碱性磷酸酶

请问新购买的碱性磷酸酶怎么稀释？ 需要特殊的缓冲吗？

我在用磷酸苯二钠测定土壤碱性磷酸酶时，配制的磷酸苯二钠（用硼酸缓冲液配制）溶液，在暗处放置了将近五天后出现了一些絮状物，请问下，磷酸苯二钠是不是现配现用啊？万分感谢！

[b][font='微软雅黑','sans-serif'][color=#FF6600]实验原理[/color][/font][/b][font='微软雅黑','sans-serif']碱性磷酸酶（alkaline phosphatase EC 3.1.3.1简称为ALPase）广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中，ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关，参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用最适PH在碱性区域，一般在PH9.0~10.5范围内。Mg[sup]2+[/sup]对该酶的活力有显著的激活使用。[/font][font='微软雅黑','sans-serif']为了获得好的提取效果，在酶的制备过程，特别应注意以下几点：[/font][font='微软雅黑','sans-serif']（1）[/font][font='微软雅黑','sans-serif']选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。[/font][font='微软雅黑','sans-serif']（2）[/font][font='微软雅黑','sans-serif']用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是最常用的盐。操作时，要注意保持缓冲液的合适PH值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细，需缓慢加入并及时搅拌溶解，尽量防止泡沫形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀，要静置20min以上，以使沉淀完全，然后方可时行离心分离。[/font][font='微软雅黑','sans-serif']（3）[/font][font='微软雅黑','sans-serif']有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。应注意在低温下操作，缓慢加入，充分搅拌，避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后，最好立即将其溶于适量缓冲液中，以避免酶活力的丧失。[/font][font='微软雅黑','sans-serif']（4）[/font][font='微软雅黑','sans-serif']在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步聚才有效。[/font][align=left][font='微软雅黑','sans-serif'] [/font][font='微软雅黑','sans-serif']酶活力的分析：通常是以对—硝基苯磷酸二纳（pNPP)为底物，在PH10.1的碳酸盐缓冲液（含2mmol/L Mg[sup]2+[/sup]）的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯（ pNP）在405 nm处有最大的吸收峰，可以根据OD[sub]4[/sub][sub]〇5[/sub]值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg[sup]2+[/sup]的测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。 [/font][/align]

各位好，今天做了土壤酸性和碱性磷酸酶的标准曲线，采用的苯磷酸二钠的方法。结果反应液的颜色没什么变化，而且吸光度值没有趋势。请问这是什么情况。请大家帮助分析一下！救命的啊

我在用磷酸苯二钠测定土壤碱性磷酸酶时，配制的磷酸苯二钠（用硼酸缓冲液配制）溶液，在暗处放置了将近五天后出现了一些絮状物，请问下，磷酸苯二钠是不是现配现用啊？万分感谢！

[color=#333333]磷酸酶对乳制品的质量有何影响[/color]

前一段时间做实验，感觉买的化学试剂可能不纯，但又不知道该如何检测纯度，甚至不知道该如何向供应商反应这一现象。具体的情况是这样的：配制用于检测血清中碱性磷酸酶的试剂，检测方法如下：对硝基苯磷酸酯在碱性磷酸酶的作用下分解成对硝基苯（405nm特异吸收），通过监测对硝基苯的生成速度，来确定样本中碱性磷酸酶的含量。以前很多批次配制的碱性磷酸酶检测试剂在405nm的吸收都比较低（0.28左右），这次吸光度高了（0.34）左右，我怀疑是对硝基苯磷酸酯不纯有一小部分分解成对硝基苯了，但是我不知道该如何检测这种化学试剂的纯度，请各位大侠支支招。

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酸性磷酸酶0.25U/ul怎么配，购买的袋子上写的是0.5-3.0U/mg

测定转化，过氧化氢，脲，磷酸酶的方法和微生物Ｃ／Ｎ的测定方法！cyh010＠.com

请哪位大能帮下载一下：乳及乳制品. 碱性磷酸酶活性的测定. 第1部分: 乳和乳基饮料的荧光分析法(ISO 11816-1-2013)

【作者】：张丽丽 阙瑞琦 徐榕敏 唐云明 【题名】： 鸭肝碱性磷酸酶的分离纯化及其部分性质研究【期刊】：西南大学学报（自然科学版）【年、卷、期、起止页码】： 2007 29(10)

第五章 基因工程 5.1 基因工程的四大要素及其实施要点1.工具酶1)限制性内切酶2)连接酶3)修饰酶4)DNA聚合酶：A. DNA聚合酶I；B. Klenow fragmentC. T4 or T7 DNA polymeraseD. Taq DNA polymeraseE. RT: 依赖RNA的 DNA polymerase5)依赖于DNA的RNA聚合酶6)T4噬菌体多核苷酸激酶TK：磷酸化7)碱性磷酸酶:脱磷酸细菌碱性磷酸酶(B. Alkaline Phosphatase)小牛肠碱性磷酸酶(Calf intestinal Phosphatase) 2.目的基因的分离方法及其用途 分离方法基因分离的物理化学方法鸟枪法cDNA文库的建立与基因的分离直接从特定的mRNA中分离基因基因组文库的建立和基因的分离从蛋白质入手分离编码此蛋白的基因基因的化学合成利用PCR or RT-PCR分离基因 用途研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构，功能及其调控与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策研究生物种系进化与相关同源性应用某种基因的大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽改良某些目的基因，以改良品种建立基因疗法。选用某种正常基因，引入患者体内，治疗某些先天性遗传疾病。 3.基因工程载体一、定义二、载体具备3 的条件：三、载体的种类：质粒载体细菌用的表达载体λ载体粘粒载体M13噬菌体载体真核细胞用载体人工染色体（YAC，8 BAC，9 PAC，10 MAC） 4.受体细胞和重组基因的导入[si

化学反应过程中的能量以光的形式释放出来，成为化学发光，有些生物体在能量代谢的过程中通过消耗ATP也可发光，为生物发光。化学发光 常用物质包括二氧乙烷衍生物、鲁米诺及衍生物、和丫啶酯。这些试剂可用于各种标本分析、HPLC检测和流动注射分析系统。二氧乙烷衍生物在碱性磷酸酶的作用下水解，形成一种高能量的中间体，这种中间体进一步分解后释放出光子，此类有代表性的物质是AMPPD和CSPD。此方法最为广泛的应用是基于碱性磷酸酶和β半乳糖苷酶的分析系统。碱性磷酸酶（AP）的测定 检测AP，β-葡糖苷酸酶活性的方法是使用一种有商品供应的稳定的1，2-二氧乙烷衍生物，这种发光底物的发光时间为数分钟至数小时。发光强度直接与酶的浓度相关。这种底物可用于1) 微孔板的免疫分析，DNA 探针捕获法和报告基因分析法, 2) 用于蛋白质和核酸分析的96-孔斑点膜。鲁米诺 是一种最古老的和最常用的试剂，在碱性条件下可被过氧化物氧化，同时发光，鲁米诺和过氧化物之间的氧化还原反应需要催化剂，这种催化剂一般为多价金属离子、过氧化物酶如铁、辣根过氧化物酶等，此种方法常用于检测过氧化物、重金属、过氧化物酶的含量，以及由此衍生的检测自由基、进行毒物分析和基于过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的分析方法。丫啶酯及衍生物 在碱性条件下可产生瞬时发光，将其作为标记物，已广泛用于免疫分析和分子杂交。

[size=5]我在做实验时的一些资料是科研老师给的，我是测土壤碱性磷酸酶的，用磷酸苯二钠测的，在做标准曲线时，加的缓冲液的量跟测样品时加的缓冲液的量不一样，而且差的挺多的（曲线加5毫升，样品加0.25毫升），这对实验有影响吗？而且我做的曲线，显色不是很明显，我感觉就是加缓冲液的量太大了。有谁可以帮帮我，非常谢谢！[/size]

生化检测仪器在医药上主要用来检测人体生化指标，如　1.肝功类 　　GPT/ALT(谷丙转氨酶) ALP(碱性磷酸酶) Alb(白蛋白) 　　GOT/AST(谷草转氨酶) T-Bil(总胆红素) CHE (胆碱脂酶) 　　TTT (麝香草酚浊度) D-Bil(直接胆红素) FB(纤维蛋白原) 　　NH3 (血氨) TP(总蛋白) 　　2.肾功离子 　　BUN(尿素氮) K(血清钾) Na(血清钠) 　　Cr(肌酐) Fe(血清铁) Ca(血清钙) 　　UA(尿酸) Mg(血清镁) Cl(血清氯) 　　CO2-Cp(二氧化碳结合力) Zn(血清锌) P(血清磷) 　　血糖血脂 T-CHO(总胆固醇) HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇) 　　TG(甘油三脂) LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇) 　　GLU(血糖) 　　心肌酶谱 　　CK(肌酸激酶) 　　LDH(乳酸脱氢酶) 　　GOT(谷草转氨酶) 等

用的磷酸苯二钠法，里面所用的26二溴醌氯亚胺试剂，大家都用的哪里的？进口的还是国产的？进口的视乎很贵啊，有没有国产的？在哪里可以买到啊？？各位帮帮忙了啊？？

机构名称：卫生部临床检验中心 联系人：王治国地址： 东单大华路1号卫生部 电话：58115054邮编：100730 电子邮箱：zgwang@nccl.org.cn 序号 计划名称 测试/测量项目 项目是否获 PTP认可 对应CNAS-AL06的领域代码 对应CNAS-AL07的PT子领域 (见注) 测试/测量/校准方法 报名时间 实施时间 备注 1 常规化学钠、钾、氯、磷、铁、镁、总钙、总蛋白、白蛋白、葡萄糖、肌酐、尿素氮、尿酸、总胆红素、直接胆红素、总胆固醇、甘油三酯、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、肌酸激酶、γ-谷氨酰基转移酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶、锂、铜、锌、碱性磷酸酶、a-羟丁酸脱氢酶、总铁结合力 是 0720.20、0720.01、0720.02 常规测量 2016年7月-11月 2017年1月-12月 2 干化学钠、钾、氯、磷、铁、镁、总钙、总蛋白、白蛋白、葡萄糖、肌酐、尿素氮、尿酸、总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、肌酸激酶、γ-谷氨酰基转移酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶、锂、铜、锌、碱性磷酸酶、a-羟丁酸脱氢酶、总铁结合力 是 0720.20、0720.01、0720.02 常规测量 2016年7月-11月 2017年1月-12月 3 脂类分析高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、脂蛋白a、载脂蛋白A1、载脂蛋白B 是 0720.01 常规测量 2016年7月-11月 2017年1月-12月 4 内分泌游离T3、总T3、游离T4、总T4、TSH、皮质醇、雌二醇、FSH、LH、孕酮、催乳素、睾酮、C-肽、叶酸、胰岛素、维生素B12、25-羟维生素D2、25-羟维生素D3、总维生素D 是 0720.09、0720.15、0720.22 常规测量 2016年7月-11月 2017年1月-12月 5 心肌标志物肌酸激酶-MB（CK-MB)、肌红蛋白、肌钙蛋白I、肌酐蛋白T、超敏CRP、同型半胱氨酸（Hcy) 是 0720.19 常规测量 2016年7月-11月 2017年1月-12月 6 特殊蛋白IgA、IgE、IgG、IgM、C3、C4、CRP、RF、ASO、转铁蛋白、前白蛋白 是 0720.01、0720.02、0720.03、0720.05、0720.07 常规测量 2016年7月-11月 2017年1月-12月 7 肿瘤标志物总PSA、CEA、AFP、HCG、CA199、CA125、CA153、β2-微球蛋白、铁蛋白、总β-HCG亚单位、游离PSA 是 0720.21、0720.26 常规测量 2016年7月-11月 2017年1月-12月 8 脑钠肽/N末端前脑钠肽脑钠肽、N末端前脑钠肽 是 0720.19 常规测量 2016年7月-11月 2017年1月-12月 [/t

生化仪是根据光电比色原理来测量体液中某种特定化学成分的仪器。由于其测量速度快、准确性高、消耗试剂量小，现已在各级医院、防疫 站、计划生育服务站得到广泛使用。配合使用可大大提高常规生化检验的效率及收益。 生化仪具有技术领先的光路反应系统，精确的试剂样品采集系统 ，高效无忧的自动冲洗系统，智能灵敏的液位探测系统，简易快捷的软件操作系统，及时周到的全国服务网络等特点。 生化仪常用检测项目有肝功：谷丙转氨酶（ALT/GPT）、谷草转氨酶（AST/GOT）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（T.BIL）、直接胆红素（D.BIL）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB） 肾功：尿素氮（BUN）、肌酐（Cre）、二氧化碳结合力（CO2）、尿酸（UA） 血脂：总胆固醇（CHO）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C） 血糖：葡萄糖（GLU） 心肌酶：肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、a-羟丁酸脱氢酶（a-HBDH）、谷氨酰转肽酶（r-GT） 离子：钙（Ca）、磷（P）、镁（Mg）、钾（K）、钠（Na）、氯（CL）等。

基因芯片实验操作流程包括样本DNA或RNA制备、标记、杂交及洗涤等步骤http://img1.jiansuo.net/trademd/upload/asset/meeting/2010/12/02/1291289644.JPG 基因芯片实验操作流程图 1、样本DNA或RNA制备 芯片实验中核酸的抽提没有特殊之处，参照常规的分子生物学实验手册就可以。但对于RNA样本，由于RNA的稳定性很差，在活体内的半衰期也很短，因此取材一定要新鲜，取材后迅速保存在液氮中，在整个处理过程中要非常小心，以免降解，影响实验成功率或结果的可靠性。 2、核酸标记方式 分子生物学常用的标记方法有同位素标记和非同位素标记方法，常用的同位素有33 P、32 P、125 I及3 H等化学发光标记和荧光标记，非同位素标记方法又分为化学发光法和荧光法。常用的化学发光物质有碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，它们能催化相应的底物产生有颜色的沉淀物；生物素和地高辛是最常用的非同位素标记物。很多荧光染料、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶可直接同抗地高辛抗体及亲和素偶联。而目前常用的荧光染料种类有德克萨斯红(Texasred)、荧光系、罗丹明、Cy3、Cy5等。生物芯片中的标记方法普遍采用荧光方法，很少采用化学发光法和同位素标记方法。 核酸样本通常采用酶反应法进行标记，蛋白质样本采用化学方法或抗体―抗原间接标记的方式。核酸中常用的酶反应方法有：反转录法、随机引物法、切口平移(nicktranslation)、PCR、体外转录等。在酶反应过程中掺人带荧光的dNTP，从而标记新合成的核酸分子。如果酶反应中需要引物，如PCR、随机引物法和反转录法，也可以将荧光基团通过化学反应加到引物的末端。 3、样品标记方法 样本标记方法很多，这里仅举几种常用的方法。 (1) RNA标记方法：对于表达谱基因芯片和RNA不同剪切体的研究，是针对RNA样本进行标记。最常见的标记方式是用Cy3或Cy5荧光，通过反转录标记法，选择不同激发波长的荧光标记不同的样本。如Cy3或Cy5标记的dNTP，通过酶反应掺人到待测样品中，便可以在一张片子上同时检测两份标本的信息，做到平行性比较，数据更可靠。另外，由于反转录法所需RNA样本量大，一般需要20fig的总RNA。对于微量的组织样本很难制备足够的RNA，这时可以采用RNA线性扩增方法，最普遍采用的RNA扩增方法是RNA体外线性扩增方法。 (2) DNA样本的标记方法：当对样本进行CGH分析、SNP、分子分型或甲基化研究时，主要选用DNA作为样本。对于CGH，可以进行全基因组标记，通常采用随机引物标记方法。这种方法需要的DNA量大，一般在2pg以上的基因组DNA。虽然有人发明了全基因组DNA的线性扩增技术以减少对样本量的需求，但效果上都不很理想，很难真正做到全基因组及完全的线性扩增。对于SNP研究，可以采用类似CGH的标记方式进行全基因组标记。由于SNP检测的是DNA的“质”，而不像表达谱或CGH质检测核酸的“量”，因此不必要考虑标记时DNA的线性关系，可以采用其他的全基因组的扩增方法。但由于杂交条件的限制，一般难以做到真正意义上的高通量。因此，一般只是选择少数目的基因的少数SNP位点进行研究，可以采用多重PCR标记方法标记目的片段代替全基因组标记。甲基化研究有两种方案，一种采用SNP的检测原理，另一种类似CGH的方法。

多聚磷酸盐嫩化法多聚磷酸盐包括焦磷酸、偏磷酸和三聚磷酸盐。1950年开始应用于肉食品 加工中，嫩化方法是将多聚磷酸盐配成腌制液用于腌制或注入肉中，然后进行滚揉。一般添加量为0.125%-0.375%，不超过0.5%。其作用机理：提高肉的pH值，鳌合金属离子，增加蛋白质静电斥力，增加肌球蛋白的溶解性，使肌动球蛋白发生解离，提高盐溶性蛋白的数量。钙盐注射嫩化法有试验表明，肌肉韧性强、嫩度差的家禽肉，在宰后立即于鸡胸肌注入浓度为0.15mol的氯化钙溶液，12小时后，其剪切力值比对照值(注入等量KC1)明显降低，嫩度得到明显提高，为肉嫩化提供了一个新的途径。其机理是：高浓度的钙渗透肌细胞中，激活CANP酶及碱性磷酸酶，促进糖酵解，加速溶酶体破裂，组织蛋白释出，共同促进了嫩度的提高。盐酸半胱酸嫩化法盐酸半胱酸可使酶分子活性基团-SH打下，改变结构，激活解胱酶系统，释放出活性蛋白质，水解聚合的胶原蛋白的肽结构、结缔组织中弹性蛋白质也有部分水解。碳酸盐嫩化法所用碳酸盐包括碳酸钠、碳酸氢钠，嫩化方法是将碳酸盐配成液体(1%-2%)，将一些原料如粗老干硬动物性原料浸入其中。碳酸盐溶液一般呈碱性，对蛋白质有一定腐蚀作用，可破坏肉类的组织结构，促使结构发生改变，从一定程度提高了肉类嫩度，但同时对营养也有一定的损失。 ??

生化分析仪的常用检测方法具体来说有一下3种： 终点法：通过检测终点吸光度的改变大小来求出被测物含量。通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值，求其平均值，根据两点的差值来判断反应终点。常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。 固定时间法：指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算，称为固定时间法（fixed-time essay）。苦味酸法测定肌酐采用此法。 连续监测法：连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（ΔA/min）计算结果。对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。

（一）外源ＤＮＡ片段未的性质带有各种未的外源ＤＮＡ的克隆方法见下表：────────────────────────────────────────────外源ＤＮＡ片段所带未端 　　克隆的要求 　说明───────────────────────────────────────────平端 　　　要求高浓度的ＤＮＡ和连接酶1)非重组体克隆的背景可能较高　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2)质粒和外源DNA拼命处的限制酶切位点消失　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　3)重组质粒会带人外源DNA的串联拷贝用两种限制酶消化后　 需纯化 　1)质粒与外源DNA拼命处的限制酶切位点常可保留不同的突出端2)非重组体克隆的背景较低质粒体以尽量提高连接效率3)外源DNA只以一个方向插入到重组质粒中相同的突出端 线状质粒DNA常用磷酸酶处理1)质粒与外源DNA接合处的限制酶切位点常可保留2)外源DNA会以两个方向插入3)重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝──────────────────────────────────────────── １．带有非互补突出端的片段　　用两种不同的限制酶进行消化可以产生带有非互补突出端的片段，刀就是最容蜴 克隆的片段。常用的大多数质粒载体均带有由几个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点。由于现有的多克隆位点如此多样，因而几乎总是能找到一种带有与外ＤＮＡ片段未匹配的限制切位点的载体。于是，采用所谓的定向克隆即可将外源ＤＮＡ片段插入到载体当中。例如：载体pUC19用BamHl和Hind－Ⅲ进行消化，然后，通过凝胶电泳或大小排阻凝胶层析纯化载体大片段，以使同芤下来的多克隆位点 缺小片段分开。于是，这一载体就可以同有与BamHl和ＨindⅢ所切出未端相匹配的粘端的外源ＤＮＡ区段相连接。用得到的环状重级体化大肠杆菌，检查氨苄青霉素抗性。由于HindⅢ和BomHI的突出端不互补，载体片段不能有效地环化，所以转化大肠杆菌的效率也极低。因此，大多数具有氨苄表霉素抗性的细菌都含有带外源ＤＮＡ区段的质业，外源ＤＮＡ区段成为连接HindⅢ和BamHI位点的桥梁。当然，可以根据特定的外源ＤＮＡ区段来改变限制酶的组合方式。　　如要制备定向克隆载体，它尽量避免使用大多克隆位点上彼此直接相邻的限制酶切位点。这些位点中的一个被切开以后，第二个位点应位于线状ＤＮＡ分子一端的几个碱基对之内，这样过于靠近末端，不利于多种限制酶的有效切割。正因为如此，所以务必检查两种限制酶对载体的消化是否完全。可采用以下两种检查方法： １）用两种限制酶中的一种对载体进行消化，当所用限制酶的最挞缓冲液对离子强度的要求有不同时，应使用所要求的盐浓度较低的酶。消化完后，应通过凝胶电泳对一小份ＤＮＡ进行检查。如所有质粒ＤＮＡ均从环状转变为线状分子时，适当调整盐浓度，并加入第二种酶。同时，另行设立一个预实验，其中含有环状质粒ＤＮＡ，并只加两种限制酶中的第二种。当预实验中的所有ＤＮＡ都转变为线状（由凝胶电泳确定）时，通过凝胶电泳或尺坟排阻凝胶层析纯化质粒ＤＮＡ大片段。\par ２）图1.7所示的是检查消化反应完全程度的一种更为严格的方法。对用第一个限制酶切割的一小份ＤＮＡ进行末端标记，经离尽柱层析法纯化后，与未标记的线状ＤＮＡ混合。然后用第二个酶消化，完全消化可使ＤＮＡ小片段释放，它应带有50％的放射性活度，这可通过层析或通过凝胶电泳和放射自显影加以检测。２。带有相同末端（平端或粘端）的片段 　　带有相同末端（平端或粘端）的外源ＤＮＡ片段必须克隆到具有匹配末端的线状质粒载体中。在连接反应中，外源ＤＮＡ和质粒都可能发生环化，也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个ＤＮＡ的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平（见本节三）．此外，常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制质粒ＤＮＡ的自身连接和环化。在体外连接反应中，仅当一个核苷酸含5’磷酸基团而另一个含3’羟基时，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶可催化相邻核苷间形成磷酸二酯健。用细菌碱性磷酸酶(BAP)或牛小肠碱性磷酸酶(CIP)去除线状ＤＮＡ两端的5’磷酸可以最大限度的地减少质粒ＤＮＡ区段可有效地与去磷酸化质粒ＤＮＡ相连接，产生一个含有两个切口的开环分子（图1.8）。因为环状ＤＮＡ（即使是带切口的环状ＤＮＡ）的转化效率比线状ＤＮＡ高得多，所以大多数转化体都含有重组质粒。３．带有平端的片段　　外源ＤＮＡ片段带平端时，还有一桩切外生枝的麻烦事，这就是蛱端的连接效率比起带有突出互袜末端的ＤＮＡ要低得多。因此，涉及平端分子的连接反应所要求的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的浓度和外源及质粒ＤＮＡ的浓度都要高得多。还要说明的是，加入低浓度的如聚乙二醇一类的物质，常可提高这类反应的效率。 （二） 质粒载体和外源ＤＮＡ中限制酶切位点的性质　　如今，质粒载体中限制酶切位点的种类极为繁多，因而通常都有可能找到某种带限制酶切位点恰恰与外源ＤＮＡ片段本身毫无二致的载体。这就具备一个不可比拟的优点，也应是可以用相应的限制酶消化重组质粒崦回收外源ＤＮＡ。另一种方案，则是把片段插入到载体中能产生匹配末端的任何位点中。例如，识别不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ产生具有相同突出末端的限制酶切片段，这样用BglⅡ消化而制备的外源ＤＮＡ片段可以克隆到用BanHl消化的质粒中。这通常会使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制备载体的任何一种酶所切开。然而很多清况下，用切点位于多克隆序列侧翼的限制酶进行消化，可将片段从重组质粒中摘出。偶尔在质粒的以及外源ＤＮＡ两端的限制酶切位点之间，不可能找到“门当户对”的搭配关系。这时可用下面两种方案加以解决：１）在线状质粒末端和（或）外源ＤＮＡ片段的末端接上合成在接头或衔接头。２）在得到控制的反应条件下，用大肠杆菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分补平带3’凹端的ＤＮＡ片段。如第九章所讨论，这样常可以使那些不相匹配的限制酶切位点转变为互补末端，从而促进载体和外源ＤＮＡ的连接。因为部分补平反应消除了同一分子两端彼此配对的能力，故连接反应过程中环化和自身寡聚化的机会也会有所降低（Hung和Wensink''1984;Zabarovsky和Allikmets''1986）。

化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) ,是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。化学发光免疫分析仪包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。简介化学发光免疫分析仪包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。 　　化学发光免疫分析仪器中核心探测器件为光电倍增管（PMT），由单光子检测并传输至放大器，并加高压电流放大，放大器将模拟电流转化为数字电流，数字电流将发光信号由R232数据线传输给电脑并加以计算，得出临床结果。 分类化学发光标记免疫分析法　　化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) ,是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物——acridin ium ester (A E) ,是有效的发光标记物 , 其通过起动发光试剂(N aOH2H2O 2 ) 作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成,为快速的闪烁发光(见图1)。吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法 ,大分子抗原则采用夹心法 , 非特异性结合少, 本底低; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。 发光酶免疫分析法　　从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析( chem ilum inescen t enzym e imm unoassay,CL E IA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂,操作步骤与酶免分析完全相同: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物,在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) ,它们有各自的发光底物。 发光试剂　　HRP 标记的CLEIA常用的底物为鲁米诺(32氨基邻苯二甲酰肼,lum ino l) ,或其衍生物如异鲁米诺(42氨基邻苯二甲酰肼) , 是一类重要的发光试剂。其结构如图4 所示。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行,在过氧化物酶及活性氧存在下,生成激发态中间体, 当其回到基态时发光, 其波长为425nm。 　　早期用鲁米诺直接标记抗原(或抗体) ,但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体, 进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物, 在过氧化物酶和起动发光试剂(NaOH2H2O 2) 作用下, 鲁米诺发光, 发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。Kodak Am erliteTM半自动分析系统就是利用这一体系专门设计的。 增强发光酶　　增强发光酶免疫分析(enhanced luminescence enzyme immunoassay, ELEIA )在发光系统中加入增强发光剂, 如对2碘苯酚等, 以增强发光信号,并在较长时间内保持稳定, 便于重复测量, 从而提高分析灵敏度和准确性。在全自动分析仪上, 还可通过计算机严密控制, 进行自动操作, 如加试剂,混合, 温育, 洗涤, 加发光试剂, 发光计数, 数据处理, 绘制标准曲线, 直至完成病人血清样品的分析并打印出结果。Am erliteTM发光增强酶免分析系统用荧光素、噻唑等增强剂, 其发光时间可持续长达20m in, 试剂盒有甲状腺功能检测的 　　促甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素, 与性激素有关的有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睾酮, 以及其他方面的如癌胚抗原、铁蛋白、地高辛等。 　　ALP标记的CLEIA所用底物为环1, 22二氧乙烷衍生物, 这是一类很有前途的发光底物 ,用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团——金刚烷基, 其分子中发光基团为芳香基团和酶作用的基团,在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。最常使用的底物是AM PPD , 中文名为: 32(2’2螺金刚烷) 242甲氧基242(3’2 磷酰氧基) 2苯基21, 22环二氧乙烷)。在碱性磷酸酶(AL P) 作用下,磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基, 得到一个中等稳定的中间体AM PD (半寿期为2～ 30m in) ,此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子, 当其回到基态时产生470nm 的光,可持续几十分钟。AM PPD 为磷酸酯酶的直接化学发光底物,可用来检测碱性磷酸酯酶或酶和抗体、核酸探针及其它配基的结合物。可检测到碱性磷酸酯酶的浓度为10- 15mol/L 。

[font=宋体][size=3]我用磷酸苯二钠比色法想测土壤磷酸酶的活性，具体应该怎么做，我查了些文章，都没有很具体的操作。我是刚刚接触酶活性这一块，感觉一头雾水。非常感谢[/size][/font]

【序号】1【题目】盐度影响真鲷幼鱼消化酶活力的研究【作者】 陈品健； 王重刚； 郑森林；【杂志】厦门大学学报(自然科学版) , JOURNAL OF XIAMEN UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE), 【年期】1998年05期 【链接】http://www.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=cjfq&dbname=cjfq1998&filename=xdzk805.024&uid=&p=【序号】2【题目】不同盐度对弓斑东方鲀消化酶活性的影响(英文)【作者】严美姣； 吴旭；【杂志】动物营养学报 ,Chinese Journal of AnimalNutrition, 【年期】2010年03期 【链接】http://www.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=cjfq&dbname=cjfq2010&filename=dwyx201003046&uid=&p=【序号】3【题目】盐度对大麻哈鱼幼鱼消化酶及碱性磷酸酶活力的影响【作者】支兵杰； 刘伟； 赵春刚； 段莹莹；【杂志】上海海洋大学学报 ,Journal of Shanghai OceanUniversity, 【年期】2009年03期 【链接】http://www.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=cjfq&dbname=cjfq2009&filename=ssdb200903006&uid=&p=【序号】4【题目】卵形鲳鲹消化酶活性的研究[/

1. 实验类型ELISA试剂盒有多种类型，不过它们都有一个共同特点，就是进行抗原捕获。一般捕获形式包括将抗原吸附到微孔板或者用微孔板上的抗体进行捕获。In-cell ELISA和酶联免疫斑点ELISPOT是两种特殊的类型，In-cell ELISA需要将微孔板中培养的细胞进行固定和通透化，然后再用抗体原位检测。ELISPOT有点像蛋白印迹Western blot，先在带膜的微孔板中培养细胞，然后在膜上检测细胞分泌的抗原形成斑点。此外，我们还需要根据自身需要选择96孔板或是384孔板进行ELISA实验。2. 抗体类型单克隆抗体和多克隆抗体都能够用于ELISA，实际上有时候二者结合效果更好。例如，对于双抗夹心法而言，用多抗进行捕获而单抗进行检测有时更有帮助。多抗能够确保捕获所有抗原，随后单抗再特异性检测拥有特定抗原表位的抗原。3. 交叉反应如果抗体间发生冲突或交叉反应就会影响整个实验的特异性。其中抗体来源所带来的兼容性就是交叉反应的一个因素。尽管现在购买源自指定动物的抗体越来越容易，我们仍有必要确认一下是否会产生交叉反应的问题。在用双抗夹心法进行ELISA检测时，检测用的二抗必须特异性针对检测一抗，而不能与捕获抗体起反应。如果检测用二抗与捕获抗体结合，实验特异性就会大打折扣。通常我们选用源自不同宿主的捕获抗体和检测一抗，来避免上述问题。4. 检测方式如今检测ELISA有许多途径，我们可以根据自己的喜好进行选择。一般ELISA检测的是酶促反应的可溶性产物，抗体上结合有相应的酶（例如通常使用的辣根过氧化物酶HRP），而反应体系中添加有相应的底物。这种酶促反应生成具有特征性的颜色，可以通过分光光度计进行检测，碱性磷酸酶AP也是一种常用酶。酶可以结合在一抗上，也可以结合在二抗上，还可以使用链霉亲和素标记的酶与亲和素标记的一抗结合。此外ELISA的结果检测还包括放射性检测、荧光检测、化学发光或显色法检测等。

吖啶酯以及相关化合物通过简单的加入氢氧化钠以及过氧化氢就可以使吖啶酯标记的抗原或抗体发光，这种抗原或抗体采用一种活性标记物[2',6'-dimethyl-4'-(N-succinimidyloxycarbonyl) phenyl 10-methylacridinium-9-carboxylate]来获得。发光过程非常短暂，只是快速的一闪，持续时间小于5s。这么短暂的发光过程给反应的起始与测量带来了一定的限制(Weeks et al．1983，Law et al．1989)。通常是将试剂直接注入放在光度计暗仓内光探测器前面的试管内来检测发光。吖啶酯以及氨甲酰吖啶类似物[acridinium-9-(N-sulronyl) carboxamide](Kinkel et al．1989，Mattingly 1991)是用于免疫分析的主要化学发光标记物(可从Assay Designs lnc，Athens，GA；Behringwerke AG，Marburg，Germany；Ciba Coming Diagnostics，Medfield，MA以及Molecular Light Technology Research Ltd，Cardiff，UK等处获得)。这类标记的检测的最小量为~0.5attomol(0.5X10-18mol)。基于杂交保护的非分离DNA探针分析(nonseparation DNA probe assay)方法已被设计出来(Arnold et al．1989)。这种类型的分析无需将结合与未结合的标记物分开，因而分析可方便的一步完成。这种杂交保护分析利用已与互补DNA杂交的吖啶酯标记探针与溶液中游离探针之间水解速率相差百万倍的特性，在pH7.6的硼酸缓冲液中破坏游离探针的化学发光特性，从而使水解后的化学发光仅仅来源于已杂交的标记探针(可从Gen-Probe，San Diego，CA获得)。 鲁米诺及其类似物鲁米诺(Luminol)是第一个用于免疫学分析标记的化学发光化合物(Schroeder et al．1978)。在合适的催化剂(辣根过氧化物酶、微过氧化物酶(microperoxidase)、铁氰化物)存在的情况下，通过加入氧化剂(如：过氧化氢)可导致发光。然而，通过鲁米诺的5-氨基进行标记会使发光量减少10倍。异鲁米诺，一种鲁米诺6氨基异构体，其发光效率较鲁米诺低(量子产额0.1％)，但当通过第6位进行标记时可使发光量增加10倍。因而，这种化合物以及其氨基取代类似物，比如ABEI(N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol)，已在免疫分析应用中成为最受欢迎的标记物(Kohen et al．1979；Pazzagli et al．1982)。吡啶哒嗪(Pyridopyridazines)代表另一类化学发光化合物。早期的数据显示这些化合物，尤其是8-氨基-5-氯-7-苯基和8-羟基-7苯基衍生物，可作为检测过氧化物酶标记的标记和协同底物(co-substrates)。与鲁米诺相比，这类化合物具有很强的化学发光特性(约为50倍)(Masuya et al．1992)。 碱性磷酸酶磷酸金刚烷基1,2-二氧杂环丁烷(如：AMPPD；disodium 3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2'-tricyclo[3.3.13,7]decan]-4-yl)-phenylphosphate)以及5-位取代类似物(如：5-choro：CSPD；可从Tropix Inc获得)已成为碱性磷酸酶标记的最为广泛使用的化学发光底物(Bronstein et al．1989，1990，1991；Schaap et al．1989)。这种酶的检测极限是1 zeptomole(10-21摩尔)并且其发光持续时间超长(1h)，因而特别适合与基于膜的分析。这个反应的发光强度可被尼龙膜表面以及特定的多聚物增强，如：聚氯苄(苄基二甲基铵)乙烯(polyvinylbenzyl(benzyldimethylammonium)chloride)。对尼龙膜来说，这种增强作用是用于其疏水性基团对去磷酸化的反应中间体的螯合作用；从而稳定和减少中间体的非发光性降解。碱性磷酸酶标记的化学发光分析目前被广泛地用于印迹试验以及DNA序列测定(Beck and Koster 1990，Tizard et al．1990)。 beta-半乳糖苷酶AMPGD(Adamantyl 1,2-dioxetane aryl galactoside)做为这种酶的底物现已越来越流行。这种酶从芳香环的第3位裂解半乳糖苷基团产生一种苯氧化物中间体，这种中间体的降解可导致发光。对这种酶采用这种分析方法的检测极限为30zeptomol。 辣根过氧化物酶鲁米诺以及其他环状二酰基酰肼(cyclic diacylhydrazides)化合物是辣根过氧化物酶的化学发光协同底物。采用鲁米诺、过氧化氢，以及一种增效剂(如：4-碘苯酚或4-羟基肉桂酸)，辣根过氧化物酶的碱性同工酶可被检测出的最小量96h)。 葡萄糖氧化酶目前已经发展了几种用于葡萄糖氧化酶的法学发光分析。异鲁米诺或鲁米诺在微过氧化物酶催化剂存在的情况下可用于分析葡萄糖氧化酶与葡萄糖反应所产生的过氧化物(Sekiya et al．1991)；另一种方法是采用化学发光荧光基团致敏的bis(2,4,6-trichlorophenyl)oxalate反应来检测(Arakawa et al．1982)。 商业试剂、试剂盒及光度计对于可获得的化学发光试剂和试剂盒以及用于发光测定的光度计的全面的评述已有发表(请参见Stanley 1992，1993)。一系列关于化学发光在基础及应用领域的当前进展的资料汇编也同样可以得到(请参见Kricka and Stanley 1992，Kricka et al．1993，Wilkinson 1998)。化学发光可采用一系列的检测设备来进行检测，包括光电倍增管(采用光子计数或灵敏度较低的光子流模式(photon current mode))、硅光电二级管、CCD照相(Wick 1989)摄影或胶片摄影(Kricka and Thorpe 1986)。CCD照相由于是检测二维光源(如膜以及96孔微板)的方便且灵敏的方法而被广泛使用。除此以外，它还能容易的监测发光动力学、可通过图像增强以及背景减影来改善结果质量。

哪位高手有土壤尿酶，磷酸酶，蛋白酶，天门冬酰胺酶的具体测定方法，小女万分感谢！[em09509]

化学发光反应参与的免疫测定分为以下几种类型： 　　（一）化学发光酶免疫测定 　　化学发光酶免疫测定（CLEIA）是采用化学发光剂作为酶反应底物的酶标记免疫测定。经过酶和发光两级放大，具有很高的灵敏度。以过氧化物酶为标记酶、以鲁米诺为发光底物、并加入发光增强剂以提高敏感度和发光稳定性。应用的标记酶也可以为碱性磷酸酶，发光底物为dioxetane磷酸酯，固相载体为磁性微粒贵州学|习网搜集整理。 　　（二）化学发光免疫测定 　　化学发光免疫测定（CLIA），是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。吖啶酯是较为理想的发光底物，在碱性环境中即可被过氧化氢氧化而发光。 　　用作标记的化学发光剂应符合以下几个条件： 　　1.能参与化学发光反应。 　　2.与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂。 　　3.偶联后仍保留高的量子效应和反应动力。 　　4.应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性。 　　鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是常用的标记发光剂。 　　（三）微粒子化学发光免疫分析 　　该免疫分析技术有两种方法：一是小分子抗原物质的测定采用竞争法；二是大分子的抗原物质测定采用双抗体夹心法。该仪器所用固相磁粉颗粒极微小，其直径仅1.0%26mu;m，这样大大增加了包被表面积，增加抗原或抗体的吸附量，使反应速度加快，也使清洗和分离更简便。其反应基本过程：（1）竞争反应：用过量包被磁颗粒的抗体，与待测的抗原和定量的标记吖啶酯抗原同时加入反应杯温育，其免疫反应的结合形式有两种，一是标记抗原与抗体结合成复合物；二是测定抗原与抗体的结合形式。（2）双抗体夹心法：标记抗体与被测抗原同时与包被抗体结合成一种反应形式，即包被抗体-测定抗原-发光抗体的复合物。 　　（四）电化学发光免疫测定 　　电化学发光免疫测定（ECLI）是一种在电极表面由电化学引发的特异性发光反应，包括电化学和化学发光两个部分。分析中应用的标记物为电化学发光的底物三联吡啶钌或其衍生N-羟基琥珀酰胺（NHS）酯，可通过化学反应与抗体或不同化学结构抗原分子结合，制成标记的抗体或抗原。ECLL的测定模式与ELISA相似。其基本原理是发光底物二价的三联吡啶钉及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧化的三丙胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌，随即释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子而常保持底物浓度的恒定。