动物源成分

随着人们生活水平的不断提高，食品安全变得尤为重要。对于肉制品中动物源性的检测成为现在的一个新的领域。往往会看到刷羊肉中掺杂鸭肉、牛肉干其实用的是貂肉等新闻。目前这项检测技术并没有完全普及实验室，今天和大家一起探讨一下运用PCR技术测定动物源成分（即动物源成分鉴定）。[img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09512.gif[/img]好多肉肉，不知道吃的是什么肉。[align=center][img=,400,300]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707130909_01_2362238_3.png[/img][/align][align=center][b] 一、实验室场地要求[/b][/align]PCR实验室的场地明显区分于化学检测。对于实验室要求符合《GB/T 19495.2-2004 转基因产品检测实验室技术要求》，要具备样品制备区、核酸提取区、扩增区和检测区四大功能区，并且对于各个工作区域的压力有一定的要求。我公司拥有完整的PCR实验室（如图），我们的方法开发也在这里进行的。[img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09502.gif[/img]请叫我摄影师！下面图片都是我拍出来的。[align=center]PCR检测室[/align][align=center][img=,690,517]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707130912_01_2362238_3.png[/img] [/align][align=center]准备室[/align][align=center][img=,690,517]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707130912_02_2362238_3.png[/img] [/align][align=center]提取室[/align][align=center][img=,690,517]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707130912_03_2362238_3.png[/img] [/align][align=center]扩增室[/align][align=center][img=,690,517]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707130912_04_2362238_3.png[/img] [/align][align=center]检测室[/align][align=center][img=,690,517]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707130912_05_2362238_3.png[/img] [/align][align=center][b]二、实验仪器设备[/b][/align]1.荧光定量PCR测定仪（博日 FQD-96A）2.普通PCR测定仪（博日 NPA-32）3.核酸测定仪（Thermo Narodrop）4.凝胶成像仪（勤翔 1850）5.粉碎机6.液氮及研磨装置7.恒温水浴锅8.[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]9.电泳[align=center][b]三、试剂和耗材[/b][/align]1.动物基因组DNA抽提试剂盒2.无水乙醇3 .10×PCR反应液4 .dNTP5 .Taq酶6.引物7 .纯狗肉（阳性对照）、其他非狗肉相近动物源，如貂（阴性对照）8 .1.5mL离心管、枪头、PCR反应管[align=center][b][b]四、实验方法[/b][/b][/align][b]（1）样品DNA的提取[/b]a、将约30mg的新鲜动物组织在液氮中充分研磨成粉末，并转移至1.5mL的离心管中。b、加入200μL 缓冲液GA，震荡至沉底悬浮，加入20μL Proteinase K，溶液混匀后，56℃放置直至组织溶解，期间混合样品2~3次。c、加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液变清亮后，简短离心，去除管盖内壁的水珠。d、加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，简短离心，去除管盖内壁的水珠。e、将上一步所得溶液加入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。f、向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。g、向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。h、重复操作步骤g。i、将吸附柱CB3放回离心管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。j、将吸附柱CB3转入新的1.5mL离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~200μL的洗脱缓冲液TE，室温放置2~5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存。[b]（2） 定性PCR检测[/b]a、配制反应体系[table][tr][td][align=center]试剂名称[/align][/td][td][align=center]体积(μL)[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]10×PCR反应缓冲液[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]dNTP[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]上游引物[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]下游引物[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]Taq酶[/align][/td][td][align=center]0.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]模板[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]水[/align][/td][td][align=center]36.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]总计[/align][/td][td][align=center]50[/align][/td][/tr][/table]b、反应程序[table][tr][td][align=center]变性[/align][/td][td][align=center]扩增[/align][/td][td][align=center]循环次数[/align][/td][td][align=center]最后延伸[/align][/td][/tr][tr][td=1,3][align=center]94℃ 3min[/align][/td][td][align=center]94℃ 30S[/align][/td][td=1,3][align=center]35[/align][/td][td=1,3][align=center]72℃ 5min[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]58℃ 45S[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]72℃ 45S[/align][/td][/tr][/table]c、反应对照设置阳性对照：用纯狗肉所提的DNA作为模板阴性对照：用非狗肉，如貂肉等所提DNA作为模板空白对照：用配制反应体系的实验用水代替模板[b]（3）凝胶电泳检测PCR产物[/b]a、称取1g琼脂糖，加入50mL TBE缓冲液，微波加热溶解。b、稍冷却后，加入5μL 4s Red Plus核酸染色，倒入制胶板，放置凝固。c、取5μL所提DNA和1μL 6×Loading Buffer混匀，加到点样孔中。d、100V电泳10min，然后将电压调至110V，电泳35min。e、凝胶成像观察电泳结果。[b]（4） 限制性内切酶酶切及产物电泳检测[/b]如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应a、 反应体系[table][tr][td][align=center]试剂名称[/align][/td][td][align=center]体积(μL)[/align][/td][/tr][tr][td][align=left]酶切缓冲液[/align][/td][td][align=left]2[/align][/td][/tr][tr][td][align=left] Hph I酶[/align][/td][td][align=left]2[/align][/td][/tr][tr][td] PCR扩增产物[/td][td]16[/td][/tr][tr][td][align=left]总计[/align][/td][td][align=left]20[/align][/td][/tr][/table]b、 反应条件37℃ 20min[b]（5）结果分析与判定[/b]a、酶切后有目的基因条带，且阳性对照、阴性对照和空白对照均正确，可根据结果判定被检样品中含有狗源性成分。b、酶切后不含有目的基因条带，且阳性对照、阴性对照和空白对照均正确，可根据结果判定被检样品中不含有狗源性成分。c、如阳性对照、阴性对照、空白对照有一项不符合判定标准，则应重新试验。终于写完了，请大家多多支持！谢谢[img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09506.gif[/img][b] [/b]

SB/T 10923-2012 肉及肉制品中动物源性成分的测定 实时荧光PCR法扩项报告[img=,690,514]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121354131339_2537_2166779_3.jpg!w690x514.jpg[/img][img=,690,278]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121354227259_115_2166779_3.png!w690x278.jpg[/img][img=,690,520]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121358160319_3798_2166779_3.png!w690x520.jpg[/img][img=,690,260]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121358296319_9317_2166779_3.png!w690x260.jpg[/img][img=,690,579]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121358379319_2077_2166779_3.png!w690x579.jpg[/img][img=,690,206]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121358476389_5015_2166779_3.png!w690x206.jpg[/img][img=,690,347]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121358558709_5282_2166779_3.png!w690x347.jpg[/img][img=,690,318]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121359016279_347_2166779_3.png!w690x318.jpg[/img][img=,690,373]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121359084229_628_2166779_3.png!w690x373.jpg[/img][img=,690,378]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121359247099_4235_2166779_3.png!w690x378.jpg[/img]

随着现代化市场经济的迅猛发展,人们的生活条件得到了改善，对动物源性食品的需求也越来越多，其安全问题也随之越来越重要,其中，氯霉素残留是较为突出的因素之一。那么，氯霉素是什么？其在动物源性食品中的现状又是怎样的呢？动物源性食品 动物源性食品是指来源于动物，可供人类食用的动物产品，包括肉、脂肪、脏器、血液、蛋、奶等。随着国民经济的发展，我国城乡居民的生活水平和健康消费观念的提高，动物源性食品在我国居民食品结构中占有比例越来越大，需求量不断增大，拉动了畜牧业的快速发展。然而，近几年发生的“瘦肉精”“掺假羊肉”“病死猪肉”“三鹿婴幼儿奶粉”等事件使消费者谈“肉”色变，动物源性食品的安全状况已成为当今广受关注的社会话题。氯霉素http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508251507_562769_2984502_3.jpg 氯霉素为白色针状或微带黄绿色的针状、长片状结晶或结晶性粉末，味苦，易溶于甲醇、乙醇、丙酮，微溶于水，干燥时稳定。氯霉素的化学结构含有对硝基苯基、丙二醇与二氯乙酰胺三个部分， 因其分子中含有一个不游离的氯，故命名氯霉素，其抗菌活性主要与丙二醇有关。 氯霉素是由委内瑞拉链丝菌产生的一种抑菌性广谱抗生素，它通过与核糖体的50s亚单位结合而抑制细菌蛋白质的合成。对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抑制作用，对立克次体、衣原体也有抑制作用。因其高效廉价，曾在畜牧业中广为应用。然而由于其对造血系统有严重的不良反应，且细菌对氯霉素有发展缓慢的耐药性，所以对其临床应用已经做出严格控制。动物源性食品中氯霉素的现状 国际上对动物源性农产品的兽药残留问题亦广泛关注，世界上许多国家禁止氯霉素使用于生产食品动物,并规定了其在畜产品中的最高残留限量。欧盟、美国等均在其相关法规中规定氯霉素的残留为“零容许量” ,即不得检出。　　我国农业部已将氯霉素从2000年版的《中国兽药典》中删除,作为禁用药品。在2002年底的农业部第235号公告《动物源性食品中兽药最高残留限量》中也明确规定氯霉素禁止使用,在动物性食品中不得检出。现在，氯霉素是动物性农产品的必检指标。动物源性食品中氯霉素的检测 关于动物源性食品中氯霉素的检测，主要使用的标准方法有：GB/T22338-2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》、GB/T20756-2006《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》、GB29688-2013《食品安全国家标准 牛奶中氯霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》、GB/T18932.19-2003《蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法 液相色谱-串联质谱法》等。食品生产企业和销售单位应把动物源性食品中氯霉素的检测作为原料质控和进货采购验证的一项重要指标进行管理，要求供应商出具相关检测报告，必要时可委托有资质的第三方检测机构进行检测。

PCR仪：预包装食品动物性成分检测[img=,632,419]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810242103024608_620_2166779_3.png!w632x419.jpg[/img][img=,611,363]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810242103098155_1046_2166779_3.png!w611x363.jpg[/img][img=,655,374]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810242103146310_2299_2166779_3.png!w655x374.jpg[/img][img=,684,231]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810242105160185_3748_2166779_3.png!w684x231.jpg[/img][img=,626,426]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810242105396535_7755_2166779_3.png!w626x426.jpg[/img][img=,610,332]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810242105480037_559_2166779_3.png!w610x332.jpg[/img][img=,623,562]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810242105529938_5889_2166779_3.png!w623x562.jpg[/img]

http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409171526_514223_271_3.jpg苏黎士动物园利用梅特勒-托利多提供的定制型称重平台对大象体重进行监测。 由于所有动物均已称重，因此台秤已通过重要测试。 尽管如此，当位于称重传感器上方的固定板移动两毫米时，动物依旧会感到有些怀疑。苏黎士公园的大象安全到达了面积为 107600 平方英尺的新居。 梅特勒-托利多并未参与搬迁过程，而是参与了称重过程。 当动物进入宽敞的室内封闭空间时，首先需要体验配有 IND560 称重终端与 PDX 传感器的台秤。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409171526_514224_271_3.jpg 新建的大象封闭区域占地 107600 平方英尺。大象的体重会随寿命而改变，是其健康的重要指标。 迄今为止，这些灰色的庞然大物每两个月称重一次，但是使用的是较小的台秤。苏黎士动物园高级管理员 Robert Zingg 评论说：“在这一方面，我们需要确保动物的四条腿全部站在秤上。 但是，在这座新的居所内，无需强迫动物做任何事情。 大象的生活离不开真正的荒野。 因此，将台秤放置在位于室内和室外封闭空间之间的通道内。 这可使动物园管理员每周按计划轻松地对大象称重。 Zingg 说：“我们希望定期对动物称重，这样我们可以很好地控制它们的体重。” http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409171528_514225_271_3.jpg 在成功称重之后，公象 Maxi 从动物园管理员的手中吃光了一块饼干。从首次签约到安装四台 PDX 传感器，整个过程任务艰巨，共需要四年时间。 梅特勒-托利多需要说服销售顾问 Stefan Büchi 尽快放弃原先的想法，即：车辆衡。 清洁这些台秤将会过于复杂。 此外，还拒绝了使用 Pinmount 称重模块这一想法，因为过多的稻草将有可能卡在内部。 最后决定使用裸露的称重传感器。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409171529_514227_271_3.jpg 安装称重传感器的梅特勒-托利多服务工程师。台秤由安装有围栏的区域包围。 如果动物园管理员想要对厚皮类动物称重，那么他们可使动物步入台秤所在并且靠近围栏的区域。 “大象不需要在秤上完全静止站立。 可将因移动所产生的波动过滤掉。”Büchi 说。 如果大象需要完全静止站立（比如在治疗时），那么这也不是问题。 在这个安装有围栏的区域内（亦称为“属地”），可通过移动横向围栏将大象关在较小的空间内。 在类似于野外的条件下生活有时需要更为复杂的环境。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409171530_514230_271_3.jpg 此地用于体重控制和医疗。此外，PDX 称重传感器易于操作。 它们可提供极为可靠的结果，并且持久耐用、易于维护。 通过可靠的 CAN 总线网络将四台传感器相互连接。 称重传感器、电缆与接头均具有防水性。 Büchi 说：“理论上存在发生洪水的可能性，但这无关紧要。” 动物园管理员使用位于台秤旁的称重终端读取亚洲象的体重（重达六吨）。 到目前为止，动物园使用这种台秤取得很好的效果。 不过，位于称重传感器上方的固定板却不受大象们的欢迎。 就结构而言，它实际只是移动几毫米。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409171530_514231_271_3.jpg 这是最后一步，然后可对苏黎士动物园内的大象进行顺畅称重。重物2014 年 2 月的一个阴天，大象专用台秤正式使用。 当六月大象园正式开放时，进入动物园的游客 将不会接触到台秤。 鉴于此，在游客区域内安装一个屏幕，显示厚皮类动物的当前体重。 最近期间，当公象 Maxi 走到台秤上时，显示的结果约为 5.6 吨，这一结果完全正常。 雌性动物的体重同样在这一绿色区域内。 动物园里的大象每天吃 4 到 8 磅的麸皮、22 到 33 磅的胡萝卜、苹果或饲料甜菜、大约 4 磅的颗粒饲料和 33 磅干草。 如此食量的大象马上会增加若干吨的体重。现在你知道大象怎么称重了吗？