产业聚集

在各个领域，溶液中的蛋白质的绝对表征都是很重要的，也是必须的。例如：在药品和生物技术中，以蛋白质为基础的产品都必须很准确，不存在聚集。多角激光光散射（MALS）是测量溶液中蛋白质分子量的理想方法。这是一种非常灵敏的方法，可以检测到是否有聚集存在，形成了多少聚集体，因为光散射的反应直接正比于被测量样品的重均分子量，是浓度的倍数。

在蛋白质溶液中聚集已被证明有有害的影响。对于较大的聚集体，可以测量这些聚集体，但是在0.150 nm至2微米范围内的较小聚集体具有很难量化。Nicomp动态光散射(DLS)技术可以证明聚集体的存在，但不能提供任何关于聚集体绝对浓度的信息。

人抗角蛋白丝聚集素/丝集蛋白抗体(AFA)检测试剂盒人抗角蛋白丝聚集素/丝集蛋白抗体(AFA)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人抗角蛋白丝聚集素/丝集蛋白抗体(AFA)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人抗角蛋白丝聚集素/丝集蛋白抗体(AFA)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人抗角蛋白丝聚集素/丝集蛋白抗体(AFA)抗原、生物素化的人抗角蛋白丝聚集素/丝集蛋白抗体(AFA)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗角蛋白丝聚集素/丝集蛋白抗体(AFA)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

关键词：生物制药，抗体药物，FDS，聚集物，蛋白质降解产物，MabThera®，Tskgel G3000SWXL，SEC，紫外检测器，蛋白质聚集

基于治疗的蛋白质溶液聚集可能产生有害的免疫原性。对于较大尺寸的团聚体，可以测量这些团聚体，但在0.15至2微米范围内的较小团聚体很难量化。动态光散射(DLS)技术可以证明聚集体的存在，但不能提供任何关于聚集体的绝对浓度的信息。单粒光写传感器技术(SPOS)现在可以测量聚集蛋白的大小和浓度，并成为这一应用的首选技术。

由于聚集体会对药物安全性产生显著影响并且可能引发抗原反应，因此蛋白质聚集是生物治疗药物蛋白质的关键质量属性 [1]。聚集体还可能会降低生物治疗药物的药效并大幅降低生产工艺的经济效益。蛋白质通常在暴露于压力条件下时发生聚集，例如 pH、温度或浓度的变化，因此不同生产阶段均有可能发生聚集。目前人们已经确定选择体积排阻色谱 (SEC) 方法进行聚集体的定量分析。在生物治疗药物开发过程中（例如在克隆选择过程中或在通过严格的“实验设计”法优化发酵条件时）监视聚集体的形成情况，这些过程可能产生大量需要进行体积排阻分析的样品。SEC 常用条件的分析时间往往需要 20 min 甚至更长，这极大限制了对大量样品的分析能力。Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱具有高度优化的粒径和孔径设计，可实现更快速的分离，从而显著减少分析瓶颈问题。本应用简报介绍的技术可提高样品通量而不影响分析的准确性。

药物开发的主要挑战之一是蛋白质聚集——这种现象不仅可能对药物质量产生负面影响，还可能影响药物安全。 在最近的一项研究中，提出的结果可以更深入地了解油水界面上蛋白质吸附和聚集之间的关系。 新的见解可以帮助设计更稳定的治疗配方，而 QSense QCM-D 是帮助解决难题的分析方法之一。

由于聚集体会对药物安全性产生显著影响并且可能引发抗原反应，因此蛋白质聚集是生物治疗药物蛋白质的关键质量属性。聚集体还可能会降低生物治疗药物的药效并大幅降低生产工艺的经济效益。蛋白质通常在暴露于压力条件下时发生聚集，例如pH、温度或浓度的变化，因此不同生产阶段均有可能发生聚集。目前人们已经确定选择体积排阻色谱(SEC) 方法进行聚集体的定量分析。在生物治疗药物开发过程中（例如在克隆选择过程中或在通过严格的“实验设计”法优化发酵条件时）监视聚集体的形成情况，这些过程可能产生大量需要进行体积排阻分析的样品。SEC 常用条件的分析时间往往需要20 min 甚至更长，这极大限制了对大量样品的分析能力。Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱具有高度优化的粒径和孔径设计，可实现更快速的分离，从而显著减少分析瓶颈问题。本应用简报介绍的技术可提高样品通量而不影响分析的准确性。

分子间距是决定有机物质光电性能的关键因素。传统有机发光分子通常以聚集体形式存在或作为单个分子分散在外部基质中。近几十年来，这些分子在发光二极管、激光器和量子技术等多种应用中引起了广泛的研究兴趣。然而，对于这些分子在聚集和分散状态之间的行为特性仍存在认知空白。最新一期Nature 由普渡大学窦乐天团队提出了一种在二维混合钙钛矿超晶格中形成的新型分子聚集相，其分子间距接近平衡距离，並将其命名为类单分子聚集体（SMA）。通过构建二维超晶格，有机发射体被维持在相对接近的位置，惊讶的发现，它们在电子上仍然保持独立，从而实现了接近单分子的光致发光量子产率。此外，钙钛矿超晶格中的发射体呈现出强烈的定向排列和密集堆积，类似于聚集体，这导致了显着的定向发射、增强的辐射复合和高效的激光输出。大量研究集中于有机基团的引入如何提高无机层的发光效率、电荷传输能力和稳定性，这已在高性能钙钛矿电子和光电器件方面取得了重大突破。然而，利用无机子晶格来调控有机分子的分子间相互作用、分子排列和发射特性的研究仍然较为有限。自1990年代末以来，一些研究小组报道了有机半导体-钙钛矿超晶格的形成，并确认发射物种可以是有机染料。然而，可以纳入分层钙钛矿的有机分子发射体系范围相对有限，它们的PLQY通常较低（通常低于10%）。研究团队展示了一种新型分子聚集相_SMA，通过将2D无机子晶格与经过精心设计的有机染料相结合，在接近平衡状态下实现。在这种混合超晶格中，有机发射体的行为与单个分子非常相似，表现为相似的发射波长和寿命，以及接近1的PLQY。理论和实验研究强调了有机发射体骨架二面角在维持这种单分子行为中的关键作用。

蛋白质药物中聚集体的数量、类型和大小对药物的安全性和有效性有很重要的影响。蛋白质聚集体的形成涉及多种机理，包括疏水基团之间的非共价键相互作用以及二硫键的形成等。蛋白质药物中任何一种聚集体的存在都是有害应当避免的，这是因为聚集体可能导致免疫原性反应（小的聚集体）或者可能影响给药（微粒）。不可逆的聚集体对蛋白质药物潜在的影响最大，尤其是在长期储存和运输过程中产生的不可逆聚集体。常用于聚集体分析的方法有高速离心、体积排阻色谱（光散射检测），以及非变性凝胶电泳。中性pH 条件下的非变性凝胶电泳可用于研究蛋白质的构像、自结合或聚集体。SDS-PAGE（SDS 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）也可用于分离聚集体，但该技术非常耗时且不能很好地分离分子量接近的聚集体或潜在杂质。安捷伦2100 生物分析仪和高灵敏度Protein 250 Assay 可以快速分离完整蛋白质、聚集体和低分子量的杂质，如非糖基化的完整单克隆抗体和游离的轻链和重链。这个分析方法具有很高的重现性 (%CV 6%)，并很容易用于开发和生产过程中的质量控制。

检测蛋白质聚集状态对了解生物医药产品的稳定性和功效是至关重要的。当有蛋白质聚集体时，对产品的质量的生物活性和原免疫性两方面有很大的影响。很多聚集体遇到生物样品会按照大小和特性排列（如：可溶的和不可溶的，共价的和非共价的或者可逆的和不可逆的）。蛋白质聚集体的范围跨度很大，从小型的低聚体（纳米级）到包含成百万的单体单元构成的不可溶的微米级的聚集体。在制造过程（细胞培养、提纯、形成）、贮存、分配和产品处理过程中的任何一步都可能产生蛋白质聚集体。它可能是由于各种压力引起的，比如，搅拌、暴露在极端的pH下、温度、离子强度或者各种界面（如，气-液界面）。在高蛋白含量（像单克隆抗体形成的情况）情况下，会出现进一步增加聚集体的可能性。因此，在开发、制造以及药物的后续贮存和描述产物时都必须仔细描述和控制聚集体。同样地，可以通过监测聚集体的状态，修改或者优化生产过程来实现。现在NanoSight提供一种以激光为基础的纳米粒子跟踪分析（NTA）的新系统，它可以使纳米粒子（如蛋白质聚集物）直接在液相中实时地观测到单个的颗粒并且对其计数。此外还可以获得高分辨率的粒度分布图。该技术具有快速、可靠、准确并且成本低，正因为这些特点使之成为现存纳米颗粒分析方法（如DLS（又称电子相关光谱PCS，）或者电子显微镜（EM））的很好的替代或者补足。

预灌封注射器（PFS）中形成的治疗性蛋白质的稳定性可能会因蛋白质分子暴露于硅油-水界面和空气-水界面而受到负面影响。另外，诸如在运输过程中经历的搅动可能增加蛋白质与界面的相互作用的有害作用（即，蛋白质聚集和颗粒形成）。在这项研究中，将含有单克隆抗体或溶菌酶的无表面活性剂的制剂在PFS中孵育，将其暴露于硅油-水界面（硅化的注射器壁），空气-水界面（气泡）和搅拌应力（发生在首尾翻转期间）。使用流动显微镜，在所有条件下都可以检测到颗粒（直径≥ 2 m）。在装有气泡的搅拌式硅化注射器中发现了最高的颗粒浓度。在这种条件下形成的颗粒由硅油滴和聚集的蛋白质以及蛋白质聚集体和硅油的附聚物组成。我们提出了一种在PFS中产生颗粒的界面机制，其中三相（硅油-水-空气）接触线上的毛细作用力从界面上去除了硅油和胶凝的蛋白聚集体，并将其运输到主体中。这种机制解释了硅油-水界面，空气-水界面和搅拌在蛋白质配方中颗粒生成中的协同作用。

采用LaVision公司的显微粒子成像测速系统MITAS对双流体低剪切速率微流控系统中红细胞的聚集和对非牛顿血液粘度的影响进行了实验测量研究

单克隆抗体 (mAbs) 是制药公司广泛生产的重要生物制品。随着 mAbs 在生物过程中的应用不断增加，对其进行详细表征的技术引起制药公司的极大关注。由于蛋白质聚集体影响生物活性，因此是监管机构、学术界和制造商之间激烈讨论的话题之一。亚可见蛋白质聚集体可能暴露出当蛋白质处于稳定形式时可能不存在的表位。可靠地鉴定聚集体的存在对于 mAbs 表征至关重要。聚集体的形成在生产、纯化、制剂和存储过程中受到众多因素的影响。因此，采用快速 QC 方法鉴定蛋白质聚集体的存在极具优势。该方法可用于抗体生产生命周期中的许多阶段（例如克隆筛选），以及在存储过程中对产品进行持续监测。作为检测蛋白质聚集体的分析方法之一，紫外光谱的优势在于它是一种无损方法。此外，该方法所需样品量少，并且仅需极少的样品前处理，样品分析更加简单。本研究的结果表明，使用 Agilent Cary 60 紫外-可见分光光度计可以监测单克隆抗体溶液中聚集体的存在。尽管该方法无法分离不同形式的聚集体，但是在采用 SEC 分离这些聚集体之前，可以将该方法作为一种快速筛选方法来鉴定是否存在聚集体。结果还表明，Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱与 Agilent1260 生物惰性液相色谱系统结合使用，能够在较短的运行时间内实现 mAb 聚集体的高分离度分析。

胶体颗粒处于不断运动的状态，它们每秒相互碰撞数百万次。如果它们之间没有排斥力，碰撞将导致粒子粘在一起，形成双聚物，并迅速发展成三聚物或更大的团聚体。很快，整个悬浮乳液可能会变成一个大的团聚体。另一种情况，聚集体（或称为絮凝体）可能会迅速沉降形成松散的沉积物，从而捕获大量的悬浮介质。

本应用简报介绍了一套完整的聚集体分析工作流程，它能够：• 优化单克隆抗体高性能体积排阻色谱 (SEC) 的流动相条件• 表征包括单体、二聚体和高阶聚集体等物质的聚集特征我们使用安捷伦缓冲液顾问软件自动进行复杂的 SEC 优化实验，实验中充分利用 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色谱系统的功能，在一系列快速液相色谱运行中对各种缓冲液组分进行自动实时混合。Agilent 1260 Infinity Bio-MDS 多检测器套装提供了动态光散射检测功能，能够检测高阶蛋白质聚集体、测定绝对分子量并扩大紫外检测系统的测量范围。

Cary Eclipse 多孔板读数器和 PEPBOPS 染料可组成估算 mAb 聚集体含量的高通量工作流程。该工作流程可对高分子量聚集体进行半定量估算，每个样品只需约 5 秒。相比之下，更常规的测量技术通常需要约 5 分钟之久。本研究使用两种治疗性 mAb（利妥昔单抗和曲妥珠单抗）和抗体标准品 NISTmAb RM 8671 对该工作流程进行测试。结果表明，该工作流程得到的结果与使用体积排阻色谱对相同样品进行正交测量得到的结果之间具有良好的相关性。本研究还表明，PEPBOPS 染料作为荧光探针加入样品中，并不会影响聚集。

如何运用BLS细胞融合仪及胚胎聚集针创建胚胎 注射器内吸入培养基，在35mm组织培养板上微滴（大致直径3mm）点样成若干行（列）。向培养板内小心注入石蜡油使其覆盖整板，注意不要使石蜡油直接倾倒在微滴上。石蜡油很容易越过这些微滴。石蜡油的量要完全覆盖这些微滴。使用配件按照说明操作，制作凹陷。37度，5%CO2条件下孵育培养板几小时，目的是让培养基在液滴内达到平衡。这一步可以在形成凹陷的步骤之前进行。实验前准备好待聚集的细胞，组织或胚胎，不要将它们长时间暴露在室温下或脱离最适培养条件时间过长。通过在组织培养板盖上加入几滴M2培养基和Tyrode’s酸溶液来去除卵透明带。将组织培养板的培养区域表面如此处理后，胚胎将本能的黏附在表面—因此我们需要使用盖。确认所有培养基溶液和酸液都接近室温。将胚胎放置在一滴M2培养基上。取尽可能少的内含10-20个胚胎的培养基，并移到一滴酸液上。重复这个步骤并将胚胎移到新的一滴酸液上。让胚胎在吸头内保持上下移动，观察卵透明带是如何溶解的。迅速将胚胎移入M2培养基。用几滴培养基溶液洗涤并移入刚才制成的凹陷中。胚胎培养条件是聚集产量的一个重要因素，因为胚胎要培养过夜，如果是四倍体胚胎在移入母体前需要培养48小时。在培养的每个细节都必须小心操作控制。这包括温度，大气，培养基，室温操作时间及矿物油质量。

AB BioTechnologies，Inc。位于印第安纳州布卢明顿，是一家私营实验室，提供药品有偿服务。 创始人兼首席执行官Jeff Schwegman博士在配方开发，冻干（冷冻干燥）循环开发和优化，热表征以及注射药物产品开发的教育和培训方面拥有丰富的经验。“我们将冷冻和冷冻干燥等应力条件应用于配方，然后将测量和表征初始解决方案以获得基线，”Schwegman博士说。 “我们添加稳定的辅料，然后我们将其再次冷冻干燥并重新检查样品颗粒，看看我们这么做是否产生什么聚集体。” 蛋白质聚集体很容易被检测到并且它们有可能变性并形成聚集体，因此找到它们是开发过程中的关键步骤。 Schwegman博士需要能够确定客户配方中可能出现的问题的进展。

本文采用岛津生物兼容性液相系统结合尺寸排阻色谱法，开发了一种检测司美格鲁肽注射液制剂中聚集体的方法。优选的流动相条件和SEC色谱柱可以实现司美格鲁肽主成分、聚集体和制剂中抑菌剂的有效分离，分离度均大于2.5 。连续六次进样，司美格鲁肽保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）在0.044% 以内，重复性良好。

mRNA聚集体检测是指使用特定的分析技术来识别、量化并表征mRNA分子在生产或存储过程中可能形成的聚集体。mRNA（信使核糖核酸）是一种单链RNA分子，它携带遗传信息，指导细胞合成特定的蛋白质。在mRNA疫苗或药物的生产过程中，mRNA分子可能会因为多种因素（如温度变化、pH值波动、物理或化学应力等）而形成聚集体。聚集体的存在可能会影响mRNA的稳定性、活性以及最终的疫苗或药物效果。因此，检测mRNA聚集体对于确保产品质量、安全性和有效性至关重要。本应用采用全新推出的Biozen dSEC-7建立了一种分析mRNA聚集体的方法，并评估加热处理对聚集体的影响。通过分子排阻色谱法（SEC-HPLC）研究人员可以更好地理解和控制mRNA聚集体的形成，从而优化mRNA疫苗和药物的生产工艺，提高产品质量。

本文使用岛津LCMS-Q-TOF液质联用系统结合尺寸排阻色谱法，开发了一种定性检测多肽类药物生长抑素中聚集体的方法，使用岛津LabSolutions Insight Explore软件对色谱峰进行解析，并对多电荷结果进行解卷积分析。实验结果显示，该方法可以分离多肽类药物生长抑素的主成分和聚集体，分离出的4个色谱峰分别为生长抑素的四聚体，三聚体，非共价二聚体和共价二聚体。

本文介绍了一种使用小粒径体积排阻色谱柱快速高效地分析抗体类蛋白聚集体的方法。 该方法使用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱，使聚集体峰与单体峰得到良好的分离。考 察了色谱柱粒径和柱长对分离和分析效率的影响。结果表明，缩短色谱柱柱长，在保证 满足分离需求的前提下，可以将分析效率提高至常规方法的 3.5 倍

到目前为止，只有岛津公司可以用一台仪器即Aggregates Sizer对亚可见区域（0.1nm-10μ m）的聚集体进行浓度分析，并且可以实现实时测定，从而可以考察疫苗的聚合过程。

使用了美国怀雅特技术公司的MALS（DAWN HELEOS）与Optilab rEX 检测器以及UV 检测器联，来监测不同流动相中蛋白聚集体的状态。使用这些检测器，可以追踪蛋白随盐浓度和缓冲液条件的改变而发生的变化，这有利于我们更深入了解我们所要研究的蛋白的性质和可预测性

细胞对暴露的纳米颗粒反应在各种环境中都是必不可少的，尤其是在纳米毒性和纳米医学中。这里,14纳米金纳米粒子在3T3成纤维细胞在一系列脉冲追踪实验研究了30分钟孵化脉冲和追逐时间从15分钟到48小时。里面的金纳米粒子及其聚合量化细胞超微结构的激光烧蚀电感耦合等离子体质谱法，可以用于评估表面增强拉曼散射(SERS)信号。通过这种方法，可以分别获得它们在微米尺度上的定位信息和它们的分子纳米环境，并且可以将它们联系起来。因此，纳米颗粒从细胞内摄取、细胞内加工到细胞分裂的路径是可以遵循的。结果表明，细胞内纳米粒子及其积聚和聚集支持高SERS信号的能力与纳米粒子的数量和高局部纳米粒子密度没有直接关系。SERS数据表明，细胞内聚集的几何形状和粒间距离必须在内体成熟过程中发生变化，并对特定的金纳米粒子类型起关键作用，才能成为高效的SERS纳米探针。这一发现得到了TEM图像的支持，它只显示了一小部分具有小颗粒间距的团聚体。经过不同的捕集时间后得到的SERS光谱显示，金纳米粒子内体加工后，其生物分子电晕的组成和/或结构发生了变化。

单克隆抗体是用于治疗各种疾病的一类重要的生物分子。生物仿制药是创新药物分子的复制品，需要详细表征其关键质量属性 (CQA)，例如聚集体和电荷异构体。与创新药物相比，这些属性必须处于一定范围内才可获得监管机构批准。本研究采用基于 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色谱和 Agilent AdvancedBio 色谱柱的两种分析工作流程，对不同制造商生产的两种利妥昔单抗生物仿制药与创新药物的聚集体和电荷异构体图谱进行了比较。结果显示了创新药物与生物仿制药在聚集体和电荷异构体图谱方面的相似性或差异性。生物仿制药 1 与创新药物在聚集体和电荷异构体方面的相似性高于生物仿制药 2。方法表现出优异的日内和日间重现性。Agilent OpenLab CDS 软件的 Peak Explorer 功能使数据审查一目了然。本研究是一系列利妥昔单抗生物相似性研究的一部分。

本文采用岛津生物兼容液相色谱仪Nexera Bio联合多角度光散射检测器测定单抗药物主成分及聚集体分子量，为推断单抗药物聚集体状态提供依据。本实验采用体积排阻色谱对样品进行分离，紫外和多角度光散射检测器进行检测，通过色谱图得知，此曲妥珠单抗药物无聚集体，多角度光散射检测器测得主成分分子量为159,722 Da，与理论值偏差为0.17%。此分子量测定方法操作简便，快速，成本低，可用于单抗药物主成分及聚集体分子量的测定。

本文介绍了使用岛津尺寸排阻色谱柱“Shim-pack™ Bio Diol”，分析mAb和ADC聚集体的案例。使用“Nexera XS inert”系统，该系统对高浓度盐的流动相具有耐腐蚀性，可抑制管道内样品的吸附。

本应用中使用粒径2 um的TSKgel UP-SW2000尺寸排阻色谱柱并配合Tosoh Bioscience的超高灵敏度光散射检测器LenS3使用，可对重组蛋白的绝对分子量及其聚集水平进行精确测量和表征。