真空转移

几年前，我所在的实验室刚刚开始利用拟南芥作为模式植物进行基因的分子生物学鉴定。拟南芥这种模式植物种子的获得，转化材料的获得都是非常容易的事情。一开始我采用喷雾的方法进行floral dip的转化，后来听说真空转化转化效率更高，于是我开始四处打听哪个公司有卖真空转化罐。首先，我开始向有真空罐的实验室打听他们的罐子是从哪里买来的，结果得到的结果只有两种：一种是老板从国外带来的，而另一种则是一来实验室就有，不知道从哪里来的。看看从国外带来的那些罐子，在国内也无法找到地方购买。于是我开始在网上搜索，信息十分有限，输入关键词“真空罐”，你会发现几乎没有你想要的类型，要是是工业上用的钢罐，要么是保存食物的玻璃罐，甚至拔罐用的真空罐，几乎很难找到能够用于拟南芥转化的特殊塑料做成的可以抽真空的真空罐。不过呢，功夫不负有心人，我终于在网上查到了一款我可以使用的真空罐，于是我开始四处查找这款真空罐出售的卖家。最终我买到了。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/11/201211131335_403735_1306303_3.jpg打开包装，有一个细节让我至今难忘，也引起我对我们一些民营小企业的一些思考。包装箱里附带着这样的一个广告页。看了这个广告页，我才知道生产我所买的这款罐子的生产厂家，以及他们的主要产品。广告页上最醒目的就是下面一行字：“尊敬的客户：请把本资料转给您的同行，看他们需要哪种型号，拜托！”这是我第一次看到这样的广告。看了这个，我很纠结，我纠结的是我查到这个东西费了我很长很长时间，而公司呢，或许因为没有实力做宣传吧，仅靠这种手把手的宣传来扩大销路。这类产品或许应用范围不是很广，所以宣传的力度并不大，即便今天事隔几年，我在网上对这个公司及产品进行搜索，结果也不过几十条，这无疑更增大了使用者查询的难度。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/11/201211131339_403738_1306303_3.jpg或许这是一种悲哀，是欲购买者的悲哀，亦或更是厂商的悲哀。或许像仪器信息网这样的平台可以帮忙对这类仪器进行一下宣传，架起购买者和厂商之间的桥梁。

微型真空泵，简单得来说是指：具备一进一出的抽气嘴、排气嘴各一个，并且在进口处能够持续形成真空或负压；排气嘴处形成微正压；工作介质主要为气体，体积小巧的一种仪器。例如，将一个密闭容器(开始时，内部是常压100KPa)，接上微型真空泵VAA6005(www.weichengkj.com/VAA.htm)，对它进行持续抽气，最后密闭容器内的气体压力就会低于大气压，达到60KPa的绝对压力。不但如此，经过特殊的技术改进，除了单抽气的微型真空泵外，还可以形成抽气打气两用的微型真空泵(即排气端可以产生比较大的正压)如PCF、FAA系列(www.weichengkj.com/FAA.htm)，用于增压、充气、克服系统阻力等等以及非常独特的水气两用微型真空泵WKA系列(www.wcjx.net/WKA.htm)，它可以用于需要长期空转、干转等等场合，不像一般的水泵空转，或者干转就会损坏泵。正因为抽气口处或者抽排气口可以与外界大气形成压力差，同时不像大型真空泵需要润滑油和真空泵油，不会污染工作介质，而且具有体积小巧、噪音低、免维护，可以连续24小时运转等优点，所以微型真空泵被作为动力装置，广泛用于气体采样、气体循环、真空吸附、加速过滤、汽车真空助力等等场合，在医疗、卫生、科研、环保等领域得到了广泛的应用。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/12/200912041047_187929_1676140_3.jpg[/img]

随着全球对生物技术和生物替代燃料开发的日益重视，使用包含生物材料的流体进行的分析工作也越来越多。无论该种分析涉及血细胞计数还是细菌培养（涉及许多其他生命科学应用），它们都有一个共同点，这就是经常需要将生物样本从一个地方转移到另一个地方。有时这种转移可手动完成（例如手持式移液器），但对高通量的需求持续推动着人们开发更加自动化的技术。目前很多研究人员面临的挑战就是，各种泵送技术对细胞物质造成的负面影响：· 往复泵——生命科学分析工作中最常使用的两种往复泵为隔膜泵和柱塞/注射泵。隔膜泵通常由单向阀和一个柔性膜片（安装在驱动电机轴上）组成，该隔膜通过自身“脉冲”动作推动液体在泵内进出。柱塞/注射泵则将正排量活塞或柱塞与某些类型的旋转剪切阀结合，通过活塞或柱塞的移动推动液体移动。这两种类型的往复泵都会带来细胞活性的问题，这是由于细胞会暴露在较强的真空力和剪切力下。这些力量会使细胞破裂，从而大大降低细胞活性以及进行更长期试验的可能性。此外这两种泵送技术还会造成清洁困难，从而导致样本夹带和交叉污染的可能性增加。· 齿轮泵——齿轮泵通过两个（或多个）啮合齿轮的高速旋转进行工作。随着“主动”齿轮和“从动”齿轮在高速旋转时相互接合，流体也在轮齿间向前移动。由于流体在高速转移时会受到物理应力的影响，因此这种泵送方式会为生物样本带来一些问题。例如轮齿经常会剪切细胞物质，从而导致分析样本或液体失效。此外，由于流体会接触泵的机械部分，样本间的交叉污染也难以避免。目前运用日益普遍的一种泵送技术采用了蠕动泵。蠕动泵通过一系列滚柱，很容易地对软壁管道进行压缩和扩展。该种泵送技术具有维持细胞活性和减少样本间交叉污染的多种优势：· 真空力小——蠕动泵通常采用软壁弹性管道。这种管道很容易被压缩，并可以很快恢复原始形状。蠕动泵使用的滚柱能够在管座下旋转的同时完全压缩流路管道。压缩后滚柱继续移动，管道也会重新扩张至原始形状，形成的低真空则可以在下一个滚柱再次压缩管道前将液体拉进管道。管道重复扩张形成的低真空足以移动液体但不会损害细胞物质。· 剪切力小——蠕动泵可保持相当一致的流量（泵的固有脉动效应除外）并避免流体与泵的机械部件直接接触。这两种特性都能将样本可能承受的剪切力减到最小，并帮助增加样本存活率。· 管道压缩点数量最少——由于软壁蠕动管道仅在有限的点完全压缩，大部分管道保持开放，从而降低了生物材料被压缩和损害的可能性。· 仅使用管道流路——蠕动泵的一个独特设计在于只有管道与被转移材料接触，被转移的材料不会接触泵的机械部分。这将使管道能够在用于不同分析工作前进行清洗、灭菌或更换，从而消除了样本间交叉污染的可能性。滚柱和管座设计也是大部分单通道Ismatec®泵的特色，它们通过滚柱在管座上推压管道。目前的很多泵都采用平面滚柱和管座，而大部分Ismatec单通道泵采用凸面滚柱和有一定弧度的凹面管座。Ismatec的滚柱在接触管道时仅会压缩管道中心，生物材料可通过缝隙进入管道壁以避免受到损害或破坏。（见下图1）http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/01/201701191653_630768_1587_3.jpg为对比此种滚柱/管座设计与其他设计而进行的独立研究清楚表明，该种设计可以同时提高细胞浓度（培养期间）和细胞活性。（见下表1和2）http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/10/201105201109396510_01_1587_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/10/201105201110103059_01_1587_3.jpg蠕动泵也存在需要考虑的一些缺陷，例如泵在工作时经受的压差十分有限。另外管道本身也需要克服一些挑战，例如弹性管道的化学兼容性不够广泛，使用过程中也会发生磨损，从而导致管道在使用期间流量不稳定及/或发生变化。事实上最重要的或许是蠕动泵需要承受脉动，这是其工作过程中的固有现象。脉动流会在离开管道流路时导致液体“喷洒”，另外分析腔内流量的不断变化也会导致实时流量分析无法提供确定的结果。虽然蠕动泵技术的这些局限阻碍了其在一些应用中的使用，但对很多应用—尤其是那些因涉及生物样本而被分类为“生命科学”的应用—蠕动泵是最佳选择。

石墨烯的出现在科学界激起了巨大的波澜，科学家对其应用前景充满希望，但由于石墨烯只有一个或几个原子厚度，所以规模化制备和转移仍是石墨烯研究的一个重大课题，今天借第十一届原创大赛的平台，跟他们一起浅谈下我在学习过程中了解到的石墨烯转移方法。石墨烯的理论性能非常优异，电导率非常高，热导率比一般材料都高两个量级，迁移率能达到硅的100倍，尽管如此，石墨烯产业化还很困难，除去合成的石墨烯性能达不到理论值（因为CVD法合成的石墨烯是多晶的，性能比单晶的还差很多），转移过程对石墨烯的性能影响也很大，较差的转移方法会导致石墨烯性能的大幅下降。由于石墨烯本身很柔软，很薄，超声清洗和接触式清洗都适用，因此，寻求一种干净的转移方法至关重要。目前，最常用的转移方法又两种：一种是应用PMMA作为载体材料将石墨烯转移到目标基体上，这种方法是先将PMMA旋涂在石墨烯上，然后刻蚀掉金属基体，再将石墨烯和PMMA转移到目标基体上，最后用溶剂冲洗掉PMMA，这样会造成PMMA和溶剂残留，且溶剂冲洗会损坏石墨烯，大面积石墨烯也不易旋涂PMMA，金属基底也不能循环利用；另一种方法是roll-to-roll（R2R），即用热释放带（TRT）做短暂支撑，这种方法可转移大面积连续性好的石墨烯，但热释放带上的有机粘合剂会对石墨烯造成很大的污染，这两种方法都是依靠化学粘合力转移石墨烯。转移石墨烯的方法有很多，按照是否刻蚀基底将其分为两大类。[b][b]刻蚀转移法(etch)[/b][/b]虽然此类方法没避免刻蚀，但较传统转移方法有很大的改进，下面介绍三种方法。[b]（1）静电荷法[/b]种方法利用静电力将石墨烯转移到目标基体上，叫做“clean-lifting transfer（CLF）”，它不引入任何类似PMMA的有机基体，省去了将石墨烯先转移到过渡膜上的步骤，直接将其和目标基体利用静电荷吸引结合在一起[sup][/sup]，具体步骤如图1，先用静电发生器（SIMCO，18kv）在目标基体上铺均匀的负电荷，操作时距基体一英尺，然后利用静电吸引将Cu基上生长的石墨烯贴在上面，随后用Fecl[sub]3[/sub]溶液刻蚀Cu基体，刻蚀后用去离子水冲洗掉残留的腐蚀剂，最后用N[sub]2[/sub]进行烘干，就得到单层石墨烯，但由于单层石墨烯没有足够高的面导电性，所以重复步骤A-D可获得多层石墨烯。此外，这种方法还对目标基体进行疏水自组装预处理，可提高其与石墨烯的粘结力，也可减少刻蚀和去离子水冲洗过程中的杂质污染。转移后，用扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜(AFM)、拉曼光谱（Raman）、X射线光电子谱（XPS)对石墨烯进行表征，发现转移后的石墨烯表面质量很高，面积也很可观。[align=center] [img=,493,180]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810240945220391_9944_3495746_3.png!w493x180.jpg[/img][/align][align=center]图1 静电荷法转移石墨烯的过程[/align]此法可实现大面积石墨烯转移，避免了残留过渡膜和有机溶液的污染（直接转移到目标基体上），且层数可控；虽采用自组装预处理减少Fecl[sub]3[/sub]残留，但不能循环利用Cu基体造成成本很高，且多层叠加转移表面的平整性仍需要改进。[b]（2）塑封法[/b] 这个方法是一个国内硕士生发对传统PMMA法进行改进提出的，虽有很多局限性，但想法很好。传统PMMA转移法只能小面积转移，此方法用塑封膜代替PMMA（塑封膜上有一层环氧树脂），解决了大面积不能旋涂的问题，对Cu基上的石墨烯进行压印，特别的是，在Cu基体下垫一层PET，压印时保证平整。压印使用塑封机（如图2（a）），压印后用marbles’ rechant（对石墨烯损伤小且刻蚀速度快，半小时内）将Cu刻蚀掉并用去离子水反复冲洗，减少刻蚀液的残留[sup][/sup]。转移后仅对石墨烯进行了压前压后电阻的测试与比较，对表面质量未进行表征。这种方法结合生活实际，在刻蚀液上和过渡膜上进行改进，且能实现大面积转移；但仍然不能避免Cu基体的刻蚀，就会不可避免地引入杂质，塑封膜虽然解决了大面积转移问题，但去除塑封膜仍会需要有机溶液，所以这种方法仅仅提供了一个较新的思路，还需改进。[align=center][img=,437,483]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810240945453094_1101_3495746_3.png!w437x483.jpg[/img] 图2　（ａ）塑封机　（ｂ）塑封后的石墨烯[/align][b]（3）压敏胶膜法（PSDF）[/b] 如图3所示，这种方法在经典的刻蚀Cu基底-PMMA做支撑膜的方法上做了改变，将PMMA换成PSAF（pressure sensitive adhesive films），因为PMMA是刚性膜，所以保持的Cu的纹理使其与目标基底不能完全贴合，而PSAF有很好的可塑性，可以对其施加均匀压力使石墨烯与目标基底完美贴合，使转移的石墨烯更平整，残留物更少（PMMA难去除干净），操作也很简单，室温就可以操作，因此石墨烯的性质得到了较好的保留，但仍然涉及到Cu的刻蚀，成本较高，也会引入掺杂（刻蚀液）。 [align=center][img=,690,223]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810240946549563_6794_3495746_3.png!w690x223.jpg[/img] 图3 PMMA-PSAF转移石墨烯示意图[/align][align=center]（a） PMMA转移石墨烯过程 （b） PASF转移石墨烯过程[/align][b][b]避免刻蚀转移法[/b][/b]刻蚀的方法不仅浪费时间，而且基体只能用一次，成本高，还会引入FeCl[sub]3[/sub]等刻蚀液杂质，所以越来越多的研究者致力于避免刻蚀的方法，已经有了不错的进展，下面介绍一些比较成功的方法。[b][b]（1）液体聚合物法[/b][/b] 传统的PMMA转移法难以实现大面积转移，且需刻蚀基体，本方法经过改进，可以解决这两个问题。过程简单如图4所示，将液态PDMS注入放有Co基石墨烯的盒子中，去除气泡、固化后进行分离[sup][/sup]。特别之处是通过改变液体聚合物的固液比来控制转移石墨烯的层数（不同固液比粘结力不同），通过四组实验（固液比为2：1、5：1、10：1和20：1）发现，固液比为10：1时转移的石墨烯性能最好，可实现多层石墨烯转移（此时Co基上只留下一层石墨烯）。转移后，用AFM对表面细节进行观察，并用拉曼光谱对表面质量和转移层数进行表征。 [align=center][img=,446,374]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810240947284114_9838_3495746_3.png!w446x374.jpg[/img][/align][align=center]　　　　　　　图4 用液态PDMS转移Co基上生长的石墨烯[/align] 这种方法步骤简介，成本低，不用刻蚀基体，转移的石墨烯质量好，特别的是可控制转移石墨烯的层数；需改进的是去除残留的PDMF和有机溶剂残留。[b]（2）聚苯乙烯膜压印法（PS）[/b] 由字面意思可看出，此方法是用PS和金属基体上的石墨烯进行压印，采用两种设备，分别是晶体真空黏贴机和热压印机，后者较前者更经济实惠，压印时在上下均垫上Si晶片（如图5）。特别地，PS表面进行叠氮处理（涂一层TFPA），可以提高其与石墨烯表面的粘结力，为了更好地涂覆TFPA，对PS先进行等离子处理[sup][/sup]。比较两种设备压印的质量时用到了AFM、XPS、Raman、Micro-Raman，表面质量表征结果都良好。[sup] [/sup][align=center][img=,453,254]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810240947556844_2050_3495746_3.png!w453x254.jpg[/img][/align] [align=center]图5　两种压印机组成　（a）热压印机　（b）晶体真空黏贴机[/align]这种方法重点在于控制压力得到均匀的石墨烯，在不同压力下比较，发现25N时石墨烯可以很好地转移，两种设备转移质量均很好，但晶体真空黏贴机得到石墨烯连续性更好，参与应变较小。[b]（3）CO插排法[/b]这个方法很特别，适用于亚单层石墨烯的转移。其原理是利用CO的部分压力（0-0.6MPA）解耦（如图6），特别是去除四周压力后CO仍存在，以便进行接下来的转移。[align=center] [img=,228,136]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810240948235414_1368_3495746_3.png!w228x136.jpg[/img] [/align][align=center]图6 CO插进Pt和石墨烯之间示意图[/align][align=center] [img=,364,223]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810240948468875_2508_3495746_3.png!w364x223.jpg[/img] [/align][align=center]图7CO插排法转移石墨烯过程[/align] 如图7所示为转移过程：在CO氛围下加压（0.2、0.4、0.6MPA）超过一小时，然后分别用两种方法转移，第一种用PDMS法，第二种用去离子水做剥离剂，发现0.6MPa时转移效果最好。很明显，用去离子水做剥离剂不会引入杂质，但是转移面积较小。转移后用扫描电子显微镜（SEM）和拉曼（Raman）对表面进行观察和表征，发现表面质量很好[sup][/sup]。这个方法巧妙地用去离子水做了剥离剂，这样不会引入其他杂质，但由于水的表面张力会产生过大的压力，不能大面积转移。不可否认的是，这是一个很好地方向，既不用刻蚀基体也不用聚合物膜，能获得纯度很高的石墨烯，所以寻找一种表面张力小的液体也许会解决这一问题，还应考虑的是，CO是一种易燃易爆的有毒气体，操作起来有安全隐患。[b]（4）水泡法[/b] CVD法制得石墨烯后，在石墨烯上旋涂一层PMMA（310nm），烘烤7min（图b），为了剥离时不皱和更容易操作，在PMMA上粘一层Kapton 胶带（3M 5413），再用聚四氟乙烯棒滚压（图c）。然后将粘有胶带的铜基底置于90度的去离子水中2h（图d），这个过程中，去离子水渗入石墨烯和铜箔之间，然后，用镊子轻轻揭下胶带，粘在目标基底上，在140度条件下烘干40min，冷却20min揭下胶带，用丙酮冲洗，去除残胶，最后进行退火（300度下10min，350度下5min）去除PMMA。[align=center][img=,690,367]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810240949142744_2612_3495746_3.png!w690x367.jpg[/img] [/align][align=center]图8 水泡法转移石墨烯[/align] 这种方法转移石墨烯成功的几率可以达到90%，并且石墨烯不会褶皱，也不会引入NaOH之类的杂质。虽然质量不如文献上报道的质量最优的石墨烯好，但之后用刻蚀Cu的经典法和水泡法对CVD法制得的同一批石墨烯进行表征，拉曼光谱验证两种方法均是单层石墨烯（G/2D=0.5），且水泡法的D峰更低，说明引入的缺陷更少，G峰较窄，说明结构紊乱较少。经典法G峰篮移说明其较多P掺杂。此方法操作简便，但依旧涉及到胶带和PMMA，去除干净成为关键问题。[b]（5）电解水法[/b]电解水法转移石墨烯是速度最快的一个方法，引入杂质也较少，所以有很好的发展前途。操作起来也很简单，首先在Pt基上的石墨烯表面旋涂一层PMMA（图9（a）），然后用其做阴极，Pt片做阳极，水溶液中加入NaOH（1mol/L），通入电流后反应开始（图9（b）），几十秒内反应就可以完成，可看见H[sub]2[/sub]气泡将石墨烯/PMMA与Pt基分离（ 2H[sub]2[/sub]O(l)+2e[sup]- [/sup]→H2(g)+2OH(aq)），H[sub]2[/sub]气泡提供一种轻微持续的力，被分离的石墨烯/PMMA被红色箭头标示出来[sup][/sup]。烘干后用AFM和Raman对石墨烯进行观察表征，结果表明表民质量良好。用Cu基底生长的石墨烯，发现Cu会被反应一部分，所以本实验选Pt生长的石墨烯，但Pt的价格又比Cu高出很多，加大了成本。Wang等用Cu生长的石墨烯重复了上述实验（用0.05mol/L的K[sub]2[/sub]S[sub]2[/sub]O[sub]8[/sub]做电解液），由于 Cu(s) + S[sub]2[/sub]O[sub]8[/sub]2-(aq) →Cu2++2SO[sub]4[/sub]2-(aq)，一小部分Cu被溶解，但与此同时生成的CuO和Cu[sub]2[/sub]O（3Cu2+(aq) +4OH-(aq)+2e-→Cu[sub]2[/sub]O(s)+CuO(s)+ 2H[sub]2[/sub]O(l)）会阻止铜基底继续被刻蚀。反应结束后，用AFM检测出被刻蚀的Cu不超过40nm，是很小的一部分，对于厚度25um的铜基底来说，影响不大，可以反复使用，这样就在很大程度上节省了成本，有利于产业化。 此方法反应速度非常快，所以若气泡鼓出的速度过快，会损伤石墨烯，所以应该控制电化学反应速度，也可以像图示那样用镊子夹着慢慢向下放，这样反应就不会过于激烈。为了让石墨烯有更好地支撑，可以在PMMA膜上再加一个轻质支架[sup][/sup]。虽然这种方法简单快捷，但依旧使用PMMA做支撑膜，避免不了残留的PMMA对石墨烯性能的损害。[align=center] [img=,675,233]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810240949421061_194_3495746_3.png!w675x233.jpg[/img][/align][align=center]图9　电解水法转移石墨烯过程[/align][align=left]以上是我在研究石墨烯过程中了解到的石墨烯转移方法，不足之处请大家指出完善，共同交流学习！[/align]