转染实验

[font=宋体]哺乳动物细胞表达系统具有促使蛋白正确折叠和实现复杂修饰的功能，表达的蛋白更近天然状态，能够运用于制药等活性要求高的领域。利用哺乳动物细胞表达系统生产蛋白通常有两种方式：瞬时转染与稳定转染（构建稳定细胞系），这两种方式在原理、操作流程、应用场景上均有所区别，本文主要就瞬时转染与稳定转染之间的区别做一介绍。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]瞬时转染与稳定转染实验原理的异同：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]瞬时转染与稳定转染都是将目的基因转染至特定哺乳动物细胞内，进而表达得到目的蛋白。不同的是瞬时转染的方式外源基因并没有转染到细胞的染色体上而是存在于游离的载体上，这样可以在短时间内获得基因的表达产物，但是随着细胞的不断分裂增殖外源基因最终会丢失，无法继续进行重组蛋白的生产；而利用细胞稳定转染则会将外源基因转染至细胞染色体上，目的基因不会随着细胞传代而消失，稳定转染的细胞株能够长期稳定的生产目的蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]实验操作的差别：[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]瞬时转染与稳定转染所用的质粒是不同的，瞬转的质粒不需要带有抗性，而用于稳定转染的质粒一定要带有特定的抗性以便于后续的克隆株筛选。另外，两者所用的培养基及实验试剂也有所区别。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]瞬时转染的操作比构建稳定细胞系的操作简单，构建好质粒后，经过细胞复苏、转染、细胞培养、蛋白纯化等步骤即可得到目的蛋白；而构建稳定细胞系需要先将构建好的质粒线性化，再导入培养好的哺乳动物细胞内，通过一定的转染方式实现质粒与细胞的融合，接着经过细胞池筛选、单克隆筛选、细胞传代培养等步骤才能得到稳定转染的细胞系。对稳定细胞系进行培养能够长期稳定的生产目的蛋白。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]瞬时转染与稳定转染优缺点对比[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]瞬时转染：[/font][font=宋体]优点：[/font][font=宋体]①能够快速生产得到微量至中量的重组蛋白[/font][font=宋体]②实验成本低[/font][font=宋体]③一个宿主可以带有多个拷贝，表达效率高[/font][font=宋体]缺点：无法长期生产得到重组蛋白[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]稳定细胞系构建：[/font][font=宋体]优点：能够长期稳定生产目的蛋白[/font][font=宋体]得到稳转株之后后续生产蛋白的成本大大降低[/font][font=宋体]能够对基因进行基因插入、基因敲除等编辑操作[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][b]稳定细胞系构建服务[/b][/url]，包含过表达细胞系构建服务和[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]稳定细胞株开发服务，详情可以参看[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service[/font][/font]

常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。转染方法有多种，根据不同的细胞，贴壁或悬浮细所可选用不同的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率的因素有多种，包括转染方法、操作技术、质粒DNA的纯度、靶细胞的生长状态等，下面重点介绍向几种常用的转染技术：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导尘等。靶基因被导入细胞后，一般在转染后48小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。

1、 电场参数电场是电转染的重要因素，细胞在电场的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此，一个适宜的电场强度至关重要。不同细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外，还可以采取较为简便的间接法。文献显示存活率在50%左右的电场参数为理想参数，故可间接测定存活率来确定最佳场强值。

4、 质粒因素从质粒浓度看，细胞密度为1*106/ml，DNA用量在2-5ug/ml转染效率最高。转染率在一定一定范围内随质粒浓度的上升呈线性增高，但是到达一个峰值后，随DNA用量增加而转染率逐渐下降，其原因可能为细胞吸纳DNA有一个饱和度，过量便会产生毒性，使存活率降低，不利于转染率提高。进行小分子量的分子转染时（siRNA/miRNA），应使用高电压、短脉冲时间。大分子量分子转染时（DNA），应使用低电压，长脉冲时间。从质粒的纯度看，用高纯度的DNA才 能提高电转的效率，且应注意以下几点：首先DNA／RNA应该超纯(A260／A2801．8)，其次应不含内毒 素，同时质粒应溶于双蒸水而不是TE缓冲溶液。

[color=#1a1a1a]1. 脂质体法[/color][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a]2. 电穿孔法[/color][/color][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a]3. 病毒介导的感染[/color][/color][/color][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a]4.非脂质体转染[/color][/color][/color][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a].........请大家补充[/color][/color][/color]

6、电转染试剂的选择电击会对细胞造成一定程度的伤害，在转染试剂的选择上要注意，应选择具有细胞膜修复成分的电转染试剂，如Entranster-E，将电击对细胞的损伤降到最低。

5、 温度 一般情况下，电转的过程是在室温下进行，但在 电击前后可对细胞进行冰浴处理。电击前冰浴的时间对转染率影响不大，但低温环境能够防止DNA被外源性DNA酶降解，并限制在电击中因Joule作用而产生的不良反应，因此，实验一般选择电击前冰浴5min。电击后冰浴，会影响DNA摄入，因为电击后冰浴可增强细胞收缩，细胞膜上的 电穿孔封闭较慢，延长外源性DNA摄入时间，从而提高其摄入量。在室温环境下，虽然细胞膜上的孔 封闭速度快，但在随后2h，质粒还可通过电内化进入细胞，因此摄人量不一定比4℃环境下低。而且，室温下细胞在5 min内即闭孔，在4℃的环境下穿孔状态可保持4h，穿孔封闭缓慢降低了存活率，同时细胞在低温下更容易受到损伤。因此，综合考虑摄人量和存活率，大部分文献倾向于电击后细胞仍在室温或37℃下保存。

2、脉冲过程1）脉冲波形脉冲波形主要分为两种：1、方波脉冲；2、指数递减波脉冲。方波脉冲是指：电压瞬间升至预设电压，保持电压放电，然后瞬间终止放电。一般哺乳动物细胞电转染时选择方波脉冲，有较高的转染效率和细胞存活率。指数递减波脉冲是指：先对电容充电，然后让电容完全放电，其电压变化呈指数递减。一般这种波形的脉冲电转染适用于细菌、酵母菌、昆虫细胞。2）脉冲时间脉冲时间的选定主要取决与脉冲波形。在方波脉冲中，脉冲时间可直接设定。在指数递减波脉冲中，脉冲时间是指电压衰减至初始电压1/3时所用的时间，等于电容（C）与电阻（R）的乘积，单位是ms。在参数优化中，增加电压应当降低脉冲时间，而减小电压则应当增大脉冲时间。3）脉冲次数一般而言，对于大多数细胞类型都选择单次脉冲。而在有些情况下可能会用到多次脉冲，因为低电压、短脉冲时间、多次脉冲可有效避免细胞损伤。多次脉冲建议中间间隔1min。

3、细胞因素用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密比稳定期的细胞差，电转后，细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA.细胞悬液浓度一般为1*106/ml，当细胞生长密度大于3*106/ml，转染效率会下降。原因除了细胞老化外，细胞过密会使相邻细胞相互作用增大，甚至使细胞相互融合，从而导致电场的局部微扰，使电场环境无法均一化，细胞体积越大对电击越敏感，所需电场强度也越小。

报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其 它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因主要有以下几种： 胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎 叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)　nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作 用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。氯霉素乙酰 转移酶基因测时可通过放射自显影观察。荧光素酶基因（luciferase Gene）1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中出来的，该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用植物整株或部分直接用X-光片 或专门仪器进行检测。具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。β-D-葡萄糖苷酶基因该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱 、荧光等进行检测。除此之外还有庆大霉素转移酶基因等。在动物基因表达调控的研究中，已使用的报告基因主要有以下几种： 绿色荧光蛋白（gfp）基因等。绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光，GFP Cdnad 开放阅读框架长度约740bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65-67位丝氨酸－脱氢酪氨酸－甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长 紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪(FACS)中直接观察基因的表达。此外还有β-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)等。

荧光显微镜下H526细胞的慢病毒转染结果

慢病毒转染过后的细胞荧光照片明场[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/06/202306302120455921_65_5389809_3.jpeg[/img]低浓度[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/06/202306302120459963_6495_5389809_3.jpeg[/img]高浓度[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/06/202306302120461778_5983_5389809_3.jpeg[/img]

不同的慢病毒转染浓度，荧光显微镜荧光场亮度可以作为简单的定量分析数据吗

[font=宋体]随着生物技术的快速发展，稳定转染细胞株的构建在基础研究和应用研究中变得越来越重要。这一技术涉及到将外源基因稳定整合到宿主细胞基因组中，从而实现基因的长期表达。然而，这一过程也伴随着一系列的挑战和常见问题。本文将深入探讨稳转细胞株构建的方法，以及在实践过程中可能遇到的问题，旨在为研究者提供实用的指导和建议。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]稳定转染细胞株构建方法：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一、慢病毒感染细胞[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]慢病毒因为可以感染大多数的分裂细胞和非分裂细胞，包装技术成熟，[/font][font=Calibri]II[/font][font=宋体]代和[/font][font=Calibri]III[/font][font=宋体]代慢病毒包装系统均能包装高滴度的慢病毒，是稳转细胞系构建的首选系统。但是因为慢病毒有包装容量限制，不适合转录本区域比较长的基因，对较大的基因有局限性。另外由于慢病毒是逆转录病毒，病毒表达载体中，是由[/font][font=Calibri]WPRE[/font][font=宋体]元件代替[/font][font=Calibri]PolyA[/font][font=宋体]稳定以达到稳定[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]的作用，对部分基因的翻译有一定影响。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二、转座子介导的稳转细胞系构建[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]转座子是存在于各种生命细胞内的可移动遗传信息元件，能实现[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]片段在染色体内部[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]之间的转移。工程化的转座子由[/font][font=Calibri]ITR[/font][font=宋体]和转座酶编码基因组成，通过转座酶与[/font][font=Calibri]ITR[/font][font=宋体]结合实现基因转移。将转座子的两个元件分别构建在两个独立载体上，并将目的基因序列替换转座酶序列，与另一个载体共转染目的细胞，实现目的基因在宿主基因组上的整合。与其他技术不同，目的基因在整合酶存在下会持续处于切割—整合状态，实现连续跳跃。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]三、[/font][font=Calibri]CRISPR/Cas9 [/font][font=宋体]基因敲入[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]利用[/font][font=Calibri]CRISPR/Cas9[/font][font=宋体]系统，通过[/font][font=Calibri]NHEJ[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]HDR[/font][font=宋体]修复机制，可将目的基因（如抗性基因和荧光标志）定点敲入细胞基因组。在哺乳动物细胞中，[/font][font=Calibri]NHEJ[/font][font=宋体]的效率高于[/font][font=Calibri]HDR[/font][font=宋体]。设计特定[/font][font=Calibri]sgRNA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]donor[/font][font=宋体]载体，可在[/font][font=Calibri]AAVS1[/font][font=宋体]位点（人基因组安全港）实现基因定点敲入。此方法稳定、安全，但敲入概率在不同细胞和位点中有所差异，需筛选单克隆以获得稳定细胞系。随着编辑效率提高，此方法将更省时省力。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]四、[/font][font=Calibri]CRISPR SAM[/font][font=宋体]系统，通过融合[/font][font=Calibri]VP64[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]MS2-P65-HSF1[/font][font=宋体]系统对基因进行过表达和干扰[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]CRISPR SAM[/font][font=宋体]通过[/font][font=Calibri]dCas9-VP64[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]MS2-P65-HSF1[/font][font=宋体]激活蛋白实现了多数细胞内源基因的特异性激活，不受基因大小限制。主要优势是应用广泛，但需要三种不同抗性病毒逐次或同时感染细胞。[/font][font=Calibri]CRISPR SAM[/font][font=宋体]将[/font][font=Calibri]sgRNA[/font][font=宋体]序列构建在[/font][font=Calibri]lenti[/font][font=宋体]载体中，配合其他两种慢病毒可激活任何基因。主要缺点是筛选细胞时需要三种不同抗性的病毒，部分细胞筛选后表型变化明显。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]稳转细胞系构建中常见问题解析：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]是否需要进行密码子优化？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]由于氨基酸密码子的简并性和[/font][font=Calibri]tRNA[/font][font=宋体]的种类多样性、数量的差异，密码子优化对长基因稳转细胞系的构建有很强的必要性，可以大幅提高目标蛋白的表达量。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. Kozak[/font][font=宋体]序列是必须要添加的吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列（通常是[/font][font=Calibri]GCCACCatgG[/font][font=宋体]），真核生物[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]真正的起始密码子位于[/font][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列的保守序列中，其共有序列是[/font][font=Calibri]CCRCCAUGG[/font][font=宋体]，几乎所有[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]的翻译起始都依赖于[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]’帽子结构募集小亚基，少数通过内部核糖体进入位点[/font][font=Calibri](IRES)[/font][font=宋体]募集小亚基。[/font][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列通过与翻译起始因子[/font][font=Calibri]eIF[/font][font=宋体]形成翻译起始复合物，起始蛋白的翻译。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]启动子应如何选择？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]CMV[/font][font=宋体]（巨细胞病毒）启动子除了在干细胞外，其他大多数细胞类型中均可以获得高表达活性。悬浮细胞中[/font][font=Calibri]SFFV[/font][font=宋体]启动子表达活性相对较高。而[/font][font=Calibri]EF1a[/font][font=宋体]（延伸因子[/font][font=Calibri]-1[/font][font=宋体]α）启动子更适用于表达长片段的基因。[/font][font=Calibri]CMV[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]EF1A[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]CAG[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]CBh[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]SFFV[/font][font=宋体]，等均属于强启动子，都可作为稳转细胞系构建可选启动子。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]稳转细胞系培养体系[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]稳转细胞系一般建议用半抗性筛选浓度维持细胞生长，如[/font][font=Calibri]hepG2[/font][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]puro[/font][font=宋体]抗性筛选浓度为[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g/ml[/font][font=宋体]，则建议用[/font][font=Calibri]1ug/mL+[/font][font=宋体]完全培养基维持生长；部分基因过表达后会影响细胞代谢，尤其肿瘤细胞，糖酵解代谢速率受影响，细胞生长缓慢，可相应添加葡萄糖或者[/font][font=Calibri]HEPES[/font][font=宋体]调节细胞细胞代谢水平，维持细胞增殖。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5. [/font][font=宋体]标签放在[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端还是[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端好？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]如果[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端有信号肽，建议放在[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端；蛋白如果较小，建议放在[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端，减少蛋白降解；如果下游有[/font][font=Calibri]P2A[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]T2A[/font][font=宋体]等自剪切肽，建议放在[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端。如果为了添加[/font][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列，建议加在[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。如果纯化中需要酶切标签，建议放在[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6. [/font][font=宋体]是否可以构建稳转敲除的细胞系？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一般不建议，因为敲除元件稳定持续的表达在细胞中，累积脱靶效应明显，影响细胞状态。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][b]稳定细胞系构建服务[/b][/url]，包含过表达细胞系构建服务和[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]稳定细胞株开发服务，其服务内容详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service[/font][/font]

[font='times new roman'][size=18px]生物实验中的基础操作[/size][/font][font='times new roman'][size=18px]—[/size][/font][font='times new roman'][size=18px]病毒转染及[/size][/font][font='times new roman'][size=18px]Q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/size][/font][font='times new roman'][size=18px]低表达细胞模型的构建[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1. [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]从[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-80[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]°C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]冰箱取出慢病毒载体冰上融化，将慢病毒用空白培养基稀释为滴度[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]×[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000]8[/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，充分混匀，准备好病毒感染增强液。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2. [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]将悬浮细胞移入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]15 mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]离心管中，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]900 rpm[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，离心[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]8 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，弃去上清，用空白培养基重悬细胞沉淀，并用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url]充分吹打混匀。取其中[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]500 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]放入细胞计数仪中计数，取出[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1.5[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]×[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000]6[/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]个细胞置入新的离心管中。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3. 12[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]孔板中以[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MOI=15[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的病毒滴度进行感染，培养[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]16 h[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4. 16 h[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]后，在原培养基中加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2 ml [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]新鲜完全培养基继续培养，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]72 h[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]后观察荧光。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5. [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]细胞生长至状态良好，加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]g/mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]嘌呤霉素筛选至[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]90%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]以上细胞产生荧光。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=18px]荧光实时定量[/size][/font][font='times new roman'][size=18px] [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/size][/font][font='times new roman'][size=18px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=18px]q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/size][/font][font='times new roman'][size=18px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]. [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]总[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的提取：分别将细胞离心，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PBS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]缓冲液清洗[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]次，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]900 r/min [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]离心[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]8 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，得到细胞沉淀。分别加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1 mL Trizol[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url]吸打至细胞完全破裂，加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]200 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]氯仿，震荡[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]30 s[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，室温静置[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，以有效分离无机相和有机相，随后[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]°C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]12000 g/min [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]离心[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]15 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。将上清移至高压过的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1.5 mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，轻柔颠倒震荡数次，室温静置[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，随后[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]°C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]12000 g/min [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]离心[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。弃去上清，加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]75%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]无水乙醇，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]°C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]12000 g/min [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]离心[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。弃去上清，沉淀置于冰上自然干燥，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]但不可完全干燥。用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] 30 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L DEPC[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]水溶解总[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]NanoDrop One[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]超微量分光光度计进行定量和纯度检测。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]. [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]cDNA [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的合成：将混合液轻柔吹打混匀，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]42[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] °C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][align=center][font='times new roman'][color=#000000]表[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000] [/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]逆转录体系[/color][/font][/align][table][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]试剂名称[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]使用量[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]RNase-free ddH[/color][/font][font='times new roman'][sub][size=13px][color=#000000]2[/color][/size][/sub][/font][font='times new roman'][color=#000000]O[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]to 16 μL[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]4*gDNA wiper Mix[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]4 μL[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]模板[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] RNA[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]Total RNA[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]：[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]1pg-1 [/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]μ[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]g[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5*HiScript III qRT SuperMix[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]4 μL[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='宋体'][color=#000000]第一步的反应液[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]16 μL[/color][/font][/align][/td][/tr][/table][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]. [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]检测[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] mRNA [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的表达[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]GAPDH [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]引物序列：[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Forward primer:5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Reverse primer:5’-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC1 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]引物序列：[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Forward primer: [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]′[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-ATTAAAGGAACAGACGGGCTC-3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]′[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Reverse primer:[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]′[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-ATGTGCGTGGTCATAGAGTATG-3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]′[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]反应体系：[/color][/size][/font][align=center][font='times new roman'][color=#000000]表[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]反应体系[/color][/font][/align][table][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]试剂名称[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]使用量[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]2*ChamQ Universal SYBR q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] Master Mix[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]1[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]0[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000] μL[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]Primer1[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]（[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]10μM[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]）[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]0.[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]4 μL[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Primer2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10μM[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]0.4 μL[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Template DNA/cDNA[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]X μL[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ddH[/color][/size][/font][font='times new roman'][sub][size=16px][color=#000000]2[/color][/size][/sub][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]O[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]To[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000] 20 μL[/color][/font][/align][/td][/tr][/table][font='times new roman'][size=16px]将混合液轻柔吹打混匀，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]37 °C, 15 min[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]85 [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]°C[/size][/font][font='times new roman'][size=16px], 5 s[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，得到[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]cDNA[/size][/font][align=center][font='times new roman'][color=#000000]表[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]反应程序[/color][/font][/align][table][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]反应步骤[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]反应温度[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]反应时间[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]循环次数[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]预变性[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]95[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000] °C[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]10[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000] [/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]min[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]1[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]变性[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]95[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000] °C[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]10[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000] s[/color][/font][/align][/td][td][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]退火[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]55-65 °C[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]1[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]0 s[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]3[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]0[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]延伸[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]72 °C[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]3[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]0 s[/color][/font][/align][/td][td][/td][/tr][/table][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Graphpad prism5 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]计算[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]mRNA [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]水平的表达量。[/color][/size][/font]

PCR................................................................................................................................. 2RT-PCR............................................................................................................................ 4琼脂糖核酸电泳............................................................................................................... 6胶回收纯化DNA.............................................................................................................. 6大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）.......................................................................... 7乙醇沉淀DNA.................................................................................................................. 8酶 切............................................................................................................................. 8连 接............................................................................................................................... 8感受态细胞的制备............................................................................................................ 9转 化............................................................................................................................. 10重组子的筛选和鉴定...................................................................................................... 10真核细胞的转染.............................................................................................................. 11转染细胞的稳定筛选....................................................................................................... 11重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量.......................................................................... 12肿瘤细胞体外传代培养及保种........................................................................................ 13肿瘤动物模型的建立...................................................................................................... 14小鼠尾静脉注射方法...................................................................................................... 14肿瘤蛋白疫苗预防性动物实验........................................................................................ 14人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养................................................................................. 14实验动物免疫方案.......................................................................................................... 15血清制备........................................................................................................................ 16ELISA............................................................................................................................ 16血清学筛选克隆新抗原/新基因....................................................................................... 17ELISPOT........................................................................................................................ 20藻酸盐包裹实验............................................................................................................. 21重组腺病毒构建，扩增及纯化基本技术操作................................................................... 21（细菌内同源重组AdEasy System）............................................................................... 21组织病理技术................................................................................................................. 26免疫组化染色................................................................................................................. 27流式细胞仪常用的几种检测方法..................................................................................... 29Western Blot(免疫印迹法)................................................................................................ 34PVDF膜上蛋白的可逆染色............................................................................................. 37人肿瘤抗原的识别与鉴定............................................................................................... 39－免疫沉淀实验流程...................................................................................................... 39蛋白质组实验流程.......................................................................................................... 41SDS-PAGE胶染色.......................................................................................................... 44数据库搜索(Databases search)......................................................................................... 45主要的公共数据库及网址............................................................................................... 46蛋白质的序列分析流程................................................................................................... 48聚丙烯酰胺凝胶的配制................................................................................................... 49双向电泳常用溶液配方................................................................................................... 51分子生物学常用溶液配制............................................................................................... 53另外给大家推荐一个资料共享的地方http://www.yiqi120.com/zlzx.asp,好东西大家一同分享.[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=128143]国内某重点实验室分子生物学实验方法与总结[/url]

[align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]慢病毒载体感染技术[/color][/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]慢病毒载体感染技术已经被广泛应用于[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]干扰技术中。使用慢病毒载体，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]shRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]被导入宿主细胞的细胞核内，根据启动子不同，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]shRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]可被[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]聚合酶[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]II[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]或者[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]III[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]催化转录[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，这些前体结构被[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]加工形成[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]pre-shRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]随后被[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Dicer[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]和[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]TRBP/PACT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]酶切，去除发卡结构，产生在两个[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]’[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]末端带有两个游离碱基的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]20-25[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]nt[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的双链[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]siRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。这一有活性的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]siRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]随后[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]与[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Argonaute[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] (Ago) [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]等蛋白质因子结合，形成[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]诱导的沉默复合体[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000](RNA-induced silencing complex, RISC)[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]作为[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RISC[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的一部分，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]siRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通过碱基互补配对以序列特异性的方式结合到靶[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]mRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在镁离子和[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ATP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的参与下，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Ago[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]切割靶标[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，产生的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]片段被快速降解，从而在转录后水平沉默靶基因的表达[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][63-65][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]凋亡是多[/color][/size][/font][url=https://baike.baidu.com/item/%E5%9F%BA%E5%9B%A0][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]基因[/color][/size][/font][/url][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bcl-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]家族、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]家族[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。内源性细胞凋亡途径始于线粒体，细胞色素[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]从线粒体内释放是关键的一步。在细胞凋亡信号的刺激下，细胞色素[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]从线粒体释放到胞浆，并与凋亡细胞蛋白酶激活因子[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Apaf-1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]结合，在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]dATP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]存在下，募集并激活[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase-9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，形成[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Cyto-3-Apaf-1-caspase-9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]凋亡体，激活下游的效应蛋白酶，如[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]6[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]7[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]8[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，启动[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的级联反应，引起细胞凋亡。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]被认为是凋亡的中心实施者，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]是调控[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，参与打靶与激活调控，激活[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]处于凋亡级联反应的核心位置，是效应[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，是参与凋亡的效应物。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的主要底物是聚合酶[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，在细胞凋亡启动时，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通过[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的裂解剪切参与凋亡的发生。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]cappase-3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]对[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的蛋白水解作用是凋亡实施的早期事件或前提条件。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bcl-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]是一种具有抑制细胞凋亡作用的蛋白，能够抑制[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]激活，结合[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Apf-1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]及[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，并维持其非活化状态，抑制[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]级联反应，并且抑制线粒体释放细胞色素[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，防止细胞凋亡[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][78, 79][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。实验中，我们通过[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]western blot[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]检测相关蛋白发现，与对照组相比，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]cleaved-caspase3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]cleaved caspase-9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]cleaved PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的表达量增加，而[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bcl-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]抗凋亡蛋白表达量减少，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达量明显下降，表明，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]低表达促进了凋亡的产生。[/color][/size][/font]

7、电转后培养液的选择细胞在电击后十分脆弱，其 培养液的选择应注重提高细胞的存活率，一般选择 低渗的RPMI 1640+10％FCS。除此之外，可参考 加入50 mmol／L海藻糖+1.25％DMSO，因为海藻 糖具有稳定DNA、蛋白质以及细胞膜的作用，并提高电转后细胞特别是淋巴细胞的存活率。此外， 有文献显示凋亡是细胞电击后死亡的主要原因，电 击后的培养液还可加入Caspase抑制剂和SCFGM-CSF等细胞因子。

iPSC神经细胞培养试剂【胜创生物】成功取得GlobalStem中国区总代理：人ES细胞mRNA高效转染试剂，GlobalStem公司2006年在美国成立，其团队核心技术骨干为原Lifetech部门，负责研发生产细胞转染试剂Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000及细胞培养试剂等。　　GlobalStem专注于iPSC（诱导性多功能干细胞神经分化）神经细胞转染、干细胞转染试剂，iPSC神经细胞培养、干细胞培养、原代细胞培养试剂。　　【胜创生物】http://www.shengchuangbio.com/-人ES细胞mRNA高效转染试剂　　DNA-In-Neuro：在神经细胞中的转染效率约高于Lipofectamine 2000的 3倍。　　DNA-In-Neuro：*转染效率高*低毒性*数据重复性高*操作简单。　　日前，【胜创生物】公司已成功取得GlobalStem的中国总代理权，电话咨询400-6400-850　　胜创生物以“品质第一，客户第一“为公司价值观，以引进”新产品、新技术“为己任，更多资讯关注胜创生物微信【sc-bios】获取详情！

题目：人骨保护素质粒转染抑制大鼠实验性牙周炎骨吸收的研究作者：唐华期刊：博士论文全文链接：http://so.med.wanfangdata.com.cn/ViewHTML/DegreePaper_Y1194727.aspx

[font=宋体]慢病毒构建稳转细胞系的原理主要是利用慢病毒载体将外源基因导入宿主细胞，并实现外源基因的稳定表达。具体来说，构建稳转细胞系的核心是将慢病毒矢量载体导入宿主细胞中，慢病毒载体通常包含病毒的复制和包装组件，以及外源基因的表达调控序列。当慢病毒载体被导入宿主细胞后，它可以利用细胞的复制和转录机制将外源基因插入宿主细胞的染色体中，从而实现外源基因的稳定表达。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]构建稳定的慢病毒转染细胞系是在细胞中稳定表达外源基因的一种有效方法。下面是一般慢病毒构建稳定转染细胞系的步骤：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、选择慢病毒载体： 选择适当的慢病毒载体，通常是一个包含[/font][font=Calibri]LTR[/font][font=宋体]、包装信号、引导[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]序列和多功能质粒载体的质粒。这个载体应该包含要表达的外源基因。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、转染慢病毒包装细胞： 使用慢病毒包装细胞系，例如[/font][font=Calibri]293T[/font][font=宋体]或其他适合的细胞系。这些细胞通常被选择因为它们能够支持慢病毒复制和包装。将慢病毒载体与包装蛋白的表达质粒一同转染进这些细胞中。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、病毒产生和收集： 慢病毒包装细胞会开始产生慢病毒颗粒，这些颗粒包含了慢病毒载体和外源基因。培养一定时间后，收集细胞培养上清液，这是富含病毒的液体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、测定病毒滴度： 对采集的上清液进行病毒滴度的测定，通常可以通过转染一定数量的目标细胞，然后测定这些细胞的感染率来确定病毒的滴度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、转染目标细胞： 将上一步获得的病毒用于转染目标细胞。这些目标细胞可以是要建立稳定转染细胞系的细胞。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、筛选稳定细胞系： 添加适当的筛选物质，例如抗生素，以选择表达了外源基因的细胞。这可以通过在培养基中添加抗生素，使得只有表达了外源基因的细胞能够存活下来。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、单克隆分离： 对稳定表达细胞群进行单克隆分离，以确保每个克隆都来自单一细胞。这有助于保持表达的一致性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]8[/font][font=宋体]、验证表达： 对所得的单克隆细胞系进行验证，确认外源基因的表达水平和稳定性。这可以通过[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Western blotting[/font][font=宋体]等分子生物学技术来实现。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]通过这些步骤，可以建立一个稳定表达外源基因的慢病毒转染细胞系，为后续的实验和研究提供了有力的工具。这种方法常用于基因功能研究、药物筛选和基因治疗等领域。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]慢病毒构建稳转细胞系的优点：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]与常用的转染方法相比，慢病毒构建稳转细胞系有以下几个优点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①高效性：慢病毒能够将外源基因整合到宿主细胞基因组中，实现稳定的外源基因表达。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②特异性：由于慢病毒的感染和复制比较特异，只会影响一定类型的细胞，因此可以实现对具体细胞的选择性转染。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③安全性：慢病毒的基因转移速度较缓慢，对宿主细胞和人体的损伤较小，因此具有较高的安全性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][b]稳转细胞株构建服务[/b][/url]，包含过表达细胞系构建服务和[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]稳定细胞株开发服务，详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service[/font][/font]

[color=#f10b00]今天看了一则同学的个性签名，觉得很有趣~很调侃~~带有些许无奈，但的确真是反映了众多生物人心中的苦楚啊~~[/color]详细内容如下：[color=#0162f4]小时不听劝，长大做实验！小时不听话，长大做转化！小时爱打架，长大PCR！小时爱耍酷，长大建文库！小时不努力，长大提质粒!小时爱偷懒，长大涂平板！小时不学好，长大养细胞！小时不像样，长大作液相！小时爱贪玩，长大做转染！小时爱睡觉，长大做发酵！[/color]

实验室的污染与防治摘要：本文分析了目前我国实验室存在的污染种类及危害，阐明实验室是一种不容忽视的污染源，其污染种类复杂，毒害较大。并针对不同污染提出相应治理办法。同时借鉴国际上相关的管理经验，提出对实验室污染防治措施，推行绿色实验室。关键词：实验室；废弃物；环境污染；治理随着我国科学技术的发展，对各类实验室的需求越来越多，各学科的重点实验室、各学校、各系统内的重点实验室层出不穷。从实验室的分布来看，主要集中在学校（包括各高等院校和中学学校）、科研机构、检测机构和企业中的检验研究部门。企业实验室的污染问题可归纳为企业的环保问题，易于被各级部门重视，企业在处理自身的环保问题时，污染问题也得到相应的处理。而各类实验室多为相对独立的行政单位，区域分散，单个污染少，易于被忽视。我国目前拥有各类高等院校1100所（1999年统计数字），普通高中1.5万所，初中6.3所。科研院所、质检、卫生防疫、环境监测、农林等各级检验机构近20000余个，已成为一个庞大的系统。实验室实际上是一类典型的小型污染源，建设的越多，污染的越大。这些实验室，尤其是在城区和居民区的实验室对环境的危害特别大，因为很多实验室的下水道与居民的下水道相通，污染物通过下水道形成交叉污染，最后流入河中或者渗入地下，其危害不可估量。科学工作者或者未来的科学工作者成了环境的污染者，令人十分遗憾。环境保护是事关可持续发展经济的大战略。在环保面前人人平等，必须本着“谁污染环境，谁负责处理”的原则贯彻执行。实验室的成本核算和对外收费都应包括实验室的环保费用在内。实验室的污染源种类复杂，品种多，毒害大，应根据具体情况，分别制订处理方案。

徐春祥　　（江苏省产品质量监督检验中心所 南京 210029）摘要：本文分析了目前我国实验室存在的污染种类及危害，阐明实验室是一种不容忽视的污染源，其污染种类复杂，毒害较大。并针对不同污染提出相应治理办法。同时借鉴国际上相关的管理经验，提出对实验室污染防治措施，推行绿色实验室。关键词：实验室；废弃物；环境污染；治理随着我国科学技术的发展，对各类实验室的需求越来越多，各学科的重点实验室、各学校、各系统内的重点实验室层出不穷。从实验室的分布来看，主要集中在学校（包括各高等院校和中学学校）、科研机构、检测机构和企业中的检验研究部门。企业实验室的污染问题可归纳为企业的环保问题，易于被各级部门重视，企业在处理自身的环保问题时，污染问题也得到相应的处理。而各类实验室多为相对独立的行政单位，区域分散，单个污染少，易于被忽视。我国目前拥有各类高等院校1100所（1999年统计数字），普通高中1.5万所，初中6.3所。科研院所、质检、卫生防疫、环境监测、农林等各级检验机构近20000余个，已成为一个庞大的系统。实验室实际上是一类典型的小型污染源，建设的越多，污染的越大。这些实验室，尤其是在城区和居民区的实验室对环境的危害特别大，因为很多实验室的下水道与居民的下水道相通，污染物通过下水道形成交*污染，最后流入河中或者渗入地下，其危害不可估量。科学工作者或者未来的科学工作者成了环境的污染者，令人十分遗憾。环境保护是事关可持续发展经济的大战略。在环保面前人人平等，必须本着“谁污染环境，谁负责处理”的原则贯彻执行。实验室的成本核算和对外收费都应包括实验室的环保费用在内。实验室的污染源种类复杂，品种多，毒害大，应根据具体情况，分别制订处理方案。

今天在资讯上看了”实验室污染严重，必须建立有效机制“的报道，心情很是沉重，实验室的污染确实很容易被人忽视，废液直接倒入下水道，有毒有害的药品直接丢入垃圾桶，这样的事情在我们的实验室是天天发生的，我们实验室的无机废液就直接倒入了下水道。我来公司两年了从来没有看到有人收过废液。不知各位同行的实验室有没有类似的现象

http://img1.17img.cn/17img/images/201607/noimg/4272ecc6-ce34-41ab-bae0-9a49bd0eb6c9.jpg　　台湾大学校园内的物理系实验室日前疑发生火灾并有氟气外泄。而南京在去年污染源调查过程中，也发现一些实验室的废水未经处理就直排进入下水道。科硏机构、大学和检验单位实验室产生的污染物排放和处理问题亟待引起各方关注。　　如今，科学技术水平不断提升，各类实验室不断新建。不可否认，实验成果的应用，对推动社会进步、改善人们生活确实发挥了重要作用。但是，实验室产生的污染物往往种类复杂、品种繁多、毒害较大。特别是有些实验人员环境意识薄弱，不能妥善处理废水、废气、废料。例如，有些实验人员尤其是学生，并不清楚含苯系物试剂包装物等属《国家危险废物名录》中的危险废物，应交由有资质处理危险废物的企业处置。此外，各类实验室多为相对独立的事业单位，主要集中在大专院校、科研机构、检验单位等。分布分散，单个污染少，易被忽视，缺少环境监管。因此，应高度重视实验室污染，加强和完善监管。　　首先，要加强对实验室的监督管理。针对各类实验室级别、规模及其产生的污染物特征和防治途经，有关部门应认真开展技术硏究，吸取先进国家实验室管理经验，按照国际标准环境管理体系(ISO14001)规定要求，制定发布操作性强、简便实用的相关实验室管理技术规范，并出台相应的考核要求和办法，将其纳入到实验室建设和管理工作中。相关实验室管理技术规范内容要确定清洁实验技术方法、产生的主要污染物类别和特征、防治措施、管理标准、监测和评价方法等。技监、环保、公安等部门，应依据现行有关法规和标准，加强对实验室的监督管理，防治环境污染。　　其次，要全面推进清洁实验。在保证实验效果的前提下，应尽量使用无毒、低毒和无污染、低污染试剂和药品。实现分质使用、一物多用、循环使用物品，规避采而不测、反复检验、骤增耗材行为，节约实验费用、减小污物产量、防治环境污染。要大力推动技术革新，适时更新实验技术方法，改善实验装置设备条件，提升各种安全防护水平，有效防止各类环境污染，保护技术人员身心健康。要抓大放小，加强大型、综合实验室能力建设，逐步减少小型实验室数量，充分发挥综合检验能力水平，达到精准检验、资源共享、节约费用、环境保护的目的。　　第三，要分质分类处理污染物。实验室产生的废液大多属剧毒、有毒物质，采取适当方法回收利用，不仅可大大降低毒性，便于处理，甚至能变废为宝。比如，用重铬酸钾法测定COD实验产生的废液有毒有害不可随意倾倒。但结合其废液性质，通过还原等措施，回收其中的银元素后，再与其他废水混合处理，就可达标排放。此外，实验室应配套建设污水处理设施，对经过分质预处理后的实验室污水，进行深度有效处理，使其能达标排放。配套建设废气处理设施和排放设施，对实验室产生的废气进行有效处理。同时，建设符合《危险废物贮存污染控制标准》的贮存设施，在规定的时间内，将危险废物交由有资质处理危险废物的单位处置，并正确履行各项手续。要加强放射源及含有放射性物质的废物管理。设置合理卫生防护距离，建设有效安全防护设施，安全防治放射性污染，保护周边居民身体健康。　　“亡羊补牢，尤为未晚”。有关部门和相关单位应积极行动，最大程度上减少科学实验对环境质量和人体健康的影响。

3.3 全面推行绿色化学、清洁实验3.3.1 选择污染少的分析方法在保证实验效果的前提下，用无毒害、无污染或低毒害、低污染的试剂替代毒性较强的试剂，尽量用无毒、低毒试剂替代高毒试剂。在一些特定实验要用到高毒性药品时，一定要用封闭的收集桶收集废液。学校在进行教育实验中，还要特别注意发挥教学多媒体的作用。教学多媒体是知识经济的产物，它是信息社会的标志之一，在实验教学中，计算机辅助教学模拟化学实验（仿真实验）是一种化学试剂和仪器装置“零投入”和“废弃物零排放”的特殊实验方式，它非常适合于演示实验。因为演示实验主要是用于培养学生的观察能力和用于模仿而不是训练动手操作能力的。某些毒害较大的化学实验也可以采用这种方式，从而可防止为了学习一点儿知识而付出高昂的环境代价的作法。[4]3.3.2 改进实验条件，开展推广微型实验[5]在实验中改善实验装置，是有效防止有毒气体逸散、有毒液体外溢的重要举措。一些商品化实验装置的产生可以大大减少实验中化学试剂的用量。微型实验是指在微型化的仪器装置中进行的实验，其试剂用量是常规实验的数十分之一至千分之一。因此，开设微型实验，是节约药品，减少开支，降低实验污染的简便方法。改进实验方法，可以减少试剂使用量。在农残检测中利用固相萃取取代传统的液液萃取，可以大大减少乙腈等有毒试剂的使用，减少污染。3.3.3 成立试剂调度网络过期、失效的化学试剂的处理是世界性的难题。各实验室可以合作成立区域性的试剂调度网，选择一部分危害大，用量少，易失效的试剂进入网络，实行实验室间资源共享，尽量避免大批化学试剂失效，也可节约实验成本。3.3.4 加强地区中心实验室的功能现行的管理体制使各级行政部门都拥有各自小而全的实验室，既浪费了大量资源，又不利于环境保护。应发挥地区中心实验室的作用，集中部分项目，对社会开发。从而达到资源共享，相对降低实验室污染物的排放，对污染相对大的实验室有利于集中治理。3.3.5 一些行之有效的清洁实验行为的实例在满足实验要求的情况下，适当降低采样量；不要购买暂时用不上的试剂；尽量利用可回收的试剂；应使用可降解的无磷洗涤剂；使用酒精温度计从而避免水银温度计可能带来的汞污染。 4 国内外实验室污染治理的现状在国外，有专门的实验室废弃物处理站来集中收集处理。实验室废弃物集中处理站的管理规范、严格，安全环境保护意识极强。专门地点集中、专门房间、专门容器存放，专门人员管理，严格分区、分类，集中送特殊废品处理场处理。各种废弃物由各实验室分类上交后，处理站要对交来废弃物称重后将信息存进计算机，再分类放到规定地方集中。例如，报废放射源、废机油、报废化学试剂、化学合成“三废物”、化学品废弃容器等都分类存放。[6]废弃物集中处理站设计内容周密，设施完备先进，安全可靠。为防止集中后的地下渗漏二次污染，设计时将处理站地下全部用水泥整体浇注。危险化学品、放射源存放在专门房间，还有安全监控、排风系统。废弃物集中处理站的费用由政府每年的经费预算中列支。另一方面，可回收废品被收购后所得资金则用于废弃物集中处理站的进一步发展。目前我国对实验室的污染排放并没有专门的规定，一般参照企业的污染排放标准。实验室在建设或认可验收时会对实验室的废弃物排放提出要求。如气体实验在通风处做，废弃物由专门的环保公司回收等。由于实验室污染种类齐全，情况复杂，多数项目产生的污染量较小，缺乏相应资金，操作起来存在着相当难度，给污染治理带来一定困难。目前除少数一些环保意识强的实验室，没有直接排放废弃物外，多数实验室仅仅把环保放在口头上，废弃物回收协议签在纸上，大量的废弃物仍然直接排放。由于实验室大多数项目只是零星开展，各项目之间的工作频次不均匀，废弃物排放物规律，污染分散，这些也给环保部门监控带来困难。一些环保措施的后处理没有完善，如残液缸满后如何处理，都是一个棘手的问题。 5 结论实验室存在着明显的环境污染，国家有关部门必须完善管理制度，研究解决办法，采取有效措施，努力避免实验室的三废污染。政府部门也应给予资金、政策的支持，建立全面、系统的治理方案，逐步推行，采用合适的方式来妥善处理废弃物，力争问题的最终解决。

这次计量认证，老师提出来了一个问题，氨氮实验会和什么实验交叉污染，当时旁边放了一瓶氨水，就说到可能是总硬度吧，后来整改项里面还真就是这个被提出来了。 那么“氨氮、总氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮”这些含氮的实验是所有有氨水的实验都会污染它们吗？ 在这里还想和大家讨论一下，实验室里面还有那些实验会交叉污染。

最近因为给一些实验室做通风净化工程，去过了一些实验室，现在粗浅的谈一下实验室的污染问题，抛砖引玉，希望能得到大家的响应：一、废气问题因为专业是这一行，所以接触的也最多。一些实验室的废气污染相当严重，一到风机的排放口，就能闻到相当刺鼻的气味。主要有酸碱废气和有机废气。但由于我国没有专门的针对实验室的废气排放标准，一般只能参照工业企业的标准，这个标准是1996年编制的，相当宽松。一般的实验室即使不处理，监测数据也是合格的。另外，实验室排放废气是间歇性的，环保监测很难捕捉到。现在一些单位做废气处理主要是计量认证的要求和被环保举报。现在废气处理的技术已经相当成熟，法律的缺失才是废气污染的主要原因。二、废水废液问题实验室的废水废液污染是相当隐蔽的，废液大部分是稀释后排入下水道，也有用收集罐收集的，但收集后的废液处理费用相当高昂。我只见过一家将收集后的废物交由危险废弃物处理中心处理。现在实验室废水的处理技术除酸碱废水外还不太成熟。主要是污染物种类太多了，量又不确定，处理设备常常顾此失彼，要不然就有二次污染问题。