蛋白偶联受体

本文介绍了利用 Agilent 1260 Infinity Ⅱ 四元液相色谱系统、Agilent 1290 Infinity Ⅱ ELSD 检测器和 Agilent Poroshell 120 SB-C18, 3.0 mm × 150 mm, 2.7 μ m 色谱柱对 PEG 偶联重组蛋白注射剂中的吐温 20 进行定量分析的简单灵敏的方法。该方法采用含三氟乙酸(0.1% TFA) 的乙腈和水溶液为流动相，以梯度条件对注射剂中吐温 20 进行分离分析。该方法操作方便，灵敏度高，具有良好的线性关系、精密度和准确度，为生物制药企业测定PEG 偶联的一类重组蛋白制剂中的吐温 20 辅料提供一种可选的解决方案。

本文介绍了一种对实际 PEG 偶联重组蛋白注射液中吐温 20 进行高效分离的方法。该方法采用 Agilent 1260 Infinity II Prime 液相色谱系统、1290 Infinity II ELSD 检测器和 Poroshell 120 SB-C18 色谱柱。1290 Infinity II ELSD 为吐温 20 提供了较高的检测灵敏度和较好的精密度结果。吐温 20 的 LOD 和 LOQ 分别为 5 μ g/mL 和 10 μ g/mL，在 10–200 μ g/mL 浓度范围表现出良好的线性，且实际样品的测定值在理论值的± 10% 范围内，表明该方法可以实现准确定量分析。针对客户测定实际重组蛋白制剂（如偶联PEG）中吐温 20 的分析需求，本文所述的方法可作为一种可靠的解决方案。

抗体偶联药物（ADC）功能分析作为抗体研发极为关键的环节，涉及如药理药效评估的内化作用检测，细胞毒增强（ADCP效应激活吞噬作用）检测，3D细胞模型评估等多方位检测及评价，赛默飞抗体药研发功能检测全流程解决方案平台可以提供从细胞活性，增殖，毒理，表达等包括成像及流式检测评估到蛋白高通量检测的一系列完整研究平台。

● 研 究 难 点在药物开发和结构生物学研究领域中，有许多重要的靶点属于膜蛋白，例如G蛋白偶联受体(GPCRs)，离子通道和膜转运蛋白等等，涉及多种生化功能和疾病发生机理，因此一直是研究人员关注的热点。然而，膜蛋白的研究存在着不少难点。让我们来看看NanoTemper公司的技术是如何帮助研究人员克服膜蛋白研究中的难题吧！

疏水作用色谱HIC是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质等生物大分子的常用方法，也是测定ADC中DAR的重要手段。在HIC模式下，高盐浓度将待分离的样品吸附在固定相上，然后线性或阶段降低流动相中盐浓度有选择性地将样品洗脱。分离过程中，随着流动相中盐浓度的降低，疏水性弱的蛋白先被洗脱下来，而疏水性强的蛋白随后才被洗脱下来，BioCore HIC-Butyl对模拟单抗偶联药物中不同效价的分离具有很好的选择性。

人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP-6)检测试剂盒人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP-6)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP-6)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP-6)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP-6)抗原、生物素化的人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP-6)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP-6)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

展示BioAccord?系统在非变性条件下分析抗体偶联药物(ADC)的性能。药物/抗体比率(DAR)是ADC的一种关键质量属性(CQA)，因为它直接影响ADC的治疗效果和药代动力学。在ADC开发过程和商业化生产运营中，DAR的测定（和监测）至关重要。 非变性电喷雾质谱（非变性质谱）已成为分析共价复合蛋白质治疗药物和非共价蛋白质复合体的有力工具。在非变性质谱条件下，使用兼容MS的非变性缓冲体系对蛋白质进行电喷雾电离。这些LC-MS分析条件使许多蛋白质能够保持折叠状态，这些状态表现出特征性低电荷态，与分析变性蛋白相比，需要在更宽和更高的质荷比(m/z)范围内具有出色的灵敏度。非变性质谱面临多种独有的难题，包括在尝试使用注入式MS时，需要在分析前进行大量样品净化，并要求操作人员拥 有更高的技术水平以获得并解析实验结果。 之前，我们致力于通过将在线SEC与现有MS 技术联用来简化非变性质谱数据的采集，促进样品脱盐和缓冲液交换，以研究半胱氨酸偶联ADC药物。

人低密度脂蛋白受体(LDLR)检测试剂盒人低密度脂蛋白受体(LDLR)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人低密度脂蛋白受体(LDLR)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人低密度脂蛋白受体(LDLR)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人低密度脂蛋白受体(LDLR)抗原、生物素化的人低密度脂蛋白受体(LDLR)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人低密度脂蛋白受体(LDLR)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人可溶性转铁蛋白受体(sTfR)检测试剂盒人可溶性转铁蛋白受体(sTfR)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人可溶性转铁蛋白受体(sTfR)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人可溶性转铁蛋白受体(sTfR)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人可溶性转铁蛋白受体(sTfR)抗原、生物素化的人可溶性转铁蛋白受体(sTfR)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人可溶性转铁蛋白受体(sTfR)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人骨成型蛋白受体Ⅱ(BMPR-Ⅱ)检测试剂盒人骨成型蛋白受体Ⅱ(BMPR-Ⅱ)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人骨成型蛋白受体Ⅱ(BMPR-Ⅱ)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人骨成型蛋白受体Ⅱ(BMPR-Ⅱ)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人骨成型蛋白受体Ⅱ(BMPR-Ⅱ)抗原、生物素化的人骨成型蛋白受体Ⅱ(BMPR-Ⅱ)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人骨成型蛋白受体Ⅱ(BMPR-Ⅱ)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人转铁蛋白受体(TFR/CD71)检测试剂盒人转铁蛋白受体(TFR/CD71)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人转铁蛋白受体(TFR/CD71)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人转铁蛋白受体(TFR/CD71)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人转铁蛋白受体(TFR/CD71)抗原、生物素化的人转铁蛋白受体(TFR/CD71)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人转铁蛋白受体(TFR/CD71)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人前动力蛋白受体2(PKR2)ELISA试剂盒人前动力蛋白受体2(PKR2)ELISA试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人前动力蛋白受体2(PKR2)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人前动力蛋白受体2(PKR2)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人前动力蛋白受体2(PKR2)抗原、生物素化的人前动力蛋白受体2(PKR2)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人前动力蛋白受体2(PKR2)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人极低密度脂蛋白受体(VLDLR)检测试剂盒人极低密度脂蛋白受体(VLDLR)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人极低密度脂蛋白受体(VLDLR)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人极低密度脂蛋白受体(VLDLR)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人极低密度脂蛋白受体(VLDLR)抗原、生物素化的人极低密度脂蛋白受体(VLDLR)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人极低密度脂蛋白受体(VLDLR)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人去唾液酸糖蛋白受体(AGSPR)检测试剂盒人去唾液酸糖蛋白受体(AGSPR)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人去唾液酸糖蛋白受体(AGSPR)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人去唾液酸糖蛋白受体(AGSPR)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人去唾液酸糖蛋白受体(AGSPR)抗原、生物素化的人去唾液酸糖蛋白受体(AGSPR)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人去唾液酸糖蛋白受体(AGSPR)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

疏水作用色谱（HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质等生物大分子的常用方法，也是测定ADC中DAR的重要手段。在HIC模式下，高盐浓度将待分离的样品吸附在固定相上，然后线性或阶段降低流动相中盐浓度有选择性地将样品洗脱。分离过程中，随着流动相中盐浓度的降低，疏水性弱的蛋白先被洗脱下来，而疏水性强的蛋白才随后被洗脱下来，BioCore HIC-Butyl对半胱氨酸偶联单抗药物中不同效价的分离具有很好的选择性。

结合了单克隆抗体 (mAb) 特异性与细胞毒性分子效能的抗体药物偶联物 (ADC) 已获得了越来越多的关注，它作为一种极具前景的方法可用于实现选择性更强的癌症治疗。由于潜在药物结合位点众多且在这些位点中的占位形式多样，因此 ADC 与未修饰的生物治疗抗体相比具有更高复杂性与异质性。为获得 ADC 分子的完全表征，本研究进行肽谱分析实验以获得关于 ADC 结合位点的详细位点特异性信息。本应用简报介绍了结合采用 Agilent AssayMAP Bravo 样品前处理平台的自动化蛋白质酶解、采用高分辨率精确质量数 Agilent 6550 iFunnel Q-TOF 系统的 LC/MS 分析以及 Agilent BioConfirm 软件的 ADC 肽谱分析工作流程。T-DM1 获得的序列覆盖率为 98.7%。采用药物偶联物可鉴定出 29 个以上的赖氨酸位点。

抗体药物偶联物 (ADC) 是一类新兴生物治疗药物，旨在通过将药物与单克隆抗体相连实现靶向给药。与小分子药物不同，ADC 不是单分子实体，而是一类异质性的抗体，每种抗体所携带的药物数量以及经历的翻译后修饰都各不相同。药物/抗体比率 (DAR) 是指 ADC 偶联的药物的平均数量。DAR 是 ADC 开发过程中需要优化和密切监测的关键质量属性，因为它将影响疗效和毒性。由于药物的释放，在血液循环中 ADC 的 DAR 将随时间发生变化。因此，制定一套测定药代动力学 (PK) 研究样品中 ADC DAR 的稳定解决方案非常关键。要确定 ADC DAR，首先必须纯化血清中的 ADC，然后使用 LC/MS 对其进行分析。通常该工作流程中的样品前处理和数据分析环节需耗费大量人力，因此易受变异性和人为误差影响。本应用简报介绍了一种用于测定血清样品中 ADC DAR 的解决方案，该方案采用 Agilent AssayMAP Bravo 平台对 ADC 进行自动亲和纯化；将 Agilent 1290 Infinity UHPLC 与Agilent 6550 Q-TOF 质谱仪联用，用于采集准确的完整蛋白分子量数据；并利用 Agilent MassHunter BioConfirm 和 DAR 计算器软件确定 ADC 质量和 DAR。该工作流程可节省人力、降低变异性以及减少产生与 ADC DAR 测定相关的人为误差的可能性，而且仅需很少的工作量即可扩展样品处理量。

体积排阻色谱 (SEC) 是表征生物治疗蛋白质体积异构体的一种常用技术。本应用简报比较了不同供应商的 2 μm 和亚 2 μm SEC 色谱柱对单克隆抗体 (mAb) 和抗体药物偶联物 (ADC) 的 SEC 分析。Agilent AdvanceBio SEC 200 Å 1.9 μm 色谱柱对实现mAb 和 ADC 的高分离度分离具有独特的优势。

本文以半胱氨酸连接的抗体药物偶联物 (Antibody-Drug Conjugate, ADC) 为研究对象，使用连接 PLRP-S 反相液相色谱柱的 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统分离还原的轻链、重链和相对应连接药物的轻重链，并通过 Agilent 6530 高分辨率四极杆飞行时间 (Q-TOF) 液质联用系统对各个色谱峰进行鉴定。通过积分处理紫外吸收图谱中各轻重链的峰面积百分比，结合各个峰的偶联药物数目，计算ADC的加权平均药物/抗体比率 (Drug to Antibody Ratio, DAR)。同时使用了安捷伦DAR 计算器 (Agilent DARCalculator)对质谱解卷积结果进行 DAR 值计算，所得结果与紫外吸收图谱计算所得结果相同。

采用纳谱分析纳谱分析BioCore SCX色谱柱对融合蛋白进行检测，主峰与杂质峰可以达到良好分离，为该药物的质量保证提供检测依据，BioCore SCX适用于单抗、双抗以及单抗偶联药物中电荷异质体的分离。

抗体偶联药物（Antibody-drug conjugates, ADC）是当下重要和主要的大分子抗癌药物类型之一。预计到2028 年，获批和处于III 期临床试验阶段的ADCs 的收入将达到260 亿美元。目前，ADC 药物依然面临着靶点特异性、有效/ 安全的Payload 释放和肿瘤穿透性差等挑战。对此，靶点/ Payload 创新（First-in-class）和递送/ 偶联机制创新（Best-in-class）成为了该领域的关注点和发展趋势。针对ADC 临床前筛选、评价和生产等重要研发环节，瑞孚迪聚焦机制创新、生理相关性和规模化三个维度，提供完善的前沿解决方案。

人骨成型蛋白受体1A(BMPR1A)ELISA试剂盒人骨成型蛋白受体1A(BMPR1A)ELISA试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人骨成型蛋白受体1A(BMPR1A)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人骨成型蛋白受体1A(BMPR1A)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人骨成型蛋白受体1A(BMPR1A)抗原、生物素化的人骨成型蛋白受体1A(BMPR1A)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人骨成型蛋白受体1A(BMPR1A)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人骨成型蛋白受体1A(BMPR-1A)检测试剂盒人骨成型蛋白受体1A(BMPR-1A)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人骨成型蛋白受体1A(BMPR-1A)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人骨成型蛋白受体1A(BMPR-1A)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人骨成型蛋白受体1A(BMPR-1A)抗原、生物素化的人骨成型蛋白受体1A(BMPR-1A)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人骨成型蛋白受体1A(BMPR-1A)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

本应用文献介绍了半胱氨酸偶联的抗体药物偶联物（ADC）-本妥昔单抗经过疏水作用色谱（HIC）分离后采用基于色谱峰收集的原理对其进行了馏分收集。安捷伦1260生物惰性液相色谱和1260生物惰性馏分收集器不仅能实现馏分收集，同时使生物药物能够在一个完全非金属的流路下完成再分析的工作，且避免HIC高盐体系的腐蚀。安捷伦1260生物惰性馏分收集器做到了高精度的馏分收集，收集的结果通过了相同HIC方法的再分析验证。同时，馏分和ADC的主峰也采用反相色谱进行了再验证。

寡核苷酸偶联抗体（Antibody Oligonucleotide Conjugates, AOC）是寡核苷酸通过定点或非定点偶联在特定靶向性抗体或抗体片段上的一类偶联抗体药物，类似于抗体偶联药物（Antibody Drug Conjugates, ADC）。AOC通过将单抗和寡核苷酸偶联，同时具有寡核苷酸药物的精准性和抗体大分子的特异性等两大优点，具有重要意义。

本文以半胱氨酸连接的抗体药物偶联物 (Antibody-Drug Conjugate, ADC) 为研究对象，使用连接 PLRP-S 反相液相色谱柱的 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统分离还原的轻链、重链和相对应连接药物的轻重链，并通过 Agilent 6530 高分辨率四极杆飞行时间 (Q-TOF) 液质联用系统对各个色谱峰进行鉴定。通过积分处理紫外吸收图谱中各轻重链的峰面积百分比，结合各个峰的偶联药物数目，计算 ADC 的加权平均药物/抗体比率 (Drug to Antibody Ratio, DAR)。同时使用了安捷伦 DAR 计算器 (Agilent DARCalculator) 对质谱解卷积结果进行 DAR 值计算，所得结果与紫外吸收图谱计算所得结果相同。

多参数表面等离子体共振(MP-SPR)是一种实时无标记检测方法，可以检测传感器表面的变化，如配体结合、分子重排和细胞粘附。由于其多参数方法，可以实时跟踪多个参数(图1)。例如，峰值角位置信号(PAP)检测GPCR激活期间细胞中发生的细微质量重分布。相反，峰值最小强度(PMI)受SPR耦合角反射回的光量的影响。通过这种方式，不同的MP-SPR反应单独或相互结合，可以在单步分析中研究不同的GPCR途径，而无需事先进行细胞处理，使用拮抗剂或途径调节化合物。

抗体药物偶联物 (ADC) 是制药公司药物开发途径中快速发展的一类新型生物治疗药物。ADC的制备方法是通过化学方法将具有生物活性的小分子药物与单克隆抗体相连。ADC 通过结合高效细胞毒性药物与靶标特异性抗体将细胞毒性药物直接送达病变组织，同时限制药物在非目标组织中的毒性。药物/抗体比率 (DAR) 是抗体所连接药物数量的平均值，它是 ADC 的重要属性。由于低载药量会降低效力，而高载药量则会对药代动力学 (PK) 和毒性产生负面影响，因此 DAR 值能够对药效产生影响。目前的偶联化学方法有赖氨酸侧链酰胺化或半胱氨酸链间二硫键还原，载药量通常为 0 ~ 8 个药物分子 (D0 ~ D8)/抗体。

人抗肌联蛋白抗体(TTN)检测试剂盒人抗肌联蛋白抗体(TTN)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人抗肌联蛋白抗体(TTN)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人抗肌联蛋白抗体(TTN)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人抗肌联蛋白抗体(TTN)抗原、生物素化的人抗肌联蛋白抗体(TTN)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗肌联蛋白抗体(TTN)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

本研究使用新型反相色谱柱来解决这些问题，以期改善抗体偶联药物的表征分析。在此之前，已有研究表明,抗体偶联药物因含有疏水性极强的Fd' 亚基(负载数为3)而更加难以进行有效分析。