK细胞（CD16+CD56-），并支持对这三种NK细胞亚群的成熟和激活状态、迁移潜力、以及NK细胞表面的激活和抑制受体的表达进行分析。此外，该方案还可分析更多NK亚群，如CD226-CD56dim NK细胞，及CD57+CD56dimCD16+ NK细胞7-11。（图3）图3- 不同状态下的NK细胞示意图Cytek® 16色 NK 细胞免疫分型方案是一款预优化的试剂组合产品，避免了耗时的、耗费劳动力的、且昂贵的方案设计与优化。该方案详细的试剂组成请参考下表1。同时，方案经过系列测试，证实可以很好兼容人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）样本和EDTA采集管收集的血液样本。表1：Cytek® 16色NK细胞免疫分型方案（P/N R7-40011）的组成。方案可添加ViaDye&trade Red Fixable Viability Dye Kit (P/N R7-60008)作为死活染料。Cytek® 16色 NK 细胞免疫分型方案识别NK细胞及其激活状态的数据分析设门策略如下图4所示，依次进行单细胞门和非红细胞（non-RBC）设门后，通过进行谱系（CD14、CD19、CD123）阴性、CD3-、淋巴细胞、及HLA-DR-CD127- 系列设门，识别出NK细胞。利用CD56和CD16绘制二维点图，以确定三种主要的NK细胞亚群：早期NK细胞（CD16- CD56bright），成熟NK细胞（CD16+CD56dim）和晚期NK细胞（CD16+CD56-）。在代表总NK细胞群的密度图中，显示了各个NK细胞标记 vs. CD56，以及CD159a vs. CD159c 的表达情况。（图4）图4- 使用Cytek® 16色NK细胞免疫分型方案数据分析设门策略。数据来自于EDTA管收集的健康供者的全血样本。Cytek 还提供以下工具来进一步优化您的实验室工作流程，提高工作效率： &bull 完整的样品制备、染色和获取操作流程 &bull 实验及分析模板参考文献：Arachchige, A.S.P.M. (2021) Human NK cells: From development to effector functions. Innate Immunity 27(3): 212-229.Sivori, S., et al. (2019) Human NK cells: surface receptors, inhibitory checkpoints, and translational applications. Cellular & Molecular Immunology 16: 430-441.Kumar, V., McNerney, M. A new self: MHC-class-I-independent Natural-killer-cell self-tolerance. Nat Rev Immunol 5, 363–374 (2005). https://doi.org/10.1038/nri1603Bjö rkströ m, N.K., et al. (2022) Natural killer cells in antiviral immunity. Nature Reviews Immunology 22: 112-123. Cooper, M.A., et al. (2001) The biology of human natural killer-cell subsets. Trends Immunol. 22(11): 633-640.Ghaedrahmati, F., et al. (2023) Targeting immune checkpoints: how to use natural killer cells for fighting against solid tumors. Cancer Commun. 43(2): 177-213Stannard, K.A., et al. (2019) Human peripheral blood DNAM-1neg NK cells are a terminally differentiated subset with limited effector functions. Blood Adv. 3(11): 1681-1694.Lopez-Vergès, S., et al. (2010) CD57 defines a functionally distinct population of mature NK cells in the human CD56dimCD16+ NK cell subset. Blood 116(19): 3865-3874.Martinet, L.A., et al. (2015) DNAM-1 expression marks an alternative program of NK cell maturation. Cell Rep. 11: 85-97.Kurioka, A., et al. (2018) CD161 Defines a functionally distinct subset of pro-inflammatory natural killer cells. Front. Immunol. 9: 486Bjö rkströ m, Niklas K., Hans-Gustaf Ljunggren, and Johan K. Sandberg. "CD56 negative NK cells: origin, function, and role in chronic viral disease." Trends in immunology 31.11 (2010): 401-406.

三氯蔗糖，是一种常见的人造甜味剂，比糖甜约600倍，常用于饮料和食品中。与其他代糖一样，它的安全性仍然尚未完全了解。 2023年3月15日，英国弗朗西斯克里克研究所的研究人员在国际顶级期刊Nature上发表了一篇题为" The dietary sweetener sucralose is a negative modulator of T cell-mediated responses "的研究论文。该研究表明，高剂量的三氯蔗糖会限制小鼠T细胞增殖和分化，从而降低免疫细胞活性，喂食高剂量三氯蔗糖的小鼠，对癌症或感染反应时激活T细胞的能力较差。 重要的是，如果这一发现在人类身上得到证实，那么就可以利用三氯蔗糖抑制免疫反应的能力，治疗人类的自身免疫性疾病，例如，1型糖尿病和类风湿性关节炎等。图1 研究成果（图源：Nature） 在该研究中，研究人员测试了三氯蔗糖对小鼠免疫系统的影响，给小鼠服食高剂量的三氯蔗糖，这一剂量高于正常人类饮食中的量，接近欧洲和美国食品安全当局推荐的最大量，相当于人类每天喝10灌含三氯蔗糖的碳酸饮料。研究发现，高剂量的三氯蔗糖会限制小鼠T细胞增殖和分化，从而降低免疫细胞活性。 从机制上讲，三氯蔗糖会影响T细胞的膜顺序，同时降低T细胞受体信号传导和细胞内钙释放的效率。喂食高剂量三氯蔗糖的小鼠，对癌症或感染反应时激活T细胞的能力较差，对其他类型的免疫细胞没有影响。 研究人员表示，在日常饮食中，人们不必过于担心，因为在日常食物中很难摄取到实验中的三氯蔗糖水平。相反，如果这一发现在人类身上得到证实，那就有希望开发一种治疗人类自身免疫性疾病的方法，即在人类身上使用更高治疗剂量的三氯蔗糖，有助于减轻过度活跃的T细胞的有害影响。 研究人员还表示，我们观察到的对免疫系统的影响似乎是可逆的，我们认为三氯蔗糖是否可用于改善自身免疫等疾病，尤其是在联合疗法中，可能值得研究。 下一步，研究人员现计划进行试验，以测试三氯蔗糖是否对人类有类似的作用。不仅如此，三氯蔗糖可以通过影响肠道菌群来影响人类健康。 2022年8月19日，魏茨曼科学研究所的研究人员在Cell上发表了一篇题为" Personalized microbiome-driven effects of non-nutritive sweeteners on human glucose tolerance "的研究论文。研究发现，人造甜味剂，尤其是三氯蔗糖，在人体内并不是惰性的，它们会影响人体肠道微生物，从而改变人体血糖水平。 此外，三氯蔗糖还增加心血管疾病风险。2022年9月7日，世卫组织、巴黎大学的研究人员在《英国医学杂志》（BMJ）上发表了一篇题为" Artificial sweeteners and risk of cardiovascular diseases：results from the prospective NutriNet-Santé cohort "的研究论文。研究表明，人造甜味剂总摄入量与心血管疾病风险增加9%相关，与脑血管疾病风险的增加更显著，高18%。 对人造甜味剂分类研究发现，阿斯巴甜的摄入与脑血管事件风险增加17%相关，乙酰磺胺酸钾和三氯蔗糖与冠心病风险增加40%和31%相关。其中，三氯蔗糖与冠心病风险显著相关。综上，研究表明，人造甜味剂不是糖的健康和安全替代品。

p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 加州大学旧金山分校的科学家们利用CRISPR-Cas9基因编辑系统创造了第一个对免疫系统功能性“隐身”的多能干细胞，这是生物工程的一项壮举，有助于帮助实验室研究防止干细胞移植排斥的出现。这些“通用”干细胞比为每位患者量身定制的干细胞更有效地完成个性化医疗，实现再生医学。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 这一研究成果公布在2月18日的Nature Biotechnology杂志上，由加州大学旧金山分校心脏外科主任Julien I.E. Hoffman博士等人领导完成， Hoffman博士说，“科学家经常吹嘘多能干细胞的治疗潜力，比如说它可以形成任何成体组织，但是免疫系统不这么认为，它一直都是安全有效进行干细胞治疗的主要障碍之一。” /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 免疫系统一方面能保护我们免受外来入侵物的伤害，如果没有它，我们人体无法正常运行；但另外一方面，这也意味着移植的器官，组织或细胞会被认作是具有潜在危险的外来物，因此会引发强烈的免疫反应，导致移植排斥，这也就是临床上所说的“组织相容性不匹配（histocompatibility mismatched）”。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 天津生物芯片 PacBio测序技术详细资料领 取 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 为此我们只能服用抑制免疫活性并减少排斥反应的药物。但不幸的是，这些免疫抑制剂使患者更容易感染和患上癌症。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 干细胞移植领域科学家曾经认为排斥问题可以通过诱导多能干细胞（iPSCs）解决，这种干细胞是由完全成熟的细胞（如皮肤或脂肪细胞）重新编程得来的，可以发育成任何构成身体组织和器官的细胞。如果将来自iPSCs的细胞移植到捐献原始细胞的同一患者体内，那么人们会认为移植的细胞是“自我”，不会发生免疫攻击。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 但实际上，iPSC的临床应用已证明这很困难。由于尚未了解的原因，许多患者的细胞被证明无法进行重编程，而且为每位进行干细胞治疗的患者生产iPSC既昂贵又耗时。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " “iPSC技术存在许多问题，但最大的障碍是质量控制和可重复性。我们不知道是什么让一些细胞能够重新编程，但大多数科学家认为这还是不太可靠。因此，大多数个体化iPSC治疗方法已被放弃。” /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 为此，研究人员尝试通过创建“通用”iPSC来回避这些问题，在最新研究中，他们发现在仅仅三个基因的活性被改变后，将iPSC移植到具有完全免疫系统功能组织相容性不匹配的受体后能够避免排斥。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " “这是第一次有人设计出可以普遍移植，在免疫功能正常的受体中存活而不会引起免疫反应的细胞，”作者表示。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 具体来说，研究人员首先利用CRISPR删除两个基因，这两个基因对于主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类蛋白质家族的正常功能至关重要。MHC蛋白质位于几乎所有细胞的表面，携带帮助免疫系统区分入侵者与本体的分子信号。缺少MHC基因的细胞不会出现这些信号，因此它们不会标记外来者。然而，缺失MHC蛋白的细胞会成为自然杀伤（NK）细胞这种免疫细胞的靶标。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 加州大学旧金山分校的Lewis Lanier教授是一位信号学专家，其研究组曾发现CD47（一种细胞表面蛋白）能作为针对巨噬细胞的“别吃我”信号，对NK细胞也有很强的抑制作用。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 研究人员认为CD47可能是完全关闭排斥反应的关键，因此他们将CD47基因加载到一种病毒中，传递给MHC蛋白缺失的小鼠和人体干细胞。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 实验结果证实了他们的假设，CD47确实是这个难题的缺失部分。当研究人员将三重修饰过的小鼠干细胞移植到具有正常免疫系统的错配小鼠时，结果没有观察到排斥反应。然后，他们又将类似调整过的人类干细胞移植到所谓的人源化小鼠体内，这些小鼠的免疫系统已经被人体免疫系统的成分所取代，也没有排斥反应。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 此外，研究人员利用这些干细胞中分化出各种类型的人类心脏细胞，并将它们再次移植到人源化小鼠体内。干细胞分化的心肌细胞能够实现长期存活，甚至开始形成基本的血管和心肌，这为修复衰竭心脏带来了希望。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " “我们的技术解决了干细胞和干细胞衍生组织的排斥问题，这是干细胞治疗领域的一大进步，”Deuse说。 “我们的技术可以使更多的患者受益，其生产成本远低于其它任何个性化方法。我们只需要制造我们的细胞一次，得到的产品可以广泛应用。 /p p br style=" text-indent: 2em text-align: left " / /p

据英国每日邮报报道，英国的研究人员识别出一种可能对所有流感病毒均能发挥免疫作用的人体免疫细胞，这一发现有助于未来开发出对普通季节性流感和新型流感等各种流感病毒均有效的广谱疫苗。 英国帝国理工学院等机构研究人员在新一期《自然-医学》杂志上报告说，他们在2009年甲型H1N1流感流行之际，对300余名志愿者的健康状况进行了跟踪研究，着重分析了他们的免疫系统对这种新型流感病毒的反应。结果发现，在那些没有出现显着症状的志愿者血液内，一种名为&ldquo CD8+T细胞&rdquo 的免疫细胞含量普遍较高。 研究人员说，普通免疫抗体是通过识别病毒的表面结构来引发免疫反应、避免感染，但而本次研究发现，&ldquo CD8+T细胞&rdquo 会直接对流感病毒的核心发起&ldquo 攻击&rdquo 。研究人员表示，流感病毒的核心部位差异很小，即使甲型H1N1流感等新型流感病毒的核心也基本没有变化，因此&ldquo CD8+T细胞&rdquo 不仅可以应对普通季节性流感病毒，对新出现的甲型H1N1流感等新型流感病毒也能发挥免疫作用。在研发对不同毒株都有效的广谱流感疫苗领域，这一发现可谓迈出了一大步。健康卫视综合报道。

第二届中国国际医学转化创新创业大赛总决赛已经落下帷幕，荆杰博士团队研发的“自动化无人细胞培养机器人系统”获得二等奖。据悉，荆杰博士团队拥有世界上首台全自动免疫细胞体外扩增系统的专利权，从而为免疫系统治疗的标准化及工业化奠定了基础。该系统可实现自动化的细胞培养和扩增，在培养细胞数量、所需时间、成本等方面大大优于传统的人工和半自动培养方法，具有规模化、标准化和低成本三大优势。与其他传统培养方式相比，扩增效果提高100-1000 倍，同时节省40-60%的培养液、生长因子和细胞因子，操作界面易操作，培养程序可优化。自动化细胞培养系统利用自主研发的，基于中空纤维管的灌注式生物反应器，细胞可以在模拟人体脉管结构的仿生环境中完成可控的生长代谢过程。赛尚推出的自动化台式ACCS-χ1 细胞培养系统能够为细胞、蛋白和病毒的规模化生产维持稳定、经济和可扩展的细胞培养。通过使用一次性耗材，ACCS-χ1 细胞培养系统显著减少了对空间和人工成本的需求，缩短细胞扩增的处理时间，并且大大降低了细胞污染或人为错误发生的可能性。据了解，浙江赛尚医药科技有限公司（以下简称“赛尚”）是由荆杰博士携自主知识产权在2011 年创立，公司主要生产全自动全封闭细胞培养系统设备及相关周边设备，提供自动化细胞体外培养系统(Automated Cell Culture System)的研发、生产、销售及相关细胞培养技术服务。主要解决细胞类生物制品在临床应用或实验研究中所面临的三个与规模化细胞培养密切相关的问题：劳动密集，耗时的重复细胞培养工作量；高成本的补充生长因子，长时间的细胞培养工作；细胞，病毒和抗体批次制备之间的差异。

近期，我国科学家团队在单细胞层面揭示了性别与衰老对外周血免疫细胞的影响，研究成果发表在《美国科学院院刊》（PNAS），标题为“Effects of sex and aging on the immune cell landscape as assessed by single-cell transcriptomic analysis”。　　研究人员采用单细胞RNA测序技术，对不同年龄与性别志愿者的外周血单个核细胞进行单细胞水平的转录组分析，首次在单细胞水平精确绘制了不同性别与年龄的外周血单个核细胞的免疫图谱。研究发现，在年轻人群中男女之间的免疫差异更集中在B细胞与单核细胞，而在老年人群中则主要集中在自然杀伤细胞（NK）。随着年龄增长，男女之间免疫细胞差异会增大，T细胞和B细胞在女性中更显“活性”，相关的激活信号通路富集更加明显。细胞通信分析显示，女性树突状细胞和B细胞之间BAFF/APRIL信号的增加，可能是女性B细胞介导自身免疫病更高发病率的原因之一，而男性则表现出更强的促炎相关通路。　　这项研究扩展了对人类免疫系统的认识，为探索性别与衰老在免疫性疾病发病机制中的作用提供了新的科学依据。 　　论文链接：　　https://www.pnas.org/content/118/33/e2023216118

导 读:100 多年来，科学家一直试图让免疫系统参与抗击癌症的斗争。在两位获奖者的开创性发现之前，仅有有限的临床研发。而检查点治疗现在已经彻底改变了癌症治疗方法，从根本上改变了我们对癌症治疗方式的看法。——诺贝尔奖官网癌症免疫疗法2018年斩获诺贝尔奖！在免疫治疗炙手可热的当口，无疑更添一笔旺火。 2018 年诺贝尔生理学或医学奖授予James P. Allison 和 Tasuku Honjo（中文翻译：本庶佑），以表彰他们在癌症免疫领域中做出的贡献。 “通过刺激患者自身的免疫系统攻击肿瘤细胞的能力”——人类抗击癌症的斗争中的一个重大里程碑 癌症每年夺去数百万人的生命，是人类最大的健康挑战之一。通过刺激我们的免疫系统的内在能力来攻击肿瘤细胞，今年的诺贝尔奖获得者为癌症治疗建立了一个全新的原则。 20世纪90年代，艾利森在加利福尼亚大学的实验室对已知蛋白——细胞毒性T细胞相关蛋白-4（Cytotoxic T lymphocyte associate protein-4，简称CTLA-4）进行了深入研究。艾利森发现，CTLA-4可以起到抑制免疫系统的作用，相当于患者免疫系统的“刹车器”。 抑制CTLA-4分子，则能使T细胞大量增殖、攻击肿瘤细胞。他意识到，如果解除这种抑制，患者的免疫细胞可以再次获得攻击肿瘤的防御能力。 与此同时，本庶佑在淋巴细胞膜上发现了一种免疫球蛋白受体，当时认为与细胞程序性死亡有关，故命名为PD-1（Programmed cell Death 1）。仔细研究它的功能后，最终揭示该蛋白也是作为一个“刹车器”，但作用机制不同。 詹姆斯 艾利森（左）本庶佑（右） 艾利森和本庶佑多年的研究展示了如何解除患者自身免疫系统的“刹车器”来治疗癌症。在他们两人取得重大发现之前，癌症临床研究陷入了瓶颈，他们的开创性发现被认为是人类抗击癌症的斗争中的一个重大里程碑，并为彻底治愈癌症带来了曙光。 医学界的bian革，正式走进细胞治疗时代！ 类似癌症免疫疗法已经给某些类型癌症的治疗带来了“ge命”，让一些患者以前无法治疗的肿瘤萎缩到近乎零。 与干细胞疗法一样，免疫治疗也基于一个变革性的理念：人类与其借助与药物治疗疾病，更应尝试“控制”细胞，让它们发挥或加强原有的作用，达到更好的疾病治疗目的——正是这样革新的理念，推动着医学界的变革，带领我们走进了细胞治疗时代。