血清细胞囊泡

最近，小贝家分别在北京和广州举办了“细胞外囊泡专题研讨班”，获得老师和同学们空前热情的参与，有的甚至千里迢迢、不远万里专程参加。是什么引起大家如此高涨的参与热情呢？当前研究的热点——外泌体。对于外泌体（又称细胞外囊泡，Extracellular Vesicles），相信大家都不陌生，它是指细胞膜上脱落或由细胞分泌的，具有双层膜结构囊泡状异质性群体，包括外泌体（Exs）、膜微粒（MP）和微囊泡(EVs)。细胞外囊泡和细胞内囊泡，有着相似的磷脂双分子层结构，包含有蛋白和核酸等生物大分子，大小在40nm-1000nm，是细胞进行物质运输、信号转导、实现生理功能的重要工具。细胞外囊泡广泛存在于细胞培养上清及各种体液，参与细胞间通讯、细胞迁移和免疫调节等多种反应。囊泡水平升高与糖尿病、艾滋病以及癌症等疾病相关，有望成为这类疾病的诊断及评估疾病预后标志物。如今，越来越多的研究者开始着眼于对细胞外囊泡进行准确的定型和定量研究。2013年10月7日，诺贝尔生理学或医学奖授予了发现细胞囊泡运输调控机制的三位科学家。外周血中有着大量的外泌体，来自不同的细胞。另外，外泌体和肿瘤微环境、肿瘤细胞迁移有着神秘联系。对于这些未知的领域，目前还缺乏研究，主要原因在于对于这种200nm以下颗粒的检测，显微镜显得力不从心，电镜又高不可及。因此强大的工具和完美的解决方案的显得尤其重要。有鉴于此，我们有幸邀请到了来自 Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School的Vasilis Toxavidis和John Tigges——两位有着丰富的流式细胞术和外泌体研究经验的学者，请他们和国内的学者进行外泌体研究的交流，分享经验。8月24日，首都北京，骄阳似火，然而参加“贝克曼库尔特细胞外囊泡专题研讨班-北京站”活动的老师和同学，有着胜似骄阳的热情，有图为证。现场不得不临时加座，才能满足大家学习和交流的热情。8月29日，羊城广州，骤雨初歇，寒潮来袭，公路上随处可见台风肆略的痕迹，这些却丝毫没有阻挡来自全国各地的40多位老师的脚步。大家齐聚中山大学，热情参与我们广州站的活动。两场研讨班，早上均为报告部分。Vasilis Toxavidis和John Tigges从理论角度讲述了外泌体检测的问题、误区和解决方案；从散射光检测原理、流式细胞仪硬件、再到样本制备，系统的阐述了外泌体的检测，并以实例讲述了心肌细胞源外泌体和红细胞源外泌体的研究结果，提出了Nano Flow Cytometry（NanoFACS）的概念。首先，来自美国哈佛干细胞研究所资源总监、哈佛医学院贝斯以色列女执事医疗中心流式技术平台负责人Vasilis Toxavidis先为大家做了流式分析EVs的技术原理、硬件可行性等方面的报告。Vasilis以MoFloXDP和CytoFLEX为教学案例，深入浅出地讲解，时时博得与会者的掌声，给大家提供了流式在微颗粒检测研究的新思路。随后，美国哈佛医学院贝斯以色列女执事医疗中心外囊泡检测中心主任John Tigges进一步介绍了利用流式细胞术研究细胞外囊泡， 并结合HF患者EVs检测案例，抽丝剥茧，逐一分析如何解决细胞外囊泡检测中问题、缺陷，阐述EVs在疾病研究中的实际意义，使大家茅塞顿开。其幽默的演讲风格也深受老师们喜爱，引得台下提问连连，将整个研讨会推上了小高潮。接着，来自贝克曼库尔特生命科学部的霍德华，讲述了贝克曼库尔特的超高速离心机——Optima XPN在样本制备和外泌体获取方面的完整工作流程。超速离心分离，是从生物体液和细胞培养样品中分离纯化外泌体的黄金标准，可以准确地重复获取外泌体，同时最大限度减少蛋白质聚集体和其他膜离子的共纯化。上午的理论部分结束后，大家对细胞外囊泡检测，超离技术助力样本采集和精准流式技术助力囊泡研究有了全面、清晰、深刻的认识。北京站的实验操作部分，在中科院过程工程研究所的、阵容强大的三台CytoFLEX流式细胞分析仪旁展开。John Tigges和Vasilis Toxavidis现场演示了如何在CytoFLEX上进行外泌体的检测。利用CytoFLEX的WDM技术和灵活的滤光片调整特点，John Tigges轻松实现200nm以下的颗粒检测，并找到外周血中神秘的外泌体。CytoFLEX使用VSSC检测Megamix-Plus微球结果及线性表现：CytoFLEX检测血液中的细胞外囊泡结果：由于FAPD的优势CytoFLEX对颗粒大小的检测保持很好的线性。出众的分辨率不仅能将噪音与细胞外囊泡很好的分开，而且还可以对外囊泡群体进行细分，分别研究其抗体表达情况。广州站的实践操作部分在中山大学北校区医学院实验室进行。大家在两位美国专家的指导下，领略了MoFloAstrios EQ和CytoFLEX精准检测细胞外囊泡的神奇魅力。EVs的大小通常只有40nm-100nm，超出传统流式的检测范围。但MoFlo Astrios EQ的增强型双前向角设计和CytoFLEX的雪崩光电二极管以超高的分辨率和灵敏度，有效地区分噪音信号和检测囊泡。连续五轮操作培训，让操作者切身感受了一把迅速快捷、多参数细胞外囊泡检测。两场培训班内容丰富、实用，而又易于理解。到会的老师和同学纷纷表示获益匪浅。贝克曼库尔特的超高速离心机（Optima XPN）和超灵敏流式细胞仪（CytoFLEX）实现了双剑合璧，为科研工作者提供了完美且可行的外泌体检测解决方案。* 本产品仅用于科研，不用于临床诊断。(此项活动得到中国科学院过程工程所和中山大学的大力协助，特此表示感谢！)

“学科交叉点往往就是科学新的生长点、新的科学前沿，这里最有可能产生重大的科学突破，使科学发生革命性的变化。同时，交叉科学是综合性、跨学科的产物，因而有利于解决人类面临的重大复杂科学问题、社会问题和全球性问题。”--中国科学院院刊 细胞外囊泡（EVs）作为递送载体，已被广泛应用于生化工程学、生物医学工程学、纳米材料学、分子影像学等交叉学科中。通过交叉学科的火花碰撞，利用前沿新技术，提高疾病治疗效果，造福广大病患。本文与您分享EV递送纳米抗氧化剂等应用案例，拓展您的课题研究思路。巨噬细胞EV参与“免疫调控-化学动力-乏氧激活 ”多级联动 2022年3月，深圳市第二人民医院李维平团队联合中国科学院大学化学工程学院魏炜团队共同发表题为“Exploration and functionalization of M1-macrophage extracellular vesicles for effective accumulation in glioblastoma and strong synergistic therapeutic effects”于《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊（IF：18.19）。 被称为“终结者”的胶质母细胞瘤（GBM）是颅内神经系统最常见的恶性肿瘤。临床治疗GBM以外科手术为主，辅助放化疗，但效果收效甚微。难以穿透的血脑屏障 （BBB） 阻止药物进入中枢神经系统，使得治疗难度雪上加霜。因此，亟需更为有效的药物递送策略。 研究人员利用M1型巨噬细胞来源细胞外囊泡（M1EVs），使其膜被两种疏水剂功能化：化学激发源CPPO（C）和光敏剂Ce6（C），并装载亲水缺氧激活原药AQ4N（A），构成的CCA-M1EVs可穿过BBB，并可趋化富集在GBM部位，通过调控巨噬细胞表型实现GBM微环境免疫调控，增加过氧化氢（H2O2）水平。H2O2和CPPO之间可进行反应，产生的化学能量进一步激活Ce6，产生大量活性氧，实现化学激发的光动力疗法（CDT）。由于该反应消耗氧气，肿瘤缺氧的加剧也导致无毒的 AQ4N 转化为有毒的 AQ4 用于化疗。因此，CCA-M1EVs在GBM中实现了免疫调控-化学动力-乏氧激活的多级联动协同作用，发挥了强大的治疗效果。 研究人员利用全自动Digital Western检测M1巨噬细胞和M1EV中CD9、CD81、ALIX、TSG101、iNOS、F4/80和GAPDH的蛋白水平（如上图b所示）。EV递送纳米抗氧化剂 2021年来自中科院过程所魏炜团队，联合上海交大医学院附属同仁医院等多家单位，共同发表题为“In situ growth of nano-antioxidants on cellular vesicles for efficient reactive oxygen species elimination in acute inflammatory diseases”于《Nano Today》期刊（IF：20.72）。 临床上常见的急性炎症疾病，有急性肠炎和急性肝损伤等等。病情严重的患者，会出现脏器功能紊乱甚至器官衰竭。急性炎症过程中，会产生大量的活性氧自由基（ROS）。ROS会引起细胞膜脂质过氧化，导致细胞膜通透性改变和进一步DNA损伤，进而引起器官功能障碍。ROS大量产生是体内炎症发生发展过程中的一个重要环节，因此需要高效手段，将药物富集在炎症部位，然后消灭ROS。 纳米抗氧化剂，例如氧化铈、氧化钼和氧化锰，可借助其催化活性清除ROS，以此减少ROS引发的组织损伤，并控制疾病进展。然而，这些纳米抗氧化剂在炎症组织中的蓄积量较低。研究人员利用红细胞囊泡递送纳米抗氧化剂，效果显著。该项研究的另一亮点是研究人员将具有组织修复功能的干细胞外泌体融合（ReMeV），并在此基础上原位生长氧化铈（shi）纳米晶体（Ce-ReMeV），用于重症急性肠炎和急性肝损伤的治疗，在有效清除ROS同时，还能修复受损组织和器官，在小鼠模型上取得了满意的效果。 研究人员利用全自动Digital Western检测外泌体 Marker（CD9）、外泌体和红细胞Marker（TSG101、HSP70）以及MSC生长因子（HGF）（如上图c所示）。每个样品仅需3μL。全自动Digital Western，为何备受大家的喜爱？ 传统Western Blot（WB）属于劳动密集型技术，时间长、步骤冗长、人为操作引入过多误差，最终导致数据质量低......最重要的是实在太影响心情！图片取材于网络 全自动Digital Western技术平台的横空出世，一扫传统Western带给广大科研工作者的阴霾，每一天都是做WB的良辰吉日，让您从此享受WB！节省出大量宝贵时间去专注于阅读、思考、交流、仰望天空、参与社团、思考人性、（校园恋爱）等更有价值的事务。全自动Digital Western检测全流程（上样后，剩下的一切都交给她，一顿晚饭的功夫拿到结果） 全自动数字式Western，带给您的仅仅是3 μL超微量的上样量？3小时出结果？全程自动化标准化？更重要的是真正数字化的高质量数据和全膜结果，让您的数据不被质疑！撤稿？不存在的！扫码索取全自动Digital Western产品资料解放双手，从此爱上WB，告别实验Emo！

近年来，细胞外囊泡 (Extracellular vesicles，EV)的研究热度正在持续增长，与EV相关的文献数量呈指数级增长，已成为生命科学和生物医学研究领域内的一大热点话题。前不久，国际细胞外囊泡学会（ISEV）发布了最新版的细胞外囊泡研究指南《Minimal information for studies of extracellular vesicles(MISEV2023): From basic to advanced approaches》，在MISEV2014和MISEV2018版本基础上整合了来自ISEV专家工作组和1000多名研究人员的反馈意见，加强了研究设计和实验细节，并为新的应用领域提出了建议和指导。MISEV2023重点对EV命名、样品收集和预处理、EV分离与浓缩、EV表征、EV研究技术方法、EV释放与摄取、EV功能研究、EV体内实验进行了介绍。（文末附全文链接）关于ISEV和MISEV简介MISEV指南由国际外囊泡协会(ISEV)编制，ISEV是研究和使用细胞外囊泡的科学家和临床医生的主要专业协会，通过其年会、专题研讨会和其他会议、同行评审期刊、在线学习平台以及与其他学会的合作，吸引了世界各地的不同研究人员群体。因此，ISEV具有独特的优势，可以指导制定和传播关于最佳实践指南和科学考虑的专家共识。MISEV 2014是ISEV发表的第一篇EV研究指南，旨在为EV研究提供可靠的支撑，MISEV 2018对EV研究发展过程中的方法和手段进行了深入的且批判性的评估，其中大部分内容至今仍然有效。而MISEV 2023与之前的版本一样，为EV研究人员提供了简明扼要的建议和指导，对 MISEV2018 中提出的要点进行了完善，并增加了对新发展领域的建议和指导。其目的是帮助EV研究和应用领域的从业人员针对每个EV来源、类型、研究问题或应用展开最佳实践。关于EV命名MISEV 2023保留了MISEV 2018的EV定义，但删除了2018年使用的“自然释放”的用词（新定义：EV是指从细胞中释放出来的颗粒，由脂质双层分隔，并且不能自行复制，即不包含功能性细胞核），以避免排除了通过细胞培养生产的EV。一般来说，ISEV建议使用通用术语“EV”和该术语的扩展，而不是使用具有误导性的术语，如与难以确定的生物发生途径相关的“exosomes（外泌体）”和“ectosomes（核外颗粒体）”。这两个术语是与假定的生物发生途径有关，需要谨慎使用且需要有强有力的证据。术语“exosomes（外泌体）”是指通过多泡体（MVB）释放的来自细胞内部的EV，而术语ectosomes（核外颗粒体，又称微囊泡Microvesicle、微粒Microparticle）是指细胞膜出芽形成的EV。由于目前大多数EV分离技术不能富集由不同机制产生的EV，且没有外泌体、核外颗粒体或其他EV亚型的通用分子标记。因此，ISEV不鼓励使用基于生物发生的术语，除非对此类EV群体进行了专门的分离和表征。相关术语及定义：EV的收集和预处理样本采集、预处理、储存等因素可能会对EV数量和质量造成影响，MISEV2023对需要注意的一些因素给出了建议。对于不同样本都适用的因素，给出了普适建议，另外也针对细胞培养物（cell culture‐conditioned medium，CCM）、细菌、血液、尿液、脑脊液、唾液、滑液、乳汁、实体组织共计9类EV来源样本的采集及处理给出了具体建议。1.血液血液是EV研究中最常见的生物体液样本，但血液样本面临供体变化、分析前处理、血液中血细胞、血小板、脂蛋白及其他蛋白成分的影响。基于此，MISEV2023对血液样本的收集与处理给出了以下建议：• 相较于其他样本，供体对血液及血液EV的影响较大，因此当收集血液样本时，需详细的记录和报告。• 静脉采血应使用管径较大的采血针，以最大限度减少血小板活化和溶血。为减少细菌和皮肤细胞污染、避免组织因子介导的血小板活化，弃去少量抽到的血液是一种有效的做法（例如，人类抽血时丢弃前面的2-3 mL）。• 选用与下游分析兼容的采血管和抗凝剂。• 采血后，应避免过度摇晃和低温，并尽快处理为血浆或血清，以减少血小板激活和EV释放。• 制备血浆或血清时，应选择能够有效去除血小板但不影响EV的方法。若使用离心法，吸取上清时应从上向下吸上清液，并在沉淀上方保留一定量的血浆或血清，以免干扰沉淀导致血小板释放。• 血液EV的主要污染物/共分离物包括血小板、脂蛋白、溶血产物以及大量可溶性/聚集蛋白，检测时需说明任一污染物。2.尿液尿液是继血液之后第二大用于EV研究的生物体液样本，可以通过非侵入性的方式连续获得大量样本。尿液EV (uEV)研究的挑战源于uEV的来源细胞不同，以及受到液体摄入量、采样时间、饮食、运动、年龄、性别、药物以及健康状况的影响。基于此，MISEV2023对尿液样本的收集与处理给出了以下建议：• 应使用无细胞尿液/无细胞的尿液生物库。• 在适当情况下，报告uEV污染物/共分离成分（THP、白蛋白、其他过滤到尿液中的蛋白）的去除方法和去除效果。• 为实现标准化，收集uEV和非EV尿液（如肌酐、PSA等）数据，用于估计绝对或相对排泄率。3.细胞培养物MISEV2018针对CCM中提出的建议仍然有效，包括但不限于描述培养基的组成和制备，记录生产细胞的特征、细胞培养条件、物理或化学刺激物处理（如果有）、CCM收获的频率和时间间隔及方法、EV分离之前CCM的储存处理。如果细胞来源不是已建立的细胞系，则应报告采集和预培养条件，如酶消化。• 如使用血清或其他添加剂，需说明来源和用量。如果使用的添加剂已经去除了EV，需说明去除方法并评估去除程度（包括稀释，通过离心的方法去除EV时稀释可能是必要的）。• 应将非条件（空白）培养基作为对照进行处理和定性，以评估培养基本身对EV检测的影响。4.细菌细菌EV和细菌来源的多样性，很难就样品类型、预处理、分离、收集和表征给出普适性建议。MISEV2023建议在处理细菌样本时需要注意以下事项：• 除其他培养参数外，细菌培养物收获时需说明细菌生长阶段。• 尽量缩短EV分离/浓缩前的储存时间，尤其是在样本未经过滤的情况下。• 当细菌EV样本来自体内或环境，应考虑宿主EV和环境中非目标EV的影响。• LPS（脂多糖）和LTA（脂磷壁酸）可分别作为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的EV通用标志物，但在许多特定细菌物种中，该特定标志物仍然不可用。• 细菌EV的非囊泡共分离物可能包括毛、鞭毛、噬菌体和蛋白质、脂蛋白和核蛋白复合物。MISEV2023的建议旨在提高EV研究的严谨性、可重复性和透明度，帮助细胞外囊泡研究和应用领域的从业者根据EV来源、EV类型、研究内容、应用方向选择或制定最佳实践方案。需要说明的是，MISEV2023的内容建立在MISEV2014和MISEV2018的基础之上，前两份指南中的指导建议很大程度上仍然有效，读者在参阅MISEV2023时应结合之前的文件。下表列出了可供参考的文章：参考：1.权威发布！细胞外囊泡研究国际指南MISEV2023 2.干货分享|外泌体研究红宝书—MISEV 2023解读（一） 3.MISEV2023解读：全面认识细胞外囊泡附全文：J of Extracellular Vesicle - 2024 - Welsh - Minimal information for studies of extracellular vesicles MISEV2023 From.pdf

细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)/外泌体(exosomes)是几乎所有细胞在其生命活动中分泌的一种具有生物膜结构的纳米尺度的小囊泡。作为细胞间通讯的一种途径，广泛参与并调控着生命机体的多种生理和病理过程(图1)。外泌体独特的物理和生化性质，赋予了这些小囊泡诸多特性，如低免疫原性、良好的生物相容性以及高效的生物屏障穿透能力，使它们在疾病治疗领域备受关注。图1. 外泌体生物发生和分泌示意图来自美国化学协会的学者检索并分析了CAS数据库中EVs在治疗和诊断领域中应用研究的发表情况，统计结果显示干细胞来源EVs(stem cells derived EV, SC-EVs)的相关研究位列第2，其中间充质干细胞来源的EVs(mesenchymal stem cells derived EVs, MSC-EVs)研究热度最高，发表文章数量高达4000篇。图2. 不同细胞来源外泌体在疾病诊断与治疗领域研究的论文情况本期文章，小编对MSC-EVs在疾病治疗、食品以及医美等领域的应用进行了简单综述，并进一步梳理了目前基于MSC-EVs的临床进展。MSC-EVs的疾病治疗研究及其产业化MSC是一种来源于成体组织和器官的多能干细胞，MSC-EVs具备免疫调节特性，且可以促进血管生成，给予细胞保护和抑制细胞凋亡等功能，因此，MSC-EVs在疾病治疗中具有极大的潜力。研究表明，来自MSC-EVs的miRNAs，特别是miR-320C，能够促进骨关节炎软骨细胞增殖。在一项心肌缺血再灌注I/R损伤研究中，携带miR-182-5p的MSC-EVs显示出改善心功能和减少心肌梗死的心脏保护作用，并伴有减少体内炎症反应。另外，MSC-EVs携带的miR-27b可诱导促炎细胞因子的下降，用于治疗脓毒症。当然，MSC-EVs本身可通过表达杀菌肽及抗菌肽如LL-37、人β-防御素2、肝素和脂钙蛋白-2和/或通过免疫调节来治疗传染病。除了直接以天然MSC-EVs作为治疗或者辅助治疗剂外，具有特定组织器官靶向功能的功能化的MSC-EVs也成为新一代研究和探索的重点，以便在治疗疾病时获得更有针对性的特异性。如图3所示，CAS数据库检索2017-2021年外泌体在不同研究领域的论文情况，表明EVs在治疗和诊断领域中应用研究的文章发表呈逐年递增情况，其中，EVs的靶向递送研究稳居C位，数量高达6000+篇。图3. 外泌体在不同研究领域的论文情况及趋势此外，来自美国化学协会的学者收集并总结了部分投身于开发EVs靶向性功能的公司在靶向不同疾病类型的布局，其中癌症、神经系统疾病、肺部疾病和伤口愈合是最受关注的疾病类型（如图4所示)。图4. 有潜力的外泌体治疗公司和靶向的疾病类型来自华南理工大学的研究者们通过疏水插入法将纤维蛋白靶向肽CREKA修饰到MSC-EVs表面，显著提高了MSC-EVs在骨缺损部位的富集和停驻，调节炎症反应和促进细胞成骨分化以实现骨骼组织的修复。该研究表明靶向修饰在骨组织修复中具有很大的应用价值，为提高MSC-EVs的治疗效率提供了一种新的策略。位于美国加州的Aetholon Medical公司另辟蹊径，开发了一款名为Hemopurifier的研究性医疗设备。Hemopurifier将细胞膜分离技术和亲和层析(affinity chromatography)技术结合在一起，可特异性地从血液循环系统中捕捉表面具有特定聚糖修饰的纳米颗粒，而病毒以及肿瘤来源的EVs往往正是通过这些聚糖修饰逃逸免疫系统。Hemopurifier在黏附和捕获表面修饰聚糖的EVs和病毒颗粒的同时，将血细胞再次送回到患者体内。该技术获得美国FDA授予的突破性设备(Breakthrough Device)认定。Aethlon公司已经通过实验证明Hemopurifier能够捕捉多种类型肿瘤分泌的EVs，其中包括乳腺癌、卵巢癌和转移性黑色素瘤。迄今为止，Aetholon Medical已使用该技术用于多种癌种、埃博拉、丙型肝炎、HIV和COVID-19等疾病的治疗。基于MSC-EVs的临床治疗试验EVs的研究已经从实验室开始进入临床阶段。Clinical trials网站数据显示，截至文章发表时共有59个注册在案的基于EVs的治疗项目处于临床试验阶段，其中超过60%的项目为MSC-EVs。如表1所示，排名靠前的研究项目包括肺部疾病(11项临床试验)、SARS-CoV-2感染(9项临床试验)、癌症、心脏病和神经系统疾病(均有4项临床试验)。其中，FDA已授权Direct Biologics公司的骨髓MSC-EVs治疗产品ExoFlo再生医学先进疗法，用于治疗COVID-19急性呼吸窘迫综合征(ARDS)(NCT04657458)。它还在对溃疡性结肠炎(NCT05176366)、克罗恩病和肠易激病(NCT05130983) 、实体器官移植排(NCT05215288)和轻/中度COVID-19(NCT05125562) 进行临床试验。Aruna Biomedical公司正在研究神经干细胞来源的外泌体(neuralstem cells derived extracellular vesicles, NC-EVs)，用于治疗卒中以及其他神经系统和神经退行性疾病，候选基因AB126具有穿过血脑屏障的能力和中枢神经系统特异性。临床前数据表明，NC-EVs在改善测试小鼠血栓栓塞性中风模型中的细胞、组织和功能结果方面比MSC-EVs更有效。表1. 外泌体治疗性临床试验（部分）其他应用：食品和化妆品（医美）此外，EVs在食品、医美等领域的应用也被不断发掘和报道。CAS资源库的检索显示，在过去3年中，与EVs在化妆品和食品中的应用相关的文献数量亦呈现急剧增加趋势(图5)。图5. CAS数据库中与化妆品（A）和食品（B）中外泌体应用相关的文献发表趋势MSC-EVs已被证明在皮肤美容中发挥重要作用，如促进伤口愈合、缓解皮肤老化和防止疤痕形成等方面。源自诱导多能干细胞的EVs能够调节MMP-1/3的表达并增强衰老皮肤成纤维细胞中I型胶原蛋白的表达。而来自脂肪干细胞的EVs能够通过PI3K / Akt信号传导途径促进伤口愈合，并增加成纤维细胞中I型和III型胶原蛋白的数量。多酚、维生素、多不饱和脂肪酸等生物活性化合物是常见的提高营养价值的食品补充剂。然而，它们的生物利用度差、水溶性较差和代谢改变可能会降低它们的效果。借由EVs作为载体，可实现其有效递送。展望干细胞EVs在疾病治疗的赛道俨然已成一匹黑马，但是EVs如何与靶细胞通信，以及如何实现组织器官选择性的潜在机制尚不清楚，而这些机制的研究是开发针对外泌体通讯的有效治疗方法和开发工程外泌体衍生的治疗载体的先决条件。此外，该领域尚无统一的分析表征标准、纯化方法、表征技术及数据分析等的差异都会导致难以获得稳定且批间一致性良好的EVs。这些均是横亘在EVs研究以及产业化道路上的问题。在此过程中，EVs的基础研究以及新分析技术的迭代，有望为干细胞EVs疗法带来新的见解和策略，并可能激发下一代递送系统的设计与开发。截至目前，纳米流式检测技术已经进入由中国研究型医院学会细胞外囊泡研究与应用分会围绕SC-EVs制定的两项全国团体标准中，以及由上海市生物医药行业协会依据协会制定的《间充质干细胞外泌体质量控制标准》(T/SBIAORG 001-2023)团体标准中，NanoFCM将紧跟行业发展，在外泌体大规模生产、纯化工艺和表征质控等过程提供完整的解决方案。参考文献Rumiana Tenchov, Qiongqiong Angela Zhou*,et al.Exosomes – Nature’s Lipid Nanoparticles, a Rising Star in Drug Delivery and Diagnostics[J].ACS Nano 2022, 16, 17802&minus 17846Y W,et al. Requirements for human mesenchymal stem cell‐derived small extracellular vesicles[J].Interdisciplinary Medicine, 2023 1:e20220015.中国研究型医院学会.T/CRHA001-2021人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡[S].全国团体标准信息平台(ttbz.org.cn)中国研究型医院学会.T/CRHA002-2021人多能干细胞来源的小细胞外囊泡[S].全国团体标准信息平台(ttbz.org.cn)上海市生物医药行业协会.T/SBIAORG001-2023间充质干细胞外泌体质量控制标准[S].上海,上海市生物医药行业协会(sbia.org.cn）部分数据来自于ClinicalTrials网站(ClinicalTrials.gov)

2022年12月24日，中国科学院深圳先进技术研究院杨慧课题组的最新研究成果发表在生物医学工程领域TOP期刊Materials Today Bio上。研究团队研发了一种微流控芯片技术，实现了细胞的工程化改造，并显著提高了细胞外囊泡的分泌量。深圳先进院客座博士生郝锐、博士生胡师为该论文的共同第一作者，杨慧为通讯作者，厦门大学萨本栋微米纳米科学技术研究院郭航教授为文章的共同通讯作者。2013年，诺贝尔生理学或医学奖颁发给发现“细胞的囊泡运输调控机制”的三位科学家。囊泡运输构建了人体生理学和病理学过程中的“智慧物流运输系统”，负责细胞间的物质递送和信息通讯。因此，细胞外囊泡被视为重要的生物标志物和天然的运载工具，在智能药物递送、重大疾病精准诊疗等领域展现了巨大的应用潜力。然而在常规培养条件下，供体细胞往往存在分泌效率有限、外囊泡产量低等技术问题，极大的限制了细胞外囊泡的实际应用。为了提高细胞外囊泡的分泌量，常用的技术手段包括分子调控、乙醇处理、pH调节等生化策略，因依赖于生化试剂添加物，易改变细胞生理状态而影响外囊泡的功能性和安全性。为应对这一挑战，杨慧团队提出一种名为“种子SEED芯片 (Small Extracellular vEsicles Developer)”的微流控编辑平台，能够高通量且无损伤的刺激细胞，提高细胞外囊泡的分泌量。“种子SEED芯片”由于借助了微流控芯片技术可在微观尺度精确操控流体的特点，该尺度相当于百分之一的头发丝直径，可以将物理场作用定位到细胞尺度，实现对细胞的高通量且高精度的操控。芯片内部引入“鱼骨型”微结构阵列，机械挤压刺激细胞，增强细胞外囊泡的分泌量，针对不同来源的细胞可实现微结构的特异性开发。研究中采用骨髓来源间充质干细胞作为应用对象，该技术成功使干细胞外囊泡的产量提高了数倍。上述干细胞外囊泡在生物医学研究及临床应用中具有重大潜力，但干细胞有限的扩增能力，极大限制了其分泌外囊泡的数量，为实际应用提出了挑战。此项工作成功构建了大规模生产细胞外囊泡的新范式，并以角膜损伤模型为例，验证了此方法生产的干细胞外囊泡能够显著促进组织修复。未来，基于微流控芯片技术增强细胞外囊泡分泌量的新策略有望发展成为一种平台型工具，并与胞内递送研究相结合，提高细胞外囊泡产量的同时，将具有临床治疗作用的外源物质装载到外囊泡中，为外囊泡装载研究以及精准治疗应用提供新的技术支持。

2022年4月4日，厦门大学颜晓梅团队在Journal of Extracellular Vesicles（IF=26）在线发表题为“Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry”的研究论文，该研究通过纳米流式细胞仪 (nFCM) 可以检测直径小至 40 nm 的单个 EV 和 SYTO 16 染色后 200 bp 的单个 DNA 片段，用于研究单个囊泡处的 EV-DNA。通过同时对单个颗粒进行侧向散射和荧光 (FL) 检测并结合酶处理，本研究表明：(1) 裸 DNA 或与非囊泡实体相关的 DNA 大量存在于由细胞培养物制备的 EV 样品中（超速离心培养基）；(2) 单个 EVs 中 EV-DNA 的数量表现出很大的异质性，DNA 阳性 (DNA+) EVs 的数量在 30% 到 80% 之间变化，具体取决于细胞类型；(3) 外部 EV-DNA 主要定位在相对较小的 EVs 上（例如，HCT-15 细胞系+ EVs 的释放增加，外部DNA+ EVs和内部DNA+ EVs的数量以及单个EVs中的DNA含量均显着增加。这项研究为深入了解 DNA 与EV的关联提供了直接和确凿的实验证据。细胞外囊泡 (EVs) 是由几乎所有细胞类型分泌的纳米级膜囊泡，通过将蛋白质、核酸和脂质从供体细胞转移到受体细胞来介导细胞间通讯。最近的研究表明，EV中存在基因组 DNA、线粒体 DNA 甚至病毒 DNA。通过 DNA 的包装和水平转移，EV 在维持细胞稳态、调节免疫反应和调节肿瘤进展方面发挥着至关重要的作用。最近，基于 EV 中的 DNA (EV-DNA) 开发了用于肿瘤诊断的液体活检测试。尽管已经认识到 EV-DNA 的生物学意义，但对 EV-DNA 的探索较少，许多基本特征仍存在争议，例如 DNA 是否与所有或部分 EV 亚群相关？EV-DNA 是否位于内腔和/或 EV 表面？DNA含量和EV大小之间有什么关系？EV-DNA 是单链 DNA (ssDNA) 还是双链 DNA (dsDNA)？对 EV-DNA 的研究通常通过从 EV 分离物中提取 DNA，然后进行丰度、片段长度和序列评估来进行。通过将 DNase 酶消化与 Fragment Analyzer 系统相结合，研究了 DNA 的相对丰度和定位（管腔内或与 EV 表面相关）。为了阐明 EV-DNA 在 EV 亚群之间的异质性，对分离的 EV 进行 DNA 分析通过密度梯度离心或不对称流场-流分馏已经进行。尽管批量分析能够识别不同 EV 亚群中的 DNA，但结果可能存在争议，因为 EV-DNA 无法与无细胞 DNA 区分开来。由于 EV 的大小和货物含量差异很大，因此迫切需要单粒子技术来破译 EV-DNA 的巨大内在异质性，并将 EV-DNA 与游离 DNA 或其他污染物区分开来。然而，EV 的纳米级粒径（大多数大小一直致力于开发一种高灵敏度的纳米流式细胞仪（nFCM）。它已实现对单个 EV、病毒、二氧化硅纳米粒子和金纳米粒子的光散射检测，分别小至 40、27、24 和 7 nm。对于荧光 (FL) 检测，检测到单个 R-藻红蛋白分子的信噪比为 17，有机染料的检测限确定为三个 Alexa Fluor 532 分子。在本研究中，尝试通过将酶消化与 nFCM 相结合，在单囊泡水平上分析外部和内部 EV-DNA。研究了 DNA+ EV 的百分比以及 DNA 含量分布与 EV 大小、ssDNA 和 dsDNA 之间的区别、EV-DNA 和组蛋白的关联以及抗癌药物治疗后 DNA 含量的改变。通过同时对单个颗粒进行侧向散射和荧光 (FL) 检测并结合酶处理，本研究表明：(1) 裸 DNA 或与非囊泡实体相关的 DNA 大量存在于由细胞培养物制备的 EV 样品中（超速离心培养基）； (2) 单个EVs 中 EV-DNA 的数量表现出很大的异质性，DNA 阳性 (DNA+) EVs 的数量在 30% 到 80% 之间变化，具体取决于细胞类型； (3) 外部 EV-DNA 主要定位在相对较小的 EVs 上（例如，HCT-15 细胞系 外部 DNA+ EVs 的分泌可以通过抑制外泌体分泌途径显著减少； (4) 内部 EV-DNA 主要封装在相对较大的 EV 的管腔内（例如 HCT-15 细胞系为 80-200 nm）； (5) 双链 DNA (dsDNA) 是外部和内部 EV-DNA 的主要形式； (6) EVs 中未发现组蛋白 (H3)，EV-DNA 与组蛋白不相关，(7) 基因毒性药物诱导 DNA+ EVs 的释放增加，外部DNA+ EVs和内部DNA+ EVs的数量以及单个EVs中的DNA含量均显着增加。这项研究为深入了解 DNA 与EV的关联提供了直接和确凿的实验证据。论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.12206

细胞外囊泡是对包括外泌体、微囊泡、凋亡小体等在内的具有封闭膜的非细胞结构的统称。它们可以携带DNA、RNA、蛋白质等生物活性分子广泛参与各种生物学过程，是近些年的研究热点领域。每年有大量研究人员进入这一领域，为了加强国内细胞外囊泡领域的学术交流，提高我国细胞外囊泡研究的整体水平，推进细胞外囊泡研究成果的转化应用，中国研究型医院学会细胞外囊泡研究与应用专委会（CSEV）将于2021年11月5-7日在广州召开“第五届全国细胞外囊泡大会”。大昌华嘉作为仪器应用专家，深耕细胞外囊泡领域多年，针对细胞外囊泡研究应用场景，提供完善的解决方案。在此，我们诚邀各位业界同仁届时莅临展位，共商前沿科技。DKSH展位：B7会议时间：2021年11月5-7日（11月5日报道）会议地点：广东省广州市越秀区寺右一马路2号 珠江宾馆

在现代生物医学研究中，流式细胞术（Flow Cytometry）已经成为不可或缺的分析工具。它能够通过分析单细胞的多参数特性，揭示细胞间的复杂异质性。而在这一领域，流式细胞指纹（Flow Cytometry Fingerprint）作为一种前沿技术，正在为我们揭示细胞微观世界的更多奥秘。本期，我们跟随贝克曼库尔特一同探究流式细胞指纹，特别是在纳米流式领域，CytoFLEX nano凭借其独特的技术优势，正在引领这一领域的进展。 什么是流式细胞指纹？流式细胞指纹是指通过流式细胞术获得的细胞或颗粒的特定光学特征，这些特征包括散射光和荧光信号。每一种细胞或颗粒都有其独特的指纹图谱，这些图谱反映了它们的物理和生物化学特性。通过对这些指纹图谱的分析，研究人员能够识别并分类不同类型的细胞，甚至可以在同一细胞群体中发现不同的亚群。传统纳米流式在细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）领域的挑战尽管流式细胞术在细胞分析中取得了巨大进展，但在传统纳米流式领域仍面临一些独特的挑战。一个主要问题是缺乏免疫分型的共识，并且同时检测的荧光信号非常有限。目前，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）亚群的研究还在起步阶段，并没有像免疫学中那样成熟。免疫细胞可以通过多色免疫分析，利用不同的CD分子的表达谱型（指纹）去定义其亚群，但在EV的研究中，类似的标记和分类标准尚未建立,并且相较于免疫细胞，EV有着更丰富的多样性，可供标记的潜在靶点也更多。 CytoFLEX nano的突破2024年3月份发布的CytoFLEX nano作为一款先进的纳米流式细胞仪（查看：3i流式新品|贝克曼库尔特发布CytoFLEX nano纳米流式分析仪），通过结合散射光和荧光信号的综合分析，显著提高了检测的准确性和灵敏度。CytoFLEX nano纳米流式分析仪品牌：贝克曼库尔特型号：CytoFLEX6荧光通道检测能力，实现精准指纹描述CytoFLEX nano能够同时检测6 个荧光通道，提供更加全面和详细的EV荧光指纹信息。5散射光通道检测能力，释放无限潜力CytoFLEX nano分析仪通过提供5个侧向散射通道扩展了您的研究可能性。通过分析不同散射的比率来研究新群体，而无需依赖染料进行鉴定或分离。这种创新方法不仅提高了实验的灵活性和精度，还为细胞外囊泡研究提供了新的可能性和洞察力。CytoFLEX nano分析仪无疑是未来EV多样性研究的重要工具。高灵敏度，确保捕捉每一个潜在的实验现象与信号在一个细胞外囊泡（EV）上，可能只有10个抗原的拷贝，而目前的流式细胞仪无法测量如此少量的抗原。CytoFLEX nano流式细胞仪的主要优势在于其改进的散射和荧光灵敏度，使得可以测量更小的颗粒并检测低密度的抗原。高阶算法应用：利用Cytobank解析EV“指纹”高阶算法的引入为细胞外囊泡（EV）研究带来了一定的变化。Cytobank平台提供了一系列强大的高阶数据分析工具，如ViSNE、FlowSOM、SPADE和CITRUS，这些工具能够高效解析流式细胞数据，揭示复杂的生物学特征。这些高阶算法在解析EV“指纹”中的应用，使得研究人员能够更精准地解析流式细胞数据，发现传统方法难以识别的细微差异。例如：癌症诊断：利用ViSNE分析癌症患者血液中的EV，发现特定的EV亚群与癌症类型和阶段相关联，为早期诊断和个性化治疗提供了新的生物标志物。心血管疾病研究：通过FlowSOM聚类分析心血管疾病患者的EV数据，识别出与疾病进展相关的特定EV亚群，为疾病机制研究提供了重要线索。免疫监测：利用SPADE分析免疫治疗前后患者的EV变化，揭示免疫反应的动态过程，为评估治疗效果提供了新的视角。差异分析：使用CITRUS对不同病理状态下的EV进行差异分析，发现与疾病相关的特定细胞亚群，帮助识别潜在的生物标志物。von Lersner, Ariana K., et al. "Multiparametric single-vesicle flow cytometry resolves extracellular vesicle heterogeneity and reveals selective regulation of biogenesis and cargo distribution." ACS nano 18.15 (2024):10464-10484.所见即所得，利用CytoFLEX SRT实现分选与分析的相互验证。CytoFLEX nano不仅让研究人员能够在EV分析阶段实现“所见”，更通过CytoFLEX SRT的精确分选功能，将这些识别出的EV亚群进行进一步的分选和深入分析，实现“所得”。这种协同工作流程，确保了数据的准确性和可靠性。CytoFLEX nano与CytoFLEX SRT的结合，为EV研究提供了一个强大的工具组合。前者通过高灵敏度的多通道检测，实现对细胞群体的初步识别；后者则通过精准的分选功能，对这些群体进行进一步的验证和分析。这一协同工作流程，使研究人员能够在分子水平上揭示EV的复杂特征和生物学功能，开拓新的研究领域和应用前景。通过这种多种方法的联动，科学家们能够更全面地理解EV的特性，从而在疾病诊断、治疗和预防中发挥更大的作用。CytoFLEX nano和CytoFLEX SRT的完美结合，真正实现了分选与分析的相互验证，尽可能捕捉到每一个潜在的EV亚群。John Tigges, DirectorFlow Cytometry Core Facility and Center for Extracellular Vesicle Detection, Beth lsrael Deaconess Medical Center“Having all these scatters at hand together with the greater sensitivity gives you the power to ask, what could I do now?lt opens up new research possibilities.“拥有这些散射通道以及更高的灵敏度，让你可以问自己，我现在还能做些什么?这开启了新的研究可能性。” 数据示例通过流式分选验证散射光流式细胞指纹的真实性在细胞外囊泡（EVs）的研究中，准确识别和表征其特性是至关重要的。使用CytoFLEX Nano流式细胞仪，我们能够通过高灵敏度的散射光检测捕捉到EVs的初步指纹信号。然而，为了验证这些散射光指纹的真实性，我们进一步利用CytoFLEX SRT进行精确分选。通过分选前后的对比分析，并使用标准微球验证散射光信号的差异，我们确保了这些指纹的准确性和可靠性。使用CytoFLEX SRT对在CytoFLEX Nano上观察到的不同散射差异信号进行分选，并通过回测确认这些差异的真实存在。同时，CytoFLEX SRT的精确分选功能也得到了验证。 结语CytoFLEX家族和Cytobank的结合，为细胞外囊泡（EVs）研究提供了一个强大且全面的分析工具组合。通过纳米流式细胞术，研究人员能够捕捉到EVs的复杂指纹信号，并通过精确分选技术，进一步验证和深入分析这些信号的真实性。这种多方法学联动，不仅提高了数据的准确性和可靠性，还揭示了EVs在不同生理和病理状态下的潜在作用。高灵敏度的散射光和荧光检测能力，加上Cytobank平台的高阶算法，使得研究人员能够更全面地理解EVs的特性，从而在疾病诊断、治疗和预防中发挥更大的作用。通过这些先进技术的应用，EVs研究已经进入了一个新的纪元，开创了更多的研究领域和应用前景。CytoFLEX nano和CytoFLEX SRT的完美结合，为现代生物医学研究带来了前所未有的便利和创新。未来，我们有理由相信，随着技术的不断进步和应用的不断深入，流式细胞术将继续在EVs研究中发挥关键作用，为生命科学的探索开辟更多可能性。贝克曼库尔特CytoFLEX SRT桌面型流式细胞分选仪品牌：贝克曼库尔特型号：CytoFLEX

肿瘤微环境（TME）影响患者对免疫治疗的响应度。携带大量生物活性分子的细胞外囊泡（EVs）可以在细胞间传递信号并重塑 TME。因此，在制定抗肿瘤治疗策略时，应综合考虑 EVs、TME 和免疫细胞之间复杂的相互作用。2022年5月，上海交通大学医学院附属第九人民医院陈万涛/严明团队，在Journal of Extracellular Vesicles（IF=26）在线发表题为“CD73 in small extracellular vesicles derived from HNSCC defines tumour-associated immunosuppression mediated by macrophages in the microenvironment”的研究论文，该研究表明头颈鳞癌细胞来源的小细胞外囊泡（sEVs）运载的 CD73 可以重塑 TME 并促进肿瘤进展、介导免疫逃逸。研究内容解析【1】 HNSCC 细胞来源的 sEVs 中高表达 CD73从原代培养的头颈鳞癌（HNSCC）细胞及配对正常黏膜细胞上清中分离 sEVs。蛋白组学分析显示，与正常黏膜细胞相比，HNSCC 细胞来源的 sEVs 中高表达 CD73（图 f-h）。图1 | HNSCC 细胞来源的 sEVs 中高表达 CD73【2】HNSCC 源 sEVs-CD73 被巨噬细胞内化以促进 HNSCC 进展CD73 是由 NT5E 基因所编码的一种膜结合形式的外核苷酸。TCGA 数据分析表明，NT5E 基因在包括 HNSCC 在内的多种肿瘤中高表达，并且与 HNSCC 患者较低的总体生存率密切相关。免疫组化结果显示，CD73 在 HNSCC 肿瘤组织中高表达，并且与患者不良预后和高淋巴结转移率相关。免疫浸润分析表明，NT5E 表达与巨噬细胞密切相关（图 c），免疫荧光结果也表明 CD73 与巨噬细胞共定位（图 d-e）。进一步分析显示，高 NT5E 表达、高巨噬细胞浸润的 HNSCC 患者总体生存率最低（图 f）。图2 | sEVs 中的 CD73 与肿瘤相关巨噬细胞和 HNSCC 恶性进展密切相关小鼠移植瘤注射 sEVsCD73，结果显示 sEVsCD73 主要与巨噬细胞共定位（图 h-i），表明 sEVsCD73 被巨噬细胞吞噬。同时体内实验结果表明（图j-n），肿瘤细胞来源的 sEVs 可以重塑引流淋巴结微环境，形成利于肿瘤转移的转移前微环境，sEVs 携带的 CD73在这一过程中发挥重要作用。【3】sEVs 通过 CD73 调节巨噬细胞介导的免疫抑制与对照相比，与肿瘤细胞共培养的巨噬细胞中 CD73 表达水平上升（图 b）；而与 RAB27A 敲除以抑制 sEVs 释放的细胞共培养的巨噬细胞相比，其 CD73 含量与正常对照组相当（图 b），表明 CD73 主要通过 sEVs 运输。sEVs 中 CD73 的水平会影响 CD73+ 巨噬细胞的比例，使其随着共培养体系中 sEVsCD73 的累积而增加。当 sEVsCD73 被巨噬细胞内化后，其吞噬作用明显增强（图 c），同时分泌促癌炎性细胞因子 IL6、IL10、TNFα、TGFβ 能力显著增加（图 e-f），预示 CD73+ 巨噬细胞具有更强的促瘤作用。流式分析显示（图 h），sEVsCD73 使巨噬细胞免疫检查点（PD-1，PD-L1，LAG3等）表达上调，表明 CD73+ 巨噬细胞可发挥更强的免疫抑制能力。图3 | HNSCC 细胞源 sEVs 中 CD73 对巨噬细胞功能的影响【4】sEVs 中的 CD73 在体内促进免疫逃逸并促进肿瘤进展接下来评估 sEVsCD73在介导体内免疫抑制和肿瘤进展中的作用。与对照组相比，Rab27a 敲除组（SCC7Rab27aKO）的小鼠肿瘤生长速度慢、肿瘤偏小，表明 sEVs 可促进肿瘤进展。然而，注射外源性中高表达的 CD73 的 sEVs（sEVsSCC7-Nt5eOE 和 sEVsSCC7）则会显著促进肿瘤的发展，但 NT5E 敲除的 sEVsSCC7-NT5EKO并没有此作用（图 b-d）。结果表明 sEVsCD73 在 HNSCC 的进展中具有重要的作用。同时，流式分析显示，sEVsCD73 可招募巨噬细胞、Tregs 细胞，而 CD8+ T 细胞浸润数目减少。此外，在瘤内注射了含 CD73 的 sEVs 后，这些免疫细胞尤其是巨噬细胞表面 CD73、PD-1 的表达水平均有所增加。该体内实验结果提示，sEVsCD73 可诱导免疫抑制，从而促进肿瘤细胞免疫逃逸。图4 | sEVs 中敲除 CD73 可拯救免疫抑制并抑制了体内肿瘤生长【5】携带 CD73 的 sEVs 通过激活 NF-κB 通路调节巨噬细胞功能对经过 HNSCC 源 sEVs 处理的 M2 巨噬细胞进行转录组测序。利用韦恩图分析M2+HNSCC 源 sEVs（M2+sEVs）相对于对照组 M2 上调的基因，以及 M2+CD73 敲除的 HNSCC 源 sEVs（M2+sEVsNT5EKO）相对于 M2+sEVs 下调的基因。通过对两组差异基因取交集，筛选出了共 143 个可能受到 sEVsCD73 调控的候选下游基因（图 a），而 NFκB1 是与这些差异表达基因最为相关的转录因子（图 b），富集分析也显示 NF-κB 通路富集最为显著（图 c）。进一步实验显示，sEVsCD73 可以显著促进 p65 在巨噬细胞细胞核内积聚（图 f），激活NF-κB 通路，并促进下游基因转录。图5 | sEVs 中 CD73 通过 NF-κB 通路调节巨噬细胞的免疫功能【6】sEVsCD73 是抗 PD-1 治疗潜在的检查点和治疗靶点从 HNSCC 患者血清中分离 sEVs，ELISA 检测显示其 CD73 含量高于健康人血清 sEVs（图 a-c）。并且高水平的循环 sEVsCD73 可能预示着更高的淋巴结转移率和更大的肿瘤大小（图 d）。为研究 sEVsCD73 在抗 PD-1 治疗中的作用，通过体内实验进一步评估 sEVsCD73 敲除联合抗 PD-1 药物对小鼠头颈鳞癌的治疗作用。当 sEVs 中 CD73 敲除时，PD-1抗体的治疗效果发生明显的改善（图 f-h）。将瘤组织取出并进行流式分析，在接受抗 PD-1 药物后，巨噬细胞、Tregs 细胞的浸润数量有所下降，CD8+T 细胞的数目增加。同时，免疫细胞表面的 CD73 和 PD-1 表达下降，说明免疫抑制的现象有所缓解。这一现象在 RAB27aKO+anti-PD-1 组最为显著，说明抑制肿瘤细胞的 sEVs 释放会提高抗 PD-1 逆转免疫抑制的效率。然而在加入外源性的 sEVsCD73 后，巨噬细胞、Tregs 细胞的浸润数量明显上升，CD8+T 细胞的数目减少。此外，免疫细胞表面的 CD73和 PD-1 表达上升，表明 sEVs CD73 显著抑制了抗 PD-1 药物对免疫应答的重激活作用。以上结果表明，肿瘤细胞源 sEVs 携带 CD73 通过 TAM 介导免疫抑制并减弱抗 PD-1 的治疗效果。sEVsCD73 可用于预测 HNSCC 的转移，是潜在的 HNSCC 抗 PD-1 治疗的联合免疫治疗靶点。图6 | sEVsCD73 可减弱抗 PD-1 治疗敏感性原文链接：https://doi.org/10.1002/jev2.12218

时间：2017年8月10日 19:30 - 20:30内容简介：细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从40nm到1000nm不等。细胞外囊泡广泛存在于各种体液中，由于其携带多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等物质，会参与到细胞通讯、迁移、免疫调节、组织再生等多种生理过程中，而成为目前的研究热点。对细胞外囊泡进行准确的定性、定量、分离及后续研究是目前主要的研究手段。目前关于细胞外囊泡研究的方法众多。而流式细胞术以其高速、高灵敏、高通量、多参数、可定量的特点，成为目前对细胞外囊泡的非常出色的检测方法。同时，带分选功能的流式也可以让您达到很好的分离效果。本次在线讲座，我们邀请了贝克曼库尔特生命科学部中国区流式产品经理周昱曦博士为大家介绍流式细胞术在微小颗粒检测方面的发展，以及使用流式细胞术对细胞外囊泡进行检测的流程介绍、优化以及相关的注意事项。主讲人简介：周昱曦 博士产品经理 贝克曼库尔特生命科学部贝克曼库尔特生命科学部中国区流式产品经理，负责非临床流式的产品管理工作。毕业于中山大学中山医学院。具有10年以上流式细胞分析、分选仪操作经验，从事流式应用支持、应用开发、市场推广超过5年。对科研流式应用及开发、仪器原理及特性拥有丰富经验。点击此处轻松报名。

五月的天气多了些燥热，空气里弥漫着太阳爆裂的味道，贝克曼库尔特的细胞外囊泡研讨班活动正在武汉、成都和深圳如火如荼的展开。具有双层膜结构囊泡状异质性群体的细胞外囊泡，参与多种生理和病理过程，细胞外囊泡研究显示出巨大的临床应用前景，来自美国哈佛干细胞研究所的Vasilis Toxavidis和美国哈佛医学院贝斯以色列女执事医学中心的John Tigges，两位有着丰富的流式细胞术和外泌体研究经验的学者辗转三地，和当地优秀的科研工作者们面对面的交流，迎来了一场场流式细胞术与细胞外囊泡研究的学术盛宴。5月24日 武汉站 武汉是细胞外囊泡检测研讨班第一站，九点的江城正为繁忙的道路拥堵而苦恼，前来听课的老师络绎不绝，早早赶到会场等待。在酷炫的武汉生物技术研究院的报告厅里，Vasilis和Toxavidis分别作了检测囊泡流式性能分析和流式检测细胞外囊泡的经验分享，贝克曼库尔特公司的全国离心机产品经理霍德华和流式应用专家刘飞分别介绍了超速离心技术及流式细胞术在外泌体研究中的经典应用。一张张投射在液晶屏上的PPT画面， 让听课老师们都表现出极大的热忱，流式与囊泡研究的碰撞，激发出思想的火花。下午的实验部分，各位老师利用CytoFLEX流式细胞仪，直接体验了一把将理论转化为实验结果的惊喜。5月26日 成都站天府之国的成都是研讨会的第二站，原本容纳一百多人的香格里拉酒店演播厅却提前出现“人满为患”的状况，后来不得不在走廊上额外添加座位。上午四场讲座，两位美国专家Vasilis Toxavidis和John Tigges的演讲引来台下老师阵阵掌声，大家踊跃提问解除心中疑惑；华西医院莫显明主任和张文庚副主任结合自己实验室优势分别作了标准化流式细胞术和肺单细胞图谱研究现状与发展的报告，将活动推向了高潮，在座的老师们深深体验到流式的博大精深。而下午的圆桌讨论，老师们根据自己的研究领域，参加不同的讨论小组，交流了解流式细胞术在不同领域的应用，老师们在热烈讨论中收获了满满的流式干货。5月28日 深圳站“长风逐细浪，大鹏入九天”，活动的最后一站来到了珠江三角洲的经济与科技前沿阵地深圳，世界瞬息万变，科学研究日新月异，促进了当地老师们对新技术的渴望。在深圳麒麟山庄报告厅，Vasilis Toxavidis和John Tigges介绍分享了利用流式手段检测100 nm的外泌体，让大家对流式技术又有了深入的认知，为大家打开了流式检测外泌体的大门。来自南方科技大学的黄巍副教授从es细胞转移研究的角度介绍了相关流式应用，南方医科大学的郑义教授则从干细胞研究角度介绍了流式的应用，贝克曼库尔特CytoFLEX系列流式细胞仪以其高灵敏度高分辨率成为广大研究者的不二之选。三场细胞外囊泡学术活动场场爆满，座无虚席，大家在轻松愉快的环境里领略了流式技术不同的风景，了解了贝克曼库尔特流式细胞仪在微颗粒检测中的独秀之美。此次活动的圆满结束，更加激励贝克曼库尔特坚定根植于广大客户的科研需求，不断发展创新，来年我们再约！* CytoFLEX流式细胞仪仅用于科学研究，不用于临床诊断。

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为蛋白质、mRNA、miRNA、脂质等信息物质在细胞间转运的载体, 是细胞与细胞间通讯的重要媒介，参与大量正常生理和病理过程，包括感染性疾病、自身免疫性疾病、心血管和其他炎症性疾病、癌症和凝血障碍等，因此研究EV在人类健康和疾病中的作用具有重要意义。EVs常分为三类外泌体 (30-150 nm) ，在胞体内区室中形成多囊泡小体，随后与质膜融合后从细胞中释放。微囊泡或微粒 (100-1000 nm) ，这是质膜起泡/出芽以及随后从细胞中释放的结果。凋亡小体 (1000-5000 nm) ，由凋亡细胞释放。目前还没有特异性标记物可以最终鉴定不同类型的囊泡。因此，我们把这些小的生物颗粒统称为细胞外囊泡。细胞外囊泡示意图EVs检测研究表明，不同疾病状态下，组织器官释放到体液中的EVs的数量及所包裹的物质是完全不一样的，因而通过检测分析EVs的特性即可对相关疾病进行精准诊断、预后判断及指导治疗。EVs具有尺寸小、异质性高且数量巨大等特点，一直以来，检测灵敏度都是EVs研究中的一个重大挑战。虽然一些关于EVs的检测是利用传统流式细胞术开展的，但也暴露出了明显的局限性，一方面由于传统流式仪器更适用于检测细胞，而细胞表面结合的荧光分子数量远远多于EVs表面；另一方面，一些传统流式仪器在检测小于500 nm单个颗粒上表现吃力。因此，想要准确的检测EVs，就需要更强大且具备高通量功能的检测工具。Amnis® 成像流式的技术优势近年来，随着Amnis® 成像流式技术的发展，越来越多的研究利用这项技术解决了EVs检测这一难题。Amnis® 技术的核心是使用时间延迟积分CCD (TDI-CCD)进行信号检测。与光电倍增管(PMT)相比，CCD具有更大的动态范围、更低的“噪声”和更高的量子效率，使其更适合测量微弱信号。与传统流式细胞术相比，这种方法信号整合时间更长，噪音低，灵敏度大幅增加，对研究EVs具有独特的优势。Amnis® 技术EVs应用案例分享以下研究体现了Amnis® 成像流式技术在小颗粒检测中的高灵敏度特点。检测脂质体和微球流式技术对比用常规流式技术 (A-B)和成像流式技术 (C-D)获得的200 nm大小的荧光标记脂质体和不同尺寸的聚苯乙烯珠(220、450、880和1300 nm)。Amnis® 成像流式可以清晰地分辨出缓冲液背景信号(灰色)以上的所有脂质体(粉色)，而常规流式仅能通过荧光分辨出一小部分脂质体。健康人类供体的血浆微粒检测(a)从6名健康供体中获取无血小板血浆，并使用CD235(红细胞)、CD41(血小板)、CD45(白细胞)和CD146(内皮细胞)标记物进行染色以确定微粒细胞的来源。(b)利用CD14(单核细胞)、CD66b(中性粒细胞)和CD3(淋巴细胞)标记物进一步对白细胞微粒进行表型分析，以确定其来源细胞。下方是图库中事件的代表性图片。(c)表为N = 6例供体的绝对计数±SEM。如图所示，Amnis® 成像流式技术可实现不同来源的外泌体的精准鉴定与计数。单核细胞内化外泌体检测(a)用Amnis® 成像流式技术分析PKH67标记的外泌体。BF和FITC荧光图像(E)所示。(b) PKH67预标记外泌体与外周血单个核细胞共孵育。使用Amnis® IDEAS® 软件内化功能测量外泌体的内化程度。Amnis® 成像流式技术不仅实现了PKH67标记的外泌体鉴定，同时也实现了单个核细胞内化外泌体检测，且呈现直观图像佐证结果准确性。小结综上，Amnis® 成像流式技术做到了真正意义上的流式数据可视化。既具备传统流式可大量检测样本的特点，又利用高灵敏度TDI-CCD技术针对每个检测到的外泌体颗粒进行成像，并可通过海量形态学数据分析EVs与亲本细胞或靶细胞间的相互作用。Cytek® Amnis® ImageStream® x Mk II 成像流式细胞分析仪以上研究均通过 Cytek® Amnis® ImageStream® X Mk II 仪器完成。通过将流式细胞术的表型分析能力、高速度和高灵敏度等优势，与荧光显微镜技术在细胞形态学细节的洞察力和针对细胞功能研究的深度有机结合在一起，Amnis® ImageStream® XMk II 平台可高速获取每个细胞的多个图像，包括明场、暗场 (SSC) 和多达 10 色荧光标记。ImageStream® X Mk II 通过高分辨率成像，可以定位荧光蛋白表达位置（细胞膜、细胞质或者细胞核），实现超乎想象的广泛应用需求。技术特点应用广泛：样本利用率高达 95%，可以更高效的方式分析稀有细胞。简单易用：简单友好的用户界面，可实时观察全部细胞图像和统计学数据。配置灵活：最高可升级至 6 根激光器。功能强大：提供数百种量化成像分析参数，实现无与伦比的广泛应用。参考文献：Erdbrügger, Uta, and Joanne Lannigan. "Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques." Cytometry Part A 89.2 (2016): 123-134.Headland, S., Jones, H., D'Sa, A. et al. Cutting-Edge Analysis of Extracellular Microparticles using ImageStreamX Imaging Flow Cytometry. Sci Rep 4, 5237 (2014). https://doi.org/10.1038/srep05237.Clark, R. Imaging flow cytometry enhances particle detection sensitivity for extracellular vesicle analysis. Nat Methods 12, i–ii (2015). https://doi.org/10.1038/nmeth.f.380.Gurunathan, S. Kang, M.-H. Jeyaraj, M. Qasim, M. Kim, J.-H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells 2019, 8, 307.https://doi.org/10.3390/cells8040307.

2022年（第六届）细胞外囊泡基础与临床转化研究高峰论坛于8月19-20日在南京长江之舟华邑酒店成功召开。开幕式由大会共同主席、东南大学医学院院长刘必成教授主持。南京江北新区生命健康产业发展管理办公室副主任罗书琴、大会主席国际细胞外囊泡学会教育委员会执行主席、南方医科大学南方医院郑磊教授，会议学术顾问清华大学尹航教授出席开幕式并发表热情洋溢的致辞。会议上，大昌华嘉科学仪器部应用专家—李亚威围绕细胞外囊泡领域进行了广泛的学术交流和研讨，针对细胞外囊泡领域应用场景，提供完善的解决方案。并于会后与参会嘉宾们就会议主题进行更深一步的学术探讨。本次展出的纳米颗粒追踪分析仪ZetaView可谓是备受瞩目，由大昌华嘉科学仪器部所提供的专门用于表征纳米颗粒的粒径分布、数量浓度、zeta电位等信息的经典NTA技术手段。尤其是在细胞外囊泡（EV）研究领域，它不仅可以测定EV样品的粒径、浓度、zeta电位等信息，还可以通过荧光标记的方式，完成EV样品的纯度检测、Colocalization检测等。另外，ZetaView因其测试速度快、操作简便、易于维护等特点，极大地提高了用户的工作效率，备受用户认可。在为期两天的会议中，大昌华嘉向参会嘉宾们展示了外囊泡研究中所需要的先进设备及最新的解决方案，为后续的外囊泡研究提供了诸多实用可靠的依据，拓宽了广大研究者的思路。本次大会的成功召开为将来外囊泡研究注入了强大动力，期待不久的将来外囊泡研究取得更加突破性的进展。

作为动态生物分子，蛋白质在肿瘤产生和发展过程中会发生丰度和结构的变化。与肿瘤发生关联的蛋白质异质性为阐明癌症发病机制提供了诊断信息，因此特异性蛋白是肿瘤诊断和药物设计的重要生物标志物。小细胞外囊泡（sEV）是由细胞释放的纳米尺度（直径30–200 nm）的膜囊泡。来自源细胞的蛋白质、核酸和脂质等与肿瘤产生发展相关的生物载物可以选择性地包装到sEV中，并通过膜融合和内吞作用等生理途径传递到受体细胞，影响受体细胞的生理功能，进而促进肿瘤的发生和发展。图 1 细胞外分泌囊泡的提取和纯化由于肿瘤来源sEV中的蛋白质异质性与肿瘤的恶性程度相关，并反映了肿瘤进展和转移的能力，因此对sEV蛋白组分的研究，有助于阐明sEV在肿瘤转移和侵袭中的作用，并促进体液活检的发展和癌症标志物的开发。传统蛋白质组学仅限于获得肿瘤细胞衍生的sEV族群的蛋白质表达信息，其在用于研究单个sEV蛋白组分时缺乏分辨率和灵敏度，特别是对蛋白质结构信息的获取。因此单个sEV的分子分析和异质性评估在技术上仍具有挑战性。光学表征提供了无损、快速、非侵入性的便捷探测手段研究蛋白质的组分和结构信息，然而由于远场光谱学的微米级光斑与百纳米级sEV直径之间的尺寸差异，使得远场光谱技术仅限于开展对sEV族群的大样本分析，其检测灵敏度和特异性受到sEV的异质性和sEV纯化挑战的影响。针对单个sEV蛋白组分分析的瓶颈，中国科学院物理研究所/北京凝聚态物理国家研究中心L04组陈佳宁研究员，SM4组叶方富研究员与国家纳米科学中心朱凌研究员、杨延莲研究员、王琛研究员和中国科学技术大学附属第一医院马小鹏副主任医师合作。利用自搭建纳米红外光谱系统（nano-FTIR）的10 nm尺度红外光场局域增强，在蛋白质酰胺I带（1600–1700 cm-1）和酰胺II带（1510–1580 cm-1）的指纹光谱频段内，通过对直径160–200 nm，高度为50–60 nm的单个sEV开展原位红外指纹光谱研究。图 2 单个细胞外分泌囊泡的近场红外成像和原位红外吸收光谱结合酰胺I带吸收频率对蛋白质骨架结构的高度敏感性，通过对健康和不同恶性程度细胞来源的单个sEV的红外光谱进行统计分析发现由于蛋白质中的C-O键和氨基酸C-OH基团中的氢键随着癌症的发展遭到破化，酰胺I/II吸收比值随着sEV来源细胞系的恶性程度增加而增加；高恶性癌症细胞来源sEV中蛋白质二级结构α-螺旋+随机卷曲的含量发生显著下降，反平行β-折叠+β-转角显著增加，这种蛋白质二级结构的改变一方面与癌细胞来源sEV在癌症发展演化起到的生理功能有关，另一方面在癌变细胞中富含β-折叠+β-转角的蛋白质的生物合成消耗更多的能量，癌症中线粒体异常的有氧糖酵解表现出异常能量代谢（即Warburg效应）在癌症的发生和发展中起着至关重要的作用，而癌变细胞来源sEV中β-折叠+β-转角含量增加带来的更多能量消耗是Warburg效应的一种表现。图 3 单个细胞外分泌囊泡的蛋白指纹光谱作为癌症恶性程度的指标作为临床应用的探索，进一步分析了从两名乳腺癌患者的原发肿瘤组织中提取的sEV（I期，无转移；IIB期，有淋巴结转移）。相较于无转移患者来源的sEV，淋巴结转移患者的α-螺旋+随机卷曲比例显著降低，分子间反平行β-折叠+β-转角比例显著提高，病人组织来源sEV蛋白质二级结构占比的变化与细胞来源的sEV中的结论一致。研究结果显示了nano-FTIR在单个sEV分子鉴定的优势，证明了sEV蛋白异质性在癌症检测和肿瘤恶性评估中的意义和临床价值，为基于sEV的nano-FTIR分子指纹谱识别的癌症诊断提供了体液活检解决方案。图 4组织来源细胞外分泌囊泡的蛋白指纹光谱区分无转移和淋巴结转移的乳腺癌患者国科温州研究院博士后薛孟飞（中国科学院物理研究所毕业）和清华大学博士叶思源（国家纳米科学中心联合培养）为共同一作。陈佳宁研究员和国家纳米科学中心的朱凌研究员、杨延莲研究员为共同通讯作者。相关工作近期以“Single-vesicle Infrared Nanoscopy for Noninvasive Tumor Malignancy Diagnosis”发表在《JACS》杂志上，上述研究工作得到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金、中国科学院战略性先导科技专项、中国博士后科学基金和中国科学院青年创新促进会的支持

近期，复旦大学研究团队在《ACS Nano》上发表了题为“Sequentially Triggered Bacterial Outer Membrane Vesicles for Macrophage Metabolism Modulation and Tumor Metastasis Suppression”的研究，证实了定向调节巨噬细胞的可能性，同时该团队开发的递送系统可实现对肿瘤微环境中不同类型细胞的靶向调节作用。　　肿瘤微环境中不同类型细胞代谢过程存在异常，许多研究尝试通过调节肿瘤细胞和其他细胞在肿瘤微环境中的代谢途径来抑制肿瘤生长。细菌外囊泡因其外泌体样结构，可作为核酸药物的载体被巨噬细胞吞噬，从而完成对巨噬细胞的基因靶向治疗。基于此，该团队设计了一个以细菌外囊泡为载体的化学药物与Redd1-siRNA的共递送系统。同时，研究人员通过在细胞外囊泡表面增加甘露糖修饰以加强对M2巨噬细胞的靶向作用。通过乳腺癌模型，该团队观察到巨噬细胞活化、肿瘤免疫激活和肿瘤微环境重塑等现象，证明该系统具有较大的研究潜力。　　该研究初步实现了对肿瘤的定向共递送作用，为后续肿瘤递送研究提供了一个新思路。 　　注：此研究成果摘自《ACS Nano》杂志，文章内容不代表本网站观点和立场。　　论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.1c05613

日前，记者从河南农业大学了解到，该校蒋士君/崔江宽研究团队联合河南农业大学学术副校长、省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室主任汤继华教授系统开展了河南玉米作物线虫危害损失和监测预警的相关研究，取得了重要进展。玉米是我国第一大粮食作物，常年播种面积在6.5亿亩左右，在粮、果、饲料和工业等方面的多元用途，使其在农业生产中占有重要地位。河南省地处黄淮海平原，是全国四大玉米主产区之一，河南玉米产量的变化对国家粮食安全有着举足轻重的作用。玉米孢囊线虫是玉米的重要新发病害，主要危害玉米根部，能够导致玉米根系发育不良，扭曲畸形，阻碍植株的正常生长和发育，造成玉米产量和品质下降。玉米孢囊线虫并非只侵害玉米这一种作物，它主要寄生在禾本科作物和杂草上，同时还可侵染茄科蔬菜和扁桃树、无花果等。自1971年印度拉贾斯坦邦首次发现玉米孢囊线虫以来，目前在巴基斯坦、埃及、泰国、尼泊尔、葡萄牙、美国、希腊、阿富汗以及我国广西等地均有报道。在我国，玉米孢囊线虫最早于2015—2016年在广西壮族自治区来宾市玉米田被发现。2017年，河南农大科研团队在河南省禹州市玉米田发现玉米孢囊线虫，调研发现，这些玉米孢囊线虫分布比较密集，繁殖力惊人。随后，研究团队在河南省郑州市荥阳、濮阳市清丰县韩村镇、许昌市长葛市董村镇和禹州市范坡镇检测点再次发现玉米孢囊线虫。“科研数据表明，当每毫升砂壤土里有5～6条玉米孢囊线虫J2幼虫时，便可造成玉米总产量下降21%～29%。”崔江宽说，而研究数据显示，河南省许昌市长葛市董村镇、禹州市范坡镇和濮阳市清丰县韩村镇地区的玉米孢囊线虫土壤中卵含量分别达到23.0、54.2和6.8粒/毫升，均已超出玉米孢囊线虫卵量的危害经济阈值。“学界之前普遍认为，玉米孢囊线虫主要分布在热带地区，而我们经过调研发现，我国黄淮海平原等温带地区也极可能是玉米孢囊线虫的重灾区。同时，根据室内接种发现，玉米孢囊线虫可以侵染小麦、水稻、大麦、谷子和高粱等多种禾本科作物，并完成其生活史。”崔江宽告诉记者。为探究河南省主要禾谷类作物的孢囊线虫发生分布，明确不同作物孢囊线虫的危害情况，团队于2017—2021年对河南省18个市50个县（区）的小麦、玉米和水稻作物的孢囊线虫种类和发生分布进行了系统取样调查。该研究共采集全省土壤样品308份，其中224份样品检测到孢囊，孢囊检出率为72.7%，覆盖了调查地区的92.0%。为监测玉米孢囊线虫在我国发生扩散，防止对玉米造成严重的减产损失，开发一套玉米孢囊线虫快速分子检测技术体系迫在眉睫。“在我国，玉米孢囊线虫是一个近几年才被发现的‘新物种’，我们是凭借经验和技术识别到它的。但其他科研人员不了解，也不好识别这种病原物的危害，我们想通过研发出玉米孢囊线虫检测‘试剂盒’，让科研机构、农业技术员和检测人员等能够简单、快速地识别到它，有针对性地进行防治。”崔江宽说。检测技术的研发需要大量样本作为支撑。5年来，河南农业大学崔江宽博士跑遍了河南省及其周边省市，采集了2500余份土壤样本，通过近缘种群大批量筛选，终于获得了玉米孢囊线虫的特异RAPD片段，进而设计出SCAR-PCR检测引物，建立了一套快速、准确、稳定的玉米孢囊线虫检测技术体系，为玉米孢囊线虫的检测和防治提供了有力技术支持。据介绍，该检测体系既避免了孢囊线虫ITS区异质现象而导致RFLP酶切图谱的差异，也弥补了RAPD技术的重复性差、结果不稳定的缺点，能够快速将玉米孢囊线虫从禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫和甜菜孢囊线虫种群中区分开，极大地提高了检测效率，可用来对玉米孢囊线虫的传播、扩散进行监测预警，相关研究成果已申请国家发明专利，并获得授权。“玉米线虫对玉米的危害非常严重，常与多种其他病原微生物复合侵染，引起多种玉米土传病害的发生。然而玉米线虫尤其是玉米孢囊线虫的研究人员非常稀缺，这对玉米线虫的监测和防治非常不利。目前我们这项研究成果的意义主要有两点：第一，系统普查了河南及其周边省市地区玉米线虫的发生种类和危害情况，首次明确了玉米孢囊线虫的潜在威胁；第二，我们研发的微量检测技术可以在土壤中线虫密度非常低的情况下完成，对玉米孢囊线虫的早发现、早预警具有非常重要的实用价值。”汤继华告诉记者，“未来，我们将集中重要科研力量，完成我国玉米孢囊线虫基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学的相关研究，系统解析玉米孢囊线虫的侵染发病机制。同时，我们将深入开展玉米抗线虫和抗病育种的相关工作，早谋划、早着手，为我国玉米抗病、育种等种业‘卡脖子’问题贡献自己的一份力量。”

● 快讯近日，同济大学医学院附属上海市第十人民医院神经内科赵延欣教授及刘学源教授课题组在细胞外囊泡与神经退行性疾病关系研究领域取得了新的进展。该项研究从小细胞外囊泡的角度为阿尔兹海默症中发生的兴奋抑制失衡提供了新见解。相关研究成果已发表在国际知名期刊《Journal of Nanobiotechnology》（IF:10.435，JCR 2区）。图1｜国际知名期刊《Journal of Nanobiotechnology》（IF:10.435，JCR2区）细胞外囊泡 (EV) 是由细胞释放到细胞外环境中的小囊泡。EVs 由脂质双层膜组成，该膜包裹着小的无细胞器的细胞质。根据它们的大小，通常分为三种类型，小EVs (sEVs) (50-150 nm)、大EVs (100-1000 nm) 和凋亡小体 ( 5 μm)。其中，sEVs 通常可通过血脑屏障 (BBB)，成为中枢神经系统 (CNS) 细胞之间通讯的关键介质，有证据表明，sEV 中的微小RNA (miRNA)参与到众多细胞和生物过程，例如神经元细胞的生长和凋亡。目前，E/I（兴奋/抑制）失衡假设被概念化为谷氨酸能和氨基丁酸（GABA）能突触输入之间的不平衡。E/I 失衡被认为是神经退行性疾病脑功能障碍的基础，包括阿尔茨海默病 (AD)、帕金森病 (PD)、精神分裂症和其他神经疾病。谷氨酸兴奋性毒性和 GABA 能神经元功能障碍似乎是 AD 中发生的神经元细胞死亡的关键原因。但是关于 E/I 失衡对AD的影响，其中的机制仍不明确。为了对该机制进行进一步阐释，赵延欣教授及刘学源教授团队在本研究中用谷氨酸/GABA/PBS 处理原代培养的神经元，并分离出 sEV。然后，将不同来源的 sEV 添加到用 Aβ（β淀粉样蛋白）处理的神经元或注射到 AD 模型小鼠中。此后对经 Aβ 治疗的小鼠和神经元进行了评估。经GABA 处理的神经元释放的 sEVs 减轻了 Aβ 诱导的损伤，而谷氨酸处理的神经元释放的 sEVs 加重了 Aβ 的毒性。此外，本研究通过 miRNA 测序比较了从谷氨酸/GABA/PBS 处理的神经元中分离的 sEV 的 miRNA 组成。该研究进一步表明，sEV 中 miR-132 的变化加速了表征病理的生化改变。图2｜实验方案示意图分离原代神经元后，用谷氨酸/GABA/PBS 处理原代培养的神经元，并分离出 sEV。将不同来源的 sEV 添加到用 Aβ 处理的神经元或注射到 AD 模型小鼠中，并对小鼠进行MWM测试。文章中，在评估在小鼠体内系统传递的 sEVs 的分布的实验中，使用了博鹭腾AniView100多模式动物活体成像系统拍摄。该实验中使用近红外染料DiR进行标记，同时进行了阴性对照实验（仅注射 DiR，不注射 sEV）。通过 APP/PS1 小鼠的尾静脉注射 DiR 标记的 sEV，使用Aniview100活体成像系统在注射后 24 小时拍摄小鼠的图像并评估分布情况。在带有 DiR 标记的 sEV 的小鼠的大脑和重要器官中均检测到荧光。随后，处死小鼠，取出器官并成像，目的为识别荧光信号来源的器官并使信号干扰最小化。此外，为了排除游离染料干扰实验结果的可能，在收集器官前用不含 sEV 的游离 DiR处理小鼠。实验结果显示，脑、心、肝、肺、脾、肠、肾均呈不同程度荧光。图3｜sEV的体内外分布情况在注射 DiR 标记的 sEV 后 24 小时，使用活体成像系统对A - C活小鼠进行成像。a)、小鼠背面成像b)、小鼠腹侧成像c)、收集指定器官后使用活体成像系统成像本研究中证明了 sEV 的功能可以受神经递质平衡状态的调节，并对神经元中的 Aβ 毒性有不同的影响。并且该研究从 sEV 的角度为 AD 中发生的 E/I 失衡提供了新见解，并表明通过GABA 能系统对 sEV 进行生物学改造可能是预防或减轻 AD 发病机制的治疗途径。论文链接：https://doi.org/10.1186/s12951-021-01070-5

近日近日，吉林大学动物科学学院实验动物中心王东旭教授课题组与吉林大学口腔医院口腔颌面外科刘炜炜教授课题组在细胞外囊泡与舌鳞状细胞癌关系研究领域取得了新的进展。相关研究成果已发表在国际知名期刊《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》（IF:5.89，JCR 2区）。▲图1｜国际知名期刊《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》（IF:5.89，JCR 2区）近年来，针对舌鳞状细胞癌（TSCC）的治疗和诊断已取得了进展，但 5 年生存率仍然很低。治疗TSCC的方法主要为手术、放疗和化疗。在过去几十年中，中医药在癌症研究方面已被广泛应用。例如，从蜂蜜中提取的白杨素可以通过非编码RNA在多种癌细胞中诱导细胞凋亡并抑制增殖。并且，纳米结构也已被广泛研究用于癌症治疗中的药物递送和诊断，例如金纳米粒子 (AuNPs)。细胞外囊泡（EVs）是由细胞释放到细胞外环境中的小囊泡。EVs 由脂质双层膜组成，该膜包裹着小的无细胞器的细胞质，EVs 的摄取特定于细胞类型。但白杨素与金纳米粒子在单独运用时对癌症缺乏特异性，有证据表明，纳米粒子与 EVs结合可作为靶向癌细胞的药物载体。因此，纳米材料与 EVs 结合可以提高癌症治疗的效率。为了探究该方法，王东旭教授与刘炜炜教授团队首先使用白杨素治疗 TSCC 细胞和分离的 EVs-白杨素。然后将四氯金酸（HAuCl4）与 EVs-白杨素一同孵育形成 Au-EVs。在 EVs-Con 和 EVs-chrysin 之间进行转录组测序筛选后，对 let-7a 家族进行了分析。该研究结果表明，Au-EVs 通过TSCC中的 let-7a 诱导细胞凋亡。▲图2 ｜实验方案示意图文章中，研究 Au-EVs在体内的抗肿瘤作用的实验使用了博鹭腾AniView600多模式动物活体成像系统拍摄观察。在该实验中，首先将SCC9 细胞注射到裸鼠体内。7天后，将Au-EVs注射到肿瘤下方，并在第8天和第15天用近红外光照射裸鼠并进行肿瘤生长分析。结果表明，Au-EVs具备肿瘤靶向性，且荧光强度随时间增加而增加。此外，近红外辐射可以淬灭 Au-EVs 的荧光。在第21天时收集肿瘤，与预期结果相符，Au-EVs 与 NIR 结合显着抑制了肿瘤生长，并且没有改变体内其他器官。这些结果表明，Au-EVs 有效地介导了等离子光热疗法（PPT）并抑制了体内肿瘤的生长。▲图3｜注射Au-EVs 后的荧光强度本研究发现，Au-EVs作为一种新型纳米材料，在SCC9 细胞中具有吸收特异性。在经过近红外辐射后，Au-EVs 能够有效增强细胞凋亡。通过RNA-seq,筛选 EVs-chrysin miRNA,Let-7a-3p，并且过表达let-7a-3p会诱导细胞凋亡，此结果表明经NIR 处理的 Au-EV 显著抑制了体内肿瘤的生长。综上所述，本研究结果提供了一种能够提高 AuNPs 靶向性的纳米材料，并且该材料可能与针对 TSCC 的疗法相关。论文链接：doi: 10.3389/fbioe.2021.766380

在过去的10年里，人们发现一些超分子效应物会在细胞-细胞连接的界面上传递信息。免疫突触(immunological synapse)是抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC)和T细胞相互作用的过程中，在细胞与细胞接触部位形成的一个特殊结构，是促进抗原、共刺激/共抑制、细胞因子三种激活信号从抗原递呈细胞传递到T细胞的分子枢纽。在与抗原呈递细胞作用过程中，T细胞会释放第四类信号—跨突触囊泡(trans-synaptic vesicles, tSV)，介导免疫细胞之间的双向通信，但是它们作用的具体方式和原理仍不清楚。近日来自牛津大学的Michael L. Dustin教授在Nature Communications上发表题为“T-cell trans-synaptic vesicles are distinct and carry greater effector content than constitutive extracellular vesicles”的文章，开创性地提出了脂质双分子层珠子(Glass Bead Supported Lipid Bilayers, BSLB)作为一种多功能的合成APCs来捕获、表征tSV，为研究tSV提供了一种新的检测手段。该研究发现与细胞外囊泡(EVs)相比，tSV中有更多的RNA结合蛋白和更高含量的microRNA，验证了tSV作为细胞间信使的特殊作用。文章首先通过BSLB模拟APC呈递细胞，研究与T细胞相互作用过程中tSV的转移和释放。T细胞-BSLB共培养物的延时成像显示，BSLB可促进来自受刺激T细胞的CD40L的转移，这在被转移的tSV组成的BSLB上留下了突触印记(图1-a)图1. BLBS原理进一步，作者将BSLB上的tSV洗脱下来，并利用NanoFCM对tSV和细胞上清获得的EVs进行综合表征和对比。发现tSV颗粒大小在82.13± 0.75nm，而EVs的粒径为65± 25nm，明显小于tSV的粒径大小。用NanoFCM的Exo粒径标准品(含68, 91, 113, 155 nm四种尺寸的SiO2球)，对EVs和tSV的粒径进行分群，发现与EVs相比，tSV中大于113nm和155nm的颗粒所占比例更高(图2-d)；tSV中TCR、CD40L、CD81阳性的tSV颗粒粒径显著大于对应的EVs阳性的颗粒(图2-e)。图2. tSV和EVs颗粒大小亚群分类进一步地，对tSV和EVs进行CD81和TCRαβ双标，发现tSV中两种标志物双阳的比例高于EVs，且TCR阳性的tSV粒径也显著大于TCR阳性的EVs(图3)。后续作者研究发现不同种类的T细胞来源的tSV内容物具有明显区别；tSV比EV携带更多的RNA结合蛋白和特有的microRNA等，感兴趣的读者可以阅读原文进行了解。总的来说作者提出了珠状脂质双分子层(BSLB)作为一种多功能的合成APCs来捕获、表征和促进对tSV生物发生的理解，开发了一种免疫细胞间信息传递和交流研究的新方法。图3. tSV和EVs功能亚群分析文章中利用NanoFCM对tSV和EVs的亚群进行精细分类，根据颗粒的大小将tSV和EVs分成四个不同大小的亚群，通过抗体标记，可对tSV和EVs 功能亚群进一步精细研究。利用NanoFCM单颗粒水平和超高分辨率的优势，可对tSV的不同亚群进行精细分类和研究，有望加快研究者对tSV的精细化研究进程！参考文献Céspedes P F, Jainarayanan A, Fernández-Messina L, et al. T-cell trans-synaptic vesicles are distinct and carry greater effector content than constitutive extracellular vesicles[J]. Nature communications, 2022, 13(1): 3460.

癌症的早期诊断是提升患者后期生存率的关键，但大部分癌症患者往往确诊时已是中晚期，极大增加了治疗难度和治疗负担。如：胰腺癌早期症状不明显，因此只有5%的胰脏癌能在早期被诊出，大多胰腺癌患者初诊时已为末期，无法手术切除，其他治疗方式效果也不佳，十年存活率约为1%，是预后最差的癌症之一。发展胰腺癌早期诊断方法是提高该类癌症早诊率的重要手段。近日，美国加州大学研究团队在《Communications Medicine》杂志上发表题为“Early-stage multi-cancer detection using anextracellular vesicle protein-based blood test”的文章，发现了通过检测血液中细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）的相关标志物，有望为胰腺癌早筛早诊提供新方法。前期研究表明，利用EVs作为诊断的靶标，通过人工智能的方式来分析EVs中含有的肿瘤蛋白，可以推测恶性肿瘤的恶性程度，具有早期诊断癌症的潜力。该研究根据EVs蛋白谱开发了一种基于血液EVs的生物标志物分类器，用于检测早期胰腺癌和其他多种癌症。使用团队开发的分离系统从血浆中纯化EVs，相对于传统的离心方法，在保证分离得到的EVs纯度足够高的情况下，操作更简便。通过对I期和II期癌症患者及对照组的初步研究，分析血浆中EVs的13种相关蛋白标记物，诊断出95.7%的I期胰腺癌，特异性超过99%，证实了该技术具有较好的特异性和灵敏度。该筛查技术对于早期癌症检测有潜在的应用价值，有望为胰腺癌及其他癌症的早诊提供新的方法，推动癌症早筛发展，提升癌症患者的整体存活率。论文链接：https://www.nature.com/articles/s43856-022-00088-6

通过交叉科学研究，提出并发展生物医学前沿新技术，是提高重大疾病治疗效果的重要手段。胶质瘤是发病率和死亡率最高的中枢神经系统肿瘤，其中胶质母细胞瘤（GBM）是最恶性的肿瘤，也被称为“癌中之王”。临床上治疗GBM以外科手术为主，同时辅助放化疗，但是效果非常有限；以手术和替莫唑胺联合治疗为例，5年生存率小于5%。因此，亟需开发新型高效的GBM治疗策略。 GMB治疗棘手的原因主要有三方面。首先， 血脑屏障（BBB） 的存在阻止了药物进入中枢神经系统，需要发展更有效的药物递送策略；其次，单一化疗药物的使用易导致耐药性的产生，需要联合新的肿瘤杀伤手段；另外，GBM具有复杂的肿瘤微环境，对其快速生长和向周围组织的浸润起到重要作用，在治疗的过程中不容忽视。 近日，中科院过程工程所生化工程国家重点实验室 魏炜 研究员、 马光辉 院士、深圳市第二人民医院 李维平 教授，作为共同通讯作者 在 Signal Transduction and Targeted Therapy 期刊发表了题为： Exploration and functionalization of M1-macrophage extracellular vesicles for effective accumulation in glioblastoma and strong synergistic therapeutic effects 的研究论文。 该研究基于工程化细胞外囊泡发展了“ 免疫调控-化学动力-乏氧激活 ”多级联动的治疗新策略，为胶质母细胞瘤的治疗带来了新思路。针对胶质母细胞瘤治疗难题，过程工程所生化工程国家重点实验室基于具有定向趋化能力的巨噬细胞的细胞外囊泡 （EVs） 和工程化的设计，提出了“免疫调控-化学动力-乏氧激活”多级联动的治疗新策略，并联合深圳市第二人民医院交叉合作，进行了个体化创新药物制剂的研发。 研究团队首先基于胶质瘤患者的临床样本和小鼠模型进行了免疫组化的研究，发现胶质瘤恶性程度越高，肿瘤组织中浸润的M2型巨噬细胞/M1型巨噬细胞的比例也相应更高，并且这些巨噬细胞大多来源于外周血。在此基础上，研究团队提出了以M1巨噬细胞EVs作为载体，一方面可以利用M1巨噬细胞的趋化特性在GBM部位大量蓄积，另一方面可以通过调控巨噬细胞表型实现GBM微环境的免疫调控。图1 胶质瘤样本中巨噬细胞的表型及其来源分析：a. 胶质瘤患者临床样本中巨噬细胞表型分析示意图；b. 不同级别胶质瘤中M1、M2和Ki67（细胞增殖指标）的分析；c. 基于TCGA数据库分析不同级别胶质瘤中M2/M1比例；d. 基于TCGA数据库分析胶质瘤患者瘤内M2/M1比例与生存曲线的关系；e. GBM组织中小胶质细胞和M1巨噬细胞的共定位分析；f. 免疫荧光染色分析GBM组织中小胶质细胞和M2巨噬细胞的共定位；g. 小鼠胶质瘤样本中巨噬细胞表型分析示意图；h. 在不同胶质瘤细胞系（U87MG、G422和GL261）中M1、M2和Ki67的分析；i. 免疫荧光染色分析不同鼠胶质瘤组织中小胶质细胞和M1或M2巨噬细胞的共定位情况；图中标尺均为50 μm 研究团队进一步在M1EVs的细胞膜和内腔差异化装载了化学激发分子对 （CPPO和Ce6） 以及乏氧药物 （AQ4N） ，以此将肿瘤微环境调控、化学激发动力学及肿瘤乏氧治疗合理有序地集成于M1EVs递送系统中。上述仿生剂型 （CCA-M1EVs） 静脉注射后，M1EVs可以携带上述组分穿过BBB进入GBM病灶，进而实现多级联动治疗：M1EVs调控免疫微环境产生大量过氧化氢，从而激发CPPO和Ce6生成自由基 （ROS） ，同时该反应消耗氧气激活细胞毒性药物AQ4N。借助上述作用的协同，在小鼠原位胶质瘤模型和患者来源的 （PDX） 模型上显著抑制了疾病的进程，大幅延长了生存期。图2 基于M1EVs的仿生剂型构建方案、抗肿瘤机制及PDX疗效：a. 仿生剂型的构建示意图；b. 仿生剂型在GBM模型中的累积及免疫调节、化学激发动力学和乏氧触发化疗的协同作用示意图；c. 基于光声成像分析仿生剂型在PDX小鼠GBM病灶中的累积；d. 各组PDX小鼠的抑瘤效果（20天核磁成像）；e. 各组PDX小鼠的生存期分析；f. 各组PDX小鼠的TUNEL分析（标尺50 μm） 十余年来，过程工程所生化室魏炜研究员和马光辉院士创制了一系列仿生递送新剂型，利用其体内的天然路径和属性，在动物模型上成功用于肿瘤、传染病、炎症性疾病的防治，并且部分剂型已通过医院伦理批准进入个体化临床前和临床研究。 深圳市第二人民医院 王晓君 博士和丁辉博士为该论文的共同第一作者，中科院过程工程所生化工程国家重点实验室魏炜研究员、马光辉院士和深圳市第二人民医院李维平教授为共同通讯作者。论文链接 ： https://www.nature.com/articles/s41392-022-00894-3

p 　　华中科技大学科研团队揭示了肿瘤微环境中肿瘤细胞与免疫细胞相互调节机制。《临床研究杂志》近日在线发表了该成果。 /p p 　　近年来，随着肿瘤免疫治疗，特别是Car-T细胞免疫治疗技术和免疫节点治疗在临床上的成功，深入研究肿瘤微环境对免疫细胞功能的调节机制具有重要的基础研究意义。 /p p 　　华中科技大学基础医学院免疫学系杨想平团队的研究发现，在小鼠模型中，皮下移植的肿瘤细胞在小鼠中生长更快，尾静脉注射的肺腺癌肿瘤细胞向肺转移结节在小鼠中明显增多，血管增多，巨噬细胞向促肿瘤表型极化增强。 /p p 　　杨想平团队和病理系王国平团队合作发现，在人的临床肺腺癌患者组织中，肿瘤细胞能通过其代谢产物调控巨噬细胞囊泡水解酶表达，从而使肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤微环境中编程重组为促进肿瘤生长的免疫细胞。 /p p 　　该研究还发现囊泡水解酶表达高低可作为肺腺癌重要的预后标志，因此具有重要的临床意义。 /p p /p

2022 年 10 月，达普生物联合南方医科大学南方医院正式推出单囊泡分析仪器 ExoStar。ExoStar 是一种基于液滴微流控技术的单分子绝对定量技术的分析仪器，原理是将待测细胞外囊泡（EVs）与抗体偶联核酸复合物一起孵育，所述抗体偶联核酸复合物由 EVs 普适性表达和/或特异的抗体与核酸偶联而成，随后，将预处理好的 EVs 与核酸信号扩增体系在微流控芯片上经液滴生成仪产生微液滴，实现单个 EV 的包裹，接着将装有液滴的 EP 管移至普通 PCR 仪器上进行热循环反应，随后将液滴转移至液滴分析芯片，通过液滴分析仪的识别读取每一个微液滴荧光信号后，根据荧光信号及泊松分布原理实现对单囊泡的绝对定量。南方医科大学珠江医院党委书记王前、南方医科大学南方医院检验科主任郑磊与达普生物创始人许潇楠、达普生物市场总监朱林为单囊泡分析仪器 - ExoStar 揭幕。从 EVs 的首次发现至今，有关 EVs 的研究突飞猛进。特别是近年来，随着 EVs 作用机制及其与疾病之间关系的深入研究，证实 EVs 已成为一类具有广阔应用前景的新型生物标志物。但是，EVs 可被任何有核细胞分泌，展现了巨大的异质性，携带特异标志物的 EVs 极易被大量正常 EVs 信号稀释，会忽视、掩盖或者遗失单个 EV 的所携带的分子信息，可能导致那些低丰度的特异 EV 亚群信息的缺失。单囊泡分析技术平台可以实现EVs数字化超灵敏检测，对特异 EVs 亚群实现精准分析。可见对 EV 群体进行单个 EV 精度的分析显得越来越迫切。单囊泡分析仪器 ExoStar 应用场景细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是由细胞向细胞外环境释放的直径在 30-2000 nm 的具有脂质双分子层膜的膜性结构。细胞把特异的生物活性分子如核酸、蛋白质等包裹到 EVs 中或结合于 EVs 表面，使其稳定地存在于几乎所有生物液体中，如血清、尿液、羊水、脑脊液和唾液等，可以通过非侵入性的方式获得。目前，已有许多研究表明 EVs 蛋白可作为多种疾病的标志物，包括恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病等。因此，通过精准的分类分析这些携带特异标志物的 EVs 亚群，有望获取疾病信息，在疾病早期诊断、治疗决策、疗效评估和耐药监测中具有巨大的发展潜力与临床应用前景。Exostar 将 EVs 检测精度提升至单囊泡水平，可有效避免传统批量检测方法中低丰度标志物信息被掩盖的缺陷。此外，Exostar 基于抗体特异性识别 EV 上的蛋白标志物，经抗体核酸标志物巧妙将蛋白质信息转换为核酸信号，进一步级联放大信号，实现特异蛋白标志物EV亚群的精准定量分析，特异性和灵敏度高。目前，Exostar 可同时检测单个 EV 上的 3 类蛋白标志物，实现 EVs 亚群的 8 分类定量分析，已在乳腺癌、肝癌等肿瘤疾病上进行验证与应用。后续通过改变蛋白标志物的 panel 可进一步扩展应用至其他疾病。单囊泡分析仪器 ExoStar 系统特点检测灵敏度高：可将 EVs 检测精度提升至单囊泡水平专利微流控液滴生成技术：液滴大小均一，扩增稳定，以保证数据精准自动化程度高：有效避免人为操作误差平面拍照式检测：可实现数据回溯封闭式芯片：可杜绝污染通用性广：通过改变蛋白标志物可扩展应用至其他疾病单囊泡分析仪器 ExoStar 部分数据展示单囊泡分析仪器 ExoStar 发布会第六届全国细胞外囊泡大会（CSEV 2022）于 2022 年 10 月 14 日在广州市广东迎宾馆隆重召开。会上，达普生物与南方医科大学南方医院合作开发的单囊泡分析仪器 - ExoStar 顺利揭幕。南方医科大学珠江医院党委书记王前、南方医科大学南方医院检验科主任郑磊以及CSEV组委会专家、达普生物创始人许潇楠、达普生物市场总监朱林、南方医科大学南方医院检验科刘春辰博士参加揭幕仪式。基于达普生物的星云数字 PCR 平台和微液滴技术，达普生物与南方医科大学南方医院郑磊教授研究团队合作开发单囊泡分析仪器 - ExoStar 及其相关检测试剂盒，致力于解决细胞外囊泡定量工作。相关研究成果“Single-Exosome-Counting Immunoassays for Cancer Diagnostics”发表于《Nano Lett》(IF：12.262)、“Multiplexed analysis of small extracellular vesicle-derived mRNAs by droplet digital PCR and machine learning improves breast cancer diagnosis”发表于《Biosensors and Bioelectronics》(IF：12.545)。达普生物与南方医科大学南方医院合作历程2018 年郑磊教授团队与姚舒怀教授团队首次基于液滴微流控技术报道了一种单个 EV 的数字化检测新方法。2021 年达普生物与郑磊教授团队开发了一种基于 4-plex ddPCR 技术并联合机器学习算法的新策略，通过分析 sEVs 来源的 mRNA，构建了 3 种乳腺癌诊断模型。2022 年《肿瘤液体活检关键技术研究及应用》荣获 2021 年度广东省科学技术奖科技进步奖一等奖！达普生物科技有限公司达普生物科技有限公司孵化于香港科技大学，于 2018 年由多位海归博士共同创立。在深圳、嘉兴、香港三地设有研发中心，研发团队近 100 人，建立了集微流控芯片、仪器及试剂生产为一体的 GMP 厂房。公司专注于将液滴微流控技术应用于精准医学领域，致力于成为集微流控芯片、仪器、试剂的研发和生产于一体的完整解决方案提供商。公司自主研发、生产两大技术平台：数字 PCR 系统和单细胞组学系统，应用于癌症研究、癌症早期筛查、靶向治疗、无创产前诊断、病毒定量检测、高通量药物和抗体筛选等领域。南方医科大学南方医院南方医科大学南方医院是南方医科大学第一附属医院、南方医科大学第一临床医学院，承担临床医疗、医学教育、医学科研和预防保健等任务，是大型综合性三级甲等医院和国家区域医疗中心。医院综合实力雄厚、学科特色突出、管理水平先进、文化底蕴深厚、是在全国乃至国际享有崇高声誉影响的高水平研究型医院。医院拥有国家级重点学科 5 个、国家级临床重点专科 17 个，国家临床重点专科建设项目 1 个，临床医学、口腔医学为一级学科博士学位授权点。近年来，在国内权威医院排行榜中，医院稳居国内综合医院前 15–20 名，10–15 个专科进入全国前十或得到提名。参考文献：[1] van Niel, G. D'Angelo, G. Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol 2018, 19, 213-228.[2] Zabeo, D. Cvjetkovic, A. Lasser, C. et al. Exosomes purified from a single cell type have diverse morphology. J Extracell Vesicles 2017, 6(1): 1329476.[3] Urbanelli L, Buratta S, Tancini B, et al. The Role of Extracellular Vesicles in Viral Infection and Transmission. Vaccines（Basel）2019，7（3）：102.[4] Atsunori Tsuchiya, Shuji Terai, Ikki Horiguchi et.al.,Basic points to consider regarding the preparation of extracellular vesicles and their clinical applications in Japan，Regenerative Therapy 21 (2022) 19e24

2021年7月22日，碧迪医疗在上海宣布BD FACSymphony™ A1 流式细胞仪正式上市。北京大学肿瘤医院张志谦教授、浙江大学免疫学研究所汪洌教授、四川大学生物治疗国家重点实验室研究员胡洪波、复旦大学医学院徐薇教授、碧迪医疗大中华区生物科学业务副总裁胡轶清博士等嘉宾出席发布仪式，共同见证新品上市的荣耀时刻，并围绕流式细胞术在生命科学领域价值与应用前景进行分享及深入探讨。发布仪式碧迪医疗持续释放价值 流式细胞术可望更可及流式细胞术是目前最先进的细胞定性定量分析技术之一，与传统细胞检测相比，具有参数多、速度快、精度高、准确性好等优点，目前已广泛应用于基础免疫学、分子生物学、微生物学、肿瘤等领域，其分析结果是科学进步的重要依据，同时还助力临床科研发现，有助于临床诊疗水平提升。近年来，伴随生物医药产业的兴起，流式细胞术在生物医药研发及生物制药领域的应用也日趋广泛，在细胞蛋白的高通量筛选、靶向抗体定位、疫苗研发以及肿瘤标志物测定等工作中均有应用，细胞疗法的技术进步也将进一步拓展流式细胞术的应用场景。然而遗憾的是，由于新冠疫情、硬件投入能力等客观因素，相当一部分研究者的流式细胞研究需求难以得到充分满足，一定程度上阻碍了流式细胞术应用价值的释放。如何打破先进研究平台可望而不可及的传统印象，让更多因经济因素导致研究受限的研究者们也能拥有出色的研究工具，充分发挥科研经费价值，推动更多先进科研成果产出，成为行业难题。以小见大 A1有望拓展生命科学研究前景作为流式细胞术的发明者与领导者，碧迪医疗长期致力于流式细胞术的科研价值挖掘，此次最新推出的FACSymphony™ A1搭载高于同行业2倍功率的4种常用激光器，提供多达19个检测参数的能力，在充分响应全球市场需求，延续业界领先性能的同时，拓展流式领域常规颗粒大小检测最下线从500nm到90nm，不断提升应用效能，降低用户使用门槛，用户仅需相对较少的费用支出即可满足绝大部分流式细胞实验需求，为研究者提供更多优质选择。Symphony™ A1浙江大学免疫学研究所汪洌教授表示：“流式细胞仪是免疫学研究的利器，但其应用门槛较高，在充分发挥科研经费价值的目标之下，我们希望单一平台能够覆盖更为广泛的研究范围，助力临床科研成果高效产出，我们非常欣喜地看到FACSymphony™ A1流式细胞仪这方面做出了卓越的努力，其在国内的应用前景值得期待。”A1的努力并不仅于此。以近年来兴起的小颗粒研究为例，北京大学肿瘤医院张志谦教授在致辞就表示：“近年来，越来越多的顶级科研成果证实了小颗粒检测研究的价值。FACSymphony TM A1流式细胞仪新增小颗粒检测可选项，能够实现对于小颗粒的精确定性定量分析，有望成为科研人员的得力助手。”生物医药领域的应用则对流式细胞仪提出了更多要求。四川大学生物治疗国家重点实验室研究员胡洪波表示：“生物制药领域流程更加复杂，对于成本控制也更为敏感，灵活小巧且拥有广阔适用领域的A1高度适合生物制药行业需求，相信该类先进研究平台的应用将使全行业共同获益，让更多本土研究得以高效率转化，最终造福中国患者。”后疫情时代 为中国生命科学研究持续加码自从1973年推出全球第一台商业化流式细胞仪（FACS），近50年来，碧迪医疗始终致力于流式细胞术的技术进步与临床应用。碧迪医疗美国定制化产品研发团队负责人Geoffrey Osborne表示：FACSymphony™ A1 流式细胞仪是碧迪医疗现有流式细胞仪家族的重要补充，目的是为科学家提供可靠稳定的科研助手，轻松实现多参数细胞检测的同时，拓展了流式细胞技术在微囊泡和纳米材料等领域的应用场景。我们相信更多中国研究者在FACSymphony TM A1 流式细胞仪的帮助下能够取得丰硕和优质的科研成果。碧迪医疗大中华区生物科学业务副总裁胡轶清博士表示：“近年来，疫情爆发为全球公共卫生行业带来严峻挑战，FACSymphony™ A1 流式细胞仪正是碧迪医疗在后疫情时代为推动中国生命科学研究进步所做出的一项重要努力，其出色的性能与多功能性，以及较低的使用门槛使得研究者构建先进研究平台的难度进一步降低，更多研究者与机构有望从中获益。未来，碧迪医疗持续践行‘植根中国，服务中国’的不变承诺，持续加码流式细胞术在中国的推广应用，助力健康中国。”

时间：2018年3月29日 14:00 - 15:00内容简介：超速离心一直是胞外囊泡分离和纯化的标准推荐方法之一。但没有一种单一的分离纯化方法可以完美无缺地精准纯化出特定目标颗粒，不同方法均具有其优点及局限性。我们将以胞外囊泡的分离纯化为例，深入分析超速离心如何通过不同的实验设计，分别从颗粒的“直径大小”和“密度”两个维度综合利用，从而有效去除各种或大小或密度与目标囊泡想接近的各种杂质，为下游的精准分析提供更加可靠的精准纯化样品来源。2016年和2017年，我们分别开设过两场外泌体纯化方式介绍的在线专题讲座，分享了如何高通量、可重复地获取完整的、高纯度的外泌体颗粒，介绍了超速离心这个当今外泌体分离纯化的经典方法。讲座受到了很多外泌体研究者的好评和鼓励，并持续不断的与多位相关研究老师互动，一起探讨和交流。为满足更多研究者和技术人员的对于渴望深入了解和掌握使用超离对外泌体进行分离和纯化的要求，今年我们再次开设相关主题的在线讲座。讲座将结合过去两年我们与用户沟通交流后得出的各种经验和教训，总结了一套更加深入、更加具体的外泌体超离纯化流程优化方案，从而使外泌体的纯化过程更加稳定和可重复，更加适用于后续的临床检测和工业生产的需要。如果您在外泌体分离纯化过程中碰到了疑难问题迟迟未有解决？欢迎您来参加我们的在线讲座，讲座后我们将预留足够的答疑时间，您有何相关问题都可与我们沟通，我们将与大家充分共享相关的经验。主讲人简介：霍德华贝克曼库尔特生命科学部离心机产品经理 从事细胞与分子生物学实验室科研及相关产品的应用支持和市场推广工作15年，对各种细胞、核酸、蛋白的常用和前沿技术及仪器具有广泛而深入的了解，曾参与了多个实验室多种技术平台的构建与优化。目前在贝克曼库尔特公司负责离心机产品线的全国市场及应用推广业务，可为客户提供离心机及周边相关的实验完整解决方案支持。近年来，已协助国内外多家客户成功搭建外泌体相关的超速离心分离纯化技术平台，并为各地贝克曼库尔特离心机的新老用户提供了多场专题培训及疑难解答，在各种超离应用领域，特别是外泌体分离纯化上积累了丰富的经验。 如需报名或索取相关资料，请在线留言，告知需要参加的讲座名称。

在哺乳动物和果蝇中，雌性多细胞雌性生殖细胞包囊（Female germline cyst）中只有一个细胞会成为卵母细胞，但是这颗卵母细胞是如何打破对称性从中脱颖而出的还不得而知。为了揭开这一问题的答案，英国剑桥大学D. St. Johnston研究组与D. Nashchekin（第一作者）合作在Science发文题为Symmetry breaking in the female germline cyst，发现微管负极稳定蛋白Patronin/CAMSAP通过标记果蝇中的卵母细胞，促使生殖细胞打破对称性从而特化形成卵母细胞的具体分子机制。在许多生物中并非所有的雌性生殖细胞都会变成卵母细胞，一部分细胞会变成辅助细胞为卵母细胞提供物料和营养支持【1】。举例来说，小鼠卵巢中一个生殖细胞包囊中包含约30个细胞，其中只有一小部分细胞会变成卵母细胞，大多数的细胞会作为营养细胞（Nurse cells）经历细胞凋亡，将胞质的内容物通过环管（Ring canals）输送卵母细胞（图1）【2, 3】。在果蝇中，生殖细胞包囊形成于生殖腺，包囊具有三个区域。生殖干细胞产生成囊细胞（Cystoblast），成囊细胞在不完全的胞质分裂的情况下分裂四次，产生一个包含16个生殖细胞组成的包囊，这些生殖细胞通过环管相连接（图2）。卵母细胞的选择依赖于非中心体组织中心（noncentrosomal microtubule organizing center，ncMTOC）在未来的卵母细胞中组织一个具有极性微管网络指导动力蛋白（Dynein）依赖的细胞命运决定因子的运输。但是这颗卵母细胞是如何脱颖而出获得命中注定的卵母细胞命运呢？为了揭开这一问题的答案，作者们将目光集中在了Patronin以及其脊椎动物同源蛋白CAMSAPs上。该蛋白是微管负极结合蛋白，是 ncMTOCs非常关键的组分【4，5】。作者们在patronin突变体中检测了卵母细胞标记物的分布，发现突变体中卵母细胞标记物的累积显著地降低。限定表达在区域3中卵母细胞中的联会复合体蛋白C(3)G也在patronin突变体中也显著降低。这些结果说明Patronin对于卵母细胞的决定非常关键。为了对Patronin在生殖腺包囊中的定位进行检测，作者们对内源荧光标记的Patronin-Kate品系进行成像，发现Patronin在2a区域时开始在单独的一个细胞中表达，早于既定卵母细胞标记物的表达，该信号会持续累积在此单个细胞中到区域2b-3，发育到该时期时会在细胞中形成点状信号，最终此细胞发育成为卵母细胞。但是作者们发现patronin的mRNA并不会定位在包囊之中，因此这种不对称的分布依赖于Patronin蛋白而非mRNA的定位或者新蛋白的合成。另外作者们发现动力蛋白在patronin突变体中的定位在推定的卵母细胞中，该结果说明Patronin的缺失会破坏前体卵母细胞中MTOC的形成，从而导致极化的微管网络形成的缺失。通过检测微管正极末端追踪蛋白EB1-GFP对包囊中的MTOC进行可视化观察，作者们发现EB1-GFP信号与Patronin的信号在相同的细胞中共定位。同样，EB1-GFP的不对称定位在patronin突变体的包囊中会消失，此时EB1-GFP的分布模式会相对比较均质。随后，作者们想知道中心体是否对Patronin MTOC的形成是否有一定的贡献，为此对中心体蛋白Asterless与Patronin的共定位进行了探究。作者们发现Patronin与Asterless只有小部分共定位，大部分的Patronin信号都在中心体聚集体的之外，该结果说明Patronin形成的MTOCs是非中心体依赖的。目前，Patronin成为了未来卵母细胞最早的标记物。那么提出了一个新的问题即Patronin是如何富集在卵母细胞中从而打破包囊中细胞的对称性的。其中一个可能的机制是对称性打破依赖于融合体（Fusome）的不对称继承【6】。融合体在区域1的有丝分裂过程中就出现了不对称分布，因此母细胞会比子代细胞继承更多的组分，四环管时期两个细胞中的一个会具有比其他细胞更多融合体。为了验证这一想法，作者们使用融合体标记物Hts检测该观点。Patronin与融合体共定位于早期2a区域，但在包囊向区域3发展时信号会集中在一个细胞之中。因此，该结果说明Patronin的最初定位由融合体决定于早期2a区域，随后被某些机制进一步将此不对称性进行扩大。进一步地，作者们想要探究其中可能的扩大机制。Spectraplakin蛋白Shot引起了作者们的注意，因为该蛋白定位融合体上并且与卵母细胞的特化相关【7】。作者们发现在shot突变体中，Patronin不能在一个细胞中累积并且也不能形成点状信号，而且也不能与融合体相互作用。因此，Shot对于招募Patronin到融合体上是非常关键的，从而能够将融合体不对称信号带给Patronin从而交给细胞命运决定过程进行解码。由此，作者们得到了一个卵母细胞命运决定的工作模型，该模型被称为“四步走”模型（图3），第一步，在包囊形成过程中融合体的不对称性促使一个细胞中继承更多的融合体内容物；第二步，在区域2a，Patronin通过Shot蛋白被招募到融合体上，形成一个微微极化的微管网络结构；第三步，包囊中其他细胞通过动力蛋白将Patronin蛋白结合的微管蛋白运输到预卵母细胞之中；第四步，形成一个正反馈循环通路，动力蛋白运输更多的Patronin以及微管蛋白到卵母细胞中，进一步扩大微管的极性，从而促进动力蛋白运输更多的卵母细胞命运决定因子进入该细胞之中。通过该不对称性建立并逐渐扩展的方式，卵母细胞从包囊中“脱颖而出”。Patronin是CAMSAP家族中保守的成员，这说明该机制可能具有一定的保守性，虽然在哺乳动物中未发现融合体的存在，但是微管依赖的细胞器通过细胞环管运输已被证明在小鼠卵母细胞分化中发挥重要作用。这一发现对于卵母细胞命运建立提供了新的思考。原文链接：http://doi.org/10.1126/science.abj3125

细胞在体外能够成功生长，培养基的选择及培养方法的优化十分关键。细胞在单纯的培养基中不能存活，各种类型的细胞培养中必须提供某些生长因子、黏附和伸展因子、微量元素等营养物质。传统培养基中一般会添加动物血清如牛血清等。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。其中胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。 血清培养的优势与局限采用天然来源的血清作为细胞培养添加物，优势在于提供丰富全面的细胞生长必需的营养，并且提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，调节其活性。结合蛋白还能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。血清还是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。但血清的使用也存在一定局限性。(1)血清可能含有细胞生长抑制因子和毒性因子，存在潜在毒性；(2)血清的获取成本高，价格较为昂贵；(3)血清由于成分不完全明确，给细胞培养的标准化带来困难，同时也给细胞表达目的产物纯化等下游操作带来困难。 无血清培养优势由于常规血清培养基存在上述问题，近年来无血清培养基越来越受到重视，其开发和应用渐成趋势。无血清培养基不含动物血清或其他生物提取液，仍可使细胞在体外较长时间生长、增殖或维持。无血清培养基可以针对特定的细胞类型配制专用的培养基，如爱必信生物研发推出的人间充质干细胞培养基，可以帮助精确地控制细胞的增殖和分化过程等。无血清培养基尤其应用于哺乳动物细胞的大规模工业培养。同时，它也是研究细胞生长、增殖、分化及基因表达调控的有力工具。无血清培养基具有以下优点：(1)其组成明确，可避免血清不同批次带来的质量变动，提高可重复性。(2)避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染风险。(3)避免血清不明组分对实验研究的影响。(4)有利于体外培养细胞的分化。(5)可提高细胞产物的表达水平并易于纯化。 所以，说了这么多，您是在进行细胞的常规有血清培养还是无血清培养呢？您更看好哪一方呢？爱必信生物提供优质、高性价比的血清产品，降低您的常规细胞培养成本！ 货号 品名 规格 价格 abs972 胎牛血清(优级) 500ml 3465 abs973 胎牛血清(优级),辐照 500ml 3675 abs974 胎牛血清(标准级) 500ml 2541 abs975 胎牛血清(标准级),辐照 500ml 2751 abs993 无外泌体胎牛血清 50ml 2478 abs976 新生牛血清(超级) 500ml 2268 abs980 澳洲新生牛血清 500ml 1155 abs981 BHK细胞专用新生牛血清(特级) 500ml 1685 abs983 Vero细胞专用新生牛血清(特级) 500ml 1685 abs985 二倍体细胞专用新生牛血清(特级) 500ml 1685 abs987 CHO细胞专用新生牛血清(特级) 500ml 1685针对现今越来越旺盛的无血清培养需求，爱必信生物特研发推出无血清干细胞培养的全面解决方案：！ 产品用途 货号 品名培养基 abs9401 Xeno-Free人间充质干细胞培养基（无酚红） abs9402 Xeno-Free人间充质干细胞培养基 abs9403 人多能干细胞条件培养基 abs9404 人多能干细胞完全培养基 abs9405 人多能干细胞分化培养基 abs9419 人脐带间充质干细胞无血清培养基(无酚红） abs9420 人脂肪干细胞无血清培养基(无酚红）基质胶 abs9410 即用型基质胶潜能分化 abs9406 人间充质干细胞成软骨分化试剂盒 abs9407 人间充质干细胞成脂分化试剂盒 abs9408 人间充质干细胞成骨分化试剂盒分化鉴定 abs9414 成脂检测染液 abs9415 成骨检测染液 abs9416 成软骨检测染液消化液 abs9409 人多能干细胞消化液 abs9411 Xeno-Free细胞消化液冻存液 abs9417 无血清细胞冻存液（科研级） abs9412 ES/iPS细胞冻存液 abs9413 无血清细胞冻存液（治疗级）添加物 abs9120 B27 NeuroMix (50x) abs44077956 Recombinant Human Transferrin重组人转铁蛋白更多细胞培养产品： 产品用途 货号 品名血清 abs972 胎牛血清(优级) abs973 胎牛血清(优级),辐照 abs974 胎牛血清(标准级) abs975 胎牛血清(标准级),辐照 abs976 新生牛血清(超级) abs980 澳洲新生牛血清 abs993 无外泌体胎牛血清抗生素 abs9245 青霉素-链霉素-庆大霉素混合溶液(100×三抗) abs9246 青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液(100×三抗) abs9244 青霉素-链霉素溶液(100×双抗) abs47014828 Hygromycin B(潮霉素B)消化液 abs47047375 胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%) 不含酚红 abs47014935 Accutase Cell Detachment Solution abs47014937 Trypsin (0.25%), Phenol Red abs47014938 Trypsin-EDTA (0.25%), Phenol RedDMSO abs9187 二甲基亚砜(DMSO)(细胞培养级)添加物 abs9156 BSA（细胞培养级） abs42019847 Insulin重组人胰岛素 abs9169 Insulin, from Bovine Pancreas abs9119 Bovine Pituitary Extract (BPE) abs80002 鸡胚提取物Absin特色产品线（全部现货）：WB相关：ECL发光液、预染marker、预制胶；IHC相关：二抗试剂盒、组化笔；IP/CoIP试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；ELISA试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)... 爱必信(上海)生物科技有限公司联系邮箱：info@absin.cn公众平台：爱必信生物

大鼠甲状腺滤泡上皮细胞的培养操作与应用！ 一、背景 大鼠甲状腺滤泡上皮细胞分离自甲状腺组织；甲状腺是脊椎动物非常重要的腺体，属于内分泌器官。在哺乳动物身体中，它位于颈部甲状软骨下方，气管两旁。甲状腺表面有结缔组织被膜，表面结缔组织深入到腺实质，将实质分为许多不明显的小叶，小叶内有很多甲状腺滤泡和滤泡旁细胞。甲状腺控制使用能量的速度、制造蛋白质、调节机体对其他贺尔蒙的敏感性。 甲状腺依靠制造甲状腺素来调整这些反应，有T3和T4。这两者调控代谢、生长速率还有调解其他的身体系统。T3和T4由碘和酪胺酸合成。甲状腺也生产降钙素，调节体内钙的平衡。其中，甲状腺滤泡上皮细胞（也称为滤泡细胞或主要细胞）是在甲状腺细胞是负责生产和分泌甲状腺激素，甲状腺素（T4）和三碘甲状腺原氨酸（T3）。 二、培养操作 1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。 2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。 1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。 2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。 3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。 4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。 3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类； 1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。 2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。 3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。 三、应用 用于RCCS模拟微重力影响大鼠甲状腺滤泡上皮细胞生长特性和分泌功能的研究： 釆用微重力细胞培养系统（the rotary cell culture system,RCCS）,研究模拟微重力对大鼠甲状腺滤泡上皮细胞生长特性和相关分泌功能的影响,为航天员在失重环境中甲状腺应激和病理性改变的防治提供理论依据。 研究方法应用RCCS技术构建FRTL-5细胞模拟微重力培养系统。将大鼠甲状腺滤泡上皮细胞FRTL-5细胞株随机分为模拟微重力组（simulated microgravity group,SMG）和正常重力对照组（normal gravity group,NG）,分别于培养第6h、12 h、24 h、36 h取细胞及上清液,MTT检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,化学发光免疫分析法检测T3、T4、FT3、FT4,ELISA检测上清液中Tg和TPO水平 应用倒置相差显微镜观察培养第6 h、12 h、24 h、36 h后细胞表面形态 透射电镜观察培养12 h和36 h的细胞超微结构 激光共聚焦显微镜观察培养36 h的细胞微丝骨架荧光强度变化。 结果：（1）MTT结果显示,SMG组FRTL-5细胞经6 h、12 h、24 h、36 h培养后,各时相细胞增殖均较NG组受到明显抑制（P0.05）,其中24 h最为明显（P0.01） 36 h表现为两种情况,一是SMG组的细胞增殖恢复,二是NG组的细胞增殖速度快速提升。 （2）流式细胞仪测细胞周期显示,与NG相比,FRTL-5细胞微重力培养6 h、12 h、24 h、36 h后G1期细胞比例显著增高 除6 h外,S期细胞比例明显降低 而各时相的G2/M期细胞比例表现为模拟失重早期（6-12 h）降低,其中12 h出现低谷值,24 h一过性显著增高,36 h回落。研究结果提示,SMG组FRTL-5细胞培养6-12 h阶段DNA合成下降,24 h的DNA合成趋活跃,而36 h的DNA合成后期比例又呈现下降趋势并向NG组的比例靠近。 （3）化学发光免疫分析法检测结果显示,RCCS培养6 h组FRTL-5细胞上清液中FT3、T4和FT4水平显著降低（P（4）ELISA测细胞上清液结果显示,与NG相比,SMG组FRTL-5细胞Tg和TPO分泌均明显升高（P0.01）,表现为6 h即显著升高,随后呈下降趋势,24-36 h阶段又趋上升,其中SMG组的6 h与24 h以及24 h与36 h之间有显著差异（P0.01）。 （5）倒置相差显微镜观察结果显示,模拟失重环境下FRTL-5细胞形态发生显著变化,实验早期细胞逐渐趋于死亡状态,24 h后细胞数量又有所增长。 （6）透射电镜结果显示,模拟失重第12 h,36 h的FRTL-5细胞超微结构发生显著变化。 （7）模拟微重力培养36 h后,激光共聚焦显微镜观察荧光素FITC标记的FRTL-5细胞,发现细胞微丝骨架局部解聚,张力纤维减少,结构和排列紊乱,细胞伪足少见,细胞形状呈不规则。 微生物菌种查询网自设细胞系板块，是细胞株提供中心,专业提供代次低、周期短、活性好的细胞株。与国内外多家研制单位，生物医药，第三方检测机构，科研院所有着良好稳定的长期合作关系！欢迎广大客户来询！

中草药作为中药材是中华民族在与疾病长期斗争的过程中积累的宝贵财富。国务院印发的《中医药发展战略规划纲要》中也倡议充分利用现代科学技术推动中药发展。中草药囊泡作为疾病治疗药物或药物载体具有免疫原性低、安全性高、可大批量低成本生产制备等优势，对于中草药囊泡的研究和应用符合国家对促进中医药传承创新发展和中医药科技战略发展目标的要求。但同时目前人们对于中草药囊泡的研究比较浅显，面临一些挑战：如中草药囊泡提纯方法的开发和标准化、特异性标志物的筛选、生物安全性评价研究等。为了克服中草药囊泡的这些缺点，应优化其分离方法以获得稳定的纳米囊泡，并评估其形态特征、定量和活性成分等与功能相关的详细信息。对于中草药囊泡来说，分离与鉴定，质量控制等环节仍存在争议与分歧，尚缺乏统一标准。中草药囊泡研究与应用是中医药现代化新机遇，应用前景无限，机遇与挑战并存。为推动中草药囊泡的发展，由全国中草药囊泡研究与应用专家委员会牵头，汇聚来自全国中草药囊泡领域的专家力量，率先形成“中草药囊泡研究与应用专家共识”，致力于建立安全、有效、可控的精准化中草药囊泡研究和应用体系，该共识发表于2024年1月的《中草药》杂志上。共识中对中草药囊泡命名方法、分离方法、质量控制及其应用进行了比较详细的描述。其中，厦门福流生物(NanoFCM Inc.)自主研发的纳米流式检测技术被正式纳入其中，作为中草药囊泡质量控制环节的重要表征标准，承担了中草药囊泡粒径、浓度和纯度表征的重要角色。Reference 参考文献 中国研究型医院学会细胞外囊泡研究与应用专业委员会中草药囊泡研究与应用专家委员会.中草药囊泡研究与应用专家共识（2023年版）[J].中草药,2024,55(1):12-22.

植物外泌体样纳米囊泡（plant exosome-like nanovesicles，PELNVs）是源于植物真核细胞的多泡体，通过后者与质膜融合释放到细胞外的一种膜性小囊泡。与此同时，来源于药用植物的姜黄(Curcuma longa)作为一种中药，常用于降血脂、抗肿瘤、抗炎等疾病，姜黄素作为从姜黄中所提取的一种天然疏水多酚，姜黄外泌体样纳米囊泡除了具有相应药理作用外，还兼具纳米载体的独特形态与组成特征，相比哺乳动物来源和人工合成的纳米囊泡，姜黄植物外泌体纳米囊泡具有来源广泛、价廉易得、功能丰富等优势，因此具有大规模生产的可行性。炎症性肠病（IBD），是一种特殊的慢性肠道炎症疾病，主要包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。随着生活水平的提高和饮食结构的变化，我国IBD发病率有不断攀升的趋势，已逐渐成为我国消化科的常见病。发展IBD诊疗新技术、新方法，将为IBD的综合防治提供有效依据，研究人员受姜黄药物价值的启发，进一步研究了姜黄外泌体样纳米囊泡在IBD治疗中的作用及分子机制。作者首先将植物姜黄用萃取器均质，然后采用蔗糖梯度超离心法获取姜黄外泌体样纳米囊泡(TDNPs)，并通过透射电镜、原子力显微镜、质谱分析等方式对TSNPs 1和TDNPs 2做出相关比较（图1）。图1. TDNPs的分离、纯化与表征接下来，作者研究了TDNPs 2的靶向性，使用IVISense™ DiR 750 (XenoLight™ DiR)标记TNDPs，灌胃结肠炎小鼠。通过Perkinelmer的IVIS成像系统对消化道、肠系膜淋巴结（MLN）和重要器官（心、肝、脾、肺和肾）进行成像，发现与PBS组、TDNPs 1治疗组的小鼠相比，TDNPs 2治疗组的小鼠结肠中有强烈的DIR信号，证实了TNDPs 2优先作用于炎症结肠部位（图2）。图2. TDNPs 2优先作用于炎症结肠部位随后在TDNPs 2优先定位于炎症结肠的条件下，进一步研究了TDNPs 2对DSS诱导结肠炎的影响，通过构建小鼠结肠炎模型，使用炎症探针通过化学发光成像进行监测。Lcn-2作为一种有吸引力的肠道炎症生物标志物，被用来监测肠道炎症的进展。作者通过研究Lcn-2在DDS、DSS+TDNPs 1、DSS+TDNPs 2三组中的水平变化，证实了TDNPs 2可减轻DSS诱导的结肠炎。IVIS生物发光结果显示，DSS组和DSS+TDNPs 1治疗组小鼠的腹部显示较强的生物发光信号，表明消化系统内存在严重的炎症反应。相反，虽然DSS+TDNPs 2治疗组的小鼠腹部仍有部分生物发光信号，但强度远低于DDS组和DSS+TDNPs 1治疗组小鼠。作者同时还评估了结肠组织中髓过氧化物酶(MPO) 、促炎细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)和氧化应激相关蛋白HO-1的表达水平，证实了TDNPs 2具有明显的抗炎和抗氧化作用（图3）。同时作者评估了TDNPs 2是否能够加速结肠炎的快速消退。通过体外伤口愈合试验，证实了TDNPs 2处理的细胞具有最快修复创面的速度，能够显著缓解DSS诱导的溃疡性结肠炎及促进炎症的快速消退。图3. 口服TDNPs 2可减轻DSS引起的结肠炎随后该团队为满足潜在临床应用，首先评估了TDNPs 2对Caco2细胞的毒性，通过MTT、ATPLite、细胞凋亡、活化caspase-3/7等证明了TDNPs 2具有良好的生物相容性。接下来，通过H&E染色对肝脏等器官进行组织学分析，证实了TDNPs 2在体内的生物安全性。最后作者研究了TDNPs 2是否影响NF-κB信号通路，NF-κB是一种重要的核转录因子，在调节炎症反应中发挥着重要作用。姜黄素是一种NF-kB抑制剂，具有广泛的性能。作者通过检测NF-κB p65依赖的荧光素酶活性、磷酸化NF-κB p65表达和p65转位到细胞核的共聚焦成像，表明了TDNPs 2可以抑制LPS对NF-κB通路的激活。同时为了研究TDNPs 2在体内对NF-κB通路的抑制作用，采用NF-κB-RE-Luc转基因小鼠对NF-κB进行了研究。通过采集重要器官(心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺)和结肠并成像。IVIS生物发光结果显示，心肝脾肺肾的生物发光信号相似，表明NF-κB在这些器官中的活性相似。相反，结肠的生物发光信号，TDNPs 2治疗组较DSS组明显降低。表明了TDNPs 2是通过抑制NF-κB信号通路发挥保护作用（图4）。图4. TDNPs 2通过抑制NF-κB信号通路发挥保护作用参考文献Oraladministration of turmeric-derived exosome-like nanovesicles withanti-inflammatory and pro-resolving bioactions for murine colitis therapy. JNanobiotechnol 20, 206 (2022).https://doi.org/10.1186/s12951-022-01421-w