重组蛋白研发

已有结果表明酶的氧化修饰会抑制酶的活性。同样，重组蛋白的氧化也可能导致功能丧失。因此在蛋白质药物的开发和生产中，需要对氧化反应进行密切监测，因为它能改变蛋白质药物的生物活性、半衰期和免疫原性。在加工和储存过程中，蛋白质中的氨基酸很容易被氧化，这些氧化必须受到连续监测。蛋白质上某些蛋氨酸残基可能被氧化成蛋氨酸亚砜甚至蛋氨酸砜。蛋氨酸的氧化能导致失活、聚集，以及增加免疫原性。天冬酰胺残基的去酰胺化形成天门冬氨酸和异天门冬氨酸是蛋白质降解的另一个重要原因，尤其在长期储存条件下容易发生。谷氨酰胺残基也能发生去酰胺化，其反应速度比天冬酰胺慢一百倍，很少在重组蛋白中检测到。色氨酸和半胱氨酸也可能发生氧化。

在生产和纯化过程中，蛋白质能表现出多种电荷异质性改变。这些变化不仅影响 稳药物的定性，也影响活性，而且还可能导致有害的免疫反应。所以，开发和生产过程中蛋白药物的电荷异构体分析非常关键。电荷变异体的表征通常是用等电聚焦或离子交换色谱进行的。等电聚焦 (IEF) 通过等电点 (PI) 进行蛋白质的分离，常规用于重组蛋白电荷异构体的指纹图分析。与传统的平板凝胶等电聚焦电泳相比，毛细管等电聚焦电泳 (cIEF) 具有更高的分离度、分析速度，定量能力和自动化性能。

蛋白质药物的开发和生产中，有效的过程监控技术是必不可少的。由于需要更好地了解生物生产过程，以及改善对产生重组蛋白的微生物的给料及其它相关参数的控制，所以需要快速有效的监测技术。生产过程也必须可靠、标准化、可转移并且不受人为因素影响，这进一步地推动了有效监测技术的需求。旨在缩短产品面市时间和确保最高效的生物生产工艺而进行的工艺开发提速也是一个强大的推动力。最后，遵守 FDA 和 EMA 关于过程分析技术 (PAT) 的指南也需要准确而可靠的监测技术。发酵、提取和纯化工艺达到合适的效率，对产品的成功至关重要。

本应用中使用粒径2 um的TSKgel UP-SW2000尺寸排阻色谱柱并配合Tosoh Bioscience的超高灵敏度光散射检测器LenS3使用，可对重组蛋白的绝对分子量及其聚集水平进行精确测量和表征。

肽图分析是蛋白质鉴定，特别是重组蛋白鉴定的最常用的方法。它通过酶解（一般使用胰蛋白酶）将蛋白质打碎形成肽段，然后以可重现的方式进行肽段的分离和鉴定。肽图分析是一种非常有用的方法，已成为生物技术领域中最有价值的工具之一，它能检测和监控单个氨基酸改变、氧化、去酰胺化，以及其它降解形式。它还能直接检测常见的单克隆抗体修饰变异，如 N 端环化，C 端赖氨酸处理，N- 糖基化，以及内含子表达等非预期的变异。肽图是蛋白质及其酶解产物的指纹图谱，它能提供待测蛋白质的全面信息。肽图分析包含四个主要步骤，蛋白质的分离和纯化；肽键的选择性酶切；多肽的色谱分离；多肽的分析和鉴定。对测试样品与参考标准品或对照样品进行同步的酶解和分析。肽图应该包括足够数量的肽段以进行有效的分析；它不仅要提供蛋白质鉴定所需的必要信息，还应尽可能地涵盖完整的蛋白质序列。

NMR在疫苗和重组蛋白领域有着悠久的历史(1,2)，其中包括许多诺贝尔奖项(3)。Kurt Wü therich（瑞士）因“核磁共振波谱法测定溶液中生物大分子的三维结构”而获得诺贝尔化学奖（2002年）。凭借其在高阶结构测定中的能力，以及其定量性质，NMR在几十年来一直是一种强大、稳定且应用普遍的技术。

重组人源胶原蛋白是基于人体皮肤Ⅲ型胶原蛋白的原始基因序列，选择水溶性强、生物活性高的部分进行拼接重组得到的重组蛋白序列的产物，在医用材料、化妆品、食品保健领域具有很大的应用潜力。重组人源胶原蛋白通常与凝胶混合制成高粘度制剂，或通过浓缩的方式制称固体浓缩蛋白，需通过测定其蛋白含量以检验制剂的有效添加量，是其质量检验的重要环节。本方案基于《GB5009.5 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》，给出了利用凯氏定氮法测定其蛋白质含量的方法。

本文介绍了利用 Agilent 1260 Infinity Ⅱ 四元液相色谱系统、Agilent 1290 Infinity Ⅱ ELSD 检测器和 Agilent Poroshell 120 SB-C18, 3.0 mm × 150 mm, 2.7 μ m 色谱柱对 PEG 偶联重组蛋白注射剂中的吐温 20 进行定量分析的简单灵敏的方法。该方法采用含三氟乙酸(0.1% TFA) 的乙腈和水溶液为流动相，以梯度条件对注射剂中吐温 20 进行分离分析。该方法操作方便，灵敏度高，具有良好的线性关系、精密度和准确度，为生物制药企业测定PEG 偶联的一类重组蛋白制剂中的吐温 20 辅料提供一种可选的解决方案。

本文介绍了一种对实际 PEG 偶联重组蛋白注射液中吐温 20 进行高效分离的方法。该方法采用 Agilent 1260 Infinity II Prime 液相色谱系统、1290 Infinity II ELSD 检测器和 Poroshell 120 SB-C18 色谱柱。1290 Infinity II ELSD 为吐温 20 提供了较高的检测灵敏度和较好的精密度结果。吐温 20 的 LOD 和 LOQ 分别为 5 μ g/mL 和 10 μ g/mL，在 10–200 μ g/mL 浓度范围表现出良好的线性，且实际样品的测定值在理论值的± 10% 范围内，表明该方法可以实现准确定量分析。针对客户测定实际重组蛋白制剂（如偶联PEG）中吐温 20 的分析需求，本文所述的方法可作为一种可靠的解决方案。

重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白，是由人干扰素α2b和人血清白蛋白2种编码基因通过基因工程技术构建的毕赤酵母工程菌，通过诱导表达产生的胞外分泌蛋白。干扰素类重组蛋白药品是目前临床上广泛用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎等顽症的有效药物。2015年版《中华人民共和国药典》对重组蛋白制品的纯度要求为不低于95.0%。本篇应用中，作者采用了离子交换色谱柱TSKgel Q-STAT建立了测定重组人血清白蛋白干扰素α2b 融合蛋白药物纯度的方法，经验证该方法适合 rIFNα2b-HSA纯度检测。

重组Ⅲ型胶原蛋白是通过生物工程技术将人体胶原蛋白的mRNA逆转录成cDNA并嫁接至载体上，再利用转录酶表达成原始蛋白，经过高密度发酵、分离、复性、纯化、酶切工艺成产的一种高分子生物蛋白。Ⅲ型胶原蛋白主要存在于婴儿皮肤或血管内膜、肠道，与皮肤损伤修复和修复质量密切相关，因此该类医药用品对改善皮肤质量、促进皮肤创伤修复具有重要作用。重组Ⅲ型胶原蛋白的有效含量直接决定了基于其研发的医药用品的效果。本方案给出了利用凯氏定氮法测定重组Ⅲ型胶原蛋白敷料贴、凝胶敷料、液体敷料的蛋白质含量的方法。

赖氨酸甲基化的生物学功能表征在组蛋白上、表观遗传学和染色质生物学的调节，如组蛋白甲基化，包括 H3K4，H3K9，H3K36 和 H3K79 等，这些修饰通过调控表观遗传学参与了生长发育和疾病，特别是肿瘤的发生发展。除了组蛋白之外，人们越来越多的认识到非组蛋白（如 p53，RB，RelA）受赖氨酸甲基化调节。

人抗组蛋白抗体(AHA)检测试剂盒人抗组蛋白抗体(AHA)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人抗组蛋白抗体(AHA)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人抗组蛋白抗体(AHA)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人抗组蛋白抗体(AHA)抗原、生物素化的人抗组蛋白抗体(AHA)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗组蛋白抗体(AHA)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人抗组蛋白(H2A-H2B)-DNA抗体/抗二聚体-DNA抗体检测试剂盒人抗组蛋白(H2A-H2B)-DNA抗体/抗二聚体-DNA抗体检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人抗组蛋白(H2A-H2B)-DNA抗体/抗二聚体-DNA抗体含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人抗组蛋白(H2A-H2B)-DNA抗体/抗二聚体-DNA抗体水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人抗组蛋白(H2A-H2B)-DNA抗体/抗二聚体-DNA抗体抗原、生物素化的人抗组蛋白(H2A-H2B)-DNA抗体/抗二聚体-DNA抗体抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗组蛋白(H2A-H2B)-DNA抗体/抗二聚体-DNA抗体呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人组蛋白H2b(histon-H2b)检测试剂盒人组蛋白H2b(histon-H2b)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人组蛋白H2b(histon-H2b)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人组蛋白H2b(histon-H2b)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人组蛋白H2b(histon-H2b)抗原、生物素化的人组蛋白H2b(histon-H2b)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人组蛋白H2b(histon-H2b)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

每个蛋白质或多肽都具有特定的氨基酸序列，即氨基酸组成。因此氨基酸组成分析可作为蛋白质或多肽的鉴定方法。氨基酸分析用于从药物发现到生产的整个过程，以确保批次之间的相似性和一致性。它也经常被用于确定裂解蛋白质所用的蛋白酶的种类。氨基酸分析也是精确测定蛋白质含量的常用工具。氨基酸分析涉及四个基本步骤，首先是将蛋白质酸解为独立的氨基酸。接着对氨基酸进行标记以使它们适合紫外或荧光检测。然后对衍生化的氨基酸进行色谱分离。最后根据标记物的强度测定每个氨基酸的相对含量。一个理想的氨基酸定量分析应当具备快速、灵敏的衍生化手段和分析技术。安捷伦1260 Infinity 或者1290 Infinity 液相色谱系统和安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18 柱可以满足这些要求，采用邻苯二甲醛(OPA) 衍生化伯氨基酸，9- 芴甲酸(FMOC) 衍生化仲氨基酸；完成自动的在线衍生化后，进行可靠的液相色谱分析。该系统可以快速、准确、灵敏和高重现地完成氨基酸分析。

尽管蛋白质生物制品总体来说是相对稳定的分子，但是在生产、制剂和储存过程中，还是会发生一些化学修饰和降解反应。许多蛋白质在纯化过程中可能发生水解断裂，而断裂形成的片段污染物可能会导致患者免疫反应的不良后果。由于存在化学修饰和降解反应，因此需要可靠而且灵敏的方法来评价研发和生产过程中蛋白质的纯度和结构完整性。 完整蛋白质、完整亚基或结构域的精确质量测定对于蛋白质序列组成的快速确认和翻译后修饰、降解和样品处理引起的分子变异的鉴定非常有帮助。电泳、色谱和质谱 (MS) 技术是完整蛋白质及其降解物分子量测定的最常用技术。其中一种最常用的分析是体积排阻色谱 (SEC)，它用于测定蛋白质是否为单体结构，并且在生产和制剂过程中是否始终保持这一结构。

蛋白质药物中聚集体的数量、类型和大小对药物的安全性和有效性有很重要的影响。蛋白质聚集体的形成涉及多种机理，包括疏水基团之间的非共价键相互作用以及二硫键的形成等。蛋白质药物中任何一种聚集体的存在都是有害应当避免的，这是因为聚集体可能导致免疫原性反应（小的聚集体）或者可能影响给药（微粒）。不可逆的聚集体对蛋白质药物潜在的影响最大，尤其是在长期储存和运输过程中产生的不可逆聚集体。常用于聚集体分析的方法有高速离心、体积排阻色谱（光散射检测），以及非变性凝胶电泳。中性pH 条件下的非变性凝胶电泳可用于研究蛋白质的构像、自结合或聚集体。SDS-PAGE（SDS 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）也可用于分离聚集体，但该技术非常耗时且不能很好地分离分子量接近的聚集体或潜在杂质。安捷伦2100 生物分析仪和高灵敏度Protein 250 Assay 可以快速分离完整蛋白质、聚集体和低分子量的杂质，如非糖基化的完整单克隆抗体和游离的轻链和重链。这个分析方法具有很高的重现性 (%CV 6%)，并很容易用于开发和生产过程中的质量控制。

重组人白蛋白可用于治疗肝硬化、腹水等适应症。白蛋白主要由肝脏合成，具有维持血液渗透压和营养载体的作用。传统的血液制备存在产量低、价格高和交叉污染等缺点。基因重组制备技术具有巨大的应用潜力。本实验参照《中国药典 2015年版 通则0704 氮测定法 第三法 定氮仪法》对重组人白蛋白注射液中的氮含量进行测定。

对于重组蛋白的分离纯化，一般都会在进行载体构建时，选择N端或C端加上一个标签，如GST，HIS6，FLAG和MBP等，带了这些标签的蛋白就可以通过亲和吸收的填料来到达初步纯化的目的，亲和纯化相对简单，带有标签的蛋白就会吸附到相应的填料上，而不带标签的蛋白会直接流出，简单的清洗杂蛋白后，只需要再把吸附在上面的蛋白洗脱下来即可，几乎不需要摸索分离纯化的条件。含有所需蛋白的分泌液或者裂解液一般体积都相对比较大，最好使用蛋白存化系统（Clear First 2000）的上样泵上样；进完样后，进行杂蛋白的清洗，再用特异的洗脱液将蛋白洗脱，通过自动接收器接收分离后样品即可，整个过程基本可以实现自动化操作。

多金属氧酸盐(polyoxometallates,POMs)由于结构的多样性以及其在分子尺寸、表面电荷分布、氧化还原电位、极性、酸性、溶解性及热稳定性等方面高度可调的分子特性，在材料，磁学，催化，尤其是医药科学等领域都有着广泛而重要的应用。肿瘤一直是威胁人类健康的一大顽疾。研究表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylaseinhibitors，HDACi)可以通过改变组蛋白或转录因子的乙酰化状态诱导肿瘤细胞生长、分化或凋亡，具有明显的抗肿瘤活性。本论文首次将多酸类药物用于HDACi的筛选，从近400种POMs化合物中筛选出了五类13种与已知HDACi具有相同作用效果的多金属氧酸盐化合物。这五类POMs化合物分别是：1.夹心型钨锗酸盐化合物PA-304 PA-312 PA-313 PA-315 PA-317；2.三有机锡取代的钨锗酸盐化合物PA-320；3.过渡金属连接二钛取代的Keggin型钨磷酸盐形成的化合物PA-324 PA-331 PA-332PA-330；4.临床有机药物与Anderson型多阴离子形成的超分子化合物PA-301 PA-303；5.含Ti的三聚杂多钨锗酸盐化合物PA-334。实验中以PA-320为代表化合物，对其抗肿瘤活性做了初步的验证。绿色荧光蛋白质粒报告基因的荧光照片显示PA-320可以诱导绿色荧光蛋白发光增强，且发光的强度要强于已知临床组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA的作用效果。直观的说明PA-320可以刺激p21基因表达增加。逆转录PCR(RT-PCR)和DNA电泳的结果证实，不同浓度的PA-320处理的细胞，其细胞中p21基因的表达量与用临床组蛋白去乙酰化酶抑制剂BUA处理细胞后的作用效果相同。说明PA-320有和临床HDACi相同的作用功效，可以刺激p21基因的表达增加。据文献报道HDAC1对p21WAF1/CIP1基因的抑制作用最为显著。PA-320对瞬时转染的HDAC1-7的实验结果证实，在转染了HDAC1的同时加入一定浓度PA-320刺激后，p21WAF1/CIP1基因启动子报告基因的活性明显增强，HDAC1的活性明显受到抑制。瞬时转染HDAC实验证明多金属氧酸盐化合物PA-320可以很好的抑制HDAC的活性。MTT实验结果证实PA-320对Hela细胞，LNCaP细胞，293T细胞，SW620细胞四种癌细胞均有抑制作用。实验测得对四种癌细胞的IC50值分别为38.8679μg/ml，45.1477μg/ml，44.4783μg/ml和9.2771μg/ml。说明PA-320可以在相对较低的浓度下(100μg/ml)，PA-320的抑制浓度也是比较低的。说明PA-320对肿瘤细胞有很好的抑制效果。

本文建立了一种使用岛津三重四极杆液质联用仪检测重组胶原蛋白中氨苄西林抗生素残留的方法。样品经乙腈沉淀蛋白，离心滤过后上机分析。采用外标法定量，在0.05~100 ng/mL范围内，相关系数大于0.9999。三个浓度下保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）分别在0.05~0.15 %和0.97~4.26 %之间。该方法灵敏可靠，氨苄西林定量限为0.05 ng/mL；三个浓度样品加标回收率在95.9~100.4%之间，每个浓度平行处理三次，测试结果的RSD在1.11~4.73%之间；可为重组胶原蛋白中氨苄西林抗生素残留测定提供参考。

甘露糖是重组人血白蛋白中的杂质，含量很低。本文建立了HPAEC-PAD法测定重组人血白蛋白中甘露糖含量的方法。CarboPac PA20色谱柱可实现甘露糖与其他单糖的分离，安培检测器利用氧化-还原反应原理对甘露糖进行检测，具有灵敏度高、准确性好的特点。

重组人生长激素 (recombinant human growth hormone，rhGH) 主要用于治疗儿童及成人身材矮小，发育迟缓等病症。rhGHFc免疫融合蛋白是将rhGH基因与特异位点突变后的人抗体IgG4 Fc段用柔性linker连接，利用CHO-k1细胞进行表达。本应用中作者采用了尺寸排阻色谱柱TSKgel G2000SWXL建立了测定重组人生长激素Fc免疫融合蛋白含量。实验结果表明，利用SEC-HPLC进行蛋白含量检测比Lowry法更加灵敏高效，可缩短检测时间。该方法系统适用性、专属性、精密性良好，准确性较高，有利于为纯化工艺提供数据支持。

甘露糖是重组人血白蛋白中的杂质，含量很低。本文建立了HPAEC-PAD法测定重组人血白蛋白中甘露糖含量的方法。CarboPac PA20色谱柱可实现甘露糖与其他单糖的分离，安培检测器利用氧化-还原反应原理对甘露糖进行检测，具有灵敏度高、准确性好的特点。

甘露糖是重组人血白蛋白中的杂质，含量很低。本文建立了HPAEC-PAD法测定重组人血白蛋白中甘露糖含量的方法。CarboPac PA20色谱柱可实现甘露糖与其他单糖的分离，安培检测器利用氧化-还原反应原理对甘露糖进行检测，具有灵敏度高、准确性好的特点。

本次实验基于优化的样品前处理、纳升液相系统与Orbitrap高分辨质谱，建立了迄今为止最高灵敏度的质谱HCPs检测方法，并利用内标蛋白进行准确的相对定量。由于我们没有查到NIS抗体标准品ELISA定量结果，所以未进行进一步对比质谱与ELISA的一致性。接下来将利用此方法对商品化的抗体药物进行HCPs的定性和相对定量，以及考察方法的重现性。

甘露糖是重组人血白蛋白中的杂质，含量很低。本文建立了HPAEC-PAD法测定重组人血白蛋白中甘露糖含量的方法。CarboPac PA20色谱柱可实现甘露糖与其他单糖的分离，安培检测器利用氧化-还原反应原理对甘露糖进行检测，具有灵敏度高、准确性好的特点。

甘露糖是重组人血白蛋白中的杂质，含量很低。本文建立了HPAEC-PAD法测定重组人血白蛋白中甘露糖含量的方法。CarboPac PA20色谱柱可实现甘露糖与其他单糖的分离，安培检测器利用氧化-还原反应原理对甘露糖进行检测，具有灵敏度高、准确性好的特点。

玻璃材料和塑料材料被广泛的使用在生物技术领域。比如注射器，浓缩装置的滤网或者容量瓶等，都是由塑料或者玻璃组成。而蛋白质都有通过疏水效果被动的吸附在玻璃和塑料的表面上的趋势，而这会给类似大规模制备重组蛋白生产带来损失。所以说材料的选择对于减少这种损失由很大帮助。本文中通过使用QCM-D技术，实时检测了蛋白在PVDF和硼硅酸盐表面的吸附情况。