基因筛选

荷兰格罗宁根大学的研究人员利用基因挖掘法从蓝色链霉菌中发现了一组活性基因簇，通过该基因簇可制造出无耐药性的新型抗生素，该研究有望为链霉菌的药用开发提供一条新思路。相关研究发表在最新一期《微生物学》（Microbiology）杂志上。 链霉菌是生活在土壤中的一种常见细菌，其家族包含多种细菌。不同于其他细菌，链霉菌在生长中会形成或长或短的孢子丝，为了生存，在繁殖前链霉菌会产生大量的天然抗生素以抵御竞争者。利用这一特性科学家已制造出了包括链霉素、四环素和红霉素在内的多种抗生素。与此同时，为保护自身免受这些高浓度致命代谢物的伤害，链霉菌同时也积累了相应的抗生素耐药基因和调节基因，而这些基因也被认为是病原细菌获得性耐药因子的最初来源。2002年英国科学家完成了对蓝色链霉菌的基因测序工作，发现这种链霉菌拥有800多万个碱基对和7825个可疑基因，是迄今为止拥有最多基因的细菌。当年5月9日发表在英国《自然》杂志上的文章，还专门描绘了3种当时未知的抗生素装配蓝图，并称这3种抗生素一旦被识别，就可作为药物开发中的启动化合物加以使用。新研究中，格罗宁根大学的研究人员通过基因挖掘的方法成功识别出了蓝色链霉菌中一组被称为cpk的基因簇，并可通过实验手段自如控制其活性。实验显示，由该基因产生的新型抗菌化合物可对包括大肠杆菌在内的多种细菌产生抗菌效果。负责该研究的格罗宁根大学佐藤高野教授称，细菌性传染病感染早期一般都较为温和且容易治愈，而一旦恶化就极易致命且具有极强的耐药性，现存的大多数药物对其都无显著疗效。因此，必须尽快开发出能对抗此类疾病的新型抗生素。利用基因挖掘法他们首次在蓝色链霉菌中识别出了有效的基因簇，此外，该法也可同样用于对其他丝状真菌以及微生物的基因筛选。未来，随着科学家们对链霉菌次级代谢分子调控机制研究的进一步深入，链霉菌将成为一个极为丰富的医药宝库。（生物谷Bioon.com）

报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其 它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因主要有以下几种： 胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎 叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)　nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作 用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。氯霉素乙酰 转移酶基因测时可通过放射自显影观察。荧光素酶基因（luciferase Gene）1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中出来的，该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用植物整株或部分直接用X-光片 或专门仪器进行检测。具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。β-D-葡萄糖苷酶基因该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱 、荧光等进行检测。除此之外还有庆大霉素转移酶基因等。在动物基因表达调控的研究中，已使用的报告基因主要有以下几种： 绿色荧光蛋白（gfp）基因等。绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光，GFP Cdnad 开放阅读框架长度约740bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65-67位丝氨酸－脱氢酪氨酸－甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长 紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪(FACS)中直接观察基因的表达。此外还有β-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)等。

第一步：目的基因的制取: 用限制性内切酶直接对基因组DNA进行部分酶切，产生一系列大小不等的DNA片段。那里面含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。获取目的基因是基因工程操作的关键。基因工程的原料就是目的基因。所谓目的基因，是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状。目前获取目的基因的方法主要有三种：反向转录法、内切酶切割分离法和人工合成法. 第二步：基因载体的选取: 用人工方法，取得目的基因的适宜的载体，即质粒（一种环状双链DNA）或病毒。载体一般带有必要的标志基因，以便进行检测。 基因克隆载体必须具备三个条件： a.具有能使外源DNA片段组入的克隆位点。 b.能携带外源DNA进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制。 c.必须具有选择标记，承载外源DNA的载体进入受体细胞后，以便筛选克隆子。http://learn.gxtc.edu.cn/NCourse/swjs/gene/Images/bz1.jpg基因工程的基本过程(点击放大) 第三步：DNA的体外重组: 即用人工方法，让目的基因与运载体相结合，首先要用限制性内切酶和其他一些酶类，切割或修饰载体DNA和目的基因，然后用连接酶将两者连接起来，使目的基因插入载体内，形成重组DNA分子。这些工作都在生物体外进行，所以基因工程操作又叫体外DNA重组。 第四步：DNA重组体导入受体细胞: 将外源DNA片段与载体DNA连接形成DNA重组体，即重组DNA。 这种重组体连接的方法主要有： 粘性末端连接法：应用同一种限制性内切酶切割载体和外源DNA分子，可产生相同的粘性末端（接口处的碱基互补），进一步用DNA连接酶将断口连好，即可获得重组DNA分子。http://learn.gxtc.edu.cn/NCourse/swjs/gene/Images/zhuru.jpgDNA重组体导入受体细胞 钝性末端连接法：用化学合成法或逆转录法得到的外源DNA片段，均为钝性末端，这种末端也可以用特殊的连接酶连接，但效率太低。通常需要用人工方法加上粘性末端，再进行连接。第五步：受体细胞的繁殖扩增: 含重组DNA的活受体细胞，再在适当的培养条件下，并进行繁殖和扩增，使得重组DNA分子在受体细胞内的拷贝数大量增加。 第六步：克隆子的筛选和鉴定: 受体细胞经转化（传染）或传导处理后，真正获得目的基因并能有效表达的克隆子一般来说只是一小部分，而绝大部分仍是原来的受体细胞，或者是不含目的基因的克隆子。为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正的克隆子，需要对克隆子进行筛选和鉴定。 第七步：目的基因的表达。

转基因食品是否安全这个话题一直饱受争议首届转基因嘉年华活动在后山艺术空间举行，中国工程院院士陈君石等“挺转”人士，现场回应了对转基因问题的一些质疑。”农大院长更是提出了转基因食品是政府帮筛选更安全的食品的理论那么你对转基因是持什么样的态度呢？请说出您支持或者反对的理由同时也可以说说检测转基因食品与检测非转基因食品的检测项目存在哪些区别欢迎大家踊跃讨论,说出你的观点吧！http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09503.gif

自人类耕作以来，就在探索有效防除杂草的途径。草甘膦，因能在结构上阻断植物体内芳香族氨基酸生物合成，导致杂草和作物死亡，有效控制危害最严重78种杂草中的76种，而占据着农药销售榜的首位。　　科学家梦想将抗草甘膦基因导入作物中，获得抗草甘膦的转基因作物。抗除草剂，便成为转基因作物商业化后，最具优势的性状之一。　　这些特性首先增加了作物的产量。“种植抗除草剂转基因作物可采用窄行间距方法，比如转基因抗除草剂大豆的行间距能从76厘米缩小到33厘米或更小。”中国农业科学院生物技术研究所所长林敏介绍说，从1996年以来，美国采用窄行间距方式使大豆增产35%。　　此外，种植的抗除草剂转基因农作物在使用除草剂后，对田间作物的残留物无需进行处理，减少了劳动力的数量和力度。据了解，如果每年种植抗草甘膦转基因玉米1000万亩，平均每亩可减少除草用工3个，每年可减少3000万劳动工作日。同时，因为每亩玉米增产30—50公斤，农民每亩可增收50—100元。　　2011年，全球耐除草剂性状的转基因农作物占到总转基因农作物种植面积的59%。面对如此庞大的市场，美国孟山都等公司在投巨资开展基因研究和开发的同时，申请并获得了上百项与草甘膦抗性相关基因的专利。目前推广的抗草甘膦作物品种中，有69.2%由孟山都研成。　　我国每年因杂草引起损失约占粮食总产的10%。但由于抗草甘膦基因长期开发的欠缺，始终没有商业化生产的抗草甘膦转基因作物品种。突出跨国公司的垄断，成为紧迫的使命。　　中国农业科学院生物技术研究所研究小组临危受命，与北京大学等研究单位密切合作，开始了自主创新抗除草剂转基因农作物的研发之路。　　中国科学家采取3条技术路线齐头并进的方法：首先利用我国极其丰富的污染环境微生物基因资源优势，建成一批具有中国特色和自主知识产权的功能菌株库、功能基因库和分子酶库。另一方面，建立环境基因组学技术、功能基因组学分析技术、高通量表达筛选技术以及高水平技术等先进技术进行集成。同时，完善极端污染土壤微生物样品的DNA免培养分离技术及功能基因筛选平台，以及草甘膦抗性基因作为筛选标记的基因表达和功能鉴定的真核筛选系统。　　通过努力，结构新颖、功能明确、草甘膦抗性显著的EPSP合成酶基因诞生。这是一个具有自主知识产权的新型抗草甘膦基因，同时获得了国内发明专利和美国专利。　　其中，G2-EPSPS基因作为研究组从免培养技术构建的群落水平DNA库中分离鉴定的第一个抗草甘膦基因，成为草甘膦抗性最强、酶活最高的基因之一。　　“经试验，G2-EPSPS基因的结构新颖，在核酸水平上与已见报道的EPSP合成酶编码基因无任何同源性，与孟山都公司专利报道的根癌农杆菌CP4的同源性为24.53%，且不含有专利保护序列和突变位点。在酶学水平上G2-EPSPS基因草甘膦耐受性高于孟山都公司的CP4-EPSPS基因，是一个具有自主知识产权和重要育种价值的新型抗草甘膦基因。”林敏强调说。　　该小组同时与国内众多研究机构以及北京奥瑞金种业有限公司等合作，开展了转G2-EPSPS基因玉米、棉花、油菜、水稻、大豆和小麦等的研发工作。　　从2010年开始，经过北京、海南两地连续三代试验，奥瑞金研究人员发现转基因玉米在田间生产上能稳定耐受使用剂量5倍的草甘膦。模拟农民喷施除草剂的方法后，也发现转基因玉米在能耐8倍的草甘瞵。研究人员在北京、海南两地的两个生长季节，对转基因玉米的农艺性状进行了观察和测量，结果表明，与非转基因受体玉米相比，转基因玉米除耐草甘膦目标性状以外，其他农艺性状等均与非转基因受体玉米没有差异。　　同时，对进入生产性试验的抗草甘膦转基因玉米的环境安全和食品安全，研究小组委托国家认可的两家检测机构中国农科院植保所和中国农业大学食品安全检测中心分别进行试验。　　“2009年迈出了产业化过程中最关键的一步，我们与种业公司签订了基因独家使用和共同推进产业化协议。利用本发明专利所保护的EPSP合成酶基因培育出转基因抗草甘膦玉米，进行了转基因生物安全的中间试验和环境释放试验，于2012年获得农业部批准，进入生产性试验阶段，这也是转基因作物产业化应用的关键阶段，如能在今后两年内获得生物安全评价的安全证书，3—5年内获得品种审定并实现商品化生产，将有利于打破跨国公司在抗除草剂转基因产业上的垄断。”林敏说。

常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。转染方法有多种，根据不同的细胞，贴壁或悬浮细所可选用不同的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率的因素有多种，包括转染方法、操作技术、质粒DNA的纯度、靶细胞的生长状态等，下面重点介绍向几种常用的转染技术：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导尘等。靶基因被导入细胞后，一般在转染后48小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。

科技日报讯（戴欣郭阳虎）近日，解放军302医院临床检验医学中心科研人员开发出一种针对丙型肝炎患者的新型基因检测技术。该技术对患者本身的白介素28B基因进行多态性分析，在国内率先将多色荧光探针技术（PCR）运用于丙肝患者临床抗病毒疗效的预测和评估中。这为快速检测丙肝患者对某种抗病毒药物是否有效提供了重要依据，从而能更有效地指导临床医务人员准确选择用药，提升治疗效果。 由于患者身体基因型的不同而导致抗病毒用药使用疗效的差异，一直是广大医师用药的困扰。业界许多专家认为，丙肝患者体内白介素28B基因的分布与抗病毒疗效可能存在非常密切的关系，掌握其分布有助于更准确的用药选择。目前国内外科研人员已相继开发了多项针对这一基因位点的检测技术，但由于操作程序复杂、周期长、准确性较差，很难应用推广，给丙肝临床诊断治疗带来一定困难。 302医院的临床检验医学中心毛远丽和王海滨带领的课题组，通过对上千例丙肝患者基因样本进行分析、检测，成功研制出一套针对丙肝患者的抗病毒治疗易感基因检测技术。该技术对多组白介素28B的基因进行筛选，通过合成DNA序列探针，构建双色荧光PCR体系，通过对患者的染色体内白介素28B的基因进行多态性分析，从而得出患者本身个别基因突变的位点。运用该方法，一小时即可完成检测，快速准确，能为患者的临床治疗提供更加准确有效的诊疗依据。 该技术在国内率先将多色荧光探针技术运用于丙肝患者临床抗病毒疗效的预测和评估，大大提高了丙肝临床诊治水平，也标志丙肝个性化诊疗迈出了重要一步。它有助于临床医生更好地选择适合丙肝患者的个性化治疗方案，准确选择抗病毒药物的种类和治疗持续时间，有效缩短患者治疗时间的同时减少就医成本。来源：中国科技网-科技日报 作者：郭阳虎 2014年01月21日

药物基因组学是上世纪九十年代末发展起来，基于药理学和基因组学，将传统的药物科学与基因、蛋白、单核苷酸多态性等知识结合起来的一门科学。正因为药物基因组学是研究基因序列变异及其对药物不同反应的科学，所以它是研究高效、特效药物的重要途径，通过它为患者或者特定人群寻找合适的药物，药物基因组学强调个体化；因人制宜，有重要的理论意义和广阔的应用前景。一、促进新药研发 由于药物基因组学规模大、手段强、系统性强，开辟了医药工业研究的新领域，可以直接加速新药的发现。首先药品制造商不仅把注意力放在可能引起疾病的基因上，而且对药物效应基因产生了兴趣，这些药物效应基因为新药研究提供依据。由于新一代遗传标记物的大规模发现，以及将其迅速应用于群体，流行病遗传学也可以大大推进多基因遗传病和常见病机理的基础研究。还可以帮助制药厂商在一些与基因和疾病相关的蛋白质、酶和RNA分子等基础上开发新药，这样不仅促进了药物的发现，还有利于开发出针对某一特定疾病的药物，从而增强疗效，并减少对健康细胞的损伤。对于每一个药物来说大约都有10-40%的人没有疗效，又百分之几的或更多的人有副作用。如果制药公司利用药物基因组学理论可以实现预见结果或筛选人群的话，可以大大增加新药的通过率，也可以对未通过药检的新药重新估价，这些药物中一个经常引用的例子是第一个非典型性抗精神活性药氯氮平（clozapine），在氯氮平的使用过程中，由于1％的病人服药后出现严重的粒细胞缺乏症，因而只有当其它药物使用后无效才使用。但是在粒细胞缺乏症的药物效应基因被确定后，极大地改善了氯氮平的使用，除极少数敏感的病人不能服用此药外，对于99％的病人来说，这一药物是一线治疗药物。在新药的临床试验研究中，如果事先知道人群可能对药物反应的话，如代谢酶的基因型，可以减少参试人群，试验的时间表也可以大大缩短。对药物有效或毒性变异的预测试验中，可用于筛选病人。经过药物效应基因突变筛选的受试者，可以加强临床试验的统计学意义，可以用更少的病例数达到所需的统计学意义，这样可以大大节约时间和费用。 二、用药个体化合理用药的核心是个体化用药。药物基因组学通过对患者的基因检测，如对一些疾病相关基因的单核苷酸多态性（ＳＮＰ）检测，进而对特定药物具敏感性或抵抗性的患病人群的ＳＮＰ差异检测，指导临床开出适合每个个体的“基因处方”，使患者既能获得最佳治疗效果，又能避免药物不良反应，真正达到“用药个体化”的目的。 医生在疾病的首次治疗过程中，往往需要临床实验来确定适合病人的药物，而药物基因组学则可以通过分析病人的遗传组成来确定最合理的治疗药物。这样就免去了先期用于药物选择的临床过程及由此带来的可能的副作用，并缩短了病热的康复期。更准确的用药剂量 通过基因组分析可以判断药物在体内的作用效果及代谢时间，并以此来确定不同个体的用药剂量，对比依据体重和年龄的方法，其具有更好的治疗效果，降低了过量服药的可能性。一些临床上经常出现的现象，例如两患者诊断相同、一般症状相同、血药浓度相同，但疗效却大相径庭，这些用传统的药代动力学原理是无法解释的。这时应考虑到与药物作用相关的位点（如受体等）是否发生了变异？是什么水平的变异?药物作用的位点的变异可能发生在基因水平，也可能发生在转录、翻译等水平，基因水平的变异相对比较容易鉴定，研究也表明基因的变异与药物效应的差异是更具相关性。研究基因突变与药效关系的药物基因组学正是适应了这一要求，因此药物基因组学在临床合理用药中的应用前景是非常之好的。将基因功能学用于合理用药，利用药物基因组学的技术和方法增加药物的有效性和安全性，减少不良反应，实现个体化、可预测及可预防的医疗，这就称之为临床药物基因组学。药物基因组学应用到合理用药中，弥补了只根据血药浓度进行个体化给药的不足，惟以前无法解释的药效学现象找到了答案，为临床个体化给药开辟了一个新的途径。这样药物基因组学原理为特定人群设计最为有效的药物，不仅提高了药效，缩短了病程，而且减少了毒副反应和成本，真正达到了“物美价廉”的要求。目前，已经有人将药物基因组学知识应用于高血压、哮喘、高血脂、内分泌、肿瘤等的药物治疗中。如原发性高血压是多因素诱发的疾病，对于许多患者，高血压药物的不同药效和耐受性与遗传变异有关。Ferrari发现，一种细胞骨骼蛋白（cytoskeletalprotein）、内收蛋白（adducin）的基因多态性与高血压的发病、对钠敏感性以及对利尿剂的效果相关。因此在抗高血压治疗需要用利尿剂时，可以对患者预先进行基因检测，以确定是否选择使用此药。通过对β2肾上腺素受体的基因多态性及其对β2肾上腺素受体激动剂的敏感性关系的研究，发现β2肾上腺素受体的基因多态性影响β2肾上腺素受体激动剂福莫特罗（formoterol）的脱敏效果，β2肾上腺素受体激动剂改善肺通气的作用对Gly纯合子个体明显比Arg纯合子个体要强，杂合子个体介于两者之间。 载脂蛋白E（APOE）的基因多态性，影响绝经后妇女用雌激素替代疗法（ERT）时的血脂和脂蛋白的浓度。人群中的APOE有3个等位基因：E2、E3、E4，ERT能使具有E2型基因的妇女血中总胆固醇含量大大高于E3、E4型。提示医生在绝经期妇女中使用ERT时，可事先检测患者的APOE基因，对具有E2型基因的妇女在治疗过程中密切监测甘油三酯浓度。如此，通过对不同个体的药物代谢相关酶、转运因子、药物作用靶点的基因多态性的研究，对突变的等位基因进行分离和克隆，在分子诊断水平上建立以聚合酶链反应（PCR）为基础的基因型分析方法，在治疗患者各种疾病前检测其基因型，更精确地选择适当的治疗药物和合适的剂量以减少不良反应的发生，对患者的治疗具有很大的意义。 随着基因分析技术的飞速发展，越来越多的药物效应的个体差异与基因多态性的关系被阐明，药物基因组学将更广泛地指导和优化临床用药。

[font=宋体]高通量抗体库技术是一种创新的生物技术，能够高效快速地开发单克隆抗体。通过使用高通量抗体库技术，研究人员可以同时对多个抗原进行免疫反应，从而在短时间内产生大量的单克隆抗体。下面为大家介绍其特点和筛选步骤：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]高通量抗体库技术的特点包括：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]高通量：该技术可以同时对多个抗原进行免疫反应，从而在短时间内产生大量的单克隆抗体。[/font][font=宋体]快速：通过该技术，可以在短时间内得到针对特定抗原的单克隆抗体。[/font][font=宋体][font=宋体]高效：该技术采用合成生物学细胞重编程方法，建立了能够识别多样性未知抗原的合成免疫细胞组库，可以识别超过[/font][font=Calibri]10^6[/font][font=宋体]种抗原，大大提高了单克隆抗体的开发效率。[/font][/font][font=宋体]无偏见：该技术可以对任何抗原进行免疫反应，不受免疫原性限制。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]高通量抗体库技术的筛选步骤包括：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]提取抗原：从目标组织、细胞器或全蛋白组中提取蛋白。[/font][font=宋体][font=宋体]蛋白组分拆分：将蛋白组按照分子量进行拆分，每个组分包含[/font][font=Calibri]300-500[/font][font=宋体]个蛋白，从而降低蛋白组的复杂度并保证不同分子量的蛋白均获得满意的免疫效果。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]免疫小鼠：将拆分后的蛋白组分分别免疫小鼠，制备[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]万[/font][font=Calibri]-5[/font][font=宋体]万个特异性识别目标蛋白组的单抗文库。[/font][/font][font=宋体]抗体筛选：通过抗体筛选试验，选择能够与目标抗原特异性结合的抗体。[/font][font=宋体]抗体优化：对筛选得到的抗体进行优化，以提高其亲和力和特异性。[/font][font=宋体]抗体鉴定：通过生物学实验和临床试验等方法，对优化后的抗体进行鉴定，确认其功能和特性。[/font][font=宋体]应用研究：将鉴定合格的抗体应用于研究和临床实践中，以解决实际问题。[/font][font=宋体]总之，高通量抗体库技术是一种高效、快速、无偏见的技术，可以用于开发针对任何抗原的单克隆抗体。其筛选步骤包括提取抗原、蛋白组分拆分、免疫小鼠、抗体筛选、抗体优化、抗体鉴定和应用研究等步骤。该技术的应用范围广泛，可以应用于基础研究、药物研发、诊断试剂开发等领域。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]为了满足抗体药物筛选等对抗体高通量、快速表达不断增长的需求，义翘神州的重组抗体[url=https://cn.sinobiological.com/services/high-throughput-antibody-production-service][b]高通量表达纯化服务[/b][/url]结合了专业的高通量基因合成、载体构建和优化的瞬时抗体表达技术，充分利用义翘优势哺乳动物细胞表达平台，能够提供在[/font][font=Calibri]HEK293/CHO[/font][font=宋体]细胞中快速生产重组抗体服务。详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/high-throughput-antibody-production-service[/font][/font]

GeneChip System ([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]S) 3000Dx v.2基因[b][url=http://hplc17.com]芯片扫描系统[/url][/b]是最可靠的临床研究平台,也是唯一被FDA批准/ SFDA,试管和CE标志芯片系统,适用于临床检测基于RNA和DNA。　　[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]S 3000 dx v . 2是扩大Affymetrix临床的基础装备,装备还包括FDA批准,试管和CE标志Affymetrix基因分析试剂和人类基因组U133 v2.0芯片,即利用人类基因组U133 v2.0 cGMP制造芯片的版本。　　Affymetrix的临床工具包提供了一种进入市场的有效方法，使测试开发人员能够节省时间、金钱和监管风险。　　Affymetrix的基因芯片技术已经得到了成千上万的研究人员的信任，在芯片应用中产生了高度可重复的结果。[img=GeneChip® System ([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]S) 3000Dx v.2基因芯片扫描系统1]http://17wab.cn/uploads/allimg/180726/1-1PH6102HW11.jpg[/img]　　[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]S 3000Dx v.2 基因[b][url=http://hplc17.com]芯片扫描系统[/url][/b]适用于：　　[b]科研[/b] 自信地分析或研究宝贵的人类样品　　[b]诊断检测的开发[/b] Affymetrix合作伙伴已经开发并商业化了一些获得FDA批准的体外诊断和符合CE-IVD的诊断检测　　[b]常规检测[/b] 一个系统，多种应用[img=GeneChip® System ([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]S) 3000Dx v.2基因芯片扫描系统2]http://17wab.cn/uploads/allimg/180726/1-1PH6102JYW.jpg[/img]　　[b]功能/应用范围：[/b]　　1.基因功能研究 　　2.基因表达谱分析、基因诊断、序列分析 　　3.药物筛选与新药开发 　　4.基因多态位点及基因突变检测 　　5.其他方面的应用，如环境保护、农业和蓄牧业等领域的应用。　　[b]主要附件：[/b]　　专用芯片杂交箱640 全自动洗涤工作站 电脑　　[b]主要技术指标：[/b]　　扫描分辨率2.5微米，存储16bit图象，固态绿色激光器，检测波长570纳米。　　[b]技术特色：[/b]　　一、　　1.强大的类比性 　　2.巨大的信息产出率 　　3.高度敏感性和专一性 　　4.高度重复性 　　5.微型化、自动化 　　6.哺育新的实验方法。　　二、全基因组表达谱，基因组SNP检测。

科学家首次测序癌症患者基因组美国科学家近日首次成功测序了一个癌症患者的基因组，这一开创性工作为利用新方法揭开癌症的遗传学基础创造了条件。相关论文发表在11月6日的《自然》（Nature）杂志上。测序的基因组来自于一位女性，50多岁死于急性骨髓性白血病（AML）。美国华盛顿大学的研究人员利用来自皮肤样本的遗传材料，测序了她2套染色体的DNA，同时根据骨髓样本检测了其肿瘤细胞中的遗传突变。所有样本均采自患者接受癌症治疗前，以防DNA受到进一步损伤。随后，研究人员将患者的肿瘤基因组与其正常基因组进行了比较，以期发现遗传差异。在患者肿瘤基因组中接近270万个单核苷变异中，将近98%同样也在患者皮肤样本的DNA中检测到，这就大大缩小了进一步筛选的范围。研究人员最终在患者的肿瘤DNA中仅发现了10个可能与AML有关的遗传突变，其中8个很罕见，它们所处基因之前从未被认为与AML有关。研究人员还显示，肿瘤样本中的每个细胞拥有9个突变，而且较少发生的那个突变可能是最后形成的。研究人员怀疑，所有这些突变对于患者的癌症都很重要。美国国立人类基因组研究所前任主管Francis Collins说：“首次确定人类癌症基因组的完全DNA序列，并与同一个体的正常组织相比较，这在癌症研究中是一个真正的里程碑。”美国俄勒冈健康与科学大学癌症研究所的Brian Druker说：“虽然这一研究尚不能告诉我们怎样治疗癌症患者，但它是这条路上关键的第一步。它为大规模癌症基因组测序和揭示癌症秘密打下了基础。”目前，研究小组正在测序其他AML患者的基因组，同时他们还计划将这种全基因组方法扩展到乳腺癌和肺癌。

http://n.sinaimg.cn/finance/transform/20160711/pBpl-fxtwuff5299873.jpg中国科学院院士朱作言。　　专访朱作言①|转基因名字让人恐慌，准确应叫分子杂交育种　　“转基因这个名字，我不太喜欢。因为别人听了，什么是转基因啊，转个什么基因啊，老百姓听了就恐慌。”近日，中国科学院院士朱作言就转基因问题，接受澎湃新闻专访时表示，准确地说，人们常说的转基因，是一种分子杂交，或分子杂交育种。　　他进一步解释说，传统的杂交育种是两个物种、品种进行杂交，引入成千上万个基因。而转基因，或叫分子杂交育种技术，唯一的不同是用一个基因去和另一物种或品种杂交，引入的是唯一一条基因，更精准高效。　　7月初，全球100多位诺贝奖获得者联合发表公开信，支持转基因技术和转基因农作物，重申其安全可靠。这一活动引发人们的广泛关注。　　朱作言是国家农业转基因生物安全委员会第一届委员会成员，也是2016年最新一届委员会的成员。　　国家农业转基因生物安全委员会是农业部履行农业转基因生物安全管理职能的技术咨询机构，由领域内专家出任，主要对农业转基因生物的安全性进行评价，并提出咨询意见。　　“转基因争论20年后再看会是一场笑话”　　澎湃新闻：您怎么看100多位诺奖得主联合署名支持转基因技术和黄金大米这件事？中国科学家在转基因话题上有无一致声音？　　朱作言：你谈到中国科学家群体，显然中国科学家中不少人对这个问题是不理解的，甚至持怀疑态度，这就是为什么中国科学家没有一致起来。　　实际上，中国科学家有一部分人，比较知道转基因科学背景的人，比如说分子生物学界的人，是毫无疑问会支持的。　　我们中国好像没有发声，不是没有发声，中国科学院发布过关于支持转基因的声明，专门发布过，院士们发表的，可以查得到，但是这个声明在社会上无声无息，就没什么影响。　　澎湃新闻：您意思是说，很缺少那种引起大家关注、掀起大讨论的，知晓度很高的科学家？　　朱作言：对。说出来好像看不起自己，但中国科学家群体在社会上的影响，真正发挥的作用还是很有限。当然，国外科学家发挥的作用有多大，我也不太清楚，但100多个诺贝尔奖获得者的签名，权威显然在。　　澎湃新闻：我们在媒体上也能看到一些专家学者说转基因是安全的，但是老百姓好像不买账。　　朱作言：专家越说，他越不买账。我看过相关的研究文章，一种社会人的心理，对主流的声音听不进去，越是非主流的声音，越是听得进去。　　澎湃新闻：很少在媒体上看到公众表达自己对转基因食品、农作物的担忧，是不是老百姓表达出来，会更有助于解决这个问题？　　朱作言：现在的问题是越做科普，疑虑越多。　　澎湃新闻：那应该怎么做呢？　　朱作言：就是这个问题，科学对话需要再深刻地考虑一下了。　　澎湃新闻：是不是科普的方式需要改变一下，带人到实验室亲自看一下？　　朱作言：看也不行，看不懂。　　澎湃新闻：是不是有一个接受的过程，公众的态度会慢慢改变？　　朱作言：我个人的观点是，不管政府态度怎么样，反转的态度怎么样，我们不看现在，过20年后，回过头来看，这是一场笑话。　　为什么？科学的发展就是这样。布鲁诺、哥白尼、伽利略，当时他们有人受到宗教的迫害，有人被烧死，现在看来，他们是被冤枉的，当时的愚昧造成的。　　我们看近代一点的例子，四十年以前，那时候试管婴儿，第一个试管婴儿出来的时候，全世界舆论口诛笔伐。现在呢，试管婴儿有多少，据说通过试管婴儿出生的人口接近上千万。这也就几十年的事情。　　转基因这个问题用不着这么久，我想，再过二十年回头来看这场争论，一场笑话！这就是科学和科学的进步，最后是不可阻挡的。　　但是在一段时间内，它会受很多委屈，被暂时封杀。　　美国90%以上大豆的种植是转基因，这封杀得了吗？让他们回过头种传统大豆？根本不可能。　　“转基因这个名字我不太喜欢”http://n.sinaimg.cn/finance/transform/20160711/kInO-fxtwuff5299891.jpg转基因黄金大米。 视觉中国 资料图　　澎湃新闻：你怎么看转基因这种技术？　　朱作言：转基因这个名字，我不太喜欢。因为别人听了，什么是转基因啊，转个什么基因啊，莫名其妙，说不清楚。　　准确地说，人们理解的转基因、常说的转基因，应该是一种分子杂交，或分子杂交育种。　　什么是分子杂交育种呢？　　原来培育作物品种过程中，杂交是应用非常广泛的。如袁隆平先生培育的杂交水稻，如同驴和马杂交后生出来的骡子。　　一个物种和一个物种的杂交，是二者各自全套的基因的杂交、混合。转基因呢，也是杂交，但它不是全套基因的杂交，它只是一个物种的一个基因，和另一个物种的全套基因进行的杂交。　　我把马的一个基因拿出来，放到驴子里边去，或者把驴子的一个基因，放到马里边去。这种杂交，是很精准地杂交，是目的性很明确的杂交，而且是在高技术基础上、现代科学技术发展的前提下。　　因为以前杂交糊里糊涂嘛，把精子和卵子放在一起，让不同的物种交配一下就行了。（澎湃新闻注：随后还要从大量产物中筛选，筛选出需要的品种）　　现在我们不用做这种，因为这种传统的杂交是非常复杂的。　　因为每个物种，它有它相对的优点，也有缺点。这个优点和缺点的基因都放在一起，就一起洗牌了，将来长成什么样，听天由命了。然后再去选好的（产物）。袁隆平不是一天到晚在那儿选择嘛，选择好的（产物）。

中国科技网讯 据物理学家组织网近日报道，美国麻省理工大学和哈佛大学达纳—法伯癌症研究所、布罗德研究所合作，利用RNA介入（RNAi）方法开发出一种RNA递送纳米粒子系统，能大大加快筛选抗癌药物标靶进程。首个小鼠试验显示，一种以ID4蛋白为标靶的纳米粒子能缩小卵巢肿瘤。相关论文在线发表于《科学·转化医学》上。 通过对癌细胞基因组进行测序，科学家发现了大量基因变异或被删除。这对寻找药物标靶来说是个福音，但对测试标靶来说，却几乎成了不可能的任务。论文高级作者、麻省理工大学卫生科学与技术教授桑吉塔·巴蒂雅说，这种纳米粒子系统克服了抗癌药物开发中的瓶颈问题。“我们所做的是努力建设一条管线，在这里你可以测试所有的标靶，然后通过小鼠模型筛选出重要标靶。你可以用RNA介入的方法，确定想要进入临床试验的标靶的优先顺序，或者开发抵抗它们的药物。” 通常筛选出药物标靶后，下一步是通过基因技术让小鼠缺乏该基因（或该基因过度表达），观察肿瘤长出来以后它们有什么反应。但还有一种更快的方法，就是在肿瘤出现后简单地将它们关闭，RNA介入法为此提供了广阔前景。在自然的RNA介入中，RNA短链与信使RNA（mRNA）结合，负责递送怎样构建蛋白质的指令。如果mRNA被破坏，就无法造出相应的蛋白质。 自上世纪90年代末发现RNA介入以来，科学家一直在研究怎样利用这一过程来治疗癌症。但要找到一种安全有效地瞄准肿瘤的方法，尤其是让RNA进入肿瘤，还有很多困难。 在实验中，研究人员将目标集中在ID4蛋白，因为在约1/3的高侵略性卵巢肿瘤中，这种蛋白都被过度表达。该基因显示出与胚胎发育有关：它在生命早期已经关闭，不知什么原因在卵巢肿瘤中被重新激活。 他们设计了一种以ID4为标靶的RNA递送纳米粒子，能同时瞄准并进入肿瘤，这是以往的RNA介入方法做不到的。其表面标记有一种短链蛋白片断，这让它们能进入肿瘤细胞，这些蛋白片断会被拉向肿瘤细胞中一种特殊蛋白p32。研究人员还发现了许多这类片断。纳米粒子外面有一层膜，内部是RNA链与蛋白质的混合。粒子进入肿瘤细胞后，蛋白质—RNA混合物能穿过膜层进入细胞内部，开始破坏mRNA。经过对卵巢肿瘤小鼠的实验，研究人员发现，通过RNAi纳米粒子治疗，能消除大部分的肿瘤。 在潜在标靶中，有许多蛋白无法与传统药物结合，而新粒子能递送RNA短链关闭特殊基因，使科学家能继续“追捕”这些“没有可能”的蛋白。达纳—法伯研究所癌症基因组发现中心主任哈恩说：“如果这一方法能在人体内发挥作用，将再打开一类全新的药物标靶。” 联合研究的目标是开发一种“混合与剂量”技术，通过混合不同的RNA递送粒子，瞄准特殊基因。目前，研究人员正在用纳米粒子系统测试其他可能的卵巢癌标靶和包括胰腺癌在内的其他类型癌症，并在研究将ID4—标靶粒子开发为一种卵巢癌疗法的可能性。（记者 常丽君） 《科技日报》（2012-09-17 二版）

基因芯片及其在病原微生物检测中的应用基因芯片是近年来迅速发展的一门生物高新技术，它以其能够快速、高效、大规模地同步检测生物遗传信息的卓越功能而得到发展。在基因测序、基因表达分析、药物筛选、基因诊断等领域显示出重要的理论和实用价值。基因芯片是指应用大规模集成电路的微阵列技术。在固相支持物表面（常用的固相支持物有玻璃、硅片、尼龙膜等载体）有规律地合成数万个代表不同基因的寡核苷酸“探针”或液相合成探针后由点样器有规律地点样于固相支持物表面；然后将要研究的目的材料中的DNA、RNA或用cDNA同位素或荧光物标记后，与固相支持物表面的探针进行杂交，通过放射自显影或荧光共聚焦显微镜扫描，对这些杂交图谱进行检测；再利用计算机对每一个探针上的杂交信号作分析处理，便可得到目的材料中有关基因表达信息。该技术可将大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可对大量核酸分子进行检测分析。基因芯片分类基因芯片按其片基不同可分为无机片基芯片和有机合成片基芯片：如果按其应用不同，可分为表达谱芯片、诊断芯片、检测芯片；如果按其结构不同可分为DNA阵列和寡核苷酸芯片；如果按其制备方法不同可分为原位合成芯片和合成后交联芯片。目前，常用于基因芯片制作的固相支持物主要包括半导体硅片、普通玻璃片、尼龙膜等基质。它们各有优缺点，可根据不同的用途和目的选择使用。用硅片制作的芯片，其DNA探针排列的密度高，在1.28cm芯片上，可达40万点阵。检测灵敏度高但专一性差。用玻璃制作的芯片，可用于双色荧光标记杂交，便于杂交信号的检测，但其灵敏度低，而且对玻璃片的处理要求高。尼龙膜主要用于制作eDNA芯片，即将不同的eDNA片断点阵于尼龙膜上，它可用同位素标记检测，灵敏度高，专一性好，但是DNA阵列的密度低。DNA探针的制备及固化探针的制备及固化有2种方法：①在片基上原位合成寡核苷酸；②在片基以外制备DNA探针，并以显微打印等手段将其固化于片基上。作者介绍了待测DNA样品的制备、标记样品与基因芯片杂交、杂交信息的检测与分析、操作过程中存在的问题及解决办法。基因芯片可以对病原细菌检测、病毒的检测及其他方面如支原体检测等。问题和展望基因芯片在病原微生物检测中具有快速、灵敏、高通量、自动化等特点。但目前仍面临一些问题有待解决，这些问题主要体现在硬件和软件2个方面。在硬件方面，DNA芯片技术需要昂贵的尖端仪器，如生产原位合成芯片需要光刻机器和寡核苷酸合成仪；构建DNA微集阵列的自动仪器约需8万美元以上，而检测芯片则要激光共聚焦显微镜、落射荧光显微镜等设备，费用较高。在软件（即技术）上也存在一些问题。首先，探针制备的环节上，原位合成寡核苷酸技术复杂，且有专利保护，合成过程中有可能插入错误核苷酸或混入杂质，降低了特异性和信噪比；显微打印技术较灵活，易实现，但需收集或合成大量探针，且阵列的集成度不高。其次，在样品和芯片杂交的环节上 ，因为杂交在固相上进行，空间因素会对杂交造成不利影响；还有，在一个芯片上存在多种探针，这对杂交条件是个挑战，因为这种探针的最适条件未必适合另一种探针；而且，复杂的探针如长寡核苷酸容易自身形成二 、三级结构，影响与靶序列的杂交或给出错误的阴性信号，当然在其它技术环节上也存在着一些难题，如样品准备复杂、检测的灵敏度低等。虽然基因芯片技术在多个环节上有待提高，但它在生命科学及相关领域中已呈现出广阔的应用前景，相信随着研究的不断深入和技术的更加完善，基因芯片会成为基础研究和临床应用的强有力工具。

基因芯片技术进展及应用 作者：刘炎 [关键词] 基因芯片；核酸探针序列；杂交 1　基因芯片概述　　随着人类基因组计划( Human Genome Project)即全部核苷酸测序的即将完成，人类基因组研究的重心逐渐进入后基因组时代（ Postgenome Era）向基因的功能及基因的多样性倾斜［1，2］。通过对个体在不同生长发育阶段或不同生理状态下大量基因表达的平行分析，研究相应基因在生物体内的功能，阐明不同层次多基因协同作用的机理，进而在人类重大疾病如癌症、心血管疾病的发病机理、诊断治疗、药物开发等方面的研究发挥巨大的作用。它将大大推动人类结构基因组及功能基因组的各项基因组研究计划。　　基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法（southern 、northern）是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析，基因芯片在一微小的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分子识别探针，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析［3，4］。基因芯片主要技术流程包括：芯片的设计与制备；靶基因的标记；芯片杂交与杂交信号检测。　　基因芯片的设计实际上是指芯片上核酸探针序列的选择以及排布，设计方法取决于其应用目的，目前的应用范围主要包括基因表达和转录图谱分析及靶序列中单碱基多态位点（single nucleotide polymorphism，SNP）或突变点的检测，表达型芯片的目的是在杂交实验中对多个不同状态样品(不同组织或不同发育阶段、不同药物刺激)中数千基因的表达差异进行定量检测，探针序列一般来自于已知基因的cDNA 或EST库，设计时序列的特异性应放在首要位置，以保证与待测目的基因的特异结合，对于同一目的基因可设计多个序列不相重复的探针，使最终的数据更为可靠。基因单碱基多态检测的芯片一般采用等长移位设计法［5］，即按靶序列从头到尾依次取一定长度的互补的核苷酸序列形成一探针组合，这组探针是与靶序列完全匹配的野生型探针，然后对于每一野生型探针，将其中间位置的某一碱基分别用其它三种碱基替换，形成三种不同的单碱基变化的核苷酸探针，这种设计可以对某一段核酸序列所有可能的SNPs位点进行扫描。　　芯片制备方法主要包括两种类型：(1)点样法：首先是探针库的制备, 根据基因芯片的分析目标从相关的基因数据库中选取特异的序列进行PCR扩增或直接人工合成寡核苷酸序列［6］，然后通过计算机控制的三坐标工作平台用特殊的针头和微喷头分别把不同的探针溶液逐点分配在玻璃、尼龙以及其它固相基片表面的不同位点上，通过物理和化学的方法使之固定，该方法各技术环节均较成熟，且灵活性大，适合于研究单位根据需要自行制备点阵规模适中的基因芯片。(2)原位合成法［7～10］：该法是在玻璃等硬质表面上直接合成寡核苷酸探针阵列，目前应用的主要有光去保护并行合成法，压电打印合成法等，其关键是高空间分辨率的模板定位技术和高合成产率的DNA化学合成技术，适合制作大规模DNA探针芯片，实现高密度芯片的标准化和规模化生产。待分析样品的制备是基因芯片实验流程的一个重要环节, 靶基因在与芯片探针结合杂交之前必需进行分离、扩增及标记。标记方法根据样品来源、芯片类型和研究目的的不同而有所差异。通常是在待测样品的PCR扩增、逆转录或体外转录过程中实现对靶基因的标记。对于检测细胞内mRNA表达水平的芯片，一般需要从细胞和组织中提取RNA，进行逆转录，并加入偶联有标记物的dNTP，从而完成对靶基因的标记过程［11］，对于阵列密度较小的芯片可以用同位素，所需仪器均为实验室常规使用设备，易于开展相关工作，但是在信号检测时，一些杂交信号强的点阵容易产生光晕，干扰周围信号的分析。高密度芯片的分析一般采用荧光素标记靶基因，通过适当内参的设置及对荧光信号强度的标化可对细胞内mRNA的表达进行定量检测。近年来运用的多色荧光标记技术可更直观地比较不同来源样品的基因表达差异，即把不同来源的靶基因用不同激发波长的荧光素标记，并使它们同时与基因芯片杂交，通过比较芯片上不同波长荧光的分布图获得不同样品间差异表达基因的图谱［12，13］，常用的双色荧光试剂有Cy3- dNTP和Cy5- dNTP。对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光技术可以大大提高芯片的准确性和检测范围，例如用不同的荧光素分别标记靶序列及单碱基失配的参考序列，使它们同时与芯片杂交，通过不同荧光强弱的比较得出靶序列中碱基失配的信息［14］。　　基因芯片与靶基因的杂交过程与一般的分子杂交过程基本相同，杂交反应的条件要根据探针的长度、GC碱基含量及芯片的类型来优化，如用于基因表达检测，杂交的严格性较低，而用于突变检测的芯片的杂交温度高，杂交时间短，条件相对严格。如果是用同位素标记靶基因，其后的信号检测即是放射自显影，若用荧光标记，则需要一套荧光扫描及分析系统，对相应探针阵列上的荧光强度进行分析比较，从而得到待测样品的相应信息。由于基因芯片获取的信息量大，对于基因芯片杂交数据的分析、处理、查询、比较等需要一个标准的数据格式，目前，一个大型的基因芯片的数据库正在构建中，将各实验室获得的基因芯片的结果集中起来，以利于数据的交流及结果的评估与分析。

青藏高原是世界上海拔最高、面积最大的高原，素有“世界屋脊”之称，极高海拔也使得青藏高原具有独特的地理气候环境、人文生活习惯和医疗卫生事业状况。高原环境对人体关键的影响因素是低压性低氧，大气压力随海拔增高而降低，氧分压也随之下降。当生活在低海拔地区的人来到高原环境时，由于氧分压的降低，会使人产生缺氧，因而引起“高原反应”，严重的“高原反应”会引起肺水肿和脑水肿，威胁到人的生命。而世居高原的人群在这样的环境下没有“高原反应”，将世居高原人群与低海拔人群的基因组进行对比分析，具有重要的启发意义。藏族人群是世界上居住高原时间最长，并对高原低氧环境适应能力最佳的民族，深圳华大[url=http://life.lifesci.cn/gene/default.htm]基因[/url]研究院发现青藏高原世居藏族人群高原适应的关键基因，有关这一科研成果的论文《50个全外显子测序揭示人类的高原适应机制》在最新一期美国权威学术刊物《科学》（[i]Science[/i]）上正式发表。该成果由深圳华大基因研究院发起和主导，得到了国家自然科学基金委员会、国家科技部、中国科学院、深圳市政府以及丹麦、美国、瑞士等国自然科学基金委员会的支持。这一成果揭示了青藏高原世居藏族人群高原适应的[url=http://life.lifesci.cn/molecular/default.htm]分子[/url]机制之谜，对预测、预防与治疗高原缺氧性疾病，促进我国高原地区社会和经济发展具有重大意义；该成果阐明了人类的[url=http://life.lifesci.cn/gene/default.htm]基因组[/url]在极端环境下发生了何种适应性变化，具有改写人类分子[url=http://life.lifesci.cn/paleontology/default.htm]进化[/url]教科书的意义。该研究使用比较基因组学的方法阐明了高原世居藏族人群的低氧适应机制。“应用先进的基因组学分析技术——全外显子测序技术，对青藏高原世居藏族人群和低海拔人群进行比较，我们发现了藏族人群适应高原环境的关键基因。”该研究负责人、深圳华大基因研究院汪建研究员说。利用第二代高通量测序技术对50个藏族人的全基因组外显子进行测序，并将结果与低海拔汉族人群以及高加索人群的外显子进行对比，通过一套新开发的寻找自然选择信号的算法，计算出在藏族人群中受到自然选择的基因。这些受到自然选择的基因，就可能是在藏族人群高原适应中起着重要作用的基因。结果显示，有一系列基因在藏族人群的高原适应中发挥作用，其中EPAS1基因可能起着关键作用。进一步通过对藏族人群中EPAS1基因的改变位点进行关联分析，发现EPAS1基因中受选择的基因型与藏族人群血红[url=http://life.lifesci.cn/gene/default.htm]蛋白[/url]的代谢有关。EPAS1基因是HIF通路（低氧诱导调节通路）中的重要基因，在人体面对低氧环境的调节通路中起到核心作用。藏族人群特有的“EPAS1”基因不同于汉族人群，正是这种[url=http://life.lifesci.cn/genetics/default.htm]遗传[/url]基因阻止了藏族人血红蛋白浓度的过度升高，降低了各种高原性疾病发生的可能性。由于EPAS1基因与缺氧及血红蛋白生成密切相关，对这一基因的研究还有可能对某些血液性疾病的治疗带来突破，并且还可应用于运动员的筛选等方面。同时，该成果发现了其它一些重要的高原适应相关基因，例如EGLN1基因、FANCA基因等共30个重要候选基因。这些基因可能在藏族人群的高原适应机制中发挥重要的作用，但是其明确的生理生化表型仍不是很确定，这为科学家们下一步对高原缺氧性疾病的研究指明了方向。这是我国在高原医学研究中的重要基础性突破，必将带动相关的基础研究和应用研究的发展。(生物谷Bioon.net)

1883-2002的标准里面说的筛选法采样和累积法采样中的筛选法和累积法是怎么解释的？

简单介绍一下关于药物高通量筛选技术的知识一.概念高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整个体系运转的技术体系。二. 高通量筛选技术体系的组成1. 化合物样品库化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。其中,人工合成又可分为常规化学合成和组合化学合成两种方法。2.自动化的操作系统自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具，简洁明了的图示代表机器的动作。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组分，根据需要可配置加样、冲洗、温解、离心等设备以进行相应的工作。3.高灵敏度的检测系统检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。4.数据库管理系统数据库管理系统承担4个方面的功能: 样品库的管理功能;生物活性信息的管理功能; 对高通量药物筛选的服务功能; 药物设计与药物发现功能。三. 高通量筛选模型常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。1. 分子水平的药物筛选模型:受体筛选模型;酶筛选模型;离子通道筛选模型1.1受体筛选模型:指受体与放射性配体结合模型。以受体为作用靶的筛选方法,包括检测功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。1.2酶筛选模型:观察药物对酶活性的影响。根据酶的特点,酶的反应底物,产物都可以作为检测指标,并由此确定反应速度。典型的酶筛选包括1) 适当缓冲液中孵化;(2)控制反应速度,如:温度,缓冲液的pH值和酶的浓度等;(3)单时间点数器, 需测量产物的增加和底物的减少。1.3离子通道筛选模型: (1)贝类动物毒素的高通量筛选,其作用靶为Na+通道上的蛤蚌毒素结合位点，用放射性配体进行竞争性结合试验考察受试样品。(2)用酵母双杂交的方法高通量筛选干扰N型钙通道β3亚单位与α1β亚单位相互作用的小分子，寻找新型钙通道拮抗剂。2.细胞水平药物筛选模型观察被筛样品对细胞的作用,但不能反映药物作用的具体途径和靶标,仅反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括: 内皮细胞激活; 细胞凋亡; 抗肿瘤活性; 转录调控检测; 信号转导通路; 细菌蛋白分泌; 细菌生长。四.问题及展望高通量筛选技术与传统的药物筛选方法相比有以下几个优点:反应体积小；自动化；灵敏快速检测；高度特异性。但是，高通量筛选作为药物筛选的一种方法,并不是一种万能的手段，特别是在中药研究方面，其局限性也是十分明显的。首先，高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型，因此任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用；其次，用于高通量筛选的模型是有限的和不断发展的，要建立反映机体全部生理机能或药物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。但我们应该相信，随着对高通量筛选研究的不断深入，随着对筛选模型的评价标准、新的药物作用靶点的发现以及筛选模型的新颖性和实用性的统一，高通量筛选技术必将在未来的药物研究中发挥越来越重要的作用。

远志系陕西道地药材，是“秦药”大宗道地药材品种之一[1]。《中国药典》2020年版所收载的远志为远志科（Polygalaceae）植物远志Polygala tenuifolia Willd.或卵叶远志P. sbirica L.的干燥根[2]，具有镇静安神、祛痰开窍、解毒消肿等功效[3]。现代研究表明，远志的主要活性成分有皂苷类、寡糖酯类、酮类等，具有抗记忆障碍、保护中枢神经系统、抗抑郁、抗心肌缺血和抗肿瘤等作用[4]。目前，关于远志的研究多集中于含量研究[5]、活性测定[6]、遗传多样性分析等[7]。随着分子生药学的发展，对药用植物相关活性成分生物合成途径相关调控基因、转录因子的挖掘已成为研究热点，基因组学、转录组学等技术在远志上的成功应用，也为远志基因家族的筛选、鉴定与分析提供了技术支撑和数据基础[8]。 碱性亮氨酸拉链（bZIP）基因家族作为真核生物中转录网络的重要开关，是植物中最大的转录因子家族之一。bZIP结构域由两个区域组成，即DNA结合基本区和亮氨酸拉链区[9]。bZIP基因家族成员通过差异基因网络或生物过程，在调节植物发育、生长以及盐胁迫响应等方面发挥着重要作用[10]。研究表明，拟南芥Arabidopsis thaliana L.、番茄Solanum lycopersicum L.、黄瓜Cucumis sativus L.、李子Prunus salicina L.和蓖麻Ricinus communisL.等多种植物中的bZIP参与调控组织分化、细胞生长、糖代谢、生物和非生物胁迫等多个生物学过程[11-12]。bZIP基因家族成员还参与多种药用植物次生代谢产物合成调控，如丹参Salvia miltiorrhiza Bunge.的SmbZIP1基因可抑制丹参酮的积累，大豆Glycine max (Linn.) Merr.的GmbZIP123基因则参与大豆种子脂质积累的调控[13]。同时，bZIP表达受外源激素和胁迫诱导，壳聚糖处理葡萄Vitis vinifera L.12 h下，其VvLysM8和VvLysM9基因表达量显著提高[14]，糜子Panicum miliaceum L.中的PmbZIP97不仅受到脱落酸（abscisic acid，ABA）、盐和干旱胁迫强烈诱导且参与调控萌发后的根系生长[15]。 本实验利用远志三代转录组数据，以bZIP基因家族为研究对象，对其基因家族进行成员鉴定和生物信息学分析，并确定其在远志中的结构特点与进化特征，进一步通过实时荧光定量分析其在不同组织、不同处理条件下的表达模式，为后续深入研究bZIP的生物学功能奠定基础，同时为bZIP家族可能参与远志次生代谢成分生物合成途径研究提供思路。 1 材料及仪器1.1 材料2021年10月于陕西中医药大学药用植物园（陕西咸阳）采集3年生远志Polygala tenuifolia Willd.及其成熟种子，经陕西中医药大学杨新杰副教授鉴定。选取5株三年生长势均匀的远志植株，将根、茎、叶等量混合后进行全长转录组测序分析。1.2 试剂及仪器ABA、壳聚糖（chitosan，CHT）均购自上海源叶生物科技有限公司，Trizol总RNA提取试剂盒、dd H2O均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，TB Green® Premix ExTaqTM Ⅱ （TliRNaseH Plus）、PrimeScriptTM Ⅱ 1st strand cDNA Synthesis Kit购自TaKaRa公司（日本），所用引物由武汉金开瑞生物公司合成。StepOnePlusTM Real-Time PCR（qPCR）仪（美国Applied Biosystems公司），NanoDropTM 2000分光光度计（美国Thermo-fisher公司），K5800自动检测超微量分光光度计（凯奥公司），?80 ℃超低温冰箱（中科美菱公司）。 2 方法2.1 样品的处理选择大小均一，颗粒饱满的远志种子，用自来水冲洗1 d，10%双氧水消毒，播种于装有泥炭土的花盆中，在光周期16/8 h，光照强度9 000 Lx条件培养[16]。选取长势均一的2月幼苗，喷200 μmol/L ABA、200 μmol/L CTS，干旱（10% PEG 6000）、盐（100 mmol/L NaCl）20 mL，以无菌水作为对照组；以0 h为空白对照，重复3次，6、12、24和48 h取样处理（3株），于?80 ℃冰箱储存，采用PacBio Seque Ⅲ进行上机测序，获得远志全长转录组学文库[17]。2.2 远志bZIP家族基因鉴定及理化性质分析基于远志转录组数据库，筛选出注释结果为bZIP的序列，将序列gene id对应的fasta结果输入editseq软件，进一步获得具有完整开放阅读框（open reading frame，ORF）的基因，通过NCBI中的BlastX进行比对与鉴定。Protparam分析目标蛋白的理化性质，ProtScale预测不同氨基酸中的蛋白亲疏水性[18]。2.3 远志bZIP家族基因二级结构、信号肽、跨膜结构及亚细胞定位分析用ExPASy分析基因编码蛋白质的结构域，CDD验证；ProtParam和SOPMA分析远志bZIP转录因子的二级结构；SignalP-5.0和TMHMM预测信号肽和跨膜区域；WoLF PSORT预测亚细胞定位[19]。2.4 远志bZIP家族基因进化树构建从Tair网站下载拟南芥蛋白序列，通过MEGA软件对远志、拟南芥bZIP氨基酸序列进行多序列比对，利用MEGA的最大自然法构建系统发育树，重复次数设置为1 000次[20]。2.5 远志bZIP家族基因密码子偏好性分析及蛋白互作预测分析采用CodonW、CUSP和Chips分析密码子偏好性。蛋白互作预测分析利用STRING进行，并以拟南芥筛选其同源基因后，通过Cytoscape 3.9.0软件作图。2.6 远志bZIP家族基因蛋白特征、保守基序分析及不同组织表达量热图通过chiplot分析bZIP蛋白的结构域，MEME获得bZIP蛋白的保守氨基酸基序，并用TBtools进行可视化，Weblogo分析蛋白序列位点。利用诺禾云平台将转录组数据库中27个PtbZIP基因在远志根、茎、叶3个部位的差异表达数据进行层级聚类分析。2.7 远志bZIP家族基因表达模式验证与分析Trizol法提取各样品总RNA，凝胶电泳检测后测定总RNA浓度。使用Prime Script TM II 1st strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，检测浓度后于?20 ℃保存备用。设计荧光定量引物，并送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（F：5’-ACAGCAACGTGCTTCTCACC-3’，R：5’-CCCTTCATCCACCACCGACTA-3’）为内参基因，验证PtbZIP26（F：5’-GCACTGATGG- GAAGGCTGAA-3’，R：5’-GATTGCCCAACAC- TTGAGGG-3’）、PtbZIP27（F：5’-GTCGGATGGT- AGTGAACGGG-3’，R：5’-CACCATTTCCCGAAC- CCTGA-3’）在不同部位样本中的表达量。选择表达量较高的PtbZIP26进行不同激素、胁迫处理下的表达量分析。qRT-PCR反应体系为TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）5.0 μL；上下游引物各0.4 μL；50×ROX Reference Dye 0.2 μL，cDNA 1.0 μL；ddH2O 3.0 μL。PCR反应程序参照TB Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂说明书进行，每个反应重复3次。基因相对表达量采用2?ΔΔCt法计算，SPSS 27.0统计分析。 3 结果与分析3.1 远志bZIP基因家族成员的鉴定和蛋白理化性质分析基于远志全长转录组数据库，共筛选得到63个注释为bZIP基因的序列ID，进一步分析后获得39个包含完整ORF的序列。整理ORF差异位点并合并重复，最终得到27个全长bZIP转录因子，编号PtbZIP1～PtbZIP27（表1）。该转录因子的氨基酸个数143～846，相对分子质量介于16 201.52～92 932.3，等电点4.59～9.69。除PtbZIP1和PtbZIP22的不稳定指数小于40，系稳定蛋白质外，其余PtbZIP均为不稳定蛋白。bZIP基因家族脂肪系数介于48.31～92.66，所有bZIP蛋白的平均亲水性数值是负值，为亲水性蛋白。图片3.2 远志bZIP基因家族成员的二级结构、信号肽、跨膜结构及亚细胞定位分析二级结构分析结果（表2）表明，远志bZIP家族蛋白均具有α螺旋、延伸链、β转角和无规卷曲，主要由α螺旋和无规卷曲构成，延伸链和β-折叠所占比例较小，散布于整个蛋白中。SignalP-5.0和TMHMM在线分析结果一致，所有远志bZIP蛋白信号肽分值都低于0.5，说明其均无信号肽，不属于分泌蛋白。跨膜结构域分析则显示，仅PtbZIP9和PtbZIP13有跨膜结构域。亚细胞定位结果表明，远志bZIP家族成员主要定位在细胞核。图片3.3 远志bZIP基因家族成员系统进化分析利用MEGA7.0构建远志与拟南芥bZIP转录因子家族系统进化树。结果表明，27个PtbZIP蛋白分为A、B、C、D、F、G、I、S 8个组，没有bZIP蛋白分到E和K组中。其中G是最大的1个亚组，含有PtbZIP家族成员共8个，占总数的29.63%；A、F、I和S组均含3个PtbZIP家族成员，B组含2个PtbZIP家族成员，C组含1个PtbZIP家族成员，D组含4个PtbZIP家族成员（图1）。图片3.4 远志bZIP基因家族成员蛋白结构域分析BRLZ、MFMR和DOG1为bZIP蛋白中的常见结构域，BRLZ参与调控果生炭疽菌的营养生长，MFMR涉及蛋白与蛋白之间的相互作用，DOG1则与种子休眠相关[21-22]。远志bZIP的结构域分析结果表明：10个蛋白存在BRLZ结构域，9个蛋白存在MFMR结构，6个蛋白存在DOG1结构域（图2）。PtbZIP3和PtbZIP13含有大小相近的CCDC 158 superfamily，PtbZIP26、PtbZIP21和PtbZIP5则均含有BRLZ、MFMR及homeobox结构，结合进化树结果可知PtbZIP3和PtbZIP13聚在一起，PtbZIP26、PtbZIP21和PtbZIP5三者亲缘关系较近。图片3.5 远志bZIP基因家族成员保守基序分析利用MEME对远志27个bZIP蛋白序列进行保守基序分析的结果显示，不同bZIP转录因子基因包含的保守元件数量及种类存在差异，其中bZIP14基因包含的保守元件数量最少（2个），bZIP18/25基因包含的保守元件数量最多（11个），说明bZIP成员具有功能冗余现象，也具有功能差异性（图3）。图片bZIP蛋白结合位点序列分析结果表明，bZIP转录因子的每个重复结构域约为65 aa，均含有1个保守的bZIP结构域，其中N端一般具有高度保守的N-X7-R蛋白基序和碱性亮氨酸区域（图4）。图片3.6 远志bZIP基因家族成员密码子偏好性分析密码子可用来推断基因组内部或基因组之间的进化关系，而不同种类或同一种类的基因对密码子使用有不同的偏好模式[23]。由bZIP基因家族中的27条核苷酸序列中密码子GC的总含量（GC）以及同义密码子第1位（GC1s）、第2位（GC2s）、第3位的（GC3s）的GC含量分析结果可知：27条PtbZIP基因序列的GC1s、GC2s和GC3s的均值分别为52.24%、44.90%和40.93%，不同位置的GC含量存在差异；它们的GC平均值为46.11%，小于50%，表明其更偏向于A或U结尾的密码子[24]（表3）。图片有效密码子（effective number of codon，ENC）反映了密码子偏离随机选择的结果，它是对同义密码子非均衡使用偏好程度的一个重要指标[25]，ENC数值一般在20～61范围内，当ENC＞35则表示密码子偏好性较弱。密码子适应指数（codon adaption index，CAI）是指编码该蛋白的所有密码子相对于这条基因都使用最优密码子的情况下的适应系数[24]。由表3可知，远志bZIP家族成员的ENC数值为43.088～57.195个，平均值为51.13个，密码子偏好性较弱。CBI值较低说明其外源基因在目的宿主中表达较弱。CAI值较低，则说明其适应性较弱。3.7 远志bZIP基因家族成员蛋白互作网络分析为深入了解远志bZIP蛋白的潜在功能和家族成员之间的相互作用，利用STRING软件，基于拟南芥数据库，对远志的27个bZIPs蛋白进行了互作网络分析。由图5可知，调控网络中共有27个节点（代表bZIPs蛋白），104条边（代表蛋白质之间的相互作用），表明远志的bZIPs蛋白存在多种互作现象，且26个bZIPs成员之间存在潜在的互作关系，为进一步验证远志bZIP的功能提供了重要依据。图片3.8 远志bZIP基因家族成员不同组织表达量热图和验证根据远志转录组数据，对27个PtbZIP基因在远志根、茎、叶中的FPKM差异表达数据进行了双向聚类分析。通过表达量热图分析可知，绝大部分基因的表达不恒定，在不同组织具有相对较高的表达量，根、茎和叶中表达量较高的基因数分别为23、2和2。PtbZIP4/15在叶中的表达量最高，茎和根次之；PtbZIP8/24在茎中的表达量最高，叶和根次之；剩下23个除PtbZIP1/17的表达量为根＞叶＞茎，其余表达模式为根＞茎＞叶（图6-A）。基于RT-qPCR验证转录组数据结果显示，PtbZIP26、PtbZIP27在根中的表达量最高，茎、叶次之，与转录组结果一致（图6-B）。图片3.9 PtbZIP26不同处理下的表达模式为了探究bZIP家族基因在远志不同处理条件下的表达模式，以PtbZIP26为代表，对其进行了激素和干旱、盐胁迫处理条件下的表达模式分析。结果发现，以0 h为空白对照（CK），PtbZIP26的表达量在ABA处理6 h内迅速上升，在24 h达到峰值；CTS处理分别持续上调至峰值为CK的5.3倍（24 h）后逐渐下调（图7-A）。PEG处理6 h迅速下降后又随着处理时间增加缓慢恢复上调，NaCl处理6 h后上调明显（图7-B）。 图片4 讨论bZIP基因家族在植物中广泛分布，参与植物的多个生长过程，如生长发育、应激反应以及次生代谢物的生物合成[26]。现阶段，bZIP基因家族已在多个物种有过相关的鉴定和研究，使得对bZIP的生物功能了解更透彻。本实验基于远志三代全长转录组数据库，找到39个bZIP isoforms，通过完整开放阅读框与BlastX分析找出具有完整ORF的基因，去除重复的isoforms，筛选并鉴定得到27个PtbZIP基因家族成员。理化性质分析显示，27个成员均为亲水性蛋白，且除PtbZIP1和PtbZIP22外均为不稳定蛋白；理论等电点小于7的蛋白有16个，属酸性蛋白，其余均为碱性蛋白。PtbZIP蛋白信号肽分值都低于0.5，说明其均无信号肽，信号肽是分泌蛋白的决定因子，推测PtbZIP蛋白不属于分泌蛋白。亚细胞定位结果显示，远志bZIP蛋白主要定位于细胞核，这与转录因子主要在细胞核中发挥作用一致。PtbZIP家族成员的蛋白二级结构也有明显的特点，主要有α-螺旋、无规卷曲。系统进化分析显示，27个PtbZIP蛋白分为A、B、C、D、F、G、I、S 8个组，其中含有8个PtbZIP家族成员的G亚组系最大亚组。PtbZIP11/18/25与拟南芥At1g32150.1、At2g35530.1高度同源，且包含的保守元件数量最多，推测PtbZIP11/18/25可能在远志干旱应答的分子机制中起重要作用[27]。研究表明，A类别的大多数功能信息提示在ABA或应激信号中的作用，PtbZIP6/12/16被分在A组，推测该基因可能参与到远志ABA信号转导途径[28]。S类别是拟南芥最大的bZIP类别之一，在胁迫处理后也被转录激活或在花的特定部分特异表达。研究证实，拟南芥bZIP家族中的S类别的基因在响应干旱有重要作用，本研究中共有3个PtbZIP基因被分到S类别下，其中PtbZIP15在叶中表达量高，PtbZIP24在茎中表达量高，可能参与调控远志对干旱的响应。同时，27个PtbZIP基因家族成员的蛋白二级结构预测结果十分相似，但序列间同源性相对较低，表明PtbZIP基因可能在远志生长发育方面发挥广泛的生物功能。表达模式分析发现，大部分PtbZIP在根中表达最高，qPCR结果验证与转录组数据一致，推测它们主要在远志地下部分发挥作用。植物中转录因子的表达与激素密切相关，研究发现葡萄VvLysM8和VvLysM9在壳聚糖处理12 h、脱落酸处理3 h时相对表达量最高[14]。马铃薯StHXK家族基因在ABA诱导下表达均显著上调，且在10%PEG胁迫处理下也呈不同程度的上调表达[29]。陆地棉GhKIN基因家族的鉴定和分析发现，干旱和盐胁迫处理后GhKIN14和GhKIN27表达出现下调，而GhKIN18等在一定时间点表现为表达上调[30]。本研究选择一个在根中高表达的PtbZIP26基因，通过不同激素、胁迫处理探讨了其是否受到相关激素和胁迫调控，结表明激素处理（ABA和CTS）远志幼苗后，PtbZIP26表达水平显著提高；同时，盐胁迫和干旱胁迫处理也可诱导PtbZIP26基因的表达发生改变且随胁迫时间的变化呈现出差异性，说明PtbZIP26可能通过不同信号通路参与远志应对逆境胁迫的表达，具体作用机制有待深入研究。本实验基于远志三代转录组数据，以远志bZIP基因家族为研究对象，对其家族成员进行鉴定和生物信息学预测分析，明确了相关结构特点与进化特征，进一步通过qPCR分析其在不同组织、不同处理下的表达模式，为探究PtbZIP参与生长发育、代谢过程及非生物胁迫的调控机制提供参考依据，为后期的基因功能研究奠定了基础。

请问通常快速筛选的灵敏度和检出限要比定量检测方法高还是低呢？常用的快速筛选方法都有什么呢？

所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。为了花费最少的工作量，在最短的时间内取得最大的筛选成效，就要求采用效率较高的科学筛选方案和手段。因为诱变育种中的筛选工作最复杂，所以，本节主要讨论诱变育种的筛选方法，这些方法也为其它育种方法的筛选提供了借鉴。 1. 菌种筛选方案在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。 2. 菌种筛选的手段筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求，对于初筛，要力求快速、简便，对于复筛，应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平。2.1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2.2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图5.6.1。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图 5.6.1 平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 . S:3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。4) 生长圈法 利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。5) 抑制圈法待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。例如：将培养后的单菌落连同周围的小块琼脂用穿孔器取出，以避免其它因素干扰，移入无培养基平皿，继续培养4-5天，使抑制物积累，此时的抑制物难以渗透到其它地方，再将其移入涂布有工具菌的平板，每个琼脂块中心间隔距离为2厘米，培养过夜后，即会出现抑菌圈。抑菌圈的大小反映了琼脂块中积累的抑制物的浓度高低。该法常用于抗生素产生菌的筛选，工具菌常是抗生素敏感菌。

DNA编码化合物库（DNA Encoded compound Library,简称DEL）合成与筛选的概念是美国Scripps 研究院的Sydney Brenner（2002年诺贝尔生理学及医学奖获得者）和 Richard Lerner（时任 Scripps 研究所所长）于1992年提出并申请了发明专利。具体地，组合化学的优势是可以快速地产生巨大数量的化合物汇合体，但在筛选过程中无法得知起作用的化合物信息。如果将一个具体的化合物与一段独特序列的DNA在分子水平连接（即对小分子化合物进行DNA编码），在筛选完成后，通过高通量DNA测序仪对筛选出小分子独特的DNA序列进行识别，从而解决由组合化学产生的巨型化合物库无法用于筛选的问题。中文名 DAN编码分子库药物筛选技术背景：药物筛选包括传统高通量药物筛选和DNA编码分子库药物筛选等，分子库是药物靶点筛选的起点和支撑。DNA编码分子库药物筛选技术在近5-7年内逐渐发展起来，已经成为创新药研发中的一种较为成熟的新兴前沿技术，并走出大学实验室，得到各大药物公司的广泛接受，在实际创新药研发中起着越来越重要的作用。已经在香港大学化学系李笑宇教授课题组完成了深入的研究工作，并取得了良好的成果。该技术的基本路线、参数已经成熟，不再需要进行验证研究，可以直接用于实际的药物筛选。李笑宇课题组曾经和拜耳、默克等世界知名药企进行过合作，并将该DNA编码分子库方法应用于实际的药物研发中，针对一些重要的恶性肿瘤的药物靶点，成功地筛选出了一系列高活性的药物候选化合物。这些实际应用充分验证了该技术的可行性、适用性和成熟性。取得发明专利。技术优势：（在李笑宇教授与拜耳的合作中已得到验证）：1、大幅提高成功概率 2、大幅降低研发成本 3、大幅缩短研发周期主要工艺范畴为这些领域所包含的化学合成工艺、蛋白质表达与表征、DNA的固相自动合成与纯化、细胞间操作工艺，以及一些DNA测序的样品处理工艺等。本项目的各个技术环节均已经较为成熟，在多年中和各个大型制药企业的合作中已经得到了充分的验证。下一步将在实践中，进一步将技术细节、工艺流程等方面标准化、自动化，以提高分子库合成与筛选的效率。技术对比：传统高通量药物筛选：分子库数量有限，主要筛选中心：5-6 百万化合物  二十年以上的积累 价格非常昂贵，分子库的维护极为复杂。筛选周期长 (6-12个月/靶点)； 高通量筛选在新药研发中需求巨大，但是在实际应用中却存在巨大的壁垒。DAN编码分子库药物筛选：超高通量 (千万~千亿级)，分子库可以随时构建：百万级/月； 价格适中，分子库的维护极为简单：一个 -80°C 冰箱； 筛选周期短：1 天/靶点； 低门槛：无需任何特殊仪器设备。市场概括：DNA编码分子库的报道：国际DNA-encoded化学库研讨会每两年在瑞士举行一次 。第四届在2014年召开时，仅有英国葛兰素史克、瑞士罗氏、丹麦vipergen、丹麦Nuevolution、美国百时美施贵宝、瑞士Philochem、美国辉瑞、美国X-CHEM等大公司参加 。第五届将于2016年8月26日召开，国际知名公司：强生、辉瑞制药、诺华、赛诺菲、罗氏、默沙东、葛兰素史克、拜耳、 安进、阿斯利康、礼来、雅培、艾伯维、美敦力、百时美施贵宝、梯瓦、利洁时、武田、百特、吉利德、默克雪兰诺、赛默飞世尔科技、诺和诺德、柯惠医疗等均已报名参加同类公司对比：1.葛兰素史克 (GSK) ：GSK在约10年前收购美国波士顿的Praecis公司的DNA编码分子库技术平台之后，一直致力于将本技术在药物研发中的应用。GSK在本领域的的技术为传统的组合化学的split-mix-split方法与酶连标记相结合。他们的分子库的特点为数目极大，为几十亿量级。分子库所筛选的靶点也种类繁多，涵盖了基本上所有的疾病类型。然而，GSK多年以来分子库虽然化合物数目巨大，但是化学结构上只有一种类型：三嗪类杂环化合物。因此较大的限制了GSK分子库的应用。2.Ensemble Therapeutics: 该公司与2002年开始运行，在美国波士顿，由哈佛大学的David Liu教授所创立。Ensemble使用DNA模板控制技术来合成分子库，主要集中在大环多肽分子库，数目并不大，每一个库大约5万个化合物，至今构建了大约几十万个大环多肽。Ensemble和罗氏、辉瑞、GSK、施贵宝都有过或是正在有药物研发合作。但是Ensemble公开的信息不多，所进行的药物筛选基本集中在癌症靶点。3.X-Chem: 同样位于美国波士顿。X-hem的分子库合成技术与GSK类似，但采取化学连接而不是酶连来进行分子库中的编码。X-Chem的分子库的数目更大，据报道已经达到了上万亿个化合物的级别。然而，从公开的数据来看，X-Chem分子库的化合物仍然集中在易合成的肽类、杂环，或是两者结合的结构类型。X-Chem和多个大型药企都有筛选的合作。4.DiCE Molecule： 位于美国加州，由斯坦福大型的Pehr Harbury教授刚刚创立。DiCE的技术主要在于将DNA编码分子库和微流控、自动化结合起来。由于该公司刚刚成立，信息非常少。从Harbury教授发表的论文来看，分子库基本上都是多肽，化合物数量在几十万左右。5.Vipergen：位于丹麦哥本哈根。该公司利用DNA分子自组装来合成分子库的技术。虽然该公司成立了近10年，但是公开信息也较少。大部分分子库也是多肽类化合物，并和若干大药企建立了筛选合作。6.NuEvolution：同样位于丹麦哥本哈根，发展历史和Vipergen非常类似。即基于一种专利技术，进行分子库的合成，同大药企进行合作。NuEvolution也是做大型分子库的公司，分子库数量在几十亿量级。7.Philochem：位于瑞士苏黎世，为瑞士联邦理工学院Dario Neri教授创立。Philochem在本领域中比较特殊，他们用DNA编码分子库做fragment-based drug discovery，即基于碎片的药物发现。Philochem公开的信息也较少，从文献和专利来看，他们研究的方向非常的集中，主要在1-2个癌症靶点上，并且很少和大药企进行合作。2015年药物筛选市场份额 国内：70~105亿人民币 国际：80~120亿美元基于DNA编码分子库的药物筛选占有药物筛选市场的10%左右，预计保持100%的平均年复合增长率。

有没有做过纺织品有机锡、有机汞筛选测试的老师？请问要怎么筛选？我们测下总汞或者总锡若未检出，是否就可以判定其有机汞及有机锡就是未检出？

人类基因组单核苷酸多态性的研究进展与动态The research development of single nucleotide polymorphisms in human genome 摘要：第一张人类基因组序列草图已经公布，正式图预计也将于2003年4月完成。但序列图只基于少数个体，它反映了基因组稳定的一面，并未反映其变异或多态的一面，而正是这种多态性，即基因组序列的差异构成了不同个体与群体对疾病的易感性、对药物与环境因子不同反应的遗传学基础。人类基因组中存在广泛的多态性，最简单的多态形式是发生在基因组中的单个核苷酸的替代，即单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）。SNP通常是一种二等位基因的（biallelic），即二态的遗传变异，在CG序列上出现最为频繁。在转录序列上的SNP称为cSNP。SNP的数量大、分布广。按照1%的频率估计，在人类基因组中每100～300个核苷酸就有一个SNP。因此，整个人类基因组（3.2 X 109bp）中至少有1,100万以上的SNPs，在任何已知或未知基因内和附近都可能找到数量不等的SNP 目前普遍认为，作为数量最多且易于批量检测的多态标记，SNP在连锁分析与基因定位，包括复杂疾病的基因定位、关联分析、个体和群体对环境致病因子与药物的易感性研究中将发挥愈来愈重要的作用。迄今，对多基因疾病候选基因的SNPs研究已积累了丰富的数据，基于这些SNPs的关联分析也正方兴未艾。本文阐述了SNP的特征、不同研究者对基于SNP进行关联分析的观点以及SNP的研究进展与动态。 关键词： SNP；遗传标记；关联研究 中图分类号：Q75 随着分子遗传学的进展，疾病遗传学研究从简单的单基因疾病转向于复杂的多基因疾病（如骨质疏松症、糖尿病、心血管疾病、精神性紊乱、各种肿瘤等）与药物基因组学的研究中。与前者相比，多基因性状或遗传病的形成，受许多对微效加性基因作用，即其中每种基因的作用相对较微弱。这些不同基因构成的遗传背景中，可能有易感性主基因（major gene）起着重要作用。它们同时还受环境因素的制约，彼此间相互作用错综复杂，所以任一基因的多态性对疾病发生仅起微弱的作用。鉴于此，需要在人类基因组中找到一种数目多、分布广泛且相对稳定的遗传标记，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)正是代表了这样一种标记，所以它成为继第一代限制性片段长度的多态性标记、第二代微卫星即简单的串联重复标记后，第三代基因遗传标记。 1． SNP作为遗传标记的优势 SNP自身的特性决定了它比其它两类多态标记更适合于对复杂性状与疾病的遗传解剖以及基于群体的基因识别等方面的研究。 （1）SNP数量多，分布广泛。据估计，人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs。SNP 遍布于整个人类基因组中，根据SNP在基因中的位置，可分为基因编码区SNPs（Coding-region SNPs，cSNPs）、基因周边SNPs（Perigenic SNPs，pSNPs）以及基因间SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）等三类。 （2）SNP适于快速、规模化筛查。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因（biallelic）。 由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。主要的技术方法包括单链构象多态性(single strand conformation polymorphisms, SSCPs)法、异源双链分析（heteroduplex analysis, HA）、DNA直接测序分析、变异检测阵列（variant detector arrays, VDA）法以及基质辅助激光解吸附电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法等。 （3）SNP等位基因频率的容易估计。采用混和样本估算等位基因的频率是种高效快速的策略。该策略的原理是：首先选择参考样本制作标准曲线，然后将待测的混和样本与标准曲线进行比较，根据所得信号的比例确定混和样本中各种等位基因的频率。 （4）易于基因分型。SNPs 的二态性，也有利于对其进行基因分型。对SNP进行基因分型包括三方面的内容：(1)鉴别基因型所采用的化学反应，常用的技术手段包括：DNA分子杂交、引物延伸、等位基因特异的寡核苷酸连接反应、侧翼探针切割反应以及基于这些方法的变通技术；(2)完成这些化学反应所采用的模式，包括液相反应、固相支持物上进行的反应以及二者皆有的反应。(3)化学反应结束后，需要应用生物技术系统检测反应结果。目前许多生物技术公司发展出高通量检测SNP的技术系统，如荧光微阵列系统（Affymetrix）、荧光磁珠技术（Luminex,Illumina, Q-dot）、自动酶联免疫（ELISA）试验（Orchid Biocomputer）、焦磷酸的荧光检测（Pyrosequencing）、荧光共振能量转移（FRET）(Third Wave Technologies)以及质谱检测技术（Rapigene, Sequenom）。 2． 基于SNP的关联研究 如果某一因素可增加某种疾病的发生风险，即与正常对照人群相比，该因素在疾病人群中的频率较高，此时就认为该因素与疾病相关联。如非遗传因素吸烟与肺癌相关；在遗传因素中，如APOE4与Alzheimer`s相关。对疾病进行关联分析需要在年龄与种族相匹配的患者和对照人群中确定待测因素（环境的或遗传的）的频率分布，患者和对照人群的选择是否恰当直接影响结果的可靠性。对常见的由高频率、低风险等位基因导致的疾病，采用致病等位基因的关联分析比连锁分析更有效。 应用SNP进行关联研究，首先需明确多少SNPs才可满足在全基因组范围内的分析。Kruglyak应用计算机模拟法预测人类基因组中超过3Kb就不存在连锁不平衡，据此推出完成全基因组扫描将需要500,000个SNPs。而Collins等收集通过家系研究得到的常染色体单倍型的信息发现，在染色体上相距0.2cM到0.4cM（约200-400kb）之间的标记仍存在连锁不平衡，如按每100kb需要一个SNP计算，那么完成全基因组扫描仅需约30,000个SNPs，平均每3-4个基因用一个SNP就可识别出整个基因组内任何位置上的具表型活性的变异。最近发现SNP与SNP之间的连锁不平衡甚至可延伸到更远的区域（0.35cM-0.45cM），那么进行基因组扫描需要的SNP数量就更少。导致上述估算SNP 数量差异的主要原因是Kruglyak进行模拟计算时，假设现在的人群在5000年前起源于共同的祖先，且人群规模的有效大小保持在10,000左右，然后经过连续的指数扩增，直至达到现在的50亿左右。Collins认为这种假设是不现实的，在人类发展的历史过程中，人群数目的增长是迂回曲折的，经历扩张与萎缩的周期性变化。 Weiss等认为Collins及其同事的结果可能低估了问题的复杂性。因为他们的结果或是基于小样本资料推断出来的，就会使连锁不平衡（LD）程度的估算偏高；或是从理论上预测LD的水平，而忽略了基因组中大量的随机变异。如大多数位点的信息是来源于小样本中测序得到的资料，据此得到的单倍型结构不可靠。目前的研究集中于基因组中LD相对广泛存在的区域，在此区域内，基因相对容易作图。如基于这些经验来进行基因组其它区域的LD分析，就可能发生偏离。如两个相距较远的SNPs 之间具有强的LD性质，就认为它们之间的SNPs及该SNP侧翼的SNPs也存在强烈的LD，这种假设仅适合于其中一些多态位点，但它并不是通则。当然，在一些罕见人群中，如Saami，在较长的区域内广泛存在大量的LD，但对Fihland人群，则在较长区域内几乎不存在LD，对全球整个复杂人群而言，LD肯定变得更复杂一些。 Gray等认为随着人类基因组测序计划的进展，人类基因组的结构逐渐被阐明，因此就可在那些富含基因的区域选择SNP进行全基因组扫描，这样所需的SNP数量还会减少。Halushka等根据他们对75个基因检测的实验结果推测，SNPs在单个基因或整个基因组中的分布是不均匀的，在非转录序列中要多于转录序列，而且在转录区也是非同义突变的频率比其它方式突变的频率低得多。Templeton 等对LPL基因突变与重组热点的研究结果提示，SNP集中分布于基因组的CG二核苷酸处或单核苷酸重复区或αDNA聚合酶的识别位点（TGGA）处。将人类基因组不同区域物理图谱与遗传图谱的进行比较，发现遗传距离和物理距离的比值有很大的差异，提示基因组不同区域的重组水平存在差异。如Dunham等将22号染色体STR的物理位置与遗传位置进行了对比，发现该染色体的重组率差异很大，提示存在重组热点。根据基因组内不同区域重组频率的高低可进一步选择SNP的数量，重组热点需要的标记数量就多，相反就少。这种设计也可能会进一步减少基因组扫描所需的SNP标记。 使用SNP进行关联分析面临的另一个问题是如何选择SNP。如果对每一个SNP都进行独立研究，那么对几百万SNPs 的研究就会导致成千上万次的假关联，结果就掩盖真实的关联性，所以，进行关联分析前，一定要对所研究的SNP进行选

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地沟油的筛选方法中提到指纹图谱，请问指纹图谱与我们平时气质分析的谱图有什么区别？

经常会遇到要自己筛选具有某种特定作用的细菌，比如说能吸附重金属的、能降解塑料的等等，如何更有效地筛选出具有特定作用的细菌呢？大家讨论下。