超高分辨图像

近日，记者从中科院化学所获悉，该所胶体、界面与化学热力学重点实验室李峻柏课题组利用其开发的“超高分辨率荧光显微镜”，观测到生物矿化过程中参与结晶的蛋白质分布信息。论文在《德国应用化学》上刊发。　　“超高分辨率荧光显微镜”可以超越远场光学显微镜的分辨率极限，直接检测到几十纳米的精细结构。而与能达到相同或更高分辨率的X光显微镜、各类电子显微镜及原子力显微镜相比，超高分辨荧光成像能在常温常压和基本不损伤生物样本活性的条件下，获得其纳米尺度的图像信息。　　研究人员介绍，“超高分辨率荧光显微镜”又称为随机光学重建显微镜(STORM)，可达到或好于50纳米分辨率。在前期研究中，李峻柏课题组在超高分辨图像采集和数据分析方面发展了实时单分子定位的程序包SNSMIL，该程序包可广泛应用于高背景成像的数据分析。　　他们利用STORM观测到方解石中生物矿化过程中参与结晶的蛋白质分布信息，为研究蛋白质诱导生物矿化的机理提供了数据。

现如今对材料进行微观形貌表征时，仅仅看到清晰的形貌是远远不够的，针对有重复结构的材料，如多孔，颗粒等结构的样品，还需对图片中的孔洞或颗粒进行统计与分析，比如统计总数，大小，尺寸等，获得量化结果，辅助研究。硫酸铝矿孔径分布测量当我们对多孔硫酸铝样品进行观察，孔径尺寸大约在10nm左右，由于孔径尺寸非常小，想要清晰的观察到孔的形貌，需要使用超高分辨场发射扫描电镜Regulus8200观察，利用其低加速电压下高分辨率的特点，轻松获取高倍清晰图片。由于图像里的孔与背景亮度对比度的不同，使用Image Pro图像分析软件对感兴趣区域框选，软件可通过信号的强弱分离孔洞并自动测量硫酸矾石的孔径分布（图2）及定量数据。图2中的图表是平均孔径的直方图。当我们分析数据时，可以选取一个孔（图2中的粉红色箭头）时，您可以看到它在直方图中的位置（红色圆圈）。或者在直方图中选择一个条柱（图 3 中的粉红色箭头）时，您可以看到所选条柱包含哪些孔（Brue 字符）。统计数据直方图如图4所示。高容量硬盘驱动器（HDD）中的，磁性颗粒粒度分析高容量硬盘驱动器（HDD）中的磁性颗粒会随着记录密度的提高而变小。然而，较小的磁性颗粒可能会产生较小的矫顽力，因此会妨碍稳定的记录。因此，评估晶粒尺寸和晶粒间距对于实现和保持稳定的HDD性能非常重要。图5（a）显示了配置高容量HDD的磁盘上磁性颗粒的BSE图像。通过使用YAG-BSE探测器拍摄70万倍的高分辨图像，并从中获取颗粒的形状。在对图像上的颗粒进行分析时，首先这些晶粒被识别为感兴趣区域（ROI），使用Image-Pro 10图像处理软件将晶界和背景进行分离，如图6（b）所示。尽管BSE图像因为通道效应导致每一个颗粒对比度和亮度不均匀，但依然可以稳定地对颗粒直径或面积定量分析，因为这些颗粒是通过信号强度提取的，另外还通过其形状和大小提取的。图7（c）是磁性晶粒直径的柱状图。超高分辨冷场扫描电子显微镜Regulus8200和图像分析软件Image-Pro 10的组合可实现HDD的高分辨率成像和定量图像分析，帮助HDD在增强记录密度的研究中。Regulus8200 "Regulus系列"扫描电子显微镜（SEM）被广泛应用于纳米技术，半导体电子行业，生命科学，材料科学等领域的材料结构观察。仅仅具有超高分辨率还远远不够。还要求能在低加速电压下对表面细微结构的观察和高灵敏度的元素分析。发挥高性能，高稳定性，轻松获取高倍清晰图片。END公司介绍：日立科学仪器（北京）有限公司是世界500强日立集团旗下日立高新技术有限公司在北京设立的全资子公司。本公司秉承日立集团的使命、价值观和愿景，始终追寻“简化客户的高科技工艺”的企业理念,通过与客户的协同创新，积极为教育、科研、工业等领域的客户需求提供专业和优质的解决方案。 我们的主要产品包括：各类电子显微镜、原子力显微镜等表面科学仪器和前处理设备，以及各类色谱、光谱、电化学等分析仪器。为了更好地服务于中国广大的日立客户，公司目前在北京、上海、广州、西安、成都、武汉、沈阳等十几个主要城市设立有分公司、办事处或联络处等分支机构，直接为客户提供快速便捷的、专业优质的各类相关技术咨询、应用支持和售后技术服务，从而协助我们的客户实现其目标，共创美好未来。

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随着纳米材料在各个工业领域的应用，推动了超高分辨率的扫描电镜的发展，但这些材料导电性不佳，因此，对低电压下仍具有高分辨率的扫描电镜提出迫切需求。 低电压扫描电镜的主要特点之一是能直接对不导电样品进行观察，同时保持高的分辨率。但是其面临的问题是束流电压降低，信号量会显著下降，同时低电压下扫描电镜像差导致分辨率降低。随着扫描电镜技术的蓬勃发展，这些问题目前都得已大大改善。 为了弥补低电压下信噪比低的问题，赛默飞Apreo 2系列电镜配备了YAG材质背散射探测器（T1）（图1）。YAG（Y3Al5O12:Ce3+）是一种具有高发光效率的闪烁体材料，用掺铈的YAG材料制成的背散射探测器，发光效率更高，亮度更高，更耐离子和电子的轰击，因此几乎不存在随使用时间的累积而导致发光效率下降的问题。Apreo 2系列电镜的T1背散射探测器置于镜筒内靠近极靴下部，这样不仅可以获取大量的信号，而且不会有误操作导致的撞毁风险。同时T1接收的是背散射电子，因此，可以大大改善导电性不佳的样品带来的荷电问题。 图1 Apreo 2 扫描电镜的T1探测器位置示意图 为了减小低电压下像差增加的问题，赛默飞Apreo 2系列电镜发展出了样品台减速模式（图2），以减小透镜色差和提高低电压图像分辨率。减速模式中引入的“着陆电压”的概念，即实际到达样品表面的电压，其计算非常简单，入射电压减去减速电压即为着陆电压。例如，电子束初始加速电压5kV，在样品台上加4kV的减速电压，在样品表面的着陆电压为1kV，采用减速模式后入射到样品上的电压是1kV，在样品内的电子束扩展范围和对样品荷电的减缓同初始加速电压为1kV的情形一致，但其电子束的亮度接近加速电压为5kV的状态。因此，采用减速模式，一方面保持了高加速电压下的亮度和足够的信噪比，以及高分辨率，同时又真正实现了样品表面荷电的有效缓解。减速模式下，还有一个优点，使电子束与样品相互作用产生的信号电子在减速电压的作用下加速，这些信号电子在被探测器探测到时能量更高，从而提高了二次电子或者背散射电子收集效率，增加了信噪比。图2 样品台减速模式工作原理示意图 在实际应用中，我们会将样品台减速模式和T1探测器联合使用，以获取高分辨图像。比如，锂电池隔膜是一种PP或者PE材质的高分子薄膜，其导电性极差，常规的电镜无法解决荷电问题，而使用T1探测器不仅可以解决荷电问题，而且搭配减速模式仪器使用还可以获取高信噪比图像（图3）。稀土氧化物Y2O3粉体是制造微波用磁性材料及军事通讯工程用的重要材料，综合导电性较差，高加速电压容易使表面积累荷电，而且会掩盖颗粒表面细节，因此，我们采用低加速电压搭配减速模式进行高分辨成像（图4）。 图3 锂电池隔膜（加速电压：500V，放大倍数：30000，探测器：T1，减速电压：1kV） 图4 Y2O3粉末颗粒（加速电压：500V，放大倍数：100000，探测器：T1）

国际知名先进探测器生产企业greateyes正式发布了一款科学级超高分辨CCD相机（GE-S），用于红外到X射线区域进行光谱分析及成像。该款相机运用最新技术，为用户提供了大动态范围下亚像素分辨的能力。与标准的科学级CCD相比，科学级超高分辨CCD相机有着更好的空间及光谱分辨能力。 为了对超分辨的性能进行评价，我们将科学级超高分辨CCD（型号：GE-S 1024 1024 BI UV1）安装到光学显微镜上。通过显微镜的点扩散函数远远小于CCD的像素尺寸，来检测探测器的真实的亚像素分辨能力。上图显示了分辨率测试卡（1951 USAF）的图像由三个条状组成。图1为CCD获取的标准图像，图2为设置亚像素尺寸的一组4x4单独阵获取的超高分辨图像，图3作为参考显示了插值图像。从以上图中可看出，超高分辨图像与标准图像和插值图像相比，可以提供更多的信息。同时，我们可以通过选取的线的强度分布，清楚看到真实的亚像素分辨能力。图1-3中的白线显示了选取的区域。可实现的亚像素探测器分辨能力被确定为1.6倍，通过优化实验布局可以得到更好的结果。greateyes科学级超高分辨CCD之所以在大动态范围下，还能达到亚像素的分辨能力，得益于在图像传感器和制冷元件后方集成了一个非常紧凑的X-Y位移装置。基于期望达到的空间分辨能力，通过软件用户可选择预定义的测量顺序。例如，2 x 2的图像子集下，最终图像尺寸增至相机图像传感器的4倍。软件采集2 x 2 = 4帧顺序图，每帧下传感器在x与y方向上移动亚像素微米级的距离。并通过算法将各帧图像合成最终的超分辨图像。 超分辨图像的获取与单个图像的获取一样简单。所有其他性能参数与greateyes科学级CCD相同。见下表。 成立于2008年的greateyes，是以德国柏林洪堡大学的技术为基础，迅速发展成为国际知名的先进探测器生产企业。如今，其科研与工业客户群体已遍布多个国家。greateyes开发、生产并销售高性能科学相机。其作为精确探测器，被广泛应用于成像与谱学应用领域。同时，greateyes公司也生产用于太阳能产业的电致荧光与光致荧光检测系统。greateyes科学级CCD以其超低的读出噪声、极高的量子化效率、极低的暗电流以及超高的动态范围而闻名。超高的动态范围相应要求具有极高的满井容量的大像元，因而其空间分辨能力十分有限。而最新型的greateyes科学级超分辨CCD集成了超分辨技术从而实现亚像素分辨能力。其实现过程是通过亚像素微米范围内探测器的移动，同时抓取不同图像生成具有较高分辨的图像。整个图像采集过程实现了全自动化。全新的产品，独一无二的超高分辨技术，让greateyes再一次成为业界人士关注的品牌。作为国际知名的先进探测器生产企业，greateyes为客户提供全球最高端最具性价比的探测器，北京众星联恒致力于成为中国最优秀的专业技术服务团队，为中国地区客户提供一流的本地服务和技术支持。

微球透镜（SMAL）成像技术，突破传统光学显微镜光学衍射分辨率极限（200nm），将用户带入全新的显微镜时代。　　 微球成像专利技术提高了光的功率，横向分辨率可达50nm，SMAL物镜可放大到400x。　　 通过SMAL成像技术，用户能够得到超高分辨率图像并保留光学显微镜所有优势——快速、简单、无损、完整、真实颜色。我们致力于为所有人能获得超高分辨率图像，无需昂贵的设备和严格的使用环境也无需大量的样品，只需光源、透镜和相机。　　 定制软件算法将高分辨率的微球图像拼接在一起，机械台会将样品移动到镜头下方。使用户能够快速的得到全彩色和超高分辨率的大区域样品图像。创新点：微球透镜（SMAL）成像技术，突破传统光学显微镜光学衍射分辨率极限（200nm），将用户带入全新的显微镜时代。 　　微球成像专利技术提高了光的功率，横向分辨率可达50nm，SMAL物镜可放大到400x。 　　通过SMAL成像技术，用户能够得到超高分辨率图像并保留光学显微镜所有优势——快速、简单、无损、完整、真实颜色。我们致力于为所有人能获得超高分辨率图像，无需昂贵的设备和严格的使用环境也无需大量的样品，只需光源、透镜和相机。 　　定制软件算法将高分辨率的微球图像拼接在一起，机械台会将样品移动到镜头下方。使用户能够快速的得到全彩色和超高分辨率的大区域样品图像。

光学显微镜至今已有三百多年的历史，从观察细胞的初代显微镜发展到如今打破分辨率极限的超分辨显微镜。近年来，生命科学领域蓬勃发展，对显微成像技术不断产生新的需求，光学显微镜不断向更高分辨率、快速成像、3D成像等高端技术方向发展。 我国高端光学显微镜市场长期处于被国外产品垄断的局面，许多关键核心部件依赖进口。令人欣喜的是，近五年来，市场上涌现出多种国产高端光学显微镜，包括超分辨显微镜、双光子显微镜、共聚焦显微镜、光片显微镜等，逐渐打破当前市场格局。基于此，仪器信息网特别制作“破局：国产高端光学显微镜技术‘多点开花’” 专题，并向国产光学显微镜企业广泛征稿（投稿邮箱：lizk@instrument.com.cn），了解各企业主要高端光学显微镜产品技术特点和发展进程。本篇为宁波力显智能科技有限公司供稿，公司主要产品为INVIEW iSTORM超高分辨率显微镜，其采用的STORM技术是目前国内鲜少有的超分辨技术类型。撰稿人：宁波力显智能科技有限公司副总经理张猛博士人类的历史，也是一部工具的历史。人类发展的历程就是关于如何对世界了解的更多，将人类生活变的更好更先进的历程。从旧石器时代，原始人拿起第一块石头当作工具开始，就开启了用工具进行未知世界探索和创造性改变的历程。从古至今，人类都是工具发明和使用的种族，新工具的问世也反哺人类的成长和进步，让人类一次次突破原有认知边界看到更多的未知，解决更多的问题，取得更多的成就。显微镜，正是一项帮助人类认识微观世界从而改变世界的革命性工具，也是人类探索微观世界不可缺少的工具。显微镜问世之前，人类仅可用感官来把握世界，所能认识到最小世界就是“目所能及”的常规世界，人的肉眼仅能分辨约0.1毫米尺度的物体，因而相关科学的发展缓慢。当罗伯特胡克使用显微镜观察到软木塞上的“小室”，并将其命名为细胞时，可能还没有意识到他这次实践将为人类开启微观世界的大门。人类对未知领域无限的好奇心是推动科学技术前进的动力之一，为了解析关乎生命基本结构，回答有关物质与生命等基本问题，为此人类不断开发出更为精密、分辨率更高的显微镜来探寻这些问题的答案。经过400多年的发展，近几年国际上出现了超高分辨率显微镜这一工具，一经面世就引起了众多科学家的关注和极大兴趣。那么什么是超高分辨率显微镜，为什么它能让科学家如此感兴趣呢？我们一起往下看。超高分辨率显微镜的诞生，是生命科学史上的一座里程碑简单的讲，超高分辨率显微技术是通过应用一系列物理原理、化学机制和算法“突破”了光学衍射极限，把光学显微镜的分辨率提高了几十倍，使得人类能在200nm以下以前所未有的视角观察生物微观世界的技术，具有超高分辨成像技术和实现超高分辨率成像能力的显微镜就是“超高分辨率显微镜”。那么什么是光学衍射极限呢？所谓光学衍射极限，是1873年德国科学家恩斯特阿贝提出的，由于光是一种电磁波，存在衍射，一个被观测的点经过光学系统成像后，不可能得到理想的点，而是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑，如果这两个点靠得很近（小于可见光波长大约一半，约200nm），弥散斑就叠加在一起，看到的就只能是一团模糊的图像，也就无法清晰观测到衍射极限以下物体的微观空间结构。并且光学衍射极限此前长期被认为是限制光学显微镜技术通向更微观的“拦路虎”和“绊脚石”，甚至被科学界一度认为是无法突破或绕开的。直到2000年，几位世界知名科学家先后发明了几种不同技术路线的的超高分辨率显微技术。其中，Stefan Hell、Eric Betzig和W.E. Moerner三位科学家就是因其在超高分辨率显微成像技术领域的突出贡献，获得了2014年诺贝尔化学奖。至此，人类才得以突破光学衍射极限这一横亘在前、不可逾越的“大山”，实现了200nm以下超高分辨率显微成像，以光学的方法观测到纳米尺度世界的真实样貌。超高分辨率显微镜可用来研究分子定位与空间分布、分子相互作用、分子复合物的构成，并可实现分子的计数。除具有200nm以下卓越分辨率性能外，对生命样品结构也可进行精准成像定位，还具备对活体细胞进行微观观察的可能性，对于生物、生命科学、医药、医学等的领域都有着重要意义，因此吸引了全球科学家的持续研究和关注。通常来说，超高分辨率显微镜主要有两大类技术策略，一类是通过特定模式照明对分子受激荧光差异化调制实现超高分辨率成像。代表产品有受激发射光耗损显微镜(Stimulated Emission Depletion, STED)和结构光照明显微镜(Structured Illumination Microscopy, SIM)。另一类，是利用荧光分子的“开关”特性，使其随机闪烁，从而能够对单个分子分别记录，实现超高分辨率成像。随机光学重构显微镜（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM）就是这类技术路线的代表。第一大类中，STED及其衍生都是利用“甜甜圈”状的空心光束来修饰位于中间激发光的点扩散函数（Point Spread Function, PSF），从而达到直接超分辨成像的目的。而SIM则是利用了结构光照明，以获得包含样本的结构信息的干涉图案“摩尔条纹”，加上后期的图像重构，达到超分辨成像的目的。第二大类中，STORM是利用了荧光染料分子“光控开关”（photo-switchable）性质，达到在一个衍射极限空间内（200~300 nm）随机“点亮”单个荧光分子并进行高精度定位的目的。既然叫超高分辨率显微镜，最为重要的就是对空间分辨率的提升。其实无论哪一类技术，理论上空间分辨率都是可以实现无穷小，但是受限于样本、荧光染料特性、标记密度、激发光效率等原因，实际拍摄中能实现的空间分辨率是几十纳米。从遍地洋货到国货崛起众所周知，高端显微镜市场被“洋货”所长期垄断，不仅在国外如此，在中国也是如此，国货“芳踪难觅”，这对于我们这样一个大国来说可算是“一言难尽”。当然，也有令人感到振奋的信息，那就是在超高分辨率显微镜这个细分领域，除了“洋货”最近也已见到了国货产品的身影。宁波力显智能科技有限公司（INVIEW）的超高分辨率显微镜产品INVIEW iSTORM就是一款国产超高分辨率显微产品。宁波力显智能科技有限公司是专业从事超高分辨率显微技术和产品研发的科技企业，依托复旦大学的自动控制、新一代信息技术及香港科技大学的生物、光学、图像处理等的技术，拥有光学、生物、自控、机械、信息技术等多领域交叉学科技术团队，将2014年诺贝尔化学奖得奖技术产业化，推出了INVIEW iSTORM超高分辨率显微产品，以帮助人类以前所未有的视角观察微观世界，突破极限，见所未见。INVIEW iSTORM超高分辨率显微镜产品采用dSTORM技术路线，具有20nm超高分辨率、2-3通道同时成像、界面友好、简单易用、系统稳定性好、环境适应性高等的特点。技术先进，20nm超高分辨率，3D成像采用STORM随机光学重构技术，加入柱面镜设计，在XY轴分辨率达20nm、Z轴分辨率达50nm，具备3D成像功能。多通道同时成像光路设计，稳定性高采用专有的多通道同时成像的光路设计，提供稳定的光路。自主开发的成像分光光路，可保证通道间的光学路径相对独立，使得样品发出的荧光最大效率地被探测器接收，最大限度降低通道间的串扰。并配合以最佳染料方案和最佳成像缓冲液配方，以多通道同时成像的方式，在几秒到十几分钟的时间范围内实现20nm的超高分辨率成像。物理样品锁定设计，锁定精度1nm采用纳米级实时动态锁定技术，以实时物理补偿方式纠正样品漂移，无需预热，即开即用，操作简便，免受如气流、温度变化、噪音、机械振动等的环对样品位置的影响，在高楼层、嘈杂、震动、常温常态的环境下也能稳定成像，因而具有高效、简便、对环境适应性好的特性，友好易用。 “傻瓜式”操作，易学易用软件集成了多种成像算法，并在采集数据时实时呈现超高分辨图像重构结果和详细参数，“所见即所需”，操作流程化，简单易用。具有拍摄过程简单易用、参数优化实时透明、超分辨图像实时重构、自动化用户数据管理、图像数据后分析功能等五大特点。此外，经过优化的样本制备方案更易于实验人员的掌握和实际操作。即便是技术新手，经过简单的技术讲解，2个小时以内就可操控系统并获得理想的超分辨率成像结果。以上，INVIEW iSTORM超高分辨率显微产品所具备的综合特点和优势，使得它能够帮助到更多科学家进行衍射极限尺度以下的生物分子组织与相互作用等的尖端科学研究。另外，值得一提的是，INVIEW iSTORM产品还以优异的光路、较低强度的照明、多通道同时成像所支持的较短成像时间等的综合性能，结合合适的荧光探针及根据探针特性调整的探测器拍照频率等，实现活细胞的超高分辨率成像，这将更大程度上帮助到科学家在生物学基本问题与机制上的科学研究。随着人类对自然的认识向更加微观的时空尺度，传统的科研手段已经不能完全胜任，没有高端科研仪器，要想做出重大原始创新科研成果很困难。力显智能科技将继续立足于超高分辨率显微镜技术研究及产品开发，不断推出新技术、新品，从而推动高端显微技术在中国的产业化和应用，努力为我国生命科学、医学、药学等领域的科学研究提供强大助力。INVIEW iSTORM超高分辨率显微产品超高分辨率显微技术的未来可期作为一种新兴荧光显微成像技术，超高分辨率显微成像正受到科学家们的广泛关注，实验室中不断产生着振奋人心的数据。围绕着超高分辨率核心，主要研究方向为不断提高显微镜成像性能，使其分辨率更高，成像速度更快，成像深度更深，视野范围更大，及更低的光毒性光漂白。而我们也可以清晰的看到，由于不同的超高分辨率成像技术提升分辨率的技术路径差异，很难有“面面俱到”的技术可以满足差异化样品的全部成像需求，“精准成像”，也就是针对不同的样品特点，而选择最适合这类样品的显微成像技术，是进行生命科学等领域研究的最优解，这也促使生物，光学，算法，图像处理等领域的研究人员不断深入跨学科合作，共同探索生命的奥秘。即便有了更快、更高、更深、范围更大，更低光毒性光漂白的超高分辨率显微镜，扩展应用仍有诸多挑战。细胞内有成千上万的转录本，有数以万计的蛋白分子。超高分辨率显微镜能否用来实现组学水平的多分子检测？能够找到或开发出足够多样的荧光染料以匹配更多分子吗？或者能找到奇方妙法可以实现多重、多轮检测吗？ 能否开发出新型的荧光染料，使其具有更高的光子预算，更好的光稳定性、光激活、光开关以及转换速率等特性；研制更快更灵敏的光子探测器、输出功率更高的激光器；更稳定、高效、智能的光学系统；更加高效的算法以及不同超高技术路线的联合应用；开发组学水平的多重检测方法等等，正有许多的科学家、研究者们正在进行着有益的尝试。相信未来超高分辨率技术应可应用于实现细胞内的原位测序、原位转录组与蛋白质组分析，并最终获得全景的、多组学、全时空细胞全部分子组织及相互作用图像，真正实现分子生物学与细胞生物学的新融合，让人类有更全面、更精细的视角来理解生命的基本分子组织及其运行的基本机制！超高分辨率技术和产品应用前景巨大，未来可期，令人振奋！

引言2020年注定是不平凡的一年，也将是载入史册的一年。一个不太热门的研究，一下子进入了公众视野，给我们上了一堂沉重的课。那么如何有效防范病毒传播，如何进行专业防控和疫苗研发，这都需要对病毒基本特征和机理深入研究。 然而，由于受到光学衍射极限的限制，普通光学显微镜分辨率只能达到200nm，而通常病毒和亚细胞结构的尺寸只有几十到200多纳米，远远小于普通光镜的分辨率。超高分辨显微技术的出现，为观测这类精细结构提供了可能，因此也得到了越来越广泛的应用。作为超高分辨技术的先驱，受激发射损耗（STimulated Emission Depletion, STED）技术更是在生命科学领域尤其是病毒学相关研究中发挥着重要作用。 本次为大家分享STED技术在病毒学研究中的应用和新进展，助力生命科学研究和发展。 STED基本原理2014年诺贝尔化学奖授予三位科学家，以表彰他们发明超高分辨显微技术。其中Stefan Hell发明了STED技术，而徕卡公司也是第一个将其商业化。从2007年开始，徕卡STED产品不断创新和优化，已经拥有近13年的STED技术积累。2014年首次推出SP8 STED 3X，即荣获当年的R&D100大奖。2019年更是创新性的推出了τ-STED，进一步在提升分辨率的同时降低了激光功率，更适合活细胞超高分辨成像。2014年诺贝尔化学奖获得者，左起分别是：Eric Betzig、Stefan W. Hell、William E. Moerner说了这么多，STED技术原理到底是什么呢？很简单。我们想象一下，一个点发射出的荧光信号，被检测后通常是一个衍射斑；如果我们同时使用一个甜甜圈样的激光将其周围的信号擦除掉，只允许中心很小的荧光信号发射出来，这样分辨率不就提高了吗。这个起擦除作用的激光便是STED激光，也叫损耗光，利用的是荧光的受激发射损耗原理。之后，通过对图像的扫描，即可直接呈现超高分辨图像，无需任何后续计算过程。同时，根据公式，可通过增加STED激光功率来提升图像分辨率。STED原理示意图：STED通过受激发射损耗去除衍射环上的荧光信号，大大缩小有效的激发区域，从而改写了分辨率公式，提高了光学分辨率 STED技术在病毒学研究中的应用实例 01第一个应用实例，是对病毒精细结构的观察。2012年发表在国际顶级期刊science上，标题为：荧光纳米显微镜（STED）揭示成熟依赖的HIV-1病毒表面蛋白的再分布特征【1】。图中绿色代表HIV-1病毒粒子，红色表示病毒表面的膜蛋白。可以看到，通过普通共聚焦无法分辨膜蛋白的具体定位位置，很模糊。包膜糖蛋白gp120（红色）与病毒粒子（绿色）90%共定位，信号模糊，分辨不出细节。而STED成像可以发现，大多数成熟病毒粒子表现出单一的包膜蛋白Env信号或焦点(图1B)，而大多数未成熟粒子表现出两个或两个以上的包膜蛋白Env信号(图1D)。 02第二个应用实例，是对病毒成熟过程的观察。标题为：STED纳米显微镜揭示HIV病毒蛋白水解成熟的时间过程【2】。利用STED显微镜发现在HIV-1病毒成熟和未成熟条件下，可非常清晰区分其Gag蛋白的不同结构特征。未成熟病毒的Gag蛋白呈中空环状（图a），而成熟病毒中呈实心固缩状（图b）。作者巧妙的利用光控方法，进行STED时间序列成像。在400nm紫外光照后，PDI（光催化降解的蛋白酶抑制剂）降解，Gag蛋白能够被蛋白酶水解切割，进而病毒成熟。STED时间序列成像可轻松捕获病毒从未成熟到成熟过程，Gag蛋白重排的结构变化过程。03第三个应用实例，是对病毒基因组示踪。标题为：以单分子分辨率示踪宿主细胞中的病毒基因组【3】。腺病毒DNA通过AF594标记的叠氮点击反应显示，衣壳蛋白通过抗hexon的抗体识别，并且只有在脱壳后，病毒DNA才可以被反应检测到荧光信号。 通过gated STED超高分辨显微成像，可显著提高分辨率，清晰呈现病毒衣壳和DNA的真实尺寸大小。腺病毒衣壳实际大小约80nm，gSTED显示约110nm（包含一二抗尺寸），与实际一致。gSTED显示被衣壳蛋白包裹的病毒DNA尺寸略小于80nm，也与衣壳尺寸符合。 04第四个应用实例，是对病毒基因组复制的观察。标题为：利用STED超高分辨显微镜观察复制的HSV-1病毒【4】。值得一提的是，本文由中科院昆明动物所周巨民老师课题组与徕卡公司合作完成。病毒基因组复制是单纯疱疹病毒 1 (HSV-1) 溶解感染周期的重要事件。目前由于检测和观察方法的局限，病毒复制过程的细节仍难以捕捉。为了获得更加详细的 HSV-1 复制机制，本文使用了STED受激发射损耗显微镜，结合荧光原位杂交 (FISH) 和免疫荧光，对HSV-1 复制过程进行了精细观察。 作者设计了位于HSV-1病毒基因组两端的探针，分别以DIG（绿色）和Biotin（红色）进行标记，在病毒复制的早期和晚期，分别成像观察。STED成像发现，在复制的早期，红绿两色信号的共定位程度较高；而在复制后期，两个系数均发生了明显降低，表明HSV-1 基因组在复制过程中经历了从紧凑到松弛的动态结构变化，同时需要占用较大的空间进行复制。 05第五个应用实例，是对病毒侵染和传播过程捕获的研究。标题为：ARP2和病毒诱导的丝状伪足促进了人类呼吸道合胞体病毒的传播【5】。利用STED超高分辨显微镜进行成像，发现感染了RSV病毒的细胞（图A第一行，标记为A和C）外存在大量的丝状伪足（红色），且富集有大量病毒颗粒（绿色）；暗示可通过丝状伪足将RSV病毒传递给邻近细胞。而在ARP2敲除的细胞中（图A第二行），即便感染了RSV病毒，细胞的丝状伪足数量都大量减少，病毒在细胞间的传播不明显。放大图像（图B），可观察到RSV病毒主要分布在丝状伪足的尖端，进一步验证了病毒可通过诱导丝状伪足的产生来促进其在细胞间的传播。 如何进一步提高STED分辨率？根据公式我们可以知道，通过增加STED激光功率就可直接增加图像的分辨率，这个方法最为简单；但问题是不利于活细胞成像。那么如何在不提高激光功率的前提下，进一步提高STED分辨率呢？有以下三种方法，分别是gated STED，gated STED + Lightning，和徕卡新推出的τ-STED。 01以两个距离76nm的DNA Origami为例，gated STED在不改变STED激光功率的前提下，逐步缩小荧光寿命的检测范围，可逐步提高分辨率，清晰地分辨两个点信号。02对中心粒的gated STED + Lightning成像结果，分辨率（半高宽）可达22nm！03新一代STED：τ-STED，即将STED和超快速的荧光寿命相结合，实时呈现超高清分辨图像。它在已有STED优势的基础上，可以更低激光功率获得更高图像分辨率，进一步拓展荧光染料的选择，非常适合长时间的活细胞成像。结语徕卡STED拥有13年的研发、技术和服务经验，也具有以下突出优势特点，是病毒学研究的绝佳利器：“纯光学”超高分辨显微技术，所见即所得全光谱、多色超高分辨成像，提供592nm/660nm/775nm三根 STED谱线专为STED设计的多款满足不同应用需求的物镜使用常规荧光染料及荧光蛋白，制样简单、方便τ-STED低光毒性，更适合活细胞超高分辨成像快速扫描头能够更好的保护样品LAS X Navigator能够轻松寻找目标视野 此外，整个STED是搭载在徕卡共聚焦平台上的，因此也拥有共聚焦的所有优点。相信徕卡STED超高分辨显微镜能够更多地贡献超高清图像结果，助力病毒学和生命科学研究发展。 参考文献：【1】Chojnacki J, Staudt T, Glass B, et al. Maturation-dependent HIV-1 surface protein redistribution revealed by fluorescence nanoscopy.[J]. Science, 2012, 338(6106): 524-528.【2】Hanne J, Gottfert F, Schimer J, et al. Stimulated Emission Depletion Nanoscopy Reveals Time-Course of Human Immunodeficiency Virus Proteolytic Maturation[J]. ACS Nano, 2016, 10(9): 8215-8222.【3】Wang IH, Suomalainen M, Andriasyan V, et al. Tracking viral genomes in host cells at single-molecule resolution. Cell Host Microbe. 2013 14(4):468–480. 【4】Li Z, Fang C, Su Y, et al. Visualizing the replicating HSV-1 virus using STED super-resolution microscopy[J]. Virology Journal, 2016, 13(1): 65-65.【5】Mehedi M, Mccarty T, Martin S E, et al. Actin-Related Protein 2 (ARP2) and Virus-Induced Filopodia Facilitate Human Respiratory Syncytial Virus Spread[J]. PLOS Pathogens, 2016, 12(12).

项目编号：清设招第2022118号项目名称：清华大学高稳定超高分辨显微成像系统采购项目预算金额：350.0000000 万元（人民币）采购需求：包号名称数量是否允许进口产品投标01高稳定超高分辨显微成像系统1套是设备用途介绍：观察固定/活细胞或组织内部超微结构和形态变化（包括但不限于各种细胞的亚细胞器、分泌囊泡、突触、染色体以及包括蛋白质在内的大分子等）的超高分辨率水平（≤50nm）图像；研究亚细胞和分子水平定性，定量和定位分布检测；并在细胞及分子生物学，神经科学，组织及病理学、病毒及微生物学，免疫及肿瘤学等领域具有广泛用途。简要技术指标：1）高稳定超高分辨显微成像模块，生物分子可实现XY方向分辨率≤50nm；2）点扫描激光共聚焦显微成像模块，生物分子可实现XY方向分辨率≤200nm；3）科研级全电动倒置荧光显微镜，超高分辨专用100X油镜，数值孔径NA≥1.45。合同履行期限：合同签订后90日内交货本项目( 不接受 )联合体投标。

超高分辨率荧光显微镜正在不断改变我们对细胞内部结构及运作的认识。不过在现阶段，显微镜技术还是存在着种种不足，如果人们希望显微镜能在生物研究领域发挥重要作用，就必须对其加以改进和提高。 　　光学显微镜的出现及其影响 　　自荷兰博物学家、显微镜创制者Antonie van Leeuwenhoek(1632-1723)在17世纪第一次将光线通过透镜聚焦制成光学显微镜并用它观察微生物(microorganisms or animalcule)以来，显微镜就一直是生物学家从事研究工作、探寻生命奥秘必不可少的利器。正是因为有了Leeuwenhoek的这项伟大发明及其后继者对显微镜技术的不断改进和发展，人们才能够对细胞内部错综复杂的亚细胞器等结构的形态有了初步的了解。 　　此后，研究人员对显微镜技术的追求从未停歇过，他们总是希望能得到分辨率更高的显微镜，从而更好地观察细胞内部更细微的结构。最近，《自然-方法》(Nature Methods)杂志上报道的超高分辨率成像技术(super-resolution imaging, SR imaging)终于使得人们可以在单分子水平上进行观察研究。 　　SR技术的发展过程 　　在达到今天SR技术水平的过程中，承载了许许多多研究人员辛勤劳动的汗水，也面临着诸多亟待解决的难题。 　　在以上这些光学SR成像技术中有两种技术&mdash &mdash 受激发射减损显微镜(stimulated emission depletion microscopy, STED)和饱和结构光学显微镜(saturated structured illumination microscopy，SSIM)最受关注。 　　最近，基于探针SR成像技术的光敏定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM)，以及借助荧光基团随机激活特性的荧光光敏定位显微镜(FPALM)都已经取得了成功。 　　通过基于探针的SR成像技术，可以获得多张原始图像。在每一张原始图像中，细胞内只有一部分被荧光标记的分子能发出荧光，即这些荧光分子都处于不断激活和灭活的交替状态，每一次都只有部分分子能被观察并成像。而且由于每次发出荧光的分子都分散得较为稀疏，因此相互之间不会受到影响，也就避免了因相邻分子发出荧光而无法分辨的问题。最后将这些原始图片叠加、重合在一起就得到了最终的高分辨率图像。这样，就能使得那些以前由于荧光点太密以至于无法成像的结构的分辨率达到纳米级水平，而且成像的分子密度也相当高，可以达到105个分子/&mu m2。 　　这种分辨率对于生物学家来说，意味着现在可以在分子水平上观察细胞内的结构及其动态过程了。 　　虽然显微镜技术已经发展到了如此高度，但它仍然只是生物学家研究中使用的一种工具。因此还需要将显微镜获得的图像与其它的试验结果互相参照，才能获得准确的结果。人们需要认清SR显微镜的优势与劣势，为操作以及判断SR图像制定出标准化的操作规范，只有这样才能最大限度地发挥SR显微镜的作用。 　　现在，由于人们对细胞内各组份的组织结构以及它们的动态变化过程都只有一个概念上的认识，因此，借助显微镜从纳米水平上对这些结构及过程进行真实的观察能让人们发现许多以往所不了解的东西。例如，以前人们通过电镜发现细胞骨架是由大量丝状网格样组织构成时，就有人对此现象持怀疑态度。那些认为细胞骨架是一种用来稀释细胞内生化物质浓汤这样一种结构的细胞生物学家把这种观测结果称作僵化的人为试验结果。 　　除非最新的SR显微镜图像或者其它的试验结果都能证明细胞骨架是由大量的丝状网格样组织构成的，否则还会有人持上述的怀疑观点。不过已经有其它的生化试验结果证实了早期的电镜观察结果是正确的。当然新兴的SR技术也需要其它传统的生化试验结果予以佐证才有价值，同时还需要电镜的辅助。因为电镜能提供纳米级的观察结果，这对于佐证具有同样分辨率的SR显微镜观测结果来说是最有价值的。 　　今后，大家在逐步了解、接受和广泛使用SR显微镜的同时，需要注意将会出现的各种问题，以下的表格列出了部分与SR显微镜使用相关的缺点及其目前的解决方法。 　　最近几年，就如何处理图像已经有了非常严格的操作规范。不过迄今为止，对于怎么处理SR图像还没有一个标准的操作规范。尤其需要指出的是，PALM和STORM数据在某些重要因素上，graph方面的共性要多于image方面。在一张SR图像上，分子的不确定性和密度都能用颜色表示出来，这种图像把细胞内该分子有可能出现的任何地点都标示出来了。而且只有被标记的分子按照一定的标准(发出的光子数)判断它的确是一个单分子并且定位准确之后才显示出来。必须对获得的图像进行这样的标准化处理之后才能分析结果。同样，对于试验数据也需要如此进行标准化处理。要提高分辨率不仅需要分子定位、分布得比较好，还需要分子数目够多，以致能达到尼奎斯特判断法(Nyquist criterion)的要求，即分子间的平均距离要小于显微镜分辨率的一半。虽然上述问题都不会影响SR显微镜的应用，但由于存在这些问题，所以我们应该时刻提醒自己，一定要仔细判读、分析SR显微镜的图像结果，只有这样才能得到有价值的生物学结论。 　　SR荧光显微镜在生物学研究中的应用 　　到目前为止，人们还很难得知，SR荧光显微镜会对生物学界的哪一个领域带来重大变革，但已经有几个领域出现了明显的改变。这些研究领域是动态及静态的细胞组织结构研究领域、非均质分子组织研究领域、蛋白动态组装研究领域等。这几个领域都有一个共同的特点，那就是它们研究的重点都是分子间如何相互作用、组装形成复合物。因此，能在纳米水平观察这些分子对它们来说具有重大的意义。 　　通过观察蛋白质之间的组合关系来了解它们的作用，并能为后续的细胞功能试验打下基础 　　结构生物学研究在这方面已经取得了很大的进展，目前已经发现了4-8纳米大小的分子间相互作用组装成细胞微管、肌丝、中间丝这些超过10微米大小聚合物的机制。不过对于核孔复合体、中心体、着丝点、中间体、粘着斑这些由许多不同蛋白经过复杂的三维组装方式组合起来的复合体，还需要更好的办法来进行研究。目标就是要达到分子水平的分辨率，这样就可以观察大复合体形成过程中的单个分子，也就能对这些分子的化学计量学有所了解了。要得到更多的生物学信息就需要SR显微镜这样的三维成像技术，例如可以使用活体细胞SR成像捕捉细胞骨架的动态重构过程等等。 　　SR成像有助于人们更好地了解分子间的差异 　　细胞膜蛋白组织方式的经典模型已经从随机分布的液态镶嵌模型转变成了脂筏模型、穴样内陷模型或特殊蛋白模型。这种差异与细胞不同功能相关，例如在高尔基体、cargo蛋白和高尔基体酶蛋白之间必须发生相互作用，但最终它们会按照各自的功能分开，发挥各自的作用。有很多试验手段，例如免疫电镜技术、荧光共振能量转移技术(FRET)等都已经被用来研究这种膜不均一性问题了。多色PALM技术(Multicolor PALM)为人们提供了一种新的手段用来观察膜蛋白集合、组织的过程，并且还能定量分析不同蛋白间的空间距离关系。因为有了PALM提供的单分子信息，人们就可以清楚地了解蛋白分子间的空间关系，甚至有可能计算出相隔某一距离的分子之间发生相互作用的可能性。这种方法除了用于研究膜蛋白之外，还能用于许多非随机分布的生物系统研究，例如研究微管上的马达蛋白。 　　SR成像技术还能用于在单分子水平研究蛋白动态组装过程 　　细胞对外界刺激信号的反应起始于胞膜，在胞膜上受体蛋白之间发生动态的集合，用来调节细胞的反应活性。像HIV这种有被膜病毒也是在细胞膜上完成病毒颗粒组装过程的病毒，也是利用了细胞的物质转运机制。尽管现在蛋白组装的物理模型还远远没有完成，但研究人员知道膜蛋白的动态组装过程是不均一的，所以通常使用荧光试验手段很难获得分子水平上的信息。同样，单分子测量技术(Single molecule measurements)也存在着类似的局限，因为单分子测量技术只能观察细胞内的几个分子，所以缺乏整体的信息。因此由于缺乏空间分辨率，很难动态地研究蛋白质组装过程。SR荧光成像技术与活细胞成像技术和单分子示踪技术(sptPALM)结合就能解决这一问题。我们可以借助分子密度准确地看出PALM图像中的蛋白质簇，蛋白质簇动态的统计数据和形态学数据能帮助我们了解蛋白质动态组装的机制。 　　上面只是选了生物学研究中的3个方面来说明SR技术的用途，但这已经很好的展示了我们是如何从Leeuwenhoek最初对于生命组成的假设一步一步走到了今天，使用SR显微镜来证实构成生命体的最基本材料&mdash &mdash 分子的组合过程。STED和PALM的商业化产品已经上市了，这标志着SR显微镜的时代来临了。我们相信SR显微镜在充满创造力的生物学家们手中，一定会充分发挥它的作用，帮助我们发现更多生命的奥秘。 　　原文检索： 　　Jennifer Lippincott-Schwartz & Suliana Manley. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nature Methods, 17 December 2008 doi:10.1038/nmeth.f.233

4月末，通用电气医疗集团(GE Healthcare)签署了一项协议，收购细胞成像产品制造商Applied Precision，具体收购金额不详。随着这次收购行动，GE Healthcare有望进入快速增长的细胞成像领域。 　　总部位于华盛顿西雅图郊外的Applied Precision开发并制造高分辨率以及超高分辨率的显微镜仪器，让研究人员能够以其他类型显微镜无法实现的规模来研究细胞过程。 　　一般显微镜所拥有的分辨率能让研究人员观察到200 nm及以上的物体。因此，对于大小在10 nm左右的胰岛素，一般的显微镜是无法看到的。然而，有了超高分辨率显微镜，研究人员就能看到。电镜的分辨率与超高分辨率显微镜相似，但它们不能活体观察细胞，而后者能做到。 　　GE Healthcare负责细胞技术的总经理Amr Abid向国外媒体透露，通过在此水平研究细胞功能，研究人员能够对功能异常细胞的机制有了更深入的了解。他举了一些例子，比如利用超高分辨率显微镜来研究HIV病毒如何穿透细胞，这为新药开发提供了信息。 　　几个世纪以来，科学家们都是利用光学显微镜对肉眼无法看到的结构进行观测，目前光学显微镜已经成为了实验室必备的实验器材之一，但是随着研究的深入，光学显微镜的分辨率已经无法达到科学家们的要求了。2008年，《Nature》杂志将超高分辨率显微技术评为年度技术。 　　Abid估计，如今整个显微镜市场大概在20亿-30亿美元。其中，超高分辨率显微镜占了约20%。Applied Precision和徕卡(Leica)是硬件方面的行业领先者，他们各自的市场份额大约为30%-35%。 　　GE目前不提供超高分辨率显微镜，也不曾开发它们。Applied Precision的产品是对GE细胞分析产品线的很好补充。GE也在探索一些方法，将其现有的细胞研究技术与Applied Precision的仪器捆绑起来。 　　目前，GE在细胞成像方面的旗舰产品是2009年上市的IN Cell平台。IN Cell Analyzer平台提供了一整套从自动化图像获取到数据的定量和深度分析以及可视化的强大工具，来协助整个高内涵分析过程。前不久，GE推出了最新版本的分析平台&mdash &mdash IN Cell 6000。 　　据Abid透露，由于Applied Precision在高分辨率以及超高分辨率显微镜方面声名卓著，故GE打算保留其名称。该公司还计划保留全部130名员工，并在技术上继续投资。 GE还打算加大力度提高Applied Precision在亚太地区(如中国、印度和日本)的知名度，对于超高分辨率显微镜而言，这些区域是一个增长点，然而，Applied Precision目前的份额还很有限。 关于通用电气（中国）医疗集团生命科学部 GE Healthcare Life Science隶属于通用电气医疗集团，我们的产品和技术主要应用于基因科学、蛋白质科学、药物开发研究、以及生物制药、诊断、法医和环保等行业。 我们为制药公司提供完整解决方案，以减少新药筛选和开发的时间和费用，迅速、简单地将研究成果转为规模化生产，并更好地从药物开发候选方案中选择开发出有效、安全药物的方案，更快地研制新药，为医药研发领域的重大突破铺平道路。我们的Biacore和Microcal非标记分子相互作用分析系统是生物分子间相互作用、动力学和热力学研究的标准方法。我们的AKTA系统是专为生物分子纯化而设计的平台，集成了液相层析系统、软件和预装柱；市场上90% 以上FDA批准的生物药正是使用基于相同设计理念的可放大平台AKTAProcess系统和填料进行生物药物分子的提纯。我们的Whatman品牌提供在全球享有盛誉的过滤产品和技术，为分析领域、医疗保健和生物科学市场提供全新的解决方案。 欲了解更多有关GE医疗集团生命科学部的信息，请访问公司网站www.gelifesciences.com.cn，或垂询800-810-9118。

p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 基于单分子定位的超高分辨率显微成像技术（例如PALM、STORM、directSTORM等）已达10 nm左右的光学分辨率。然而，要获得超高分辨率图像，需要较长的采集时间（1-30分钟），而样品漂移（通常1 nm/s）会对此产生影响。目前，加入外源标准参照物（荧光小球、金属纳米颗粒等），引入基于额外近红外监测轴向焦平面变化的商用漂移校正系统，或使用基于互相关方法的图像后处理算法等策略，已被应用于样品漂移校正。但是，外源物的引入及光漂白效应等导致三维尺度漂移校正的精度不佳。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 10月15日，中国科学院上海药物研究所研究员黄锐敏团队在Optics Express上，发表题为Three dimensional drift control at nano-scale in single molecule localization microscopy的研究论文，报道一种利用明场照明模式下细胞内囊泡的衍射信息作为内源参考物来补偿样品三维漂移的新策略。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 研究人员通过光路改造，增加一个近红外CCD用于囊泡位置检测。根据其xyz三维位置信息，通过算法对三维压电陶瓷样品台进行漂移校正，获得xy向& lt 1.0 nm，z向& lt 6.0 nm的定位精度。将该方法应用于F-actin的超分辨率显微成像中，并与商用的漂移校正系统及互相关图像后处理算法进行漂移校正比较，结果表明，重建的超分辨率图像的图像质量显著提高，可更好地显示肌动蛋白微丝的细节（图1）。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 该样品漂移校正方法的优势在于：（1）使用生物样品自身结构作为基准，不需引入外源参照物，从而简化样品的制备过程；（2）不需对显微镜系统做较大改造，费用低廉，普适性较强；（3）校正是基于明场图像，不依赖于荧光，可避免光漂白效应导致的定位精度下降问题。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 上海药物所公共技术服务中心分子影像技术服务部博士范晓明为论文第一作者，黄锐敏为论文通讯作者。参与该研究的有德国于利希研究中心博士Thomas Gensch、教授Georg Bü ldt，上海药物所研究生张元亨、祖里帕力· 木沙、张文渊以及上海药物所神经药理学研究国际科学家工作站博士Renza Roncarati。研究工作获得国家自然科学基金委员会、国家卫生健康委员会新药创制科技重大专项、中科院的资助以及国家蛋白质科学中心（上海）的技术支持。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " a href=" https://www.osapublishing.org/oe/fulltext.cfm?uri=oe-28-22-32750& id=441680" target=" _self" style=" text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 论文链接 /span /a /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/74b57170-3475-4f34-b184-6022752b7cb4.jpg" title=" 捕获.PNG" alt=" 捕获.PNG" / /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " （A）实验光学成像原理图；（B）A549细胞内囊泡在不同z向深度的明场信息；（C）不引入位移校正和引入位移校正以及在两种情况下分别加入和不加入互相关图像后处理算法校正的肌动蛋白微丝的超高分辨率图像比较 /p

2014年的诺贝尔化学奖授予了三位率先突破光学极限的科学家。现在，200nm已经不再是光学显微镜所能达到的极限，人们对细胞的认识从未像现在这么清晰。 　　纳米显微技术常能获得异常美丽的图像，说它们是艺术品也不为过。《自然》杂志近日挑选了一些这样的图像以飨读者。 　　诺贝尔奖得主Eric Betzig(霍华德· 休斯医学研究院 HHMI)获得这张图像，是为了理解大肠杆菌如何组织膜中的三个受体蛋白。亮光来自于研究人员标记在目的蛋白上的荧光分子。Betzig与斯坦福大学的William Moerner开发了光激活定位显微技术PALM，这一技术在这里揭示了蛋白的细胞定位。 　　这张图片的左半部分是PALM的三维成像，显示了黑腹果蝇细胞中的微管。红色、蓝色到紫色，这些颜色代表着微管的不同深度，展示了Z轴方向共500nm的微管三维结构。右半部分是同一个细胞的普通显微镜成像。 　　这是一个人类脑瘤样本，在共聚焦显微镜下显得很模糊(左)，用STED技术(受激发射损耗)成像就清楚多了(右)。这一技术的发明者是诺贝尔奖获得者Stefan Hell(Max Planck生物物理化学研究所)。 　　在诺贝尔奖获得者的工作之后，其他研究者也发明了工作原理类似的纳米显微镜。哈佛大学的庄小威(Xiaowei Zhuang)用自己开发的随机光学重建显微技术STORM，展示了细长的神经纤维(轴突)如何每隔180nm就被肌动蛋白的环加固。 　　这里显示的是一个细胞中的线粒体。图像的左边是传统显微镜获得的图像，中间是超高分辨率技术STORM的三维成像，右边是STORM的层切面图像。 　　结构照明显微技术SIM是第四个问世的超高分辨率技术，这一技术通过特殊的照明模式(栅格移动)产生干涉图案(摩尔纹现象)，这些干涉图案包含了样本的结构信息。这是一张人骨癌细胞的三维SIM图像，肌动蛋白呈紫色，DNA呈蓝色，线粒体呈黄色。 　　SIM技术生成了许多漂亮的细胞图像。这是一个癌细胞，红色的是肌动蛋白，蓝色的是微管，绿色的是转铁蛋白受体(负责将铁带入细胞)。 　　原文检索： 　　Richard Van Noorden. Through the nanoscope: A Nobel Prize gallery. Nature, 14 October 2014 doi:10.1038/nature.2014.16129

显微镜技术经过长期发展，加之近年来物理学界接二连三出现的重大科研进展，终于，在2008年，显微镜发展史上的新成果&mdash &mdash 超高分辨率荧光显微镜为科学家所研制出。人们预言，它定会成为生物学家的好帮手。 　　Stefan Hell打破了物理学界的传统看法 　　自从1873年Ernst Abbe第一次发现光学成像具有衍射限制现象以来，物理学界就公认，显微镜的分辨率具有极限，该极限与光源的波长有关。直到一个多世纪之后，罗马尼亚物理学家Stefan Hell推翻了这一观点。他是首位不仅从理论上论证了，而且用实验证明了使用光学显微镜能达到纳米级分辨率的科学家。 　　罗马尼亚物理学家Stefan Hell，现任德国马克斯· 普朗克生物物理化学研究院(Max Planck Institute of Biophysical Chemistry)主任。 　　早在上世纪80年代中期，当时师从德国海德堡大学(University of Heidelberg)一位低温固态物理学家的Stefan Hell就已经发现，如果不是像常规那样使用一个透镜聚焦，而是将两个大孔径的透镜组合在一起聚焦，就可以提高光学显微镜的分辨率。Stefan Hell是首位发现这一现象的研究人员。 　　Hell于1990年顺利完成了他的博士学业，但同时，这也意味着他将无法再凭借奖学金的资助进行研究了。Hell最终决定独自一人继续在家研究以上的发现，并最终成功发明了4Pi显微镜。 4Pi显微镜，超高分辨率成像中的一个步骤 　　时任美国马萨诸塞州坎布里奇市哈佛大学(Harvard University)化学系教授的Sunney Xie遇到了Hell，当他了解了Hell发明的4Pi高分辨率显微镜时，Xie对Hell勇敢地对传统物理学观点提出挑战的精神表示赞许。 　　随后，Hell带着他的发明来到了位于德国海德堡的欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory, EMBL)，并获得了德国科学基金会提供的奖学金。1991年，Hell在该实验室开始他的博士后研究工作。 　　起初，许多科学家，包括那些声名显赫的物理学家都认为Hell的工作对于提高光学显微镜的分辨率没有太大的意义。他们认为，Hell仅用他那少得可怜的科研经费来从事这项研究简直就是在冒险。但Hell却始终坚信他能够打破衍射极限。 　　Hell的努力没有白费，他的冒险终于获得了回报。1992年，Hell第一次用他的4Pi高分辨率显微镜证明了他的确能将传统光学显微镜的分辨率提高3~7倍。然而，尽管Hell提高了Z方向的分辨率，他还是没能突破衍射极限的限制。 　　此后不久，Hell又在芬兰土尔库大学(University of Turku)得到了他的第二个博士后职位。一个星期六的早晨，Hell正躺在研究生公寓的床上看一本有关光学量子理论的书，突然，灵光一闪，Hell脑海里浮现了一个想法：如果使用一种合适的激光，仅激发一个点的荧光基团使其发光，然后再用一个面包圈样的光源抑制那个点周围的荧光强度，这样就只有一个点发光并被观察到了。Hell给他的这项发明取名STED，即受激发射损耗显微镜(stimulated emission depletion)。有了这个想法后，Hell立即行动，冲进实验室进行相关实验。每当回想起当时的心情，Hell都会觉得那是他科研生涯中最激动的时刻。 　　曾在EMBL与Hell共事，并共同研发4Pi显微镜的Pekka Hanninen指出，Hell在土尔库大学进行研究工作时非常刻苦。那时，他经常被许多问题困扰。尽管如此，研究过程中还是有许多快乐萦绕着他们。Hell不仅是一名严谨的科学研究者，还是一名音乐爱好者，每当工作至深夜时，实验室走廊总会回响起Hell吹奏萨克斯风的动听乐声。 由共聚焦显微镜(左图)和STED(右图)成像的一个神经元。 　　1994年，Hell在《光学快报》(Optics Letters)上发表了他关于STED的理论文章。不过直到多年以后，这项理论才得以在实践中被证实。在那段时间里，Hell一面继续研究工作，一面四处奔走筹集科研经费，还卖掉了他4Pi 显微镜的专利。 　　但是那个时候Abbe的衍射极限理论仍然在学界占统治地位，许多物理学家对Hell的理论都持怀疑甚至批评态度，因此他们也都将研究重点放在其它的成像技术上。尽管如此，Hell还是在1997年与马普生物物理化学研究所签订了一份长达5年的合同，以继续他的STED研究。 　　1999年，Hell将他的研究成果分别投给了《自然》(Nature)杂志和《科学》(Science)杂志，不过都被退稿。当时两位杂志的主编都没有意识到他的研究成果将会改变整个显微镜领域。 　　直到2000年，事情才终于有了转机&mdash &mdash 《美国国家科学院院刊》(PNAS)发表了Hell的科研成果。采用 Hell的STED技术，人们第一次得到了纳米级的荧光图像。Hell的工作由此获得了广泛的肯定，2002年，他获得了马普研究所的终身职位。从此，Hell一直在马普研究所从事成像技术的研究工作。 　　紧随STED这项开创性工作之后，世界各地实验室等研究机构内陆续出现了一批高分辨率的显微镜技术。例如，由珍妮莉娅法姆研究学院(Janelia Farm Research Campus)的物理学家兼工程师Mats Gustafsson领导的研究团队开发出了结构光学显微镜(structured-illumination microscopy, SIM)。 果蝇卵母细胞内的肌动蛋白的3D SIM成像，该照片拍摄于完整的卵泡内。 　　SIM技术的原理是通过一系列光成像的图案对低分辨率莫尔条纹形式的精细结构进行成像，此类图像是采用其它技术所无法观察到的。然后再由计算机处理、分析这些条纹中包含的信息，最终就可以获得高分辨率的图像。 　　同年，Gustafsson小组得到了HeLa细胞中肌动蛋白细胞骨架的图像，他的图像相比传统显微镜的图像来说，在测向上的分辨率提高了2倍。随后，Gustafsson小组又使用非线性技术将整体分辨率提高了4倍。 　　科研竞赛 　　2006年，超高分辨率显微镜研究行业翻开了新的篇章。Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz小组、Samuel Hess小组以及庄晓威(音译)科研小组几乎同时报道了他们提高显微镜分辨率的科研成果，下面分别介绍这三个小组的研究情况。 　　Eric Betzig、Harald Hess以及Jennifer Lippincott-Schwartz小组 　　2005年夏天，细胞生物学家Jennifer Lippincott-Schwartz卸下了她在美国马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院(HIV)暗室里的红色灯泡。Lippincott-Schwartz正在为赋闲在家的两位物理学家Eric Betzig和Harald Hess腾出空间，筹备实验室。正是这两位物理学家研制出了光敏定位显微镜(photoactivated localization microscopy, PALM)，他们的这种新产品能将荧光显微镜的分辨率提升至纳米级水平。 　　接下来的整个冬天，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz等人都一直在那间狭小的没有取暖设备的实验室里工作。现在就职于美国弗吉尼亚州阿士伯恩霍华德休斯医学研究所珍妮莉娅法姆研究学院(Howard Hughes Medical Institute&rsquo s Janelia Farm Research Campus in Ashburn, Virginia)的Hess承认，自己与Betzig对生物学的认识都不深。不过近15年来，他们一直都在努力，希望能运用生物学知识获取高分辨率的显微图像，但是没有取得明显进展。然而，当Hess和Betzig了解到Lippincott-Schwartz和George Patterson在2002年发明的光敏绿色荧光蛋白(photoactivatable green fluorescent protein)后，他们知道他们已经找到了解决问题的关键所在。 　　回想起当时的情形，Lippincott-Schwartz指出：&ldquo 他们当时非常激动。我还记得当我们得到第一张显微图像时，你根本无法看出那是什么东西。直到我看到他们将荧光图像和电镜图像叠加之后的结果才相信，我们成功了。我当时觉得这一切真是太神奇了。&rdquo 　　2006年，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz小组在《科学》(science)杂志上发表了他们的PALM研究成果。使用PALM可以清楚得看到细胞黏着斑和特定细胞器内的蛋白质。 　　Samuel Hess小组 　　Samuel Hess小组是上述三个小组之一。Hess是美国缅因州立大学(University of Maine)物理系的助理教授。2005年夏天，Hess一直在和他们学校的化学工程师和生物学工程师，就如何提高观察活体细胞脂筏结构的分辨率等问题进行交流。 　　2005年的一个夏夜，Hess被邻居家举办舞会的声音吵醒。半睡半醒的Hess走下楼来，随手画了一副设计图，他的这种设计是需要借助荧光标记的蛋白质来显示细胞形态的。第二天早上，当Hess重新翻看这幅非清醒状态绘制的潦草的设计图时，不由得大笑起来。不过令人吃惊的是，他的这幅设计图竟然没有一点问题。于是他把这幅图拿给物理系的同事检查，但同事也没有发现任何问题。 　　接下来，Hess就按照他的设计图开始制作显微镜了。此时，他的科研经费所剩不多，而结题时间转眼就到。因此，Hess等人以最快的速度组装好显微镜，并进行了试验。同时，在不到两天的时间里，缅因州立大学表面科学技术实验室的同事就为Hess制备好供检验显微镜效果的蓝宝石晶体样品。 　　对于同事们的帮助，Hess总是不胜感激。 　　2006年，《生物物理学期刊》(Biophysical Journal)刊登了Hess小组的科研成果。他们将这项研究成果命名为荧光光敏定位显微镜(fluorescence photoactivation localization microscopy, FPALM)。2007年，Hess小组证明了FPALM可以分辨细胞膜脂筏上的蛋白质簇。 　　庄晓威科研小组 　　与此同时，另一个研究小组&mdash &mdash 哈佛大学霍华德休斯医学研究所(Howard Hughes Medical Investigator at Harvard University)的研究员庄晓威科研小组也在研究高分辨率成像技术。 　　通过3D STORM观察到的一个哺乳动物细胞内线粒体网状系统。传统荧光成像(左图) 3D STORM成像(中图)，其中，采用不同颜色标记出z的位置 3D STORM成像中xy维图像(右图)。 　　其实，这三个小组都有一个共同的也是非常简单的理念，那就是先获得单分子荧光图像，再将成千上万个单分子图像叠加在一起，获得最终的高分辨率的图像。 　　早在2004年初，庄等人就已经意外发现了有一些花青染料可以用作光敏开关。这也就意味着这些染料既可以被激活发出荧光，也可以被关闭不发光，人们可以使用不同颜色的光束来随意控制这些花青染料的开和关。 　　从那以后，庄等人就一直在研究如何用光敏开关探针来实现单分子发光技术。他们希望能用光敏开关将原本重叠在一起的几个分子图像暂时分开，这样就能获得单分子图像，从而提高分辨率。Eric Betzig小组和Samuel Hess小组也都采用了同样的策略，只不过他们使用的不是光敏开关而是一种可以先被荧光激活继而被漂白失活的探针。 　　2006年，庄的科研成果在《自然-方法》(Nature Methods)杂志上发表，他们将这项成果命名为随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。使用STORM可以以20nm的分辨率看到DNA分子和DNA-蛋白质复合体分子。 　　此后几年，超高分辨率荧光显微镜又得到了进一步的发展。现在，生物学家已经能够使用超高分辨率荧光显微镜在纳米水平上观察细胞内部发生的生化变化了。以往那些大小在200nm至750nm之间的模糊泡状图像再也无法对他们造成困扰了。尽管早在上世纪80年代，科研机构里就已经出现了超高分辨率显微镜的构思，但只是最近几年里这项技术才伴随着它的商业化进程获得了快速发展。现在，已经有几十家实验室安装了这种最新型的显微镜并投入了使用。正像Lippincott-Schwartz所说的，超高分辨率显微镜正在以飞快的速度被科研界接受，在生物学界更是如此。 　　超高分辨率显微镜的成绩 　　已经开始使用这些显微镜的生物学家对这项技术都表示出了极高的热情。Jan Liphardt这位在美国劳伦斯伯克力国家实验室(Lawrence Berkeley National Laboratory)工作的生物学家，还清楚地记得他2006年第一次在《科学》(science)杂志读到Betzig的那篇有关PALM技术的论文时的激动心情。当他看到那幅线粒体蛋白的图像时立刻想到了该技术可以用于他自己的微生物研究领域。 　　Liphard说道：&ldquo 通常，我们得到的大肠杆菌荧光图像都只有20像素，甚至更低，现在突然有一幅几千像素的图片摆在你面前，你可以想象那是一种什么感觉。&rdquo 　　Liphard现在正与Betzig以及其他一些研究人员一起研究大肠杆菌的趋化现象(chemotaxis)。Liphard还提到：&ldquo 我从没想到这项技术达到的分辨率有这么高，可以如此清楚地看到细胞内单个蛋白质分子的定位，甚至还能定量。而对我来说，每天的工作实际上就是在弄清楚这些蛋白质在什么位置，什么时候存在。而之前我们的研究主要采用间接方法。但超高分辨率显微镜这项新技术是我从事科研工作这么长时间以来，感触最深，获益最大的一项科技成果。&rdquo 　　美国丹佛市科罗拉多州立大学医学院(Medicine at the University of Colorado Denver)的助理教授Nicholas Barry也正在和Betzig合作，他们使用了一台蔡司的全内反射荧光成像系统(total internal reflection fluorescence imaging, TIRF)来研究肾细胞顶端胞膜上的蛋白质簇。 　　Barry指出，只需要一台蔡司显微镜和普通电脑，差不多就足够了。此外，他们还花费3万美元添置了两台激光发射器。现在，Barry等人可以在8分钟内得到一幅图像，这幅图像由10000帧图像合成，每一帧图像上显示10个分子。最后的图像文件大小大约是0.3GB。Barry等人还使用Perl语言自己开发了一套免费程序。Barry表示：&ldquo 这里面包含了每帧图像的资料信息，客户可以根据这些信息进行相关计算。&rdquo Barry充满信心地提到，很快就会有人为NIH的那套免费图像分析软件ImageJ开发出一套运算程序作为插件使用。 　　美国斯坦福大学(Stanford University)化学及应用物理系教授W.E. Moerner曾于1989年第一个在试验中使用光学显微镜得到了单分子图像。W.E. Moerner教授表示，这几年来，超高分辨率显微镜研究领域已经取得了巨大的进展，终于达到了纳米级单分子分辨率。他兴奋地说：&ldquo 经过了近20年对单分子成像课题的研究，我们终于取得了完美的成果。&rdquo 　　展望 　　自从2006年STORM技术和PALM技术问世以来，科技工作者就一直在不断努力，对它们进行改进、完善和提升。2008年，Lippincott-Schwartz的研究团队将PALM技术和单颗粒示踪技术(single-particle tracking)结合，成功地观测到活体细胞胞膜蛋白的运动情况。同年，庄小威研究组在《科学》(science)杂志上也发表了他们的3D STORM成像成果，该技术的空间分辨率比以往所有光学3D成像技术的分辨率都要高出10倍。论文中，他们展示了用3D STORM成像技术拍摄的肾细胞内微管结构图和其它的分子结构图。随后，他们又进一步将该技术发展成了多色3D成像技术(multicolor 3D imaging)。Gustafsson，还有其他一些科研工作者使用3D SIM技术(该技术使用3束干涉光，而不是常见的2束)观察到了共聚焦显微镜(confocal microscopes)无法观测到的哺乳动物细胞核内结构。位于德国的世界知名光学仪器制造公司蔡司公司进一步发展了SIM和PALM技术，不过他们将PALM称为PAL-M。蔡司公司预计将于2009年末推出全新的成像产品。 　　2008年，Hell小组使用STED技术通过抗体标记目标蛋白，观察到了活体神经元细胞中突触小泡(synaptic vesicles)的运动过程。同年稍晚些时候，他们又使用4Pi显微镜和STED技术得到了固定细胞内线粒体的3D图像，分辨率达到了40至50nm。最近，他们又使用超高分辨率显微镜成像技术对脑切片组织中的形态学变化进行了研究，并得到了活体神经元细胞树突棘(dendritic spines)的3D图像。 PALM在哺乳动物细胞内拍摄到的粘附复合物。 　　由于最近几年这些新技术的不断涌现，现在可以对活体细胞进行三维观察了。Gustafsson指出，随着PALM技术和STORM等新技术的出现，以前很多看起来不可能的事情现在都变得可能了。 　　尽管已有许多科学家从这项技术进展中获益，但是仍然可以进一步提高，以使更多的研究人员能够在自己的工作中使用它。到目前为止，那些成功应用此项技术的实验室都采取了正确的技术组合：研究人员可以很好地将物理学与生物学相结合&mdash &mdash 他们将显微镜装配并做适当的调节，然后用它对生物学样品进行检测。Moerner指出，软件的编写也不容小觑：对检测到的光子进行定位和报告需要进行准确计算，从而得到合适的分辨率。 　　仅仅是显微镜的价格就已经限制了它的普及性，Leica&rsquo s TCS STED显微镜高达100万美元。因此，如何获得相应的资金来购置显微镜仍然是摆在研究人员面前的一个难题，位于丹佛市的科罗拉多大学(University of Colorado)光学显微镜组主任Bill Betz这样说道。 　　Betz曾申请用于显微镜购置的资金，但遭到了拒绝。但他表示，他们已经计划再次申请相关资金。而Stefan Hell曾指出，激光领域的技术进展已经可以使得研究人员自己在实验室内构建一个STED平台，花费只需不到10万美元。 　　除了要将这一技术方法普及，使生物学家能够加以利用之外，该项技术的研发人员还表示，他们已经开始致力于研究更宽范围及更多样的荧光探针了。更好的探针当然能够为我们带来更高的分辨率及更快速的图像处理。美国纽约阿尔伯特&bull 爱因斯坦医学院(Albert Einstein College of Medicine)解剖学及结构生物学副教授Vladislav Verkhusha说到：&ldquo 为了对活体哺乳动物细胞进行研究，你就需要有一整套的荧光标记蛋白和可通过光控开关控制的蛋白质。&rdquo 他本人在荧光蛋白领域的研究工作就受益于PALM的出现。 　　庄晓威的众多项目之一便是与Alice Ting及其在麻省理工学院(MIT)的实验室合作，对蛋白标记技术进行研究，希望能够找到一种方法可以将小和明亮的光控开关可控的探针标记于细胞的特异蛋白上，从而可以对活细胞进行成像。她提到：&ldquo 将遗传标记方法与小而明亮且可被光控开关控制的探针结合在一起，将是今后发展分子级别超高分辨率成像的十分理想的一种方法。&rdquo 　　尽管研发人员还将继续努力，以进行相应技术的提高，但是超高分辨率荧光显微镜更加广泛的应用还是毫无疑问地成为新的一年的标志。Harald Hess说：&ldquo 这一技术的确会为生物学家的工作带来很大的帮助。同时，我们也在不断询问，&lsquo 你们想要用它做什么精彩的实验?&rsquo 事实上，我们也得到了许多精彩的答案。&rdquo

p 　　北京大学陈良怡团队联合华中科技大学谭山团队发明了一种超灵敏结构光超高分辨率显微镜 -- 海森结构光显微镜 （Hessian SIM）。此项成果近日以全文形式在线发表于Nature Biotechnology （影响因子41.67），论文题目为“Fast， long-term， super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy”。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201804/insimg/9733f7f5-ffa5-4262-9ca6-a6f439e01233.jpg" title=" 1.png" / /p p style=" text-align: center " 图1：海森结构光显微镜解析囊泡融合孔道形成全过程。上图：实际的动态过程解析；下图：由实验结果得到的囊泡融合的四个中间态。 /p p 　　在每秒钟得到188张超高分辨率图像时，海森结构光显微镜的空间分辨率可以达到85纳米，能够分辨单根头发的1/600到1/800大小结构，而所需要的光照度小于常用的共聚焦显微镜光照度三个数量级。由于极低的光漂白以及光毒性，实现了100 Hz超高分辨率成像下连续采样10分钟得到18万张超高分辨率图像，或者是在1 Hz超高分辨率成像下连续1小时超高分辨率成像基本无光漂白。 /p p 　　与获得2014年Nobel化学奖的受激辐射损耗超高分辨率显微镜（STED）相比，海森结构光显微成像以极高的时间分辨率、极低的光毒性在活细胞超高分辨率成像方面占显著优势。例如，在观察细胞内囊泡与细胞质膜融合释放神经递质和激素过程中，海森结构光显微镜与STED显微镜（分辨率60纳米，每秒5幅左右； 巫凌钢实验室2018年3月Cell上线的文章）都可以观察到囊泡融合形成的孔道；但是，海森结构光显微镜还解析出囊泡融合时四个不同中间态，包括囊泡打开3纳米小孔、囊泡塌陷、融合孔道维持和最后的囊泡与细胞质膜完全融合的过程，真正可视化膜孔道形成的全过程（图1）。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201804/insimg/a8d935d2-2f07-4d3a-bfc4-18cf43e9c1ae.jpg" title=" 2.png" / /p p style=" text-align: center " 图2、海森结构光显微镜显微镜下观察到COS-7细胞中的内质网和线粒体相互作用的动态过程，蓝色的线粒体用MitoTracker Green标记，可以清楚辨识内嵴结构；品红色的是用SEC61-mCherry标记内质网结构。 /p p 　　此项突破一方面是基于硬件自主设计的新偏振旋转玻片阵列、高精度的时序控制程序以及高数值孔径物镜的应用；另一方面是创新的重构算法，借鉴了人眼区分信号和噪声的机制，首次提出将生物样本在多维时空上连续、而噪声是完全随机分布的先验知识用于构建海森矩阵，指导超高分辨率荧光图像的重建。 /p p 　　超灵敏海森结构光显微镜是目前活细胞成像时间最长、时间分辨率最高的超高分辨率显微镜，适用于各种细胞、不同探针的荧光成像 – 可以说，所有应用扫描共聚焦显微镜的场景都可以使用海森结构光显微镜，因而具有广泛的应用前景。 /p p 　　该论文的第一作者为北京大学黄小帅、华中科技大学范骏超和北京大学李柳菊，通讯作者为北京大学陈良怡、华中科技大学谭山。工作得到了国家自然科学基金委重大仪器研制基金、重大研究计划专项、科技部国家重点研发计划基金、重点基础研究发展计划和北京市自然科学基金委重点项目的资助。陈良怡、黄小帅等主创成员参与了早先发表于Nature Methods的高分辨率微型化双光子显微镜的研制，荣获2017年中国十大科学进展等荣誉。未来，他们将进一步实现微型化海森结构光的显微在体成像。 /p

p 　　中科院膜生物学国家重点实验室联合华中科技大学发明了一种超灵敏结构光超高分辨率显微镜-----海森结构光显微镜 （Hessian SIM)，实现了活细胞超快长时程超高分辨率成像，能辨清囊泡融合孔道和线粒体内嵴动态。在每秒钟得到188张超高分辨率图像时，海森结构光显微镜的空间分辨率可以达到85纳米，能够分辨单根头发的1/600到1/800大小结构，而所需要的光照度小于常用的共聚焦显微镜光照度三个数量级。同时，该显微镜也实现了细胞“能量工厂”线粒体的超快超分辨成像，首次在活细胞中解析线粒体融合、分裂时内嵴的活动，及线粒体内嵴自身的重组装过程，并能够观察内质网与线粒体发生相互作用时的动态变化。 /p p 　　与获得2014年Nobel化学奖的受激辐射损耗超高分辨率显微镜（STED）相比，其具有极高的时间分辨率、极低的光毒性，在活细胞超高分辨率成像方面优势显著。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/235ade60-4b77-42b8-bfd2-21c083b4ea5d.jpg" title=" 640-2.jpeg" / /p p 　　海森结构光显微镜解析囊泡融合孔道形成全过程。上图：实际的动态过程解析；下图：由实验结果得到的囊泡融合的四个中间态。 /p p 　　灵敏海森结构光超高分辨率显微镜的成功验证，一方面基于新偏振旋转玻片阵列、高精度的时序控制程序以及高数值孔径物镜等硬件的自主研制；另一方面是重构算法的创新，首次提出将生物样本在多维时空上连续，而噪声是完全随机分布的先验知识用于构建海森矩阵，指导超高分辨率荧光图像的重建。 /p p 　　超灵敏海森结构光显微镜适用于各种细胞、不同探针的荧光成像。可以说，所有应用点扫描共聚焦显微镜的场景都可以使用海森结构光显微镜，因而具有广泛的应用前景。 /p p 　　此项研究成果以题为“Fast, long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy” 以全文形式于近日在线发表于《Nature Biotechnology》 上。 /p p 　　论文链接：https://www.nature.com/articles/nbt.4115 /p p br/ /p

2023年8月6日至12日，由清华大学蛋白质研究技术中心、生物医学测试中心、中国细胞生物学学会细胞器生物学分会联合主办的第四届活细胞与超高分辨成像高级研讨会在清华大学成功举办。众多领域专家学者、行业头部翘楚齐聚一堂，和来自全国各地的100余位青年学者一起见证了这场学术盛宴。研讨会邀请了北京大学席鹏教授、陈良怡教授、孙育杰教授，中科院生物物理所李栋研究员，中国科技大学唐爱辉教授，西湖大学章永登研究员、清华大学陈春来副教授等十数位在活细胞、超分辨、单分子成像等领域的知名专家进行报告，还邀请了尼康、徕卡、蔡司等公司就超分辨成像、一体化活细胞成像等仪器进行了专业介绍和体验展示。在本次研讨会上，力显智能科技联合创始人兼COO张猛博士就《单分子定位超高分辨率显微镜iSTORM在生物医学领域的应用》进行了相关报告分享。会议期间，力显智能科技研发的新品活细胞超高分辨率显微成像系统iSTORM VIVO在清华大学正式发布，更是为这场精彩盛宴增添了一抹亮色。现场，清华大学高级工程师王文娟老师与力显智能科技联合创始人兼COO张猛博士共同为活细胞超高分辨率显微成像系统iSTORM VIVO揭幕。揭幕仪式力显智能科技联合创始人兼COO张猛博士表示：非常感谢一路支持力显的各位朋友和老师，是大家的支持和帮助，促成了这次活细胞超分辨新品在清华大学的圆满发布，这是广大用户对力显超分辨的再一次肯定，也是力显智能科技自研国产超分辨之路的又一个重要里程碑。活细胞超高分辨率显微成像系统iSTORM VIVO作为目前国内唯一的商业化单分子超分辨显微系统，iSTORM成功实现了光学显微镜对衍射极限的突破，使得在20纳米的分辨率尺度上从事生物大分子的单分子定位与计数、亚细胞及大分子复合物结构解析、生物大分子生物动力学等的研究成为现实。在原先标准版iSTORM的基础上，经光机系统、染料、算法协同开发，iSTORM VIVO在活细胞超分辨成像领域获得极大技术提高，提升原始图像拍摄速度，搭配高密度快速荧光定位算法，可以在维生条件下进行快速活细胞超高成像，以高精密度的成像能力解析活细胞的各种生命生理过程，极大弥补了传统STORM技术在活细胞超分辨成像领域的短板，给生命科学、医学等领域带来重大突破。

仪器信息网讯 2015年3月17日，北京理化分析测试技术学会和北京市电镜学会主办的&ldquo 北京市2015年度激光共焦超高分辨显微学学术研讨会&rdquo 在北科大厦举行。该会议旨在推动北京市及周边省市激光共焦超高分辨显微学的进步和发展，提高广大相关工作者的学术及技术水平，促进上述学科在生命科学等领域中的应用。会议得到了相关学者的热烈响应，约160余人参加了此次会议。 会议现场 　　北京市电镜学会理事长郑维能、秘书长张德添，北大医学部何其华、北大医学部第一医院王素霞主持会议。 　　超高分辨显微技术进展 　　自荷兰博物学家、显微镜创制者列文虎克在17世纪第一次将光线通过透镜聚焦制成光学显微镜并用它观察微生物以来，显微镜就一直是生物学家从事研究工作、探寻生命奥秘必不可少的利器。正是因为有了列文虎克的这项伟大发明及其后继者对显微镜技术的不断改进和发展，人们才能够对细胞内部错综复杂的亚细胞器等结构的形态有了初步的了解。 　　然而为了更好地理解生命过程和疾病发生机理，生物学研究需要观察细胞内器官等细微结构的精确定位和分布，阐明蛋白等生物大分子如何组成细胞的基本结构，重要的活性因子如何调节细胞的主要生命活动等，而这些体系尺度都在纳米量级，远远超出了常规的光学显微镜的分辨极限(约为200nm)。 　　为了解决生命科学研究面临的一系列难题，超高分辨率显微技术应时而生，并且一经问世就得到了广泛的响应。2008年Nature Methods将这一技术列为年度之最。2014年，美国科学家Eric Betzig，德国科学家Stefan W. Hell，美国科学家William E. Moerner，因他们在超分辨率荧光显微技术领域取得的成绩，获得了该年度的诺贝尔化学奖。 报告人：北京大学 席鹏 　　目前，超高分辨显微技术虽然能获取很高的空间分辨率，却总是以牺牲时间分辨率为代价。同时，这些方法技术复杂、系统成本较高，这给推广应用带来一定困难。如果人们希望显微镜能在生物研究领域发挥重要作用，就必须对其加以改进和提高。 　　北京大学席鹏课题组一直致力于超分辨显微成像技术研究。在报告中，席鹏介绍了超分辨显微技术的发展与应用，并详细介绍了课题组研究的两类超分辨技术：多色联合标记超分辨技术和多模态三维超分辨技术。其中多色联合标记超分辨研究成果发表于Nature出版的Scientific Reports期刊，多模态三维超分辨技术相关研究成果发表于Springer和清华大学出版社联合出版的Nano Research期刊上。 报告人：蔡司 库玉龙 　　库玉龙介绍了蔡司在2014年最新推出的Airyscan技术。Airyscan技术可以应用于蔡司LSM 800和LSM880激光共聚焦显微镜，是第一款可用于正置显微镜观察的超高分辨率产品。据介绍，传统的共聚焦显微镜通过针孔来阻止非焦平面的发射光。Airyscan检测器不在针孔处限制光通量，而是直接用一个32通道的六边形平面探测器收集所有发射光，其中每个探测器元件都是有效的单个针孔。这一技术的使用，使LSM880的总体分辨率增加了1.7倍，即140 nm的横向分辨率和 400nm的轴向分辨率。 报告人：徕卡 吴立君 　　吴立君介绍说，2014年诺贝尔化学奖获得者Stefan W. Hell与徕卡显微系统的工程师和科学家有长期良好的合作关系，从他还是博士生时，他就与徕卡共同研发超高分辨显微镜，至今双方合作超过15年。早在2004年双方合作推出了商业化4Pi超高分辨显微镜 2007年, Stefan W. Hell将STED(受激发射损耗)专利技术授权徕卡研发。 　　此外，吴立君介绍了徕卡推出的Leica TCS SP8 STED 3X受激发射损耗显微镜，以及即将推向市场的光谱更宽、分辨率更高、样品保护更强的受激发射损耗显微镜新产品。 报告人：尼康 赵媛 　　赵媛介绍了尼康的N-SIM和N-STORM超分辨显微镜。据介绍，N-SIM结构照明显微技术专门为活细胞超高分辨率成像而设计，使用了全内反射结构照明(TIRF-SIM)来提高样品表面的空间分辨率，并且时间分辨率可以达到0.6秒/帧。其中结构照明显微技术(SIM)由旧金山加州大学授权。 　　N-STORM则将哈佛大学授权的&ldquo 随机光学重构显微术(STORM)&rdquo 与尼康的Eclipse Ti研究级倒置显微镜结合在了一起，能够显著提高分辨率，可达到传统光学显微镜分辨率的十倍或者更多，可采集纳米级的二维或三维多光谱图像。 报告人：奥林巴斯 方琳 　　方琳介绍了奥林巴斯近年来推出的多光子扫描显微镜和超高分辨技术。2013年9月，奥林巴斯推出了FVMPE-RS多光子扫描显微镜，具有高速高灵敏度双光子成像技术、空间精确红外光刺激和可见光光刺激及更深的成像深度，更长波长光校准及透过率系统。能够有效收集动态影像，如被标记的细胞在血液中&ldquo 缓缓&rdquo 流动，斑马鱼的心脏&ldquo 慢慢&rdquo 起伏等。 　　2014年10月，奥林巴斯推出了独创的超高分辨技术FV-OSR，结合了众多精良的光学部件和超高灵敏度探测器，成功将传统共聚焦显微镜的分辨率提高了两倍，理想条件下XY水平分辨率可达120~150 nm。实现了简化操作和广泛兼容等新特性，将共聚焦技术与特制的超分辨光学附件相结合，可以在FV1000或FV1200共聚焦系统上升级。 报告人：珀金埃尔默 卢毅 　　高内涵筛选(HCS)系统可以对细胞形态或生化特性所发生的改变进行高通量分析。现在，高内涵筛选系统已经成为基础科学和药物研发领域中的一个重要工具。 　　卢毅介绍说，PerkinElmer在2014年推出了Opera Phenix&trade 共聚焦HCS系统。这款设备的设计旨在令速度最大化，同时不牺牲系统的灵敏度。对于HCS系统来说，在获取数据的同时进行数据分析会限制检测的灵敏度，不过这样能够节省筛选的时间。有时光谱重叠会导致不同的荧光素发生相互干扰，从而限制整个系统的灵敏度。而Phenix依赖于PerkinElmer的专利技术Synchony&trade Optics，该技术可以控制荧光素的激发，从而减少荧光信号之间的干扰，提高了系统的灵敏度。 　　超高分辨显微技术应用 　　很长时间以来，人们都认为光学显微镜技术无法突破&ldquo 阿贝分辨率&rdquo ，即永远不可能获得比所用光的波长一般更高的分辨率。然而近十多年来，科学家们在此领域获得了精彩的成果，突破了光的衍射极限分辨率。其中尤其是STED（受激发射损耗）显微技术和分子定位显微技术，让科学家能在纳米水平观察到活细胞内个别分子的作用路径，可以看到分子是如何在大脑神经细胞形成突触的 也可以跟踪哪些与帕金森症、阿茨海默症等疾病有关的蛋白质分子聚集，在真正意义上扩大了科学家们的视野。而这些都将有助于人们进一步了解这些疾病的形成机理，帮助我们去克服治愈它们。 报告人：清华大学 谢红 　　清华大学谢红在报告中介绍了双光子活体成像技术在学习记忆和阿尔兹海默病研究中的应用。双光子显微镜现在已经成为活体脑功能研究中重要的研究工具，双光子成像具有较深的穿透力、更为集中的空间聚焦、较小的组织损伤性等特征。因此，一方面利用双光子显微镜能够在细胞甚至是亚细胞水平上对活体中的神经细胞结构形态、离子浓度、细胞运动、分子相互作用等生理现象和过程进行直接的成像监测，另外还能进行光裂解、光激活、光转染和光损伤等光学操纵。 报告人：中科院生物物理所 李岩 　　中科院生物物理所李岩目前的研究主要为：以果蝇为动物模型，探索高级脑功能的细胞分子机制，涉及的研究领域和方法包括神经发育生物学、分子遗传学、学习认知行为的神经环路等方面。并以已有的行为范式，如进食，睡眠和学习记忆为基础，深入研究单基因对细胞形态、神经网络发育、及高级脑功能的作用，并探讨环境因素，如地磁场等对生物高级脑功能的影响及其机制。在她的研究中，激光共聚焦超分辨显微学技术发挥了重要作用。 报告人：阜外医院 聂宇 　　阜外医院聂宇则介绍了激光共聚焦超分辨显微技术在&ldquo 激活心外膜&mdash &mdash 哺乳动物心肌再生调控的新途径&rdquo 中的应用。据介绍，由于心肌梗死发生后，梗死区被纤维组织替代，心脏泵功能受损，最终导致心衰和死亡 其原因在于心肌无法实现对损伤的自我修复，心肌细胞发生凋亡或坏死后，如果有充足的心肌细胞来源，对其进行替代和补充，将可能实现心功能的重新恢复。故而，心肌再生是目前心血管科学领域的研究热点。 撰稿：秦丽娟

仪器信息网讯 2021年4月10日，“北京市2021年度激光共焦及超高分辨显微学学术研讨会”在北京召开。会议由北京市电镜学会主办，北京理化分析测试技术学会协办，会议旨在推动北京市及周边省市激光共焦超高分辨显微学的进步和发展，提高广大相关工作者的学术及技术水平，促进上述学科在生命科学等领域中的应用。150余名光学高分辨显微学领域国内专家学者、青年科技工作者，及相关仪器厂商代表慕名参会。会议现场“铁打的”进口品牌，悄然崛起的国产技术本次参会，从专家报告分享到会见交流，都给笔者留下一个印象——国产仪器技术正在逐渐崛起。以下笔者整理了仪器信息网参加的近六届“北京市年度激光共焦及超高分辨显微学学术研讨会”（2020年度因新冠疫情停办一次）仪器技术相关报告情况，从仪器技术分享报告数量来看（含仪器技术研究与商业化技术），近六年来，进口品牌变化不大，而国产技术已在悄然崛起。谈应用：市场需求大 超分辨荧光成像解决的科学问题还比较有限中国科学院动物研究所财务资产部资产管理办公室主任王荣荣分享了动物所在激光共聚焦超高分辨显微镜等技术支撑下的科研创新情况。其影像学平台主要提供光学成像类分析测试服务，先进的设备可满足XY分辨率从50nm-500nm的成像需求，专业团队可提供从分析测试到后期图像处理、定量计算的整套解决方案。据介绍，影像学平台配置有结构光照明、激光扫描共聚焦显微镜、双光子显微镜等成像要求设备17套，目前处于饱和运行，接下来还有很大采购需求。在这些设备支持下，平台支持的许多科研成果发表在《Cell Research》、《PNAS》、《Cell Stem Cell》等国际高水平期刊上。中国科学院生物物理研究所王晋辉研究员分享了光学成像技术在示踪大脑记忆细胞方面的应用，以小鼠大脑成像进行研究，对小鼠的胡须、嗅觉，及尾巴进行温度刺激，研究表明，多个相关信号是联合捕获的，大脑会集成和存储这些相关信号，且信号间可相互检索，联想记忆是认知和感情的基础。且联想记忆相关的脑细胞可以对多个相关信号的存储进行编码，可以接受多种来源突触神经的支配。中国农业大学傅静雁教授分享了团队利用超分辨显微技术解析中心体骨架蛋白装配的研究进展。如何重建中心体以满足细胞的需求？基于组装中心体蛋白质动态3D形态的目标，其团队利用系列超高分辨显微技术研究了中心中心体蛋白质的3D结构及形成过程。分别利用3D-SIM技术（120nm分辨）研究得出中心体的分层模型，及中心体蛋白动态装配顺序；进一步利用STED技术（50nm分辨率）研究得出中心体核心蛋白空间分布；接着，利用Expansion microscopy+3D-SIM技术（30nm分辨率）最终研究得出中心体九轴对称的分子基础结构。谈仪器技术之“铁打的”进口品牌：新技术百花齐放徕卡显微系统邢斯蕾介绍了徕卡去年推出的STELLARIS共聚焦平台。与以往平台相比，STELLARIS性能显著增强。蓝-绿波段的灵敏度增强（PDE 55%）提升了最常用光谱的检测限值和动态范围。集成式TauSense是基于荧光寿命而无需增加额外专用硬件的创新成像模式。能够让研究者区分特异性的荧光信号和多余的自发性荧光，从而改善最终图像的质量并通过光谱分离技术将原先无法分离的荧光分离出来。Andor（牛津仪器）王坤主要介绍了其多模式共聚焦显微成像系统Dragonfly，其核心功能是多点高速，高灵敏度共聚焦成像，其采集速度比普通点扫描共聚焦技术快至20倍。另外采用高分辨，高灵敏的探测器，有效减少活细胞成像的光毒性及光漂白，同时也适合于固定样品的高分辨快速三维成像。据介绍，该产品推出以来已经实现全球装机200台，中国装机50台。卡尔蔡司吕冰洁介绍了其去年推出的全新Lattice Light Sheet晶格层光显微镜——Lattice Lightsheet 7，该产品基于Ernst H.K. Stelzer教授在德国海德堡欧洲分子生物学实验室，以及诺贝尔奖获得者Eric Betzig教授在美国霍华德休斯医学研究所Janelia研究园区对于光片技术开创性的研究成果。该产品具有非常低的光毒性，从而能长时间以亚细胞分辨率观察细胞及微小生物体的3D动态过程。配置以环境温控系统以及稳定的光学设计，该产品能帮助研究人员连续观察活体样本数小时，甚至数天。奥林巴斯王咏婕主要介绍了其NoviSight 3D分析软件带来的共聚焦显微凸显分析新方法。该软件特别适合对多孔板多细胞球等标本在复杂的3D范围内进行数据分析。具有精准快速的3D检测、简单便捷的分类分析、数据图片实时联动、与多种共聚焦兼容等特点。上海仁科生物黎瑜辉介绍了美国3i光片显微镜系统产品，包括Lattice LightSheet（超分辨光片系统，实现活细胞内超分辨4D成像）、Marianas LightSheet（多功能光片显微镜，专为活细胞定制）、VIVO LightSheet（活体多光子成像系统）、Cleared Tissue LightSheet（CLTS光片显微镜，专为透明化组织成像定制）等。尼康仪器薛志红分享了其2020年推出的新品显微镜自动培养和成像系统BioPipeline-Live，可解决研究人员在细胞培养与细胞成像环节中的潜在难题。产品具有高内涵平台、摆脱箱式系统的束缚、强大软件系统等特性，采取了灵活的高内涵倒置显微镜平台,可适用于高内涵采集和分析的镜、探测器、影像采集设备和应用程序。软件系统NIS-Elements为用户提供了一个处理和分析工具箱，同时也搭载了全新三大AI模块。谈仪器技术之悄然崛起的国产技术：产业化品牌逐现中国科学院生物物理研究所黄韶辉研究员分享了其团队关于荧光相关光谱（FCS）单分子技术的仪器研发机产业化工作。相关成果在广东中科奥辉科技有限公司实现转化，研制出首创的桌面式荧光相关光谱单分子分析仪CorTectorTM SX100，被纳入中科院首批（2019）推荐国产仪器目录，并认定为广东省高新技术产品，首批客户包括美国国立卫生研究院（NIH）、加州大学旧金山分校等。锘海生物翟星帏主要介绍了其于2019年推出的锘海LS 18平铺光片显微镜，LS 18是一款为透明化大组织样品设计的高分辨率3D成像仪器，采用自主研发的动态虚拟光片平铺技术，克服传统光片显微镜3D空间分辨率、Z轴层析能力和成像视野之间的矛盾，摒弃了原有选择性平面照明显微镜中的单光片照明的方式，利用多个薄的光片分段照明，在不损失成像视野的情况下，获得高分辨率的3D图像，具有高速高分辨率成像、成像模式灵活可调，多色同时成像等优势。据悉，该产品已完成10台销售。北京大学陈良怡教授发明了一系列高时空分辨率生物医学成像方法，还将原创技术转化为国内急需的高端显微镜产品，解决国内高端显微镜“卡脖子”现状。发明的主要技术包括：高分辨微型化双光子显微镜、高三维成像速度的贝塞尔三光子荧光显微镜、大视场下高分辨双光子三轴扫描光片显微镜、海森结构光成像结构超分辨荧光显微镜等。在广州超视计生物科技有限公司产业化的自主创新超灵敏结构光超分辨显微镜HiS-SIM PRO，性能参数皆由于国外厂商同类高端超分辨显微镜，且商品化产品已经达到已经发表高水平文章中的效果。北京世纪桑尼赖博分享了公司于2018年启动研发，2019年实现上市的CSIM 100/110共聚焦成像系统，基于独特光路结构（激光和荧光相向穿过同一个针孔等）和自主开放的信号放大电路（更高信号转换效率等），该系统具有相应时间快、重复精度高等优点。目前该系统DAMO及装机用户包括兰州大学、遗传发育所、军科院、北京大学等高校院所，并表示性能不弱于进口品牌。最后，赖博分享了超分辨技术摄像的探讨及接下来的研发工作，基于其发现的无限远校正光学系统原理，提出增加扫描透镜和真空透镜距离，可提高系统轴向分辨率，突破物镜分辨率极限的计划畅想。

项目编号：ZJ-2230985-01 项目名称：浙江省人民医院超高分辨共聚焦显微镜 预算金额（元）：5200000 最高限价（元）：5200000 采购需求： 标项名称: 超高分辨共聚焦显微镜 数量: 1 预算金额（元）: 5200000 简要规格描述或项目基本概况介绍、用途：用于获取清晰的高质量的以及超高分辨率的共聚焦荧光图像 备注：允许进口 合同履约期限：标项 1，按采购文件要求 本项目（是）接受联合体投标。

蔡司 Elyra 7 with Lattice SIM摘得“分析/测试”类桂冠德国耶拿，2019年11月22日 蔡司荣获负有盛名的2019年度R&D 100大奖。R&D 杂志的评委选择了蔡司 Elyra 7 with Lattice SIM超高分辨率显微镜作为“分析/测试”类的获奖技术。 蔡司Elyra 7 with Lattice SIM是用于生物医学研究中超高分辨率成像的显微镜系统。其创新的Lattice SIM技术具有非常高的光效率，并且能快速超高分辨率成像。此外，其光毒性低和成像速度快的特点，可让研究人员从中受益良多。Lattice SIM照明技术突破了快速超高分辨率的界限，其目前可用于几乎所有活细胞和固定样本的成像实验。得益于此，研究者可以借助Lattice SIM 多通道长时间的以三维大视野、温和地观察活细胞样品的快速动态过程细节。 Lattice SIM可进行光学切片，并在3D模式下获得2倍于衍射极限的分辨率。Lattice SIM技术在传统超高分辨率结构照明显微成像（SR-SIM）的原理上进行了创新，可实现高达255帧/秒（fps）的图像采集速率。此外，Lattice SIM的高对比度和强大的重构能力，可在更深或光散射更强的生物样品中实现成像。 蔡司 Elyra 7可以在空间分辨率和成像速度上与研究者的实验需求完美契合。Lattice SIM技术可以克服传统SIM技术在速度、3D和光毒性等方面的局限性，为生命科学许多领域的新发现打开了大门。 R&D 100大奖是一项年度国际评比，旨在选出100项杰出的科学和技术创新。获奖者来自工业界、学术界、私人研究机构和实验室。本年度颁奖典礼将于12月5日的R&D100会议期间在加利福尼亚州圣马特奥举行。

近日，R&D 100 Awards宣布52届R&D100获奖名单，徕卡显微系统超高分辨率产品Leica TCS SP8 STED 3X获奖。R&D 100 Awards 是卓越品质的风向标，被誉为科技领域的“奥斯卡奖”,是国际科技研发领域极为推崇的科技研发奖。*2014 R&D 100 Award名单：徕卡显微系统Leica TCS SP8 STED 3X产品获奖TCS SP8 STED 3X是唯一能够以视频速度采集超高分辨图像的系统，为科研工作这进行亚细胞结构的动态研究提供了有力的武器。2014年恰逢徕卡显微系统推出超高分辨率产品10周年，STED 3X的获奖， 将更加激励徕卡人为超高分辨的发展做出更大贡献。 关于R&D 100 Awards：自1963年起，R&D 100 Awards 每年都会对新推向市场的革新技术进行鉴定。通过一个独立的评委组以及美国《研发杂志》编辑选出100名优胜者。很多获胜产品和技术已经在日常生活中发挥了不可忽视的作用，例如自动提款机（1973）、传真机（1975）以及 HDTV（1998）。R&D 100 Awards 早就成为生物技术、电信、软件和制造业等不同工业部门产品卓越品质的风向标。获胜者是工业、学术界、私人研究公司以及政府实验室的典型代表。 完整获奖名单请点击链接：http://www.rdmag.com/award-winners/2014/07/2014-r-d-100-award-winners 关于徕卡显微系统：徕卡显微系统有限公司是显微镜和科学仪器领域的全球先驱。十九世纪，公司从家族事业起步，如今成为全球知名企业，以无可匹敌的创新精神铸就辉煌历史。与科学界一贯的紧密合作是徕卡显微系统有限公司创新传统的关键，从而将用户的想法付诸实践并根据用户需要为其量身定制解决方案。徕卡显微系统有限公司的全球运作分为四个部门，它们均已成为其各自领域的先驱：生命科学部门、工业部门、医疗部门和纳米科学部门。公司在全球 100 多个国家设有代表处，在 5 个国家设有 6 家制造厂，在 20 个国家设立了销售和服务机构，并且具有全球性的代理商网络。公司总部设在德国的韦茨拉尔 (Wetzlar)。更多徕卡显微系统产品及应用介绍请见徕卡官网：www.leica-microsystems.com/cn/自2014年7月起，徕卡超高分辨显微镜“现身”徕卡北京、上海实验室，欢迎预约咨询，试用获奖明星产品！ 徕卡北京实验室体验Leica GSD 3DXY 分辨率 ≤20nm, Z分辨率≤ 50 nm多色荧光标记常规染料超稳定，无漂移咨询预约电话：13701278345 徕卡上海实验室体验Leica STED 3XXY 分辨率 ≤50nm, Z分辨率 ≤130 nm视频超高分辨成像速度纯光学多维超高分辨成像全光谱多色荧光标记咨询预约电话：15900785098

2023年8月6日至12日，由清华大学蛋白质研究技术中心、生物医学测试中心、中国细胞生物学学会细胞器生物学分会联合主办的第四届活细胞与超高分辨成像高级研讨会在北京清华大学成功举办。本次研讨会分为理论研讨和上机实操两个部分，吸引了来自全国各地100余位青年学者、学生和技术人员参会。此次会议在深入了解显微成像前沿进展及其在生物医学中的应用方面发挥了重要的推动作用。第四届活细胞与超高分辨成像高级研讨会参会人员合影本次研讨会邀请清华大学生命科学学院副院长、蛋白质研究技术中心常务副主任王新泉教授发表致辞。王新泉教授强调，每年持续举办此研讨会的意义不凡。随着显微成像技术飞速发展，我们需紧跟前沿技术进展，并着重推动原创性方法与技术研发。这次研讨会为构建科研平台、推动技术进步、促进合作交流以及解决技术选择难题提供了契机。同时，也期盼与会者从中汲取灵感，激发更多独创性的成果，为活细胞与超分辨成像领域贡献智慧和力量。生命科学学院副院长、蛋白质研究技术中心常务副主任王新泉致辞研讨会邀请了北京大学席鹏教授、陈良怡教授、孙育杰教授、中科院生物物理所李栋研究员、中国科技大学唐爱辉教授、西湖大学高亮研究员、章永登研究员、清华大学陈春来副教授、王文娟高级工程师和北京脑科学与类脑研究中心赵瑚研究员共十位在活细胞、超分辨、单分子成像、透明化、光片成像和图像处理等领域的知名专家进行报告。专家报告另外，来自Nanostring Technologies、LiT、锘海、英诺激光、安捷伦、Zeiss、Leica、Evident、Andor等显微成像公司的技术专家就当前热门技术如空间组学、光片、高内涵、光声、全息断层、X射线成像、荧光寿命、超分辨成像、一体化活细胞成像等技术原理、应用及其功能进行专业介绍。 研讨会现场在上机实操培训中，清华大学蛋白质研究技术中心细胞影像平台张彦丽、刘冰钰、李静、生物医学测试中心尼康生物影像中心王瑾瑜、曹慧珍等平台工程师，以及多位厂商技术专家就显微成像及图像处理技术开展仪器实操演示，使参会人员身临其境，更加透彻地理解显微成像及后期图像处理技术原理及操作流程，深刻体会不同技术之间的应用差异。将理论与实践融合共进，给参会人员带来这场显微成像的技术盛宴，实现活细胞与超分辨成像领域的跨越式成长。上机实操本届研讨会由清华大学蛋白质研究技术中心细胞影像平台主管、生物医学测试中心尼康生物影像中心主管王文娟高级工程师统筹并全程主持会议。参加上机实操学员领取结业证书并合影留念

教科书上的化学反应均以单分子形式进行概念描述，但实验中得到的却是大量分子的平均结果。一瓶380毫升的水，约含有10的25次方个水分子，投入金属钠会产生激烈的反应。不妨试想，宏观可见的化学现象，具体到单个分子是怎样的表现?　　单分子实验是从本质出发解决许多基础科学问题的重要途径之一。近年来，虽已有单分子荧光显微镜技术，冷冻单分子电镜技术等诺贝尔奖级别的成果问世，观察、操纵和测量最为微观的单分子化学反应仍是科学家面对的长期挑战。　　8月11日，浙江大学化学系冯建东研究员团队在国际顶级期刊《自然》发表封面文章。浙大团队以电致化学发光反应为研究对象，发明了一种可以直接对溶液中单分子化学反应进行成像的显微镜技术，并实现了超高时空分辨成像。该技术可实现更清晰的微观结构和细胞图像，在化学成像和生物成像领域具有重要应用价值。　　捕获分子发光信号 1秒内连拍上千张图片　　电致化学发光，是指具有发光活性的物质在电极表面通过化学反应实现发光的形式，可令分子产生光信号，在体外免疫诊断、成像分析等领域已有应用。　　“在溶液体系还难以开展单分子化学反应的直接光学捕捉。”冯建东介绍，单分子化学反应伴随的光、电、磁信号变化非常微弱，而且化学反应过程和位置具有随机性，很难控制和追踪。　　如何实现微弱乃至单分子水平电致化学发光信号的测量和成像?如何在电致化学发光成像领域实现突破光学衍射极限的超高时空分辨率成像，即超分辨电致化学发光成像?3年来，冯建东团队致力于这两大难题的研究，通过联用自制的具有皮安水平电流检出能力的电化学测量系统以及宽场超分辨光学显微镜，搭建了一套高效的电致化学发光控制、测量和成像系统。　　“团队通过搭建灵敏的探测系统，将电压施加、电流测量、光学成像同步起来，通过时空孤立捕获到了单分子反应后产生的发光信号。” 论文第一作者、浙大化学系博士生董金润介绍。　　从空间上，研究团队通过不断稀释，控制溶液中的分子浓度实现单分子空间隔离。时间上，通过快速照片采集，最快在1秒内拍摄1300张，消除邻近分子间的相互干扰。　　利用这套光电控制和测量平台，团队首次实现单分子电致化学发光信号的空间成像，其成像特点在于无需借助外界光源，可在暗室操作。　　多重曝光合成叠加 实现纳米级超高分辨率　　现如今，传统光学显微镜在数百纳米以上的尺度工作，而高分辨电镜和扫描探针显微镜则可以揭示原子尺度。“但能够用于原位、动态和溶液体系观测几个纳米到上百纳米这一尺度范围的技术非常有限。”冯建东提到，主要在于受到光的衍射极限限制，光学成像分辨力不足，即相邻很近的两个点难以分辨。　　为此，冯建东团队在获取单分子信号图像基础上，着手研究电致化学发光的超分辨成像。受到超分辨荧光显微镜技术的启发，研究团队利用通过空间分子反应定位的光学重构方法进行成像。　　“好比人们夜晚抬头看星星，可以通过星星的‘闪烁’将离得很近的两颗星星区分开一样。”冯建东介绍，技术原理即通过空间上的发光位置定位，再把每一帧孤立分子反应位置信息叠加起来，就能构建出化学反应位点的“星座”。　　为验证这一成像方法的可行性以及定位算法的准确性，研究团队通过精密加工的方法，在电极表面制造了一个条纹图案作为已知成像模板，并进行对比成像，条纹间隔为几百个纳米。　　记者看到，该微纳结构的单分子电致化学发光成像与电镜成像结果高度吻合。而且，单分子电致化学发光成像将传统上数百纳米的电致化学发光显微成像空间分辨率提升到了前所未有的24纳米。　　研究团队进而将该成像技术应用于生物细胞显微成像，以细胞的基质黏附为对象，对其进行单分子电致化学发光成像，观察其随时间的动态变化，成像结果与荧光超分辨成像可关联对比，其分辨率也可与荧光超分辨成像相媲美。　　“相比于荧光成像技术，电致化学发光成像不需要对细胞结构做标记，意味着不易影响细胞状态，对细胞可能是潜在友好的。”冯建东表示，未来，这项显微镜技术将作为一项研究工具，在单分子水平揭示更多化学奥秘，也有助于揭示更为清晰的生物结构和看清生命基本单位细胞如何工作。

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　　人类大脑是世界上最复杂的器官之一，据统计，人类大脑中神经元数量约达1000亿个，如此庞大数量的神经元是如何协同工作，如何在大脑中“对话”呢?张勇研究员以“在活体动物样本上观测AMPA受体突触的可塑性”为题，介绍了其在国外期间的一项相关研究，通过运用双光子活体成像的技术，研究了神经元表面AMPA型谷氨酸受体动态变化、神经元活性，以及神经元内多种信号通路的活性对动物行为的影响。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/adb7a5a7-39e1-47dc-8377-609523fee294.jpg" title=" 3.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong 报告人：JPK公司 郭云昌 /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：原子力显微镜与超高分辨光学最新联用技术 /strong /p p 　　从1999年成立以来，德国JPK公司成立历史虽然不足20年，但JPK近来的发展却不可小觑，其原子力显微镜产品不仅在生命科学领域获得广泛好评，2016年还推出了世界首台光镊-原子力显微镜联用仪OT-AFM。作为JPK中国区总经理，郭云昌博士在报告中介绍了JPK的发展历史，同时还详细讲解了JPK的产品系列、JPK原子力显微镜的全针扫描技术，以及AFM-Raman、AFM-光镊等联用技术。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/0331fee5-a95e-4678-827c-e098f021ee05.jpg" title=" 4.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong 报告人：中国科学院过程所 魏炜 /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：基于材料设计高效的疫苗佐剂 /strong /p p 　　针对胞内病毒感染需要增强细胞免疫的关键问题，魏炜研究员团队构建和设计了具有pH敏感特性的薄皮大腔PLGA纳微球，并将其进行了模式抗原OVA的装载，体外考察表明其具有良好的pH敏感释放行为。同时，DC细胞实验表明所构建的纳微球被摄取后，能够有一部分抗原成功逃逸至胞质中，循MHCⅠ途径递呈，增强细胞免疫，而未逃逸的抗原则可以循MHCⅡ途径提呈，活化B细胞分泌抗体，动物实验结果也证实，所构建的薄皮大腔PLGA纳微球与传统实心颗粒相比，能够获得更好的细胞与体液免疫水平。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/2fc57a5b-1131-41c2-9c25-7337ed390de0.jpg" title=" 5.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong 报告人：蔡司 傅利琴 /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：蔡司共聚焦超高分辨快速成像的新方法 /strong /p p 　　来自蔡司的傅利琴重点介绍了蔡司革新共聚焦LSM8系列产品：搭载Airyscan技术的LSM800和LSM880。据蔡司针对250多位专业共聚焦用户调研结果显示，用户更加关注的需求包括：兼具更优异的图像质量、清晰(更多细节)、活细胞快速成像、组织或活体深度成像等，而LSM8系列产品的优良性能则正是满足了客户上述的需求。另外傅利琴还介绍了蔡司的光电联用解决方案，包括关联显微镜样品台、一体化软件解决方案、光电图像半自动化重叠等。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/649a113c-0ef6-44c9-81bd-80812a4ca0de.jpg" title=" 6.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong 报告人：中国科学院生物物理所 候冰 /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：组织透明技术研究进展 /strong /p p 　　作为一种与传统切片技术互补的新兴组织学技术，组织透明技术因目前最先用于、也最常用于脑组织而又被称为透明脑技术。候冰老师在报告中为大家介绍了组织透明技术的产生背景、技术原理，以及该技术在发展演化历史长河中的教条及突破。最后，候冰老师还分享了时下流行组织透明技术的比较以及该技术的选择原则。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/256e9493-9919-46d5-adf5-3e01c4c42a9f.jpg" title=" 7.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong 报告人：FEI公司 于洋 br/ /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：FEI光电关联技术的应用 /strong /p p 　　2016年，赛默飞世尔科技完成对电子显微镜制造商FEI的收购，来自FEI的于洋首先介绍了光学显微镜与电子显微镜的应用区别以及光电联用的技术背景，接着重点讲解了FEI电镜与其他光学显微镜联用的桥梁软件MAPS,搭载这款软件的光电联用设备的多图片拼接技术，可以实现电子显微镜高精度和光学显微镜大视野图像的完美拟合。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/73de4795-ef8e-40e7-9b61-d2cde516cff6.jpg" title=" 8.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong 报告人：安道尔公司 王刚 /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：多模式高速共聚焦成像平台-Dragonfly /strong /p p 　　隶属于牛津仪器的安道尔科技有限公司的王刚向大家介绍了多模式高速共聚焦成像平台-Dragonfly，Dragonfly 核心功能是多点高速，高灵敏度共聚焦成像，其采集速度比普通点扫描共聚焦技术快至20倍。另外采用高分辨，高灵敏的探测器，有效减少活细胞成像的光毒性及光漂白，同时也适合于固定样品的高分辨快速三维成像。Dragonfly 配制的Fusion软件简化了Dragonfly的控制系统,用它的多种成像模式,荧光基团和成像模式的选择可通过鼠标三次点击切换。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/c495d354-4d31-43a1-a7e7-119c4b8d531a.jpg" title=" 9.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong 报告人：中国医科大学 赵伟东 /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：活细胞中的半融合与半分裂现象 /strong /p p 　　真核细胞中动态的膜融合与膜分离对维持细胞的生命活动至关重要，赵伟东在研究半融合与半分裂现象过程中，利用活细胞显微成像结合膜片钳技术来检测单个囊泡的分泌及胞吞。最终证实了半融合假说，提供了实验模型，为探讨活细胞中膜性细胞器的膜融合及分裂机制提供了理论基础及实验模型。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/e4ff8a3f-3e0d-41e7-9ea6-b0d95d440ff1.jpg" title=" 10.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong 报告人：蒂姆温特 齐冬 /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：最方便易用的光电联用技术介绍 /strong /p p 　　蒂姆温特的齐冬向大家介绍了一种方便易用的光电联用技术：光电融合成像显微镜(CLEM)，该技术具有的优势包括：解析光镜未见结构、实现电镜多色标记、准确区分小目标物、长距离结构关联性等。另外，齐冬还表示，他们已经做了一些光电融合成像设备的简单尝试，结果显示，该产品具有高速、易用、高效、简洁、高NA成像、自动图像叠加、开源软件等特点。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/382a1df1-bf69-45af-b2e9-a8c5e52c999e.jpg" title=" 11.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong 报告人：中国科学院生物物理所 李硕果 /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：3D-SIM超高分辨荧光显微镜使用经验分享 /strong /p p 　　李硕果向大家分享了自己多年在科学研究平台生物成像中心使用超高分辨荧光显微镜Delta Vision OMX V3的使用经验。从样品制备、设备保养、注意事项等多角度与大家进行了交流。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/1647a981-19d0-4959-8a21-f1ff481cd4ef.jpg" title=" 13.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　 strong 　报告人：GE公司 宁丰收 /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：SIM用于活细胞超高分辨成像 /strong /p p 　　超高分辨技术主要包括:SIM技术、STED技术、单分子定位超高技术(STORM/PALM)，来自GE公司的宁丰收主要介绍了SIM技术的原理及应用，同时详解了GE产品在SIM技术方面的优势以及诸多广大客户的成功应用案例。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/54ba275a-866f-4c4d-84ca-0b4f889a4af3.jpg" title=" 14.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong 报告人：北京大学 席鹏 /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：超分辨显微成像：更清晰，更丰富 /strong /p p 　　超分辨显微成像技术的进一步发展受到如下方面的制约：分辨率仍需进一步提高，以及从超分辨图像中提取更多的生物信息。席鹏研究员在报告中介绍他们团队的一些相关工作：第一，通过引入镜面反射实现干涉，将STED超分辨的轴向分辨率提高了6倍，水平分辨率提高了2倍。首次观察到了细胞核孔中心孔的环状结构，分辨率达到了19nm，刷新了STED分辨率在生物样品上的世界纪录 第二，成功实现了在30mW的低功率连续光照射下，28nm的超分辨显微 第三，实现了一种全新的超分辨技术---荧光偶极子方位角超分辨(SDOM)。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/b7d9574d-b1dc-4a6b-b8d2-84142395d25b.jpg" title=" 15.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong 报告人：奥林巴斯 戚少玲 /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：OLYMPUS最新共聚焦成像技术：FV3000 /strong /p p 　　来自奥林巴斯的戚少玲向大家分享了去年发布的新一代激光扫描共聚焦显微镜新品——FV3000，据介绍FV3000引入了两套扫描振镜，其中一套是高分辨率扫描振镜，具有先进显微镜特有的高分辨率成像能力 另一套是共振式扫描振镜，在保持大视野成像基础上兼顾了高速成像的表现。在全视野成像标准下，FV3000能够实现一秒钟内在屏幕上连续投射出 438张静止画面的采集速度，创下了业内扫描速度的新记录，可实时观察测钙、血流、心肌收缩等活细胞反应。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/3bf43132-90ed-4d76-874f-27b8898baa1e.jpg" title=" 16.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　 strong 　报告人：中国科学院植物所 张辉 /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：植物根样品钙火花来源的基础方法学研究 /strong /p p 　　与其他报告不同，张辉研究员报告内容的主题不是动物，而是植物。张辉研究员首先为大家科普了动物与植物细胞在超微结构上的巨大区别。最后介绍了自己团队进行植物根样品钙火花来源的基础方法学研究的研究背景以及前期设计的静态观察技术路线(高压冷冻和冷冻替代制备叶组织)。 /p p style=" text-align:center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/b0407962-b620-48ab-829a-1bc28841e144.jpg" title=" 17.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong 报告人：尼康仪器 李勋 /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：超高分辨系统最新进展——N-STORM /strong /p p 　　来自尼康仪的李勋向大家介绍了尼康新一代N-STORM超分辨显微成像系统，与N-STORM相比，N-STORM 4.0的图像采集速度提高了10倍，使得活细胞纳米级分辨率图像的拍摄成为了可能。N-STORM 4.0 实现了激光激发设计和sCMOS相机的升级，单张图像的采集速率从分钟级提高到秒极。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/6415041d-a54c-43c6-b54c-116eb46b0a0c.jpg" title=" 18.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong 报告人：军事医学科学院 周涛 /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：高分辨显微技术在细胞周期研究中的应用 /strong /p p 　　细胞周期异常与疾病密切相关，有丝分裂异常可能导致发育缺陷、心血管疾病、肿瘤等。周涛博士在报告中介绍其在细胞周期研究中应用到的两种显微成像技术，借助传统共聚焦成像技术考察了蛋白质有丝分裂时相中的定位、染色体中期排列状态、微管光强等 而利用超高分辨成像技术，则可以进一步研究微管与着丝粒的连接、着丝粒在微管上的运动状态，以及后期染色体滞后表型。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201703/insimg/870a1693-ef06-471c-86a5-be2958f37169.jpg" title=" 19.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 strong 报告人：徕卡 王怡净 /strong /p p style=" text-align: center " strong 　　报告题目：徕卡超高分技术的最新应用 /strong /p p strong & nbsp & nbsp & nbsp /strong 据来自徕卡的王怡净介绍，2014年诺贝尔化学奖获得者Stefan W. Hell与徕卡显微系统的工程师和科学家有长期良好的合作关系，早在2004年双方合作推出了商业化4Pi超高分辨显微镜，2007年, Stefan W. Hell将STED(受激发射损耗)专利技术授权徕卡研发。徕卡激光共聚焦平台——Hyvolution，可以帮助研究人员在140nm的分辨率下研究活细胞的快速动态过程，并同时采集多荧光标记的图像，或捕捉细胞内的细节信息。　　 /p

近日，中国科学院空天信息创新研究院遥感科学国家重点实验室研究员倪文俭带领的森林遥感团队，在利用超高分辨率光学遥感立体观测数据提取森林三维结构研究方面取得重要进展。现有研究认为，光学多角度立体观测数据在林区不具备穿透能力，故在缺乏林下地形数据时，无法独立进行森林垂直结构参数的直接测量，特别是在浓密山地林区。本研究发现：分辨率优于0.2 米的光学立体观测数据能够对单株树木的冠顶结构进行精细刻画；受树木异速生长方程启发，创建了“生长关系约束的林下地形逼近算法”(AGAR)，打破了传统的认知局限，实现了仅利用光学立体观测数据对森林垂直结构的直接测量。相关研究成果发表在Remote Sensing of Environment上。 　　森林作为重要的陆地生态系统碳库之一，准确估算其碳储量是遥感研究的主要方向，可服务于我国的“双碳”战略和地球系统碳循环过程研究。过去，国内外开展了基于遥感影像光谱或微波散射强度等“二维”特征的森林碳储量估算原理与方法研究，而“地形影响”“遥感信号饱和”仍是难以逾越的两大科学难题。因此，国际学界逐渐转向以卫星测距技术为基础的“三维”遥感，包括以激光测距为基础的激光雷达遥感、以微波测距为基础的合成孔径雷达干涉以及以视觉测距为基础的光学多角度立体观测。美国科学家致力于发展具备冠层穿透能力的星载激光雷达，包括早期搭载在航天飞机上的激光高度计SLA01和SLA02、2003年至2009年运行的ICESat/GLAS卫星、2018年发射的ICESat-2卫星以及2019年放置在国际空间站上的GEDI。欧洲科研人员则积极发展穿透能力较强的L波段Tandem-L和P波段BIOMASS合成孔径雷达干涉卫星，并计划2024年发射。相较于激光雷达和合成孔径雷达干涉，光学多角度立体遥感具有图像直观形象的显著优势但受穿透能力的限制，目前主要用于地表高程的测量，且需要依靠其他数据源提供的林下地形才能对森林垂直结构进行测量，应用价值和场景受限。 　　近年来，中国在光学多角度立体遥感方面快速发展，先后发射了资源三号、高分七号、天绘系列以及其他商业遥感卫星，同时影像空间分辨率逐步提高。能否利用不断提高的空间分辨率来突破其穿透能力弱的限制，进而最大程度地发挥超高分辨率光学多角度立体遥感数据的应用价值，既是国际前沿科学问题又是中国遥感科研人员亟需回答的问题。 　　森林遥感团队意识到超高分辨率光学多角度立体观测遥感数据的独特价值，自2014年对无人机立体观测数据在森林结构参数测量中的应用进行了持续研究，并于2018年开展了大兴安岭林区大范围无人机采样观测实验，揭示了观测角度与影像分辨率的耦合规律，证实了森林高度信息对叶面积指数估算的补充作用，研发了针对落叶林区森林高度提取的有叶季和无叶季影像协同解决方案，突破了光谱与三维几何特征协同的散发枯立木识别技术、单木识别与分割技术、以背景识别为基础的高精度森林覆盖度提取技术。在上述数据与技术积累的基础上，该团队创建了“生长关系约束的林下地形逼近算法”(AGAR)，实现了复杂地形条件下森林高度的直接提取。该成果证实了无需额外林下地形数据的支持，AGAR算法仅利用超高分辨率光学多角度立体观测数据即可实现森林高度提取。 　　尽管AGAR算法使用无人机获取的立体观测影像开展研究，且算法的具体技术细节需要进一步测试完善，但随着0.1米卫星光学遥感数据时代的到来，该方法将开启超高分辨光学立体遥感影像森林三维遥感新时代。图1.生长关系约束的林下地形逼近算法(AGAR)的核心思路图2.典型地形条件下森林高度提取的效果。(a)-(c)为光学多角度立体观测数据获取的数字表面模型(DSM)；(d)-(f)为光学多角度立体观测数据通过林窗插值提取的森林高度，由于浓密林区林窗较少，导致树高被严重低估或者地形特征去除不彻底；(g)-(i)为利用AGAR提取的森林高度。(a)区域覆盖山脊，(b)区域覆盖山谷；(c)区域覆盖从山脚到山顶的斜坡。

项目编号：DCHKZB009220180（校方编号） YKDX220929004（代理编号）项目名称：中国药科大学超高分辨激光共聚焦显微镜项目预算金额：350.0000000 万元（人民币）采购需求：中国药科大学拟采购超高分辨激光共聚焦显微镜1台，用于组织切片、活细胞的荧光标记、三维图像重建分析研究；细胞生物物质的定性、定量、定时和定位分布检测等。具体参数详见招标文件。合同履行期限：国产货物：合同签订后三个月之内交付；进口货物：收到信用证或发货通知后十三周内交付。本项目( 不接受 )联合体投标。

p 　　 strong 仪器信息网讯 /strong 2019年3月19日，“北京2019年度激光共焦及超高分辨显微学学术研讨会”在北京天文馆召开。会议由北京理化分析测试技术学会和北京市电镜学会共同举办，旨在推动北京市及周边省市激光共焦超高分辨显微学的进步和发展，提高广大相关工作者的学术及技术水平，促进上述学科在生命科学等领域中的应用。200余名光学高分辨显微学领域国内专家学者、青年科技工作者，及相关检测仪器厂商代表共同参与了本次研讨会。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/54180d3d-ac1e-4e40-a04e-5dd3855d52cb.jpg" title=" IMG_7154.jpg" alt=" IMG_7154.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 研讨会现场 /span /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/5ff22fdd-bdf9-48f3-bbd6-82ed351ddf29.jpg" title=" IMG_6948.jpg" alt=" IMG_6948.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 北京市电镜学会秘书长张德添致辞 /span /p p 　　会前致辞中，北京市电镜学会秘书长张德添表示，激光共焦技术商业化的30余年来，从单光子到双光子再到高通量等，取得了飞速的发展。为紧随技术发展步伐，打通高端应用专家与一线科技工作者之间的屏障，秉承北京市电镜学会“学术与公益第一”的原则，此次论坛特邀十余位在光学高分辨显微学领域杰出专家与行业领先的仪器商技术专家，与大家共同分享激光共焦及超高分辨显微学领域最新应用成果及最新技术动态，并期待与会者能够满载而归。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/ddd048d5-7074-4e86-b77f-400bca4e7d92.jpg" title=" IMG_7005.jpg" alt=" IMG_7005.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告人：李栋（生物物理所） /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告题目：掠入射结构光超分辨显微镜（GL-SIM）揭示细胞器、细胞骨架动态相互作用 /span /p p 　　李栋曾在“北京市2016年度激光共焦超高分辨显微学学术研讨会”报告介绍了当时其团队开发的两种光学超分辨技术：high NA TIRF-SIM和PANL-SIM。李栋笑称，今天再次在此论坛报告，算是对自己三年来工作成效的一个汇报。 /p p 　　掠入射结构光超分辨显微镜（GL-SIM）技术由李栋团队与美国霍华德休斯医学研究所合作完成。该技术能够以97纳米分辨率、每秒266帧对细胞基底膜附近的动态事件连续成像数千幅。并利用多色GI-SIM技术揭示了细胞器-细胞器、细胞器-细胞骨架之间的多种新型相互作用，深化了对这些结构复杂行为的理解。微管生长和收缩事件的精确测量有助于区分不同的微管动态失稳模式。内质网（ER）与其他细胞器或微管之间的相互作用分析揭示了新的内质网重塑机制，如内质网搭载在可运动细胞器上。据悉，2019年2月底，该GL-SIM技术成功入选科技部高技术研究发展中心公布的2018年度中国科学十大进展。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/8c003b42-f045-4b4e-8b39-942e0322002e.jpg" title=" IMG_7010.jpg" alt=" IMG_7010.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告人：王怡净（徕卡显微系统(上海)贸易有限公司） /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告题目：高分辨率成像的新突破 /span /p p 　　样品表征首先找到适合的表征技术手段十分重要，王怡净介绍了一种更加适合活细胞实时成像、大样品图像拼接方面的表征技术——徕卡THUNDER imagers技术，该技术基于宽场成像技术，由徕卡近期推出。 /p p 　　宽场成像是生命科学显微成像中最重要的方法之一。但限于其本身不能有效避免背景信号及多焦面间的信号互扰，因此主要被用于单层细胞或厚度不超过50 μm组织切片。过厚的样本将导致宽场成像变的模糊，成像结果无法用于发表的论文或数据分析，如厚病理切片、培养皿中大量生长的活细胞（尤其悬浮细胞）、微孔板中的Colony、模式动物等样本等。而分辨率更高的共聚焦成像技术又存在成像时间过长（很多生命过程十分迅速）、对于厚样本单层共聚焦图像有时不能很好代表整体生物学信息等缺陷。THUNDER imagers技术则可以在与普通宽场成像相同成像速度的基础上，获得更高清晰度的图像，同时兼具与共聚焦相同的大样本拼接、层扫和3D重建功能。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/1101dc9e-1569-4f58-814c-8e8b1d47103e.jpg" title=" IMG_7078_副本.jpg" alt=" IMG_7078_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告人：陈建国（北大生科院） /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告题目：中心体的结构与组装 /span /p p 　　中心体是一个部分真核细胞的细胞器，由两个互相垂直的中心粒构成，是动物细胞与低等植物细胞中主要的微管组织中心，同时也能够调节细胞周期进程。陈建国结合其团队近期工作进展，首先介绍了中心体与微管网络结构的组织概况、中心体的结构、中心体的复制与细胞周期、子中心粒的组成、中心体的蛋白组分等。接着介绍了中心粒亚远端附属结构的组装以及中心粒远端结构蛋白和纤毛结构的组装及其调控机制，并对中心粒可能在人体中的功能进行了分析。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/dc539b06-860a-4157-8cb0-0d591d817d08.jpg" title=" IMG_7090.jpg" alt=" IMG_7090.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告人：朱凤胜（上海宇北医疗器械有限公司） /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告题目：前瞻性超分辨活细胞纳米荧光成像技术与系统 /span /p p 　　受激辐射光淬灭超分辨率共聚焦显微影像系统 (pulsed-STED)由2014诺贝尔化学奖Stefan W.Hell团队设计，并随之创立Abberior公司。朱凤胜表示，Abberior pulsed STED具有的诸多优势包括：大幅减少“无意义”激光伤害和荧光漂白；高效时间分辨率，使各触控逐渐高度智能化协调，同时提供解析度；提供升级空间，满足更多应用需求等。与传统STED的3D分辨率（130*130*130nm）相比Abberior pulsed STED高至70*70*70nm，2D分辨率则由STED CW的80nm和g-STED的50nm提升至20nm。接着介绍了新一代 3D STED 超分辨纳米成像技术——Easy 3D STED，其SLM 调控的单一光路，提供镜头像差修正，可以切换使用油镜、水镜、甘油镜、硅油镜等，使得成像的厚度深达180微米。最后，朱凤胜预告了该公司的另一项革命技术MINFLUX，表示该技术将能够实现分辨单一纳米水平的分子结构。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/c6ef7e30-dbe0-4494-87c6-a2af27b0f6db.jpg" title=" IMG_7130.jpg" alt=" IMG_7130.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告人：纪伟（生物物理所） /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告题目：通过冷冻和干涉成像提高单分子定位显微镜的分辨率 /span /p p 　　纪伟首先介绍了单分子定位成像技术的原理和进一步提升定位精度的方法（新的荧光探针和抗漂白试剂）。基于此，又分别介绍了冷冻单分子定位成像和干涉单分子定位成像技术，并针对已有的技术弊端进行改进；设计搭建冷冻超分辨光电融合成像系统以及干涉单分子定位成像系统，实验验证了其优异的性能表现。最后表示，纳米精度成像的应用方向包括：原位结构方面，为原位电镜结构解析提供导向定位；细胞成像方面，100nm以内的亚细胞结构解析和分子定位、功能；以及生物大分子动态构想变化等。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/b88d1cf7-7252-4273-a089-8f3938f7d10e.jpg" title=" IMG_7168.jpg" alt=" IMG_7168.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告人：孟丽丽（奥林巴斯（中国）有限公司） /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告题目：海量活细胞筛选下的超分辨成像技术 /span /p p 　　孟丽丽报告中表示，海量活细胞的筛选具有“大数据”和“云计算”的特征，具体表现包括海量数据的快速采集与定量定性分析；获得全部样本数据；通过对对海量数据筛选，获得稀有事件（日CTC循环肿瘤癌细胞）等。奥林巴斯围绕这种需求提供了全面解决方案，如scanR软件可提供全自动海量细胞采集过程中的细胞周期精细分析、Time-Lapse活细胞动态分析，实时快速部件保证速度与精度，提供超高分辨/共聚焦高内涵/宽场高内涵显微三种成像模式等。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/ed552f26-bc0c-46b6-b1da-aeac60a9beee.jpg" title=" IMG_7196.jpg" alt=" IMG_7196.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告人：张毅（北京师范大学） /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告题目：花粉微丝骨架动态的调节机制 /span /p p 　　花粉粒的萌发和花粉管的伸长对于开花植物完成双受精从而进行繁殖至关重要。花粉粒多为球形或椭球形的对称结构，其如何建立极性，进而确定萌发位点，一直是植物细胞生物学领域重要的科学问题。然而，由于花粉粒不易进行荧光显微镜观察，目前对这一重要生物学问题的研究非常滞后。张毅研究组以双子叶模式植物拟南芥为材料，利用转盘式激光共聚焦显微镜对花粉粒内微丝的动态变化进行长时间的实时追踪观察，发现微丝骨架在花粉粒萌发前建立极性并标记萌发位点；进一步的药理学和遗传学实验发现了不同于经典的以微丝作为运输轨道的细胞内物质运输方式。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/205d6c81-9c02-4a6d-b917-e1bf146874d4.jpg" title=" IMG_7242.jpg" alt=" IMG_7242.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告人：Jaron Liu（GE公司） /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告题目：Deltavision OMX Technology ：One System, All the Answers /span /p p 　　来自新加坡的Jaron Liu主要介绍了GE公司的DeltaVision OMX SR超高分辨率显微镜的主要优势和应用。该系统提供2D和3D结构照明（SIM）技术以及单分子定位显微镜以及快速宽场采集高分辨率成像模式。创新Blaze SIM模块实现了高速SIM成像，使活细胞超高分辨率成像成为现实。此外，该系统支持创新的Ring-TIRF系统使得TIRF模式下也能实现的大面积均匀照明视野，用于多种应用，比如单分子追踪和单分子定位超高分辨率成像。其专利的BlazeSIM模块可以实现最多每秒15幅的超高分辨成像速度，轻松完成活细胞超高实验。单分子定位模块最高分辨率可以达到20nm。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/b7765b64-ac53-4c45-b5b3-cdc2e80ea8df.jpg" title=" IMG_7264.jpg" alt=" IMG_7264.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告人：席鹏（北京大学） /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告题目：为结构光超分辨赋予极性 /span /p p 　　席鹏利用GE公司的DeltaVision OMX系统与尼康公司的N-SIM系统，通过小鼠肾段肌动蛋白的Polar-3D-SIM等对结构光超分辨的极性研究，获得启示：关于超分辨，新的维度或许可以打开新的视野。而偶极取向或是荧光分子的一个新的维度，如超分辨偶极取向显微镜、SIM与SDOM之间相似性、利用SIM直接获取极性信息等。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/cd59bc20-53b2-4059-978b-a15df45fcb4c.jpg" title=" 微信图片_20190319230724_副本.jpg" alt=" 微信图片_20190319230724_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告人：周建春（尼康仪器（上海）有限公司 ） /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告题目：尼康新型共聚焦及超分辨率系统介绍 /span /p p 　　周建春介绍了尼康新型共聚焦及超分辨率系统的一系列创新：激光器方面，最多支持8个激光器，全固体激光器，寿命长，稳定性高等；Scan head方面，视野由传统的18mm增至25mm，使得“所见即所得”升级为“见，所未见”，高通量成像，节约成像时间等；新型高级共振扫描头（适用于活细胞成像）方面，高速和高清晰度（1k）、低光毒性等；可扩展功能方面，多模块成像、可定制软件、HCA软件、分辨率增强升级等。最后介绍到活细胞超分辨成像技术的优越之选——N-SIM S（高速成像达15fps，极低光毒性）。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/e36ef2de-b217-4abc-bb05-12ecc899e320.jpg" title=" IMG_7306.jpg" alt=" IMG_7306.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告人：张然 （蔡司） /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告题目：关于新一代蔡司超高分辨技术的应用 /span /p p 　　张然介绍了蔡司于2018年年底推出的全新一代超高分辨率显微镜3D成像系统——Elyra 7平台。新品发布信息中，Elyra 7被描述为一种“快速、温和、灵活”的超高分辨率显微镜3D成像系统。新增的Lattice SIM技术扩展了结构化照明显微镜(SIM)的应用范围：采用晶格图案而非光栅可使图像对比度更高，图像重构处理更高效。科研工作者可以采用2倍的采样效率降低光毒性，观察超高分辨率条件下细胞的快速移动过程。即使在高帧率下也能确保高图像质量。Elyra 7平台广泛扩展性包括：SMLM单分子荧光定位显微技术、LSM激光共聚焦显微镜、关联显微镜等。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/92e7ff8f-acdc-465d-b675-2a8fda661f74.jpg" title=" IMG_7338_副本.jpg" alt=" IMG_7338_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告人：齐冬（蒂姆温特远东有限公司） /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 报告题目：光片显微镜——高速、低杀伤的发育及功能研究 /span /p p 　　齐冬首先通过与激光共聚焦的各项性能对比，介绍了光片显微镜的优点与不足，其主要适合对象为大样品长时程、低杀伤的发育生物学研究，如斑马鱼、果蝇、植物、早期胚胎、3D细胞培养、透明脑类研究等。接着介绍了蒂姆温特远东公司针对光片显微镜的设计与应用情况，创新的设计方案包括倒置式双轴、三轴（对侧照明& amp 单侧成像）、四轴（对侧照明& amp 对侧成像），并结合斑马鱼、果蝇、植物等介绍了其出色的应用。同时还介绍了其低杀伤、可大透明化样品直接观察等优势。面对大数据处理（TB级别以上）的问题，齐冬提出建立工作站、课题组共享的建议。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/65ce0dea-448a-4af8-ad15-56f63db80b66.jpg" title=" 展商.jpg" alt=" 展商.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 展商一角 /span /p

荧光显微成像技术对人们理解神经科学起了非常关键的作用。而最近一些年出现的各种超分辨显微成像技术和专门的荧光探针能够以超过以往普通光学显微镜的分辨率直接观察神经元亚细胞结构和蛋白质排列。并以直观可视方式揭示了神经细胞骨架组成、分布、运动和膜蛋白信号传导、突触下结构和功能，以及神经元−胶质细胞相互作用。同时超高分辨显微成像技术（Super Resolution,SR,下文中出现SR均指超高分辨率显微成像技术）对于许多自身免疫和神经退行性疾病模型中的分子靶点研究也提供了全新的强大工具。今年春，Werner等科学家在美国化学学会会刊（ACS)上最新发表了一篇综述，比较详实系统介绍了超高分辨率显微技术在神经科学上的最新应用进展。我们在此文基础上进行了编译整理。因文章较长，我们将分三期陆续介绍。本期介绍第一部分。1. 背景介绍成像技术是推动生命科学几乎所有学科基础研究的核心平台。在神经科学领域，近几十年来，共聚焦显微镜技术已成为分析神经组织的标准荧光成像技术。激光扫描共聚焦显微镜对固定的神经元样本进行观察，在扫描水平上提供了三维和多色图像并使单个细胞达到树突结构的分辨率。作为补充，电子显微镜（EM）用于获取神经元和亚区室超微结构的信息，并用于大脑的连通性分析。EM非常适合于神经元突触和囊泡、细胞器和膜构象的结构分析。然而，由于靶向特异性标记方法的局限性，基于EM的复杂样品中蛋白质和特定电子密度特征的识别受到限制。为了进一步理解神经元功能，包括双光子显微镜在内的几种活体视频显微镜应用的发展使神经元细胞培养的活细胞成像、器官型切片培养和动物模型的活体成像成为可能。同时，新的荧光染料、功能探针和荧光蛋白以及光遗传学方法和光驱动（如笼状化合物）不仅可以表征神经元，还可以操纵神经元及其从单分子水平到整个神经系统的相互作用。然而，荧光显微图像中可见细节的水平，即图像分辨率，仍然受到衍射极限的限制。一个多世纪以来，由λ/2NA定义的阿贝衍射极限（λ为波长，NA为显微镜物镜的数值孔径）决定了光学显微镜的分辨率极限，限制了两个位置小于200纳米的细节分辨。在过去的二十年中，超分辨显微镜（SRM）已经发展成为一种非常有效的亚细胞水平荧光成像和分辨细胞器结构的研究手段。SRM现在可以提供远低于常规光学显微镜衍射极限的空间分辨率，从而能够深入了解神经元细胞和组织中蛋白质的空间结构和相互作用。本文综述了超分辨显微镜和荧光标记方法及其在神经科学中的成功应用。我们将首先详细介绍各种SRM方法的基本原理、新的功能型荧光探针和标记技术。接着，我们将回顾SRM如何有助于我们理解神经元亚细胞结构和功能以及神经元−胶质细胞相互作用。此外，我们将概述超分辨率成像方法如何帮助研究自身免疫和神经退行性疾病的病理生理学。最后，我们将介绍这些新的成像方法是如何应用于神经精神疾病相关的人类样本的分析。由于该领域持续快速发展，我们最多只能代表一份中期报告。进一步的创新和新的显微镜方法的发展将使人们对神经系统功能有更详细的了解。 2. 神经科学中的超分辨率成像方法2.1. 光学衍射极限及其对神经科学的影响人类大脑包含超过800亿个神经元，每个神经元由数千个突触连接。因此，它构成了复杂神经元网络。这些网络的主要组成部分，例如突触神经末梢，显示的空间维度接近于光学衍射极限分辨率∼200 nm。释放递质的突触活性区（突触前细胞基质的特化区）的直径通常约为300±150 nm。突触小泡作为递质运输和释放的关键元件，其尺寸平均小10倍，直径为40−50nm。这些递质被释放到宽度为20-50nm的突触间隙中−再结合突触后受体。由于衍射极限的尺寸限制，胞吐机制和跨突触信号在传统的光学显微镜下基本上是无法观测到的，因此需要用提高10倍分辨率的方法进一步研究。（图1）。图1. 兴奋性突触结构组成。左图为兴奋性突触的油画示意图，右图为左图的灰度图像，其中浅紫色圆圈为衍射极限光斑；玫红色圆圈为兴奋性突触囊泡，约40-50nm；绿色为突触后膜AMPA受体，尺寸小于10nm；黄色部分为突触间隙，约20-30nm。 此外，大量参与突触信号传导的不同的分子，位于极小的突触内，造成很高的分子分布密度，这对微观研究具有挑战性。例如，对于较小的突触，兴奋性突触可以包含数百个小泡，对于大型苔藓纤维束突触，可以包含数千个小泡，每个小泡包含多达1万到10万个递质分子。在这些囊泡中，约有10±5个与释放部位对接，释放的递质平均与0−20 个NMDA受体和0−200个AMPA受体结合，而这些突触后受体又被320±130个突触后PSD-95密度蛋白分子环绕。由于加速电子的波长要短得多，因此EM是唯一能够解析突触纳米级结构的方法。然而，虽然传统的EM产生的电子密度图像具有极好的超微结构分辨率，但需要进行固定和靶向特异性标记的制样方法在很大程度上限制了蛋白质识别和神经元追踪。荧光显微镜可以很容易地对蛋白质进行选择性标记，但是受制于可见光的衍射（400−700 nm）使生成的图像无法实现对纳米结构的分析。 2.2.绕开光学衍射极限的光学显微镜方法 20世纪后期，人们开发了新的策略，通过利用物理或化学手段来区分不同荧光团的发射或减少同一时间荧光分子的数量，以尽量绕过衍射极限。减少荧光团的点扩散函数（PSF）的重叠可以通过生成光图案在集合级别以确定性方式进行，或者通过减少同一时间荧光团的数量在单分子水平上以随机方式进行。在下文中，我们将从确定性集合方法开始介绍，该方法将激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）的有效空间分辨率推到理论极限。2.2.1. 确定性集合超高分辨率成像方法（Deterministic Ensemble SR-Imaging Methods） CLSM用针孔探测器阵列替换单点探测器，空间分辨率可以提高√2倍。CLSM测量每个扫描位置探测器每个点的荧光信号。在应用适当的算法后，生成分辨率提升的图像。这些所谓的像素重分配方法包括图像扫描显微镜（ISM）、重扫描共聚焦（RSC）、光学光子重分配（OPRA）、AiryScan和即时结构照明显微镜（iSIM）。对于信号检测，使用了诸如CCD相机、光电倍增管阵列、单光子雪崩二极管阵列和六角光纤束等探测器阵列。结构照明显微镜（SIM）在光路中插入光栅，产生与样品干涉的相干光束，生成横向和轴向方向不同的新照明图案。然后可以使用傅里叶变换提取这种新照明图案的信息，从而在所有三维空间中实现空间频率分解和分辨率倍增。SIM对样品制备的要求最低，并且可使用所有常规荧光探针，这些探针具有最低的光稳定性，并且可以很容易地扩展到多色成像。然而，当记录三维或长时间成像时，强烈建议使用光稳定性更高的荧光团。此外，SIM使用更低的激发强度，因此是活细胞SR实验的理想选择。为了获得更高的分辨率，引入了通过图案化饱和或荧光激发或图案化耗损光开关染料的非线性SIM（NL-SIM）。然而对染料开关特性的苛刻要求限制了NL-SIM在常规生命科学实验中的适用性。非线性SIM单位时间内还需要采集更多的图像，因此实际上仅限于2D成像。另一方面，掠入射（GI）-SIM显示了高达每秒266帧的快速超分辨率成像以及100nm分辨率，揭示前所未有的细胞器动力学细节。结构照明的局限性在于其对波长的普遍依赖性、与其他SR成像技术相比的低分辨率以及对系统稳定校准的需要。最后，后处理需要进行先验质量检查以避免伪影,例如由于高背景信号或不充分标记产生的低对比度图像导致的人工蜂窝图案。通过受激发射耗损(STED)显微镜进行超分辨率成像是一种实现更高空间分辨率的成像方法。这里，高斯分布的激发激光束被中空的甜甜圈样的耗损激光束覆盖，使扫描点外围的荧光团返回基态，这导致纳米级焦点区的直径与耗损光束的强度成反比，耗损光束的强度直接转换为STED显微镜的分辨能力：上图公式中λ为波长，n为折射率，α为物镜的收集角，ISTED为STED光束的照射强度，IS为饱和强度。因此，可以通过改变损耗激光强度来调整分辨率，可定制设计分辨率达30−80nm 的显微镜。STED显微成像可通过连续或脉冲激光激发、门控检测。带有脉冲激光的STED显微镜会降低激发能量，从而减少实时成像中的光毒性效应。STED显微镜中的时间门控检测可以去除荧光团光子到达时间前的空间信息，并且可以在较低的平均功率下工作。商品化STED能提供用户友好的高分辨率成像，无需进一步的数据后处理。活体成像，例如活体树突棘动态成像已经很成熟，但快速动态成像仅限于小帧尺寸，因为它仍然是点扫描方法，高激光强度可能会导致光损伤。STED通过应用自适应照明方式Dymin和rescue技术，可以明显减少光损伤。在Dymin STED中，在共聚焦模式下扫描时确定最低可能的STED光束强度。根据样品的标记密度，这将使STED光束强度降低20到100倍。Rescue STED同样通过减少STED激光开放的区域，从而比普通STED减少光漂白接近8倍。STED的另一个限制是对荧光团光稳定性的依赖，因为在高激光强度下会发生明显的光漂白。这影响了动力学的研究和三维图像的获取。值得注意的是，最近通过使用荧光团标记的寡核苷酸（瞬时结合到连接靶蛋白结合探针的互补寡核苷酸）或非结合荧光团来进行细胞STED成像，从而绕过了STED光漂白问题。这两种方法中，基于DNA互补标记的STED成像和超分辨率阴影成像SUSHI分别通过荧光团标记的寡核苷酸和高浓度的非结合和自由扩散的荧光团不断交换来防止光漂白。SUSHI的方法已经成功地用于活体脑片中细胞外间隙和神经肽的结构解析及其动力学的STED成像。如果使用具有毫秒或更长寿命的两种稳定状态的可逆切换荧光团来代替标准荧光团，则STED强度可以显著降低。可逆饱和切换光学线性荧光转换方法（RESOLFT）已通过可逆可切换荧光蛋白（reFPs）实现，并成功应用于活体海马脑片树突棘的超分辨率成像。2.2.2. 随机单分子SR成像方法（Stochastic Single-Molecule SR-Imaging Methods）上述的确定性方法是通过改变激发模式或相位掩膜来暂时控制荧光发射达到超分辨成像，而基于单分子的定位SR显微镜则是随机地在时间上分离单个荧光团的发射。单分子定位显微镜（SMLM）基于单个荧光团的随机激活，使用配备高灵敏相机（EMCCD或sCMOS）的宽场荧光显微镜进行单分子检测，以及精确的位置测定。通过将理想PSF与实际测量的光子分布拟合来进行分子定位。只要信号来自单个发射区，且单个发射区之间的距离大于显微镜能分辨的最小距离，则通过收集更多光子和最小化噪声，定位的标准误差可以任意小。激活和定位过程重复多次，所有定位最终用于重建超分辨率图像。为了确保在成像的任何时候，只有稀疏的小荧光团以其活性荧光形式存在（开启状态），使用了光开关、光转换、光激活或自发闪烁的荧光团。由于定位精度和最终图像分辨率取决于每次检测到的光子数量，通常采用明亮且稳定的荧光团与1 kW/cm2的辐照强度相结合的方式。根据所使用的荧光团不同，SMLM可达到10−50 nm横向分辨率。光激活荧光蛋白（FPs），自2006年以来已用于光激活定位显微镜（PALM），例如在405 nm的激光照射下可从关闭状态不可逆地转换为打开状态的PA-GFP和PA-mCherry 以及可通过适当波长的激光照射从一种波长状态不可逆地转移到另一种波长状态的光转换FPs，例如MEO。此外，还成功地应用了诸如Dronpa之类的光开关FPs，其在不同激发波长的激光照射下可在非荧光和荧光状态之间可逆地切换。对于活细胞应用，使用荧光蛋白的PALM是首选方法。因为在理想情况下，每个感兴趣的蛋白质都可以用荧光蛋白进行计量标记。然而，荧光蛋白比有机染料表现出更低的光稳定性和光子计数，从而降低了定位精度，并且通常需要更长的采集时间。此外，对于PALM成像而言，融合蛋白通常会过度表达，这可能会导致不真实图像，而用转基因变体替代显示野生型表达和功能的自身蛋白仍然具有挑战性。对于细胞内源性蛋白质的标记，通常使用有机染料的免疫标记。SMLM适用的有机染料必须是光开关、光激活或自发闪烁的，以实现单个染料发射的时间分离，但化学计量标记要困难得多。有机染料通常表现出较高的光子计数和光稳定性，从而使定位精度达到5−10nm。花菁染料Cy5和Alexa Fluor 647可以在荧光开启状态（其典型寿命为10 ms）和非荧光关闭状态（寿命为几秒，利用光开关缓冲液，缓冲液包括PBS，10−100mM硫醇，如ß-巯基乙缅（MEA），酶促氧清除剂，可以有/没有激活染料）之间可逆切换，为随机光学重建显微镜（STORM）和直接型STORM（dSTORM）的发展铺平了道路。近年来，应用于（d）STORM的染料已大大扩展，除了菁染料外，还包括罗丹明和恶嗪染料。有趣的是，最近的研究表明，即使是多个标记的抗体在光开关缓冲液中也呈现出类似于单发射的表现，因此适用于dSTORM实验。光活化染料的作用与光活化荧光蛋白相似。也就是说，它们在被光照射或自发激活之前处于非荧光状态。罗丹明衍生物PA-JF549和PA-JF646以及桥环菁染料Cy5B是已成功用于SMLM的光活化染料。此外，在没有光开关缓冲液的水溶液中，硅罗丹明HMSiR等自发闪烁染料也能应用于SMLM。最近，通过图案化照明方式实现更高的定位精度，单个荧光发射区的定位得到了改进。定位精度取决于信号的大小和强度，可以通过测量的PSF标准偏差的平方除以收集的光子数来估计。然而，包括拟合性能、标记密度、标记误差和显微镜漂移在内的其它参数决定了高定位精度是否可以转化为低于10 nm的空间分辨率。此外，到目前为止，因为SMLM方法成像需要昂贵的仪器和成像者具备广泛的专业知识，这在一定程度上阻碍了其广泛应用。2.2.3. SMLM-点累计纳米成像技术（PAINT，Point Accumulation for Imaging Nanoscale Topography）第一代SMLM技术依赖于荧光团的光开关和光激活，其分辨率需要有效地利用荧光团发出的光子数，而PAINT(point accumulation for imaging nanoscale topography)方法使用活的，与目标区域结构短瞬结合的染料。在成像过程中，被漂白的荧光团可以被成像介质中充足的新鲜荧光团不断置换替补。由于游离染料在采集单个图像帧期间在多个像素上快速扩散，因此它们仅显示为模糊背景且不能准确定位，而结合染料显示为PSF且能准确定位。因此PAINT的第一种方法是将荧光染料（如尼罗红）与细胞膜进行非特异性结合，然后进行光漂白和新的结合。此外，基于蛋白质片段的探针被用于单分子定位标记。在最近的一个研究中，将这种方法与传统的基于phalloidin的肌动蛋白标记方法进行了比较。通过引入通用PAINT（uPAINT）使Ni-Tris-NTA与转基因蛋白质上表达的His-Tags更特异结合，并可用于突触间隙成像。uPAINT也可以应用于其它标记方法，如免疫标记（内源性蛋白抗体、纳米抗体如绿色荧光蛋白）或受体配体结合。为了提高PAINT的适用性和特异性，引入DNA-PAINT方法。它使用长度小于10个核苷酸的短的可控的寡核苷酸链（成像链）瞬时标记其靶结合互补寡核苷酸链（对接链）。成像链与对接链的瞬时结合产生明显的闪烁。因此，荧光团开-关状态之间的切换与其光物理性质不直接关联。DNA-PAINT首先在DNA折纸（DNA-origami）上得到验证。DNA折纸是一种自组装的DNA结构（具有已知的大小），通过侧链和荧光团进行结合，并通过宽场显微镜观察。总的来说，DNA-PAINT是一种易于实现的SR成像标记方法，无需特定光物理特性的荧光团。因为探针可以在一轮结合后，从成像介质中置换补充荧光团，从而避免了光漂白。DNA-PAINT的缺点是图像获取时间长，这是由成像链与对接链的结合和解离速率决定的，以及荧光成像链的纳摩尔浓度引起的背景信号。尽管通过使用优化的DNA序列和缓冲条件，以及使用串联的周期性DNA结构域或通过短肽的卷曲螺旋相互作用（称为“Peptide-PAINT”），可以加快采集速度，但还是要利用全内反射荧光（TIRF）（仅限于对靠近盖玻片结构进行成像的特点），才能更好地减少成像链的背景信号。另一方面，基于DNA的探针提供了序列成像复用的明显优势，如Exchange PAINT中所述，已成功用于小鼠视网膜切片中多个结构的成像（图2）。Exchange PAINT的概念也被推广到dSTORM、STED、SIM和更传统的衍射限制的宽场和共聚焦荧光显微镜。最近，通过一种称为PRISM(probe-based imaging for sequential multiplexing)的基于DNA-PAINT的成像方法，实现了高达10个神经元蛋白质的分辨率约为20nm的多通道成像。该方法使用了低亲和力成像探针，该探针与突触、肌动蛋白和微管一抗上的对接链结合。图2 原代神经元中多个神经元靶点的多标Exchange-PAINT成像。（A）DNA-PAINT顺序成像的四种突触蛋白的超分辨图像：圆圈表示漂移校正的基准点；（B）为（A）中不带*的感兴趣区域的高放大倍率图和超分辨图像。（C）为（A）中带*的感兴趣区域的超分辨结果及单通道图像。2.2.4. 定量SMLM如果每个目标分子都可以单独标记和定位的话，与所有其他超分辨率成像技术相比，SMLM还可以提供有关分子分布和分子绝对数的单分子信息。然而，内源性蛋白质的定量免疫标记仍然是一个挑战，并且多标记抗体的不同定位数目也会使数据解释复杂化。另一方面，达到内源性表达水平比较困难，另外FPs蛋白成熟缓慢也同样会令定量化困难。然而，可以通过设计专门的对照实验估计拷贝数，并提取出有关生物目标结构分子的真实信息。借助合适的算法，SMLM可以提供有关拷贝数、聚类、共定位和复杂化学计量的数据，用于定量模型的生成和模拟。此外，还可以通过将突触结构信息与其功能关联来实现量化，例如膜片钳神经元的生物细胞素标记。例如，通过对链霉亲和素标记后膜片钳神经元进行STORM成像，结合CB1受体的免疫标记，然后在GABA能的海马轴突终端内定量，研究了内源性大麻素信号。本研究发现，与树突投射型中间神经元相比，胞周投射型中间神经元具有更高的CB1受体密度和更复杂的活动区。通过免疫标记和dSTORM研究了黑腹果蝇神经肌肉连接处内源性Bruchpilot（Brp）分子的数量。利用抗体滴定实验，确定了野生型神经肌肉连接处活性区细胞基质中Brp蛋白的数量为137个，其中四分之三以约15个七聚体簇状排列结合从相同组织样本记录的电生理数据，研究Brp如何组织控制活动区功能。利用DNA纳米结构作为校准，每个活性区Brp蛋白的数量估计通过定量DNA-PAINT（qPAINT）实验证实。此外，定量dSTORM实验表明，每个活性区Brp蛋白的数量和分布受突触标记蛋白-1的影响，这说明突触活性区递质释放的复杂性。在最近的一项研究中，使用Alexa Fluor 532和Alexa Fluor 647免疫标记的双色dSTORM已用于小鼠小脑平行纤维活性区中代谢型谷氨酸受体4（mGluR4）的定量研究（图3）。该研究还使用抗体滴定实验估计每个活性区平均包含约35个mGluR4分子，并排列在小纳米结构中。此外，mGluR4通常在munc-18-1和CaV2.1通道附近被发现，这支持了mGluR4与这些蛋白质相互作用以调节突触传递的观点。图3小鼠脑片中代谢型mGluR4受体定位定量双色dSTORM。上图：mGluR4和Bassoon免疫染色的小脑冠状切片的dSTORM图像，作为活性区参考。与宽场显微镜结果的比较。（A）DBSCAN聚类算法定义了近距离的En face活性区表面积（灰色）和mGluR4信号（品红）。（B）活性区大小的频率分布直方图（C）mGluR4信号到突触和突触外区域的映射。（D）通过Ripley H函数分析评估Bassoon和mGluR4的聚集分布。与随机分布的分子（蓝色、灰色）进行比较。虚线表示Ripley分析的最大值。这些研究显示了定量SMLM在神经科学研究中的潜力。可以预见，定量SMLM的进一步发展将为突触前和突触后蛋白质的功能关系，及其组织和结构的研究提供更有价值的信息。2.2.5. 组织三维（3D）SMLM虽然SMLM方法实现了仅几纳米的非常高的水平定位精度，但它需要特殊的方法来打破图像平面上方和下方PSF的对称性，来实现高轴向定位精度。实现高轴向定位精度的两种方法是PSF重塑和多焦面检测，通常用于在3D中精确定位荧光团。在SMLM中最常用的方法是通过在成像路径中插入单个柱面透镜从而不对称地扭曲PSF，利用光学像散原理来实现三维定位。基于像散方法的3D dSTORM技术还可以与光谱拆分相结合，对COS-7细胞中的网格蛋白表面小窝成像。像散引起的畸变程度由荧光团的轴向位置决定，因此可用于轴向位置计算。例如，3D散光SMLM已用于确定抑制性突触后密度区gephyrin蛋白和受体复合物的分布和拷贝数，或突触前活动区和突触后密度区各种成分的空间关系。采用双物镜像散成像方案，通过3D SMLM研究组织中肌动蛋白、血影蛋白和其他相关蛋白的结构，发现这些蛋白在轴突中形成190nm的周期性环状结构。替代方法包括使用相位掩模、变形镜实现双螺旋、四足或鞍点PSF重塑，和双焦面成像方法实现更大的轴向范围，并已成功应用于不同的应用中。为了在2D和3D中定位单个荧光发射区，已经开发了不同的算法和软件工具。在最近的一次综述中，列出了不同3D SMLM方法获得的水平和轴向分辨率，以供比较高30倍。此外，使用NHS染料对所有蛋白进行标记，然后进行迭代ExM，可以对高蛋白密度的结构或细胞器（如线粒体），实现与EM相比具有更高对比度的超微结构细节。为了在分子尺度上进行成像，ExM与SMLM方法（如dSTORM）相结合是一个理想的选择。然而在含有硫醇和盐的传统光转换缓冲液中，会发生荷电氢凝胶收缩。可通过使用低离子强度缓冲液或加入中性溶液使凝胶稳定以避免收缩。另一种策略是使用自发闪烁的荧光团（如HMSiR）在水中进行SMLM。通过Ex-dSTORM实现分子分辨率的关键是膨胀后标记，这增加了表位可及性，从而提高了标记效率并减少了标记错误。Ex-dSTORM超分辨成像已成功应用于原代细胞和神经元中微管和中心粒结构的解析。

p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 使用显微镜，是为了实现人力所不能及的事情。显微镜一直是生物学家从事研究工作、探寻生命奥秘必不可少的利器。为了看到更精细的生命体精细结构，研究人员对显微镜技术更高分辨率的追求从未停止。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 早在19世纪初，John Herschel和George Airy分别提出，点光源通过理想透镜成像时，由于衍射而在焦点处形成的光斑。这种中央明亮、周围有一组较弱的明暗相间同心环状条纹的光斑，在第一暗环以内的的中央亮斑称作艾里斑，在数学中通常用点扩散函数PSF来表示 sup [1,2] /sup 。如图所示，当两点之间的距离大于埃里斑时，才能被解析出来，可以被解析的最小距离即为分辨率。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 德国物理学家Ernst Abbe在此基础上提出了分辨率的解析方程Angular Resolusion，可以用来描述人眼、相机、物镜等一系列成像设备的解析能力。他将这个假说应用的物镜上第一次提出了物镜的数值孔径（NA）的概念，并在1873年提出了决定物镜分辨率的方程 sup [3] /sup 。1896年，Lord Rayleigh对这个方程做了z轴的测算 sup [4] /sup 。具体如下： /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 其中d代表分辨率，表示可以解析的两点之间最小距离；λ代表入射光波长；NA即为数值孔径，由光的最大入射夹角决定。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " & nbsp img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 314px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/f54bf352-44d0-429f-b2b1-df42d4702fbf.jpg" title=" 图片1.png" alt=" 图片1.png" width=" 450" height=" 314" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " 图1：（a）埃里斑示意图，中央明亮、周围有一组较弱的明暗相间同心环状条纹的光斑。（b）可以解析的两个相邻埃里斑。（c）无法解析的两个相邻埃里斑。（图片来源于网络） /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 因此，20世纪的显微镜生产商们主要通过提高物镜的数值孔径来提高物镜的分辨率。 span style=" text-indent: 2em " 但是，由于衍射的存在数值孔径的提高是有极限的，衍射极限限制了系统的分辨率。 /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 极限是用来打破的 /strong /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 几十年以来，研究者们采取了不同策略进一步了提高显微镜的分辨率。 有一些尽在衍射极限之外适度地提高了分辨率，比如共聚焦成像时采用更小的针孔大小、借助于反卷积或者神经网络算法 sup [5,6] /sup 、4Pi显微镜 sup [7] /sup 和结构光照明显微镜技术 sup [8] /sup 等等，这些技术不需要特殊制样，分辨率提升一般在2倍左右（100-150nm）。除此之外，还有另外两种被称为Nanoscopy的超高显微技术：一类是采用受激辐射或其他方法对发射光PSF进行擦除的确定性超高分辨率显微镜，如STED、GSD、RESOLFT和SSIM等 sup [9,10] /sup ；另一类是基于荧光分子随机定位的超分辨技术，使得相邻的荧光分子在不同时间发光，从而将它们分辨开来，如STORM、PALM、PAINT、dSTORM等等 sup [11,12] /sup 。这两类技术都可以将显微镜的成像分辨率推进到100nm以内，相较于荧光分子定位技术而言，第一类技术对生物制样要求相对容易，因此在常规生物实验室研究中应用更加广泛。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 常用商业化超高显微技术 /strong /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 随着技术的发展，硬件和软件都更趋于稳定，超高分辨显微技术也有了越来越多的商业化产品。由于成像技术和成像需求的多元化，根据成像需求和样品特点来选择合适的超高分辨率显微镜技术对用户来说相当重要。在此，我们针对几类常见超高分辨显微镜技术在生命科学领域中应用做简要介绍。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " strong （1）反卷积计算技术 /strong /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 这是一类最早走进生物学应用的超高分辨率技术，它主要基于图像计算。只要有光线传播就存在卷积现象，在光学成像过程中也是如此。一般来说显微镜成像中的信号模糊主要受卷积和噪音两方面因素影响。因此，采用适合的采样方式和去卷积算法可以很大程度上提高图像的分辨率和信噪比。这类技术对物镜的品质要求较高，需要物镜的PSF参数达到可以计算的标准才能有比较好的效果；另外，传统的去卷积技术也对成像的像素点密度有所要求，需要参考Nyquist定律来判断采样频率是否达到需求。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " & nbsp /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/f50ef5b2-747b-4812-a935-f525916de89f.jpg" title=" 图2.png" alt=" 图2.png" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " 图2.& nbsp （a）PSF在成像过程中的影响。（b）荧光显微镜图片去卷积前（右）和后（左） /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " （图像来源于网站） /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 目前市场上此类产品主要分为两类，一类是反卷积显微镜，另一类是单独的反卷积软件。一般来说，反卷积显微镜是基于宽场荧光显微镜设计的自动化成像系统，综合考虑了特定物镜的PSF、采样频率和相对应的反卷积算法，因此成像速度快、操作简单。而单独的去卷积软件需要用户了解该图像处理方法对样品、物镜和采样方式的要求，并匹配合适的分析方法。虽然操作有一定的门槛，但是这类软件针对的显微镜种类较多，从荧光显微镜到共聚焦乃至超高分辨率显微镜都有相应的算法，一般成像技术都可以通过去卷积算法进一步提高分辨率。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " strong （2）基于共聚焦的超高技术 /strong /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 针孔（Phinhole）是激光共聚焦显微镜成像中的必要组件，在共聚焦成像中通过针孔来去掉焦平面以外的杂散光，从而实现层扫的效果。而针孔的大小除了影响层扫的厚度之外还影响成像的分辨率。当针孔缩小时，层扫厚度变薄、xy和z轴分辨率提高（PSF减小）、可检测的信号减少。我们可以使用较小的针孔大小（0.5AU）和去卷积技术结合得到分辨率和信噪比较高的图像。 span style=" text-align: center text-indent: 0em " & nbsp /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 550px height: 473px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/6ba2022e-1146-4803-bb6b-fd8a05e3dd23.jpg" title=" 图片2.png" alt=" 图片2.png" width=" 550" height=" 473" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " 图3.& nbsp 共聚焦侧向分辨率与针孔大小的关系。在针孔小于1AU的情况下，针孔越小分辨率越高。（图片来源于网络） /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 由于上述方法在实际使用时会大大降低光效率，无法对较弱信号实现超高分辨率成像。近几年来，基于这种分辨率提高方式也有两类商业化产品推出，一是基于阵列检测器的Airyscan技术，它利用带有32 个同心排列的检测元件一次性采集1.25 AU的信号。单个检测元件可以检测0.2AU左右的信号，在针孔变小和点结构光运算的基础上，成像分辨率和灵敏度都得到了明显地提高。另一种是基于转盘共聚焦的超高成像技术，以yokogawa的为例，这种技术并通过光学变倍达到针孔信号扩束的效果并采用点结构光运算，提高分辨率。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/b38871c2-288c-4a52-9dfb-268d2f546adf.jpg" title=" 图片3.png" alt=" 图片3.png" / /p p br/ /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: center text-indent: 0em " 图4. （a）Airyscan检测器示意图[13]。（b）Sora转盘共聚焦示意图。 br/ （右图来源于网络） /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 这两种技术总体上来说分辨率相当，在120-150nm左右，去卷积处理后都可以进一步改善图像分辨率和信噪比；相较而言，Airyscan对弱信号更加灵敏，而基于Sora等技术的成像速度更快。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " strong （3）基于结构光照明的超高技术 /strong /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 1995年，早在SIM的概念提出之前，Guerra便通过光栅旋转的方式得到了更高分辨率的图像，随后的研究发现通过类似照明手段和傅立叶变换的方法可以收集到观察区域外的频域信号从而能够重构出更高分辨率的图像。这种光学成像技术近年来发展迅速，目前已经有更多的照明方式和相应算法出现，而这种成像方式也融合到多种成像技术中用以提高成像的效果，可以提高荧光显微镜、全内反射显微镜、光片显微镜等成像技术的分辨率。 span style=" text-align: center text-indent: 0em " & nbsp /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 550px height: 257px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/7109771f-658b-4344-8c6b-c0cd3f924fea.jpg" title=" 图片4.png" alt=" 图片4.png" width=" 550" height=" 257" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " 图5.& nbsp 光栅式结构光照明荧光显微镜技术重构示意图。（a）宽场荧光显微镜成像结果。（b）结构光照明成像结果，箭头部分指的是高频信息。（c）经过获取不同格栅位置的图像计算得出七个不同组分的高频信息。（d）将七组分拟合得到包含高频信息的高分辨率图像。（图像来源于网络） /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 目前商用的SIM技术主要集中在荧光显微镜和全内反射显微镜，分辨率为100-120nm之间，对样品折射率和样品厚度有一定的要求，广泛应用于活细胞成像中。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " strong （4）基于受激辐射损耗的超高技术 /strong /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 除了前面提到的缩小针孔之外，使用受激辐射的方法将埃里斑变小也可以进一步地提高分辨率，这种方法也被称为受激发射损耗（STimulated Emission Depletion，STED）显微镜。受激辐射，即处于激发态的发光原子在恰好是原子两能级能量差的外来辐射场的作用下，发出与外来光子的频率、位相、传播方向以及偏振状态全相同的光子的现象。由于这种现象造成原荧光发射波段信号被擦除的效果，甜甜圈形状的同心圆受激辐射光使得荧光光斑变小，从而进一步得提高了分辨率。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 550px height: 179px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/a73facd6-7365-4a21-850a-29e376cf2f9a.jpg" title=" 图片5.png" alt=" 图片5.png" width=" 550" height=" 179" border=" 0" vspace=" 0" / span style=" text-indent: 0em " & nbsp /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: center " 图6.& nbsp STED成像方式示意图。（a）STED成像中用于激发光的光斑。（b）STED成像中用于受激辐射的光斑。（c）实际成像过程中的光斑。（图像来源于网络） /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 十几年以来，这种成像技术发展迅速，cwSTED、gated STED、3d STED、MINFLUX等技术的出现，使得STED成像光漂白更小、3D成像效果更好也更加易用。相较于Airyscan和Sora技术，STED样品的优化对于成像效果影响明显。结合去卷积算法，一般生物组织样品的分辨率可以达到40-60nm。但是，STED样品经常需要对荧光探针和制样方法进行优化，尤其在进行多通道成像和Z-stack成像时。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 结语 /strong /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 结合平时的应用，针对生物组织样品成像中常见的几种商业化超高分辨率技术做了简要综述。超高分辨率技术发展迅速、种类繁多，每一种超高成像技术都有明显的优势和短板，因此针对不同的应用目的做出相应的选择对于用户而言非常重要[14]。希望此次分享，能够为其他用户提供参考。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " strong span style=" font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun " 参考文献： /span /strong /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun " [1] Herschel, J. F. W. (1828).& nbsp Treatises on physical astronomy, light and sound& nbsp contributed to the Encyclopaedia metropolitana. R. Griffin. /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun " [2] Airy, G. B. (1835). On the diffraction of an object-glass with circular aperture.& nbsp TCaPS,& nbsp 5, 283. /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun " [3]& nbsp Abbe, E. (1873). Beiträ ge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv fü r mikroskopische Anatomie, 9(1), 413-468. /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun " [4] Rayleigh, L. (1896). L. Theoretical considerations respecting the separation of gases by diffusion and similar processes. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science, 42(259), 493-498. /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun " [5] McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., & amp Conchello, J. A. (1999). Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods, 19(3), 373-385. /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun " [6] Wang, H., Rivenson, Y., Jin, Y., Wei, Z., Gao, R., Gü nayd?n, H., ... & amp Ozcan, A. (2019). Deep learning enables cross-modality super-resolution in fluorescence microscopy. Nature methods, 16(1), 103-110. /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun " [7]& nbsp Egner, A., Verrier, S., Goroshkov, A., Sö ling, H. D., & amp Hell, S. W. (2004). 4Pi-microscopy of the Golgi apparatus in live mammalian cells. Journal of structural biology, 147(1), 70-76. /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun " [8] Gustafsson, M. G. (2000). Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of microscopy, 198(2), 82-87. /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun " [9]& nbsp Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., & amp Hell, S. W. (2006). STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature, 440(7086), 935-939. /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun " [10]& nbsp Xue, Y., & amp So, P. T. (2018). Three-dimensional super-resolution high-throughput imaging by structured illumination STED microscopy. Optics express, 26(16), 20920-20928. /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun " [11] Rust, M. J., Bates, M., & amp Zhuang, X. (2006). Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).& nbsp Nature methods,& nbsp 3(10), 793-796. /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun " [12] Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., ... & amp Hess, H. F. (2006). Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.& nbsp Science,& nbsp 313(5793), 1642-1645. /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun " [13] Huff, J. (2015). The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.& nbsp Nature methods,& nbsp 12(12), i-ii. /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " span style=" font-size: 14px font-family: 宋体, SimSun " [14] Schermelleh, L., Ferrand, A., Huser, T., Eggeling, C., Sauer, M., Biehlmaier, O., & amp Drummen, G. P. (2019). Super-resolution microscopy demystified.& nbsp Nature cell biology,& nbsp 21(1), 72-84. /span /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 0em text-align: right " 作者：李晓明 上海科技大学生命科学分子影像平台 /p p br/ /p