基因技术

常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。转染方法有多种，根据不同的细胞，贴壁或悬浮细所可选用不同的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率的因素有多种，包括转染方法、操作技术、质粒DNA的纯度、靶细胞的生长状态等，下面重点介绍向几种常用的转染技术：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导尘等。靶基因被导入细胞后，一般在转染后48小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。

10月29日， 中国政策科学研究会国家安全政策委员会近日在北京召开再论转基因与国家安全研讨会。西南财经大学教授顾秀林在研讨会上的发言：　　我坚决不同意标注出售转基因食品，因为就算标注百分之百正确，仍然是允许带着不可估量威胁食品合法进入市场，而且反而把它合法化了。所以我从来都反对，我说标注这个事不要提，我的观点是一刀切禁止。　　从五十年代以来，教育了一个非常错误的理论。从高中生物学课本就错了,即“一个基因，一个蛋白”这种假设根本就是错的。一种特定基因能够控制一种蛋白的生成，这是一种非常少的现象，在绝大多数生物里头就是一个基因决定非常多的蛋白的合成。一个基因给一个指令，这个指令会被修改，修改条件是身体状况和环境的胁迫。现在已知人类基因可以合成三千种甚至上万种蛋白。第一代转基因大豆到现在十五年，现在基本上不行了，它破坏了大豆生物调控系统，破坏了原有结构，破坏了它的调控系统，生物是在反抗的，因为这个外源基因非常强大，它强制地表达自己，这个植物没有办法，所以它一方面制造毒素，一方面挣扎地活着，但是越来越退化。这种技术用在农业上是短命的伤害的技术，二元技术，抗除草剂的大豆和除草剂共用。这个东西在一位美国科学家眼中看来是终极性的，它会毁坏农田生物系统，毁坏植物本身，这从根本上是灭绝人类的一个技术。它是控制植物的一种功能，让植物的功能不起作用，它就被除草剂杀死了，但是这个东西扩散开的话，对生物的杀伤是不可想象的，是一种邪恶技术。生物是一个整体，生态系统是一个活的系统，硬性让几十亿年进化磨合成的和谐系统表达你的东西，这对生物的破坏是根本性的破坏。关于顾老师的发言，你怎么看？

事件一：7月4日，俄罗斯总统普京签署法令，禁止在俄境内种植转基因作物、养殖转基因动物、生产转基因食品，并禁止俄罗斯进口转基因食品，违者将处以罚款。=======================================================================事件二：7月29日，美国总统奥巴马签署了一项有关转基因食品销售的法律，要求生产商在食品包装上标注其是否含有转基因成分，从而让消费者“买得明白”。======================================================================= 美俄两个超级大国在转基因领域的大动作，代表着一个趋势，那就是政府部门对转基因食品的监管会越来越严格，立法越来越完善，因此对检测的技术要求也会越来越高。那么目前国内转基因发展现状，转基因成分的检测技术都有哪些，依据什么原理，准确度怎么样呢，就由小编为大家简单介绍一下。~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）统计报道，目前国内共批准60项转基因作物事件，分别为转基因玉米17项、转基因阿根廷油菜12项、转基因大豆10项、转基因棉花10项、转基因西红柿3项、转基因水稻2项、转基因杨树2项及转基因甜椒、转基因甜菜、转基因矮牵牛花和转基因木瓜各1项。转基因技术的核心是对物种遗传物质进行人为改造，导入外源基因，从而获得预期的目的性状。因此可以通过检测材料中是否含有外源启动子、终止子、标记基因、目的基因(抗虫、抗除草剂、抗病和抗逆等基因)及其表达产物来判断是否含有转基因成分。目前国内外对转基因成分的检测从原理上可以分为两类，基于外源蛋白靶标检测和基于外源核酸成分检测。基于外源蛋白靶标的检测技术主要是以免疫分析技术为基础，利用转基因作物产生的特定的外源蛋白与抗体的特异性识别进行检测和定量的技术。常见的基于外源蛋白靶标的转基因检测技术包括酶联免疫吸附技术（ELISA）、蛋白印迹（Western blot）检测技术、免疫层析试纸条技术及蛋白质芯片技术（Protein chip）等。ELISA方法和免疫层析试纸条法快速准确，但仅可检测一种目标蛋白，而蛋白质芯片可通过设计不同的探针阵列和特定的检测方法，使一次反应同时检测多个蛋白，具有通量高、微型且自动化等优点，但背景信号高、蛋白质活性难以长久保持。蛋白质检测方法往往不能检测加工食品，而且受目的蛋白质在转基因作物中的表达部位、表达时间及环境等的影响，限制了其应用。而核酸成分，尤其是DNA，因其稳定性好，在加工过程中不易降解，被广泛用于转基因检测中。基于外源核酸成分的检测方法主要包括 PCR 技术、恒温扩增技术、基因芯片技术等。PCR技术已经成为转基因作物及产品日常检测工作中应用最广泛的技术，国内以及国际发布的食品和饲料中转基因产品的检测标准方法大都采用的PCR技术原理，应用普通PCR方法或实时荧光定量PCR可以对检测样品进行定性和定量检测。在此基础上，新的PCR技术如巢式和半巢式 PCR、多重 PCR、PCR-免疫层析等技术也成功应用于转基因成分的检测中。同 PCR 检测技术相比，恒温扩增技术具有特异性强、等温高效、操作简单、耗时较短、产物易检测及设备要求低等优势, 在快速检测中具有良好的前景。基因芯片综合了 PCR 技术和分子杂交的优点，可用于一种转基因作物中多个基因的平行检测或对多种转基因作物进行同时检测，其快速简便、自动化、微型化、高通量、准确度高等优点，使其在转基因作物检测方面具有广阔的应用前景。数字 PCR 是一种基于单分子 PCR 的对DNA分子直接计数的绝对定量方法，不需要标准品作为参考，融合了定量 PCR的准确性及基因芯片的高通量，因此有望成为绝对定量新标准，也有潜力解决转基因检测通量和劳力成本的问题。目前, 国内外针对转基因成分的检测主要以DNA为检测对象的核酸扩增检测技术为主，但是却面临着两大挑战：1、Talen和CRISPR等基因组编辑技术在转基因研发中的应用；2、加工技术水平和加工精度的提高, 导致DNA的提取难度加大，提取质量下降。但是我们相信，正是在这些挑战的激励下，我们的检测技术会不断地发展，检测人员的水平也会不断地提高。行路难！行路难！多歧路，今安在？长风破浪会有时，直挂云帆济沧海。

基因芯片技术进展及应用 作者：刘炎 [关键词] 基因芯片；核酸探针序列；杂交 1　基因芯片概述　　随着人类基因组计划( Human Genome Project)即全部核苷酸测序的即将完成，人类基因组研究的重心逐渐进入后基因组时代（ Postgenome Era）向基因的功能及基因的多样性倾斜［1，2］。通过对个体在不同生长发育阶段或不同生理状态下大量基因表达的平行分析，研究相应基因在生物体内的功能，阐明不同层次多基因协同作用的机理，进而在人类重大疾病如癌症、心血管疾病的发病机理、诊断治疗、药物开发等方面的研究发挥巨大的作用。它将大大推动人类结构基因组及功能基因组的各项基因组研究计划。　　基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法（southern 、northern）是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析，基因芯片在一微小的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分子识别探针，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析［3，4］。基因芯片主要技术流程包括：芯片的设计与制备；靶基因的标记；芯片杂交与杂交信号检测。　　基因芯片的设计实际上是指芯片上核酸探针序列的选择以及排布，设计方法取决于其应用目的，目前的应用范围主要包括基因表达和转录图谱分析及靶序列中单碱基多态位点（single nucleotide polymorphism，SNP）或突变点的检测，表达型芯片的目的是在杂交实验中对多个不同状态样品(不同组织或不同发育阶段、不同药物刺激)中数千基因的表达差异进行定量检测，探针序列一般来自于已知基因的cDNA 或EST库，设计时序列的特异性应放在首要位置，以保证与待测目的基因的特异结合，对于同一目的基因可设计多个序列不相重复的探针，使最终的数据更为可靠。基因单碱基多态检测的芯片一般采用等长移位设计法［5］，即按靶序列从头到尾依次取一定长度的互补的核苷酸序列形成一探针组合，这组探针是与靶序列完全匹配的野生型探针，然后对于每一野生型探针，将其中间位置的某一碱基分别用其它三种碱基替换，形成三种不同的单碱基变化的核苷酸探针，这种设计可以对某一段核酸序列所有可能的SNPs位点进行扫描。　　芯片制备方法主要包括两种类型：(1)点样法：首先是探针库的制备, 根据基因芯片的分析目标从相关的基因数据库中选取特异的序列进行PCR扩增或直接人工合成寡核苷酸序列［6］，然后通过计算机控制的三坐标工作平台用特殊的针头和微喷头分别把不同的探针溶液逐点分配在玻璃、尼龙以及其它固相基片表面的不同位点上，通过物理和化学的方法使之固定，该方法各技术环节均较成熟，且灵活性大，适合于研究单位根据需要自行制备点阵规模适中的基因芯片。(2)原位合成法［7～10］：该法是在玻璃等硬质表面上直接合成寡核苷酸探针阵列，目前应用的主要有光去保护并行合成法，压电打印合成法等，其关键是高空间分辨率的模板定位技术和高合成产率的DNA化学合成技术，适合制作大规模DNA探针芯片，实现高密度芯片的标准化和规模化生产。待分析样品的制备是基因芯片实验流程的一个重要环节, 靶基因在与芯片探针结合杂交之前必需进行分离、扩增及标记。标记方法根据样品来源、芯片类型和研究目的的不同而有所差异。通常是在待测样品的PCR扩增、逆转录或体外转录过程中实现对靶基因的标记。对于检测细胞内mRNA表达水平的芯片，一般需要从细胞和组织中提取RNA，进行逆转录，并加入偶联有标记物的dNTP，从而完成对靶基因的标记过程［11］，对于阵列密度较小的芯片可以用同位素，所需仪器均为实验室常规使用设备，易于开展相关工作，但是在信号检测时，一些杂交信号强的点阵容易产生光晕，干扰周围信号的分析。高密度芯片的分析一般采用荧光素标记靶基因，通过适当内参的设置及对荧光信号强度的标化可对细胞内mRNA的表达进行定量检测。近年来运用的多色荧光标记技术可更直观地比较不同来源样品的基因表达差异，即把不同来源的靶基因用不同激发波长的荧光素标记，并使它们同时与基因芯片杂交，通过比较芯片上不同波长荧光的分布图获得不同样品间差异表达基因的图谱［12，13］，常用的双色荧光试剂有Cy3- dNTP和Cy5- dNTP。对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光技术可以大大提高芯片的准确性和检测范围，例如用不同的荧光素分别标记靶序列及单碱基失配的参考序列，使它们同时与芯片杂交，通过不同荧光强弱的比较得出靶序列中碱基失配的信息［14］。　　基因芯片与靶基因的杂交过程与一般的分子杂交过程基本相同，杂交反应的条件要根据探针的长度、GC碱基含量及芯片的类型来优化，如用于基因表达检测，杂交的严格性较低，而用于突变检测的芯片的杂交温度高，杂交时间短，条件相对严格。如果是用同位素标记靶基因，其后的信号检测即是放射自显影，若用荧光标记，则需要一套荧光扫描及分析系统，对相应探针阵列上的荧光强度进行分析比较，从而得到待测样品的相应信息。由于基因芯片获取的信息量大，对于基因芯片杂交数据的分析、处理、查询、比较等需要一个标准的数据格式，目前，一个大型的基因芯片的数据库正在构建中，将各实验室获得的基因芯片的结果集中起来，以利于数据的交流及结果的评估与分析。

八、基因芯片的应用（一）基因表达分析基因芯片具有高度的敏感性和特异性，它可以监测细胞中几个至几千个mRNA拷贝的转录情况。与用单探针分析mRNA的点杂交技术不同，基因芯片表达探针阵列应用了大约20对寡核苷酸探针来监测每一个mRNA的转录情况。每对探针中，包含一个与所要监测的mRNA完全吻合和一个不完全吻合的探针，这两个探针的差别在于其中间位置的核苷酸不同。这种成对的探针可以将非特异性杂交和背景讯号减小到最低的水平，由此我们就可以确定那些低强度的mRNA。目前，Affymetrix公司已经生产出HugeneFL、Mu6500（含有小鼠6500个基因）、Ye6100（含有酵母6100个基因）等基因芯片成品。1.分析基因表达时空特征。英国剑桥大学Whitehead研究所的Frank C.P. Holstege等人，应用含有酵母基因组的基因芯片，深入研究了真核细胞基因组的调节周期。应用基因组水平的表达分析，监测那些表达受转录起始机制的关键成分控制的基因，发现RNA聚合酶II、主要的转录因子TFIID和SAGA染色体修饰复合物等均在基因的表达中有自己特定的作用位点。通过本试验，研究人员揭示了：（1）基因特异性的转录因子对表达的调控作用。（2）细胞在缺乏营养的环境中，基因不同位点的协同调节作用的全新机制。（3）信号转导通路的最终作用位点，在最初的几步中就可以确定。以此试验为基础，研究人员进一步绘制出了酵母基因组控制图，并由此分析出了各种调节因子在基因上不同的作用位点和其作用的分子机制。美国Stanford大学的V.R.Iyer等人，对成纤维细胞中与细胞增生和损伤修复有关的基因进行了分析。首先，他们用成纤维细胞中的8600个基因片断制成基因芯片的探针阵列，通过与mRNA反转录形成的cDNA的杂交反应，可以判断出该基因的活性。在试验中，成纤维细胞被置于无营养的环境中，使绝大部分基因的活性关闭，两天后，加入10%的血清，24小时内，分6个不同的时间点，观察基因的活化情况。试验结果表明，在所有被监测的基因中，约有500个基因最为活跃，而使细胞保持不分裂状态的基因活性被抑制。其中，最早被活化的是那些转录调控基因。在活化的基因中，有28个基因共同作用，控制细胞的增殖；8个与免疫反应的激活有关；19个与血管重建有关；另有许多基因，与血管新生密切相关。在肿瘤细胞中，基因的表达与正常的细胞存在着明显的差异。通过基因芯片绘出基因表达的时空图谱，有助于人类认识生命活动过程和特征。2.基因差异表达检测生命活动中基因表达的改变是生物学研究的核心问题。理解人类基因组中10万个不同的基因功能，监测某些组织、细胞不同分化阶段的差异基因表达（differential gene expression ，DGE）十分重要。对差异表达的研究，可以推断基因与基因的相互关系，细胞分化中基因“开启”或“关闭”的机制；揭示基因与疾病的发生、发展、转归的内在联系。目前DGE研究方法主要有表达序列标签（ESTs）测序、差减克隆（subtractive cloning ）、差异显示（differential display）、基因表达系列分析 (serial analysis of gene expression，SAGE)。而cDNA微阵列杂交技术可监测大量mRNA的转录，直接快速地检测出极其微量的mRNA，且易于同时监测成千上万的基因，是研究基因功能的重要手段之一。Rihn BH等利用基因芯片检测胸膜间皮瘤与正常细胞间比较了6500个基因，，发现了300多个差异基因的表达。其中几个典型基因的表达经RT-PCR进行定量后，可作为胸膜间皮瘤诊断的标记物（Markers）。Sgroi报告DNA芯片结合激光捕获显微切割技术（laser capture microdissection）用于乳癌浸润期和转移期及正常细胞的基因表达谱（gene expression profiles）差异研究，结果被定量PCR和免疫组化所证实。差异表达有助于早期发现瘤细胞3万个基因与正常细胞的区别，有助于了解瘤细胞的发生、浸润、转移和药敏。最近，美国毒物化学研究所（CIIT） 和国家环境健康科学研究所（NIEHS）正计划在一张玻片上建立8700个小白鼠cDNA芯片，用于肝癌的研究。我国也已成功研制出能检出41000种基因表达谱的芯片。美国Stanford大学的David Botstein利用cDNA微阵列芯片，对乳腺癌细胞的基因表达进行了分析，发现其基因表达水平明显低于正常细胞。利用基因芯片对表达进行分析，在一次试验中可以获取相当于在60余万次传统的Northern杂交中所获得的关于基因表达的信息。通过这种实验方法，可以建立一种全新的肿瘤分类学方法，即依据每个肿瘤细胞中的基因表达情况对肿瘤细胞进行分类。基因芯片技术在分析基因的表达中具有不可比拟的优势。3.发现新基因　Moch等利用肿瘤微阵列芯片（5184个cDNA片段）发现了肾细胞癌的肿瘤标志物基因，并于正常细胞进行比较。在532份标本中检测到胞浆纤维Vimentin的表达基因，阳性率为51%～61%。追踪观察，有Vimentin表达的患者，预后极差。人类大量ESTs给cDNA微阵列提供了丰富的资源，数据库中400000个ESTs代表了所有人类基因，成千上万的ESTs微阵列将为人类基因表达研究提供强有力的分析工具。这将大大地加速人类基因组的功能分析。定量检测大量基因表达水平在阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗靶等方面是很有价值的。如该技术在炎症性疾病类风湿性关节炎（RA）和炎症性肠病（IBD）的基因表达研究中，由RA或IBD组织制备探针，用Cy3和Cy5荧光素标记，然后与靶cDNA微阵列杂交，可检测出炎症疾病诱导的基因如TNF-α、IL或粒细胞集落刺激因子，同时发现一些以前未发现的基因如HME基因和黑色素瘤生长刺激因子。Schena等人报道了cDNA的微阵列在人类基因表达监测、生物学功能研究和基因发现方面的应用。采用含1,046个已知序列的cDNA微阵列，用高速机器人喷印在玻片上，用双色杂交法定量监测不同基因表达，在一定的实验条件下，不同表达模式的阵列成分通过序列分析鉴定其特征。该方法较以往常用的方法敏感10倍以上，检测限度为1：500,000（wt/wt）总人体mRNA。在培养T细胞热休克反应的测定中，发现17个阵列成分的荧光比较明显改变，其中11个受热休克处理的诱导，6个呈现中度抑制，对相应于17个阵列成分的cDNA测序发现5个表达最高的成分是5种热休克蛋白，17个克隆中发现3个新序列。另外，在佛波酯诱导检测中，发现有6个阵列成分信号增强超过2倍，测序及数据库比较揭示有5个已知的，诱导表达最高的两个是PCA-1酪氨酸磷酸酶和核因子-κB1，有一个是未知的。这4个新基因的表达水平均相对较低，仅呈现2倍的诱导。Northern杂交结果证实了微阵列的结果。进一步检测了人的骨髓、脑、前列腺及心脏组织中热休克和佛波酯调节基因的表达，4种组织中检测出15种热休克和佛波酯调节基因的表达，其表达水平与Jurkat细胞中相应成分的表达水平密切相关如在四种组织中表达水平最高的两个基因β-actin和细胞色素C氧化酶在Jurkat细胞中的表达水平也很高。上述实验提示在缺乏任何序列信息的条件下，微阵列可用于基因发现和基因表达检测。目前，大量人类ESTs给cDNA微阵列提供了丰富的资源，数据库中400,000个ESTs代表了所有人类基因，成千上万的ESTs微阵列将为人类基因表达研究提供强有力的分析工具。这将大大地加速人类基因组的功能分析。4.大规模DNA测序　人类基因组计划的实施促进了高效的、自动化操作的测序方法的发展。芯片技术中杂交测序（sequencing by hybridization，SBH）技术及邻堆杂交（contiguous stacking hybridization，CSH）技术即是一种新的高效快速测序方法。用含65536个8聚寡核苷酸的微阵列，采用SBH技术，可测定200bp长DNA序列，采用67108864个13聚寡核苷酸的微阵列，可对数千个碱基长的DNA测序。SBH技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高，但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加则提高了微阵列的复杂性，降低了杂交准确性。CSH技术弥补了SBH技术存在的弊端，CSH技术的应用增加了微阵列中寡核苷酸的有效长度，加强了序列准确性，可进行较长的DNA测序。计算机模拟论证了8聚寡核苷酸微阵列与5聚寡核苷酸邻堆杂交，相当于13聚寡核苷酸微阵列的作用，可测定数千个核苷酸长的DNA序列。Dubiley等人将合成的10聚寡核苷酸固定于排列在载片表面的0.1×0.1×0.02mm或1×1×0.02mm聚丙酰胺凝胶垫上制备聚寡核苷酸微阵列，先用分离微阵列（fractionation chips）进行单链DNA分离，再用测序微阵列（sequencing chips）分析序列，后者联合采用了10聚寡核苷酸微阵列的酶促磷酸化、DNA杂交及与邻堆的5聚寡核苷酸连接等技术。该方法可用于含重复序列及较长序列的DNA序列测定及不同基因组

美国加州的山景城是“硅谷”的重要组成部分。现在，一个与硅芯片相关的潜力大产业正在这里兴起，那就是基因组测序技术产业。这个产业的发展是随着多家大公司的激烈竞争开始的。不过，一家名为“整合基因”（Complete Genomics，CG）的公司不像别的公司一样研发和销售测序仪器，而是为科学家提供外包的测序服务，更绝的是，在这家公司里做测序的，并不是研究人员，而是一排排的机器人。近日，《新科学家》杂志探秘了这家充满科幻意味的公司。前台都是“机器人”走进CG公司，连前台都由计算机终端出任。它会主动向来客问好，询问姓名、身份和来访意图。旁边连接的一台打印机则自动打出访客挂牌。与此同时，一份电子邮件已经发送到内部接应人员的电脑上。这家公司的生产线更像科幻电影里的实验室，昏暗蓝色的房间里到处都是高级仪器，室内温度保持在28℃和相对较高的湿度，几名穿着实验服，带着发罩的工作人员在监视着电脑屏幕，查看着机器人的运作状态。这儿已经成为了世界上最大的人类基因组测序工厂。只是在这里工作的不是人类，而是机器人。在一个大约只有半个网球场大的房间里，“坐着”16台机器人，不间断地进行着人类基因组测序的工作。去年，它们完成800个人的DNA测序工作其中三分之一是后半年做出来的。到了今年，它们已经可以每个月生产出400个人的基因了。CG公司只是目前迅速形成产业的诸多基因组测序公司中的一家，但是它十分独特。公司市场总监图柯特（Jennifer Turcotte）对《新科学家》杂志解释说，通常而言，DNA测序是在一个密封的机器里进行的，但在这家公司的实验室里，机器人却是在一个开放暴露的环境下做基因组测序，这是为了便于维修。实验室特定的温度和湿度是为了符合测序中出现的生化反应，微弱的蓝光是为了避免荧光探测剂在探测基因代码符号时受到其他频率光波的破坏。这儿所进行的基因组测序，已是目前最新的第三代基因组测序技术，称为“DNA纳米球测序技术”。这种新方法是将DNA链放置在一小块硅芯片上进行调节，自我组装成所谓的“纳米球”。这样的测序所需要的试剂更少，得到的数据则更多。技术人员都穿着无尘室服装，因为任何一点灰尘都会干扰测序，除非哪儿出问题了，一般而言这些技术人员不会干预机器人的工作。机器人则会自动添加试剂，操作样本，每个DNA纳米球上携带着70个核苷酸，其排列顺序会通过光信号被拍摄记录下来。费用正在逐步降低这些机器人正在做的工作，是一个浩大庞杂的工程蓝图中的第一步，所有的人类基因组中有着30亿对碱基对，而CG计划将其全部组装出来。这需要非常大的计算量，公司为此也建了一个自动数据中心。不过，这个数据中心设在距离公司大约有20分钟车程的地方那儿的电费更便宜。目前CG公司只针对研究者和制药公司开放，个人还没法购买他们的服务。在这里，每对基因组测序要价9500美元，如果购买1000对以上，则每对价格降为5000美元。这个价格是随着基因组测序技术突飞猛进而急剧下降的，要知道，十年前，第一对人类基因组序列完成时，其价格是以十几亿美元计量的。而科学家现在已经预计几年后，基因组测序的价格可能会降到一般人都可能支付得起的程度。基因组测序的流水线完全是由机器人来做的，而职员做什么呢？公司共有185名职员，部分是科研人员，忙于改善公司的测序技术，另一部分则是做市场和联络，与各类客户打交道。基因组测序工程是一项既有非常光明的前途但又异常庞大的科学工程，而自动化则可能成为处理这项工作的最佳工具。基因学家们认为，通过一些基因扫描，是可以找到导致人类易感疾病的一些基因变异，人类基因谱上，有一些常见明显变异，但是就整个遗传问题来看，还有大量的混乱的遗传变异隐藏在DNA双螺旋体中，这些也导致了世界上千奇百怪的遗传疾病。如何去捕猎这些神秘莫测的错误基因代码呢？只剩下一个方法，那就是将整个人类基因谱测序，来捕捉一些可能和疾病有关的基因变异。这个方法虽然听上去如同“大海捞针”一样不靠谱，但目前一些迹象表明，今后或许基因组序列会成为医疗记录的一部分，或者科学家可以通过家庭的基因组测序来纠正基因错误。比如，去年西雅图系统生物学研究所的胡德（Leroy Hood）及其小组与CG公司进行了合作，在《科学》杂志上刊登了一篇论文。他们对一家四口的基因组进行了测序。这是个特殊的家庭，两个孩子都患有两种隐性遗传病米勒综合征和纤毛运动障碍，而父母则完全正常，在分别测出这家人的基因序列后，研究者将父母和子女基因组序列进行比较，验证了米勒综合征这种非常罕见遗传病的致病突变。提供测序外包的服务目前，站在基因组测序产业化起跑线上的企业包括了同样位于加州的生物科学公司Pacific Bio。这个公司创立了首次可以对单个DNA进行测序的仪器。和CG公司一样，目前，这家公司也只向研究者提供服务。有一些大型的、从事基因组测序产业的公司已经将基因组测序做到医院和个人普及的地步了，如研发制造大型测序分析仪器的Illumina公司。这个公司在2008年美国成长最快的科技公司评选中，风头甚至盖过了Google。它们提供的产品甚至可以直接给病人使用。而另一位基因创业企业家罗斯伯格（Jonathan Rothberg）甚至发明了可以放在桌子上的基因解码器，可以在2小时之内以很高的精度解读出1000万个基因代码符号。大部分的基因组测序企业都站在一个竞争线上，尽力提高DNA测序的速度，降低费用。而CG公司其实并非和它们是严格意义上的竞争对手他们计划组装出所有的人类基因序列，研发也是为此目的而进行。此外，他们并不如其他公司一样开发更高级更小巧的基因组测序仪，而是为科学家提供基因组测序的外包服务，也就是说，研究人员无需购买、安装、培训、运行和维修仪器，而只要将样品交给这家公司，等待结果到来就可以。虽然很多人不理解他们的做法，但这家公司始终坚持自己的观点，认为这样的服务最能让科学家将时间从捣腾仪器设备的工作中解放出来，专心放在生物学和假说验证上。从这几年CG公司取得的成绩来看，这种做法确实是有效的。2009年，CG公司宣布其测出了第一个人类基因序列，并移交给美国生物科技信息中心数据库。同一年，他们在《科学》上刊文，发布了三个完整人类基因组序列分析的结果，当时文章还宣布，测序的成本已经可以降到1726美元。这在生物界引起了轰动。到了那一年结束，他们已经做出了50个人的基因序列。此外，他们的名字也随着来自各地的科学家一起多次登上了权威学术杂志。除了去年帮助科学家解开了米勒综合征突变难题给科学界留下难忘的印象之外，美国的罗氏公司还曾经借助CG的基因组测序技术，完成了人类科学史上第一例肺癌患者的全基因组比较。相关研究结果刊登在《自然》杂志上。而美国癌症学会也开始和CG公司联手，希望通过其服务比较正常人和癌细胞基因组序列的差异。或许在不久的将来，解开癌症之谜的第一个贡献就属于这些蓝光照耀下的机器人。

科技日报讯（戴欣郭阳虎）近日，解放军302医院临床检验医学中心科研人员开发出一种针对丙型肝炎患者的新型基因检测技术。该技术对患者本身的白介素28B基因进行多态性分析，在国内率先将多色荧光探针技术（PCR）运用于丙肝患者临床抗病毒疗效的预测和评估中。这为快速检测丙肝患者对某种抗病毒药物是否有效提供了重要依据，从而能更有效地指导临床医务人员准确选择用药，提升治疗效果。 由于患者身体基因型的不同而导致抗病毒用药使用疗效的差异，一直是广大医师用药的困扰。业界许多专家认为，丙肝患者体内白介素28B基因的分布与抗病毒疗效可能存在非常密切的关系，掌握其分布有助于更准确的用药选择。目前国内外科研人员已相继开发了多项针对这一基因位点的检测技术，但由于操作程序复杂、周期长、准确性较差，很难应用推广，给丙肝临床诊断治疗带来一定困难。 302医院的临床检验医学中心毛远丽和王海滨带领的课题组，通过对上千例丙肝患者基因样本进行分析、检测，成功研制出一套针对丙肝患者的抗病毒治疗易感基因检测技术。该技术对多组白介素28B的基因进行筛选，通过合成DNA序列探针，构建双色荧光PCR体系，通过对患者的染色体内白介素28B的基因进行多态性分析，从而得出患者本身个别基因突变的位点。运用该方法，一小时即可完成检测，快速准确，能为患者的临床治疗提供更加准确有效的诊疗依据。 该技术在国内率先将多色荧光探针技术运用于丙肝患者临床抗病毒疗效的预测和评估，大大提高了丙肝临床诊治水平，也标志丙肝个性化诊疗迈出了重要一步。它有助于临床医生更好地选择适合丙肝患者的个性化治疗方案，准确选择抗病毒药物的种类和治疗持续时间，有效缩短患者治疗时间的同时减少就医成本。来源：中国科技网-科技日报 作者：郭阳虎 2014年01月21日

科学家发现一种基因识别新技术科学家们发现了一项基因识别新技术，能将我们掌握的动物遗传信息增加70-80%。研究结果发表在《自然—方法学》（Nature Methods）杂志上，有可能彻底改变我们对于动物遗传学和疾病的认识，并提高我们对于如SARS等跨越物种障碍由动物向人类传播的危险病毒的认识。现代基因组测序技术的进步使得科学家们能够揭示各种各样动物、植物和昆虫的遗传密码，确定控制一切事物，从我们的眼睛颜色到对某些疾病易感性的遗传信息和变异。直到现在，正确识别隐藏在新测序物种遗传物质中的基因和蛋白质还是一项艰巨的任务，需要细致的观察以及编撰大量构成任一动物、植物或昆虫的成千上万基因的数据。论文的主要作者、布里斯托大学细胞与分子医学院的高级讲师David Matthews说：“基因识别主要是借助计算机程序搜寻与在其他动物或人类中已经发现的基因相似的基因组区域。然而，这种分析并不总是有效。”布里斯托大学研究小组现在发现了一种更有效的方法：测序表达的mRNA生成蛋白质数据库再进行质谱分析。这种将高通量测序与蛋白质鉴别技术相结合的方法可以直接观察生成的基因和所有蛋白质，检测存在于动物、植物和昆虫中的遗传信息。为了证实他们的技术起作用，研究人员进行了一项实验，验证他们的程序在基因发现方面的能力。他们用一种充分了解的感冒病毒模拟新发现的病毒感染人类细胞。随后采用新技术分析了这些感染细胞。 当与人类和感冒病毒的已知遗传信息进行比较时，由此生成的“发现”基因和蛋白质的列表证实是极其成功的，并且证明了这一方法的效力。对于仓鼠细胞的类似分析提供了直接观察的证据，在一项相对廉价的实验中研究人员证实仓鼠存在数以千计的基因和蛋白。这些仓鼠中几乎所有基因和蛋白质的直接证据均无法在仓鼠基因和蛋白质的“官方”列表上获得。Matthews博士补充说：“这些研究发现为利用当前强有力的分析工具研究人类疾病，并将它们应用于动物、昆虫或甚至植物——研究一些以往非常具有挑战性或根本不可能的事物开辟了可能性。这一技术也将使得科学家们能够更容易更有效的研究从农场动物及其疾病到危害农作物的病虫害等一切事物。”近年来，包括流感、SARS、埃博拉病毒（Ebola virus）、亨德拉病毒(Hendra virus)和尼帕病毒(Nipah virus)等许多危险的新病毒从动物向人类传播。今年早些时候在中东有三人接触了一种被认为是直接来自蝙蝠的新SARS样病毒而患重病，其中两人死亡。“由于对这些生物体的遗传构成所知甚少，为何这些病毒对蝙蝠的疾病影响有限是一个待解谜题。我们开始将我们的技术应用于实验室培养的蝙蝠细胞，通过分析蝙蝠的遗传和蛋白质含量更多地认识它们的遗传学，了解它们是如何能够与常常对人类造成致命后果的这些病毒明显共存的。

1、基因修复技术修复有机物污染土壤：利用基因修复技术修复含苯酚的污染土壤，通过引入苯酚代谢基因到微生物中，使得微生物可以更高效地降解苯酚，从而达到治理土壤污染的效果。2、基因修复技术修复重金属污染土壤：利用基因修复技术修复含铅污染的土壤，通过引入铅离子转运基因到植物中，使得植物可以更高效地吸收和转运土壤中的铅离子，从而达到治理土壤污染的效果。3、基因修复技术修复农药污染土壤：利用基因修复技术修复含农药的污染土壤，通过引入具有农药降解能力的基因到微生物中，使得微生物可以更高效地降解土壤中的农药，从而达到治理土壤污染的效果。4、基因修复技术修复石油污染土壤：利用基因修复技术修复含石油类化合物的污染土壤，通过引入具有石油降解能力的基因到微生物中，使得微生物可以更高效地降解土壤中的石油类化合物，从而达到治理土壤污染的效果。

日前，卫生部发出通知，决定将原本需经过国家卫生部审批的基因芯片诊断技术“下放”由省级卫生行政部门负责其临床应用管理。业内人士分析，此举使高高在上的尖端科技“跌落云端”，基因诊断将更快走入寻常百姓家，只需一滴血，你就可以预知自己是否会患上乳腺癌、高血压。检测：诊断更快更准更贵武汉大学中南医院基因诊断中心主任郑芳昨日介绍，疾病的发生发展经历了从基因到蛋白质，再到细胞、组织的变化，最后表现在脏器层面等一系列复杂的过程。传统的表形诊断技术最早能捕捉到蛋白质的异常，基因诊断则能提前到最早期的量变。此外，基因诊断速度更快。比如耐药性结核病，传统检测手段至少需要1个月，有些病人还没等确诊就恶化了，而基因诊断最快可在1天内得出结果。但是，基因诊断要做到更快更准，其尖端的设备和从业人员使得收费自然不菲，动辄数千上万元的价格往往令人望而却步。预知：并非一定发生“基因诊断能预知疾病，但其结果并非一定就会发生。”郑芳说，基因改变作为最早期的量变，与疾病的关系并不能一一对应，所有基因检测的结果，仅具有参考价值。比如癌症，基因检测可明确找出一个人是否携带相关的癌症基因，但是癌症发病受环境、遗传等诸多因素影响，有突变基因不代表一定会发病。规范：不同医生解读答案应相同首先，基因芯片诊断主要适用于那些依靠目前的临床诊断手段仍无法确诊，而病人已有症状或者主观感觉不适者。通俗地说，基因芯片并不能完全取代目前临床实验室诊断，而只能视其为补充或扩展。其次，从业人员也应接受完整、规范的培训，以对基因检测的结果做到统一解读，也就是说，一种基因检测不同医生给出的答案应当只有一个。对患者，医师应全面告知基因芯片诊断的目的、技术可靠性、参考价值、结果的客观评估和注意事项，以及可能发生的经济和心理负担，并签署知情同意书。

《Nature Methods》盘点2011年度技术，选出了最受关注的技术成果：人工核酸酶介导的基因组编辑（genome editing with engineered nucleases）技术。除了基因组编辑以外，《Nature Methods》也整理出了2011年最值得关注的几项技术，分别为：单细胞技术（Single-cell methods）、功能基因组资源（Functional genomic resources）、糖蛋白组学（Glycoproteomics）、单倍体因果突变（Causal mutations in a haploid landscape）、单层光生物成像（Imaging life with thin sheets of light）、非模式生物（Non?model organisms）、光基础电生理学（Light-based electrophysiology）和RNA结构（RNA structures ）。其中单细胞或者单分子之类的技术几乎每年都会出现在Nature Methods的这一名单中，比如去年的单分子结构分析技术（Single-molecule structure determination）。所谓单细胞技术很好理解，就是相对于群体细胞研究，针对单个细胞的研究技术，由于培养基或者机体中的细胞存在多样性，或者说是异质性，这为许多实验分析造成了障碍。可以说，随着现代生物学的发展，“平均值”这个词已经不能满足我们的需要了，我们要了解细胞之间的差异性。然而要进行单细胞分析也困难重重，从技术上说也存在几个方面的问题。首先无论是针对一个特异性大分子，还是在OMIC水平上进行分子分析，都存在单细胞提取物数量少，难以分析的困难，这甚至可以说是不可能完成的，因此增加灵敏度势在必行。除此之外高通量分析也是一个瓶颈，要想获得单细胞分析确切的分析结果，研究人员必须快速而准确的分析多个细胞，这并不容易。另外单细胞分析也常常需要进行多种方式分析，这不仅是由于细胞存在于一种异质性环境汇总，而且也在同一时间，也需要测量多个参数。不过值得庆幸的是，今年在这些方面都不断有好消息传出，比如质谱流式细胞分析技术，这种技术采用了同位素作为抗体标记，替代荧光探针，从而延伸了流式细胞仪的多元分析能力。这篇题为“Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum”的文章由多伦多大学和斯坦福大学完成，他们采用同位素标记抗体，结合质谱分析的方法实现了同时对细胞表面多达一百种标记物的检测。通常采用的荧光抗体标记细胞表面蛋白结合流式细胞术检测的方法，虽然能实现细胞分选，但只能够同时识别6-10种不同颜色的荧光，且还需尽量避免发生荧光重叠。而这项研究通过这个可以称为大量细胞计数法的方法，观察了人类骨髓产生的不同形态细胞中及表面的34种物质，不但能正确归类10多种不同类型的免疫细胞，还能观察到各类免疫细胞的内部变化，从而预知可能发生的变化。这将有助于更快更广泛的测量处方药对人体细胞的反应及功效，提前发现细胞病变，研发出针对个人的治疗药物。另外在基因表达分析研究中，数字逆转录酶PCR（digital reverse-transcriptase）技术，结合微流体设备也帮助实现同时监控上百个单细胞中上百个基因的表达。今年的一项研究证明了这一点：Single-cell dissection of transcriptional heterogeneity in human colon tumors。这项有关肿瘤异质性的研究利用新技术对数百个结肠癌细胞进行了单细胞基因表达分析，由此获得了人类结肠癌异质性图谱。随着单细胞分析技术越来越多的用于解答生物问题，对于灵敏度和高通量的要求也在不断增加，尤其是在大分子分析方面――这比DNA和RNA分析的需求更多，而且商业用途的需求也越来越多。

自人类耕作以来，就在探索有效防除杂草的途径。草甘膦，因能在结构上阻断植物体内芳香族氨基酸生物合成，导致杂草和作物死亡，有效控制危害最严重78种杂草中的76种，而占据着农药销售榜的首位。　　科学家梦想将抗草甘膦基因导入作物中，获得抗草甘膦的转基因作物。抗除草剂，便成为转基因作物商业化后，最具优势的性状之一。　　这些特性首先增加了作物的产量。“种植抗除草剂转基因作物可采用窄行间距方法，比如转基因抗除草剂大豆的行间距能从76厘米缩小到33厘米或更小。”中国农业科学院生物技术研究所所长林敏介绍说，从1996年以来，美国采用窄行间距方式使大豆增产35%。　　此外，种植的抗除草剂转基因农作物在使用除草剂后，对田间作物的残留物无需进行处理，减少了劳动力的数量和力度。据了解，如果每年种植抗草甘膦转基因玉米1000万亩，平均每亩可减少除草用工3个，每年可减少3000万劳动工作日。同时，因为每亩玉米增产30—50公斤，农民每亩可增收50—100元。　　2011年，全球耐除草剂性状的转基因农作物占到总转基因农作物种植面积的59%。面对如此庞大的市场，美国孟山都等公司在投巨资开展基因研究和开发的同时，申请并获得了上百项与草甘膦抗性相关基因的专利。目前推广的抗草甘膦作物品种中，有69.2%由孟山都研成。　　我国每年因杂草引起损失约占粮食总产的10%。但由于抗草甘膦基因长期开发的欠缺，始终没有商业化生产的抗草甘膦转基因作物品种。突出跨国公司的垄断，成为紧迫的使命。　　中国农业科学院生物技术研究所研究小组临危受命，与北京大学等研究单位密切合作，开始了自主创新抗除草剂转基因农作物的研发之路。　　中国科学家采取3条技术路线齐头并进的方法：首先利用我国极其丰富的污染环境微生物基因资源优势，建成一批具有中国特色和自主知识产权的功能菌株库、功能基因库和分子酶库。另一方面，建立环境基因组学技术、功能基因组学分析技术、高通量表达筛选技术以及高水平技术等先进技术进行集成。同时，完善极端污染土壤微生物样品的DNA免培养分离技术及功能基因筛选平台，以及草甘膦抗性基因作为筛选标记的基因表达和功能鉴定的真核筛选系统。　　通过努力，结构新颖、功能明确、草甘膦抗性显著的EPSP合成酶基因诞生。这是一个具有自主知识产权的新型抗草甘膦基因，同时获得了国内发明专利和美国专利。　　其中，G2-EPSPS基因作为研究组从免培养技术构建的群落水平DNA库中分离鉴定的第一个抗草甘膦基因，成为草甘膦抗性最强、酶活最高的基因之一。　　“经试验，G2-EPSPS基因的结构新颖，在核酸水平上与已见报道的EPSP合成酶编码基因无任何同源性，与孟山都公司专利报道的根癌农杆菌CP4的同源性为24.53%，且不含有专利保护序列和突变位点。在酶学水平上G2-EPSPS基因草甘膦耐受性高于孟山都公司的CP4-EPSPS基因，是一个具有自主知识产权和重要育种价值的新型抗草甘膦基因。”林敏强调说。　　该小组同时与国内众多研究机构以及北京奥瑞金种业有限公司等合作，开展了转G2-EPSPS基因玉米、棉花、油菜、水稻、大豆和小麦等的研发工作。　　从2010年开始，经过北京、海南两地连续三代试验，奥瑞金研究人员发现转基因玉米在田间生产上能稳定耐受使用剂量5倍的草甘膦。模拟农民喷施除草剂的方法后，也发现转基因玉米在能耐8倍的草甘瞵。研究人员在北京、海南两地的两个生长季节，对转基因玉米的农艺性状进行了观察和测量，结果表明，与非转基因受体玉米相比，转基因玉米除耐草甘膦目标性状以外，其他农艺性状等均与非转基因受体玉米没有差异。　　同时，对进入生产性试验的抗草甘膦转基因玉米的环境安全和食品安全，研究小组委托国家认可的两家检测机构中国农科院植保所和中国农业大学食品安全检测中心分别进行试验。　　“2009年迈出了产业化过程中最关键的一步，我们与种业公司签订了基因独家使用和共同推进产业化协议。利用本发明专利所保护的EPSP合成酶基因培育出转基因抗草甘膦玉米，进行了转基因生物安全的中间试验和环境释放试验，于2012年获得农业部批准，进入生产性试验阶段，这也是转基因作物产业化应用的关键阶段，如能在今后两年内获得生物安全评价的安全证书，3—5年内获得品种审定并实现商品化生产，将有利于打破跨国公司在抗除草剂转基因产业上的垄断。”林敏说。

生物科学正迅速地演变为一门信息科学。最明显的一个例子就是目前正在进行的HGP（human genome project），最终要搞清人类全部基因组的30亿左右碱基对的序列。除了人的遗传信息以外，还有其它生物尤其是模式生物（model organism）已经或正在被大规模测序，如大肠杆菌、啤酒酵母、秀丽隐杆线虫以及中国和日本科学家攻关的水稻基因组计划。但单纯知晓生物基因组序列一级结构还远远不够，还必须了解其中基因是怎样组织起来的，每个基因的功能是什么，又是怎样随发育调控和微环境因素的影响而在特定的时空域中展开其表达谱的，即我们正由结构基因组时代迈入功能基因组时代。随着这个功能基因组学问题的提出（后基因组时代，蛋白组学），涌现出许多功能强大的研究方法和研究工具，最突出的就是细胞蛋白质二维凝胶电泳（2-D-gel）（及相应的质谱法测蛋白分子量）和生物芯片（Biochip）技术。一、什么是基因芯片生物芯片，简单地说就是在一块指甲大小（1cm3）的有多聚赖氨酸包被的硅片上或其它固相支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等，但需经特殊处理。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基（视所要固定的分子为核酸或寡肽而定）并与保护基建立共价连接；作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等）将生物分子探针（寡核苷酸片段或基因片段）以大规模阵列的形式排布，形成可与目的分子（如基因）相互作用，交行反应的固相表面，在激光的顺序激发下标记荧光根据实际反应情况分别呈现不同的荧光发射谱征，CCD相机或激光共聚焦显微镜根据其波长及波幅特征收集信号，作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片。而基因芯片中，最成功的是DNA芯片，即将无数预先设计好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成点阵，与样品中同源核酸分子杂交的芯片。基因芯片的基本原理同芯片技术中杂交测序（sequencing by hybridization，SBH）。即任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8nt亚序列：　　(1)　CTCATATG　　(2)　GCTCATAT　　(3)　AGCTCATA　　(4)　TAGCTCAT　　(5)　TTAGCTCA这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。亚序列中A、T、C、G4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA 的互补寡核苷酸序列。二、芯片类型一般基因芯片按其材质和功能，基本可分为以下几类：(一)元件型微阵列芯片1 .生物电子芯片2 .凝胶元件微阵列芯片3 .药物控释芯片(二) 通道型微阵列芯片1.毛细管电泳芯片2 .PCR扩增芯片3 .集成DNA分析芯片4 .毛细管电层析芯片(三)生物传感芯片1 .光学纤维阵列芯片2 .白光干涉谱传感芯片小鼠基因表达谱芯片（MGEC）附：目前国内基因芯片常见品种（上海博星公司）http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/08/01/1217591301.gifhttp://www.biomart.cn/upload/asset/2008/08/01/1217591302.gifhttp://www.biomart.cn/upload/asset/2008/08/01/1217591303.gif

来源：中国科技网-科技日报 作者：王怡 2013年10月31日 原标题：我自主研发基因测序技术将实现产业化 科技日报讯（记者王怡）2013年国际基因组学大会10月29日在青岛举行。在开幕现场，中国科学院北京基因组研究所与吉林紫鑫药业股份有限公司就合作开发第二代高通量测序系统项目签订投资意向协议，这标志着由中科院自主研发的第二代测序仪项目即将进入市场转化和产业转化阶段。 基因测序技术，自人类基因组计划实施以来长期占据着国际生命科学技术研究的制高点，随着第二代基因测序技术的发展日趋成熟和成本急剧降低，该项技术被越来越多的科研和实践领域所应用，形成庞大市场。目前我国市场上所有高通量测序设备和试剂均来源于进口，据估计仅2013年我国在仪器和试剂上的投入就超过20亿元。 “我们的基因组学研究一直处于世界前列，源于我们最早参与人类基因组测序的工程，但是我们使用的设备一直都依靠国外的进口设备，中国科学院作为国立科研机构，我们有义务自主研制开发基因测序仪打破国外垄断。”中科院北京基因组研究所党委书记杨卫平说。 在中科院资助下，历时两年半时间完成第二代测序仪研发项目，于2011年实现原理样机和性能验收，部分性能指标超越同类进口产品。其后中科院北京基因组研究所自主投入完成该项目的工程化和产品化开发，并形成其自主知识产权群，目前已有9个专利获得授权。 “第二代高通量测序仪的产业化发展是我们的第一步，后面我们希望能有更多的进展，比如在试剂、数据库和后台都能实现国产化。”杨卫平说。

植物转基因技术已经成为现代分子生物学研究中的最重要手段。在过去的十几年里，植物转基因技术获得了重大发展，新型和更为有效的转化方法应运而生。尽管如此，农杆菌介导的遗传转化和基因枪法进行的遗传转化仍然是最重要的两种转化方法。农杆菌转化广泛应用于在谷类及双子叶植物。同时，其他转基因技术也迅速发展，如显微注射法、激光微束穿刺法、PEG 法、花粉管通道法、超声波法、阳离子转化法等1][/sup]。常规转基因技术具有很多优点。农杆菌介导的遗传转化成本低，不需要复杂的仪器设备，转化效率高，适用范围广，插入片段大。正因为具有以上优点，农杆菌转化是目前应用最为广泛的转化方法。基因枪法对转化受体要求低，几乎可适用于所有植物物种，方法快速简单；然而基因枪设备要求高，转化成本相对较高，这在一方面限制了基因枪法的使用。同时利用基因枪法获得的转化子通常具有多个转基因拷贝，粒子轰击也常会造成目的片段的断裂失活，转化子出现嵌合体频率高，这些也都在一定程度上限制了基因枪法的使用。其它方法在应用上都存在一定的局限性，或者是操作复杂，或者是适用的物种少。然而不管使用哪种常规方法，都有共同的局限性：1）插入位置的随机性，由于这种随机性的存在，可能导致转化受体发生性状上的改变，如败育，生长不良等等。2）常规的转基因技术多是进行单性状基因的转入，很难将控制多个性状的多个基因同时转入一种作物中，更难将整条复杂代谢途径中的所有基因引入作物中，很难产生新的复杂性状或代谢产物。3）外源基因在转入作物时，往往因整合进内源基因而破坏该内源基因的功能；同时转化的随机性使转入的外源基因受到整合区域上游或下游调控元件的影响，很难进行操控1]。相比之下，植物人工染色体技术具有很多优势：1）植物人工染色体单独成对存在于转化受体，并且稳定遗传给子代，不会影响和破坏其他染色体的结构和功能。2）植物人工染色体采用位点特异重组技术可以将目的基因定点整合到人工染色体的特定位置，不会破坏受体内源基因的功能，也不会受到整合区域上下游的影响。3）植物人工染色体可以承载多个基因，甚至编码复杂代谢网络的众多基因[[url=http://bbs.instrument.com.cn/post.asp?forumid=487&threadid=&postid=&title=&action=&FTTID=1&hasReadRelease=yes#_ENREF_2]2]。正是这些优势的存在，使得植物人工染色体技术当仁不让的成为第三代植物转基因技术，并具有广泛的应用前景。 [size=10pt][1] Barampuram, S. and Zhang, Z.J. (2011). Recent advances in plant transformation. Methods Mol Biol 701, 1-35.[size=10pt][2] Yu, W., Han, F. and Birchler, J.A. (2007). Engineered minichromosomes in plants. Curr Opin Biotechnol 18, 425-31.

最近，来自美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校、克雷格·文特尔研究院和Illumina公司的科学家对现代基因测序算法进行了改良，只需从一个细菌细胞中提取的DNA(脱氧核糖核酸)就可组装成接近完整的基因组，准确率达到90%，而传统的测序方法至少需要10亿个相同的细胞才能完成。这一突破为那些无法培养的细菌提供了测序方法。研究发表在9月18日的《自然·生物技术》网络版上。　　实验室无法培养的细菌范围极广，约占99.9%，从产生抗体和生物燃料的微生物，到人体内的寄生菌。它们的生存条件特殊，比如必须和其他菌种共生，或只能生存在动物皮肤上，因此很难进行人工培养。　　论文合著者、文特尔研究院的罗杰·拉斯肯教授10年前曾开发出一种多重置换扩增(MDA)技术，可对实验室无法培养的细菌测序，能恢复70%的基因。其工作原理是对一个细胞的基因片断多次复制，直到其数量相当于10亿个细胞那么多。不过，这种技术却给测序软件带来很多麻烦，它在复制DNA时会出现各种错误，而且并非完全统一放大，有些基因组被复制数千次，有一些却只被复制一两次。但测序算法不能处理这些不一致，而是倾向于舍弃那些只复制了少数次的基因，即使它们对整个基因组来说很关键。　　加州大学圣地亚哥分校雅各布工程学院计算机科学教授、现代基因测序技术算法创建人帕维尔·帕夫纳和同事改进了这一方法，保留了那些少量复制的基因片断，并用新方法对一个大肠杆菌测序以检验其精确性，发现它能恢复91%的基因，接近传统的培养细胞水平。这已足够解答许多重要的生物学问题，比如该细菌能产生什么抗体。　　人体细菌占体重的约10%，它们有些会造成传染病，但也有的能帮助消化，最近研究还发现，它们能改变人的行为方式，比如引诱人吃更多的东西。新方法也有助于科学家理解细菌行为，研究人体内细菌能产生哪种蛋白质和多肽，这些蛋白质和多肽是细菌之间、细菌和宿主之间互相沟通的工具。　　研究小组还用新方法对一种以前未曾测序过的海洋细菌进行了测序，获得了相当完整而且能解释的基因组，掌握了它是如何生存和运动的，该基因组将被存入美国国家卫生研究院的基因银行(GenBank)。研究人员表示还将对更多迄今未知的细菌进行测序。

据美国物理学家组织网近日报道，马萨诸塞大学医学院研究人员开发出一种新的突变基因筛查技术，该技术能在同一试管中检测出可能发生突变的每个氨基酸，并分析出每种突变对细胞造成的影响。新技术为检测遗传疾病、识别突变细菌和新疫苗开发开辟了一条捷径。该研究发表在近日的美国《国家科学院院刊》（PNAS）网站上。人类染色体组中每个基因都由上千个DNA（脱氧核糖核酸）密码组成，其中一个密码改变就可能造成严重疾病，如癌症、囊性纤维化、肌肉萎缩或亨廷顿病等。同样，病毒或细菌中一个微小突变也能产生抗药性菌种，使常规药物失效。即使很小的基因片段都可能有上千种变化，要系统分析它们很难。通常的DNA测序是阅读整个染色体组。而生化与分子制药副教授丹尼尔·玻仑领导的研究小组开发出名为EMPIRIC的新技术，能在同一个试管中，精确计算并记录细胞的上百种不同变异。波尔他们使用新技术对活性面包酵母菌进行了检测，该酵母菌基因包含9个氨基酸，同时在同一试管中检测出这一小片基因中发生的500多种不同DNA突变。而之前的检测技术需要做几千次试验，花几年才能完成。新技术的关键突破在于，能在同一个试管中同时分析大量突变。目前的抗药性筛查技术要依赖偶然的突变，所以效率低下，对那些可能发生却并未发生的突变更是无从下手。但由于病毒基因氨基酸相对较少，新技术可在同一试管中检测出某种病毒进化出抗药性的所有突变，将病毒整个基因组系统地筛查一遍。这为系统地鉴定抗药性突变、开发新型疗法和新疫苗提供了一条捷径。新方法还有助于深入理解生物寄主的问题，包括环境压力怎样在基因层面影响了进化过程，何种突变可能造成基因疾病，如何筛查可能产生抗药性的突变病毒等。玻仑说：“虽然我们只用酵母菌细胞做了试验，但新技术很全面，能用于任何迅速生长的细胞，还能作为一种对癌症、病毒或细菌的基因控制手段。”( 来源：科技日报 )

[font='Times New Roman'][font=宋体]目前[/font][/font][font=宋体]，[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]尚无[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱[/color][/url]技术用于转基因油脂的鉴别研究[/font][/font][font=宋体]。食用植物油中转基因成分含量低，[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱[/color][/url]技术较难实现痕量分析。不过[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱[/color][/url]技术可实现转基因油脂原料的鉴别，现阶段已有近红外高光谱成像技术用于转基因油脂原料（大豆）快速无损鉴别的相关研究[/font][sup][font=宋体][font=Times New Roman][102][/font][/font][/sup][font=宋体]。[/font]

不过短短数十年，基因测序的价格从近30亿美元步入千元时代，这让你有没有恍如隔世的感觉？如果全基因组测序的价格降到非常低，你会选择测自己的基因序列吗？商家说做基因测序可以预知孩子有哪些天赋，你相信吗？Illumina、Life Tech、罗氏、华大基因，基因测序仪器市场谁主沉浮？中科院北京基因组研究所、中科院半导体所、北京大学、东南大学，学院派能否挑起测序仪器国产化的大梁？质谱技术也可以用来做基因测序，你听说过吗？虽然基因测序越来越容易，但我们得到的却是一本生命天书，要完全读懂它我们还需要多少时间？更多关于基因测序的信息，请访问：http://www.instrument.com.cn/news/subject/s325/

日本 PCR分析 猪牛鱼等基因技术

基因工程技术在食品中的运用

作为中国连接世界的跨界创新平台，11月8日在北京举行的腾讯WE大会邀请了12位全球顶尖科学家、互联网思想家和技术专家，讲述对未来的畅想。从人工智能、脑机接口、基因科技、到外太空旅行探索等多领域的创新和行业趋势，腾讯公司希望通过WE大会，让中国互联网从业者们站在未来，连接一切，参与一场由新兴产业引导的全球“进化运动”。基因技术推动生物医药跨越发展当下的世界，各种与基因相关的出生缺陷、肿瘤、心脑血管病影响着80%人类的健康和生死，如果我们能以基因技术推进生物医药跨越发展，将能为人类的健康和生命质量带来翻天覆地的改变。本次WE大会特别邀请了我国基因科技领军人物、华大基因研究院院长王俊，他所领导的华大基因是世界上最大的基因测序公司，致力于用基因科技造福人类，推动个体化医疗和健康的新模式使更长寿、更健康的生活成为可能。2013年9月，王俊被美国商业杂志《财富》评为2013年度全球40位40岁以下精英，是该榜单首位上榜的中国科学家。2012年，王俊被英国《自然》杂志评选为年度十大科学人物，也是路透社2012年度最热门科学人物之一，获得科学研究领域“影响世界华人大奖”。

上海交大一项研究有望降低抗肿瘤良药成本2013年02月26日 来源： 中国科技网 作者： 王春 沈海燕 中国科技网 讯 （沈海燕 记者王春）上海交通大学微生物代谢国家重点实验室林双君研究小组通过对链黑菌素生物合成基因簇进行基因解析，阐明了链黑菌素复杂的生物合成途径。由此得到的链黑菌素类似物不仅抗癌活性高很多，其毒性上也比原始链黑菌素降低了约5倍。该研究成果近日发表在国际权威学术期刊《美国化学会会志》上。 链黑菌素是由一株绒毛链霉菌所产生的抗肿瘤抗生素，具广谱抗肿瘤活性。但在上世纪七八十年代进行二期临床实验时，因其毒性过强而被迫终止。 基因组测序技术为生物合成机制的研究提供了更多信息。林双君研究小组首先克隆了链黑菌素潜在的抗生素基因簇，定位出链黑菌素的生物合成的48个独立基因编码，再通过微生物遗传学、化学及生物化学技术和手段，获得了其中17个基因的突变菌株，从中分离鉴定了12个与链黑菌素生物合成相关化合物的化学结构，提出了链黑菌素生物合成途径的模型。 在这一过程中，还揭示了多个新颖或关键的酶催化反应的分子生物学机制。该项研究为抗生素药物新颖酶催化反应基因的挖掘，并利用合成生物学等前沿生物技术创造新的结构衍生物奠定了基础。林双君称，这是首次在基因水平实现链黑菌素的生物合成途径的解析。 课题组通过基因工程技术获得的一个链黑菌素类似物，在抗癌活性上比目前临床使用的抗癌药物高很多。这个类似物在临床应用方面，对治疗淋巴瘤、白血病、鼻咽癌等疾病将有更大的优势。林双君表示，只要将产量提高到可规模化生产，就可将链黑菌素或类似物转化为一个新型的抗癌药物，不仅有望降低药价，而且减少化疗时产生的毒副作用。 《科技日报》2013-2-26 一版

第三张“基因变异图谱”与第二代基因组测序技术——评“千人基因组计划”首期研究成果的医学意义世界上任意两个人的基因99%都是相同的，而恰是那1%不同，负责着个体间的表型差异。《自然》杂志近期披露，当人体内携带有250到300基因变异位点的时候，相关基因就就会“沉默”。甚至，一个人只携带了 50到100基因变异位点，就可能患上某种疾病。10年前，“人类基因组计划”这一耗资30亿美元、历时10余年的伟大科学工程完成之际，人们以为得到了揭开自身生命奥秘的天书，生命科学也划时代地进入了“后基因组时代”。如今看来，当时得到的仅仅是人类基因组的“参考图谱”，对于人群里个体间的基因差异，或是更具医学意义的“基因变异图谱”来说，人们知之甚少。第三张“基因变异图谱”为了探寻个体间的基因差异，科学界在2002年启动了HapMap（人类基因组单体型图谱）计划。Hapmap在2005年完成的“第一张基因变异图谱”含有一百万个“单核苷酸多态性”（SNPs）位点；HapMap在2008年完成的“第二张基因变异图谱”含有三百一十万个SNPs位点。而此次“千人基因组”所公布的一期结果——“第三张基因变异图谱”，已经包含了一千五百万个SNPs位点。今年10月28日，《自然》杂志为此刊出的文章题目为“基于群体规模的基因变异图谱”，鲜明的指出，“千人基因组计划”首期研究成果，其最大优势在于：“第三张基因变异图谱”所采用的样本，针对了“大规模人群”。 远超过此前两张“基因变异图谱”所测定的样本数。绘制“第三张基因变异图谱”的所有数据，是基于两个核心家庭，6个个体的精确基因组测序，179个个体的低覆盖率基因组测序，以及七百多人的蛋白编码区的基因测序。检测人群数目庞大，人种涉及中国人、日本人、西欧人等。因此，第三张“人类基因变异图谱”的问世，可以从更深的层次上了解，种族之间、个体之间的基因差异。更具医学意义的是，对于人群中发生频率在１％以上的基因变异，本次研究的覆盖率达到９５％以上。这就意味着：此前Hapmap计划所绘制的两张“基因变异图谱”中，没能涉及的“罕见病”致病基因，可能在“第三张基因变异图谱”中已经被标出。“基因变异图谱”的医学应用随着，“人类基因变异图谱”绘制的日臻完善，和商业化全基因组SNP 分型芯片成本的不断降低，以及新的统计方法和软件的出现, “全基因组关联分析”( Genome-Wide Associat ion Study , GWAS) 越来越多的应用于复杂疾病“易感基因”的确定。今年6月6日，安徽医科大学的张学军教授领衔的团队，通过对中国汉族和维吾尔族人群近2万份样本进行分析，在人类基因组的3个区域内发现与白癜风发病密切相关的4个易感基因。今年8月2日，中***事医学院贺福初院士领衔的蛋白质组学国家重点实验室，通过对大陆5个肝癌高发区的4500多名肝癌病例和对照的研究，发现了肝癌易感基因新区域（1p36.22）今年8月23日，新乡医学院的王立东教授联合国内18家医院，建立了数十万份的食管癌标本资料库，并首次在人类第10号和20号染色体上，发现两个食管癌易感基因(PLCE1和C20orf54)。基因变异有着很强的人种差异，相比国外此领域的研究成果，以上研究成果的临床意义，在于其是针对我国的特有人群。也就是说，以上研究成果在我国的临床上更具医学价值。更为可喜的是，以上研究成果均发表在此领域最为权威的《自然 遗传学》杂志上。我国在利用GWAS需找复杂疾病易感基因领域的研究，已经得到了世界的公认。

现代生物技术，又称生物工程，是利用生物有机体（从微生物直至高等动物）或其组成部分（器官、组织、细胞等）发展新工艺或新产品的一种科学技术体系。 生物工程主要包括基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程和发酵工程等5个部分。以重组DNA为核心的现代生物技术的创立和发展，为生命科学注入了新的活力，它所提供的实验方法和手段极大地促进了传统生物学科如植物学、动物学、遗传学、生理学、生物医学等的发展。同时，生物技术目前也已被广泛地应用于医药、食品、化学、农业及环保等领域，为这些行业带来了一场新的技术革命。现代生物技术的发展仅20余年，但它在生命科学研究和产业化方面已产生了巨大的影响，但这仅仅是个开始，生物技术的发展和应用仍方兴未艾。基因工程即重组DNA技术，是指对不同生物的遗传基因，根据人们的意愿，进行基因的切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型。世界上第一批重组DNA分子诞生于1972年，次年几种不同来源的DNA分子装入载体后被转入到大肠杆菌中表达，标志着基因工程正式登上历史舞台。基因工程彻底改变了传统生物科技的被动状态，使得人们可以克服物种间的遗传障碍，定向培养或创造出自然界所没有的新的生命形态，以满足人类社会的需要。蛋白质工程也称“第二代基因工程”。蛋白质工程主要包括通过基因工程技术了解蛋白质的DNA编码序列、蛋白质的分离纯化、蛋白质的序列分析和结构功能分析、蛋白质结晶和蛋白质的力学分析、蛋白质的DNA突变改造等过程。蛋白质工程为改造蛋白质的结构和功能找到了新途径，推动了蛋白质和酶的研究，为工业和医药用蛋白质（包括酶）的实用化开拓了美妙的前景。细胞是生物体的结构单位和功能单位。细胞工程是利用细胞的全能性，采用组织与细胞培养技术对动、植物进行修饰，为人类提供优良品种和保存濒危珍稀物种。细胞工程主要包括体细胞融合、核移植、细胞器摄取和染色体片段重组等。体细胞融合是指两个不同种类的细胞，加上融合剂，在一定条件下，彼此融合成杂交细胞，使来自两个亲本细胞的基因有可能都被表达，从而打破了远缘生物不能杂交的屏障，提供了创造新物种的可能。细胞核移植对动物优良杂交种的无性繁殖具有重要的意义。克隆技术便是细胞核移植的一个最为典型的应用。细胞器的摄取主要是指叶绿体和线粒体的摄取。如用白化型原生质体摄取正常的叶绿体，进而发育成正常的绿色植物；用抗药型草履虫的线粒体植入其他草履虫细胞，使后者获得抗药性。染色体片段重组是利用染色体替换来改变生物遗传特性，如利用染色体的易位、缺体等方法，获得新的染色体组合。酶是生物体内的一种具有新陈代谢催化剂作用的特殊蛋白质，它们可特定地促成某个反应而自身却不参与反应，并具备反应效率高、反应条件温、反应产物污染小、能耗低以及反应易于控制等优点。酶工程即利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产品。酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，它的应用主要集中于食品工业、轻工业和医药工业等领域。发酵工程是指利用微生物的特定性状，通过现代工程技术，在生物的反应器中生产有用物质的一种技术系统。当前的医用和农用抗生素绝大部分是发酵的产品，此外发酵工程产品还包括氨基酸、工业用酶等，人们日常生活中广泛使用的味精、维生素B2等也是发酵工程的产品。基因工程的操作步骤基因工程一般包括四个方面的基本内容：一是取得符合人们的要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA（质粒和病毒DNA称作载体）；三是把重组DNA引入某种细胞（称为受体细胞）；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。DNA分子很小，其直径只有20埃，约相当于五百万分之一厘米，在它们身上进行“手术”是非常困难的，因此基因工程实际上是一种“超级显微工程”，对DNA的切割、缝合与转运，必须有特殊的工具。首先，要把所需基因——目的基因从供体DNA长链中准确地剪切下来。1968年，沃纳·阿尔伯博士、丹尼尔·内森斯博士和汉密尔·史密斯博士第一次从大肠杆菌中提取出了限制性内切酶能够在DNA上寻找特定的“切点”，认准后将DNA分子的双链交错地切断。人们把这种限制性内切酶称为“分子剪刀”。这种“分子剪刀”可以完整地切下个别基因。自70年代以来，人们已经分离提取了400多种“分子剪刀”，其中许多“分子剪刀”的特定识别切点已被弄清。有了形形色色的“分子剪刀”，人们就可以随心所欲地进行DNA分子长链的切割了。由于限制性内切酶的发现，阿尔伯、史密斯和内森斯共享1978年诺贝尔生理和医学奖。DNA的分子链切开后，还得缝接起来以完成基因的拼接。1976年，科学在5个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶，这种酶可以将两个DNA片段连接起来，修复好DNA链的断裂口。1974年以后，科学界正式肯定了这一发现，并把这种酶叫作DNA连接酶。从此，DNA连接酶就成了名符其实的“缝合”基因的“分子针线”。只要在用同一种“分子剪刀”剪切的两种DNA碎片中加上“分子针线”，就会把两种DNA片段重新连接起来。把“拼接”好的DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种分子小、能自由进出细胞，而且在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。基因的理想运载工具是病毒和噬菌体，病毒不仅在同种生物之间，甚至可以在人和兔培养细菌细胞转移。还有一种理想的载体是质粒。质粒能自由进出细菌细胞，当用“分子剪刀”把它切开，再给它安装上一段外来的DNA片段后，它依然如故地能自我复制。因此，它是一种理想的运载体。有了限制性内切酶、连接酶及运载体，进行基因工程就如可以愿以偿了。把目的基因装在运载体上，运载体将目的基因运到受体细胞是基因工程的最后一步。一般情况下，转化成功率为百万分之一。为此，遗传工程师们创造了低温条件下用氯化钙处理受体细胞和增加重组DNA浓度的办法来提高转化率。采用氯化钙处理后，能增大体细胞的细胞壁透性，从而使杂种DNA分子更容易进入。目的基因的导入过程是肉眼看不到的。因此，要知道导入是否成功，事先应找到特定的标志。例如我们用一种经过改造的抗四环素质粒PSC100作载体，将一种基因移入自身无抗性的大肠杆菌时，如果基因移入后大肠杆菌不能被四环素杀死，就说明转入获得成功了。　　目的基因：所谓目的基因就是我们想要的基因片段，它在生物体内能表达产生所要蛋白产物。生物界的基因有上亿个，多数存在于染色体上，少数存在于细胞质中。取得目的基因的办法是用“分子剪刀”剪切供体DNA分子，把它切成一些比基因略长的片段，然后再从中找出包含所需目的基因的DNA片段。到目前为止，人们用这种方法已分离出40种大肠杆菌蛋白质基因、鸡的组蛋白基因等。另一种获得目的基因的方法是人工合成。随着技术的进步，已有用于自动测定DNA顺序的专门仪器和自动合成DNA仪器。还有一种基因合成方法是模板合成。基因工作指令的传递是按照“DNA-RNA-蛋白质”这一方向进行的，相反的信息传递即由RNA-DNA也存在。基因模板合成法就是先以信使RNA为模板，反向转录出一条DNA单链，再以互补的方式加倍成DNA双链。用这种方法人们已先后合成了家兔、鸭和人的珠蛋白基因、羽毛角蛋白基因等。载体：目的基因片段很难直接转入生物体细胞，而且由于它自身常无DNA复制所需信息，在细胞分裂时不能复制给子细胞，就会丢失，所以人们要把它连在一些能独立于细胞染色体之外复制的DNA片段上，这些DNA片段就叫载体。常用的载体有质粒和病毒。当然载体还有其它作用，如促进目的基因转化、表达等。人们对天然质粒及病毒进行了一系列改造，如加上耐药性基因片段等，提高基因的转化、筛选、表达效率。限制性内切酶： 在细菌内存在的一类能识别并水解外源DNA限制性内切酶，它具有极好的专一性，能识别DNA上的特定位点，将DNA的两条链都切断，形成粘性末端或平末端。DNA经限制性内切酶切割后产生的具有碱基互补单链的末端称为粘性末端。限制性内切酶的生物学功能在于降解外面侵入的DNA而不降解自身细胞的中的DNA，因自身DNA的酶切位点经修饰酶的甲基化修饰而受到保护。限制性内切酶较为稳定，常用的约100多种，并已大多转化为商品。限制性内切酶在分析染色体结构、制作DNA的限制酶图谱、测定较长DNA序列以及基因的分离、基因的体外重组等研究中是不可缺少的重要工具酶。

２０１０年全球生物技术／转基因作物商业化发展态势

今年以来关于转基因技术的争论一直不断。生物技术是国家科技中长期发展规划的重点发展领域，也是战略性新兴产业之一，农业生物技术已在现代农业中广泛采用。自1996年以来，国内外推广转基因作物种植，到2010年整整走过了15年历程。全球商业化种植的转基因农作物面积已超过我国耕地总面积，并且成为近年来世界农业增产的重要手段。虽然转基因作物商业化种植经历了种种争论，走过了风风雨雨，但是从1996年到2010年，转基因作物面积前所未有地增长了87倍，是现代农业历史上采用速度最快的作物技术。 中国2008年启动了《转基因生物新品种培育重大专项》，2009年国务院发布了《关于促进生物产业发展的若干政策》，旨在推动生物技术产业在我国的发展。"十二五"期间，中国将进一步健全生物技术在农业发展中的政策环境与配套设施，培育现代生物农业企业和农业生物产业基地。 由国务院发展研究中心农村经济研究部、中国科学院农业政策研究中心、美国谷物协会北京办事处共同举办的2011年中美农业生物技术研讨会于6月20日在北京举行，来自政府部门、科研院所、行业协会、中美农业生物技术和种业企业的专业人士，就农业生物技术领域普遍关注的问题进行了交流和讨论，分析产业现状和社会经济环境，共同探讨中国农业生物技术产业化发展的道路。本报将研讨会的精彩内容集纳在此，以飨读者。

基因芯片技术对于疾病耐药性检测可从两个方面加以实现：1.在肿瘤中，通过检测肿瘤耐药基因的表达变化来分析对药物的抗性；2.在感染性疾病中，病原体的耐药性检测可通两种方式：表达谱芯片检测药物诱导的表达改变来分析其耐药性；寡核苷酸芯片检测基因组序列的亚型或突变位点从而分析其耐药性。一、多药耐药基因的表达检测肿瘤治疗中对细胞毒素药物的抗性是引起治疗失败的重要原因，是限制化疗的重要因素。机制是复杂的，由肿瘤的综合特征决定，如存活细胞的比例、血液的供给是否充分、特殊的细胞机制及多药耐药表型，多药耐药是指当肿瘤细胞暴露在某一化学治疗药物后会产生对此药及其他结构上没有联系的药物的交叉抗性，可由不同的机制引起，如MDR1、MRP、LRP等基因的过度表达，拓扑异构酶II和谷胱甘肽代谢的改变等，另外，其他促进DNA修复和抑制细胞凋亡的基因表达改变也可能导致多药耐药。检测多药耐药基因表达的变化不但可以研究恶性肿瘤的不同耐药机制，还可以用于临床诊断，以指导制定治疗方案。目前已建立了几种多药耐药检测方法，在RNA水平上有：Northern blot、Slot blot、RT-PCR、Rnase protection assay和原位杂交，从蛋白水平上的检测方法有免疫组化、Western blot及流式细胞仪等。这些方法一次只能对一个基因进行研究，效率低，难以定量检测耐药基因表达增加的幅度。基因表达谱芯片可同时对成千上万的基因表达进行检测，可以大大加速这方面的研究，在设计芯片时，可以将已知肿瘤相关基因及标记基因都点到芯片上，同时，芯片上还包含目前所有报导过的耐药基因。这样可以同时得到肿瘤的各个方面的信息。另外基因芯片还可以帮助发现新的耐药基因。二、病原体耐药性检测细菌对三种以上不同类抗菌药物耐药者即可称为多重耐药菌（multi-drug resistant bacteria, MDR）。MDR感染在全球的状况十分严重，对婴幼儿、免疫缺陷者和老年人的威胁巨大，1992年美国疾病控制中心（CDC）的资料表明，有13300例住院患者，是因为对所使用的抗菌药物耐药，细菌感染得不到控制而死亡。MDR感染已成为治疗上的难点和研究上的热点。MDR大多为条件致病菌，革兰阴性杆菌（GNR）占较大比例，如肠杆菌科中的肺炎杆菌、大肠杆菌、阴沟杆菌、粘质沙雷菌、枸橼酸菌属、志贺菌属、沙门菌属等，以及绿脓杆菌、不动杆菌属、流感杆菌等。革兰阳性菌中有甲氧西林耐药葡萄球菌（MRS），尤以MRSA和MRSE为多；万古霉素耐药肠球菌（VRE），近年来在重症监护室（ICU）中的发病率有明显增高；青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP），常引起肺炎、脑膜炎、菌血症和中耳炎，人结核分支菌等。此外尚有淋球菌、脑膜炎球菌、霍乱弧菌等。耐药性又称抗药性，一般是指病原体的药物反应性降低的一种状态。这是由于长期应用抗菌药，病原体通过产生使药物失活的酶、改变原有代谢过程，而产生的一种使药物效果降低的反应，因而作用的剂量要不断增加。细菌对抗菌药物的耐药机制可有多种，最重要者为灭活酶的产生，如β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等；其次为靶位改变如青霉素结合蛋白（PBPs）的改变等；其他尚有胞膜通透性改变，影响药物的进入；细菌泵出系统增多、增强，以排出已进入细菌内的药物；以及胞膜主动转运减少、建立新代谢途径、增加拮抗药物等，两种以上的机制常可同时启动。耐药菌及MDR的发生和发展是抗菌药物广泛应用，特别是无指征滥用的后果。找到耐药菌的耐药基因，从而根据这些耐药基因设计新型抗生素，或将耐药菌分成不同的亚型，针对不同的亚型在临床上使用相应的抗生素，达到改善治疗效果的目的。国外采用基因芯片技术，检测耐药菌基因的改变，即检测耐药基因。如Michael Wilson就曾使用此方法检测到肺结核杆菌中脂肪酸合成酶II、fbpC、efpA、fadE23、fadE24和ahpC基因发生改变与耐药性有关。提供了新药物作用的靶目标，并指导抑制这些靶目标试剂和药物的合成。在感染性疾病中，病原体的耐药性检测可通过两种方式：1.表达谱芯片检测药物诱导的基因表达改变来分析其耐药性；2.寡核苷酸芯片检测基因组序列的亚型或突变位点从而分析其耐药性。用基因芯片不仅可以同时检测耐药菌的多个耐药基因，还可以同时对多个耐药菌的多个耐药基因进行检测。对临床上用药和新药物的合成均具有指导作用。

一直以来都想把自己在基因克隆方面的心得写出来，让更多的刚刚进入生命科学领域的人受益，因为自己刚开始做克隆时也遇到过各种问题，经过较长时间的总结和实践，我的题组现在的基因克隆都是一次到位的，基本不需要重复做。其实我只是一个只有几十万科研经费的小青椒，不过我对科研非常热爱，我喜欢买实验用的各种酶啊，好用的耗材之类的东东超过我对自己的衣服鞋子的热爱，所以我看起来穿的及其普通，可是我的实验花费有点奢华，呵呵，可能像我这样的人不多吧，哈哈，反正无所谓开心就好。下面言归正传（1）是酶切位点的选择。我的实验室有Takara、Promega以及NEB三种公司的常用的酶，这极大的丰富了我们的选择，所以在设计PCR产物的酶切位点之前首先要看看哪两个酶之间是可以进行同时酶切的。因为这三家公司的双酶切表的组合完全不同，最佳的方案是我们能够按照需要去选择合适的酶。有人说这得花很多钱吧，其实不然，Takara几乎每年9月都有一次促销活动，在他们七折的时候我一下买了三千块钱的酶，这一年来有用之不尽的感觉。Promega的酶也非常好用，而且长期五折，我也是常用的酶买了一批放在实验室里。至于NEB的实在是有一点贵的，我一般不批量买了，在NEB买的一般都是不常用的酶，比如FseI、AscI等等。酶的选择是实验成功的关键吆。（2）PCR引物的设计这一点我不想多说，虽然有很多的攻略里面讲到了PCR引物设计的原则等等，大家设计的时候要参考各种原则，我认为不然，因为做过实验的战友都清楚，有的时候很多PCR引物的选择是没有选择的，比如我要扩增一个完整的基因的ORF框，那么它的起始密码子，终止密码子部分都要克隆出来的，不能多也不能少一个碱基，即使起始部位或者终止部位的AT含量很高，高到你难以忍受，那怎么办呢，基本我们没有选择，如果实在是没办法的条件下，只能在PCR引物的5端加入人为设计的碱基而把引物的扩增部分后移或前移来避开难以扩增的部位，我不知道说清楚没有，如果引物序列OK，可以忽略上句话。所以大多数情况下引物我们是没得选择的，那么我们只能从PCR扩增条件上下功夫。（3）PCR扩增对于PCR扩增其实不同的基因可能策略不同，我来说几点相同的。首先很多新手会忽略引物的浓度问题，我在最开始做PCR的时候因为当时的基因非常容易扩增，所以其实我的条件并不是最佳的，但当时把基因扩出来了我也没有在意，直到有一天我需要在基因的5端加入3个HA标签，这样的PCR引物长度差异很大，一支引物100多bp，一支引物只有30bp，于是当我还有以前的条件时我扩不出任何的基因。当时扩了几次都不成功，各种温度都试过了也不成。于是我静下心来，把PCR的实验条件进行了全方位优化，在PCR反应体系中，把引物调整到各种浓度的，把模板调整到各种浓度的，有的加Mg2+，有的加BSA，还使用梯度PCR的条件，试了各种扩增温度的，结果让我很开心，最后我的基因被扩增出来了，而且好亮好亮的那种。记得当时自己高兴地跳了起来。也许这就是科研的魅力吧！在这次试验中我找到了最佳的PCR条件，这是三年前的事了，这个条件让我在三年中屡试不爽，几十个基因的扩增从未失手过。其实体系很简单，50ul体系中buffer 5ul、Mg2+ 1mM、dNTP 0.2mM、引物每支1ul（配成10umol/L浓度)、PCR酶一般是0.5ul、其余部分用水补平，混匀，离心一下，进行PCR扩增。其中引物从公司拿到干粉后我一般用水溶解至100umol/L浓度保存，吸取少量稀释十倍后用于PCR反应，这个浓度是最佳的。所以PCR体系中引物并不是越多越好，同样的模板的量也很关键，一般我都在10ng-100ng之间，太少或太多都会抑制PCR反应。当然，不同的基因其退火温度差异较大，建议第一次做直接做梯度PCR，设置的温度范围宽些，总会有扩出来的。反正把反应体系加好，把温度控制好应该就万事大吉了，如果这样仍然扩不出来，那就直接调整DNA模版的量吧，其他的因素应该不是原因（当然得保证引物，以及酶的质量得前提下）。（4）PCR产物的酶切，这是最简单的一步，一般我都是酶切过夜的。因为我认为PCR产物切得尽可能的充分对克隆很重要，毕竟保护性碱基只有几个。（5）质粒的酶切。虽然质粒的酶切很简单但是却很讲究，决定着克隆的成败。质粒提取我一般都用试剂盒，天根的很便宜了，现在好像一盒已经六折，一盒有200个，可以用很久。质粒提取完毕后我会用紫外分光光度法对质粒进行定量测定，根据A260的值计算出质粒的量，然后再进行酶切，一般酶切体系60ul，60ul体系中我只切总量1ug的质粒，一次切两管，酶切过夜后切胶回收或者不切胶直接回收，这取决于两个限制性内切酶之间的距离，十几bp以内我就直接回收了，如果偏大就要切胶回收。（6）连接 连接我采用的是Promega公司的T4 DNA连接酶，它的特点是22度连接三小时以上几款，这样我就可以在上午把质粒片段以及PCR片段回收后马上做连接，连接一个白天，到下午可以做转化了，涂板，过夜培养第二天早上看结果。然后挑克隆（一般我一个基因就挑四个克隆足已）培养一白天，下午稍晚些提质粒，然后马上酶切鉴定，一般酶切鉴定体系中我都做20ul体系，酶用0.5微升就够了（呵呵，该省的就省点吧），酶切一个小时跑胶就可以知道克隆是否成功了。这样从PCR到克隆鉴定完毕，一共三天。不过从我带学生的经验来看，从一个懵懵懂懂的新手到成功掌握该技术快则半个月，多则一个月，引人而异。各位也试试看吧！以上为本人在基因克隆方面的一家之言，难免有疏漏或过于肯定之处，感谢各位战友多提宝贵意见，多多交流，以后我会陆续贴出各种技术的实验心得，欢迎大家相互交流！