实时定量

实时定量PCR的操作流程

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ， PCR）自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。随着分子生物学技术研究的不断进展，定量PCR技术取得了突飞猛进的发展，不仅建立了一系列的方法，而且也诞生了许多与这些方法相匹配的新型热循环仪和实验材料。实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术，所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。目前它作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，仅2000-2001年，收录在Medline上的以real-time PCR为关键词的文章就达一千多篇。实时PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增。本文将对实时定量PCR目前的应用状况、仪器应用、新材料进展以及实验条件的优化作一综述。实时定量PCR的应用现状实时定量PCR技术自1996年诞生以来，由于它显著的优越性，不仅广泛的应用于分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段应用于临床。其应用涉及到的范围包括DNA、mRNA和病毒荷载量的定量，核酸多态性分析，基因突变分析等多个领域。Giulietti 等人对用实时定量PCR测定细胞因子基因的表达作了详细的描述。细胞因子是一种调节蛋白，它对免疫反应、炎症反应具有重要的调节作用，其量的改变常常与一些疾病，如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的关系。由于所得到组织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平的检测，另外，通常用的蛋白质检测方法（如ELISA）的灵敏度也难以完成对极微量的蛋白产物的检测，所以应用PCR定量进行基因诊断就显得十分有意义。众所周知，cDNA微排列和差异表达PCR技术是对基因表达变化分析的两种关键技术，但是这两种技术只能对基因表达变化进行定性分析，而不能进行定量分析。Rajeevan等人利用实时定量PCR技术却成功地将基因表达的变化进行了量化，不仅有效地证明了上述两种方法的有效性，而且提供了一种具有高通量的对基因表达变化进行检测的新技术。实时定量PCR技术的出现不仅增强了有关对基因量变化的研究方法，而且也增强了对基因质所发生变化方面的研究。例如Laird和他的同事们建立了一种被称作Methylight的实时定量PCR方法，它能通过特异的引物和/或Taqman探针检测基因CpG岛的胞嘧啶是否发生了甲基化。由于实时PCR的敏感性和特异性，使得这种方法对胞嘧啶的过度甲基化常常具有极高的灵敏度。最近有研究表明这种方法可以从食管癌病人的食管粘膜中检出含有发生了过度甲基化基因的细胞。又如Sevall等人证明可以用实时定量PCR方法区分含有突变的等位基因。这是利用两种不同的荧光报告基团标记Taqman探针，该探针既可同野生型基因又可同突变型基因发生杂交，由于探针的杂交效率及随后的切割是由杂交决定的，所以如果出现一种信号强于另一种信号则表明两条基因具有同源性，若两种信号都增强则表明为异源性。目前实时定量PCR在临床诊断方面的应用主要体现在对感染组织或细胞负载病毒的定量测定上，这一技术对DNA和RNA病毒都可以检测，目前已有标准的操作手册供人们使用，但是必须明确，国际上既没有统一的病毒荷载的标准，也存在着对其标准曲线和定量准确性的各种争论。这里值得一提的是一种称为NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）的技术，它是一种利用电化学以光的等温PCR反应，在反应过程中能产生一种与靶RNA反极性的RNA扩增子，分子beacon常用于这种技术 ，这种方法常常用于对逆转录病毒的定量测定。常用的热循环仪对PCR产物进行实时定量的测定之所以能成为现实，并且应用如此广泛，其中一个重要的原因就是新的热循环仪的研制与推广。目前，国内外常用的热循环仪主要有以下几种：一、PE公司生产的Applied Biosystem系列1、 ABI Prism 7700 Sequence Detection System (SDS)是第一种作为商业用途的实时PCR测定仪，它由激光激发荧光，并且可在500-660nm范围内调节波长，可以用于基于水解探针、双链DNA结合染料、分子beacon原理的分析。一次可以测定96个样本，并且速度较快，一批样本的完成只耍要2小时。但是它不能实时对扩增结果进行分析，而只能在全部扩增结束后才进行数据分析。2、Gene Amp 5700 SDS: 它的基本工作原理和操作与ABI Prism 7700 SDS相同，但是它是利用卤素灯为激发光源，而且只设计了一个检测波长。3、ABI Prism 7900 SDS: 这是一种为实现高通量检测而设计的仪器，其基本构成与ABI Prism 7700 SDS相同，但程序设计完全实现自动化要求，而且有两种样品盘可供选择（96孔和384孔）。如果加上一个装载辅件，可以在24h之内完成84个384孔板的样本测定。二、Roche 公司生产的Lightcycler热循环仪，它以能装载20-25ul的毛细硅管作为反应管进行扩增，光源选用冷光源系统，可以减少光源对样本的影响。由二极管发射蓝光激发荧光，并提供三个滤光片，可利用荧光分光测定的原理，同时对一个反应体系的多种荧光进行检测，所以它完全可以进行多重PCR.由于Lightcycler使用了其独特毛细管反应体系和空气快速热循环系统，使样本能在非常短的时间内有效地实现温度变化，从而能在20-30min内快速完成30-40循环，达到样本扩增的目的。Lightcycler通常使用的实验材料主要是SYBRI Green I荧光染料和Taqman荧光探针和杂交探针。虽然Lightcycler有相当多的优点，但是这也有一些不足之处，由于它只提供一个32孔的样品盘，这使得不能在一次进行较多的样本测定。三、Bio-rad 公司生产的iCycler iQ：这种仪器提供连续的检测波长调节，程序满足实时数据处理，可以同时在一个反应体系中检测四种荧光信号，由于一批能完成96个样本的测定，所以能提供相对较快的扩增反应。四、Strategene公司的MX4000 Multiplex: 这种仪器的检测波长可在350-750nm范围内进行调节，以卤素灯作为激发光源，常选用的实验材料包括Taqman探针、杂交探针和分子信标（molecular beacon），其样品盘的规格有多处可供选择，包括96孔盘、8联管或单管，其程序也提供实时数据分析。五、Cepheid公司的Smart Cycler System: 这种仪器正如其名一样具有强大的功能，它有16种反应模式可供选择，而且每种模式都有各自的程序，任一模式不仅能同时检测四种荧光信号，而且不同的使用者可对同一批样品同时运行不同的模式进行检测。Smart Cycler System的这种设计虽然有其优点，但是其缺点也是显而易见的，由于其将样品盘分得过细，所以不利于同时进行较多样品的分析。六、Corbert Research 公司的Rotor-Gene: 这种仪器与Lightcycler相比，属于中心型热循环仪，即从反应体系内部进行热变化；其具有双光源系统，蓝光在470nm处激发荧光，绿光在530nm波长激发荧光；具有两种样品盘（32孔和72孔）供选择；可以对多种荧光材料进行测定

实时荧光定量PCR哪家好

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本人即将开展大豆转基因方面的检测，研究工作，现已购置ABI公司的实时荧光定量PCR，但是对后期的试剂耗材比较头痛，原厂试剂是不错，但是价格昂贵，不适合大量，长期使用，请问各位，国产那个公司的试剂可以替代，以保证实验长期进行。

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METHODS 25, 402–408 (2001)Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2－△△CT MethodKenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen¶,1*Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ¶ Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534原文下载摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量 实时PCR Taqman反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中有介绍。用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道（5,6）。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外，本文还介绍了2－△△CT两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中都可能被用到。1. 2－△△CT方法1.1. 2－△△CT方法的推导PCR 指数扩增的公式是：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054042.jpg这里，Xn 是第 n 个循环後目标分子数，X0 是初始目标分子数，Ex 是目标分子扩增效率，n 是循环数，C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。因此：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054008.jpgX T 是目标分子达到设定的阈值时的分子数。C T,X 是目标分子扩增达到阈值时的循环数。Kx 是一个常数。对于内参反应而言，也有同样的公式：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054009.jpg用XT 除以RT 得到：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054010.jpg对于使用 Taqman 探针的实时扩增而言， XT 和 RT 的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数K 并不一定等于1 。假设目标序列与内参序列扩增效率相同：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054011.jpg http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054018.jpg或：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054019.jpgXN 代表经过均一化处理过的初始目标分子量；△CT表示目标基因和内标基因CT值的差异（CT,X－CT,R ）整理上式得：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054020.jpg最后用任一样本q 的XN 除以参照因子（calibrator, cb）的XN得到：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054021.jpg在这里http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054023.jpg对于一个少于150bp 的扩增片断而言，如果 Mg2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是http://tong.dxy.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054022.jpg

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彭年才12 张镇西1 兰邹然3 黄兵3 李红东2 李明2 苗保刚2 1西安交通大学生物医学分析技术与仪器研究所 2西安天隆科技有限公司 3山东省动物疾病预防与控制中心2009年4月30日摘要：病原检测方法及仪器是人感染猪流感防控的关键环节，针对实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]分子诊断核酸检测技术的先进性以及国产试剂和仪器的成熟性，本文分析了该技术在以往禽流感检测被采用的国家标准以及使用的广泛性，最后介绍了最新发布的美国CDC《针对人感染猪流感病毒治疗和预防的临时指南》和我国卫生部《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》，两部法规都将实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]确定为人感染猪流感实验室检测的确诊方法。从以上情况可以获知：实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在人感染猪流感诊断中具有先进、快速、成熟、合法的特点，是一种法定的主流技术，将来实施中，国产化仪器和试剂都有保障。关键词：人感染猪流感 猪流感诊断 快速检测 实时定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] Real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]全球性的人感染猪流感公共卫生事件发展势头迅猛，发生国家众多，世界卫生组织29日晚已将全球流感大流行警告级别从4级提高到5级，我国也于28日召开了国务院常务会议对防控进行了部署。现在已进入关键的防控措施落实阶段，其中检测与诊断技术至关重要。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在以往禽流感诊断中的应用众所周知，虽虽然本次人感染猪流感事件的病毒基因序列还在进一步确立当中，但本次疫情病原学基础明确，属于RNA病毒感染性疾病。回顾近年来感染RNA病毒的烈性传染病，如SARS、禽流感，世界卫生组织及我国卫生行政和技术部门相继制定了较为成熟的实验室检测和诊断标准，其中我国颁布的应用实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法进行实验室检测和快速诊断的标准如《GB/T 19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT—[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测方法》、《GB/T 19438.2—2004 H5亚型禽流感病毒荧光RT—[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测方法》、《GB/T 19438.3—2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT—[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测方法》等，同时我们也注意到近年来国家针对食品安全尤其是乳品检测和食物致病菌检测的实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测标准，如《SN/T 1632.3-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法：荧光[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法》和《SN/T 1870-2007 食品中致病菌检测方法：实时[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法》。以上实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在禽流感及其它方面检测的国家标准是该技术在当前的人感染猪流感诊断中应用的基础和前提。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术及在我国卫生应急中的应用要求 实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]，如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]即Real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]）是实时[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法，它是指对DNA或经过反转入（RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]）的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。Real Time [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。目前被普遍使用的多种常规[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法如各种凝胶电泳[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法，终点荧光定量法或[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-ELISA法叫做终点[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法最大的优点是克服了终点[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。普通[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术发明于1983年，而实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术发明于上世纪九十年代并于1996年生产出了世界上第一台实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪，实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术得以实现的技术要素主要有荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]试剂盒和实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪，我国荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]试剂盒研发实力强大，生产厂家较多，临床诊断的品种如HBV/HCV及禽流感诊断试剂盒性能优良、供应充足，基本实现国产化。在猪流感病毒RNA核酸序列明确的情况下，利用现有的试剂研发平台，人感染猪流感实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]诊断试剂盒很快就会面世。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪由于技术含量高，只有少数几家中国企业有能力生产如西安天隆科技有限公司生产的TL-988系列仪器不但取得了发明专利、国家科学技术奖、国家重点新产品证书、医疗器械注册证，而且被国家发改委确立为国家高技术产业化示范工程2008年生物医学工程专项，产品性能达到国际先进水平，在乳品检测行业市场占有率比进口仪器还高[1-3]。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪应用广泛，1999年开始，西方发达国家尝试将[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]应用于临床传染病诊断、食品安全检测以及血液筛查，目前已相当普及。2008年12月13日中国卫生部下发《卫生应急队伍装备参考目录》（卫办应急发[2008]207号），其中要求县级以上卫生应急队伍建设中必须配备[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪和实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪作为传染病控制类装备。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在猪流感诊断中的作用已有法规确立在人感染猪流感病毒出现以前，针对猪与猪传染的传统猪流感疫情，近年来我国科技人员经过不懈努力，探索快速检测与诊断方法，发表了一系列应用实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测的研究论文[4-5]。人感染猪流感疫情发生后，美国疾病预防控制中心（CDC）于2009年4月28日发布了针对人感染猪流感病毒治疗和预防临时指南，西安天隆科技有限公司在第一时间将其翻译成中文版本[6]。其中规定了确诊病例的诊断方法：具有急性发烧呼吸道疾病的临床症状并且经实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] (real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url])或病毒分离培养 (viral culture)实验室检测方法检验证实感染A（H1N1）型猪流感病毒。卫生部办公厅于4月30日印发了《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》的通知》[7]，其中在实验室检测和病例诊断报告章节，内容如下：检测程序呼吸道标本应首先应用real time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法检测A型流感病毒的M基因、Swine（ H1N1）的HA基因和NP基因，以及质控对照RNP基因。同时，接种MDCK细胞或SPF鸡胚进行病毒分离，并测定病毒的全基因组序列。 推荐检测方法用Real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法检测猪流行性感冒（ H1N1病毒）病毒。 其他检测方法 快速流感抗原检测 病毒培养免疫荧光法（或装配的IFA ） 显然，上述卫生部法规中，与“其他检测方法”不同，实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法被法定为人感染猪流感诊断的推荐检测方法。参考文献：1. Nian-cai Peng（彭年才）, Chun-lin Wang ,Li-li Zhang ,Miao-lin Lu ,Zhen-xi Zhang: Asymmetric [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] method in generation of HBV ssDNA for pyrosequencing, Academic Journal of Xi’an Jiaotong University,VOL.21 No.1,Feb 2009，54-562. 彭年才，张镇西，李明：乳制品中阪崎肠杆菌的快速检测，食品安全导刊，08.7：96-1003. 彭年才，苏明权，张镇西：乳品检测中实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪的研制，中国乳品工业，200705：62-644. 段廷云，陈红英，崔保安等：实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测H1N1亚型猪流感病毒，畜牧兽医学报，2008。39（6）：752-7565. 张春明，乔传玲，陈艳等，猪流感病毒M基因实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]诊断方法的建立，中国预防兽医学报，2008。20（10）：805-8096. 美国CDC针对人感染猪流感病毒治疗和预防的临时指南（中英文全文）http://www.medtl.com/ckxw.asp?id=757.中国卫生部：人感染猪流感预防控制技术指南（试行）http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsyjbgs/s3577/200904/40319.htm

单位想采购一套实时荧光定量PCR、全自动核酸提取系统，与没有朋友推荐几个品牌，要进口的，市场占有率高，售后服务好的

实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]在人感染猪流感诊断中的作用彭年才12 张镇西1 兰邹然3 黄兵3 李红东2 李明2 苗保刚2 1西安交通大学生物医学分析技术与仪器研究所 2西安天隆科技有限公司 3山东省动物疾病预防与控制中心2009年4月30日摘要：病原检测方法及仪器是人感染猪流感防控的关键环节，针对实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]分子诊断核酸检测技术的先进性以及国产试剂和仪器的成熟性，本文分析了该技术在以往禽流感检测被采用的国家标准以及使用的广泛性，最后介绍了最新发布的美国CDC《针对人感染猪流感病毒治疗和预防的临时指南》和我国卫生部《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》，两部法规都将实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]确定为人感染猪流感实验室检测的确诊方法。从以上情况可以获知：实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在人感染猪流感诊断中具有先进、快速、成熟、合法的特点，是一种法定的主流技术，将来实施中，国产化仪器和试剂都有保障。关键词：人感染猪流感 猪流感诊断 快速检测 实时定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] Real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]全球性的人感染猪流感公共卫生事件发展势头迅猛，发生国家众多，世界卫生组织29日晚已将全球流感大流行警告级别从4级提高到5级，我国也于28日召开了国务院常务会议对防控进行了部署。现在已进入关键的防控措施落实阶段，其中检测与诊断技术至关重要。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在以往禽流感诊断中的应用众所周知，虽虽然本次人感染猪流感事件的病毒基因序列还在进一步确立当中，但本次疫情病原学基础明确，属于RNA病毒感染性疾病。回顾近年来感染RNA病毒的烈性传染病，如SARS、禽流感，世界卫生组织及我国卫生行政和技术部门相继制定了较为成熟的实验室检测和诊断标准，其中我国颁布的应用实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法进行实验室检测和快速诊断的标准如《GB/T 19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT—[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测方法》、《GB/T 19438.2—2004 H5亚型禽流感病毒荧光RT—[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测方法》、《GB/T 19438.3—2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT—[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测方法》等，同时我们也注意到近年来国家针对食品安全尤其是乳品检测和食物致病菌检测的实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测标准，如《SN/T 1632.3-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法：荧光[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法》和《SN/T 1870-2007 食品中致病菌检测方法：实时[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法》。以上实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在禽流感及其它方面检测的国家标准是该技术在当前的人感染猪流感诊断中应用的基础和前提。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术及在我国卫生应急中的应用要求 实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]，如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]即Real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]）是实时[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法，它是指对DNA或经过反转入（RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]）的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。Real Time [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。目前被普遍使用的多种常规[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法如各种凝胶电泳[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法，终点荧光定量法或[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-ELISA法叫做终点[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法最大的优点是克服了终点[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。普通[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术发明于1983年，而实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术发明于上世纪九十年代并于1996年生产出了世界上第一台实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪，实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术得以实现的技术要素主要有荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]试剂盒和实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪，我国荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]试剂盒研发实力强大，生产厂家较多，临床诊断的品种如HBV/HCV及禽流感诊断试剂盒性能优良、供应充足，基本实现国产化。在猪流感病毒RNA核酸序列明确的情况下，利用现有的试剂研发平台，人感染猪流感实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]诊断试剂盒很快就会面世。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪由于技术含量高，只有少数几家中国企业有能力生产如西安天隆科技有限公司生产的TL-988系列仪器不但取得了发明专利、国家科学技术奖、国家重点新产品证书、医疗器械注册证，而且被国家发改委确立为国家高技术产业化示范工程2008年生物医学工程专项，产品性能达到国际先进水平，在乳品检测行业市场占有率比进口仪器还高[1-3]。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪应用广泛，1999年开始，西方发达国家尝试将[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]应用于临床传染病诊断、食品安全检测以及血液筛查，目前已相当普及。2008年12月13日中国卫生部下发《卫生应急队伍装备参考目录》（卫办应急发[2008]207号），其中要求县级以上卫生应急队伍建设中必须配备[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪和实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪作为传染病控制类装备。实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术在猪流感诊断中的作用已有法规确立在人感染猪流感病毒出现以前，针对猪与猪传染的传统猪流感疫情，近年来我国科技人员经过不懈努力，探索快速检测与诊断方法，发表了一系列应用实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测的研究论文[4-5]。人感染猪流感疫情发生后，美国疾病预防控制中心（CDC）于2009年4月28日发布了针对人感染猪流感病毒治疗和预防临时指南，西安天隆科技有限公司在第一时间将其翻译成中文版本[6]。其中规定了确诊病例的诊断方法：具有急性发烧呼吸道疾病的临床症状并且经实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] (real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url])或病毒分离培养 (viral culture)实验室检测方法检验证实感染A（H1N1）型猪流感病毒。卫生部办公厅于4月30日印发了《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》的通知》[7]，其中在实验室检测和病例诊断报告章节，内容如下：检测程序呼吸道标本应首先应用real time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法检测A型流感病毒的M基因、Swine（ H1N1）的HA基因和NP基因，以及质控对照RNP基因。同时，接种MDCK细胞或SPF鸡胚进行病毒分离，并测定病毒的全基因组序列。 推荐检测方法用Real-time RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法检测猪流行性感冒（ H1N1病毒）病毒。 其他检测方法 快速流感抗原检测 病毒培养免疫荧光法（或装配的IFA ） 显然，上述卫生部法规中，与“其他检测方法”不同，实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法被法定为人感染猪流感诊断的推荐检测方法。参考文献：1. Nian-cai Peng（彭年才）, Chun-lin Wang ,Li-li Zhang ,Miao-lin Lu ,Zhen-xi Zhang: Asymmetric [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] method in generation of HBV ssDNA for pyrosequencing, Academic Journal of Xi’an Jiaotong University,VOL.21 No.1,Feb 2009，54-562. 彭年才，张镇西，李明：乳制品中阪崎肠杆菌的快速检测，食品安全导刊，08.7：96-1003. 彭年才，苏明权，张镇西：乳品检测中实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪的研制，中国乳品工业，200705：62-644. 段廷云，陈红英，崔保安等：实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]检测H1N1亚型猪流感病毒，畜牧兽医学报，2008。39（6）：752-7565. 张春明，乔传玲，陈艳等，猪流感病毒M基因实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]诊断方法的建立，中国预防兽医学报，2008。20（10）：805-8096. 美国CDC针对人感染猪流感病毒治疗和预防的临时指南（中英文全文）http://www.medtl.com/ckxw.asp?id=757.中国卫生部：人感染猪流感预防控制技术指南（试行）http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsyjbgs/s3577/200904/40319.htm

实时定量PCR区分酿酒酵母和鉴定野生酵母的最优技术注：全文见附件。有用到的鼓掌不要都做伸手党

1． 实时PCR原理 对扩增产物进行可重复性的定量长期以来一直是科学家和研究者的目标。传统的方法需要对终产物进行凝胶电泳分析。这种方法可以确定目的产物和竞争产物的大小，估算纯度，计算条带强度。然而，所用扩增试剂和体系的变动会造成扩增的终产物的重复性有较大的变动，成为这种方法的主要弊端.扩增过程的指数期提供给我们最有用的，可重复的数据。在起始的目的DNA量与循环过程的指数期的扩增产物量之间存在着定量关系。这正是实时扩增的基础。随着DNA内嵌染料和探针特异性化学的发展，实时探测量子学的跳跃发展推动了对扩增过程的研究进展。今天的实时设备由荧光读数计和热循环仪组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。 原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。在扩增的每个循环中至少收集一次荧光数据来进行扩增的实时*。用户能够根据一个一个的循环知道那个样品正在扩增。这些即时的数据答应用户看清楚各个样本相对于标准品，阳性对照和阴性对照是如何扩增的。用户不仅能在扩增过程中监督整个反应，还可以根据反馈的信息来优化相应程序。因此增加了敏感性，特异性和有效性。正常化后的数据画成荧光值相对于循环数的对数图。 原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。假如同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。2． 探测化学物质有5种主要类型的探测化学物质用于实时扩增，包括：2.1内嵌染料（Sybr-Green I ） 内嵌染料，例如Sybr-Green I ，能与双链DNA结合 a)SG不与单链DNA结合，荧光信号强度较低 b)SG与双链DNA结合，荧光信号强度极大的增强 SG是一种荧光染料，能结合到DNA双螺旋的小沟。处于溶解状态的未结合染料显示低 的荧光强度，一旦结合到双链DNA之后荧光信号增强。这种特性被利用在实时扩增中。由于 在扩增反应中DNA增加，染料结合到扩增产物上，荧光信号增强。荧光信号相对背景水平的 增加进行分析。根据扩增子的长度有多个荧光染料的分子结合到双链DNA上。内嵌染料可以 所有其他传统扩增成分，例如水，缓冲液，MgCl2，dNTPs,Taq-聚合酶，引物和模板一起加到扩增反应管中。因为不需要设计序列特异性探针和新的引物对，这种方法是一种简便 ，性价比较高的实时监测方法。 内嵌染料没有序列特异性，可以结合到包括非特异产物和引物二聚体在内的任何dsDNA上，因此有必要区分目标信号和假信号。内嵌染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解，称为溶解曲线分析。在溶解曲线分析过程中，随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点，实时仪器连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链，可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。溶解峰反映了反应中扩增到的产物。这些峰是凝胶电泳中条带的类似物。因此，用溶解曲线数据对SG反应后的产物进行质量监督。2．2 双标记探针 双标记探针是一种短的寡核苷酸序列，5‘末端连接有荧光报告染料，3‘端连接有荧光淬灭分子。由于这种探针只有15-25bp长，报告基团和淬灭基团紧密接近，几乎探测不到荧光信号。在循环过程中，Taq DNA聚合酶对每个引物进行延伸。DNA聚合酶具有外切核酸酶活性，因此在延伸过程中会切除下游的探针。一旦探针被降解，报告染料就会与淬灭分子相分离。 a) 报告染料R发射的能量被淬灭分子Q所吸收和淬灭。 b) 聚合酶的外切核酸酶活性通过水解方式将报告染料与淬灭分子相分离导致了荧光信号的增加。 在每个扩增循环由于切开了探针因此实时设备探测到报告染料的增加。由于报告染料被切开，因此不能进行溶解曲线分析。双标记探针比内嵌染料有更高的特异性，这里有2个原因 。首先，双标记探针具有序列特异性，只结合到互补区。第二个原因是双标记探针对每扩增的一个拷贝只释放一个分子的荧光染料。由于双标记探针增加了特异性，这种探测方法很适合检测低拷贝数的模板。2．3．FRET 探针 FRET 探针依靠荧光能量从一个荧光染料到另一个的传递。两个独立的特异寡核苷酸序列都标记上荧光基团。上游探针在3‘末端有一个供体基团，下游探针在5‘末有一受体基团。设计探针时他们在与目标序列结合时互相临近，使供体和受体荧光基团紧密接近。一旦探针杂交到模板上，从供体到受体荧光基团的能量传递产生了一个不同波长的荧光信号。供体荧光信号的减弱和受体荧光信号的加强都能分别监测到。因此，只有当两个探针都结合上去才能检测到荧光信号。FRET 探针可以进行溶解曲线分析，对基因型分析，SNP检测和其他突变检测非常有用。 a) 扩增循环中，两个探针与靶DNA退火 b) 供体被外部光源激发通过能量传递导致发射荧光的产生。

谁能告诉我梯度PCR、温度梯度PCR、实时荧光定量PCR的区别？他们是什么样的概念？主要用途是什么？目前那些厂家做的比较好？谢谢！[em17]

实时定量PCR应用中的问题及优化方案荧光材料新进展为了满足实时PCR更高敏感性要求，各试剂公司都致力于开发新型的化学发光材料，目前作为商业用途的这些化学物质都能适用于上述的各种仪器。它们主要有以下几种：1. 水解探针或Taqman探针：这种探针用于Taqman分析法，它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’à3’活性所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。常同探针5’端相结合的基团有FAM（6－羧基荧光素）,TET（四氯－6－羧基荧光素）,JOE（2，7－二甲基－4，5－二氯－6－羧基荧光素），HEX（六氯－6－甲基荧光素）或VIC，常与3’端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA (6- 羧基四甲基若丹明)或DABCYL（4-（4’-恶烷氨基苯偶氮）苯甲酸）。相较之于TAMRA，使用DABCYL可以更有效的减少自发荧光信号。目前，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有高特异性与高敏感性。2. 分子信标: 是一种单链DNA形成的发夹结构，在其一端有一报告基团，在另一端有一淬灭基团，当它形成发夹结构时，由于荧光报告基团与淬灭基团想互靠近，两者之间发生荧光信号能量共振转移（fluorescent resonance energy transfer FRET），当热循环温度达到分子beacon的解链温度时，其构象发生改变，能与模板结合而完全伸展成线性分子，使得FRET消失，报告基团发出荧光信号。分子信标特别适用于检测点突变，这能区分只有一个核苷酸差异的不同DNA序列，而且其敏感性要远比同等长度的寡核苷酸探针高，分子beacon已被用于突变检测、病原体定量、病毒检测和胚胎的性别判断，它同时出用于多重PCR检测逆转录病毒。3. scorpions: 它由两个寡核苷酸分子组成，一个是引物，另一个是带荧光分子的探针，但是此探针也具有引物的功能。引物与形成发夹结构的探针相连，在探针上由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近，不能发射荧光。在反应的变性阶段，探针的发夹结构会解开，构象发生改变，在退火时则与模板相结合，形成线性分子，报告基团同淬灭基团分离而发射荧光。同Taqman探针和分子beacon相比，scorpion能更快地发射出荧光且信号更为强烈，其特异性也很高，因为只有在反应体系中存在特异的目的基因，探针-引物才会与之相结合。Scorpion是一种较新的荧光材料，具有良好的应用前景。4. 杂交探针：该材料使用四个寡聚核苷酸分子，两个引物与两个探针，杂交探针分别单标，一个携带荧光供体基团，一个携带荧光受体基团，当这两个探针杂交到目的基因上时，能形成首尾相连的结构使两个荧光基团相互靠近，发生FRET。受体基团能转移能量，使得供体基团在不同波长条件下被激发，发射出的荧光量直接与目的基因的产量成相关关系。这一方法已被Roche公司生产的Lightcycler所应用，进行病原体检测、病毒荷载量的测定等领域。5. SYBR Green I: 这是一种DNA结合染料，能非特异地掺入到双链DNA中去。在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA中以后，便可以发出荧光。它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中，从经济角度考虑，它也比其它的探针的价格要便宜得多，但由于它能与所有的双链DNA结合，所以一旦反应体系中出现非特异扩增，那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性。要避免这种不利因素，一方面可以通过Lightcycler和Rotor gene、Smart gene等热循环仪内设定的程序过对扩增曲线进行分析，以区分由PCR产物和本底造成的荧光信号，另一方面就是选择良好的引物和探针并优化反应条件以消除非特异性影响。

[font=宋体][font=宋体]实时荧光定量聚合酶链式反应（[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]）指的是在[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]进行的同时，对其过程进行监测的能力（即实时）。因此，数据可在[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增过程中，而非[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]结束之后，进行收集。这为基于[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] (q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url])[/font][font=宋体]中，反应以循环中检测到目标扩增的时间点为特征，而非在一定循环数后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高，则会越快观察到荧光的显著增加。相反，终点法检测（也称 “读板检测”）测量的是[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]循环结束时累计的[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]产物量。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]一、实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]使用方法[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、样品准备：首先将样品进行细胞分离，提取细胞总[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]，然后将细胞总[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]转换为[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]，最后将[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]作为[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应的模板。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应：将样品[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]混合物，[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]引物，[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]缓冲液，[/font][font=Calibri]Taq DNA[/font][font=宋体]聚合酶等混合在一起，在[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应管中加入荧光探针，然后将反应管放入[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]仪中，按照[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应的温度曲线进行反应，最后将反应管放入荧光检测仪中进行检测。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、检测：在荧光检测仪中，按照设定的参数，实时监测[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应管中的荧光信号，根据荧光信号的变化，可以实时监测[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应的进展情况，并对样品进行定量分析。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]二、实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]使用注意事项[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、样品提取：根据实验目的，确定样品提取的方法，如细胞分离，细胞总[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]提取，[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]合成等，以确保最终检测的准确性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应：在[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应中，应注意控制反应温度，反应时间，反应次数，配制反应体系时，应注意控制反应体系的稳定性，以确保反应的准确性和可靠性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、荧光检测：在荧光检测中，应注意控制荧光探针的添加量，以确保检测的准确性，并且应注意控制检测仪器的稳定性，以确保检测的准确性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、数据分析：在数据分析中，应注意控制参考样品的添加量，以确保数据的准确性，并且应注意检测的结果是否符合实际情况，以确保数据的可靠性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]技术是一种非常有效的检测技术，它可以用于检测和定量分析样品中特定基因的表达水平，但在使用过程中，还需要注意以上几点，以确保实验的准确性和可靠性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、实验重复性和可重复性：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]为了确保实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]结果的准确性和可靠性，需要进行多次重复实验。重复实验可以检测实验的随机误差和系统误差。同时，实验设计应考虑可重复性，以确保不同实验条件下的结果具有可比性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6、[/font][font=宋体]质量控制：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在进行实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]时，需要建立严格的质量控制体系。质量控制包括对试剂、仪器、实验操作过程以及数据分析过程的质控。通过质量控制可以及时发现并纠正实验中存在的问题，确保实验结果的准确性和可靠性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]总之，实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]是一种灵敏且可靠的分子生物学技术，在生物医药领域具有广泛的应用价值。为了确保实验结果的准确性和可靠性，需要在实验设计、样品处理、反应条件、数据分析、实验重复性和可重复性以及质量控制等方面进行充分考虑和优化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/real-time-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-service][b]实时荧光定量[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/real-time-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-service][b][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/real-time-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-service][b]技术服务[/b][/url]，更多详情关注[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/real-time-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-service[/font][/font]

国家质量监督检验检疫总局24日公布近期对全国液体乳产品抽检结果，蒙牛乳业(眉山)有限公司生产的一批次产品被检出黄曲霉毒素M1超标140%，黄曲霉毒素M1为已知致癌物，具很强致癌性。昨日，资深乳业专家王丁棉表示，牛奶中含有黄曲霉毒素，主要是因为奶牛食用了含这种物质的饲料所致。据介绍，即使是牛奶加工中用高温的巴氏杀菌法也无法清除黄曲霉毒素。食品卫生安全是保障人类和公共卫生的重要课题。随着在乳制品中出现三聚氰胺造成社会关注的食品安全事件以来，加强对食品安全的监控已成为政府和社会关注的重大问题。对于食品特别是乳制品中的致病微生物的检测技术的应用具有现实的重要意义。国内外已将实时荧光定量PCR检测技术强制应用于相关行业并相继制定了国际、国家、及行业标准作为法律依据。　　SN/T 1632.3-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法 荧光PCR方法，ISO22174-2005 食物病原体PCR检测方法，以上方法均为当前黄曲霉毒素M1的检测提供了检测参考依据。

各位大虾：我正在实施ABC等化合物分析方法的完善/验证，目前正在实施定量限的确认，分2种，1是纯标准，已完成确认，2是含有样品基质条件下的确认，实施中问题：正在评估含有样品基质状态下时，发现所要测定的A化合物在此样品中也有，含量大概在4mg/kg，由此，想请教下在这种情况下，想确认基质的影响并得到实测的定量下限，该如何确认，另外，在实施添加回收时，其添加量又如何实施？我用的是LCMSMS

[font=宋体][font=宋体]实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]Quantitative Real-time [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]）简称[/font][font=Calibri]q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]，是一种在[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]扩增体系中加入荧光基团，通过聚合酶链式反应（[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]）循环实现荧光信号的积累，从而实现检测每次[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]循环后产物总量的一种方法，是核酸检测和定量分析的“金标准”。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]技术原理[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]根据所使用的荧光标记方法可分为两种：荧光染料（[/font][font=Calibri]SYBR Green I[/font][font=宋体]染料为主）和荧光探针（[/font][font=Calibri]TaqMan[/font][font=宋体]探针）。[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①[/font][font=Calibri]SYBR Green I[/font][font=宋体]染料法[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]SYBR Green I[/font][font=宋体]染料是一种结合于所有双链[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。这种染料在反应体系中处于游离状态时，发出的荧光极其微弱，但当其与[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]双链结合的时候，荧光信号就会被放大，从而被仪器所检测。在[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]实验中，染料的结合量与[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的浓度呈现正比关系，所以我们可以通过检测荧光信号的强度来反映[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]体系中[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的浓度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]优点：可用于检测任何双链[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]序列的扩增，无需单独设计探针，操作简单，成本较低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②[/font][font=Calibri]TaqMan[/font][font=宋体]探针法[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]TaqMan[/font][font=宋体]荧光探针是进行荧光检测的另一种方法。[/font][font=Calibri]TaqMan[/font][font=宋体]荧光探针是由[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]’端的荧光报告基团、[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]‘端的荧光淬灭基团和靶基因特异性结合的序列构成。当探针在反应体系中处于游离状态时，荧光报告基团的信号会被荧光淬灭基团所吸收。但当[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]进行到退火、延伸阶段时，[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]聚合酶会将荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而发出荧光，因此探针法也可以通过检测荧光信号强度来反应[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]体系中[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的浓度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]优点：荧光探针只与目的序列结合，具有良好的特异性，无需实验优化；不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针，兼容多重反应。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]常见术语：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]CT[/font][font=宋体]值：[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]代表[/font][font=Calibri]Cycle[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]代表[/font][font=Calibri]Threshold[/font][font=宋体]，即指[/font][font=Calibri]q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]在扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]惰性参比染料（[/font][font=Calibri]ROX[/font][font=宋体]）：用作荧光信号标准化内部参照，可以逐孔校正因移液不准确、孔位置及荧光波动造成的变动。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]扩增曲线：[/font][font=Calibri]Amplification curve [/font][font=宋体]，随着[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应的进行，荧光信号强度随着扩增产物的增加逐渐增强，通过荧光强度来检测扩增产物的变化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]扩增效率：一个[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]分子扩增为[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]个[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]分子，这种情况下的扩增效率为[/font][font=Calibri]100%[/font][font=宋体]。实际上会出现偏高和偏低的情况，[/font][font=Calibri]90-110%[/font][font=宋体]之间。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]溶解曲线：[/font][font=Calibri]Melting curve[/font][font=宋体]，是指扩增反应结束后，对双链[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]进行升温处理，此时，[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]双链逐渐解开，染料脱落，荧光值下降，荧光值随温度变化的曲线即“溶解曲线”，可用来判断体系中是否含有引物二聚体和非特异性扩增。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]NTC[/font][font=宋体]：无模板对照（[/font][font=Calibri]No template control[/font][font=宋体]），是指扩增反应中，模板通常用水来代替，用于检测试剂污染或外源[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]造成的污染。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/real-time-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-service][b]实时定量[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/real-time-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-service][b][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/real-time-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-service][b]分析服务[/b][/url]，服务内容和服务案例详情可以参看：[/font][font=Calibri]http[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]s[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]://cn.sinobiological.com/services/real-time-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-service[/font][/font][font=Calibri] [/font]

问题描述：实时荧光定量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]和LAMP方法的主要区别？解答：[align=left][b][font='Times New Roman','serif'][color=black] [/color][/font][/b][/align] [table][tr][td] [align=center][b][font=宋体][color=black]比对项目[/color][/font][/b][/align] [/td][td] [align=center][b][font=宋体][color=black]实时荧光定量[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/color][/font][font=宋体][color=black]技术[/color][/font][/b][/align] [/td][td] [align=center][b][font=宋体][color=black]环介导等温扩增技术[/color][/font][/b][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][font=宋体][color=black]检测技术[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font=宋体][color=black]化学荧光，实时监测目标[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]DNA[/color][/font][font=宋体][color=black]片段[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font=宋体][color=black]等温扩增[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]+[/color][/font][font=宋体][color=black]生物荧光，检测的扩增产物中的副产物焦磷酸盐[/color][/font][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][font=宋体][color=black]酶[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font='Times New Roman','serif'][color=black]Tag[/color][/font][font=宋体][color=black]聚合酶，目前已经第四代[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]DNA[/color][/font][font=宋体][color=black]聚合酶，技术成熟[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font='Times New Roman','serif'][color=black]Bst[/color][/font][font=宋体][color=black]酶[/color][/font][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][font=宋体][color=black]特异性[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font=宋体][color=black]引物[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]+[/color][/font][font=宋体][color=black]探针双重特异性[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font=宋体][color=black]引物特异性[/color][/font][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][font=宋体][color=black]荧光检测通道[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font=宋体][color=black]最多[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]6[/color][/font][font=宋体][color=black]个荧光检测通道，支持多重致病菌检测[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font=宋体][color=black]仅支持单一致病菌检测[/color][/font][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][font=宋体][color=black]扩增条件[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font=宋体][color=black]变温（热启动：[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]95℃[/color][/font][font=宋体][color=black]，变性[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]95℃[/color][/font][font=宋体][color=black]，退火[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]60℃[/color][/font][font=宋体][color=black]，延伸[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]72℃[/color][/font][font=宋体][color=black]）[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font=宋体][color=black]恒温[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]60℃[/color][/font][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][font=宋体][color=black]抗干扰能力[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font=宋体][color=black]强[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font=宋体][color=black]较低[/color][/font][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][font=宋体][color=black]灵活性[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font=宋体][color=black]开放式平台，检测更灵活[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font=宋体][color=black]封闭式系统[/color][/font][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][font=宋体][color=black]准确性[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font=宋体][color=black]部分试剂盒含内参，可防止[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/color][/font][font=宋体][color=black]抑制产生的假阴性[/color][/font][/align] [/td][td] [align=center][font=宋体][color=black]无内参，易产生假阴性结果[/color][/font][/align] [/td][/tr][/table][align=left][font=宋体][color=black]扩增区、扩增产物分析区可合并。[/color][/font][/align]以上内容来自仪器信息网《PCR实战宝典》

[table=100%][tr][td]做定量PCR，仪器每次在设置时都显示“one or more calibrations are expired.”校准过期，而每次我都忽略，不知道会不会对结果有影响？仪器该如何校准？[/td][/tr][/table]

FZ/T 01026-2017纺织品 定量化学分析 多组分纤维混合物 将于2017年10月1日实施？为什么还找不到标准呢？大家谁拿到这个标准，分享一下？

以前我做的是，实时分析里建一个批处理表（方法文件老师做好的），把标准样品曲线的点和未知样品的的信息输进去，得到数据文件，自己数据处理图谱差减相似度搜索，注册质谱处理表，手动积分做曲线和定量报告，以前没研究过这东西，现在自己看是自己选择一个适合浓度的标样做scan 扫描，之后创建定量用的scan或者sim 或者两个一起扫描文件来做定量，可以在标准样品后做批处理表向导得到定量文件，那定性的呢也要做一个批处理表吗，现在步骤是会了，以我的思路我可能会得到定量数据后，再做过的数据返回去做定性，但是不应该先定性在定量吗，有的培训教材是，scan 扫描之后定性，就做一个批处理表，定量在做一个，你们是这样的吗

布鲁克tensor 27，气体组分定量问题。目前采用的是标准气校正曲线，采集谱图后手动调用定量方法进行定量。与工程师交流，据说OPUS自带一个软件升级包，好像叫Process的，可以实现实时采集谱图，自动定量，给出动态监测气体浓度的曲线。不知道有没有小伙伴用过这个功能，或者了解相关情况的，请教！

各位使用MassHunter工作站的朋友是否有碰到过在正常进样分析时工作站上的实时谱图是空白的，但是谱图的生成数据是正常的，均可用定性及定量软件打开的，不知道出现这种情况是什么原因，看不到实时谱图极不方便。