蛋白质质谱

俗话说：文无第一，如果非要整出个蛋白质质谱与蛋白质组学领域世界第一牛人，显然并不是一件容易的事，也注定是一件有争议的事。作为一个半路出家的准业内人，我就本着无知者无畏的革命精神，说一下我自己心目中的第一牛人：Ruedi Aebersold。 　　考虑到科学网的大多数网友对蛋白质组学并不了解，先简单科普一下，根据百度百科的定义：“蛋白质组学(Proteomics)一词，源于蛋白质(protein)与 基因组学(genomics)两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。” 1995年(也有1994，1996年之说)Marc Wikins首次提出蛋白质组(Proteome)的概念1，1997年, Peter James(就职于有欧洲MIT之称的瑞士联邦工学院(ETH))又在此基础上率先提出蛋白质组学的概念2。基因组学和蛋白质组学的概念又进一步催生了N多的各种各样的组学(omics)，两者的诞生的发展，也使系统生物学成为可能，本文的主人公Ruedi Aebersold与Leroy Hood一起于2000年在美国西雅图创办了系统生物学研究所(ISB),该所的建立不但标志着系统生物学作为一门独立的学科的诞生(此句话貌似不靠谱，参见文后14楼的评论)，也带动了包括蛋白质组学在内的多种组学的发展，当然各种组学的发展也同时促进了系统生物学的发展。尽管日本也于2000年在东京建立了系统生物学研究所，但是同为第一个吃螃蟹的，东京的这个所，无论是学术水平还是世界影响都无法和西雅图的那个系统生物学领域的麦加相提并论。闲话少叙，我之所以认为Ruedi Aebersold是蛋白质质谱与蛋白质组学领域世界第一牛人，是基于如下原因： 　　Ruedi Aebersold对蛋白质组学的最大贡献可谓是同位素代码标记技术(ICAT)，现在这一蛋白组定量技术自从1999年在Nature上发表以来，该技术已世界广泛应用，该论文迄今(截至2013年1月11日)已被引用了近3000次。Web of Science的检索结果显示，蛋白组学领域迄今已经至少有超过10万篇论文发表，按照被引用次数排名，该论文位居第三位。有意思的是，被引用次数排第四位的是Ruedi Aebersold和另外一位牛人Mathias Mann(下面会介绍)于2003年发表在Nature上的有关蛋白质质谱与蛋白质组学的综述论文，迄今也已被引用近2800次。而引用次数排第一和第二的两篇论文的通讯作者并算不上是蛋白质质谱与蛋白质组学领域的，蛋白质组学仅仅是他们使用的工具，他们的影响也在这个领域之外。蛋白质组学领域，最重要的专业协会应该算是HUPO (国际人类蛋白质组组织), 最重要的专业会议也当属HUPO世界大会，Ruedi Aebersold曾获HUPO含金量最高的成就奖，他本人也经常是HUPO世界大会的分会主席或大会特邀报告人。当然Aebersold还获得了包括美国质谱协会(ASMS)大奖在内的许多专业大奖。可能有人会列出另外的自己心中的第一牛人(如上述的Mathias Mann)，但Ruedi Aebersold无疑至少是领域内公认的前几位的世界级牛人。另外，顺便说一下德国马普所的Mathias Mann(其在丹麦首都也有实验室)，Mann和Aebersold可谓是蛋白质组学领域的双子星座，都是该领域的顶级牛人，Mann发表的论文有多篇都在蛋白质组学领域被引用次数前10位，不少被引用次数都上千次。上述的Mann和Aebersold两人能在Nature发表综述论文也说明了他们的江湖地位。Aebersold和Mann所发表的论文总被引次数分别超过了5万和3万次，这个数字在世界所有领域都是惊人的。另外，Mathias Mann在蛋白质组学最大的贡献可以说是发明了蛋白质组体内标记技术SILAC3,这种技术与Ruedi Aebersold发明的ICAT已及另外一种标记iTRAQ是公认的应用最为广泛的蛋白质组学定量标记技术。 　　今年年近花甲的Ruedi Aebersold是世界蛋白质组学的开拓者之一，现在在上述的ETH的工作，和最早提出蛋白质组学Peter James在同一个大学。作为土生土长的瑞士人，Ruedi Aebersold是在2004年底、2005年初才开始在ETH全职工作的，可谓是瑞士的大海龟。Ruedi Aebersold此前在西雅图的ISB和华盛顿大学工作，作为ISB的元老和共同创办人，Ruedi Aebersold现在还是ISB的兼职教授，发表论文时也还署ISB地址。Mann和Aebersold都是欧洲人，现在又都致力于将蛋白质质谱与蛋白质组学应用到临床，尽管蛋白质组学已有十多年发展历史，现在最大的一个瓶颈可以说在基本无法应用到临床，现有的技术，对于临床应用而言，时间和经济成本都太高(无法高通量、检测成本太贵)。这一块硬骨头显然不是一般人能够啃得动的，需要从临床样品制备、质谱技术到数据分析都要有突破甚至革命性的创新，我很期待，也相信Mann和Aebersold有能力最终使蛋白质组学(尤其是基于此的生物标志物鉴定技术)应用到临床。 　　我国在蛋白质质谱与蛋白质组学领域在世界上最出名的无疑非贺福初莫属，贺福初的名字在国内搞蛋白质组学应该都知道他的名字，他的头衔很多(如将军、院士)，我就不一一列举了，新年伊始他又多了一个牛头衔：万人计划中的科技领军人才。贺的工作和学术水平，我不熟悉，不敢评头论足。他的文章被引用次数最高的是发表在Cancer Research一篇论文，迄今已有126次，但并非是蛋白质组学领域。在蛋白质组学领域，他的被引次数(含自引)最高的论文是2007年发表在蛋白质组学顶级期刊MCP的文章4，迄今已有105次引用。蛋白质质谱领域，我国在世界上最出名的学者估计要数复旦大学的杨芃原了，他的被引用次数最高的一篇论文，是2005年发表在化学顶级期刊德国应用化学的文章5，迄今已被引用70次，杨芃原为该论文的共同通讯作者。我国在蛋白质组学目前被引用次数最高的是南开大学王磊(澳大利亚海归、长江学者)2007年发表在美国科学院院刊(PNAS)的论文6，迄今被引次数已经超过500次。 　　蛋白质质谱仪主要生产商Thermo Fisher(即原来的Finnegan), 最近新出了本挂历，这本特别的挂历上列了13位在蛋白质质谱与蛋白质组学领域的牛人，上述的Ruedi Aebersold和Mathias Mann都在之列，其余11位简单介绍、列表如下。 姓 名 工作单位 主要贡献 Richard D. Smith 美国太平洋西北国家实验室 1990年首次用三重四级杆质谱Top-down（自上而下）分析完整蛋白 John Yates III 美国Scripps研究所 SEQUEST MS/MS数据库搜索程序 Joshua Coon 美国威斯康星大学麦迪逊分校 发明了电子转移解离技术(ETD) Neil Kelleher 美国西北大学 Top-down蛋白质组学 Kathryn Lilley 英国剑桥大学 蛋白质组学定量技术 Pierre Thibault 加拿大蒙特利尔大学 应用生物质谱和蛋白质组学到细胞生物学 Michael MacCoss 美国华盛顿大学（西雅图） 稳定同位素标记技术 Albert Heck 荷兰Utrecht大学 基于质谱的结构生物学 Catherine Costello 美国波士顿大学 HUPO前任主席，质谱技术发展及应用 Alexander Makarov 德国Thermo Fisher Scientific 生物质谱全球研发总监 领导研发Orbitrap质谱仪 Donald Hunt 美国弗吉尼亚大学 FT-MS and ETD 　　简单的说，上述13位世界级牛人都来自欧美，没有一位来自亚洲，也没有一位华人。我不知道以Ruedi Aebersold代表的上述牛人是如何炼成的，但可以肯定的是：他们不是欧美版的“百人”计划，也不是“千人”计划，更不是“万人”计划而“计划”出来的。网上的公开信息表明：Ruedi Aebersold除了在国际专业协会和期刊有学术兼职外，没有任何行政职务，就是一普通教授，但是这不妨碍他成为蛋白质质谱与蛋白质组学领域世界第一牛人。

6月美国质谱学会年会(ASMS)上发布的最新数据表明，新的仪器和工作流程极大地提高了基于质谱的血浆蛋白组学实验的覆盖深度和通量。这些进步可使质谱成为各应用领域中更有用的工具，包括血浆蛋白生物标志物的开发以及迄今由Olink和SomaLogic等亲和性平台主导的大规模人群研究。　　血浆是一种易于获取和常用的样本来源，尤其是在临床工作和人群研究中。然而，由于血浆含有大量丰度较高的蛋白质和较宽的动态范围，传统的质谱蛋白质组学分析能力不足。对于细胞裂解物的分析，质谱工作流程可测量8000到12000个蛋白质，但对血浆，类似的工作流程只能测量500到1000个蛋白质。虽然可通过去除丰度较高的蛋白质或进行粗分离来改善这一情况，但这也会牺牲通量。　　去年，瑞士蛋白质组学公司Biognosys在Journal of Proteome Research杂志上发表了一项研究，他们使用赛默飞的Orbitrap Exploris 480质谱仪，通过两小时的液相色谱梯度测量了180个去除了高丰度蛋白的血浆样品中的2732个蛋白质，这是未进行血浆分离处理情况下最高深度的血浆蛋白质组分析。　　最近，蛋白质组学公司Seer推出了一种新的血浆蛋白组学解决方案。该公司的Proteograph系统使用一组纳米颗粒来富集血浆蛋白质，然后可以使用质谱等技术对其进行鉴定和定量分析。与传统的血浆蛋白组学方法相比，Seer系统在覆盖深度和通量上都有所提升。在一份发表于四月BioRxiv 预印本的研究中，威尔康奈尔医学院-卡塔尔团队使用该系统分析了345个血浆样本，测量了大约3000种蛋白质，在其液相色谱-质谱法的运行时间下每天可分析大约10个样本。　　根据以上数据，Biognosys分析和Seer系统的覆盖深度都接近于Olink的Explore平台，后者可以在血浆中测量大约3000种蛋白质，但它们仍远远落后于SomaLogic的SomaScan平台，后者可以在血浆中测量大约7000种蛋白质。在每周约70个样本的处理量上，Biognosys和Seer系统的通量仍然落后于Olink和SomaLogic平台，后者每周分别可以处理多达1000个和340个样本。　　ASMS年会上，赛默飞展示了使用Seer最新发布的Proteograph XT试剂盒在其新的Orbitrap Astral仪器上测量大约6000种蛋白质的数据，每天处理大约30个血浆样本。这些数据标志着血浆蛋白组学工作流程的重大进展，并表明在大规模血浆研究方面，结合Seer Proteograph等血浆富集技术的质谱法与基于亲和性的平台现在可能成为竞争对手。　　剑桥大学临床医学院MRC流行病学单位的生物信息学家Maik Pietzner表示：“坦白说，我们没有预见到这么大的飞跃。”他和他的同事在大规模蛋白质基因组学研究中使用了SomaLogic的SomaScan和Olink的Explore。他指出，根据ASMS展示的数据，“看起来现在似乎变得可行了”，因为他们的研究需要1000个或更大的样本队列。　　华盛顿大学基因科学教授Michael MacCoss还表示，质谱技术具备的覆盖深度和通量使其成为大规模人群研究的有用工具。他说：“像英国生物库(UK Biobank)或弗雷明汉心脏研究(Framingham Heart Study)这样的大型队列……这些样本的价值是巨大的，研究人员希望能够以最少的资源获取最多的信息，很多实验都使用了Olink或SomaLogic。”　　如果质谱技术能够可靠地提供ASMS演示中展示的覆盖深度和通量，它可能成为亲和性平台的有力补充和竞争对手。许多蛋白质存在多种形式，或称为蛋白质变体，其变异包括氨基酸变异、截断或翻译后修饰等，这些变化会影响它们的功能，在亲和性平台上往往不清楚或不确定测量的是蛋白质的哪种变体。质谱方法更适合分析这些不同的蛋白质变体。　　Olink总裁Carl Raimond表示，他认为质谱和亲和性平台是“绝对互补的”，并补充说“看到蛋白质分析领域有创新是非常好的”。然而，他表示在Olink占据领先地位的大规模人群研究中质谱技术近期可能无法成为竞争对手，他同时也质疑ASMS展示的令人印象深刻的数据在广泛应用时是否能够经受考验。他说：“细节决定成败。提出要求很容易，但真正能够实现或提出关于这一要求背后的问题则是完全不同的事情。”Raimond补充说，虽然质谱技术不断改进，但亲和性平台也将不断进步。Olink正在将其Explore平台扩展到约5,000种蛋白质靶点，而SomaLogic计划在今年年底前将SomaScan平台扩展到覆盖约10,000种蛋白质。Pietzner同样表示，虽然在ASMS上发布的数据令人兴奋，但他和他的同事们期待看到更广泛的数据，包括总体的蛋白质覆盖范围，不同蛋白质和肽段在样本中检出的一致性和重复性。他说，“亲和性方法已经应用于规模大于50,000的人群队列中，并带来了惊人的发现。我们需要进行头对头的比较以评估这些新的质谱技术是否能够实现类似的扩展。”　　MacCoss表示，使用质谱进行此类研究的公司或研究人员需要提供数据，证明他们能够在每个样本中一致且可重复地测量一组核心蛋白。他说：“当人们使用Olink时会有一个清单，上面列出了每次都会测到的蛋白质。我们仍然需要这样做。我们仍然需要说，这是每次实验都会返回定量值的蛋白质列表……以及测量中获得高质量分析数值的蛋白。”　　Pietzner表示，他和他的同事目前正在努力扩展他们的蛋白质基因组学研究以包括质谱技术。强生和强生制药公司的神经科学数据科学主管，以及英国生物库药物蛋白质组学项目(PPP)主席Christopher Whelan表示，目前一个规模最大的蛋白质基因组学人群研究项目正在实施基于质谱的蛋白质组学。　　Seer本月宣布推出Seer技术访问中心，该中心将组合其XT试剂盒与Orbitrap Astral质谱仪，为没有质谱仪的用户提供蛋白质组学服务。　　尽管到目前为止很难全面评估赛默飞的Orbitrap Astral和Seer的Proteograph XT的性能，但一些早期用户表示其产生的结果很出色。　　Cedars-Sinai精准生物标志物实验室主任Jennifer Van Eyk一直在使用Orbitrap Astral进行血浆蛋白质分析，在这方面它比先前的仪器有更强的能力。Van Eyk表示，在每天运行60个样本时，新仪器可测得的蛋白质数量是相同工作流程下使用Thermo Fisher的Exploris 480仪器的2到2.5倍。　　她说：“我们不仅可以检测到更多蛋白质，而且可以定量更多蛋白质，并且这些蛋白质是可重复的，也就是说，如果我们运行一个样本五次，我们确实会五次都观察到同样的蛋白。这是一个很大的飞跃。”这台仪器最出色的或许是其高通量，Van Eyk表示，她和她的同事们每天可以运行多达180个的未去除高丰度蛋白的血浆样本并获得良好的数据和深度的覆盖。她说，“在每天运行180个样本的情况下，突然间你可以开始讨论运行10,000个样本，然后它就成为一个人群研究了。”Van Eyk和她的同事目前正在试验Seer Proteograph系统，以“充分测试”其性能，并评估是否要将其作为血浆蛋白质组学工作流程的一部分。　　威斯康星大学麦迪逊分校的生物分子化学和化学教授Joshua Coon指出，他的实验室能够使用50分钟的液相色谱梯度在未处理的血浆中测量大约1,500种蛋白质，并且已经在该仪器上开发出了一种一分钟的直接注射方法，能够在每个样本中测量约200种蛋白质。　　Coon还是SeerProteograph平台的用户，尽管他尚未将其与Orbitrap Astral结合使用。他的实验室一直在使用Seer XT试剂盒分析阿尔茨海默病患者的血浆样本以及长期新冠肺炎(long COVID)个体的样本。他说，尽管他的团队尚未开始处理大批量样本，但在初步工作中，实验室每个样本一致地测量到约3,000种蛋白质，这是不使用Seer系统时的五倍左右。他认为，当研究人员将工作流程应用于Orbitrap Astral系统时，这些数字还会进一步提高。　　除了覆盖深度外，Coon表示，Proteograph对简化质谱样品制备非常有用。他说：“我没有完全认识到到它的自动化程度，它非常方便。现在主要的用户是一个一年级和二年级的研究生……所以他们必须快速学习。他们在处理样本、获得消化产物和肽段方面取得了很大的成功。当你有新人或者长时间不做该工作的人时，进行大规模蛋白质组学研究的样品制备将耗费整个实验一半以上的精力，只需使用该平台然后熟练掌握。”　　尽管Seer Proteograph平台提供的覆盖深度使质谱血浆蛋白质组学在某些应用中与Olink和SomaLogic等亲和力平台更具竞争力，但Seer本身在血浆富集领域面临新的竞争。　　在ASMS会议上，蛋白质组学样品制备公司PreOmics推出了其ENRICH-ist富集血浆和血清蛋白质的试剂盒。该试剂盒使用非功能化顺磁性微珠来富集低丰度蛋白质，据该公司称，与未去除高丰度以及未富集的血浆相比，用该试剂盒处理血浆可将蛋白质检出率从50%提升至100%。PreOmics首席执行官Garwin Pichler表示，微珠与缓冲液的结合可在去除高丰度蛋白的同时富集低丰度蛋白以提高覆盖深度。Biognosys推出了一种新的基于微珠的血浆蛋白质组富集试剂盒，作为其TrueDiscovery服务平台的一部分。据该公司称，这种试剂盒可以高通量定量人类血浆中约4,000种蛋白质。　　此外，在本月，华盛顿大学研究人员领导的团队在BioRxiv预印本上发表了一篇论文，描述了一种使用ReSyn Biosciences的磁性微粒富集血浆蛋白质的方法，其通过结合血浆中的膜结合囊泡并分析相关蛋白质来提高覆盖深度。华大的MacCoss是这篇预印本的通讯作者，该预印本的第一作者Christine Wu也是该富集方法的主要开发者。他们能够在Orbitrap Astral上使用30分钟的液相色谱梯度稳定地定量约4,800种血浆蛋白质，每天可处理约40个样本。在使用一小时的液相色谱梯度时，他们能够测量5,000到6,000种蛋白质。MacCoss他们迄今没有过度挑战该方法的能力，所以这些数字是相对保守的。MacCoss表示，由于Seer公司的技术成本较高，研究人员对于血浆蛋白质组学富集的替代方法很感兴趣。他说：“Seer在制造这些产品方面做得很好，但成本是一个高门槛。”　　维也纳分子病理研究所的蛋白质组学负责人Karl Mechtler表示，他与Seer的讨论中，每个样品的报价大约是600美元。他说：“如果我有100个样品，对于一个蛋白质组学实验室来说，这是一笔巨款。”他指出，对于一个典型的蛋白质组学实验室，一个合适的价格范围应该在每个样品25到50美元左右。Wu表示，使用华大的富集方法进行实验的每个样品成本低于5美元。PreOmics将ENRICH-ist试剂盒作为完整蛋白质组学样品准备工作流程的一部分销售，每个样品总共80美元。　　在回答成本问题时，Seer公司董事长兼首席执行官Omid Farokhzad表示，他认为价格是“价值交换的问题”。他说：“并非所有内容都是等价的。问题在于，从Seer所提供的与其替代方案所提供的内容来说，价值交换是什么?”在血浆蛋白质组学领域最新的发展中，这个问题的答案似乎是一个不断变化的目标。　　参考文献：[1] Tognetti Marco,Sklodowski Kamil,Müller Sebastian et al. Biomarker Candidates for Tumors Identified from Deep-Profiled Plasma Stem Predominantly from the Low Abundant Area.[J] .J Proteome Res, 2022, 21: 1718-1735.[2] bioRxiv - Genomics Pub Date : 2023-04-21 , DOI：10.1101/2023.04.20.537640Karsten Suhre, Guhan Ram Venkataraman, Harendra Guturu, Anna Halama, Nisha Stephan,Gaurav Thareja, Hina Sarwath, Khatereh Motamedchaboki, Margaret Donovan, Asim Siddiqui, Serafim Batzoglou, Frank Schmidt

贾伟、陈熙 沃特世科技（上海）有限公司实验中心 氢氘交换质谱法是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术。它在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用。随着氢氘交换质谱技术的不断发展，它正在成为结构生物学家及生物药物研发的重要手段。 氢氘交换质谱（HDX MS，hydrogen deuterium exchange mass spectrometry）是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术。其原理是将蛋白浸入重水溶液中，蛋白的氢原子将于重水的氘原子发生交换，而且蛋白质表面与重水密切接触的氢比位于蛋白质内部的或参与氢键形成的氢的交换速率快，进而通过质谱检测确定蛋白质不同序列片段的氢氘交换速率，从而得出蛋白质空间结构信息[1]。这个过程就像将握着的拳头浸入水中，然后提出水面并张开手掌。这时，湿润的手背表明它在&ldquo 拳头&rdquo 的结构中处于外表面，而较为干燥的手心表明它是&ldquo 拳头&rdquo 的内部。除样品制备外，氢氘交换质谱法的主要过程包括：交换反应、终止反应、将蛋白快速酶切为多肽、液相分离、质谱检测、数据解析。其中交换步骤需要在多个反应时长下进行，如0s、10s、1min、10min、60min等，以绘制交换率曲线，得到准确全面的信息。氢氘交换质谱技术在蛋白质结构及其动态变化研究[1]、蛋白质相互作用位点发现[2]、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用[3]。 与经典的蛋白质结构研究方法相比，如X射线晶体衍射（X-Ray Crystallography）和核磁共振（NMR. Nuclear Magnetic Resonance）等方法，氢氘交换质谱不能够提供精确的蛋白空间结构，它直接提供的主要信息包括哪些氨基酸序列位于蛋白质空间结构的表面位置（包括动态变化中的）、可能的活性位点和蛋白-蛋白相互作用位点等。但是氢氘交换质谱技术有着其他经典方法不具备的优点：首先，可以进行蛋白质结构动态变化的研究是氢氘交换质谱的一个突出优点，包括变化中的活性位点及表位；其次，氢氘交换质谱在蛋白复合体构象的研究中也具有独到的优势；此外，氢氘交换质谱还具有对样品需求量小、纯度要求相对较低、研究对象为溶液环境下的蛋白质的天然构象而非晶体中构象等优势[1,4,5]。自1991年第一篇研究论文发表起，氢氘交换质谱技术不断发展，已经成为结构生物学及质谱技术中一个非常重要的应用领域[6]。但是氢氘交换质谱实验的复杂的实现过程在一定程度上影响了其应用的广泛度。主要的难点有：1、如何避免交换后氘代肽段的回交现象；2、实验控制的高精确性和重现性要求；3、交换后造成的叠加的质谱峰如何准确分辨；4、简易高效的分析软件需求；5、以氨基酸为单位的交换位点辨析。沃特世公司自2005年起，针对以上难点不断进行攻关，推出了目前唯一商业化的全自动氢氘交换质谱系统解决方案&mdash &mdash nanoACQUITY UPLC® HD-Exchange System(图1)。在全世界范围内，这套系统已经帮助科学家在包括Cell、Nature等顶级研究期刊中发表研究论文[7,8]。除科研需求外，沃特世氢氘交换质谱系统也受到众多国际领先制药公司的认可，并用于新药开发中蛋白药物活性位点及表位的研究工作中。 氢氘交换实验中的回交现象将严重影响实验数据的可信度，甚至导致错误结果的产生。要避免回交需要做到两点：尽量缩短液质分析时间和保证液质分析中的温度和pH为最低回交反应系数所要求的环境。沃特世UPLC® 系统采用亚二纳米色谱颗粒填料，较HPLC使用的大颗粒填料，UPLC具有无与伦比的分离度。因此UPLC可以做到在不损失色谱分离效果的要求下，极大缩短液相分析时间的要求[9]。对于对温度和pH控制问题，在多年的工程学改进中，nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System已经实现了对酶切、液相分离等步骤的全程控制[10]。 对氢氘交换质谱实验精确性和重现性的要求是其应用的第二个主要难点。在实验中一般需要采集0s、10s、1min、10min、60min、240min等多个时间点的数据。如果进行人工手动实验，很难做到对10S-10min等几个时间点的精确操作。再考虑到重复实验的需求，人工手动操作会对最终数据可信度产生影响。而且实验过程重复繁琐，将给实验人员带来非常大的工作压力。nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System完全通过智能机械臂，精确完成交换、终止交换、进样、酶切等一系列实验过程，而且始终保证各个步骤所需不同的温度环境。这些自动化过程不但保证了实验数据的可靠性，提高了实验效率，也将科学家从繁琐的重复实验中解放出来。 氢氘交换实验的质谱数据中，随着交换时间的延长，发生了交换反应的多肽，由于质量变大，其质谱信号将逐渐向高质荷比方向移动。因此，这些质谱峰可能与哪些未发生交换反应的多肽质谱峰逐渐叠加、相互覆盖。相互叠加的质谱信号，不但影响对峰归属的判断，更会增加交换率数据的误差。因为交换率判断需要通过对发生交换的多肽进行定量，毫无疑问因叠加的而混乱的质谱数据将极大的影响对质谱峰的准确定量。这点对于单纯通过质荷比进行分析的质谱仪来说完全无能为力。但是，这个看似不可能完成的任务却被沃特世 nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System攻克了。这是因为，不同于其它常见质谱，沃特世的SYNAPT® 质谱平台还具备根据离子大小及形态进行分离的功能（行波离子淌度分离）。在数据处理时，除多肽离子的质荷比信息外，还可以通过离子迁移时间（离子淌度维度参数）将不同离子区分。因此这种SYNPAT独有的被命名为HDMSE的质谱分析技术可以将因质荷比相同而重叠的多肽分离开，轻而易举地解决了质谱信号叠加的问题，得到准确的交换率数据[11,12]（图2）。SYNPAT质谱平台一经推出就夺得了2007年PITTCON金奖，目前已经推出了新一代的SYNAPT G2HDMS、SYNAPT G2-S HDMS等型号，并具备ESI、MALDI等多种离子源。除氢氘交换技术外，SYNAPT质谱系统在蛋白质复合体结构研究中也是独具特色，已有多篇高质量应用文献发表[13,14,15]。 实现氢氘交换质谱技术的第四个关键点，是如何高效分析实验产生的多时间点及多次重复带来的大量数据。人工完成如此巨大的信息处理工作，将消耗科学家大量的时间。沃特世氢氘交换质谱解决方案所提供的DynamX软件可以为科学家提供简便直观的分析结果，并包含多种呈现方式。 在某些特殊研究中，要求对蛋白氢氘交换位点做到精确到氨基酸的测量，这是氢氘交换质谱研究的又一个难点。在常规的研究中采用CID（碰撞诱导解离）碎裂模式，可能导致氘原子在多肽内重排，而致使不能对发生交换的具体氨基酸进行精确定位。SYNPAT质谱提供的ETD（电子转移解离）碎裂模式可以避免氘原子重排造成的信息混乱，并具有良好的碎裂信号[16]。 沃特世的nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System为氢氘交换质谱实验提供了前所未有的简易的解决方案，强有力地推动了氢氘交换技术在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位以及活性位点鉴定方面的应用，正在成为众多结构生物学科学家和生物制药企业必不可少的工作平台。 参考文献 (1) John R. 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大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Improved Label-Free Quantification of Intact Proteoforms Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry [1]，文章的通讯作者是美国俄克拉荷马大学的Luca Fornelli教授。完整proteoforms的非标记高通量定量方法的应用对象通常为从整个细胞或组织裂解物中提取的0 - 30 kDa质量范围内蛋白质。然而当前，即使通过高效液相色谱或毛细管电泳实现了proteoforms的高分辨率分离，可鉴定和定量的proteoforms的数量也不可避免地受到固有的样品复杂性的限制。近年来，随着质谱技术的发展，自上而下蛋白质组学质谱(top-down proteomics)研究中蛋白质的鉴定数量大大提升，生成了包含数万种proteoforms的数据集，但在proteoforms的量化能力方面并没有得到相应的性能提升。为克服这一问题，本文中作者通过应用场不对称离子迁移谱法(Field asymmetric ion mobility spectrometry, FAIMS)对大肠杆菌中的proteoforms进行了非标记定量。由此产生的改进允许在单次LC-MS实验中采用多个FAIMS补偿电压(Compensation voltages, C.V.)，而不会增加整个数据采集周期。与传统的非标记定量实验相比，FAIMS的应用在不影响定量准确性的情况下，大大增加了鉴定和定量的proteoforms数量。首先，作者优化了质谱stepped-C.V.数据采集方法对Orbitrap Eclipse性能的影响，并从中筛选出了最优条件(−40、−20、0 V组合)。所有最新的基于Orbitrap的质谱仪(包括Exploris platform和Orbitrap Ascend)都可以采用single time-domain transients(即单次微扫描)在top down FTMS实验中生成高质量的质谱图。作者认为这对于在单次LC - MS2运行期间应用多个C.V.值的采集策略特别有益。接下来，作者应用该方法对大肠杆菌中的蛋白质进行了检测，并与传统的LC - MS2 DDA采集方法进行了比较(图1)。如图所示，每个C.V.值下的总离子流图都不同，且这一额外的分离导致在LB(Luria broth)和M9(醋酸钠处理)样品中鉴定到的proteoforms的数量显著提升。　　图1. 样本制备方法和proteoforms鉴定结果总结虽然在LC-FAIMS和LC-only数据集中，大多数鉴定到的proteoforms质量都小于15 kDa，但其中约20%的质量大于18 kDa甚至高达33.3 kDa(图2)。对已鉴定的proteoforms列表的深入分析表明，达到鉴定低丰度proteoforms的关键参数之一是在串联质谱(MS2)中有足够的时间注入离子。　　图2. A. FAIMS和非FAIMS鉴定到的proteoforms的质量分布。B. 鉴定到的proteoforms与注射时间之间的关系。最后，作者采用ProSight PD v 4.2 (Proteineous, Inc)进行了基于MS1的非标定量，结果显示基于FAIMS的数据集在LB样品(蓝色)和M9样品中检测到的差异表达的proteoforms均有所增加(图3)。作者评估了两个数据集之间的差异(使用和不使用FAIMS采集数据)，以验证FAIMS的应用是否会对量化准确性产生不利影响，结果只有1个proteoform显示相互矛盾的丰度趋势。这种差异是由于该蛋白和一个共流出蛋白之间质谱峰几乎完全重叠造成的。它们具有非常接近的单同位素质量，这样高水平的信号干扰可以很容易地干扰基于MS1的量化。启用FAIMS可以使MS1谱图简化，因为两种proteoforms可以富集在两种不同的C.V. 值下。　　图3. 大肠杆菌proteoforms无标记定量结果分析。作者将LC - FAIMS - MS2数据集与通过BUP在类似样品上获得的非标定量结果进行比较，得出两个主要的结论:1. BUP仍然对蛋白质组提供了更深层次的定量表征 2. BUP提供了与单个基因相关的所有产物的整体丰度水平信息 而TDP方法表明，给定的UniProt accession可以由多个差异表达的proteoforms组成，可能具有不同的行为(即在给定条件下，一些被上调，另一些被下调)。这一额外的信息可能具有潜在的生物学意义，但在基于BUP的定量分析中可能会被遗漏。本文描述的基于FAIMS的定量数据采集方法与PEPPI(Passively eluting proteins from polyacrylamide gels as intact species)蛋白分离技术完全兼容，产生0 - 30 kDa的组分，并且可以方便地根据待分析蛋白的平均质量调整质谱参数(C.V.值)，未来在更大的蛋白质定量方面具有广阔的应用前景。　　撰稿：张颖　　编辑：李惠琳　　原文：Kline JT, Belford MW, Huang J, Greer JB, Bergen D, Fellers RT, Greer SM, Horn DM, Zabrouskov V, Huguet R, Boeser CL, Durbin KR, Fornelli L. Improved Label-Free Quantification of Intact Proteoforms Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry. Anal Chem. 2023 Jun 13 95(23):9090-9096.　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　1.Kline JT, Belford MW, Huang J, Greer JB, Bergen D, Fellers RT, Greer SM, Horn DM, Zabrouskov V, Huguet R, Boeser CL, Durbin KR, Fornelli L. Improved Label-Free Quantification of Intact Proteoforms Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry. Anal Chem. 2023 Jun 13 95(23):9090-9096.

2011年6月8日，苏黎世联邦理工学院及 AB SCIEX(全球领先的生命科学分析技术公司)的科学家汇聚一堂，公布一项基于质谱应用的新技术，利用此项技术，科学家有史以来首次可以获得单独蛋白质组学样品分析中每个肽段的数据。SWATH 采集模式 是一项重大技术突破，使用质谱研究蛋白质组学的用户得以获知整个蛋白质组的完整数据。在与苏黎世联邦理工学院 Ruedi Aebersold 博士进行的 MRMAtlas 合作的过程中，AB SCIEX 将开发 MS/MSALL 增强功能，使 AB SCIEX TripleTOF™ 5600 系统可以运行 SWATH 采集模式供全球科学家使用。有关 SWATH 的详情将于本周在丹佛召开的美国质谱协会 (American Society of Mass Spectrometry, ASMS) 会议上公布。 　　SWATH 采集模式是 Aebersold 博士及其在苏黎世联邦理工学院的团队共同开发，为未来的蛋白质组学研究提供的一种新的工作流程，该系统预计将产生令人震撼的蛋白质组学新发现，并克服目前的质谱平台中因数据重复而给科学家带来的困惑。本技术关键优势在于其能提供样品的完整定量与定性结果，该结果能按照提出的新假设经电脑模拟进行回溯性的挖掘。 　　这一新技术是对 MRMAtlas 的完美补充，MRMAtlas 以质谱技术为基础，向大多数人类蛋白质组提供研究平台。全球科学家利用这一图谱极大推进了生物标志物研究、蛋白药物开发、基础生物及生物医学研究。MRMAtlas 提供简单及有效分析能力，探索蛋白质组中前所未见的新领域。利用 TripleTOF 5600 系统的 SWATH 采集模式，将有更多科学家能使用 MRMAtlas。 　　现有高分辨率及轨道阱质谱系统仅能定性检测出复杂样品中的蛋白质子集，因为它们 MS/MS 获取速度相对较慢，且为探知更准确的定量结果，常常会采用其他仪器再次进样分析样品。面对这些挑战，AB SCIEX 开发出 SWATH 采集模式可以在单一进样分析中同时对所有蛋白质与肽进行定量与定性检测。 　　与 Aebersold 博士及其团队共同展开的这一活动还将继续开发软件处理方法，更好解析 MRMAtlas 的数据。SWATH 采集模式 是 AB SCIEX 的 MS/MSALL 技术的延伸，只能在 TripleTOF™ 5600 上完成，这是因为需要将极高的采集速度与定量能力、精确质量及高分辨率整合在一起方可实现。MS/MSALL 以前已成功用于脂质组学及特种结构表达。现在进一步扩展此能力，MS/MSALL 采用 SWATH 采集模式，极大提高了工作效率，因此可以结合 LC/MS， 显著提高了质谱技术。 　　瑞士联邦理工学院(苏黎世联邦理工学院)分子系统生物学学院Ruedi Aebersold 博士、教授 　　“利用 SWATH 和 MRMAtlas，我们能够重新思考研究蛋白质组学的方法。我们能够利用前所未有的方法研究样品，我们预计这将产生令人震撼的新发现。与 AB SCIEX 合作使我们达到开发此项技术所必须的速度与定量层次，我们将向全球整个科学界提供这一技术。” 　　AB SCIEX 制药与蛋白质组学业务部总经理兼副总裁 Dave Hicks 　　“AB SCIEX 再一次与世界一流科学家紧密合作，推动质谱技术发展，达到其他任何厂家均难以想象的高度。TripleTOF 5600 系统提供的能力和速度使这一革命性的 SWATH 技术成为现实。我们预计这一发展将在接下来的几年中重振蛋白质组学研究。”

最近，来自瑞士和荷兰的科学家，对在22种不同生长条件下大肠杆菌表达的蛋白质，进行了定量和定性分析。确定了超过2300个蛋白质，其中一些处于每个细胞一个副本的平均水平。由此产生的数据集描述了细胞中大多数( 90%)的蛋白质量，对细胞生物学家来说这将是一个宝藏。相关研究结果发表在十二月出版的《Nature Biotechnology》。　　为了了解细胞内的基因组信息和它们的生理机能之间的关系，重要的是要评估哪些基因在不同条件下积极参与产生蛋白质。收集这些信息的最直接的方式是，对细胞中存在的蛋白质进行定量测量。　　随着技术的进步，最近才使得绝对蛋白质水平的大规模测量成为可能。来自巴塞尔大学和苏黎世大学(瑞士)、格罗宁根大学(荷兰)的科学家们，联手测量在22种不同条件下生长的大肠杆菌中的蛋白质。使用质谱法为基础的蛋白质组学方法，他们不仅确定了存在哪些蛋白质，而且还确定了每个细胞中有多少个副本。　　大型数据集　　系统生物学教授Matthias Heinemann说，来自大规模数据集的结果，将激励更多新的研究成果，他与巴塞尔大学的Alexander Schmidt一起协调实验。他解释说：“我们成功地分析了这些细胞中百分之90的蛋白质量。我们发现，有超过2300种不同的蛋白质，代表着4300个细菌基因中的超过一半。这使大肠杆菌中绝对定量的蛋白质数量增加了一倍。对于这些蛋白质中的一些，还没有确定其功能。但是，通过研究超过22种不同生长条件下的表达模式，我们现在获得了一个关于‘它们正在做什么’的线索。”　　免费索取Life Tech蛋白质组学产品信息　　蛋白质有非常不同的表达水平，从每个细胞平均超过100000个副本，到两个、一个甚至更少的水平。Heinemann说：“首先，这表明我们的方法是多么的敏感，但它也会让你想知道，在非常低的水平表达的蛋白质有什么功能，通过纯粹的随机效应，虽然一些基因可能是活跃的(从而随机产生蛋白质)，但我们并不排除一个细胞中一个蛋白单拷贝的一种适当功能。毕竟，其他的生物实体——显示为单拷贝(如基因)，也具有一种功能，研究还发现了对细菌蛋白质的新翻译后适应性。　　新问题　　在这篇论文中描述的数据集，正在被其他科学家所使用，并引发了新的令人兴奋的研究调查。作者指出：“我们的数据将作为新研究的参考数据，并已经促成了一些正待出版的研究结果。这个数据集可让科学家们能够提出并回答新的问题。”　　对于这项研究，在不同条件下生长的细菌是在格罗宁根大学培养的。样品被运到巴塞尔大学，蛋白质含量(包括膜结合蛋白)是通过质谱分析法分离和分析的。最后，整个团队对这些结果进行了分析。

p 　　用于生物样品分析的蛋白指纹法，该专利技术被国际顶级科学杂志《科学》以及医学界权威杂志《柳叶刀》评为世界蛋白指纹图谱和蛋白质芯片排名第一的技术。针对这项技术的一些问题，火石创造对许洋博士进行了深度的专访。 /p p style=" text-align: center " img width=" 300" height=" 385" title=" 001.png" style=" width: 300px height: 385px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/ebf3be8e-c0c2-49d6-9891-a76d207d183f.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " strong 　　许洋博士 /strong /p p 　　许洋博士一直致力于蛋白质组学研究开发，怀揣近五十项蛋白分子质谱诊断技术的自主发明专利。2009年他创办了湖州赛尔迪生物医药科技有限公司，凭借专利产品蛋白指纹图谱仪成为行业领头羊，也成为此类器械行业标准的起草者。 /p p strong 　　火石：请问您为什么做蛋白质谱? /strong /p p 　　许洋博士：我研究蛋白质谱是偶然也是必然。在美国纽约著名的Sloan-Kettering研究所单克隆抗体实验室早期研究治疗白血病时，我们制造了全世界第一枚人源化单克隆抗体(抗CD33人源化单抗)。后来我又和顶尖美国公司合作第一个将人源化单克隆抗体做成了靶向药。有了扎实的基础，必然能在更窄的蛋白质谱领域做的更好。 /p p 　 strong 　火石：蛋白质谱当前的临床应用情况如何? /strong /p p 　　许洋博士：只有拿到医疗器械注册证才算进入临床，蛋白质谱目前只有三种临床应用：对肿瘤的筛查 对早期肾脏疾病的分析 在细菌上的鉴定应用。蛋白质谱在国内仍处于非常早期的阶段，且具有垄断性，极少人能做且在做。 /p p strong 　　火石：作为国家“千人计划”医疗器械特聘专家，您认为蛋白指纹图谱仪在医疗器械中的角色是什么? /strong /p p 　　许洋博士：蛋白指纹图谱仪分析的大数据可以生动地比喻为人体疾病的健康地图。 /p p 　　蛋白指纹究竟是什么?把质谱仪的显示屏中的每一个蛋白质都用一个分子量来表达，这些分子量组合起来就叫蛋白指纹。就像每个人的指纹都是不同的，每种疾病的特定蛋白质表达物也不同，称之为指纹图谱。蛋白指纹图谱技术是由蛋白质芯片及分析仪器——表面加强激光解析电离飞行时间质谱仪两部分组成，可以将病人血清中蛋白质成分的变化记录下来，绘制成蛋白指纹质谱图，并显示样品中各种蛋白的分子量、含量等信息。将这张图谱与正常人、某种疾病病人的谱图或基因库中的谱图进行对照，就能最终发现和捕获新的特异性相关蛋白及其特征。这种方法具有微量、精确、简易、快速的特点，适应于基础和临床等各个领域。 /p p 　　之所以将蛋白指纹图谱仪分析的大数据比喻为人体疾病的健康地图(MAP)，是因为既然β2—微球蛋白是11731、人绒毛膜促性腺激素是37580、转甲状腺素蛋白是13761(数字对于计算机的应用更好管理)，而每个蛋白质在质谱仪分析中都是数字，它本身就是大数据。任何物质在质谱底下都是数字，综合起来就是大数据。我把大数据串联起来，就能将分子在身体的MAP做出来。譬如一位吸烟的男士来体检，能发现他吸了烟数年之后肺部出现影像学病理性位点，结合质谱仪分析发现相关的疾病标志物，我们能够模拟出肺部疾病的健康地图，即通过质谱仪检测的健康大数据，可以模拟出该患者肺部出现了数个小红点，点击每个红点后都会解释原因，如显示铅、铬等数据是否超标，以及告诉你相应的对策。这样的技术开启了全智能健康4.0时代。 /p p 　　Tips：β2—微球蛋白(β2—MG)被认为是诊断早期肾功能损伤的敏感指标，尤其对于糖尿病肾病、高血压肾病、红斑狼疮肾炎的早期诊断具有重要参考价值，因此β2—微球蛋白的测定在临床上是有多种价值的。 /p p 　　 strong 火石：您和您的团队在蛋白质组学研究的技术或者方法上有什么突破吗? /strong /p p 　　许洋博士：蛋白质作为标志物对肿瘤的诊断，确实没有太大的进展。 /p p 　　一直以来蛋白质组学研究面临的重大瓶颈是蛋白质分离问题：人体内有十万种蛋白质与衍生物，多数可能与疾病有关联，但这十万种蛋白质与衍生物只有分开后，质谱才能分析清楚。此前蛋白质组学技术中最流行、最通用的蛋白质分离方法是双向电泳，基本上能分离近二千种血浆蛋白质，远远不及十万种，所以成为了瓶颈。 /p p 　　2006年我提出了一个设想：和蛋白有关的抗体至少有一万多种，那为什么不用抗体来分离蛋白质?这件事一直有人在做，但之前都没有人想到用抗体组把一千个蛋白质一次性快速、实时地分离出来。之后就诞生了免疫质谱分析方法(专利号ZL 200610140652.0)，可以在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析，还可以同时检测多个生物标志群。用免疫组质谱技术能测定抗原变异片段的分子量。另外，还可以将多种疾病特异性抗原的抗体同时标在一个基质点上。 /p p 　　Tips:免疫质谱分析方法：质谱与抗体分离技术联合应用即为免疫组质谱(Immunomic mass spectrometry，IMS)。免疫组质谱检测为一组多种(类)抗体与质谱联合来精确地鉴别变异或修饰生物标志群的方法。在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析。可以同时检测多个生物标志群(biomarkers)。 /p p 　　双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)：是一种等电聚焦电泳与SDS-PAGE相结合，分辨率更高的蛋白质电泳检测技术。目前是快速成长的蛋白质组学技术中最流行最通用的蛋白质分离方法。目前2D-PAGE能够在同一块凝胶上同步检测和定量数千个蛋白质。 /p p 　　从整个2015年的政策看，医疗器械行业是受到国家大力扶持的，行业地位与重要性大幅提升，法规向国际化看齐，行业监管不断趋严，医疗器械正成为与药物齐头并进的新兴产业。 /p p 　　 strong 火石：是什么驱动着行业的高增长? /strong /p p 　　许洋博士：一是需求，老龄化加剧，家庭支付能力增强，导致医疗需求高增长 二是政府加大医疗卫生投入，《医疗器械科技产业“十二五”专项规划》表示，“十二五”期间将扶植形成8～10家产值超过50亿元的大型医疗器械产业集团 三是为配合新医改完善基层医疗建设的目标 四是国内生物技术研发应用进入突破期。 /p p 　　 strong 火石：您认为接下来医疗器械未来发展的特点和前景会是怎么样的? /strong /p p 　　许洋博士：未来5年，医疗器械和制药占比将会达到1:1。近十年，我国医疗器械市场规模快速增长，国内医疗器械工业总产值从2003年的189亿人民币上升到2013年的1889亿，2013年同比增长21%，增长速度远快于药品。预计在未来5年左右，我国医疗器械行业仍然将保持高速增长。医疗器械行业涉及到医药、机械、电子、塑料等多个行业，中高端医疗器械更是多学科交叉、知识密集、资金密集的高技术产业，研发成本高，决定了只有大型厂商才能在大中型医疗器械方面有所作为。此外，器械“国产化”也会成为必然趋势。 /p p 　　 strong 火石：赛尔迪当前开展的业务、研发的产品有哪些?公司部署战略是怎么样的? /strong /p p 　　许洋博士：我们现在正在做一张人类的大健康MAP。通过精准医疗计划，基于环境健康大数据，通过蛋白指纹图谱仪完成健康管理。现在的疾病市场最关注的问题分别是：检测0～6岁儿童智力、优生优育(为什么生不出聪明宝宝)、高达5千万的肿瘤人群以及3.5亿的高血压、糖尿病人群。 /p p 　　其中糖尿病肾病是糖尿病最常见且严重的并发症之一，是糖尿病所致的肾小球微血管病变而引起的蛋白排泄和滤过异常那个渐进性肾功能损害。而微量白蛋白尿即早期糖尿病肾病是可逆的，这不同于大量白蛋白尿即临床糖尿病肾病，因此积极防治早期糖尿病肾病就显得尤为重要。去年底，赛尔迪公司与中国医学科学院北京协和医院签署协议，承担国家对糖尿病肾病体内铅、镉毒素的临床大样本检测。全新升级的蛋白指纹图谱仪，是目前唯一获国家药监局批准、能检测含微量白蛋白、β2—微球蛋白以及泛素3项指标的医疗器械。这对糖尿病肾病的早发现、早治疗具有重大意义。 /p p 　　赛尔迪接下来将按照个体化精准检测所附带的信息，由这些信息与大数据库交流，提出符合个体化治疗的方案，向个体化精准医学管理方式转变。 /p p 　　随着大数据时代的来临，“互联网+”概念的提出让医疗健康事业呈现出了新的发展势态和特征。医学知识体系正被大数据、精准医疗所重构，信息化进程提高了知识传递速度与医疗协同效率。 /p p strong 　　火石：蛋白质组学技术如何助推精准医疗? /strong /p p 　　许洋博士：常识知道铅、镉会引起糖尿病性肾病。但铅、镉指标不是医院常规检测的项目。如果采取个体化精准治疗，每年常规检查一次体内铅与镉的指标，发现异常就能进行针对性的从尿液排泄的治疗。已经得了肾病正在透析的病人，检测铅与镉指标后进行针对性排泄也会增强治疗效果。利用蛋白指纹图谱仪能够发现早期的肿瘤和心血管标志物，这就会对疾病的治疗带来极大的希望。随着质谱技术在精准医疗的应用，越来越多的个体化标志物将会被发现，人体的蛋白指纹图谱测定将会成为医院的常规工作。 /p p 　　精准医疗，即考虑每一个体健康的差异，制定个性化的预防和治疗方案。正确的选中一个工具，解决关键问题，这就是精准医疗。基于基因组测序技术、生物医学工具以及大数据工具逐步成熟和完善，精准医疗能够为个体基因特征、环境以及生活习惯进行疾病干预及治疗，但如何尽快与大数据结合才是发展重点。日前我与北京协和医院合作，创立了中国特色的首个百万人疾病与环境毒素数据库与IMS(爱睦世)特检中心：HZIMS2008，首次在复杂疾病系统中构建了基于环境毒素大数据的移动网络数据库的质量控制体系，使我国重大疾病，如高血压、糖尿病、肿瘤的大数据病因学研究处于世界领先。 /p p /p

糖是组成生命体的四大类重要分子之一，糖蛋白质是由糖链与肽链中的特定氨基酸残基以糖苷键共价连接而成的蛋白质。糖蛋白质普遍存在于生物体内，在很多生命过程中起着重要作用，如蛋白质的折叠、细胞之间的相互识别、炎症反应等。同时，糖基化修饰在疾病中，特别是肿瘤的发生、发展和转移过程中也起到重要作用，许多疾病诊断标志物及治疗的靶标都是糖蛋白质。糖蛋白质组学和糖组学的研究具有重要的科学意义。以基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)为代表的生物质谱技术，因具有快速、灵敏、可提供结构信息等优点，已成为糖蛋白质组和糖组分析的重要工具。　　由复旦大学杨芃原教授团队撰写的综述文章“质谱技术在糖蛋白质组学与糖组学方面的研究进展”发表于2016年第3期的《国家科学评论》。这篇综述论文系统介绍了近年来以质谱为核心的糖蛋白质组和糖组的研究策略和方法，以及该领域重要的生物和临床发现。重点讨论了国内糖蛋白质组学和糖组学研究团队在糖蛋白质和糖链的分离富集、糖链的衍生，糖链和糖蛋白质的质谱碎裂技术，糖链及糖蛋白质序列组成分析的软件技术等方面的进展，并分析了基于质谱技术的糖蛋白质组和糖组研究的关键问题，展望了该领域未来的发展趋势。　　杨芃原教授团队在基于质谱的糖蛋白质组学和糖组学方面展开了系统的研究。他们发展了一系列糖蛋白质/糖链富集和质谱定性的新方法，建立了基于复合纳米材料的富集新方法，基于新的共价反应的富集新策略，以及基于协同富集思路的富集新流程 建立了一系列糖蛋白质/糖链的质谱定量新方法，提出了酶促去糖链过程中的标记定量新方法和糖蛋白质组在蛋白质水平、糖基化程度水平及糖链水平的同时定量新方法等 开发了高通量糖蛋白质质谱检索的新算法等。这些工作提升了中国糖蛋白质组学和糖组学的研究水平，为糖蛋白质组学和糖组学研究提供了新的研究方法。

项目概况 超灵敏蛋白质组4维分离鉴定质谱系统 招标项目的潜在投标人应在上海市共和新路1301号C座110室获取招标文件，并于2022年02月10日 09:00（北京时间）前递交投标文件。一、项目基本情况项目编号：SHXM-00-20220120-1069项目名称：超灵敏蛋白质组4维分离鉴定质谱系统预算编号： 0021-W10796 预算金额（元）： 6650000 最高限价（元）： 6184500 / 采购需求： 包名称：超灵敏蛋白质组4维分离鉴定质谱系统 数量：1 预算金额（元）：6650000 简要规格描述或项目基本概况介绍、用途：带CCS值的淌度分离，可进行同分异构分离；（详见第八章） 合同履约期限： 合同签订后6个月内 本项目（ 不允许 ）接受联合体投标。二、申请人的资格要求：1.满足《中华人民共和国政府采购法》第二十二条规定；2.落实政府采购政策需满足的资格要求：国际招标3.本项目的特定资格要求： 1）具有独立的法人资格。2）投标人是专业生产本次所需设备的制造商，或由制造商指定一个代理商作为本次投标的唯一授权代理。3）投标人提供的投标机型应是原产地的全新产品。4) 投标人应当于招标文件载明的投标截止时间前在机电产品招标投标电子交易平台（网址：http://www.chinabidding.com）成功注册。否则，投标人将不能进入招标程序，由此产生的后果由其自行承担。5) 不接受联合体投标；6) 已购买本招标文件。 三、获取招标文件时间：2022年01月20日至2022年01月27日，每天上午09:30至11:00，下午13:30至16:00（北京时间，法定节假日除外）地点：上海市共和新路1301号C座110室方式： 邮件报名购买 售价（元）： 600 四、提交投标文件截止时间、开标时间和地点提交投标文件截止时间：2022年02月10日 09:00（北京时间）投标地点：上海市共和新路1301号C座111会议室开标时间： 2022年02月10日 09:00 开标地点：上海市共和新路1301号C座111会议室五、公告期限自本公告发布之日起5个工作日。六、其他补充事宜因新冠肺炎疫情，本次招标文件均采用邮件报名购买。有意向的投标人可从2022年1月20日起至2022年1月27日上午9:30至11:00,下午13:30至16:00（节假日除外），将公司基本信息发至crystal_wxjing@163.com、zhuchangliv@sina.cn邮箱，将标书款汇至招标公司账上并提供汇款证明。本招标文件每套售价为人民币600元或美元100元，标书售后不退（邮购须另加50元人民币或50美元）。七、对本次采购提出询问，请按以下方式联系1.采购人信息名 称：上海科技大学地 址：上海市浦东新区中科路1号联系方式：021-206851822.采购代理机构信息名 称：上海中招招标有限公司地 址：上海市静安区共和新路1301号C座110室联系方式：021-26065294、021-260652803.项目联系方式项目联系人：吴小晶、朱昌丽电 话：021-26065294、021-26065280

项目编号：0811-234DSITC0247项目名称：蛋白质组学质谱分析系统预算金额：790.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：790.0000000 万元（人民币）采购需求：蛋白质组学质谱分析系统/壹套（项目预算：人民币790万元，可以采购进口产品）合同履行期限：合同签订之日起至合同内容履行完毕止本项目( 不接受 )联合体投标。获取招标文件时间：2023年02月20日 至 2023年02月27日，每天上午9:00至11:30，下午13:00至16:30。（北京时间，法定节假日除外）地点：微信公众号“东松投标”方式：关注微信公众号“东松投标”，完成信息注册，即可购买招标文件售价：￥700.0 元，本公告包含的招标文件售价总和对本次招标提出询问，请按以下方式联系。1.采购人信息名称：同济大学地址：上海市四平路1239号联系方式：袁老师 021-659856142.采购代理机构信息名称：上海东松医疗科技股份有限公司地址：上海市宁波路1号申华金融大厦11楼联系方式：刘韵、王悦 0086-21-63230480转8606、86273.项目联系方式项目联系人：刘韵、王悦电话：0086-21-63230480转8606、8627

记者30日从中国农业科学院获悉，该院生物技术研究所联合国内多家单位共同绘制了水稻全景定量蛋白质组图谱。相关研究成果日前发表在国际期刊《自然植物》上。中国农业科学院 图一直以来，受限于蛋白质组技术的覆盖度和精度，人们对作物定量蛋白质组以及蛋白质表达的调控机制理解还不够深入。蛋白质是作物实现各种生物学功能的主要执行者，构建全景定量蛋白质图谱在阐释植物生长发育、逆境响应及代谢调控等方面具有重要意义。论文通讯作者、中国农业科学院生物技术研究所研究员梁哲告诉记者，科研人员利用质谱等技术，量化了水稻主要组织中超过15000个基因的蛋白质水平，鉴定了8964个蛋白质，并为另外7077个蛋白编码基因提供了蛋白质水平证据，从而绘制出水稻全景定量蛋白质组图谱。“本研究成功绘制了迄今为止首个作物全景定量蛋白质组图谱。此前的植物基因表达调控研究主要聚焦在基因组至转录组层面，建立了中心法则（生物体内遗传信息的流动方向）中转录本（RNA）到蛋白质这一关键环节的多组学研究策略。此次研究发现，蛋白质的表达量不仅受到转录过程的影响，还受到转录后修饰的调控。这一研究为水稻的基因功能研究提供了重要的蛋白表达量资源，为基于多组学数据的作物智能设计育种提供了新思路。另外，研究运用的定量蛋白质组的方法也给其他作物蛋白质组的深入研究提供了借鉴。”梁哲说。

2023年6月4日，ASMS会议中，赛默飞推出了基于全新质量分析器的Orbitrap Astral质谱仪，为生命科学质谱应用带来了未来的无限可能。蛋白质组学因其在理解生命科学中的重大意义及技术上对于质谱仪的高分辨率、高灵敏度、高质量精度以及定量准确性的全方位高要求，使得我们愈发得期待全新Orbitrap Astral质谱仪能够为蛋白质组学向更快、更深、更全面的发展提供帮助。而全新Orbitrap Astral质谱仪的表现如何呢？让我们用数据说话~在对于生命体的理解中，作为生命活动的最终执行者，蛋白质的重要性不言而喻；而蛋白的复杂性极高，在不同的物种、组织、细胞等层级中，它具有不同的时空表达特异性；在这些变化中，同样的蛋白可能会有不同的形态，而呈现中多种多样的功能；而这些变化可能发生在不同的细胞中，也可能发生在不同的细胞组分甚至是不同的蛋白复合物中。分析蛋白质的金标准技术是质谱技术，现代质谱技术应用于蛋白质组学的分析中，我们明确的有三个大的方向亟待改进：1. 检测通量，我们需要将检测的能力提升至上万个样品的大队列的水平；2. 更高的蛋白组覆盖度，我们期待在每次检测中都能够得到所分析样品更高的蛋白鉴定深度，从而鉴定与定量更多感兴趣的蛋白；3. 灵敏度，即在极低量的样品中如单细胞样品中即可获得最大蛋白组覆盖度的能力。赛默飞一直致力于多个质谱质量分析器的组合，期待它们能如同交响乐般的发出混合且和谐的声音，对于质谱仪而言，我们现在所使用的质谱仪无疑是非常强大的，以Orbitrap为例，它具有超高的分辨率、质量精度和动态范围，它一直支撑着我们走过了蛋白质组学的蓬勃发展的阶段，时代的脚步再一次来到了全新的Orbitrap Astral质谱仪，在这里，我们将在检测通量、蛋白组覆盖深度、灵敏度及精准定量等多个维度展示其超强悍的性能：图1：全新一代Orbitrap Astral质谱仪全面提升蛋白质组学分析能力首先，我们看检测通量的变化：现在我们的科学家们所拥有的的丰富的样品量与目前市面上的质谱所能提供的单日检测通量有着显著的矛盾，目前我们的质谱仪约能提供的单日最大检测通量约为48个样品，而Orbitrap Astral 创造历史的将这个值提升至每天180个样品，这使得蛋白质组学在分析中的限速步骤不再是质谱的通量；每天180个样品通量意味着我们的单个样品总梯度为8min，实际分离梯度为5.5min，超短的梯度能提供超过8000个protein group的鉴定深度！而如果使用略长的14.4min梯度，达到100SPD（单日检测样品量），可以得到单个样品9000个protein group的鉴定深度；而24min梯度60SPD，则可以得到单针超过10000个蛋白的鉴定；60min梯度就可以得到超过12000个蛋白的鉴定水平；超高的检测通量兼具鉴定深度，使得用户能更加游刃有余的根据其实验需求，在检测样品通量与样品鉴定深度之间寻求更好的平衡；更深的鉴定能力带来对于生物学功能的更深的认知，我们期待着全新一代Orbitrap Astral质谱仪带给我们更有趣的生物学发现！图2：全新一代Orbitrap Astral质谱仪兼具超高的检测通量与深度蛋白组覆盖能力（点击查看大图） TMT技术路线是定量蛋白质组学的重要方法之一，目前TMT的通量已经达到18-plex，而全新的Orbitrap Astral质谱仪，其结合了超高分辨率和动态范围的Orbitrap质量分析器与超高扫描速度及超高灵敏度的Astral质量分析器，分别执行一级与二级扫描，二级Astral质量分析器在m/z524时的分辨率约为8万分辨率（m/z130时分辨率约为5万），适用于分辨TMT的报告离子从而进行TMT定量。如果将TMT样品分为2个fraction，运行90min梯度，即可拿到8000个定量蛋白；按照TMT-18plex的通量，我们可以达到每天144个样品的检测通量；而如果我们使用4个fraction进行检测，则可以拿到超过10000定量蛋白。图3：全新一代Orbitrap Astral质谱仪为TMT定量检测注入全新动力（点击查看大图）其次，我们来关注蛋白组的覆盖度：更深的蛋白质组覆盖度一直是我们的追求，以目前的质谱技术，蛋白鉴定的最大深度在12000个蛋白附近，这个值与mRNA测序相当；其实我们如果想要使用质谱技术来实现目前的鉴定深度，要牵扯到很多步骤，一般需要进行离线分级后多针上机检测的操作，比如，我们可以首先运行一个77min的离线分离梯度，收集46个馏分，每个馏分33min梯度；消耗了34.5个小时，最终达到12000个蛋白的鉴定水平；人们用这种方法，这样的蛋白鉴定深度，得到了很多生物学信息，比如肿瘤细胞系的通路等，发现了很多关键蛋白；如果我们想把这样的技术路线用在真正的大规模研究上，它对机时的消耗过于巨大了，实验过程过于艰苦；而我们使用全新的Orbitrap Astral质谱仪，能够实现单针，60min色谱梯度的情况下，即可达到12000个蛋白的鉴定；那如果我们在Orbitrap Astral上也使用多次进样的方法，4.5小时我们就可以拿到超过15000个蛋白了，这也使得我们在历史上第一次无限接近于整个蛋白质组的鉴定深度。其一天内的鉴定通量达到了8个proteomes的水平，我们真正具备了处理大规模研究的能力。图4：全新一代Orbitrap Astral质谱仪为蛋白质组学带来前所未有的鉴定深度（点击查看大图） 在蛋白质组学中，除了常规的细胞裂解液样品，解决具有极大的动态范围的血液样品也是巨大的挑战。在180个SPD的通量下，未经高丰度去除的血浆样品可以达到600个蛋白的鉴定水平，若需要更深的覆盖度，经seer处理后的5个fraction长梯度可达到超过6000个蛋白鉴定深度。而使用30min梯度分析经富集的血浆样品（5个fraction单独进样），DIA方法更是能够重复定量样品里的4500多种蛋白。全新一代Orbitrap Astral质谱仪鉴定深度，使得我们的用户可以根据实验需要，在鉴定深度与通量之间寻求到平衡。图5：全新一代Orbitrap Astral质谱仪为血液样品研究带来新的可能（点击查看大图） 而后，我们来关注灵敏度：✦ ✦ ✦ ✦ 如今单细胞组学快速走进了人们的视野，要进行更深度、更高通量的单细胞蛋白质组学，对质谱的灵敏度提出了更高的要求。我们研究蛋白质组学，从来便是越深入越困难。而全新的Orbitrap Astral质谱仪，可以以极高的速率进行高动态范围的检测，同时兼具超高的灵敏度。在进行单细胞蛋白质组学的检测中，全新的Orbitrap Astral质谱使得我们可以以80个SPD的检测通量(18min梯度单针运行时间)的同时得到超过5000个蛋白的鉴定水平。这表明，使用全新的Orbitrap Astral质谱仪，我们可以在检测通量翻倍的同时，得到更高的蛋白鉴定能力，从而为单细胞蛋白质组学树立了新的标准。图6：全新一代Orbitrap Astral质谱仪为单细胞蛋白质组学树立新的标准（点击查看大图） 定量蛋白质组学不仅追求更高的鉴定能力，我们也同时迫切的需要更加精准的定量，从而为我们提供准确的差异蛋白信息，指导生物学研究。全新的Orbitrap Astral质谱仪具有在宽线性动态范围的基础上的精准的定量能力，如图7，在经过不同比例混样的样品比较中，Orbitrap Astral所产生的定量比值，均符合实际混样比例，提供了精准的定量比值。甚至即使是极低的拷贝数的蛋白(如200-3000个拷贝数)，Orbitrap Astral也能提供精准的定量值。图7：全新一代Orbitrap Astral质谱仪展现了精准的定量性能（点击查看大图）在拥有了强劲的性能后，我们还需要仪器能够更加稳健的运行：在仪器的鲁棒性测试中，进行了超过2200次进样，其间的QC数据均表现出优异的鉴定稳定性与重现性。图8：全新一代Orbitrap Astral质谱仪拥有优异的稳定性与重现性（点击查看大图）总 结赛默飞全新划时代的蛋白质组学工作流，为您的蛋白质组学研究提供无缝衔接的全面支持。新的时代，无比期待!图9：赛默飞全新划时代的蛋白质组学工作流 了解Astral高分辨质谱仪应用详情，请点击“血浆蛋白质组学的新标准”

回顾质谱的百年发展史，得益于机械、电子和计算机行业的不断创新，质谱仪的性能也在不断提升。而真正推动质谱实现飞跃的是那些偶然的革命性创新，即具有颠覆性的技术创新——创造全新的分析规模和能力水平。蛋白质组学的大规模分析亦是革命性创新所推动实现的，John Yates III便是实现这项工作的关键科学家之一。John Yates：I was instantly hooked when I first saw a mass spectrometer. 迷恋 | 与质谱的初见作为MudPIT (Multi-dimensional Protein Identification Technology) 与SEQUEST的发明者，John Yates为蛋白质组学技术带来了突破性的进展，而他的每一份成就离不开对质谱的热爱。Yates也在某次采访中直言，在他第一眼看到质谱时，就被“迷倒了 (instantly hooked)”！MudPIT与SEQUEST的发明者——John Yates据Yates回忆，当时他还是个本科生，看到质谱仪是怎么运作的那个瞬间，他惊呼：“这好酷！”；而当看到实验室里满满当当的计算机时，他又被其强大的数据处理能力所震撼。因此，1980年获得缅因大学 (University of Maine) 动物学学士学位的Yates，选择继续在本校攻读化学专业的研究生课程。在学习过程中，为了深入探究质谱法与蛋白质组学研究的关联性，实干派Yates联系了弗吉尼亚大学(University of Virginia)的Don Hunt（弗吉尼亚大学的化学和病理学系教授）。不久后，他收到了一封手写的邀请函，并就此开展了他在弗吉尼亚大学的研究。与此同时，Yates已经看到了质谱的潜力，并希望将其应用于蛋白质组学研究中，但受限于“无法通过人工对数据进行快速解析”。因此，他带领团队在1994年开发了质谱数据的翻译器——软件工具SEQUEST。 John Yates发明SEQUEST算法释放质谱的魅力 | “翻译器”SEQUEST某种程度上而言，SEQUEST的开发是一种必然。1990年，美国能源部 (United States Department of Energy) 和美国国立卫生研究院 (National Institutes of Health, NIH) 向美国国会 (United States Congress) 提交了人类基因组测序的联合计划。自那时起，数据库开始充满了DNA序列信息，用于挖掘数据生物信息学的相关算法也大量涌现。1994年是数据依赖型采集 (data-dependent acquisition, DDA) 的诞生元年，开创性成果SEQUEST也在这一年诞生，万众瞩目。作为自下而上蛋白质组学（自下而上法：对蛋白质进行酶解处理后，得到多肽进行分析) 检索程序的开山鼻祖，SEQUEST的开创不仅奠定了蛋白质组学研究的核心基础，使更多生命科学领域中的研究人员意识并认同蛋白质组学的价值，更向全世界展示了质谱的魅力与潜力。简单来说，SEQUEST是通过利用人类基因组学的信息来解释质谱的信息（即肽和蛋白)。在研究细胞中的蛋白时，得益于这个方法，研究人员不需要对每个蛋白进行纯化，只需要对整体蛋白进行剪切，再通过质谱分析其中的每一种蛋白，便可获得全部蛋白的信息。SEQUEST分析方法可分为四步：（1）对质谱数据进行压缩；（2）通过比对蛋白质数据库 (database)与实验质谱数据在分子质量层面的信息，匹配 (compare)可能的多肽序列；（3）将从数据库中得到的序列的预测片段离子与质谱信息进行比较，从而产生最佳匹配序列表；这个序列被用于进行打分和统计学运算，进而（4）得到分析结果。SEQUEST分析步骤这套方法不仅采用了彼时最前沿的技术，如求互相关性的快速傅里叶变换(fast Fourier transform, FFT)，还融入了作者在对质谱数据深入理解后的大胆假设，如对数据进行的系统归一化处理和多项经验打分权重等。SEQUEST提高了质谱技术的有效性和准确性，可以使关键性的生物和临床问题得以解决。自其开发以来，世界各地的研究人员对细胞器中的大部分蛋白质进行研究，根据正常和疾病状态中蛋白质表达差异进行“画像”，从而揭示疾病发生发展的机理。此外，这项工作也促进了蛋白质组学的大规模应用（将在下文进行介绍），他本人将其应用于确定单细胞生物体和哺乳动物细胞中蛋白质复合物成分的大规模研究中。一系列的其他软件亦在SEQUEST的影响下被开发，促进了蛋白质组在分子和细胞生物学研究中的各种应用，包括肽/蛋白的定性定量分析、翻译后修饰的鉴定、蛋白质结构动态研究等等。新战场 | 蛋白质大规模鉴定1998年，Yates提出鸟枪法蛋白质组学 (Shotgun proteomics)，以推动蛋白质组的大规模鉴定分析。这个思路来源于人类基因组草图的制作方之一——塞莱拉基因组公司 (Celera Genomics)。他们采用了彼时非常先进的基因测序技术：鸟枪法 (Shotgun)。这种方法跳过将基因组拆分、克隆的过程，直接将其打成小片段进行随机测序，就像拼图一样：我们把一块完整的拼图买回家，彻底打乱后，再开启游戏之旅。2001年，基于鸟枪法蛋白质组学的想法，John Yates团队开发了MudPIT技术，并将其成果发表于 Nature Biotechnology，文章题目为Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology。实现将鸟枪法应用于蛋白质组学是一件里程碑式的发展成就，其不仅颠覆了传统的蛋白质分析方法，还推动实现大规模分析。Yates带领团队开发MudPIT彼时应用最为广泛的蛋白质分析鉴定方法是二维聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Two-dimensional gel electrophoresis, 2D-PAGE)，该技术是通过等电点(isoelectric point, pI) 和分子量 (molecular weight, MW) 两个维度，对蛋白质进行鉴定，拥有高分辨率的特点。然而，2D-PAGE存在着一些难以克服的缺陷：（1）虽然该技术可以提供蛋白质的相对分子质量、等电点、表达丰度的相对量等信息，但它无法完成一些更为“精细”的任务，如低丰度蛋白质点的检测，极酸性和极碱性区蛋白质及高分子质量区蛋白质的分离等；另一方面，（2）这项技术自动化程度低，重复性差且耗时长；除此以外，（3）鉴定量和通量一直是这项技术的瓶颈。反观MudPIT，这是一种非凝胶技术，可以实现复杂蛋白质和多肽混合物中某一成分的分离与鉴定工作。首先，肽段先在二维液相色谱中被分离，然后再进入多维毛细管液相色谱中分离、而后进行串联质谱分析以及最后的数据库检索工作。该技术可对样品量较少的蛋白质进行快速分析，适用于蛋白质组学中大规模蛋白质的分离鉴定研究。Yates的文章将MudPIT较之2D-PAGE技术的优势全盘展示。他们完成了彼时鉴定量最大的蛋白质鉴定研究：从酿酒酵母 (S. cerevisiae) 的蛋白质组中分离鉴定了1484个蛋白质；作为对比，当时最大的基于2D-PAGE的蛋白质组学研究，仅鉴定出了流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenza) 蛋白质组的502个蛋白质。总体来看，MudPIT的灵敏度和动态监测范围都有了更大的进步，且应用范围更广、自动化程度高。因此，MudPIT也成为了二十世的最初的十年里，研究复杂生物样本中大规模蛋白质表达、定性和定量的强有力工具。制胜密码 | 创新与协作John Yates：I’ve become very intrigued with the concept of innovation.科研进展十分依赖于研究人员的高强度攻坚，及不断创新。他们需要不停地“刁难”自己、“刁难”别人，保持新方向、新想法的敏感度。Yates也一直非常希望更多的科学家可以在他的方法上继续创新。为了帮助各位科学家早日创新、淘汰自己的方法，Yates分享了自己的“创新书单”，希望大家一起从书中学习创新路径并得到启发，如Jon Gertner的 The Idea Factory（这是一部关于传奇科研机构——贝尔实验室的传记，其中共孕育了9位诺贝尔奖得主），以及Steven Johnson的 Where Good Ideas Come from（在这本书中，作者深入发明的创新自然史，对其进行跨越学科、领域的追踪，确定了创新的七种关键模式）。Yates也回忆道，在2003年与一家质谱制造商讨论合作时，他的第一个问题是“扫描速度可以更快吗？”也正是这个问题使得我们迎来了现在的升级版质谱仪。此外，当新设备准备落地时，Yates还会不断提出新的想法，与合作方商讨，寻找更优解。除创新以外，Yates还十分主张团队协作性，并先后培养出来70多位优秀的科学家。其中一位曾在Yates实验室进行博士后工作的研究员Michael Washburn（目前是美国堪萨斯大学医学中心肿瘤生物学教授）称，Yates使他深刻认识到建立一个多学科团队的必要性。因为质谱研究不是一场单机游戏，它极度需要跨学科的方法论，复合型人才的相互教导，才能解决研究瓶颈取得成果。因此，在当年与Yates一起开发出MudPIT后，Washburn在蛋白质组学研究领域继续开疆拓土，并以基于质谱来研究染色质重塑复合物而闻名。Michael Washburn成就、扎根 | 年轻的蛋白质组学SEQUEST 与 MudPIT 的开发，及其他杰出的科研成果奠定了Yates在蛋白质组学领域的泰斗地位，他也毫不意外地入选了 2011年 “2000-2010年全球顶尖一百位化学家”名单。John Yates入选2011年 “2000-2010年全球顶尖一百位化学家”名单此外，他于2019年获得ASMS质谱杰出贡献奖及 Khwarizmi 国际奖，以表彰他对蛋白质组学的贡献。蛋白质组学诞生（1997年）至今才二十余年。得益于全球科学家和HUPO的不懈努力，这个年轻的前沿学科已获得许多令人振奋、惊叹的里程碑式成果。未来，我们亦期待、欢迎有更多的年轻研究人员参与进来，一同以蛋白质组学为支点，揭示生命的奥秘，开创疾病治疗的新篇章。年轻科研力量的崛起是科技创新、发展的重要引擎。2015年，HUPO特设Early Career Researchers (ECRs）项目，以推动年轻科研人员对新知识、新思想和前沿科技创新的引领作用。具体而言，该项目的主旨为：（1）为ECR提供更多研究和交流平台，提高他们的科学知名度：HUPO设立稿件竞赛 (Manuscript Competition)，以便让杰出的年轻科学们展示自己最新工作成果；（2）为ECR策划职业发展相关活动，提高他们在学术界、工业界的竞争力：HUPO邀请来自不同科研、技术和商业领域的世界知名科学家，分享他们的科研经历与职业生涯；（3）提高蛋白质组学领域的公平性、多样性和包容性。参考资料1. Washburn, M. P., Wolters, D., & Yates, J. R. (2001). Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nature biotechnology, 19(3), 242-247.2. Proteomics goes global. Nature biotechnology, 24, 302–303 (2006). https://doi.org/10.1038/nbt0306-3023. Eng, K. J., McCormack, A. L., & Yates, J. R. (1994). An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society Mass Spectrometry, 5(11), 976–989.4. Yates, J. R. (2013). The revolution and evolution of shotgun proteomics for large-scale proteome analysis. Journal of the American Chemical Society, 135(5), 1629-1640.5. Vivien, M. (2013). Digging deep into proteomes. Nature Method, 10(1), 3.6. MICHGAN STATE UNIVERSITY. (n.d). Dr. Michael Washburn. Retrieved from https://bmb.natsci.msu.edu/about/awards/john-a-boezi-memorial-alumnus-award/dr-michael-washburn/7. Scripps Research. (2019). Chemist John Yates receives 2019 ASMS John B. Fenn Award for innovations that advanced mass spectrometry. Retrieved from https://www.scripps.edu/news-and-events/press-room/2019/20190614-yates-amsmaward.html

质谱组学云课堂 | 代谢组学、蛋白质组学双重盛宴来袭 蛋白质作为生命活动的功能执行者，使得质谱表征的蛋白质组学能够为生命活动提供更加贴近表型的解释，它为疾病致病机理发现、癌症的早期诊断及新型标志物研发、预后预测、精准分型、指导用药、临床样本数字化等均提供了准确全面的信息，是人类对抗疾病的一大利器。 代谢组学作为蛋白质组学的下游组学，同时也是环境暴露、治疗干预、生活习惯以及上游组学这一系列事件在人体的最终直观放大反应，也是更能直观反应生物体系的状态的组学，因此代谢组学的研究是精准医疗的重要一环。近几年，在学术前沿领域有众多的学者意识到代谢组学的重要性。赛默飞 × 华大基因赛默飞携手华大基因紧跟学术前沿，结合组学研究需求，推出基于Orbitrap在组学中的研究方案，助力组学技术的进展，紧跟热点，分享单细胞/微量样品、精准医学等相关应用。 代谢组学系列讲座 基于Orbitrap平台的代谢组学和脂质组学方案时间: 10月28日 15:00~16:30内容简介： 1. Orbitrap仪器原理、用于小分子组学的硬件优势 2. 用于小分子组学的主要软件Compound Discoverer和Lipidsearch介绍 3. 相关应用案例介绍吴珊湖，赛默飞世尔科技（中国）有限公司液质联用小分子领域应用工程师，主要支持LC-MS、LC-MSMS系列平台的应用开发，在小分子组学、杂质分析、中药定性等方面具有丰富的经验。肠道菌群与代谢组学关联分析时间: 10月28日 16:30~17:30内容简介： 1. 宏基因组/16S与代谢组关联分析方法 2. 宏基因组/16S与代谢组关联分析案例梅占龙，哥本哈根大学生物信息学博士，任华大基因质谱平台信息分析负责人。擅长代谢组学技术研究及生物信息分析，参与开发多款华大基因代谢组学分析流程。在代谢组学的应用上有丰富经验，与客户合作发表文章多篇。 扫码报名 医学蛋白质组学系列讲座 蛋白质组学在精准医学研究中的应用时间: 11月5日 15:00~16:00内容简介： 1. Orbitrap超高分辨质谱的发展及其在蛋白质组学领域的全面解决方案 2. 蛋白质组学技术在精准医疗领域的应用及进展齐英姿，赛默飞世尔科技大分子方向应用工程师，毕业于军事医学科学院国家蛋白质科学中心北京，一直从事蛋白质组学相关技术支持工作；2021年加入赛默飞世尔科技，具有丰富的蛋白质组学研究以及质谱数据分析相关经验。单细胞/微量样本的蛋白质组学技术时间: 11月5日 16:00~17:00内容简介： 1. 单细胞蛋白质组学技术的发展和现状 2. 单细胞和微量蛋白质组学技术的应用案例李思奇，哥本哈根大学生物化学博士，深圳华大基因质谱平台资深研发工程师。擅长蛋白质组学和质谱技术的开发与应用，负责多项实验技术的设计、搭建和优化，参与发表多篇SCI文章。 扫码报名扫描下方二维码即可获取赛默飞全行业解决方案，或关注“赛默飞色谱与质谱中国”公众号，了解更多资讯+

蛋白质是生命的物质基础，通过与不同生物分子间的相互作用在生物体内执行着各项重要工作，其功能与结构直接相关。因此，解析蛋白质及其复合物高阶结构对于深入理解蛋白质功能、生理现象及药物研发具有重要意义。过去的60余年，随着X-射线晶体衍射(X-ray)、核磁共振(NMR)以及冷冻电镜(cryoEM)等技术的出现和不断发展，蛋白质结构解析取得了长足发展。然而，如何在分析蛋白质时使其保持近似自然生理环境的非变性状态，对其动态、异质性、相互作用等属性的研究是结构生物学领域的热点和难点。　　质谱技术的不断发展使其在蛋白质结构表征领域发挥了越来越重要的作用。非变性质谱(native MS)兴起于20世纪90年代，是一种可以分析蛋白高阶结构的生物质谱方法。与传统的破坏蛋白质立体结构和弱相互作用力的方法不同，非变性质谱采用质谱兼容的近生理pH值的溶液体系(主要为醋酸铵)和更温和的电离方式，使生物大分子在气相中能够最大程度地保持自然折叠状态、非共价相互作用和相关的生物学功能。因此，非变性质谱可以提供分子质量、寡聚态、构象(折叠vs 去折叠)、异质性、配体结合、靶蛋白-小分子亲和力以及复合物中蛋白亚基的相互作用网络关系等更具生物学意义的重要信息，为蛋白质“序列-结构-功能”关系提供分子基础，已成为结构生物学不可或缺的互补工具,在生物制药、蛋白一配体、蛋白一蛋白复合物结构分析等诸多领域具有广泛应用。　　近年来,蛋白质结构研究领域经历着剧烈的技术迭代。2021年人工智能(AI) AlphaFol2横空出世,将蛋白质3D结构预测的精度从60%提升到90%以上,在给传统结构解析技术带来冲击的同时,也为结构质谱的发展提供了契机。　　未来,非变性质谱技术的发展需要简化样品处理,提升仪器的灵敏度、分析通量和鲁棒性,实现内源性蛋白复合物样本的直接或原位分析,推动其在生物医药表征、蛋白多聚态等领域的更广泛应用。非变性质谱技术与离子消度(MS)、自上而下串联解离(top-down)、电荷检测质谱(CDMsS)等创新联用技术和方法的不断开发及完善,将极大地提升结构信息的广度、丰富度及精确度,补充生物物理学方法缺失的结构信息。同时,非变性质谱与cryoEM1、氢完交换质谱(HDX-MS)、交联质谱等技术联用将更加常态化,这些实验数据与AI结构预测算法的进一步整合将有效解决蛋白及蛋白复合物结构预测存在的精度问题,推动结构生物学发展,助力新药研发。　　此外,非变性质谱技术的应用发展将更加关注:1)蛋白复合物结构一功能关系的研究,通过与计算机模拟(MD)、HDX-Ms、cryoEM等技术联用,揭示标志物蛋白在人类疾病发展过程中的作用,推动靶向药物设计和精淮医疗 2)通过研究小分子与靶蛋白的相互作用获取二者结合的亲和力信息,加速靶向药物筛选 3)翻译后修饰(PTMS)、突变等因素导致的蛋白高度异质性及其对蛋白或亚基折叠动力学、构象及构象变化、结合计量比等造成的结构和功能影响 4)蛋白与其他生物分子(配体、DNAA/RNA、金属离子等)之间的相互作用。　　李惠琳，中山大学药学院教授，博士生导师。主要从事生物大分子质谱新技术的开发及应用，其研究主要侧重于1)开发整合结构质谱技术，并对蛋白质机器结构、功能和动态变化及靶向药物作用分子机制进行深入研究2)开发middle-down/top-down蛋白质组学技术，探索蛋白翻译后修饰在生命过程中的调控机制。承担国家自然科学基金项目3项，荣获美国质谱学会颁发的Postdoctoral Career Development Award (2014) ，入选珠江人才计划(青年拔尖人才，2019)，其研究成果发表在Nature Chemistry, Analytical Chemistry, J. Am.Soc.Mass Spectrom.等杂志。　　"非变性质谱技术研究与应用"专栏共收录7篇论文,既介绍了非变性质谱技术的样品制备、离子源、质量分析器、联用技术等基础内容,也涵括了样品提取、样品引入、离子化及电荷操控等方式,以及在蛋白结构及构象解析、蛋白・蛋白相互作用等领域的应用,代表了国内非变性质谱技术的发展现状。希望本专栏能成为《质谱学报》广大读者颇有价值的科技文献,同时也希望更多的学者加入到非变性质谱研究领域,推动我国结构质谱技术的创新发展。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Microfluidic Platform for Time-Resolved Characterization of Protein Higher-Order Structures and Dynamics Using Top-Down Mass Spectrometry [1]，文章的通讯作者是北京大学生物医学前沿创新中心的王冠博教授和中国科学院深圳先进技术研究院的门涌帆副研究员。　　蛋白质的高阶结构和动力学特性对理解蛋白质的生物学功能和揭示其潜在机制至关重要。自顶向下质谱法(Top-down MS)在完整蛋白水平和肽段碎片水平都能获得结构信息。非变性Top-down MS可以分析蛋白质复合体的结构以及完成亚基鉴定和修饰分析。自顶向下氢/氘交换质谱(Top-down HDX MS)为构象或结合界面分析提供了高空间分辨率，并实现了构象特异性表征。微流控芯片可以为这些质谱工作流程的前端反应提供优越的平台。然而，目前大多数质谱微芯片装置是为Bottom-up或Top-down蛋白质组学设计的。本文中，作者提出了一种用于蛋白质高阶结构和动态Top-down MS分析的芯片设计策略。它适用于时间分辨的非变性质谱和HDX质谱，该设计旨在有效电离完整的蛋白质复合物，灵活控制多种反应物流动，并在较大的流速范围内精确控制反应时间在亚微升/分钟。本文通过对单克隆抗体、抗体-抗原复合物和共存蛋白构象等体系的分析来验证该装置的性能。　　TDK-MS(Top-down and kinetic MS)芯片的结构如图1A所示，该方法可以有效电离完整的蛋白质，包括单克隆抗体(mAb)和抗体-抗原复合物(图1 B, C)。　　图1. 完整蛋白质和蛋白质复合体在非变性条件下的高效电离　　虽然分析蛋白质组合化学计量学和监测构象变化需要保持蛋白质高阶结构和非共价相互作用的完整性，然而为了推导结构信息或在串联MS中展开蛋白质以提高碎裂效率，往往需要不同程度的变性来产生亚复合体，因此变性剂的浓度和变性的时间对变性程度至关重要。本文中，作者采用交错人字微结构(Herringbone microstructure, HM)(图2A, B)，并对其性能进行了评估(图2C−E)。如此高的混合效率为进一步微型化芯片混合模块提供了可能。在监测Mb的变性时，作者使用TDK-MS芯片和商用混合三通管平行混合holo-Mb溶液(5 μM)与乙腈(ACN)，并比较它们在混合比例变化时的响应(图2F)。TDK-MS芯片在非变性和变性条件之间切换的快速响应通过NIST mAb的变性得到了证明，在向NIST mAb溶液中添加甲酸后，响应时间小于5分钟(图2G)。　　图2. 高效混合和快速响应的流体控制　　微芯片的灵活通道设计允许引入独立控制的溶液。例如，尽管酸和有机溶剂都能诱导变性，但这两种变性剂同时存在时，对变性途径的影响是不同的。Mb和Hb是血红素蛋白，其中血红素基团分别非共价连接在1条多肽链和4条非共价组装链上，因此这是研究共存复合体解离动力学和亚基构象变化的理想模型。将5 μM holo蛋白溶液与ACN和FA按一定的混合比例依次混合，可以通过解离产物的出现和蛋白质离子电荷态分布的变化来表征复杂的解离和蛋白质的展开。在固定ACN浓度下，随着FA浓度从0.01增加到0.3% (v/v)，依次观察到的主要现象是血红素丢失、apo-Mb展开以及折叠的holo-Mb转化为展开的apo-Mb(图3A)。相比之下，在FA浓度恒定的情况下，当ACN从1增加到50%时，Mb主要表现为血红素损失，只有中等程度的apo-Mb展开，这可能是由于展开的部分迅速聚集(图3B)。　　图3. (A)增加FA浓度，固定ACN浓度和(B)增加ACN浓度，固定FA浓度时获得的Mb和Hb的质谱图。　　在HDX MS检测中，TDK-MS芯片提供了快速和有效的氘代及淬灭，精确控制HDX反应时间，并在2H-标记形式下高效电离完整蛋白质(图4)。　　图4. 2H标记完整的(A)Mb、(B)Hb α亚基和(C)Hb β亚基在不同反应时间下的HDX质谱图　　由于过大的流速不利于电离效率，并且有可能会增加堵塞或流动中断的风险，因此流速应保持在最佳范围内，这又限制了混合通道中HDX时间的可调节范围，从而影响了HDX动力学分析的灵活性。为了解决这一问题，作者设计了一个具有多个不同长度反应通道的混合模块，在不更换芯片的情况下，除了改变流速外，还可以通过通道切换在更大范围内调整反应时间。在原型芯片中，5个不同长度的通道可以在对蛋白质电离和流动稳定性都最优的流速下，产生从几秒到几分钟不等有效的HDX时间(图5)。　　图5. Top-Down HDX MS 分析　　本文中作者开发的策略将有利于生物大分子结构的精细分析，并有助于质谱微芯片的方法开发。

加州圣何塞（2011年2月5日）- 世界领先的科学服务商赛默飞世尔，今天宣布Thermo Scientific质谱仪持续推动蛋白质组学研究中的突破性进展，这一点由权威杂志Nature和Nature Methods近期的出版文章得以证实。Thermo Scientific质谱仪系统凭借其独特的功能，在10月2日至11月6日近一个月内出版的14篇重要文章中扮演了重要角色。 &ldquo 短期内出版的大量重要文章中均使用Thermo Scientific质谱仪，这表明我们在蛋白质组学的关键性挑战中提供了领先的技术，&rdquo 赛默飞世尔科技分析仪器部的首席技术主管，Ian Jardine说道。&ldquo 例如，很多研究者都开始享受最新Thermo Scientific Orbitrap Elite组合质谱仪的超高分辨率和速度带来的优势，极大丰富了从top-down蛋白质组学实验中获得的信息。&rdquo 在这些文章中，Thermo Scientific离子阱、三重四极杆和以Orbitrap为基础的质谱仪用于推动蛋白质组学中的重要进展：提高大规模top-down蛋白质组学研究中产生的信息量，提高同量异序标记方法的定量准确性，提高糖蛋白质组学效率，并加速目标定量研究的步伐。举例如下： Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics（《使用top-down蛋白质组学绘制研究模式下的完整蛋白质亚型》）是目前出版的最为成功的大规模top-down蛋白质组学研究文章。作者提出一种四维方法，采用Orbitrap EliteTM 和Thermo Scientific LTQ FT质谱仪在液相色谱（LC）时间尺度上，将分离能力和蛋白质组覆盖率提高了20倍。 MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics（《MS3减少同位素标签的多元定量蛋白质组学实验中的比率失真》）提出一种方法，可提高同位素标签实验定量数据的精确性。作者采用Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos质谱仪实现三级裂解（MS3），以减少同量异序离子的干扰。 Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging（《气相纯化利用同位素标签记实现准确的多元蛋白质定量》）一文提出一种方法，当使用同位素标签定量时可以减少干扰并提高结果。作者使用LTQ Orbitrap VelosTM质谱仪的电子转移解离（ETD）功能，减少母离子的电荷数。一旦电荷减少，离子之间的m/z不再重叠，因为在定量时不再彼此干扰。 Nature是一本出版最前沿研究的国际周刊，根据2010年期刊引证报告（Thomson Reuters, 2011），它是世界上被引用最多的多学科科学期刊。虽然大部分科学期刊都是专注于某个领域，而Nature是极少数出版一系列科学领域原创性研究文章的期刊之一。 欲了解更多赛默飞世尔科技质谱信息，请登录：http://www.thermo.com.cn/ms 。 赛默飞世尔科技蛋白质组学应用专题：http://www.thermo.com.cn/proteomics。 关于赛默飞世尔科技 赛默飞世尔科技（纽约证交所代码： TMO）是科学服务领域的世界领导者。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额120亿美元，员工约39000人。主要客户类型包括：医药和生物技术公司、医院和临床诊断实验室、大学、科研院所和政府机构，以及环境与过程控制行业。借助于Thermo Scientific、Fisher Scientific和Unity&trade Lab Services三个首要品牌，我们将创新技术、便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合，为客户、股东和员工创造价值。我们的产品和服务帮助客户解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战，促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。欲了解更多信息，请浏览公司网站：www.thermofisher.com

沃特世质谱技术研究人员Bob Bateman和John Hoyes荣获HUPO科学技术奖 沃特世公司（纽约证券交易所代码：WAT）近日于国际人类蛋白质组研究组织（HUPO）第15届国际大会上推出全新的数据采集模式SONAR™ ，该模式专为Xevo® G2-XS四极杆飞行时间（QTof）质谱仪（MS）而开发，提供全新的非数据依赖型采集（DIA）方案获取MS/MS数据。这项技术能够帮助分析科学家们提升实验室工作效率，同时让他们对生成的结果更有信心。借助SONAR数据采集模式，科学家们只需执行一次进样即可完成复杂样品中脂质、代谢物和蛋白质的定量和鉴定，免去了采用MS/MS方法分析时通常需要额外进行方法开发的麻烦。 沃特世在HUPO国际大会期间隆重介绍了这一新型MS采集模式。会议同时表彰了沃特世公司的高级质谱技术专家Bob Bateman和John Hoyes为推动质谱技术发展所作的杰出贡献。在现代蛋白质组学实验中，基于DIA的质谱技术是分析人员获取包含大量数据的样品谱图时常用的一项技术。随着蛋白质组学和脂类组学研究的不断发展，科学家们越来越追求针对性更强的实验，来定量分析特定的肽和蛋白质，这就需要进行额外的方法开发和重复分析。面对越来越复杂的样品，沃特世新推出的SONAR数据采集模式能够提供更丰富的信息，同时提升数据的清晰度。 沃特世公司的组学业务开发高级经理David Heywood表示：“如今的蛋白质组学研究已十分成熟，科学家们已经能够收集到蛋白质的大部分相关信息。现在，他们希望实现的目标是先针对某种蛋白质或特定的肽提出假设，然后采用靶向MS/MS定量方法就这种假设观点展开研究，而无需额外开发新的方法或实验。现在，借助SONAR数据采集模式，科学家们可以完成一站式分析并具有更高的选择性。这种模式可兼容高速UPLC分离，工作流程更加高效，通过一次进样即可完成更准确的定性和定量分析。” 沃特世科学家荣获HUPO国际大会表彰此次HUPO国际大会还向沃特世公司的技术研究顾问Bob Bateman和质谱技术总监兼首席科学家John Hoyes颁发了HUPO科学技术奖，以表彰他们为推动蛋白质组学研究技术发展与开发QTof质谱仪所作出的杰出贡献。 HUPO执行委员会在颁奖辞中表示：“QTof串联质谱仪在其问世初期对蛋白质组学的发展产生了巨大影响，这类质谱仪与纳升级液相色谱（LC）联用后，能够在蛋白质组分析中表现出无与伦比的性能。”Waters® （Micromass® ）Q-Tof™ 质谱仪自1996年进入市场以来不断进行技术创新，继上一次集成离子淌度分离技术之后，此次又增添了全新的SONAR MS数据采集模式。 SONAR为MS数据采集模式带来有效的性能提升SONAR在选择性方面实现的提升主要得益于质谱仪四极杆的运行方式。在SONAR模式下，四极杆并不会始终保持打开状态传输所有离子，而是扫描指定的质量范围，每次扫描可捕获200张谱图。这种四极杆运行方式让SONAR能够兼容快速的超高效液相色谱（UltraPerformance Liquid Chromatography® ，UPLC® ）分离，从而提高实验室分析通量。过去可能会发生色谱共洗脱的化合物现在可以通过四极杆实现分离并单独记录下来，数据库的搜索效率将随之得到提高。SONAR通过一次进样即可同时采集定量和定性数据。 HUPO国际大会于9月18日至22日在台北国际会议中心召开，期间将举办多场以SONAR技术为主题的研讨会。 SONAR数据可整合至Waters Progenesis® 和Symphony™ 软件分析工作流程，还可兼容Skyline等第三方软件包。由MassLynx® 软件控制的Waters Xevo G2-XS QTof质谱仪现已整合SONAR模式。 关于沃特世公司（www.waters.com）沃特世公司（纽约证券交易所代码：WAT）专注于为实验室相关机构开发和生产先进的分析和材料科学技术。50多年来，公司开发出一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术。

日前，由弗雷德哈钦森癌症研究中心(Fred Hutchinson Cancer Research Center)领导的一个国际研究小组证实了大规模、标准化蛋白质检测的可行性，这是验证疾病生物标志物和药物靶点的必要条件。这项刊登在《自然-方法》(Nature Methods)杂志上的最新论文表明，科学家们开发的一种靶向性蛋白质检测方法具有系统地、可靠地检测人类蛋白质组的潜力。 　　论文主要作者、癌症蛋白质组学专家 Amanda Paulovich 博士和同事们开发的这项技术，可同时准确地检测许多不同样本中成百上千种蛋白质的丰度。来自西雅图、波士顿和韩国等其他地区的实验室重现了人类乳腺癌细胞中 319 种蛋白质的检测结果，证实这种方法可跨越实验室和国界实现标准化。 　　Paulovich 表示：&ldquo 这种方法有潜力彻底改变我们检测人类蛋白质的方式。利用全球资源对所有人类蛋白质进行标准化定量设立一些新标准，无疑将能提高临床研究的可重现性，其将对转化新型治疗和诊断带来巨大的影响。&rdquo 　　作为所有生物功能的执行分子机器，蛋白质掌控着早期疾病和疾病进程的信号传导。探求癌症生物标记物&mdash &mdash 细胞中的蛋白质指纹有可能促使开发出一些测试方法，更早期地检测疾病，早在癌症形成之前鉴别出个体的特殊风险，以及更好地指导患者的治疗。然而没有标准化和可重现的方法来检测它们的水平，验证新发现的候选生物标记物是一件不可能的事情。 　　每个有前景的生物标记物都必须在临床试验中开展进一步的研究，这就要求研究人员能够检测数百到数千个患者样本中每个候选标志物的丰度。由于将任何一种候选标记物转化至临床应用的机率都极其的低，鉴别一种具有临床价值的生物标记物必须对大量的蛋白质进行测试。 　　Paulovich 表示：&ldquo 现在，你还不能对大多数的人类蛋白质进行大规模检测。在我们完成人类基因组测序，获得DNA分子全目录10多年之后，仍然不能够采用一种标准化定量方法在各种通量模式下对人类蛋白质组开展研究。&rdquo 　　为了解决这一问题，Paulovich 和同事们利用了一种称作为多反应检测质谱法(MRM-MS)的敏感性靶向蛋白质检测技术。这种质谱法并非是全新的技术，多年来全球的临床实验室利用它来测量药物代谢产物和与先天性代谢缺陷有关的一些小分子。最近，Paulovich和其他研究人员开始利用它来检测人类蛋白质。 　　采用研究人员开发的这种方法，每天每台仪器能够对最少 20 个临床样本中的 170 种蛋白质进行高度特异性地、精确地、多路定量分析 任何其他的现有技术都没有这种能力。 　　由于质谱技术是针对性的，这意味着研究人员能够调整设备寻找癌细胞或其他样品类型中特殊的蛋白质亚群，相比于非针对性策略，它可以在更低的水平上检测微量血液样本或活检标本中目的蛋白质的存在。 　　研究的主要作者、Paulovich 实验室分析化学家 Jacob Kennedy 说：&ldquo 我们的目标是用这一技术来取代当前采用的一些非常老旧的技术。&rdquo 　　当前，研究人员通常是采用 Western blotting、ELISA 或是免疫组化(IHC)技术来检测临床样本中的蛋白质水平。这些方法往往无法在实验室之间重现结果，从而很难验证适用于临床的候选生物标记物，它们不适用于一次检测大量的蛋白质和样本。 　　Paulovich 和同事们通过分析乳腺癌细胞生成的 300 多种已知蛋白质验证了他们的技术 研究结果表明，MRM-MS 可以重现及扩展以往采用其他技术进行乳腺癌研究所生成的观察结果。 　　该研究证实了，MRM-MS 能够以一种标准化方式一次检测许多的蛋白质，为开展国际性的、有组织的研究工作定量人类蛋白质中的每种蛋白奠定了基础。 　　原文检索： 　　Jacob J Kennedy,Susan E Abbatiello,Kyunggon Kim,Ping Yan,Jeffrey R Whiteaker,Chenwei Lin,Jun Seok Kim,Yuzheng Zhang,Xianlong Wang,Richard G Ivey,Lei Zhao,Hophil Min,Youngju Lee,Myeong-Hee Yu,Eun Gyeong Yang,Cheolju Lee,Pei Wang,Henry Rodriguez,Youngsoo Kim,Steven A Carr& Amanda G Paulovich. Demonstrating the feasibility of large-scale development of standardized assays to quantify human proteins. Nature Methods, 08 December 2013 doi:10.1038/nmeth.2763

阐明小分子（包括内源性代谢物和外源性化合物）如何发挥调控作用的关键问题之一是小分子的靶标发现和验证，即蛋白质-小分子相互作用研究。蛋白质与小分子的相互作用模式既有较稳定的共价结合，也有瞬时的弱相互作用。如何灵敏、高效地捕获并解析多种类型的蛋白质-小分子相互作用是分析难点。目前，蛋白质-小分子相互作用的分析策略大致可分为两类：一是靶向相互作用研究，以蛋白质（或小分子）为中心，发现并验证与之相互作用的小分子（或蛋白质）；二是非靶向相互作用研究，全面识别多种蛋白质-小分子的相互作用轮廓。应用的具有分析技术包括：表面等离子体共振技术（surface plasmon resonance，SPR）、氢氘交换质谱分析技术（hydrogen deuterium exchange mass spectrometry，HDX MS）、限制性蛋白水解-质谱分析技术（limited proteolysis-mass spectrometry，LiP-MS）、蛋白质热迁移分析技术（cellular thermal shift assay，CESTA）和药物亲和反应靶标稳定性分析技术（Drug affinity responsive target stability，DARTS）等。本期介绍限制性蛋白水解-质谱分析技术（LiP-MS）的原理、技术流程和其在蛋白质-小分子相互作用研究中的应用。1. 原理LiP-MS技术最初由瑞士苏黎世联邦理工学院的Paola Picotti课题组建立 [1] ：利用小分子结合蛋白后相较于原蛋白产生蛋白质空间构象和位阻的变化，经蛋白酶切后形成差异肽段，液质联用分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段推测蛋白质与小分子的相互作用位点。2. 技术流程在非变性条件下提取蛋白，以保留蛋白活性和空间结构。先使用低浓度（1:100, w/w）蛋白酶K在较低温度（25℃）下短时间内（5 min）对蛋白-小分子复合物进行有限的蛋白酶切。蛋白与小分子结合后，相互作用位点存在空间位阻，从而避免被蛋白酶K切割，由此产生差异肽段。随后进行蛋白变性和胰酶酶切，蛋白质组分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段所处位置预测蛋白质与小分子的相互作用位点（图1）。图1 限制性蛋白水解-质谱分析（LiP-MS）技术流程 [2]3. 试验试剂和分析仪器3.1 蛋白抽提：可依据实际目的和细胞类型选择不同的细胞/组织裂解液，如RIPA、N-PER、M-PER等，进行细胞/组织蛋白抽提，获得的细胞/组织全蛋白提取物可直接与目标小分子共孵育。3.2 蛋白酶切：关键的蛋白酶切试剂，例如蛋白酶K、胰酶等均有市售。3.3 分析仪器：目前多种类型的液相色谱-高分辨质谱联用仪均可用于蛋白质组学分析，已应用于LiP-MS的高分辨质谱仪包括，布鲁克、赛默飞、沃特世和SCIEX等品牌的飞行时间质谱、轨道阱质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱等。4. 应用实例研究人员基于LiP-MS技术在大肠杆菌中探索多种内源性代谢物和蛋白的相互作用模式 [1]，先采用凝胶过滤法除去大肠杆菌全蛋白提取物中的内源性代谢物，获得大肠杆菌全蛋白；随后将大肠杆菌蛋白与20个中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、6-磷酸葡萄糖、果糖-1,6-二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸等，见图2A）分别共孵育。基于LiP-MS流程发现，上述20个内源性代谢物可与大肠杆菌中1678个蛋白发生潜在相互作用，其中1447个相互作用是首次发现的（图2B）。作者将所发现的相互作用与在线数据库BRENDA对比（主要涉及酶的功能和代谢通路等信息），证明LiP-MS技术能够准确地识别已报道的蛋白-内源性代谢物相互作用，假阳性率低于6 %。图2 20个与中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（图A）及其在大肠杆菌中发生相互作用的蛋白数量（图B）[1]参考文献：[1] Piazza, I., Kochanowski, K., Cappelletti, V., Fuhrer, T.,Noor, E., Sauer, U., Picotti, P. A map of protein-metabolite interactions reveals principles of chemical communication. Cell, 2018, 172(1-2), 358-372.[2] Pepelnjak M, Souza N D, Picotti P. Detecting Protein–Small Molecule Interactions Using Limited Proteolysis–Mass Spectrometry (LiP-MS). Trends in Biochemical Sciences, 2020, 45(10), 919-920.

一、项目编号：SHXM-00-20220128-1029二、项目名称：超灵敏蛋白质组4维分离鉴定质谱系统三、中标（成交）信息 序号标项名称中标（成交金额）中标供应商名称中标供应商地址1超灵敏蛋白质组4维分离鉴定质谱系统RMB6184000SWIFT INTERNATIONAL LOGISTICS CO.,LIMITEDFLAT/RM38，BLK D 10/F,MAI TAK INDUSTRIAL BUILDING NO.221 WAI YIP STREET,KWUN TONG,KL,HONGKONG 四、主要标的信息 序号包名称标的名称品牌数量单价规格型号1超灵敏蛋白质组4维分离鉴定质谱系统超灵敏蛋白质组4维分离鉴定质谱系统布鲁克科技1套RMB6184000timsTOF pro2

近日，郑州大学第一附属医院杨静华教授团队与空军军医大学朱平教授团队、上海大学陈亮教授团队合作在国际顶尖学术期刊Science上发表了题为“Cysteine carboxyethylation generates neoantigens to induce HLA-restricted autoimmunity”的长篇研究论文。 该研究报道了一种泛蛋白修饰组学技术并发现了新型蛋白修饰和诱导限制性自身免疫。 自身免疫性疾病，如强直性脊柱炎 (AS)，机体的免疫系统对外来的抗原会做出相应的免疫应答，结果通常是将外来抗原清除，而对自身的成分通常也会发生无伤害作用的免疫应答。 一般情况下，基因可编码并翻译成蛋白质。但现有蛋白质测定技术却发现了很多与基因编码不同的氨基酸，研究者把这些现代技术检测不到的“非编码氨基酸”（ncAAs）称为人类蛋白质中的黑色物质。 非编码氨基酸包括天然蛋白质中各种形式的氨基酸修饰、变异和衍生物，可反映基因编码以外的蛋白质序列和结构的改变信息，并直接影响着蛋白结构、功能和调控。每一个非编码的氨基酸都可能是蛋白质维度上的疾病标记物和药物靶点，与人类疾病发生发展的分子机制密切相关。 杨静华教授团队经过多年研究，基于超高分辨蛋白质谱和国家超算平台，建立了一套泛蛋白修饰组学的搜索引擎，用于测定大队列人群蛋白质组中的ncAAs图谱。ncAA图谱包括基因编码以外的蛋白质结构信息，是人类疾病发生、发展及转归的分子基础。本研究采用泛蛋白修饰组学搜索引擎，测定了强直脊柱炎患者外周单核细胞的泛蛋白修饰图谱，发现了一系列与疾病相关的非编码氨基酸。论文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abg2482

近日，中科院大连化学物理研究所研究员王方军团队与南方科技大学教授田瑞军、副教授李鹏飞等人合作，利用193nm紫外激光解离—质谱装置，实现了免疫共受体CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域识别结合机制解析。相关研究成果发表在Cell Chemical Biology上。与常规毫秒级碰撞诱导质谱解离（CID）相比，5ns单脉冲193nm紫外激光解离（UVPD）可直接激发非变性蛋白质骨架共价键至高能态引发高效解离，激发解离速率提升6个数量级，位点解离效率和碎片离子产率与其局部非共价作用和微观结构密切相关，通过碎片离子和解离产率分析可同时获得蛋白质序列和结构信息。目前，193nm紫外激光解离质谱尚未商品化设备，仅在少数实验室有自主搭建设备。免疫共受体CD28是癌症免疫治疗的重要靶点，其胞质端酪氨酸磷酸化激活引起的下游蛋白识别结合机制尚不清楚。本工作中，研究人员采用光亲和质谱法发现CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域特异性结合；利用193nm紫外激光解离质谱对C2结合前后进行了全序列覆盖位点光解离效率的差异分析，发现了光解离效率显著下降的三个关键结合区域和核心识别位点K49、H63、R68；证明了高能紫外激光解离策略在蛋白质动态识别结构变化分析中的高灵敏度和单位点分辨高精度优势。团队通过交叉学科联合攻关，在大连相干光源搭建了193nm紫外激光解离-高分辨质谱装置，在前期工作中通过高能光子对多肽分子的高效激发解离实现了多磷酸化肽修饰位点精确定位和蛋白质组学规模化序列鉴定。相关论文信息：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2022.01.005

p style=" text-indent:28px" span style=" font-family:宋体" 近日，美国威斯康辛大学麦迪逊分校葛瑛团队借助布鲁克 /span span maXis II /span span style=" font-family:宋体" 电喷雾行时间串联质谱在自顶而下的蛋白质组学研究中取得了重大突破。相关研究成果发表在著名期刊“ /span span nature methods /span span style=" font-family:宋体" ”（ /span span IF=26.919 /span span style=" font-family:宋体" ）上，文章题目“ /span span A photocleavable surfactant for top-down proteomics /span span style=" font-family:宋体" ”。 /span /p p style=" text-indent:28px" span style=" font-family:宋体" 翻译后修饰的蛋白质在许多关键细胞中发挥着重要作用，因此对蛋白质组进行全面的分析，对于解释分子作为一个系统如何相互作用，以及了解细胞系统在健康和疾病中的功能至关重要。而基于 /span span top-down /span span style=" font-family:宋体" 质谱技术的蛋白质组分析是表征完整蛋白质组的新兴手段，它可以提供一个系统的、全局的、无偏差的、定量的蛋白质评估，包括相互作用，修饰，位置和功能方面的信息。 /span /p p style=" text-indent:28px" span top-down /span span style=" font-family:宋体" 质谱技术是将反相液相色谱（ /span span RPLC) /span span style=" font-family:宋体" 直接与 /span span MS /span span style=" font-family:宋体" 偶联来进行操作的，可以对来自于全细胞或组织裂解液的复杂混合物中的完整蛋白进行快速、灵敏的分析。然而，由于蛋白质组的高度复杂性和动态性，蛋白质组学依然面临着巨大的挑战。其中之一便是蛋白质溶解的问题，为了有效的从细胞或组织中提取蛋白质，提取缓冲液中通常含有表面活性剂。但是传统的表面活性剂与质谱不相容，它们的存在极大的抑制蛋白质的质谱信号，因此在质谱分析前要先除去表面活性剂。 /span /p p style=" text-indent:28px" span style=" font-family:宋体" 葛瑛团队针对这一难题，创造性的合成了可光降解的表面活性剂 /span span Azo /span span style=" font-family:宋体" 。并对其进行了一系列的质谱分析，来验证其作为表面活性剂在蛋白质组学中的优异性能。 /span /p p style=" text-align:center" & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp span style=" font-family:宋体" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/b918dc99-5c9a-4371-b153-1b8548915f5d.jpg" title=" 1_meitu_1.jpg" alt=" 1_meitu_1.jpg" width=" 579" height=" 102" style=" width: 579px height: 102px " / /span /p p style=" margin-top:8px margin-right:0 margin-bottom:8px margin-left:0 text-align:center" strong span style=" font-family:宋体" 图 /span span 1 Azo /span /strong strong span style=" font-family:宋体" 作用机理 /span /strong /p p style=" text-indent:28px" span style=" font-family:宋体" 首先在保证对蛋白质增溶的前提下，借助布鲁克 /span span maXis II /span span style=" font-family:宋体" 电喷雾质谱分析小分子蛋白质 /span span ubi /span span style=" font-family:宋体" 与 /span span 0.1% /span span style=" font-family:宋体" 表面活性剂的相容性质。结果表明，在所有被评估的表面活性剂中， /span span Azo /span span style=" font-family:宋体" 是唯一一种既能有效溶解蛋白质，又能与完整蛋白质的 /span span top-down /span span style=" font-family:宋体" 质谱分析相容的表面活性剂。 /span /p p style=" margin-top:8px margin-right:0 margin-bottom:8px margin-left:0 text-align:center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/7c38388f-f60e-4eea-ba33-92d4e4c80f54.jpg" title=" 8.jpg" alt=" 8.jpg" width=" 385" height=" 346" style=" width: 385px height: 346px " / /p p style=" text-align: center " strong span style=" font-family:宋体" 图 /span span 2 Azo /span span style=" font-family:宋体" 与常用表面活性剂的质谱相容性评价 /span /strong /p p style=" margin: 8px 0px text-align: center " img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/7da2baff-7569-4bd5-b574-f4bca40cfad0.jpg" title=" 9.jpg" alt=" 9.jpg" width=" 385" height=" 281" style=" width: 385px height: 281px " border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin: 8px 0px text-align: center " strong span style=" font-family:宋体" 图 /span span 3 /span span style=" font-family:宋体" 表面活性剂对心肌组织裂解液 /span span LC-MS /span span style=" font-family:宋体" 分析的影响比较 /span /strong /p p style=" text-indent:28px" span style=" font-family:宋体" 对 /span span Azo /span span style=" font-family:宋体" 在在线反相液相色谱和质谱联用（ /span span span RPLC-MS /span /span span span span style=" font-family:宋体" ）中自顶向下蛋白质组学中的应用 /span /span /span span style=" font-family:宋体" 进行评估，对比没有表面活性剂蛋白浓度和质谱信，使用 /span span Azo /span span style=" font-family:宋体" 时号均明显升高（ /span span b /span span style=" font-family:宋体" ）。在单一的 /span span RPLC-MS /span span style=" font-family:宋体" 运行中，在 /span span Azo /span span span style=" font-family:宋体" 存在的蛋白质缓冲液中 /span /span span style=" font-family:宋体" 观察到 /span span 663 /span span style=" font-family:宋体" 个独特的蛋白形式，而在无 /span span Azo /span span style=" font-family:宋体" 存在的蛋白质缓冲液中只观察到了 /span span 6 /span span style=" font-family:宋体" 个（ /span span c /span span style=" font-family:宋体" ， /span span d /span span style=" font-family:宋体" ）。此外，从三种液相色谱 /span span - /span span style=" font-family:宋体" 质谱联用的准确质量测量上，共检测到 /span span 2836 /span span style=" font-family:宋体" 种蛋白质形式（ /span span e /span span style=" font-family:宋体" ， /span span f /span span style=" font-family:宋体" ）。 /span /p p style=" text-align:center" span style=" font-family:宋体" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/3892f310-54a7-42e0-a5fc-3281847cecf7.jpg" title=" 10.jpg" alt=" 10.jpg" width=" 385" height=" 335" style=" width: 385px height: 335px " border=" 0" vspace=" 0" / /span /p p style=" margin: 8px 0px text-align: center " span & nbsp /span strong span style=" font-family: 宋体 " 图 /span 4 RPLC-MS span style=" font-family: 宋体 " ） /span Azo span style=" font-family: 宋体 " 在自顶向下蛋白质组学中应用 /span /strong /p p style=" margin-top:8px margin-right:0 margin-bottom:8px margin-left:0" span style=" font-family:宋体" 此外， /span span Azo /span span style=" font-family:宋体" 还能大大提高检测的深度，并显示出许多在对照样品中检测不到的蛋白质。 /span /p p style=" text-align:center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/d4e74520-0d11-49b0-aec3-4c991dc3f8f5.jpg" title=" 11.jpg" alt=" 11.jpg" width=" 385" height=" 320" border=" 0" vspace=" 0" style=" width: 385px height: 320px " / /p p style=" margin: 8px 0px text-align: center " strong span style=" font-family:宋体" 图 /span span 5 Azo /span span style=" font-family:宋体" 队翻译后修饰蛋白质的质谱分析 /span /strong /p p style=" text-indent:28px" span style=" font-family:宋体" 葛瑛团队还进一步证明 /span span Azo /span span style=" font-family:宋体" 能有效提取心肌组织及胚胎肾细胞的膜蛋白，并能够进行自上而下的蛋白质组学质谱分析。通过借助布鲁克用 /span span maXis II /span span style=" font-family:宋体" 电喷雾质谱对表面活性剂 /span span Azo /span span style=" font-family:宋体" 的质谱分析，验证了 /span span Azo /span span style=" font-family:宋体" 与 /span span MS /span span style=" font-family:宋体" 具有良好的相容性，能有效的增加蛋白质的溶解度，可用于高通量自顶向下的蛋白质组学。同时， /span span Azo /span span style=" font-family:宋体" 还是唯一一种能够有效溶解蛋白质，包括膜蛋白，而不阻碍下游自上而下的质谱分析的强表面活性剂。 /span /p p style=" margin-top:8px margin-right:0 margin-bottom:8px margin-left:0 text-indent:28px" strong span style=" font-family:宋体" 产品介绍 /span span -- /span span style=" font-family:宋体" /span /strong span style=" font-family:宋体" 布鲁克 /span span maXis II /span span style=" font-family:宋体" 电喷雾飞行时间串联质谱 /span /p p style=" text-align:center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/a9e5b405-9ff8-414d-8d4e-de35249fa535.jpg" title=" 0.jpg" alt=" 0.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong span style=" text-indent: 28px " span style=" font-family: 宋体 text-indent: 28px " 布鲁克 /span maXis II /span span style=" text-indent: 28px font-family: 宋体 " 电喷雾飞行时间串联质谱 /span /strong /p p style=" text-indent:28px" span style=" font-family:宋体" 布鲁克 /span span maXis II /span span style=" font-family:宋体" 电喷雾飞行时间串联质谱在广泛的应用领域展现出良好的性能和解决最具挑战性分析难题的能力， /span span maXis II /span span style=" font-family:宋体" 能同时提供全方位的性能指标。另外， /span span maXis II /span span style=" font-family:宋体" 提供电子转移解析 /span span (ETD) /span span style=" font-family:宋体" 功能，能够分析包括单克隆抗体亚基在内的整体大蛋白序列分析。可选功能“ /span span HighMass /span span style=" font-family:宋体" ”有利于表征大分子和天然状态的蛋白质复合物如抗体药物偶联物。 /span /p p style=" text-indent:28px" span maXis II /span span style=" font-family:宋体" 配备上最新的 /span span TOF /span span style=" font-family:宋体" 创新技术，使其在整合解决方案、灵敏度、光谱精确度和动态的范围方面处于领跑位置。来自于 /span span maXis II /span span style=" font-family:宋体" 的高质量数据，有准确的质量和真实的同位素模型 /span span (TIP) /span span style=" font-family:宋体" ，结合 /span span Bruker /span span style=" font-family:宋体" 公司的计算公式发现工具， /span span SmartFormula /span span style=" font-family:宋体" & #8482 和 /span span SmartFormula & nbsp 3D /span span style=" font-family:宋体" & #8482 ，确保提供最大程度的准确分子式。 /span /p p style=" margin-top:8px margin-right:0 margin-bottom:8px margin-left:0 text-indent:28px" span maXis II /span span style=" font-family:宋体" 最佳适用范围包括抗体表征 /span span ( /span span style=" font-family:宋体" 完整蛋白与亚基 /span span ) /span span style=" font-family:宋体" 、分析整蛋白和蛋白质组、蛋白复合物、小分子鉴定与定量，采用 /span span High Mass /span span style=" font-family:宋体" 可选功能，可以获取天然态质谱图，同时有电子转移解析 /span span (ETD) /span span style=" font-family:宋体" 功能 /span span ( /span span style=" font-family:宋体" 可选 /span span ) /span span style=" font-family:宋体" 。 /span /p p br/ /p

大家好，本周为大家分享一篇发表在Anal Chem上的文章，Native Ambient Mass Spectrometry Enables Analysis of Intact Endogenous Protein Assemblies up to 145 kDa Directly from Tissue [1]。该文章的通讯作者是来自英国伯明翰大学的Helen J. Cooper教授。非变性原位质谱（native ambient mass spectrometry, NAMS）是一种新型的自上而下质谱分析方法。它结合非变性质谱和原位质谱的优势，可直接在蛋白质及其复合物的生理环境中进行对其进行无标记表征。NAMS可提供蛋白质结构、空间及瞬时相互作用的信息，具有直接从组织中分析内源性蛋白质组装体的巨大潜力。但是，目前，NAMS仅成功应用于直接检测低分子量 (图 1. 离子图像和 HCD MS2光谱表明大鼠脑中蛋白质复合物的亚基解离。(a) H&E染色的连续组织切片的光学图像。标签：Ce,小脑；C，大脑皮层；CC，胼胝体；F，穹窿；V，侧脑室区；Mb，中脑；Me，髓质和脑桥；H，海马；Th，丘脑；Ht，下丘脑；BG，基底神经节；OR，嗅觉区域。(b) Nano-DESI 全扫描质谱，代表光学图像中标记为“(b)”的像素。（c，d）巨噬细胞抑制因子同源三聚体显示均匀分布。（e，f）PGAM1同型二聚体分布。（g，h）MDH2同型二聚体分布。此外，作者在大鼠肾脏中鉴定了四种同源二聚体蛋白组件（61.2-94.2kDa），包括ω-酰胺酶 (61.2kDa)、MDH2 (66.4kDa)、苹果酸脱氢酶1 (MDH1, 72.8kDa) 和α-烯醇化酶 (94.2kDa)，并将其成像（图2）。其中观察到的α-烯醇化酶为金属结合形式，每个亚基上结合了2个Mg 2+离子。图 2. (a)大鼠肾脏的H&E染色连续切片显示皮质(C)和髓质(M)组织。(b)在MSI期间获得的大鼠肾皮质组织中单个nano-DESI 像素的示例全扫描质谱。(c, d)α-烯醇化酶同型二聚体。(e, f)苹果酸脱氢酶1。(g, h) MDH2同型二聚体。(i, j) ω-酰胺酶。研究还从大鼠肝组织中鉴定出同型三聚体鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC，108.8kDa）和同型四聚体乳酸脱氢酶A（LDHA，145.4kDa）（图3）。其中，在全扫描模式下，nano-DESI可以检测到145.4kDa的LDHA的较弱信号。通过nano-DESI-PTCR MS2的进一步确认，检测到的物质确实为LDHA。图3. (a) 直接来自大鼠肝组织的完整OTC同源三聚体的nano-DESI-PTCR MS 2。(b) 完整OTC同源三聚体的nano-DESI-HCD MS2显示亚基质量为36.2kDa。(c)完整LDHA同源四聚体 (145.4kDa)的nanoESI-PTCR MS2。(d)完整LDHA 同源四聚体的nanoESI-HCDMS2。在此研究中，作者成功利用NAMS质谱分析方法，直接从组织中检测并鉴定出内源性蛋白质组装体，分子范围为37.0-145.4kDa，包括二聚体、三聚体以及四聚体。其中检测到的上限（145.4kDa）超出LESA MS报道的质量上限的两倍，比nano-DESI 报道过的质量上限高出100kDa。通过调整离子光学和高m /z的气体压力，或者后续仪器和方法的开发，NAMS有可能进一步突破145.4kDa的上限，检测到分子量更大的蛋白组装体。[1]Hale OJ, Hughes JW, Sisley EK, Cooper HJ. Native Ambient Mass Spectrometry Enables Analysis of Intact Endogenous Protein Assemblies up to 145 kDa Directly from Tissue. Anal Chem. 2022 Apr 12 94(14):5608-5614.[2]Hale OJ, Cooper HJ. Native Mass Spectrometry Imaging and In Situ Top-Down Identification of Intact Proteins Directly from Tissue. J Am Soc Mass Spectrom. 2020 Dec 2 31(12):2531-2537.

p style=" line-height: 1.5em " & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp 中国科学院计算技术研究所研究员贺思敏及其研究团队设计和实现了新一代开放式搜索算法Open-pFind，可提高质谱数据解析的数量与质量，有望成为蛋白质组学日常数据分析的主力工具。相关成果10月9日在线发表于《自然—生物技术》。 br/ /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/419b4d61-469e-48e0-baf9-3ef492f7ff8b.jpg" title=" 2018-10-12_165404.png" alt=" 2018-10-12_165404.png" / /p p style=" line-height: 1.5em " 　　质谱数据的低解析率直接影响着肽段和蛋白质鉴定数目和鉴定精度的提高。质谱数据解析率一直较低，是由于质谱数据中通常有大量存在意外修饰或发生意外酶切的肽段，传统的限定式搜索因搜索空间有限，通常无法对上述肽段进行有效检索。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　新一代开放式搜索引擎Open-pFind采用基于序列标签索引的开放式搜索流程，快速扫描蛋白质数据库并对部分高质量谱图进行鉴定。在此过程中，意外修饰、突变、半特异及非特异性酶切肽段均在引擎的搜索空间内。Open-pFind通过基于支持向量机的肽谱匹配重打分算法，挖掘数据中的特征信息，并据此进行第二次精细搜索。同时，Open-pFind集成了前端数据处理的pParse模块，对肽段母离子进行校准，并有效提取混合谱图，进一步提升了谱图解析率。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　在四组典型质谱数据集上，Open-pFind解析率均达到了70%~85%，比同类软件鉴定结果多出50.5%~117.0%。对于高质量的串联质谱图，Open-pFind甚至基本实现了完全解析。在搜索空间是常规引擎5个量级的基础上，Open-pFind的速度仍然是常规引擎的2~3倍，是同类开放式引擎的数十倍甚至上百倍。在超大规模人类蛋白质组数据集上，Open-pFind报告了超过12000种蛋白，且准确度远远超过以往常规分析结果。 /p p 　　 /p p br/ /p

近日，大连化学物理研究所生物技术研究部生物分子高效分离与表征研究组(1810组)赵群研究员和张丽华研究员等人与中国科学院精密测量科学技术创新研究院龚洲副研究员合作，提出了利用原位化学交联—质谱技术(in vivo XL-MS)，解码细胞中蛋白质动态结构的策略。该策略将AlphaFold2的结构作为先验信息，结合in vivo XL-MS数据与多种结构计算方法评估结构与交联信息的匹配度，重构了细胞内多种蛋白质，尤其是多结构域蛋白质和固有无序蛋白质(intrinsically disordered protein，IDP)的原位动态结构。为深入研究蛋白质在细胞微环境中发挥功能的分子机制提供技术支撑。活细胞内蛋白质的原位动态结构对于揭示其生物学功能至关重要。随着深度学习算法助力蛋白质结构预测的发展迭代，AlphaFold2实现了对蛋白质结构的全面预测，然而该方法对柔性区域的结构预测仍面临挑战。近年来，in vivo XL-MS以高通量、高灵敏，且对蛋白质纯度要求低等优势，在解析活细胞内蛋白质的原位动态结构方面展示出重要潜力。张丽华团队一直致力于in vivo XL-MS新技术研究，实现了蛋白质原位构象和相互作用的规模化解析(Anal. Chem.，2020；Anal. Chem.，2022；Anal. Chem.，2022；Anal. Chem.，2022；Anal. Chem.，2023；Angew. Chem. Int. Ed.，2023；Nat. Commun.，2023)。 　　本工作中，针对多结构域蛋白质，研究团队提出了将结构域作为整体，利用结构域间的XL-MS数据对细胞内蛋白质动态结构建模，实现了三种多结构域蛋白质——钙调蛋白、hnRNP A1和hnRNP D0在细胞内的动态结构表征。此外，针对IDP，研究团队提出了两种互补的结构表征策略：一是将XL-MS信息直接转换为距离约束用于IDP的结构计算，二是首先使用全原子分子动力学模拟进行无偏采样，然后基于XL-MS数据对采样结构进行评估和筛选。利用这两种策略，研究团队解码了高迁移率组蛋白HMG-I/Y和HMG-17在细胞内的动态系综构象。 　　上述成果以“Decoding Protein Dynamics in Cells Using Chemical Cross-Linking and Hierarchical Analysis”为题，于近日发表在《德国应用化学》(Angewandte Chemie International Edition)。该工作的第一作者是1810组博士研究生张蓓蓉。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国科学院青促会等项目的资助。

近日，大连化物所生物分子结构表征新方法研究组（1822组）王方军研究员团队与南方科技大学田瑞军教授、李鹏飞副教授等人合作，利用193nm紫外激光解离—质谱装置，实现了免疫共受体CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域识别结合机制解析。 与常规毫秒级碰撞诱导质谱解离（CID）相比，5ns单脉冲193nm紫外激光解离（UVPD）可直接激发非变性蛋白质骨架共价键至高能态引发高效解离，激发解离速率提升6个数量级，位点解离效率和碎片离子产率与其局部非共价作用和微观结构密切相关，通过碎片离子和解离产率分析可同时获得蛋白质序列和结构信息。目前，193nm紫外激光解离质谱尚未商品化设备，仅在少数实验室有自主搭建设备。　　免疫共受体CD28是癌症免疫治疗的重要靶点，其胞质端酪氨酸磷酸化激活引起的下游蛋白识别结合机制尚不清楚。本工作中，研究人员采用光亲和质谱法发现CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域特异性结合；利用193nm紫外激光解离质谱对C2结合前后进行了全序列覆盖位点光解离效率的差异分析，发现了光解离效率显著下降的三个关键结合区域和核心识别位点K49、H63、R68；证明了高能紫外激光解离策略在蛋白质动态识别结构变化分析中的高灵敏度和单位点分辨高精度优势。　　大连化物所王方军和肖春雷研究员通过交叉学科联合攻关，在大连相干光源搭建了193nm紫外激光解离-高分辨质谱装置，在前期工作中通过高能光子对多肽分子的高效激发解离实现了多磷酸化肽修饰位点精确定位（Chin. Chem. Lett.，2018）和蛋白质组学规模化序列鉴定（Anal. Chim. Acta.，2021）。　　相关研究结果以“Motif-dependent Immune Co-receptor Interactome Profiling by Photoaffinity Chemical Proteomics”为题，于近日发表于Cell Chemical Biology上。

p style=" text-align: left background: rgb(255, 255, 255) margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 蛋白质组学是对复杂生物样品中蛋白质结构和功能的大规模系统性研究，生物样本的高复杂性和不均一性为蛋白质组学研究带来了极大挑战。近年来，离子淌度与高分辨质谱的联合使用，使得蛋白质组学进入了4D新时代。4D-蛋白质组学是指在3D分离即保留时间（retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）这三个维度的基础之上，增加了第四个维度--离子淌度（mobility），根据离子的形态、大小进行分离（图1）。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 305px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/7b2a33cb-0815-40c6-b214-afc66996233a.jpg" title=" 图片1.png" alt=" 图片1.png" width=" 600" height=" 305" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: center text-indent: 0em " 图1. 新一代4D-蛋白质组学示意图 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 布鲁克推出的基于timsTOF Pro的4D-蛋白组学平台，采用了创新的TIMS（Trapped Ion Mobility Spectrometry，捕集离子淌度）技术和PASEF（Parallel Accumulation Serial Fragmentation，平行累积连续碎裂）采集模式（图2）。捕集型离子淌度TIMS是指离子在气流的推动下向前运动，将离子按大小和形状分开，在离子运动的反方向施加电场，阻滞离子的运动，将离子trap在特定的位置，然后逐渐降低电场，将离子由大到小逐个释放。timsTOF Pro使用了双TIMS结构，具有独特的PASEF扫描模式，离子在第一个TIMS部分中进行累积并聚焦，然后传输到第二个TIMS中，进行淌度分离和释放；同时第一段TIMS会重新进行新一批离子的累积；并且，四级杆对母离子的选择、碰撞池对离子的碎裂与TIMS中离子的释放同步进行，实现快速、高效的二级采集。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 279px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/60853c3f-0b18-48df-8afc-114acc2bc4ab.jpg" title=" 图片2.png" alt=" 图片2.png" width=" 600" height=" 279" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " 图2. timsTOF Pro的结构示意图 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 基于timsTOF Pro的4D-蛋白组学平台，具有鉴定深度、定量准确性、检测速度、仪器稳定性等性能的全面提升： /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp 具有色谱保留时间、离子淌度、质荷比、谱峰强度4维信息，显著提高对复杂样本的分离能力和谱图质量，促进了共流出组分的同分异构体区分； /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp 创新双TIMS设计，使离子的累积和淌度分离同步进行，带来近100%的Duty Cycle； /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp 离子碰撞截面积（CCS）值的准确、高重现性测量； /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp 灵敏度的革命性提升，适合微量样本的组学分析； /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp 超过100 Hz二级扫描速度； /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp 超级稳定的整体设计，能够保证长时间连续样本测试的稳定性，耐用性，易维护。 span style=" text-indent: 2em " & nbsp /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 基于timsTOF Pro的4D-蛋白组学平台不仅适合于蛋白质组的深度鉴定、定量分析，还适合于翻译后修饰的精准研究，临床大队列样本的快速检测，微量样本甚至单细胞蛋白质组研究、蛋白质复合体交联分析等。该平台发布两年多以来，已经得到越来越多的蛋白组学研究团队认可并开始使用此革命性技术，一方面，是因为过去两年多已经有大量的数据证明，timsTOF Pro的采集速度和灵敏度的同时提升大大突破了蛋白组学研究现有瓶颈，这提高了基础蛋白组学研究的水平；另一方面，timsTOF Pro灵敏度和扫描速度上的独特优势，意味着所以可以用更低的进样量和更短的色谱梯度鉴定到更多的蛋白，同时离子淌度的引入，更是大幅提高了数据的完整性和谱图的归属性，这些特点对基础蛋白组学研究向临床蛋白组学应用的转化至关重要。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" color: rgb(79, 129, 189) " strong 4D-蛋白质组学技术提高蛋白和多肽覆盖深度 /strong /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " strong 基于质谱技术的蛋白质组学研究方法在生命科学研究的各个领域都取得了傲人的成果，但由于蛋白质组学样本的自身复杂性（蛋白丰度的动态范围& gt 106）和目前质谱仪采集速度和灵敏度的局限性，低丰度蛋白鉴定异常困难，这让深度覆盖蛋白组学面临着巨大的挑战，提高蛋白质组学覆盖深度一直是科研工作者努力的方向之一。 /strong /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 4D组学质谱平台timsTOF Pro的出现，让蛋白组学技术产生了革命性的变化，timsTOF Pro采用双TIMS结构，并采用独特的PASEF扫描模式，可以提供超过100 Hz的MSMS扫描速度，能使二级采集速度和灵敏度同时提高，这个特性可以完美应对传统质谱在采集速度和灵敏度方面的挑战。timsTOF Pro出色的灵敏度，只需要传统分析十分之一的进样量，就可以得到更好的鉴定深度（图3），这让timsTOF Pro更加适合生物标志物研究、药物发现、临床蛋白组学研究和单细胞蛋白组学等这些样本量通常会比较少的应用。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 258px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/c49572a1-0f8c-4b8e-ad7e-510ac1369573.jpg" title=" 图片3.png" alt=" 图片3.png" width=" 600" height=" 258" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " 图3. timsTOF Pro的蛋白水平和多肽水平深度覆盖 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" color: rgb(79, 129, 189) " strong 4D-蛋白质组学技术带来更精确的翻译后修饰组学研究 /strong /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 蛋白质翻译后修饰（如磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化和泛素化等）通过动态调控蛋白的结构和功能，参与信号传导、基因表达、物质代谢等多种生命活动，成为了科研工作的关注焦点。近年来，随着样品制备手段和质谱技术的快速发展，翻译后修饰的研究方法不断涌现。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 传统的质谱分析技术在蛋白质翻译后修饰研究中常面临着巨大的挑战： /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp 蛋白质的翻译后修饰在样本中含量低且动态范围广； /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp 应用于蛋白质翻译后修饰的研究策略主要还是基于鸟枪法的蛋白组学，酶切极大提高了样本复杂度； /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp 由修饰位点不同带来的同分异构多肽会在色谱上存在严重的共洗脱问题，而这些同分异构肽段在传统蛋白组学质谱平台上不能得到有效分离。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 由于翻译后修饰分布广泛且含量较低，往往需要进行修饰肽段的富集，所得到的样本量较少，需要灵敏度更高的仪器进行检测；此外，翻译后修饰位点、修饰类型的确认，对于蛋白功能的解析至关重要。布鲁克推出的4D-蛋白组学平台timsTOF Pro，提高了峰容量和修饰位点异构鉴定的可信度，具有大于100Hz的扫描速度和优越的灵敏度，显著提高了翻译后修饰的鉴定深度和位点鉴定的准确性（图4）。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 265px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/5bfed120-716a-48f7-b0e9-9801dd628a74.jpg" title=" 图片4.png" alt=" 图片4.png" width=" 600" height=" 265" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em " 图4. 磷酸化组学分析。A.& nbsp 50-100 ug起始蛋白量进行IMAC富集，采用不同色谱梯度，单针分析磷酸化多肽鉴定数目。B. 离子淌度可以准确区分修饰位点异构，提高修饰鉴定和定量的可靠性。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" color: rgb(79, 129, 189) " strong 4D-蛋白质组学加快组学研究向临床应用转化 /strong /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 蛋白质组学不仅是研究生命活动、疾病机理的最有效方法之一，而且在对癌症、老年痴呆等人类重大疾病的分子诊断和临床治疗方面也有十分广阔的前景。随着样本制备、色谱分离和质谱技术的进步，临床蛋白组学渐渐开始走向大队列研究，矩形研究策略则是趋势。高通量蛋白组学则成为了生物医学基础研究和应用开发的重要前沿和突破口，而如何实现对大队列样本稳定可靠地分析也逐渐成为了科研热点和难点。总的来说，实现高通量临床蛋白组学面临如下挑战： /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp 蛋白质组学样本自身的复杂性和不均一性（蛋白丰度的动态范围& gt 106），使得低丰度蛋白鉴定和定量异常困难； /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp 目前质谱仪采集速度和灵敏度的局限性，使得短梯度下难以实现蛋白深度覆盖； /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp 大队列样本分析对高通量方法和仪器稳定性提出了很高的要求。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 基于timsTOF Pro的4D-蛋白组学平台具有更快的扫描速度、更高的灵敏度和更好的离子选择性，显现出了向临床转化的广阔前景。布鲁克应用专家以及timsTOF Pro的用户做了大量工作，开发了多个成熟的高通量样本检测的应用方案，以探索蛋白组学技术用于临床研究的可能。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 布鲁克nanoElute LC为timsTOF Pro质谱标配的纳升流液相，采用短梯度色谱方法（图5A）28.8min一个循环，单针进样200ng的HeLa平均可以鉴定4180种蛋白质（图5B），26000条多肽（图5C），30针重复的相关系数R& gt 0.97（图5D）。这些结果表明，此方法与timsTOF Pro的高扫描速度和灵敏度结合，能同时兼顾分析通量和蛋白覆盖深度。我们将此方法用于多组份样本分析，小于12小时即可完成24个组份分析（图5E），HeLa样本24个组份可以鉴定大于9000种蛋白质，小鼠小脑样本24个组份可以鉴定大于10000种蛋白质。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 359px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/999652fb-442b-4b16-bebd-29d5867ff800.jpg" title=" 图片5.png" alt=" 图片5.png" width=" 600" height=" 359" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " 图5. 基于nanoElute短梯度高通量方案 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" text-indent: 2em " 布鲁克与Evosep公司合作，联合推出用于临床蛋白质组学研究的整体解决方案，timsTOF Pro出色的扫描速度和灵敏度与Evosep One LC强大的分离能力和稳定性完美适配。英国牛津大学纳菲尔德医学系Roman Fischer教授，采用这套系统进行临床大队列的的血液蛋白组研究，用于快速发现疾病标志物。将收集的192例血浆样本去除12个高丰度蛋白，在timsTOF Pro与Evosep液相平台上使用11.5分钟梯度（100例样品/天）分析，样本测试中插入20针QC样本进行质控，总计212个样本仅需51小时测试时间（图6A），这项工作采用传统的质谱方案可能需要接近10天。实验结果显示，采用4D Match Between Runs，192个样本中，可以对500个蛋白进行定量分析，并且CV值小于10%，而QC样本的CV值小于5%（图6B、6C）。 /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " & nbsp /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/7c042971-4e8a-4eca-ae3c-d7e819e5b0f9.jpg" title=" 图片6.png" alt=" 图片6.png" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " 图6. & nbsp Roman Fischer教授采用的临床血液蛋白组研究案例 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " & nbsp /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 创新的4D-DIA非标记定量技术：dia-PASEF@ /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 布鲁克与苏黎世联邦理工学院、德国马普研究所和多伦多大学合作，将PASEF与DIA（Data-Independent Acquisition，数据非依赖采集）的优势相结合，产生了一种新的采集模式称为dia-PASEF@（图7）。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " & nbsp /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/5d5aae78-f80d-488e-a9e9-da3eab36fa54.jpg" title=" 图片7.png" alt=" 图片7.png" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " 图7. 全新dia-PASEF@采集策略 span style=" text-indent: 2em " & nbsp /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 在dia-PASEF@扫描模式中，母离子在进入四级杆之前已经通过淌度进行了累积和分离，根据碰撞截面积（CCS）大小依次洗脱（与m/z有一定相关性），这样四级杆就可以根据洗脱离子的m/z进行离子选择，并且每批PASEF都会有多个窗口进行扫描，从而提高离子的利用率，避免了传统DIA方法中离子利用率低的问题。此外，使用离子淌度和质量数双重隔离窗口来触发MS/MS，提高了母离子选择和匹配的准确性，并降低了二级混合谱图的复杂性。并且在一级热图中，可以选择多电荷区域作为dia-PASEF@的母离子窗口，有效屏蔽单电荷杂质的干扰。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 306px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/df424259-85f1-478c-8cd3-dc81f106d619.jpg" title=" 图片8.png" alt=" 图片8.png" width=" 600" height=" 306" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " 图8. dia-PASEF@进行高通量、微量样本的蛋白质组定量分析 span style=" text-indent: 0em " & nbsp /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " dia-PASEF@具有更深的蛋白质组覆更高的分析通量和更优异的灵敏度，适合于高通量、微量样本的蛋白质组定量分析。采用95min梯度，单针进样200ng的HeLa，利用dia-PASEF@可以鉴定超过7,600种蛋白质、66,000种肽段。采用不同长度的梯度，30min可以鉴定6395个Hela细胞蛋白、4032个Yeast蛋白，达到快速、深度覆盖。即使在微量样本时，如单针进样10ng的Hela，仍能鉴定3000种蛋白质。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 布鲁克在ASMS 2020发布了高通量dia-PASEF@方案（图9A），即将Evosep One LC与timsTOF Pro再次联合，最大程度发挥Evosep One LC快速分离和timsTOF Pro扫描速度和稳定性的优势。该方案目前有4种方法（图9B），分别采用4.8min、7.2min、14.4min和24min色谱方法，对应的每天可以分析300、200、100和60蛋白质组学样本，把蛋白组学分析通量提升到一个全新的高度。分析结果（图9C，9D）显示出此方案在保证分析通量的同时，蛋白覆盖深度也有很好的保证，4.8min的分析单针可以鉴定2158蛋白，24min可以得到与传统蛋白组学长梯度分析相当的结果。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 284px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/fb3f5696-51bb-453a-8e70-cf3ba53b5151.jpg" title=" 图片9.png" alt=" 图片9.png" width=" 600" height=" 284" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " 图9. 高通量dia-PASEF@方案 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 英国牛津大学Roman Fischer教授采用高通量dia-PASEF@方案，进行血液蛋白质组学大队列研究，43天完成4300针连续进样，总共采集2.5亿张二级谱图，整个采集过程只需一次离子传输管清洗（图10）。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 324px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/4ca80514-f97a-4b36-b172-fa4ce1cf4a03.jpg" title=" 图片10.png" alt=" 图片10.png" width=" 600" height=" 324" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " 图10. Roman Fischer教授采用dia-PASEF@技术进行大队列研究 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 创新的4D-PRM靶向定量技术：prm-PASEF@ /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 在布鲁克的革命性timsTOF Pro平台上，通过将PASEF与平行反应监测（PRM）相结合，使其非标记靶向蛋白质组学性能得到了进一步增强。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " prm-PASEF@技术在保持高灵敏度的同时，使靶向离子数目最大化，100ms的PASEF扫描时间可以靶向10个以上的肽段，有效离子利用率提高10倍以上，实现了谱峰上采集点数目最大化，显著提高数据的完整性（图11A）。prm-PASEF@技术根据色谱流出时间、淌度、质荷比以及碎片离子的分辨能力进行离子筛选，具有更好的选择性，定量更加准确（图11B）。此外，来自卢森堡健康研究所Antoin Lesur教授采用prm-PASEF@技术在细胞样本里30min梯度检测213种靶向肽段，在5amol到50fmol范围都可以准确定量，具有优秀的灵敏度（图11C）。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 428px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/4aa99cb0-4e1d-46da-87c1-f588c4faa99a.jpg" title=" 图片11.png" alt=" 图片11.png" width=" 600" height=" 428" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " 图11. prm-PASEF@进行靶向蛋白质组定量分析 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 综上，捕集型离子淌度技术引领蛋白质组学进入4D新时代，基于timsTOF Pro的4D-蛋白质组学平台在蛋白质组分析方面展现出极佳的灵敏度、采集速度和覆盖深度，有利于实现更精确的翻译后修饰分析、高通量的临床大队列样本分析。新开发的dia-PASEF@和prm-PASEF@离子利用率高，具有更高的鉴定深度和定量准确性。随着布鲁克和合作团队对蛋白组学方案的不断开发，4D-蛋白质组学必将越来越完善，展现出更加广泛的应用前景。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " & nbsp & nbsp /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 参考文献 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp Antoine Lesur, et al.,& nbsp New prm-PASEF for highly multiplexed targeted acquisition in clinical samples. ASMS 2020, Poster TP470. /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp Christopher M. Adams, et al.,& nbsp Identification and Quantitation of Phosphopeptide PositionalIsomers using Trapped Ion Mobility Spectrometry and PASEF. ASMS 2019, WP 662 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp Florian Meier,& nbsp et al.,& nbsp Online Parallel Accumulation–Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Molecular & amp Cellular Proteomics, 2018,17(12),2534-2545. /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp Florian Meier,& nbsp et al.,& nbsp Parallel Accumulation–Serial Fragmentation (PASEF): Multiplying Sequencing Speed and Sensitivity by Synchronized Scans in a Trapped Ion Mobility Device. J. Proteome Res. 2015, 14,12, 5378-5387 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp Matthew Willetts，et al.,& nbsp High Sensitivity PTM Characterization in Complex Cell Lysates Using Trapped Ion Mobility. ASMS 2019, Poster TP630 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp Shourjo Ghose，et al.,& nbsp Analysis of Histones from HEK293T Cells using a QTOF with Trapped Ion Mobility and PASEF Workflows. ASMS 2019, Poster TP642 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp Stephanie Kaspar-Schoenefeld,& nbsp et al.,& nbsp High throughput 4D-Proteomics – Application of dia-PASEF & reg and the Evosep One for short gradients. App Note 1867805 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp Thomas Kosinski,& nbsp et al.,& nbsp Maximized throughput and analytical depth for shotgun proteomics using PASEF on a TIMS equipped QTOF. ASMS 2018, TP 685 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp Thomas Kosinski,& nbsp et al.,& nbsp Plasma proteomics goes high throughput-timsTOF Pro with PASEF and 4D feature alignment to quantify 500 plasma proteins in 11.5min. App Note 1867805 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " · & nbsp Thomas Kosinski,& nbsp et al.,& nbsp Short nanoLC gradients optimize throughput on a tims equipped QTOF with PASEF, ASMS 2019, TP 514.& nbsp /p

Fig. 1: View of the SuperMaMa laboratory at the University of Vienna. The hanging gold-plated insert is the radiation shield behind which the superconducting nanowire detectors are installed. C: Quantennanophysik @ Universität Wien　　Fig. 2: Counting single proteins with a superconducting nanowire. The background and nanowire are altered in Photoshop with the Generative Fill AI. (Human Insulin PDB:3I40). C: CC BY-ND 4.0 Quantum Nanophysics University of Vienna.　　据奥地利维也纳大学(University of Vienna, Boltzmanngasse, Vienna, Austria.)2023年12月4日提供的消息，由维也纳大学量子物理学家马库斯阿恩特(Markus Arndt)领导的国际研究团队在蛋白质离子检测方面取得突破：超导纳米线探测器凭借其高能量灵敏度，实现了蛋白质离子检测的突破(Quantum physics: Superconducting Nanowires Detect Single Protein Ions)。几乎100%的量子效率，比传统离子探测器在低能量下的探测效率高出1000倍。与传统探测器相比，它们还可以通过冲击能量来区分大分子。这允许更灵敏地检测蛋白质，并提供质谱分析中的附加信息。这项研究的结果于2023年12月1日已经在在《科学进展》(Science Advances)杂志网站发表——Marcel Straus, Armin Shayeghi, Martin F. X. Mauser, Philipp Geyer, Tim Kostersitz, Julia Salapa, Olexandr Dobrovolskiy, Steven Daly, Jan Commandeur, Yong Hua, Valentin Köhler, Marcel Mayor, Jad Benserhir, Claudio Bruschini, Edoardo Charbon, Mario Castaneda, Monique Gevers, Ronan Gourgues, Nima Kalhor, Andreas Fognini, Markus Arndt. Highly sensitive single molecule detection of macromolecule ion beams. Science Advances, 1 Dec 2023, Vol 9, Issue 48. DOI: 10.1126/sciadv.adj2801. https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adj2801　　参与此项研究的除了来自维也纳大学的研究人员之外，还有来自奥地利科学院(Austrian Academy of Sciences, Boltzmanngasse, Vienna, Austria)、荷兰MSVision(MSVision, Televisieweg 40, 1322 AM Almere, The Netherlands)、荷兰单量子(Single Quantum, Rotterdamseweg 394, 2629 HH, Delft, The Netherlands) 瑞士巴塞尔大学(University of Basel, St. Johannsring 19, CH-4056 Basel, Switzerland)以及瑞士洛桑联邦理工学院(école Polytechnique Fédérale de Lausanne简称EPFL, Rue de la Maladière 71b, CH-2002 Neuchatel, Switzerland)的研究人员。　　大分子的检测、识别和分析在生命科学的许多领域都很有趣，包括蛋白质研究、诊断和分析。质谱法通常用作检测系统即一种通常根据带电粒子(离子)的质荷比分离带电粒子(离子)并测量检测器生成的信号强度的方法。这提供了有关不同类型离子的相对丰度的信息，从而提供了样品组成的信息。然而，传统探测器只能对具有高冲击能量的粒子实现高探测效率和空间分辨率——这一限制现已被使用超导纳米线探测器的国际研究团队克服。　　低能粒子的合力(Joined forces for low energy particles)　　在当前的研究中，由维也纳大学与代尔夫特的单量子、EPFL、MSVision和巴塞尔大学的合作伙伴协调的欧洲联盟首次展示了超导纳米线的使用所谓的四极杆质谱(quadrupole mass spectrometry)中蛋白质束的优秀检测器。待分析样品中的离子被送入四极杆质谱仪并进行过滤。“如果我们现在使用超导纳米线而不是传统探测器，我们甚至可以识别以低动能撞击探测器的粒子，”维也纳大学物理学院量子纳米物理小组(Quantum Nanophysics Group at the Faculty of Physics at the University of Vienna)的项目负责人马库斯阿恩特 (Markus Arndt) 解释道。这是通过纳米线探测器的特殊材料特性(超导性)实现的。　　借助超导技术实现这一目标(Getting there with superconductivity)　　这种检测方法的关键是纳米线在非常低的温度下进入超导状态，在这种状态下它们失去电阻并允许无损电流流动。进入离子对超导纳米线的激发导致返回到正常导电状态(量子跃迁)。在此转变期间纳米线电特性的变化被解释为检测信号。“通过我们使用的纳米线探测器，”第一作者马塞尔 施特劳斯(Marcel Strauß / Marcel Straus)说，“我们利用了从超导到正常导电状态的量子跃迁，因此可以比传统离子探测器性能高出三个数量级。” 事实上，纳米线探测器在极低的冲击能量下具有显著的量子产率-并重新定义了传统探测器的可能性：“此外，配备这种量子传感器的质谱仪不仅可以根据分子的质量到电荷状态来区分分子，还可以根据分子的动能对它们进行分类。这改善了检测并提供了更好的空间分辨率的可能性，”马塞尔施特劳斯说道。纳米线探测器可以在质谱、分子光谱、分子偏转或分子量子干涉测量中找到新的应用，这些领域需要高效率和良好的分辨率，特别是在低冲击能量下。图 2(Fig. 2)是用超导纳米线计数单个蛋白质。　　团队和资金(Team & Funding)　　单量子(Single Quantum)领导超导纳米线探测器的研究，洛桑联邦理工学院的专家提供超冷电子学，MSVISION 是质谱专家，巴塞尔大学的专家负责化学合成和蛋白质功能化。维也纳大学将所有组件与其在量子光学、分子束和超导性方面的专业知识结合在一起。　　本研究得到了戈登和贝蒂摩尔基金会 (Gordon and Betty Moore Foundation: 10771)、欧盟地平线2020框架计划(European Union’s Horizon 2020 Framework Programme: 860713 and 777222)的资助。　　上述介绍，仅供参考。欲了解更多信息，敬请注意浏览原文或者相关报道。　　Abstract　　The analysis of proteins in the gas phase benefits from detectors that exhibit high efficiency and precise spatial resolution. Although modern secondary electron multipliers already address numerous analytical requirements, additional methods are desired for macromolecules at energies lower than currently used in post-acceleration detection. Previous studies have proven the sensitivity of superconducting detectors to high-energy particles in time-of-flight mass spectrometry. Here, we demonstrate that superconducting nanowire detectors are exceptionally well suited for quadrupole mass spectrometry and exhibit an outstanding quantum yield at low-impact energies. At energies as low as 100 eV, the sensitivity of these detectors surpasses conventional ion detectors by three orders of magnitude, and they offer the possibility to discriminate molecules by their impact energy and charge. We demonstrate three developments with these compact and sensitive devices, the recording of 2D ion beam profiles, photochemistry experiments in thegas phase, and advanced cryogenic electronics to pave the way toward highly integrated detectors.文章来源：科学网 诸平