寡核苷酸

寡核苷酸是一类短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸及核糖核酸），如用于基因扩增和基因诊断的 PCR 引物和反义核酸，介导基因沉默的小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）等，努力研究开发基因靶向治疗药物用于治疗病毒、肿瘤和遗传疾病。天然的寡核苷酸在体内容易降解，稳定性差。通过修饰的寡核苷酸具有较好的药学特性和体内稳定性 [1-2]，但合成的寡核苷酸产物含有各种杂质，需纯化精制，产物的鉴定和产品的质量控制至关重要。液相和液质联用于寡核苷酸目标产物的高分辨分离和鉴定， 可以判断待测寡核苷酸结构的变化，比如脱嘌呤、氧化、磷酸化等。寡核苷酸样品中存在的盐分会影响其离子化过程和造成峰强度降低，因此有必要进行质谱鉴定前的除盐处理。常规离线除盐方法耗时；可以利用在线除盐方式进行寡核苷酸的分离鉴定，但样品通量需要提高，以满足高通量的要求，如平均每天 2000 个样品的需求等。

由亚磷酰胺化学法合成的寡核苷酸通常使用离子对反相液相色谱 (IP-RPLC) 和阴离子交换色谱进行分析和纯化。在 IP-RPLC 分析中，阴离子交换纯化馏分的高含盐量会削弱寡核苷酸参与离子配对的能力。这就需要在 IP-RPLC 分析之前对样品进行脱盐，这一步骤通常使用离心过滤器手动完成。本应用简报展示了高盐浓度溶液中寡核苷酸的直接二维液相色谱分析：在第一维(1D) 中进行在线脱盐，随后在第二维 (2D) 中进行 IP-RPLC 分析。在该设置中，二维液相色谱的使用提高了工作流程速度，同时避免了手动的样品前处理过程。

本文使用生物惰性超高效液相色谱四极杆质谱联用仪LCMS-2050测定反义寡核苷酸分子量。采用DUIS（ESI+APCI）负离子模式对待测样品进行质谱扫描，使用LabSolutions软件对质谱图进行多电荷分析。结果表明，质谱图中含5种多电荷离子，电荷数量为4~8。通过多电荷解卷积分析计算得到该反义寡核苷酸样品分子量为6681.57 Da，与理论值的偏差为0.4 Da，质量准确度高。LCMS-2050具有质量范围宽的特点，适合分子量较大的反义寡核苷酸分子量检测。

以反义寡核苷酸等为代表的核酸药物通过作用于细胞内外的靶点（基因、蛋白等）发挥药效。核酸药物是通过化学合成生产的，但在其合成过程中会引入错误长度的产物以及保护基团等多种杂质，因此，如何正确分离含有杂质的大量寡核苷酸是一大挑战。LC分析中，反相离子对色谱法（RP-IP）是一种分离具有电荷的物质时常用的分离模式。在RP-IP中，分离模式会因为用于流动相的离子对试剂添加浓度以及有机溶剂成分的不同而发生变化，但是，变化的行为取决于寡核苷酸链长、碱基组成和修饰键的有无等，因此，针对每个目标序列分别进行分离优化尤为重要。本文介绍使用分析方法开发辅助软件LabSolutions MD，针对具有不同链长和修饰键的寡核苷酸及相关杂质，分别通过筛选和优化阶段，高效地实现寡核昔酸和相关杂质的最佳分离。

本文建立了简单、快速、高效的液相色谱 - 线性离子阱质谱仪（Vanquish Duo-LTQ XL）在线除盐和检测寡核苷酸分子量的分析方法。该方法一个样品的整个分析周期为 42 秒（包括进样针清洗、进样和质谱数据采集），利用该方法对不同分子量的寡核苷酸样品进行快速除盐分析，测定分子量与理论分子量平均偏差约 100 ppm（表 4）。建立的在线除盐方法快速简便，质谱鉴定准确度高，样品分析周期非常短（42 秒），24h 内可以分析高达 2000 个样品，满足寡核苷酸样品的高通量分析要求。

本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱进行寡核苷酸分子量测定和序列确认的方法。目标寡核苷酸是长度为21mer、进行了2'-O-methyl修饰的RNA类型的寡核苷酸。使用Insight Explore CSD软件中Respect算法进行多电荷解卷积处理，寡核苷酸各同位素峰分离良好，单同位素质量误差0.16 ppm。使用Protein metrics中Oligo模块进行了寡核苷酸序列确认，结果显示目标寡核苷酸序列与设计序列匹配良好。可为寡核苷酸分子量测定和序列确认提供参考。

寡核苷酸是一类短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸及核糖核酸），如用于基因扩增和基因诊断的 PCR 引物和反义核酸，介导基因沉默的小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）等，努力研究开发基因靶向治疗药物用于治疗病毒、肿瘤和遗传疾病。

本文应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪MALDI-8030的负离子模式对合成的寡核苷酸引物探针进行分析。在负离子模式下，三份寡核苷酸样品均成功检测到样品的单电荷离子峰[M-H]-及双电荷离子峰[M-2H]2-，检测结果与理论值相符。本应用案例表明寡核苷酸类样品在MALDI-8030负离子模式下谱图简单易于解析，MALDI-8030是寡核苷酸类样品分子量检测和合成质量控制的有力工具。

手持式拉曼光谱仪可以直接穿透棕色瓶选择性地鉴定寡核苷酸原料（也称为亚磷酰胺）。本应用简报介绍了基于空间位移拉曼光谱 (SORS) 的安捷伦手持式拉曼光谱系统的原理和部署，用于在良好生产规范 (GMP) 环境中对亚磷酰胺进行化学身份验证。

摘要手持式拉曼光谱仪可以直接穿透棕色瓶选择性地鉴定寡核苷酸原料（也称为亚磷酰胺）。本应用简报介绍了基于空间位移拉曼光谱 (SORS) 的安捷伦手持式拉曼光谱系统的原理和部署，用于在良好生产规范 (GMP) 环境中对亚磷酰胺进行化学身份验证.

本篇应用介绍了采用超高效尺寸排阻色谱法在分辨长度相差一个碱基的不同寡核苷酸样品的能力。采用了粒径2微米、12.5 nm孔径的硅基SEC色谱柱TSKgel UP-SW2000，此款色谱柱适用于分离小蛋白、肽和寡核苷酸。该色谱柱也可在UHPLC系统上用来分析寡核苷酸。配合使用东曹的多角度光散射检测器还能获取更多有关寡核苷酸和样品杂质的分子量信息。

寡核苷酸偶联抗体（Antibody Oligonucleotide Conjugates, AOC）是寡核苷酸通过定点或非定点偶联在特定靶向性抗体或抗体片段上的一类偶联抗体药物，类似于抗体偶联药物（Antibody Drug Conjugates, ADC）。AOC通过将单抗和寡核苷酸偶联，同时具有寡核苷酸药物的精准性和抗体大分子的特异性等两大优点，具有重要意义。

本文建立了一种使用离子交换色谱法结合生物惰性液相色谱分离不同序列长度寡核苷酸的分析方法，假定较短序列的寡核苷酸组分为合成过程中可能产生的短序列杂质，并考察了流动相pH变化对分析结果的影响。 岛津生物惰性超高效液相色谱仪“Nexera XS inert”可以出色地抑制含磷酸基团化合物的金属表面吸附，获得优异的峰型、良好的重现性和出色的灵敏度。

合成寡核苷酸是短的DNA或RNA序列，在分子生物学中有不同的应用，例如用于DNA测序和聚合酶链反应(PCR)扩增的引物。近来，合成寡核苷酸也被探索用于治疗和诊断目的，以及在几种条件下基于DNA的诊断试剂盒。

本文使用生物惰性超高效液相色谱仪Nexera XS inert与单四极杆质谱LCMS-2050联用，快速分离反义寡核苷酸（ASO）及其杂质，并测定分子量信息。通过优化流动相，2 min内将ASO主成分及杂质分离，通过多电荷解卷积测定ASO主成分和杂质的分子量，从而推断杂质类型。

由于核酸药物是在生物反应作用机制的上游发挥作用，不良反应相对较少，而被视为治疗多种疾病的有希望的药物，因此利用质谱对核酸分析进行表征是目前备受关注的研究方向。尽管高分辨率及高精度的ESI质谱仪能够对核酸的质量进行准确测定，但使用ESI质谱仪进行常规寡核苷酸序列分析仍依然存在困难。使用经典的ESI-MS/MS技术很难获得完整的内部寡核苷酸序列。另一方面，据报道使用MALDI-TOFMS的In Source decay (ISD)是核酸序列分析的一种有用的方法，尽管该仪器的性能不像ESI质谱仪一样可以对核酸的质量进行准确测定。本文将介绍使用LCMS‐9030（ESI‐QTOF）和MALDI‐8030（配备双极性台式线性MALDI‐TOFMS）进行核酸表征的案例。

亚磷酰胺单体是寡核苷酸药物化学合成的关键物料，对亚磷酰胺单体进行分子量及杂质分析是寡核苷酸药物生产质量控制的重要内容。本文应用台式MALDI-8030分析了16种常见的亚磷酰胺单体，包括8种用于合成DNA的亚磷酰胺单体及8种用于合成RNA的亚磷酰胺单体，可以快速获得样品的精确分子量及杂质组成情况，为寡核苷酸药物化学合成物料的质量控制提供直接依据。

MALDI-TOF质谱技术具有前处理简单、分析速度快、分析质量范围宽、图谱简单易解析等优点，本文介绍了应用岛津台式基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MALDI-8020快速检测寡核苷酸药物的分子量及杂质的案例，该方法除直接测定样品精确分子量外，还可对可能含有的杂质情况进行监测。

本文采用超高效液相色谱和单四极杆质谱LCMS-2050联用仪对寡核苷酸合成用亚磷酰胺单体原料进行定性分析。采用DUIS（ESI+APCI）离子源的正离子模式分析待测样品，通过优化色谱条件和质谱采集参数，使得亚磷酰胺单体色谱峰型良好并有较好的保留，且亚磷酰胺单体结构中磷原子处存在的两种非对映异构体均得到很好的分离。本方法适用于亚磷酰胺单体合成质控分析和原料进厂质控分析，可对其进行分子量确认。

由亚磷酰胺化学法合成的寡核苷酸通常使用离子对反相液相色谱 (IP-RPLC) 和阴离子交换色谱进行分析和纯化。在 IP-RPLC 分析中，阴离子交换纯化馏分的高含盐量会削弱寡核苷酸参与离子配对的能力。这就需要在 IP-RPLC 分析之前对样品进行脱盐，这一步骤通常使用离心过滤器手动完成。本应用简报展示了高盐浓度溶液中寡核苷酸的直接二维液相色谱分析：在第一维( 1 D) 中进行在线脱盐，随后在第二维 ( 2 D) 中进行 IP-RPLC 分析。在该设置中，二维液相色谱的使用提高了工作流程速度，同时避免了手动的样品前处理过程。

本文中为您介绍假定分析siRNA型核酸类药物的原料药，使用三重四极杆质谱仪LCMS-8060分析合成双链寡核苷酸的案例。确认了SIM（Selected ion monitoring）的定量性能。在使用SIM模式绘制标准曲线时，得到了1 fmol～10 pmol范围内的线性。另外，多电荷离子通过解卷积分析确认了分子量。

应用立陶宛Ekspla公司的偏振分辨振动和频光谱测量系统（SFG-VS）对寡核苷酸对层状阳离子脂质双层膜的腹层吸附过程进行了实验研究和理论分析。

生物质谱的技术为寡聚核苷酸的分子质量和序列分析提供了新的途径。之前，基质辅助激光解吸电离飞行质谱（MALDI-TOF）主要用于分子质量比较小的寡聚核苷酸分析，受仪器的灵敏度，分辨率，碱金属离子加合峰的影响，测试的精确度和可靠性都存在一定问题。另外，基于常规的电喷雾离子阱（Ion Trap）质谱的检测，同样受限于分辨率与质量精度，也无法满足高精度、高分辨、高灵敏的寡聚核苷酸的检测分析。LTQ-Orbitrap Elite 组合式质谱仪结合了最新的双压线性离子阱质谱仪和新型高场 Orbitrap TM 质量分析器，可以提供高达240,000 的分辨率（FWHM）、高灵敏度、快速的扫描速度和更大的动态范围，并且可以在同一台质谱上可以同时实现低分辨和高分辨扫描，满足客户的不同需求。该系统可以为寡聚核苷酸的分子质量测定提供准确、快速、可靠的分析测试。

报告了在碳酸胍体系中研究6种5'-单磷酸核苷酸的分离工作，考察了分离条件对分离结果的影响。在最佳条件下，TMP、AMP、CMP、GMP、IMP、UMP等6，种核苷酸的线性范围分别为：5～350、2～300、10～40、5～350、10～4o0和10～4o0 rag／L；其检出限分别为：1、0．5、2、1、2和2 ms／L。初步探讨了胍基与不同核苷酸之间的相互作用及这种作用对毛细管电泳分离的影响。并将实验结果与普通碳酸盐体系作了比较。

核苷酸和β-环糊精（β-CD）及硼酸盐之间存在络合作用，可应用于核苷酸的高效毛细管电泳分离，在10 mmol / Lβ-CD 和20 mmol / L 硼酸盐存在时，实现了8 种单磷酸核苷酸的分离测定；讨论了pH 值、β- CD 浓度、硼酸盐浓度及分离电压对分离和络合作用的影响。

随着寡核苷酸的应用越来越广泛，不少企业相继加入寡核苷酸合成的赛道。想得到优质高纯度的核酸不是一件简单的事，对于不同的寡核苷酸链，应该如何选择合适的纯化方法？

报道了包括5 一肌苷酸(IMP)、5 一鸟苷酸(GMP)和腺苷酸(AMP)3种呈味核苷酸在内的5种5 核苷酸的毛细管区带电泳分离，讨论了pH、缓冲溶液浓度及分离电压对分离的影响。在高pH(9．5)的20mmol碳酸钠一碳酸氢钠缓冲溶液中，5种主要呈味核苷酸及其近似物在10min内实现了基线分离。

本文采用岛津三重四极杆液质LCMS-8050建立了5种核苷酸的测定方法，本方法分析时间短、灵敏度高、重现性好，适用于婴幼儿奶粉中核苷酸的检测。

采用东曹C18柱TSKgel ODS-100V（4.6 mmI.D.X250mm,5 μ m），参照GB 5413.40-2016，对婴幼儿奶粉中的胞嘧啶核苷酸（CMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、次黄嘌呤核苷酸（IMP）、鸟嘌呤核苷酸进行含量测定。实验结果表明，该方法可以满足国标中对核苷酸的分析测定要求。

本应用建立了采用岛津高效液相色谱仪Nexera LC-40测定婴幼儿奶粉中核苷酸的检测方法。该方法灵敏度高、重复性好，满足《GB 5413.40—2016食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》中规定的定量限检测要求，为婴幼儿奶粉中核苷酸含量检测提供参考。