盘点氮的测定技术，一个长盛不衰的分析技术
盘点氮的测定技术，一个长盛不衰的分析技术——致敬定氮技术百来年给人类带来的贡献写在格哈特175周年庆典之际 定氮，氮的测定，我们从事生物化学分析者接触到的最基础分析技术之一。定氮，太熟悉了！——我们真的很清晰吗？我们既然熟知定氮分析，怎么又有那么多可以纠结的事情？如：这个结果可信吗？这个仪器好吗？这个标准怎么这样的？… … 让我们一起来盘点一下定氮技术，看看我们是否全都认知无疑吧！内容提纲：（文章篇幅有点长，可以分提纲查看喜欢的内容）l 氮循环——大自然活动的基本循环l 人类对氮的认识，经历了250年，有将近100年氮被认为是无用的东西l 有机化学的发展，引发了人类对生命的研究，氮开始成为生命至关重要的元素l 定氮技术让我们认识了蛋白质，蛋白质的发现锁定了定氮技术l 凯氏定氮法之所以伟大，在于其方法原理清晰无疑，无以比拟l 当今的定氮，凯氏定氮法和杜氏定氮法并驾齐驱，共担参比方法n 现代的凯氏定氮法，终极参比方法n 现代的杜氏定氮仪，3-5分钟完成一个样品的分析，结果精度比凯氏定氮高一个数量级 ============== （本文撰稿人，陈奕，cy@cgerhardt.net，个人文责自负！）氮循环——大自然活动的基本循环 这是大自然活动的基本循环，周而复始，生生不息，一图尽述，搞定氮者不可不知。 人类对氮的认识，经历了250年，有将近100年氮被认为是无用的东西 我们在做定氮，可曾经想过，我们是怎么认识氮的？ 1772年，丹尼尔卢瑟福（Daniel Rutherford，苏格兰化学家），在经过了50年的探究，否定了之前的认识：1722年，他与其老师做了一个实验：在一个密封容器中放进老鼠和蜡烛，一段时间后蜡烛熄灭，老鼠死亡（我们现在都很清楚是怎回事），但容器还有很多气体残留，他用石灰水吸收了已知的一种燃烧后的气体（我们现在都知道是二氧化碳）后还有很多气体。本来这个结果是与“燃素论”很不相符的结果，可他们那时就没有正确认知，一起受“燃素论”错误引导，认定是“燃烧剩余的废气或者有害毒气”。 否定意味着新的认识。卢瑟福重新认定，原来以为的“废气”是空气中一种可以分离的成分，而不是燃烧后的废气。但是，他那时候还不知道是什么气体，只能对其性质做个描述：不能维持动物的生命，既不能被石灰水吸收，又不能被碱吸收，还不支持燃烧，并把这种物质定义为“浊气”。250年前就有这么深奥的研究，我们确实应该纪念，卢瑟福是第一个确定氮这种物质的先辈。 1787年，“近代化学之父”的法国化学家，元素命名发明者，安托万洛朗拉瓦锡（Antoine Laurent de Lavoisier，历史上最伟大化学家之一）首先给“浊气”定义为一种“无活性气体”的元素“氮”，后人重新定义为“硝石素”Nitrogen。 拉瓦锡除了给元素命名，更重要的是提出“质量守恒定律”而开创了定量化学。这里我们特别要提他，还在于他提出的“燃烧氧化学说”。这个学说可是现代化学研究的基础方法，我们第一个定氮技术就是燃烧氧化学说引发而来的。1777年拉瓦锡发现了Oxygen（氧，酸素），继而发现“水”不是元素，是氧元素和另一种“成水素”Hydrogen（氢）所构成，因此有了“通过氧气燃烧的方法形成氧化物，然后再分析氧化物”这样的化学研究方法，并且发现了物质是元素的不同组合转化，其总质量是不变的。他也因而想到：植物是以空气和水为生，动物是以植物或素食动物为生，而每一种生物最后仍把吸收的东西归还尘土。发酵，腐败，以及燃烧，是一切东西归还尘土的过程。生命是循环不已而前进的。 有机化学的发展，引发了人类对生命的研究，氮开始成为生命至关重要的元素 19世纪初，后来被誉为“有机化学之父”的德国化学家尤斯图斯冯李比希（Justus von Liebig，历史上最伟大化学家之一）沿着拉瓦锡（见上）的推断，优化了燃烧实验设备，形成了燃烧法分析的基本设备，研究有机物的燃烧产物。那时侯，大家认为这类物质是碳、氢、氧三种元素组成，而组成比例的不同，物质的性质就不同。拉瓦锡是第一个开展有机物研究的科学家，他用测量燃烧产生的气体的体积，然后通过冷却的水分和吸收了二氧化碳后体积的减少等办法，测定出有机物含有碳氢的比例，并测算出有机物的组成。 因为气体的体积测量很难准确，1831年，李比希根据产生的二氧化碳和水的量能够精确的确定碳和氢的含量，发明了用固体吸附剂吸收燃烧后的水分和二氧化碳，而用重量变化代替气体检测，李比希发明了5联瓶的燃烧装置成了研究有机物成分的基本设备。 人们在应用李比希的燃烧法测定有机物的碳、氢、氧比例时，发现经常有些误差，尤其是存在一些意外的气体，人们因此开始发现有些有机物还含有氮。1833年，法国化学家让-巴蒂斯特安德烈杜马斯（Jean Baptiste André Dumas）在李比希的燃烧装置中加入铜粉烧红以使氮氧化物还原成氮，然后在后面连接了一个集气量筒，量取集气量筒中收集的气体就知道有多少氮气产生，因此建立了世界上首个氮的测定方法——杜马斯燃烧法（杜氏定氮法）。杜马斯定氮法的基本原理，至今没有变化，只是设备化并应用了各种新的处理技术、检测技术来实现，并且发展成为五大有机元素CHONS（碳、氢、氧、氮、硫）的基本分析方法。 大家有没有想到，在杜马斯发明这个定氮方法的时候，人们还没有认识蛋白质。这个时候，人们仅认识几种含氮的有机酸——氨基酸，但已经知道自然界的生物样品中含有氮。经过系列研究，人们发现碳氢比、碳氧比、乃至碳氮比对某些具体的物质其比例基本一定，并与某些物质有很好的相关性，这些发现大大地加快了人们研究生物物质的进度。化学界在之后的近百年间，几乎都是围绕着氮这个元素发展的，人们发现了蛋白质，发现了生命的基本物质，进而发现了生命的遗传物质，进而开始了维持生命生活的营养，定氮技术也就成为了研究生命活动的重要手段。 定氮技术让我们认识了蛋白质，蛋白质的发现锁定了定氮技术 在18世纪，安东尼弗朗索瓦德福克罗伊（Antoine François de Fourcroy）等就从动植物材料中发现了一类独特的生物分子，用酸处理能够使其凝结或絮凝，但还不知道是什么东西。 1820年法国H.布拉孔诺 (H. Braconnot)发现甘氨酸和亮氨酸，这是最初被鉴定为蛋白质成分的氨基酸，以后又陆续发现了其他的氨基酸。 荷兰化学家格利特马尔德（Gerhardus Johannes Mulder）对之前发现的有独特性质的生物物质深入研究。他观察到有生命的东西离开了它就不能生存，那是生物体内一种极重要的高分子有机物，占人体干重的54%。他对其进行元素分析，发现几乎所有的物质都有相同的实验公式。1838年马尔德（Mulder）的合作者，瑞典化学家永斯雅各布贝采利乌斯（Jöns Jakob Berzelius，历史上最伟大化学家之一）用“Protein（蛋白质）”这一名词来描述这类分子。Protein来源于希腊语，是“唯一的最为重要”的意思。这个时候，人们还不知道蛋白质的真谛，但已经发现蛋白质的组成中大约为：碳50%， 氢7%， 氧23%， 氮16%，硫0~3%，其他元素很少，这个比例对于所有蛋白质都基本一致，且都含有NH2这个基团。伟大的化学家李比希是首先认定这类天然物质是由碳氢氧元素组成的，但他当初并不认为那是一类化合物。1814年伟大的化学家贝采利乌斯命名“有机物”时的定义也只是一类来自于生物体的“有生机的物质”，并不认为是自然界的一大类物质。 这个观点是燃烧定氮法发明者杜马斯首先破除的，他是首先提出“基团论”，并形成“结构化学”学科和有机化学学科奠基人。他发现“有机物”并非李比希等所认为的“物质都是矿物元素为基本组成而具有相关元素相关的性质”，而是另外的一类物质，多个元素组成“基团”，而产生完全不同于元素所具有的性质这个“有机物的真谛”，那是有机化学，乃至生物化学的重大发现，他的“反动发现”（他作为一个年轻人挑战李比希等权威专家）和研究，后来都证明是对的。他于1838年给葡萄糖（1747年有分析化学之父德国化学家马格拉夫（Andreas Sigismund Marggraf）所发现）定名，随后有了“氨基酸”，因为该类物质都含有氨基（NH2）——一个有活性的基团。所以我们说李比希是有机化学之父，而杜马斯是有机化学的奠基人，甚至是“有机化学学科的创始人”——法国著名有机化学家查尔斯-阿道夫武尔茨 (Charles-Adolphe Wurtz，有机化学极重要的“武兹反应”的发明者)的评语。 “有一类有机物不仅含有碳、氢、氧，还含有氮，而且是所有生物都具有的活性物质”这样的结果，在化学界、科学界乃至人类史上具有极其重要的意义。因此，荷兰科学家格利特马尔德在1838年发现了蛋白质，他观察到有生命的东西离开了蛋白质就不能生存，蛋白质是生物体内一种极重要的高分子有机物，占人体干重的54%。后来的研究才发现蛋白质主要由氨基酸组成，因氨基酸的组合排列不同而组成各种类型的蛋白质，光人体内估计就有10万种以上的蛋白质，而用于构建蛋白质的氨基酸只有20种（还有2种氨基酸是特定情况才有的）。这个结果也引发了李比希、杜马斯等有机化学科学家为首的大批人对蛋白质含量分析的研究。 杜马斯定氮法（Dumas Nitrogen Method）无疑是最重要的分析手段，但当时燃烧法是极其麻烦和耗时且很难做好的方法。1841年之后的很多年，杜马斯等都在开发化学的方法，他是首先提出把有机物中的氮转变成氨来测定的，但他和其他多个同行试验了很多年，未能找到合适的方法，他们的实验思路基本上是用碱法处理样品，把燃烧后的氧化氮用碱还原成为氨，这是一条非常麻烦的思路，方法上就没有对路。杜马斯等的化学定氮方法探索，包括“Nessler试剂法”、“Biuret法”、“Berthelot法”等蛋白质测定方法的开发，更有后来对非蛋白质氮的研究并产生出“氮转换因子”NCF（Nitrogen Conversion Factor）等，都可能是凯道尔提出“酸消化方法”的前期基础。 奥洛夫哈马斯滕（Olof Hammarsten），著名的瑞典生理生化学家，数十年研究酶和蛋白质的作用，尤其是系统的研究了蛋白质的组成，非蛋白氮和总氮的关系，基本形成了通过蛋白质中氮含量的相对稳定比例，提出了用定氮方法，用NCF的换算，可能测定蛋白质含量的思路，并在1883年，在他的新论文中系统的提出了6.25作为蛋白质的NCF换算系数 [O. Hammarsten,“Zur Frage ob das Casein ein einheitlicher Stoff sei”， Zeitschrift fu ̈r Physiologische Chemie, “酪蛋白是否为单一物质”，生理化学杂志（德国），vol. 7, pp. 227– 273, 1883.]，这给同年凯道尔报告他的定氮方法在啤酒发酵上的蛋白质定量分析，提供了计算依据。把6.25叫做“凯氏定氮系数”其实是我们后人“张冠李戴”。 凯氏定氮法之所以伟大，在于其方法原理清晰无疑，无以比拟 1883年3月7日，嘉士伯啤酒厂的老板，丹麦著名酿酒师雅各布克里斯蒂安雅各布森（Jacob Christian Jacobsen）在丹麦化学学会年度会议上，邀请其引以为荣的嘉士伯基金会实验室化学部主任，约翰古斯塔夫克里斯托弗托尔萨格凯道尔（Johan Gustav Christoffer Thorsager Kjeldahl）博士介绍其在嘉士伯啤酒厂搞的科研成果，利用“酸消化后蒸馏滴定”检测啤酒酿造过程中跟踪发芽期间谷物中蛋白质的变化的技术方法。 同年，这一方法用“测定有机物中氮的新方法”标题发表在德国分析化学杂志《Zeitschrift für Analytische Chemie》[Kjeldahl J. Neue methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern. 1883 22:366–382]，并在嘉士伯实验室的通讯中用法语和丹麦语书写。因为雅各布森非常敬重法国著名的微生物学家路易斯巴斯德（Louis Pasteur，，微生物学鼻祖，巴氏消毒法发明者——首创用于解决啤酒变酸问题的办法），以及他为法国葡萄酒行业所做的贡献，法国人也大量发表了“嘉士伯论文”的摘要。在1883年8月的《化学新闻》上刊登了“凯氏定氮法论文”的扩展摘要[Kjeldahl J. New method for the determination of nitrogen. Chemistry News. 1883 48(1240):101–102]，使得该方法很快被广泛传播。 尽管布莱思（Blyth）曾简要提到过该方法，但给出的凯氏定氮法名称错误地称为Vijeldahl[Blyth AW. A method of determining organic nitrogen in liquids. Analyst. 1884 9(7):115–116]，凯道尔实则在1885年首次在《分析家》[Analyst Ed. On Kjeldahl method for determination of nitrogen. Analyst. 1885 10(6):127–128]和《分析学报》给出了该方法的细节。在极短的时间内，凯氏定氮法在欧洲和美国众多新闻出版物上转载了这一主题。在如此惊人短暂的时间内，没有一种分析方法像这种评价氮的“凯氏定氮法”那样被广泛选用。“凯氏定氮法”造就了凯道尔，一个化学家的名字能够流芳千古并且其方法能够用其名字来冠名已经少见，而能够成为一个动词使用，如“这个样品凯氏一下”、“这个结果是凯氏来的”这样的表述，后来更是成为一门“学科”，凯道尔时代是绝无仅有的。 凯道尔为“凯氏定氮法”专门设计了一个反应容器，称为“凯氏烧瓶”，他从纯粹化学处理的角度出发，采用加热浓硫酸消煮样品直至样品澄清，此时样品中的蛋白质被消煮为留在硫酸中的硫酸铵，而碳被消煮为二氧化碳、氢和氧被消煮为水，后两者都变成气体跑掉，可能含有的硫、磷等其他元素不是变成可溶物就是气化掉，然后硫酸铵就被“凯氏定氮装置”加上苛性钠变为碱性环境，硫酸铵就变成氨（气），很容易就被加热用的蒸汽“蒸馏”带出来，氨和水蒸汽形成氨水是碱性，用一个定量的酸（硫酸溶液）就可以收集，再检测酸溶液残余的浓度（用准确的碱来滴定），就可以计算出含氮量。 这样的方法原理及其清晰无疑，所有搞化学的人一看就明白，而且清楚如何操作。人们发现原来用杜马斯等的定氮方法极难操作的定氮方法（大家都清楚用氮的转化因子NCF=6.25折算就可以获得蛋白质含量），自己在实验室就可以完成。世界顿时沸腾。 凯道尔本人并没有在凯氏定氮法上做深入的研究，他的兴趣是酿造化学，所以后来的“凯氏化学”可以说与凯道尔没有关系。 因为凯道尔的方法还很原始，工作效率很低，最长的消化时间可能达到两周时间（消化“焦煤”样品），蒸馏滴定需要两种标准溶液的操作，和现代的方法先比较，还是费时繁琐，但原理清晰，方法可靠，随后数十年，科学界（不仅仅是化学界，物理学界、仪器界等都加入）把凯氏定氮法变成一门“学科”——凯氏化学，并盛行至今不衰，“凯氏粗蛋白含量”也成为不二的参比方法结果。随着现代仪器科技的发展，古老的凯氏定氮法“脱胎换骨”成为当今近乎“傻瓜式”的定氮方法，一般样品基本一个多小时（批量样品5分钟左右）就可以获得确切的结果，越来越受青睐。定氮技术毫无疑问，是人类化学史乃至生物科学史最伟大的技术方法。 当今的定氮，凯氏定氮法和杜氏定氮法并驾齐驱，共担参比方法 分析方法属于专业技术，和我们这样的科普性内容有点相悖，因此这里尽量不讲述得太专业和太细致。如果需要深入了解，我这里欢迎大家随时随地的联系我，或者中国格哈特仪器公司，这是一家拥有175年历史的德国分公司并具有40年本地服务经验，格哈特见证了凯氏定氮技术发展的全过程，参与了凯氏定氮技术发展的全过程，同时拥有最顶级凯氏定氮分析仪器和杜氏定氮分析仪器，相信能解决目前社会上遇到的所有相关定氮的问题。如果大家对技术概要都没有兴趣了解，这一段内容其实是可以不费精神的。 现代的凯氏定氮法，终极参比方法： 现代的凯氏定氮方法：样品+浓硫酸+凯氏催化剂，400度1小时加热消化，可以全自动完成；蒸馏分析采用硼酸做吸收液，仅需一种标准溶液，5分钟分析，可以有标定好的标准溶液，全自动分析，符合GLP要求。最高级的方法近乎“傻瓜式”，“自动化”的仪器技术方案已有40多年，科技的发展带来的先进性无容置疑。 凯氏定氮，也早已变成万用的定氮方法，不仅是测定蛋白质，所有需要定氮分析的样品，全都可以按凯氏定氮的法定标准方法。如果任何其它直接或者间接的定氮分析方法有任何争议，最终以“直接法测定”的凯氏定氮为仲裁。近140年的凯氏定氮发展，NCF（氮的转换因子）也变成了“凯氏因子”，在精细测定蛋白质含量是还可以有多种和凯氏定氮相对应的NCF（需要明示），获得更加精准的蛋白质评价。所有的分析过程产生的废气废物都可以有合理简单的处理防范措施，仪器设备技术越来越精准、可靠，最精准的仪器技术已经可以很精确的测定精准到0.05mgN的水平（一般要求达到0.1mgN以下）。仪器维护技术和服务方案更可以做到“给您一个无忧无虑实验家园”的水平，服务质量可以做到7x24小时在线、视频指导、微信服务等及时到位的本地服务质量… … 现代的凯氏定氮仪，已经没有多少原理技术可以改良，毕竟那是100多年已经定型无疑的原理和技术方案。所以如果有谁告诉你他的定氮仪技术多先进，能够做得更好，那一定是不懂凯氏定氮的技术。凯氏定氮方法，不管是最简单的纯手动纯手工搭建的定氮装置，抑或是最高级的最专业的系统，所得到的结果必须都是一样准确，一样稳定，一样的好，那才叫合格的做凯氏定氮，这一点我希望能够获得大家的共鸣。当然，一分钱可能就有一分价值，可一定不是在结果的准确性和精确性上（那不可能差异太大），最多就是稍微稳定、重现性好点，例如能够控制到0.05mgN的检测精度（凯氏法综合测定已经不可能低于这样的检测限，除非是直接测定标准品并且是不做消化过程的。这个只要懂得凯氏定氮的方法原理，就必须懂得这个道理！），检测误差或者重现性低到0.5%相对误差（这个也是直接标准品测试的结果），正常化学分析的有机样品是基本不能保证低于这样的误差的，因为那是全过程的操作基本误差，化学分析技术告诉我们，不高于1%的误差（普通含量的样品）那是合理的操作误差，凯氏定氮因为有人工操作的部分，非常专业的水平和非常专注的操作，才能控制在低至0.5%的操作误差这个层面。但作为凯氏定氮的样品分析，是绝对不可能保证到0.5%的误差水平的，也没有必要，只要不高于1%的水平就可以。如果确实需要更高的检测误差，那就应该采用检测精度高一个数量级以上，大部分都是仪器自己完成的杜马斯燃烧法定氮，而不要对凯氏定氮做这种无知的要求。 那现在的凯氏定氮，有什么技术上的差别？严格来说就两个方面：一是持续稳定性，二是操控便利性，当然可以有一些细微的技术应用，但对价值不会有太大影响。这个方面要论述可能太长篇，也不适宜，这里只是给大家分享一点常识性知识。l 持续稳定性是现代仪器品质、档次的基本表现，其实就是仪器硬件综合性能的表现。调试好的仪器，都必须是精准的，但能够持续稳定较长久的保持精准，那就是技术、品质的保障，这些方面千万
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