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我想做一下肿瘤细胞的P谱，但以前没有做过，制备样品是把肿瘤细胞制成细胞悬液就行了吗？内标和普通样品的内标一样吗？是不是应该先做一下细胞培养液的P谱？求大神帮助！！

植物细胞原生质体制制备与融合2006-11-20 17:14植物细胞原生质体制制备与融合1、原生质体常现的杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰。科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示，逐渐将眼光转向细胞融合，试图用这种崭 图3-2新的手段冲破自然界的禁钢。１９３７年michel率先实施植物细胞融合的试验。如何去除坚韧的细胞'接成了牛物学工作者必须解决的首要难题。１９６Ｏ年该领域终于出现了重大突破。由英国诺丁汉大学Cocking教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶，成功地制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体，开辟了原生质体融合研究的新阶段。植物细胞原生质体是指那些已去除全部细胞壁的细胞。2、原生质体制备（１）取材与除菌 为了让制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。常用的外植体包括：种子根。子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无需除菌。对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗２～３次，然后浸人 ７０％酒精消毒后，再放进 ３％次氯酸钠处理。最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。（２）酶解 现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。①配制酶解反应液：反应液应是一种ＰＨ值在５·５～５·８的缓冲液，内合纤维素酶０．３%～３．０%以及渗透压稳定剂、细胞膜保护剂和表面活性剂等，②酶解：除菌后的叶片 撕去下表皮 切块放人反应液 不时轻摇 (条件25℃～30℃,2～4h)反应液转绿。反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。（３） 分离 在反应液中除了大量的原生质体外，尚有一些残留的组织块和破碎的细胞。为了取得高纯度的原生质体就必需进行原生质体的分离。可选取２００～４００目的不锈钢网或尼龙布ｊ叭ｉ过滤除渣，也可采用低速离心法或比重漂浮法直接获取原生质体。（４） 洗涤刚分离得到的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养。再生的试剂，应以新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤２～４次。 （5） 鉴定 只有经过鉴定确认已获得原生质体后才能进行下阶段的细胞融合工作。由于已去除全部或大部分细胞壁，此时植物细胞呈圆形。如果把它放人低渗溶液中，则很容易胀破。也。'厂月荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察，残留的细胞壁呈现明显荧光。通过以上观测，基本上可判别是否原生质体及其百分中 此外，尚可借助台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察以及测定人、作用、呼吸作用等参数定量检测原生质体的活力。4、 原生质体的融合（1）化学法诱导融合 化学法诱导融合无需贵重仪器，试剂易于得到，因此一直是细胞融合的主要方法。尤其是聚乙二醇（ＰＥＧ）纳合成钙高ｐＨ诱导融合法已成为化学法诱导细胞融合的主流。以下简介此方法（在无菌条件下进行）：按比例混合双亲原生质体-----滴加 ＰＥＧ溶液，摇匀，静置----滴加高钙高ｐＨ值溶液，摇匀，静置-----滴加原生质体培养液洗涤数次-----离心获得原生质体细胞团一筛选、再生杂合细胞。（２）物理法诱导融合 １９７９年Ｓｅｎｄａ等发明了微电极法诱导细胞融合。１９８１年Ｚｉ。。ｍａｎｎ等提出了改进的平行电极法，现简介如下：将双亲本原生质体以适当的溶液悬浮混合后，插入微电极，接通一定的交变电场。原生质体极化后顺着电场排列成紧密接触的珍珠串状。此时瞬间施以适当强度的电脉冲，则使原生质体质膜被击穿而发生融合。电激融合不使用有毒害作用的试剂，作用条件比较温和，而且基本上是同步发生融合。只要条件摸索适当，亦可获得较高的融合率。上述操作实际上是供体与受体原生质体对等融合的方法。由于双方各具几万对基因，要筛选得到符合需要且能稳定传代的杂合细胞是相当困难的。最近，有人提出以Ｘ射线、伽玛射线。纺锤体毒素或染色体浓缩剂等对供体原生质体进行前处理。轻剂量处理可造成染色体不同程度的丢失、失活、断裂和损伤，融合后实现仅有少数染色体甚至是DNA片段的转移；致死量处理后合ｕ可能产生没再仅体万染色体ｗ划她旋余种。利用这种价值不对称融合方法，大大提高了融合体的生存率和可利用率。经过上述融合处理后再生的细胞株将可能出现以下几种类型．2） 亲本双方的细胞核和细胞质能融洽地合为一体，发育成为完全的杂合植株。这种例子不多。3） 融合细胞由一方细胞核与另一方细胞质构成，可能发育为核质异源的植株。亲缘关系越远的物种，某个亲本的染色体被丢失的现象就越严重。 4） 融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量他方染色体或ＤＮＡ片段构成。④原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开。以后它们各自分生长成嵌合植株。5、 杂合体的鉴别与筛选双亲本原生质体经融合处理后产生的杂合细胞，一般要经含有渗透压稳定剂的原生质体培养基培养（液体或固体），再生出细胞壁后转移到合适的培养基中。待长出愈伤组织后按常规方法诱导其长芽、生根、成苗。在此过程中可对是否杂合细胞或植株进行鉴别与筛选。 (1) 杂合细胞的显微镜鉴别 根据以下特征可以在显微镜下直接识别杂合细胞：若一方细胞大，另一方细胞小，则大。小细胞融合的就是杂合细胞；若～方细胞基本无色，另一方为绿色，则自绿色结合的细胞是杂合细胞；如果双方原生质体在特殊显微镜下或双方经不同染料着色后可见不同的特征，则可作为识别杂合的标志；发现ｈ述杂合细胞后可借助显微操作仪在显微镜下直接取出，移置再牛培养基培养。（2）以互补法筛选杂合细胞 显微鉴别法虽然比较可信，但实验者有时会受到仪器的限制，工作进度慢且未知其能否存活与个长 遗传互补法则可弥补以上不足。 遗传互补法的前提是获得各种遗传突变细胞株系。白化互补：不同基山叨的白化突变株出aBｘAh，可互补为绿色细胞株AaBb。生长互补：甲细胞株缺外源激素Ａ不能生长，乙细胞株需要提供外源激素Ｂ才能生长，则甲株与乙株融合，杂合细胞在不含激素Ａ、Ｂ的选择培养基上可能生长。抗性互补筛选：假如某个细胞株具某种抗性(抗青霉素)另一个细胞株具另一种抗性（如抗卡那霉素），则它们的杂合株将可在含上述两种抗生素的培养基上再生与分裂。这种筛选方式即所谓的抗性互补筛选。代谢互补筛选：根据碘代乙酚胺能抑制细胞代谢的特点，用它处理受体原生质体，只有融合后的供体细胞质才能使细胞活性得到恢复，等等。 （３）采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体 经细胞融合后长出的愈伤组织或植株，可进行染色体核型分析、染色体显带分析、同功酶分析以及更为精细的核酸分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性（ＲＦＬＰ，见８．２．２．２）和随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析，以确定其是否结合了双亲本的遗传素质。（４）根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别质。

植物细胞原生质体制制备与融合1、原生质体常现的杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰。科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示，逐渐将眼光转向细胞融合，试图用这种崭 图3-2新的手段冲破自然界的禁钢。１９３７年michel率先实施植物细胞融合的试验。如何去除坚韧的细胞'接成了牛物学工作者必须解决的首要难题。１９６Ｏ年该领域终于出现了重大突破。由英国诺丁汉大学Cocking教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶，成功地制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体，开辟了原生质体融合研究的新阶段。植物细胞原生质体是指那些已去除全部细胞壁的细胞。2、原生质体制备（１）取材与除菌 为了让制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。常用的外植体包括：种子根。子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无需除菌。对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗２～３次，然后浸人 ７０％酒精消毒后，再放进 ３％次氯酸钠处理。最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。（２）酶解 现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。①配制酶解反应液：反应液应是一种ＰＨ值在５·５～５·８的缓冲液，内合纤维素酶０．３%～３．０%以及渗透压稳定剂、细胞膜保护剂和表面活性剂等，②酶解：除菌后的叶片 撕去下表皮 切块放人反应液 不时轻摇 (条件25℃～30℃,2～4h)反应液转绿。反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。（３） 分离 在反应液中除了大量的原生质体外，尚有一些残留的组织块和破碎的细胞。为了取得高纯度的原生质体就必需进行原生质体的分离。可选取２００～４００目的不锈钢网或尼龙布ｊ叭ｉ过滤除渣，也可采用低速离心法或比重漂浮法直接获取原生质体。（４） 洗涤刚分离得到的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养。再生的试剂，应以新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤２～４次。 （5） 鉴定 只有经过鉴定确认已获得原生质体后才能进行下阶段的细胞融合工作。由于已去除全部或大部分细胞壁，此时植物细胞呈圆形。如果把它放人低渗溶液中，则很容易胀破。也。'厂月荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察，残留的细胞壁呈现明显荧光。通过以上观测，基本上可判别是否原生质体及其百分中 此外，尚可借助台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察以及测定人、作用、呼吸作用等参数定量检测原生质体的活力。4、 原生质体的融合（1）化学法诱导融合 化学法诱导融合无需贵重仪器，试剂易于得到，因此一直是细胞融合的主要方法。尤其是聚乙二醇（ＰＥＧ）纳合成钙高ｐＨ诱导融合法已成为化学法诱导细胞融合的主流。以下简介此方法（在无菌条件下进行）：按比例混合双亲原生质体-----滴加 ＰＥＧ溶液，摇匀，静置----滴加高钙高ｐＨ值溶液，摇匀，静置-----滴加原生质体培养液洗涤数次-----离心获得原生质体细胞团一筛选、再生杂合细胞。（２）物理法诱导融合 １９７９年Ｓｅｎｄａ等发明了微电极法诱导细胞融合。１９８１年Ｚｉ。。ｍａｎｎ等提出了改进的平行电极法，现简介如下：将双亲本原生质体以适当的溶液悬浮混合后，插入微电极，接通一定的交变电场。原生质体极化后顺着电场排列成紧密接触的珍珠串状。此时瞬间施以适当强度的电脉冲，则使原生质体质膜被击穿而发生融合。电激融合不使用有毒害作用的试剂，作用条件比较温和，而且基本上是同步发生融合。只要条件摸索适当，亦可获得较高的融合率。上述操作实际上是供体与受体原生质体对等融合的方法。由于双方各具几万对基因，要筛选得到符合需要且能稳定传代的杂合细胞是相当困难的。最近，有人提出以Ｘ射线、伽玛射线。纺锤体毒素或染色体浓缩剂等对供体原生质体进行前处理。轻剂量处理可造成染色体不同程度的丢失、失活、断裂和损伤，融合后实现仅有少数染色体甚至是DNA片段的转移；致死量处理后合ｕ可能产生没再仅体万染色体ｗ划她旋余种。利用这种价值不对称融合方法，大大提高了融合体的生存率和可利用率。经过上述融合处理后再生的细胞株将可能出现以下几种类型．2） 亲本双方的细胞核和细胞质能融洽地合为一体，发育成为完全的杂合植株。这种例子不多。3） 融合细胞由一方细胞核与另一方细胞质构成，可能发育为核质异源的植株。亲缘关系越远的物种，某个亲本的染色体被丢失的现象就越严重。 4） 融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量他方染色体或ＤＮＡ片段构成。④原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开。以后它们各自分生长成嵌合植株。5、 杂合体的鉴别与筛选双亲本原生质体经融合处理后产生的杂合细胞，一般要经含有渗透压稳定剂的原生质体培养基培养（液体或固体），再生出细胞壁后转移到合适的培养基中。待长出愈伤组织后按常规方法诱导其长芽、生根、成苗。在此过程中可对是否杂合细胞或植株进行鉴别与筛选。 (1) 杂合细胞的显微镜鉴别 根据以下特征可以在显微镜下直接识别杂合细胞：若一方细胞大，另一方细胞小，则大。小细胞融合的就是杂合细胞；若～方细胞基本无色，另一方为绿色，则自绿色结合的细胞是杂合细胞；如果双方原生质体在特殊显微镜下或双方经不同染料着色后可见不同的特征，则可作为识别杂合的标志；发现ｈ述杂合细胞后可借助显微操作仪在显微镜下直接取出，移置再牛培养基培养。（2）以互补法筛选杂合细胞 显微鉴别法虽然比较可信，但实验者有时会受到仪器的限制，工作进度慢且未知其能否存活与个长 遗传互补法则可弥补以上不足。 遗传互补法的前提是获得各种遗传突变细胞株系。白化互补：不同基山叨的白化突变株出aBｘAh，可互补为绿色细胞株AaBb。生长互补：甲细胞株缺外源激素Ａ不能生长，乙细胞株需要提供外源激素Ｂ才能生长，则甲株与乙株融合，杂合细胞在不含激素Ａ、Ｂ的选择培养基上可能生长。抗性互补筛选：假如某个细胞株具某种抗性(抗青霉素)另一个细胞株具另一种抗性（如抗卡那霉素），则它们的杂合株将可在含上述两种抗生素的培养基上再生与分裂。这种筛选方式即所谓的抗性互补筛选。代谢互补筛选：根据碘代乙酚胺能抑制细胞代谢的特点，用它处理受体原生质体，只有融合后的供体细胞质才能使细胞活性得到恢复，等等。 （３）采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体 经细胞融合后长出的愈伤组织或植株，可进行染色体核型分析、染色体显带分析、同功酶分析以及更为精细的核酸分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性（ＲＦＬＰ，见８．２．２．２）和随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析，以确定其是否结合了双亲本的遗传素质。（４）根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别质。

【背景】CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g, IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。【培养原理】CIK培养用细胞因子和抗体：nCD3激发型单抗：T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。nIL-2 (白细胞介素-2)IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。nIFN-g (干扰素-g)IFN-g 具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN- g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN- g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。nIL-1a(白细胞介素-1a)IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK 的细胞毒作用。【细胞制备】1．外周血单个核细胞的采集1.1用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；1.2淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；1.3无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。2．CIK细胞的培养及鉴定2.1将PBMC按1-2 x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g，37oC，5%CO2培养箱中培养；2.224h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。2.3每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；2.4在培养的第14d，收获CIK细胞。2.5CIK细胞质控：2.9.1台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；2.9.2流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。2.9.3细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10 : 1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200 ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。2.9.4收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素5 Eu)。【步骤简图】http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/04/B1366873006_small.jpg 【推荐试剂】http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/04/B1366873008_small.jpg 注：Animal Free意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质，尤其是牛蛋白的混入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病原体(如疯牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成分的重组细胞因子。【其它相关试剂】 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/04/B1366873009_small.jpg【参考文献】 Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125-2133

【序号】：2【作者】：郜坤洁【题名】：人脐带脱细胞细胞外基质水凝胶的制备及相关性能研究【期刊】：南方医科大学【年、卷、期、起止页码】：2022【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C447WN1SO36whLpCgh0R0Z-i16_wNaYct1rCckkTLVqOrRrxFeU2NGsFOH53JjrctrPrUUGId2crPEl-rpQXKB0w&uniplatform=NZKPT

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【序号】：5【作者】：杨加敏1,2,3胥义1,2,3党航宇【题名】：组织器官脱细胞支架的制备及研究进展【期刊】：生物工程学报. 【年、卷、期、起止页码】：2022,38(06)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iJTKGjg9uTdeTsOI_ra5_XZOJZj6lYY-rRktrXX2v5EUIjgLXFCaais9If6RP3sXH&uniplatform=NZKPT

[font=宋体][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞是一种新型的免疫疗法，在癌症治疗中具有广泛的应用前景。本文将全面解析[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞的制备过程、来源及优缺点，帮助读者更好地了解和评估这种免疫治疗方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞的制备过程：[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]? 对不同来源的[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞进行分离和制备时，可以用[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]表达载体（如慢病毒）进行修饰；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 在特定的扩增培养基中扩增[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 建立的[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]‐[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞通常采用静脉注射，以选择性杀死肿瘤细胞。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞，不仅通过[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]特异性识别抗原表达肿瘤的能力，而且通过[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞受体自身来消除肿瘤。[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞的活性取决于是刺激和抑制信号的平衡，而不是抗原特异性。这些信号激活衔接蛋白，释放穿孔素和颗粒酶，并控制细胞因子的产生。[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞的另一种杀伤机制，涉及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。因此，[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞的靶向裂解基于[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]依赖和[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]受体依赖机制，并且裂解也适用于抗原阴性膜的肿瘤。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在临床前和临床试验中，[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞疗法当之无愧成为细胞疗法中的热门选手。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞的来源[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前，[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞主要来源包括外周血、脐血、诱导多能干细胞[/font][font=Calibri](iPSC)[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]NK92[/font][font=宋体]细胞系。经常使用的是捐赠者外周血提取的[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞，但不同捐赠者外周血扩增的[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞可能存在差异。因此，对纯化要求较高。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]诱导多能干细胞[/font][font=Calibri](iPSC)[/font][font=宋体]，是指将终末分化的体细胞通过导入特定的转录因子重编程为多能干细胞。[/font][font=Calibri]iPSC[/font][font=宋体]的优点较多，包括制备需少量供体细胞，可进行无限培养，成本较低，可实现自体供给，免疫原性较低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞疗法是一种新型的免疫疗法，其优点包括：[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①安全性：[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞疗法使用的是经过基因修饰的[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞，可以更安全地攻击肿瘤细胞，减少副作用和毒性。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②高效性：[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞疗法结合了基因工程技术、免疫细胞治疗和靶向治疗等手段，可以更高效地杀伤肿瘤细胞，提高治疗效果。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③持久性：[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞疗法通过增强[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞的杀伤能力和持久性，可以更有效地控制肿瘤细胞的生长和扩散，提高患者的生存期和生活质量。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]然而，[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞疗法也存在一些缺点：[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①制备复杂：[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞的制备过程相对复杂，需要经过多步操作和筛选，成本较高。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②疗效有限：虽然[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞疗法对某些癌症类型具有较好的疗效，但对于一些实体瘤的治疗效果有限。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③不适用于所有患者：由于个体差异和肿瘤类型等因素的影响，[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞疗法并不适用于所有患者。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]总之，[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞疗法是一种具有潜力的新型免疫疗法，但仍需要进一步的研究和改进，以解决其存在的缺点和局限性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前义翘神州为制药公司提供综合性的[/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/category/solutions/car-nk-therapy][b]CAR-NK[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/category/solutions/car-nk-therapy][b]细胞疗法开发解决方案[/b][/url]，包括从[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]开发、[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞获取和表征、[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞活化和扩增、[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞纯化、[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞制备到[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞质量控制的每一阶段。更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/category/solutions/car-nk-therapy[/font][/font]

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感受态细胞的制备(一)制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞　　下述操作方案是由Hanahan(1983)提供的，所制备的大肠杆菌DHl、DH5和ＭＭ249感受态细胞培养物能使每微克超螺旋ＤＮＡ以≥5x108转化菌落的频率进行转化，其他大多数大肠杆菌菌株的最高转化率大约只有前述菌株的1/10-1/5。尽管如此，实际上对所有克隆方面的用途来说，这已绰绰有余。一些大肠杆菌菌株（如ＭＣ1061）不适于此法。下列有３个因素对于获得持续高的转化频率来说是至关重要的：（１）转化缓冲液中试剂的纯度 务必使用所能得到的最高质量的试剂，这些试剂应分装成小份，避光保存于冷处。（２）细胞的生长状态 由于一些不清楚的原因，直接用贮存于-70┴冰冻培养基中的贮存原种搠种而进持培养的细菌，所得到的转化效率最高，不应使用在实验中的贮存原咱接种崦进持培养的细菌，所得到的转效率最高，不应使用在实验室中连续传代，贮存于４℃或贮存于室温的培养物。（３）玻璃和塑料器皿的清洁度 痕量的去污剂或其他化学物质的存在可能大大地降低细菌的论效率，所以最好拨出一批玻璃器皿专用于制备感受态细菌，而不作它用。这些玻璃器皿应用手洗刷，再灌满纯水（Ｍilli-Ｑ级或与其相当的级别），然后高压灭菌，临用前方把水倒掉。细心操作的话，几乎总是可以获得转化效率高的感受态细胞，每微克超螺旋ＤＮＡ可能得到5x107-1x108个转化菌落。然而甚至经验最为丰富的工作者也不可能保证持有必要用标准的螺旋质粒ＤＮＡ制品来检测每一批新的感受态细胞的转化效率。制备感受态细胞前，先制备一大批黧的螺旋质粒ＤＮＡ，分装成许多小份贮存于-70℃。这些标准制品可用来检验每一批新的感受态细胞的转化效率，并检查每一个实验的转化效率。设立这样一个阳性对照后，如果某一次实验得不到转化菌落，就可以根据对照的情况查明宣究竟是感受态细菌方面有庇漏，还是ＤＮＡ制品间有差异。分装的感受态细菌可在-70℃保存几个月而转效率无明显下降。１）用无菌铂丝直接蘸取冻存有大肠杆菌ＤＨl株（或ＤＨ５株、ＭＭ249株原种）（贮存于-70℃的冻培养基上，见附录Ａ），在SOB琼脂平板表面划线， 于37℃培养16小时。将冰冻的细菌融化，铂丝在冻存细菌原种的表面划过时，已带上足量的细菌，因此一管冻存细菌原种可使用多次。２）将４－５个分隔良好的菌落转移到１ml含20mmol/L MgSo４的SOB中，菌落直径为１－２mm。中速振荡使细菌分散，然后在1L锥瓶中用30-100ml含20mmol/LMgSO4的SOB稀释培养物。３）于37℃将细菌培养0.5-3.0小时，为达到高效转化，活细胞数务必少于108细胞/ml，可每隔20-30分钟测定ＯＤ600值来检测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长培养物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各稀释度的培养物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。４）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。切记：下述所有步骤均需无菌操作。５）于４℃用Sorvall GS3转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟， 回收细胞。６）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。７）用约20ml（每个50ml管）用冰预冷的转化缓冲液（对于TFB''见表1.3；对于FSB，可参见表1，4）轻轻振荡，重悬沉淀（若制备需立即使用的感受态细胞可用TFB:若制备需要贮存于－70℃的感受态细胞则用FSB），将重悬细胞冰浴10分钟。８）于４℃用Sorvall GS3转头或与其相当的转头）以4000转．分离心10分钟，回收细胞。９）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。10）用４ml（每个50ml管）用冰预冷的ＴＦＢ或ＦＳＢ轻轻振荡重悬沉淀。按步骤11）a给出的操作程序制备立即使用的感受态细胞，而步骤11）b制德贮存于-70℃留待以后使用的感受态细胞。11）a.新鲜感受态细胞的制备a）将140μl DnD溶液加到每一悬液的中心，立即轻轻旋转以混匀悬液，然后在冰上放置15分钟。DnD溶液二硫苏糖醇（DTT) 1.53gDMSO 9.0ML1mol/L乙酸钾（pH78.5) 100μl水至 10MLDnD溶液作可耐受人机溶剂的Millex SR膜（Millipore）过滤除菌，将DnD溶液分装成160μl小份放入0.5ml的无菌微量离心管中，密封管口，贮存于-20℃。DMSO的氧化产物，据推测可能是二甲硫醚，是转化的掏物。为避免这个问题，应购买质量最好的DMSO。应将所购试剂分装成10ml小份，放入无菌试管，密封管口，贮存于-70℃。每小份只用１次，用后弃去。１mol/L乙酸钾（pH7.5）的配法。b）每管再加140μlDnD溶液，轻轻旋转混匀之，将悬液置于冰上，再放15分钟。c）将小份悬液分装到冷却的无菌聚丙烯管（Falcon 2059''17x100mm）中，将管置于冰上。就大多数克隆方面的用途来说，50μl感受细胞悬液已绰绰有余。然而，如需要更大量的转化菌落（如构建cDNA文库），每小份感受态细胞的量可能需要加大些．加入ＤＮＡ后，于42℃短暂加热感受态细胞，这是一个关键步骤，务必以正确的升温速度使细胞加温到正确的温度。下面给出的所有时间和温度是用Falcon 2059型管获得的数据，其他类型的管未必可产生相同的结果。b.冻存的感受态细胞的制备a）每４ml重悬细胞加140 μl DMSO，轻轻旋转混匀之，将悬液置冰上15分钟。b）每份悬液再加140μl DMSO，轻轻旋转混匀之，重新放入冰浴中。c）迅速将悬液分装到冷却的无菌的微时离心管中，封紧管口，没入液氮中快速冰冻感受态细胞。贮存于-70℃备用。就大多数克隆方面的用途来说，50μl感受态细胞悬液已绰绰有余。然而，如需要更大量的转化菌落（如构建cDNA文库），每小份感受态细胞的量可能需要加大些。d）需要时，从-70℃冰箱中取出一管感受态细胞，把管握于手民主，融化细胞。细胞一经融化，立即把管转移至冰浴中，在冰上放置10分钟。e）用一冷却的无菌吸头把感受态细胞转移到冷却的无菌聚丙烯管中（Falcon2059''17x100mm）中，放置在冰浴上。加入ＤＮＡ后，于42℃短暂加热感受态细胞，这是一个关链步骤，务必以正确的升温速度使细胞如温到正确的温度。下面给出的所有时间和温度是用Falcon 2059试管获者的数据，其他类型的管未必可产生相同的结果。12）将ＤＮＡ加入到感受态细胞中，轻轻旋转几认混匀内容物。在冰上放置30分钟。为得到最佳结果，ＤＮＡ溶液的体积不应超过感受态细胞体积的５％。转化体的数量相对于所加入的ＤＮＡ量近妣例地增加，直至系统达到饱和，尽管感受态细胞在不同批次之间有一些差异，50μl感受态细胞通常可被约lng超粒ＤＮＡ所饱和。虽然再加ＤＮＡ也不影响转化体的总产量，但使用过多的ＤＮＡ将降低系统的效率（以每微克ＤＮＡ所获转化体的数量来衡量）。当所转化的ＤＮＡ很难得时（如用从相对难得的样品中提取mRNA而合成的cDNA），这就显得格外重要。为最大限度地提高转化菌落的数目，可把现有ＤＮＡ分置于几小份感受态细胞中，以期系统不致饱和。试验中一定包括下面的对照：a.加入已知量的标准超螺旋质粒ＤＮＡ制品的感受态细胞。b.完全不加质粒ＤＮＡ的感受态细菌。13）将管放入预加温到42℃的循环水浴中放好的试管加架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。14）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却１－２分钟。15）每管加800μl ＳＯＣ培养基（见附录Ａ）。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育43分钏使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。为最大限度地提高转化效率，复苏期中应温放地摇动细胞（转速225转/分）。16）将适当体积（每个90m平板达200μl）已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和相应抗生素的ＳＯＢ琼脂培养基上。如培养物体积太小（〈10μl），可再加肉汤培养基，用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平表面。如在一个90mm平板上铺200μl以上的感受态细胞，应离心浓缩细胞（于室温用Sorvall SS34转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟），然后用适量SOC轻轻重悬细胞。如用四环素抗性作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上（或铺在软琼脂中）。然而如选用氨苄青霉素抗性，则只能将一部分培养物（根据实验决定）铺在单独的平皿上，氨苄青霉素抗性菌落数的曾加与平皿上所加细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞可释放生长抑制物质的缘故。\par 17）将平板置于室温直至液体被吸收。18）倒置平皿，于37℃培养，12-16小时后可出现菌落。如检查氨苄青霉素抗性，用转化细胞铺平板时密度应较低（每个90mm平板不超过104菌落），于37℃培养平板时不应超过20小时。氨苄青霉素抗性的转化体可将β－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。这样，铺平板时懊度太高或培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉敏感的卫星菌落。在造

[font=宋体][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]细胞基因转导具有一定的挑战性，慢病毒载体、逆转录病毒载体、转座子和 [/font][font=Calibri]mRNA [/font][font=宋体]电穿孔技术是较为常见的转导方法，这些技术的进步赋予 [/font][font=Calibri]T [/font][font=宋体]细胞新的生命力，实现了[/font][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]对靶细胞高、精、准的持久杀伤，极大地提高了肿瘤特异性 [/font][font=Calibri]T [/font][font=宋体]细胞的临床治疗效果。慢病毒载体（[/font][font=Calibri]Lentivirus[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]LV[/font][font=宋体]）因其宿主范围广、目的基因表达稳定、对哺乳动物细胞具有高感染效率、转基因负荷量更大，可容纳 [/font][font=Calibri]6.5 kb [/font][font=宋体]外源基因且兼具基因毒性更小等优势，成为了[/font][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]细胞构建中最常用的病毒载体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]一、慢病毒包装相关产品[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]慢病毒载体是[/font][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]细胞构建中最常用的病毒载体。义翘神州为慢病毒包装过程提供全方位的支持：[/font][font=Calibri]HEK293[/font][font=宋体]培养基以及补料液、[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级核酸酶、核酸酶残留检测试剂盒和[/font][font=Calibri]HEK293[/font][font=宋体]细胞建库及细胞库检测服务、大规模质粒开发服务。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①细胞培养基[/font][font=宋体][font=宋体]在慢病毒包装过程中，为了提高慢病毒的安全性，慢病毒载体系统所需的组分被分成三个质粒：[/font][font=Calibri]VGF[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]psPAX2[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]pMD2.G[/font][font=宋体]。使用无血清细胞培养基悬浮培养[/font][font=Calibri]HEK293 [/font][font=宋体]细胞达汇合度[/font][font=Calibri]90%[/font][font=宋体]，将三个质粒共转染到[/font][font=Calibri]HEK293 [/font][font=宋体]细胞基因组中。宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]与[/font][font=Calibri]psPAX2[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]pMD2.G[/font][font=宋体]基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州经过十多年的研发，开发出一系列无血清细胞培养基产品，可用于[/font][font=Calibri]HEK293 [/font][font=宋体]细胞悬浮培养和目标分子表达，培养基生产的整个过程严格按照[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]规范进行管理。所有细胞培养基均为即用型，经过数千种蛋白及抗体表达案例的验证，细胞培养基具有蛋白表达量高、细胞生长好、质控严格、批次稳定性好等特点，已经被多个知名实验室用于细胞培养和蛋白表达研究。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②细胞培养基补料液[/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州开发的细胞培养基补料液[/font][font=Calibri]SMS 293-SUPI[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]Cat#: M293-SUPI[/font][font=宋体]）是一种无蛋白，无血清的液体加料液。其仅用于科学研究，不推荐用于人类或动物的诊断和治疗。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③细胞转染试剂[/font][font=宋体][font=宋体]利用重组慢病毒载体将表达[/font] [font=Calibri]CAR [/font][font=宋体]的基因导入并整合到 [/font][font=Calibri]T [/font][font=宋体]细胞中是一种最常用的 [/font][font=Calibri]CAR-T [/font][font=宋体]细胞改造方法。义翘神州拥有高品质的转染试剂 [/font][font=Calibri]Sinofection Transfection Reagent (Cat#: STF02)[/font][font=宋体]，细胞毒性小、重复性高，可用于慢病毒载体的高效转染，转染效率基本可以达到[/font][font=Calibri]95%[/font][font=宋体]以上。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]二、核酸去除及检测相关产品[/b][/font][font=宋体][font=宋体]利用慢病毒进行[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]基因转导[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞的过程中会产生核酸残留，这些核酸残留物具有潜在的危害性。残留的核酸可能会在人体内造成细胞增殖失控，变为肿瘤细胞。核酸残留可能存在感染性病毒基因，增加体内免疫反应。因此，利用核酸酶进行有效的核酸残留去除，是非常重要的。同时，核酸酶在慢病毒包装过程中同样不能有残留，所以在使用核酸酶去除核酸后，还需要对核酸酶进行清除，并进行检测，确保产品符合生产标准要求。北京义翘神州开发高品质的[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级备案核酸酶（[/font][font=Calibri]Cat#: GMP-SSNP01[/font][font=宋体]），用于去除慢病毒扩增过程中的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]污染。同时，我们还提供高性能配套的核酸酶残留检测试剂盒（[/font][font=Calibri]Cat#: KIT-SSNP01[/font][font=宋体]），可用于检测和定量分析样品中的核酸酶残留量，具有灵敏度高、特异性好、通用性等优点。义翘神州的高质量核酸去除及检测产品为[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]基因转导解决核酸残留的困扰。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级条件下生产的全能核酸酶[/font][font=Calibri]Super Nuclease[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]Cat#: GMP-SSNP01[/font][font=宋体]），无动物源性，可高效降解单链、双链、线性、环状、超螺旋等任何形式的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]及[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]。超高活性，应用场景广泛且使用量低不易残留，质量、性能、供货能力可靠，并已完成在[/font][font=Calibri]FDA[/font][font=宋体]的药物主文件申报备案（[/font][font=Calibri]DMF Number#:35978[/font][font=宋体]），满足药物申报的规范。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]三、细胞库检测[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在进行慢病毒包装过程中，需对共转染前的宿主[/font][font=Calibri]HEK293 [/font][font=宋体]细胞进行微生物安全风险检测。[/font][font=Calibri]HEK293 [/font][font=宋体]细胞的微生物安全风险可能涉及细菌、真菌、支原体、外来病毒等污染。微生物安全问题需要高度关注，因为在生产过程中很容易发生微生物污染，最终导致细胞产品无法净化。义翘神州细胞库检测实验室为生物安全二级实验室，已在北京市备案，且通过[/font][font=Calibri]CNAS[/font][font=宋体]认证。该实验室按照[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]GLP[/font][font=宋体]质量体系运行，[/font][font=Calibri]B+A[/font][font=宋体]环境，满足无菌检测、分枝杆菌检测环境要求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]四、慢病毒包装质粒生产[/b][/font][font=宋体][font=宋体]慢病毒载体是由三个包装质粒和一个表达质粒（也称穿梭质粒）瞬间共转染[/font][font=Calibri]293T[/font][font=宋体]细胞，通过克隆筛选获得稳定组装表达高滴度慢病毒载体的细胞株，经发酵纯化后获得一定质量要求的慢病毒。慢病毒载体可以将[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]基因的目的。义翘神州能够提供快速、高通量、高品质以及个性化的慢病毒包装质粒制备服务，满足实验室研究人员的小量慢病毒质粒制备需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]例如：质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]制备服务[/font][/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州升级改造后的慢病毒质粒制备平台，采用[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级别的生产线，对过程和最终产品的严格管控，确保了最终产品质量符合客户需求。义翘神州可以提供从μ[/font][font=Calibri]g[/font][font=宋体]级别，[/font][font=Calibri]mg[/font][font=宋体]级别至[/font][font=Calibri]g[/font][font=宋体]级别不同规模的科研级质粒生产服务，满足不同的需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多关于[/font][url=https://cn.sinobiological.com/research/car-t-therapy/lentivirus-packaging][b][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]细胞制备[/font][font=Calibri]-[/font][/b][/url][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/research/car-t-therapy/lentivirus-packaging][b]慢病毒包装[/b][/url]详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/research/car-t-therapy/lentivirus-packaging[/font][/font][font=宋体] [/font]

[font=宋体]目前有多种方法可用于开发单克隆抗体。杂交瘤技术是经典的抗体开发技术，但效率相对较低，而且容易丢失抗体的多样性。噬菌体展示技术广泛用于单抗开发，但容易丢失抗体的天然配对信息。[/font][font=宋体][font=宋体]一般认为，在抗体开发中，保留[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞的天然[/font][font=Calibri]VH[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]VL[/font][font=宋体]配对是十分重要的。近年来兴起的单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术保留了轻重链可变区的天然配对，具有简单快捷、所需细胞数量较少、效率高等优势。该技术通过直接扩增单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞的[/font][font=Calibri]VH[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]VL[/font][font=宋体]编码基因，是一种从人和免疫动物中制备单克隆抗体的有力技术。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]利用单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞分选平台，义翘神州可向全球客户提供单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体制备服务，整个过程涉及单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞分离、测序、克隆和单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体筛选等步骤。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体发现的工作流程[/font][/b][/font][font=宋体] [font=Calibri]1[/font][font=宋体]）单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞的分离[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]从外周血或淋巴组织中分离单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞，有随机分离和抗原特异性分离两种方式。随机[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞分离，可通过显微操作、激光捕获显微切割和荧光激活细胞分选（[/font][font=Calibri]FACS[/font][font=宋体]）等进行细胞挑选。抗原特异性分离可通过抗原包被磁珠、多参数[/font][font=Calibri]FACS[/font][font=宋体]的荧光素标记抗原、溶血斑块实验和荧光焦点法等方法进行抗原特异性[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞的筛选。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]利用[/font][font=Calibri]FACS[/font][font=宋体]技术，可以根据特定细胞表面标志物的表达模式，明确区分待分选[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞的发育和分化阶段，几乎任何阶段的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞都可以分选。为了有效获得特异性抗体，必须评估供体的免疫应答，例如，在单细胞分离之前，使用酶联免疫斑点技术（[/font][font=Calibri]ELISPOT[/font][font=宋体]）测定外周血中抗体特异性细胞（[/font][font=Calibri]ASC[/font][font=宋体]）的丰度，从而选择含抗原特异性抗体浓度较高的血样进行后续抗体制备。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [font=Calibri]2[/font][font=宋体]）单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体的测序和克隆[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]通常在[/font][font=Calibri]96[/font][font=宋体]孔板上进行单细胞的[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]合成。全长[/font][font=Calibri]Ig[/font][font=宋体]基因转录产物通过巢式或半巢式[/font][font=Calibri]RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]进行扩增。通常情况下，对抗体重链轻链可变区不同前导序列设计前向引物的混合物，反向引物特异性互补于抗体恒定区。某些情况下，如果分离和扩增不同同种型的抗体，反向引物则是特异性互补于各种同种型抗体恒定区的混合物。表达载体可直接转染至哺乳动物细胞中，用于单克隆抗体的体外表达。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [font=Calibri]3[/font][font=宋体]）抗体的表达和筛选[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]鉴定抗体或片段的抗原特异性和生物活性之前，需将携带有抗体基因的表达载体在相应系统中表达。最简单和最常见表达系统是原核系统（例如大肠杆菌），而哺乳动物细胞系统（例如[/font][font=Calibri]HEK 293[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]细胞）更有利于抗体的翻译后修饰，主要是瞬时表达或稳定表达。在[/font][font=Calibri]E. coli[/font][font=宋体]中，通常抗体基因表达为抗原结合片段（[/font][font=Calibri]Fab[/font][font=宋体]）的形式，而在哺乳动物细胞中，以完整的[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]形式表达。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/single-b-cell-antibody-service][b]单个[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/single-b-cell-antibody-service][b]B[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/single-b-cell-antibody-service][b]细胞抗体服务[/b][/url]，包含：流式单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞服务和基于[/font][font=Calibri]Beacon[/font][font=宋体]平台的单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体开发，更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/single-b-cell-antibody-service[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]文章来源：[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology][b]单[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology][b]B[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology][b]细胞抗体技术[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology[/font][/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体][b][font=宋体]什么是[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞疗法[/font][font=Calibri]?[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]自然杀伤（[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]）细胞是具有高度细胞毒性的非特异性免疫效应细胞，具有消除肿瘤细胞和感染病毒细胞等异常细胞的能力。[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞疗法在血液瘤和实体瘤中发挥显著的效果，与[/font][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]疗法相比，[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞疗法更安全，引起细胞因子释放综合征（[/font][font=Calibri]CRS[/font][font=宋体]）和移植物抗宿主病（[/font][font=Calibri]GVHD[/font][font=宋体]）的可能性更低，具有更强的抗肿瘤活性，是一个现货免疫细胞的理想选择。[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞的来源广泛，包括脐带血（[/font][font=Calibri]UCB[/font][font=宋体]）、外周血（[/font][font=Calibri]PB[/font][font=宋体]）、人诱导多能干细胞（[/font][font=Calibri]hiPSCs[/font][font=宋体]）、人胚胎干细胞（[/font][font=Calibri]hESC[/font][font=宋体]）、造血干细胞（[/font][font=Calibri]HSC[/font][font=宋体]）和[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞系。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞的制备过程：[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]? 对不同来源的[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞进行分离和制备时，可以用[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]表达载体（如慢病毒）进行修饰；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 在特定的扩增培养基中扩增[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 建立的[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]‐[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞通常采用静脉注射，以选择性杀死肿瘤细胞。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][url=https://cn.sinobiological.com/category/solutions/car-nk-therapy][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞疗法整体解决方案[/font][/url][/b][/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州为制药公司提供综合性的[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞疗法开发解决方案，包括从[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]开发、[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞获取和表征、[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞活化和扩增、[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞纯化、[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞制备到[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞质量控制的每一阶段。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]开发：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]可特异性识别肿瘤细胞表面抗原并与其结合，因此获得高质量[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]是开发中的关键步骤。基于[/font][font=Calibri]15+[/font][font=宋体]年的经验积累和技术沉淀，义翘神州建立了四大抗体开发平台（噬菌体抗体库、杂交瘤、流式单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞、[/font][font=Calibri]BeaconB[/font][font=宋体]细胞）满足[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]发现的需求。同时我们还提供用于[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]筛选和[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]亲和力检测的多种[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]靶点蛋白和[/font][font=Calibri]SPR/BLI[/font][font=宋体]亲和力检测服务，支持[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]研究。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞获取和表征：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞源于脐带血（[/font][font=Calibri]UCB[/font][font=宋体]）、外周血（[/font][font=Calibri]PB[/font][font=宋体]）、人诱导多能干细胞（[/font][font=Calibri]hiPSCs[/font][font=宋体]）、人胚胎干细胞（[/font][font=Calibri]hESC[/font][font=宋体]）、造血干细胞（[/font][font=Calibri]HSC[/font][font=宋体]）和[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞系。由于[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞来源广泛，需要对[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞进行分离，清除[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞、[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞或其他污染物。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞被定义为[/font][font=Calibri]CD3-CD16+CD56+[/font][font=宋体]的淋巴细胞。根据[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞表面标志物[/font][font=Calibri]CD16[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]CD56[/font][font=宋体]的差异性表达，可将[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞划分为两个亚群[/font][font=Calibri]CD56brightCD16dim/[/font][font=宋体]? 和[/font][font=Calibri]CD56dimCD16+[/font][font=宋体]。根据这些不同的表面标志物，利用流式抗体进行检测从而区分[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞亚群。义翘神州已开发高质量的[/font][font=Calibri]CD3[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]CD16[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]CD25[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]CD56[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]KIR2DL1[/font][font=宋体]流式抗体，可有效分离和表征[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞群或亚群。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞活化和扩增：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在外周血白细胞中，只有约[/font][font=Calibri]5%-15%[/font][font=宋体]为[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞，如何获得足够的[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞仍是患者采用免疫治疗的主要挑战。从[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞活化阶段进行高效的[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞转导，以诱导细胞增殖。目前[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞培养存在多种培养方式，应用最广泛的两种方法为饲养层细胞培养和细胞因子培养。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级细胞因子[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]相关法规明确规定，对于细胞治疗药物中原材料的选择，应尽量采用符合药典标准的原材料或批准上市的药品，优先级是：药品级＞[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级＞[/font][font=Calibri]RUO[/font][font=宋体]级。[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级细胞因子对于[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞的发育和存活具有重要调节作用，如[/font][font=Calibri]IL-21[/font][font=宋体]能诱导[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞的成熟，并增强其细胞毒性。[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级细胞因子作为重要原料应用到[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]药物开发过程中，可在体外扩增过程中高效激活[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞。义翘神州严格遵循[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]质量管理体系，成功开发出高质量、高活性的[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级细胞因子：[/font][font=Calibri]IL-2[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IL-7[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IL-12[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IL-15[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IL-21[/font][font=宋体]，助力[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞培养。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]④[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞制备：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]慢病毒包装是[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞制备的关键环节。影响慢病毒包装是否成功的因素包括载体系统、转染试剂和慢病毒滴度等。义翘神州提供高品质的无血清[/font][font=Calibri]HEK293[/font][font=宋体]培养基、[/font][font=Calibri]Sinofection[/font][font=宋体]转染试剂和超级核酸酶，用于慢病毒载体的高效转染。同时我们还提供细胞库检测服务和核酸酶残留检测试剂盒，满足[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞制备需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑤[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞质量控制：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]为确保[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞治疗产品的安全性，需要进行严格的质量控制检测，包括活细胞比例检测、细胞群或亚群检测、[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]阳性率检测和杀伤效力评价等。义翘神州提供高质量的产品和服务，支持[/font][font=Calibri]CAR-NK[/font][font=宋体]细胞质量控制检测。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/category/solutions/car-nk-therapy[/font][/font]

[size=10px][font=&]大肠杆菌宿主菌株作为受体细胞，当这些受体细胞经过([/font][font=&]CaCl[/font][font=&][sub]2[/sub][/font][font=&])处理时，它们的细胞膜通透性会发生暂时性的改变，从而成为能够允许外源[/font][font=&]DNA[/font][font=&]分子进入的感受态细胞。[/font] [b]一、感受态细胞 [font=&]1.感受态：[/font][/b][font=&]受体细胞最容易接受外源基因并将其转化的一种[b]生理状态[/b]。[/font][b][font=&]2.感受态细胞：[/font][/b][font=&]受体细胞通过理化方法处理，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态的细胞。[/font][b][font=&]3.感受态菌龄：[/font][/b][font=&][/font][font=&]细胞的感受态一般出现在[b]对数生长期[/b]，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态和实现成功转化的关键。[/font] [b][font=&]4.质粒转化：[/font][/b][font=&]质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。[/font] [/size] [b][size=10px]二、感受态细胞制备的原理[/size][/b] [size=10px][b][font=&]1.外源基因表达的条件：[/font][/b][font=&]重组[/font][font=&]质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因。[/font][b][font=&]2.感受态制备原理：[/font][/b]将快速生长的大肠杆菌置于经低温0℃预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（渗透作用），同时，[font=&]Ca[/font][sup]2+[/sup]会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。[b][font=&]3.质粒转化原理：[/font][/b]感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物。将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激90s，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。 [b]4.外源基因表达：[/b]进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将转化后的细胞在选择性培养基上（相应抗生素抗性）培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。 [b]三、感受态细胞的制备（[font=&]CaCl[/font][font=&][sub]2[/sub][/font]法） [font=&]1. 受体菌种活化：[/font][/b][font=&]取[/font][font=&]-80℃[/font][font=&]冰箱中保藏的菌株（如[/font][font=&]DH5α[/font][font=宋体]、[/font][font=&]Top10、DE3、BL21等）[/font][font=&]在[/font][font=&]LB[/font][font=&]平板（无抗性）上划线分离，放置于[/font][font=&]37℃[/font][font=&]恒温培养箱中倒置培养。[/font][b][font=&]2. 受体菌培养：[/font][/b][font=&]从[/font][font=&]LB[/font][font=&]平板上挑取单菌落，接种于10mLLB液体培养基中，[/font][font=&]37℃[/font][font=&]震荡培养12h左右至对数生长中后期。[/font][b][font=&]3. 菌种的准备：[/font][/b][font=&]将受体菌菌悬液以2%的接种量接种于装有20mLLB液体培养基（无抗性）中，37℃震荡培养大约2-3h至OD600=0.4-0.5，菌落数[/font][font=&]＜[/font][font=&]10[/font][font=&][sup]8[/sup][/font][font=&]cfu/mL[/font][font=&]。[/font][/size][align=center][size=10px] [/size][/align][size=10px][font=&][/font][b][font=&]4. 感受态细胞的制备：[/font][/b][font=&][/font][b][font=&](1)离心：[/font][/b][font=&]把上述菌液转移至1.5mL离心管中，冰浴10min，在4℃，3000r/min，离心10min。[/font][b][font=&](2)重悬冰浴：[/font][/b][font=&]弃上清液，加入10mL预冷的0.05M 的CaCl[sub]2[/sub]溶液，轻轻混匀，冰浴30min后，在4℃，3000r/min，离心10min。[/font][b][font=&](3)重悬：[/font][/b][font=&]弃上清，加入6mL预冷的含15%甘油的0.05MCaCl[sub]2[/sub]溶液，轻轻混匀，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。或弃上清，加入6mL预冷0.05MCaCl[sub]2[/sub]溶液，轻轻混匀，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液，直接使用。[/font][b][font=&](4)分装：[/font][/b][font=&]用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url]分装重悬液至1.5mL离心管中，每个离心管中分装50μL悬浮液。[/font][b][font=&](5)保藏：[/font][/b][font=&]标记贴标签[/font][font=&]，使之迅速冷冻，-80℃保藏备用。 [/font][b]五、质粒化学转化[font=&]1.取感受态：[/font][/b][font=&]如果感受态细胞保藏于-80℃，从-80℃冰箱中取一支感受态，室温下解冻后立即冰浴；如果感受态细胞没有保藏，可以直接用于转化。[/font][b][font=&]2.质粒处理：[/font][/b][font=&]一般质粒为粉末，1ng质粒添加10μL缓冲液或蒸馏水，混匀。[/font][b][font=&]3.转化：[/font][/b][font=&][/font][font=&]在含有50μL感受态细胞的离心管中加入1μL稀释后的标准质粒充分混匀，冰上静置30min。[/font][b][font=&]4.热击：[/font][/b][font=&]将离心管置于42℃热击60-90s，然后迅速冰浴，使细胞冷却2-3 min。[/font][b][font=&]5.培养：[/font][/b][font=&]向离心管中加入已预热的无菌LB培养基（无抗性）300μL，150rpm、37℃恒温震荡培养45min。[/font][b][font=&]6.涂布：[/font][/b][font=&]吸取100μL菌液于LB固体培养基上（含抗性），用涂布器均匀涂布，放置于[/font][font=&]37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h。 [/font][b][font=&]7.转化率计算：[/font][/b][font=&][/font] [font=&]转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中菌落数可计算出转化子总数和转化效率，公式如下：[/font] [font=Times New Roman, serif]转化总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积[/font] [font=Times New Roman, serif]转化率=转化子总数/质粒[/font][font=&]DNA[/font][font=Times New Roman, serif]加入量[/font][font=&]μg[/font] [font=&]理论上转化率最高为每微克的标准质粒转化的菌落数为1×10[/font][sup]10 [/sup][font=&]。[/font] [b]六、注意事项 [font=&]1. 严格无菌操作[/font][/b][font=&][/font] [font=&]操作过程，注意进行无菌操作，避免环境中杂菌污染。[/font] [b][font=&]2.严格控制温度[/font][/b][font=&][/font] [font=&] 操作过程，要注意操作温度，以保持细胞的状态；[/font] [font=&]加入抗生素时注意温度，避免过高温度导致抗生素失活。[/font] [b][font=&]3. 严格控制浓度[/font][/b][font=&][/font] [font=&]严格控制细胞的生长阶段和菌浓，严格控制质粒DNA的质量和浓度，以提高转化效率。 [/font] [font=&][/font] [b][font=&]4. 计算转化率[/font][/b][font=&][/font] [font=&]记录和计算转化率的指标如转化子总数、感受态细胞总数和转化频率以评估转化效率。[/font][/size]

【序号】：2【作者】：俞磊【题名】：新型温敏脱细胞髓核基质凝胶的制备及治疗椎间盘退变的研究【期刊】：中国人民解放军海军军医大学【年、卷、期、起止页码】：2021【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C447WN1SO36whLpCgh0R0Z-iszBRSG4W40qHYXhao9i2htytOwJsOmnHEFlHgP7bWRdMyILZlip3VgrSlF4VXULr&uniplatform=NZKPT

【序号】：5【作者】：王学斌薛源茆华女【题名】：光/还原双重响应水凝胶微球的制备及在细胞三维(3D)培养中的应用【期刊】：高等学校化学学报. 【年、卷、期、起止页码】：2022,43(08)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=-93ivAxQXRp8imTuk0mwMoo-OKIJGlmTtLx_DvxMo7V_IhVninuYj7_mef_3g7mSrhrwna6V1EVhKsFPvS878nd4cQ3A3zu5ckLWprsT8toKFsi-AxDyyQiWdHD8B9CLXI4oWDgAryknUkVZAZKEgw==&uniplatform=NZKPT&language=CHS

[em0808]我要做的是小鼠的卵细胞的电镜，但是我所能获得的卵细胞的数量有限的，不知道有什么技巧可以保证细胞能包埋进去，听说有人做了好几次就没有作出来呀 急哦 谢谢大家了

[quote][b]项目概况[/b]河北省血液中心不规则抗体及残余白细胞等试剂耗材采购项目 招标项目的潜在投标人应在河北省成套招标有限公司601室获取招标文件，并于2023年02月22日 09点30分（北京时间）前递交投标文件。[/quote][font=inherit]一、项目基本情况[/font]项目编号：HBCT-230115项目名称：河北省血液中心不规则抗体及残余白细胞等试剂耗材采购项目预算金额：34.5100000 万元（人民币）采购需求：01包：不规则抗体检测细胞等试剂；02包：残余白细胞试剂耗材；03包ABO血型、RH血型室内质量控品合同履行期限：合同签订后一年本项目( 不接受 )联合体投标。[font=inherit]二、对本次招标提出询问，请按以下方式联系。[/font]1.采购人信息名 称：河北省血液中心地址：石家庄市和平路299号联系方式：袁女士 0311-870443142.采购代理机构信息名 称：河北省成套招标有限公司地　址：石家庄市工农路486号联系方式：常女士 0311-830869303.项目联系方式项目联系人：常女士电　话：　　0311-83086930

【序号】：5【作者】：张洋【题名】：仿生杂化水凝胶的制备及用于骨髓间充质干细胞体外3D培养的研究【期刊】：北京协和医学院【年、卷、期、起止页码】：2018【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C475KOm_zrgu4lQARvep2SAk-6BvX81hrs37AaEFpExs0Jr05fYy6UvubZSZnKcMjNnWslIQkwvtg3XpY8vwW0K9&uniplatform=NZKPT

[font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][size=18px]我国科学家在新一代干细胞制备技术上取得重要突破，未来可用于治疗重症肝病、恶性肿瘤等重大疾病。[/size][/font]

【序号】：2【作者】：张小雅【题名】：γ-聚谷氨酸/壳聚糖复合水凝胶的制备及其软骨细胞相容性的检测【期刊】：河南大学【年、卷、期、起止页码】：2022【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=-93ivAxQXRoWpzvnmijM_l1O7kO4p08OzI4shh4Z48M_spDiNyv7zEK1DYOM4745a7bypCSHM2OlQPXqZ-4az5mDBe_vxk9UAQX3EQ7IkMV6z-pdakeD50lyGCOK9l3AUQTRl16TU6wOPRRtbKXh9w==&uniplatform=NZKPT&language=CHS

基本原理本分离单核细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法，主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。此法易操作，且使用通常的实验设备即可完成。试剂与器材•外周血单个核细胞（参见实验1）•PBS1×和PBS10×（无Ca2+、Mg2+），含0.5mM EDTA•胎牛血清（56℃，30分钟加热灭活）•HCl 1mol/l•Percoll分层液（密度=1.130g/ml,商品）•4g/l台盼蓝染液（溶解在PBS液中）•50ml聚丙烯圆锥管•毛细吸管•移液管（1、2、10ml）•CO2孵箱•超净台•有旋转桶转子装置的离心机•PH计操作步骤所有的操作应该在无菌条件下进行一．不同密度Percoll分层液的配制1. Percoll分层液储备液的制备：取未稀释的Percoll原液（从瓶中取）9ml+1ml PBS 10×（无Ca2+、Mg2+），用HCl 1PH至7.42. Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）的配制：取Percoll储备液3.12 ml（前一步配制）+1.88 ml PBS1×（无Ca2+、 Mg2+）3. Percoll分层液 （Ⅱ）（密度=1.069g/ml）的配制：取Percoll分层液（Ⅰ）2.68 ml+2.32ml PBS 1×（无Ca2+、Mg2+）4. Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）的配制：取Percoll分层液（Ⅱ）2.32 ml +2.68 ml PBS 1×（无Ca2+、Mg2+）二．不连续密度梯度制备1. 将洗涤过的8×107外周血单个核细胞重新悬浮在2ml的Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）在这层液体的表面上轻轻铺上2ml Percoll分层液（Ⅱ）（密度=1.069g/ml），后再于第二层液面上轻轻铺上2ml的Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）2. 20℃，在旋转转子中1000×g离心上步所形成的密度梯度90分钟（慢慢增加速度，无制动停转）。三．单核细胞的分离1. 离心后单核细胞存在于Percoll分层液（Ⅱ）和（Ⅲ）（密度较小的部分）之间的界面中。 （图1）图略(暂时)图1. Percoll非连续性密度梯度离心分离法2. 用毛细吸管仔细收集单核细胞。3. 用含1-5%胎牛血清的PBS 1×液洗涤细胞3次，4℃，400×g离心5分钟，弃上清液。4. 若需要进一步实验，将细胞重新悬浮于培养基中。5. 用台盼蓝拒染法测定细胞存活率。（参见第一章第一篇第一节）结果本法回收的细胞中单核细胞占70-100%（存活率应大于90%），淋巴细胞占0-20%，粒细胞占0-5%，红细胞占0-7%，血小板小于0.5%。实验要点1. 为了得到较好的结果，外周血单个核细胞分离后应立即使用。2. 所有操作过程应在18-20℃中进行。3. 仔细覆盖各种Percoll分层液，避免破坏其界面。4. 洗涤分离细胞3次，以除去残存的Percoll分层液和血小板。5. 如果所制备的细胞仍不纯，可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗体分子的磁珠， 以除去残存的NK、T、B淋巴细胞。

白细胞与红细胞在此重新定向。白细胞（WBC）和红细胞（RBC）是血液中的重要组成部分，在生命体延续发展和生物治疗中具有不同的功能。红细胞，又称红血球，含有一种蛋白质称作血红蛋白。当血红蛋白从肺部吸收氧气时，血液呈红色。随着血液流经全身，血红蛋白向人体组织释放氧气。红细胞的生命周期为4个月，其形如圆盘，中间下凹，边缘较厚，呈圆饼状。白细胞，又称白血球，具有更加复杂的功能。白细胞构成了人体抵抗感染的一种防御机制。有多种不同类型的白细胞，其生命周期和功能各不相同。白细胞还能够产生一种特殊的蛋白质，称作抗体，能够识别并吞噬入侵人体的外来异物。 红细胞白细胞物理特征红细胞呈双凹圆盘状，无核。尺寸大约为6-8 μm。白细胞呈不规则性，但有一个核和外缓冲层。生命周期120天。几天，但在健康人体中可存活数天至数年不等。类型：血液中只有一种红细胞在血液中存在许多类型的白细胞，其功能各不相同：嗜中性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞（巨噬细胞）、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。循环系统：心血管系统。心血管和淋巴系统总计红细胞700:1白细胞男性每立方毫米460-6200万个；女性每立方毫米4200-5400万个。每立方毫米4000 – 11000个功能：向身体的不同部位提供氧气，并负责运送二氧化碳和其它废物。产生抗体，对感染形成免疫力，有些具有噬菌功能。血液中含量：

单细胞凝胶电泳步骤：1. 分离制备单细胞悬液：（1） 体外培养的细胞株：用胰酶消化，最后用PBS悬浮吹打成单细胞悬液，细胞要计数，具体的量我前边已经说过。（2） 体内脏器细胞：处死动物，取出脏器，于Hanks’液中制备成单个细胞悬液。2. 胶板制备：（1） 取100μl于45℃水浴中保温的0.5%NMA，铺于磨沙载玻片上，形成底胶。盖玻片推匀，不能有气泡，4度凝固5至8分钟。（2） 水平取下盖片，取100μl于37℃水浴中保温的0.5%LMA与20μl细胞悬液（约400个细胞）混匀，立即铺片，加上盖玻片，4度凝固5至8分钟。3. 细胞裂解与电泳：（1） 将制备好的胶板去掉盖玻片后，浸于4℃预冷的细胞裂解液中，在4℃下裂解2.5到3小时。（2） 取出胶板，用双蒸水浸没漂洗后放入电泳槽中，浸泡在4℃预冷的电泳液中解旋20分钟。（3） 玻片水平放置阳极端附近，4℃电泳20到25分钟（25V，300mA）。可在电泳槽周围加冰块以保持低温。4. 中和与染色：（1） 电泳结束，将胶板浸泡于中和液中，每次10分钟，共中和3次，每次要更换中和液。最后晾干。（2） 取出胶板，置于染色缸中，在2μg/ml的EB染色液中，暗处染色5到10分钟。（3） 蒸馏水漂洗2次，每次5分钟。稍晾干，滤纸吸去多余水分，尽快在荧光显微镜下观察。从胶板制备开始到最后都应该在暗光下操作。先讲这些，你们可以先开始摸索，真正做了才能发现具体的问题，到时我们再探讨。

二、仪器、用品与试剂0.4 % w/v 台盼兰trypan blue (GibcoBRL 15250-061) Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline 血球计数盘及盖玻片(Hem℃ytometer and coverslip) 计数器(counter) 低倍倒立显微镜 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics) 三、操作步骤（一）细胞计数3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。 3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色 ( 或红色- Erythrosin bluish) 。3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线 上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细 胞。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数x 2/ 4×10000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占 10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。（二）细胞活力1、将细胞悬液以 0.5ml加入试管中。2、加入 0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色 2一 3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用 。

[font='calibri'][size=13px]单克隆抗体的制备过程及原理是什么？[/size][/font][font='宋体'][size=13px]义翘神州是一家抗体试剂和定制抗体的领先供应商，目前已成功交付了数以万计的抗体项目，客户涵盖科研院校、生物制药公司、诊断公司和其他生物技术公司等。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]针对定制单克隆抗体，义翘神州提供了一套全面的解决方案。我们将与您通力合作，完成从抗原设计、纯化和抗体验证的完整过程。义翘神州拥有包括杂交瘤、噬菌体抗体库和单B细胞在内的抗体发现平台， 我们可根据您感兴趣的靶点、抗体应用和时间表等，来选择最合适的技术平台。 此外，义翘神州还提供ELISA、WB、流式细胞术、IHC、基于细胞的筛选、亲和力检测等多种表征和筛选技术，确保最终鉴定到最佳的抗体，以满足研究、诊断和治疗领域等应用。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]单克隆抗体的制备原理：[/size][/font][font='宋体'][size=13px]单克隆抗体(MAb)是针专一的抗原决定簇产生的抗体，单克隆技术又名杂交瘤技术起源于1975年，由G.K?hler和Milstein创立。主要原理是利用产生抗体的B细胞与肿瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]单克隆抗体的制备过程：[/size][/font][font='宋体'][size=13px]1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]2、细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。[/size][/font][font='宋体'][size=13px][url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services][b]单克隆抗体定制服务[/b][/url]推荐：https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/size][/font]

我初次接触TEM，是准备看细胞的精细结构，完全没有经验，有很多问题想问，现在先问问样品制备的问题。1、细胞准备用抗体金标记蛋白，需要哪些试剂和材料呢？ 支撑膜？包埋树脂？四氧化锇？醋酸饿？缓冲液是电镜专用吗？等等等2、以上试剂和材料在哪里购买？3、细胞厚度有几个微米，应该是需要切成薄片吧。细胞用什么样的切片机？我们实验室肯定没有，你们一般是怎样切片的？哪位大神帮忙解答一下，拜托了http://img0.imgtn.bdimg.com/it/u=511146182,1771180330&fm=21&gp=0.jpg

最经在做细胞内辅酶Ⅰ提取研究，想通过制备型液相来纯化经高压均质机破壁和粗提取的辅酶。但是不知道该制备型液相固定相怎么选择，选择哪种填料好