小鼠粪样代谢产物

前言 药物代谢(drug metabolism)是研究药物在生物体内的吸收、分布、生物转化和排泄等过程的特点和规律的一门科学，即药物分子被机体吸收后，在机体作用下发生的化学结构转化。也是药物研发产业链中的重要环节，贯穿药物研究过程的始终。本实验涉及黄酮类成分在大鼠体内代谢的研究，大鼠灌胃给予药物，累积24h尿液，尿液经处理，运用各种色谱手段，分离得到目标代谢产物。在此过程中有一关键的因素时刻威胁着我们，即代谢产物的降解，因此要设法保证代谢产物的稳定，如低温保存样品，调节尿液的酸碱性，等等。 本实验利用Ultimate XB-C18对两个重要的代谢产物在尿液中的稳定性进行简单的考察。1.Chemical and reagents 甲醇(色谱纯，天津大茂)，水(哇哈哈纯净水，杭州)，三氟乙酸(TFA, Dikma, USA)，其它试剂均为分析纯。2.animals Wista大鼠(220-250g，SPF级，由本校动物实验中心提供)3.HPLC analysis of two important metabolites Waters 高效液相色谱系统，由Waters Model 600 controller液相色谱，Millennium 32 工作站，Model Delta 600 泵，以及Waters 996 DAD检测器组成。 色谱柱：Ultimate XB-C18柱(5μm, 4.6x250mm) 流动相：A通道：甲醇，B通道：水(0.05%TFA)=(20:80, v/v) 流 速：1mL/min 柱 温：35℃ 检测波长：190-400nm扫描 进样量：20μL3.Sample preparation 代谢产物M1和M2之前已制备分离得到，各取1mg，混合溶于2mL水中(M1和M2水溶性很强，也可溶于甲醇)，取20μL进样分析；剩余部分置于250mL锥形瓶中，加入新鲜收集的大鼠尿液10mL，室温放置24h，之后该混合溶液，过ODS亲水柱，先用水洗脱，弃去，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱溶液，45℃浓缩并定容至2mL。取20μL进样分析。4.Results and discussionhttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/07/201107010000_302457_2160661_3.jpg图1. M1与M2纯品混合色谱图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/06/201106302310_302433_2160661_3.jpg图2. M1与M2纯品混合色谱图(局部放大图10-20min)http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/06/201106302310_302434_2160661_3.jpg图3. M1与M2在尿液中放置24h后色谱图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/06/201106302310_302435_2160661_3.jpg图4. M1与M2在尿液中放置24h后色谱图(局部放大图20-30min)5.conclusion 1. M1与M2在尿液中放置24h后发生了降解，在保留时间为25分钟左右，出现2个降解产物，其紫外吸收与M1和M2分别对应相似，M1紫外吸收(~271nm, ~310nm), M2紫外吸收(~273nm, ~343nm)。 2. 降解产物可能为M1与M2水解产物，因为M1与M2为极性较大的代谢产物，推测可能为葡萄糖醛酸或硫酸结合产物，其降解过程可能为水解脱掉葡萄糖醛酸基或硫酸基。 3. 这样的结果提示我们，在研究黄酮类成分的代谢过程中要注意样品的保存，在收集到尿液后要快速处理，或者在收集的过程中就进行预防，所采用的方法文献报道有加入乙醇或加酸调pH至5左右，可以防止该类代谢产物的降解。Acknowledgement感谢月旭公司提供Ultimate XB-C18柱。

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作者：http://d.g.wanfangdata.com.cn.www.auth.njfu.edu.cn/Images/head_pic.gif张鹏 http://d.g.wanfangdata.com.cn.www.auth.njfu.edu.cn/Images/head_pic.gif仇峰 http://d.g.wanfangdata.com.cn.www.auth.njfu.edu.cn/Images/head_pic.gif魏广力 http://d.g.wanfangdata.com.cn.www.auth.njfu.edu.cn/Images/head_pic.gif刘昌孝 http://d.g.wanfangdata.com.cn.www.auth.njfu.edu.cn/Images/head_pic.gif钟大放 Author：ZHANG Peng QIU Feng WEI Guang-li LIU Chang-xiao ZHONG Da-fang 作者单位：沈阳药科大学药物代谢与药物动力学实验室,沈阳,110016 沈阳药科大学药物代谢与药物动力学实验室,沈阳,110016;天津药物研究院,天津药代动力学与药效动力学省部共建国家重点实验室,天津,300193 天津药物研究院,天津药代动力学与药效动力学省部共建国家重点实验室,天津,300193 沈阳药科大学药物代谢与药物动力学实验室,沈阳,110016;中国科学院上海药物研究所,上海,201203摘要： 目的 考察SIPI在大鼠体内的代谢转化.方法 采用液相色谱-质谱(LC-MSn)联用技术,检测在单剂量静脉注射给予SIPI后大鼠尿,粪及胆汁中的SIPI及代谢物.色谱柱为Diamonsil C18柱;流动相为甲醇-水-甲酸(40∶60∶0.5),流速为0.5mL·min-1;质谱仪离子源为电喷雾离子源(ESI),正离子方式检测.代谢物经LC-MSn方法分离和分析,通过质谱和色谱行为推测其结构.结果 在大鼠尿样中共检测到8种代谢物,在大鼠粪样中共检测到4种代谢物,在大鼠胆汁样品中共检测到3种代谢物.结论 SIPI在大鼠体内广泛代谢,形成多种代谢产物.http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/08/201208271754_386607_2379123_3.jpg

盐酸芬戈莫德在大鼠体内代谢的尿液及胆汁样品分析芬戈莫德最初是由冬虫夏草(子囊菌亚门赤僵菌)培养液中提取的抗生素成分经化学修饰后合成的免疫抑制剂。药物及实验动物：盐酸芬戈莫德为本所研制，实验用大鼠为Wistar雄性大鼠，6-8周龄，体重范围约200-250g/只，本所实验中心提供；大鼠代谢笼为苏州动物实验仪器厂产品。色谱条件色谱柱：Acquity BEH C18 (100mm×2.1mm,1.7μm)流动相：A：水（0.05%TFA）B：乙腈（0.05%TFA）质谱条件结果分析：通过比较大鼠灌胃盐酸芬戈莫德溶液后收集的尿液样品、空白尿液样品及分到的代谢产物的高分辨质谱和多级质谱数据，在给药后的尿液中共鉴定出了8个代谢产物（如下图）所有代谢产物的高分辨质谱数据的准确度均小于1PPm。通过比较大鼠灌胃盐酸芬戈莫德溶液后收集的胆汁样品、空白胆汁样品及分到的代谢产物的高分辨质谱和多级质谱数据，在给药后的胆汁中共推测出了4个代谢产物(如下图)。所有代谢产物的高分辨质谱数据的准确度均小于1PPm。结果与讨论：经过对于给药后大鼠尿液及胆汁样品分析，初步推测盐酸芬戈莫德在大鼠体内的代谢产物有8种。

高效液相色谱法分析苯并芘大鼠肝脏线粒体的代谢产物 本实验建立了一种用高效液相色谱法分析苯并芘及其在大鼠肝脏线粒体中的六种代谢产物的分析方法。使用乙腈、水梯度洗脱作为流动相，紫外探测器分析得到苯并芘的羟基化代谢产物以及苯并芘酮，包括3-羟基苯并芘、9-羟基苯并芘、苯并芘4,5-二氢二醇、苯并芘-7,8-二氢二醇、9，10-二羟基-9，10-二氢苯并芘、苯并芘二酮。其中苯并芘二酮含量最低。该实验结果对于推断细胞CYP1A1酶在体内体外模型中对于苯并芘增毒和解毒作用奠定了重要的基础。 前言：苯并芘是苯与芘稠合而成的一类多环芳烃，苯并芘和其他多环芳烃主要是有机物的不完全燃烧或热解生成，并且在环境中普遍存在。除了污染空气的吸入，摄入的主要途径有吸烟和饮食以及一些职业的摄入如煤、焦炭、沥青的燃烧以及煤焦油的使用。苯并芘能够导致细胞毒性、致畸致突变的毒性以及致癌的毒性。动物实验长期暴露于苯并芘中可导致动物的皮肤、胃、肺组织的癌变。苯并芘在作用于DNA之前需要代谢活化，这也是苯并芘发挥毒性很重要的代谢步骤。细胞色素P450（CYP）酶和环氧化物酶是主要的苯并芘的活化酶,首先CYP酶将苯并芘氧化为环氧化物然后在环氧化物水解酶的作用下生成二氢二醇，CYP同工酶将其进一步的活化为活性成分苯并芘-7,8 - 二氢二醇-9,10 - 环氧化物（BPDE），其可作用于DNA，其优先在鸟嘌呤残基上形成加合物，该加合物是BPDE在体内体外试验中于DNA主要的加合物。在CYP酶中，CYP1A1和B1认为是BaP代谢活化中重要的酶，但是CYP1A1在体内排毒的作用较大于其活化BaP的作用。为了解释这些发现，BaP的体内体外代谢与解毒作用应该进一步进行评价，定性和定量分析BaP在CYP同工酶和环氧化物酶下的所有代谢产物，以及这些致癌物与DNA加成物的评价也很有必要。本实验优选色谱条件使得BaP在大鼠肝脏线粒体内的代谢产物能够很好的分离以及通过紫外检测器灵敏的检测。苯并芘在生物体内的代谢步骤：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409291248_516273_2360169_3.jpg材料和方法试剂甲醇（色谱级）乙腈（色谱级），苯并芘 ,NADP+,葡萄糖-6-磷酸，二喹啉甲酸，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶微粒体的制备微粒体来自于10只SD大鼠的肝脏，预先用苏丹I处理。微粒体蛋白质浓度通过二辛可宁酸蛋白质测定法测定，牛血清蛋白作对照。CYP同工酶的含量通过示差光谱测定。孵化体系：用于研究BaP代谢的孵化体系包含有100mM磷酸钠缓冲液（pH7.4），NADPH生成体系（1毫NADP+，10mL D-葡萄糖-6 - 磷酸，1U/mL的D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）,0.5mg的微粒体蛋白质，50μM的BaP（溶于5μl甲醇），总体积为500微升。通过加入50μl的NADPH生成体系来启动反应的发生。孵育体系通过未加入酶体系或无NADPH生成体系或无的BaP来控制。孵化在敞开的试管中进行（37℃），20分钟后，取5μl 1mM的非那西丁乙醇溶液加入作为内标物。BaP的代谢物用乙酸乙酯（2×1毫升）萃取两次，并蒸发至干。将样品溶解在25μl的甲醇，通过HPLC分离。BaP代谢物的HPLC分析：安捷伦液相1200高效液相色谱仪配紫外可见检测器，色谱柱为diamonsil 4.6﹡150﹡5u色谱条件：所用的色谱条件如下表： 时间流动相A(乙腈)流动相B（水）流速00%100%0.6ml/min3530%70%4060%40%4580%20%50100%0%我们还对代谢产物进行了质谱

姜黄素对β-淀粉样蛋白致小鼠空间学习记忆障碍的改善作用阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种常见的慢性进行性精神功能衰退性疾病。近年来，研究发现AD患者大脑中的主要成分β-淀粉样蛋白（Aβ）明显增多，Aβ可能是该病发病机制的起始因素和关键环节。 姜黄素为二苯庚烷类化合物具有较明显的抗炎、抗菌、降血脂、抗老年痴呆，但其是否可以对抗Aβ引起的神经毒性未见报道。本文通过研究其对Aβ引起的记忆障碍模型小鼠的保护作用]，为临床可能应用姜黄素治疗老年性痴呆症提供依据。 本题为探讨姜黄素对β[font=Times New Roman]-[font=宋体]淀粉样蛋白[font=Times New Roman]25-35[font=宋体]致小鼠空间学习记忆障碍的改善作用。方法采用侧脑室一次性注射[font=Times New Roman]β-[font=宋体]淀粉样蛋白4μl[font=宋体]导致小鼠空间学习记忆障碍模型，采用隐藏平台获得实验和空间搜索实验，观察姜黄素[font=Times New Roman]J（5、2、1 mg·kg-1[font=宋体]）对空间学习记忆障碍模型小鼠的保护作用。结果显示姜黄素各个剂量组均能明显改善β-淀粉样蛋白致小鼠空间学习记忆障碍，能明显缩短寻找站台潜伏期和游泳路径。材料与方法1 材料与仪器1.1 [font=楷体_GB2312]动物 雄性昆明种小鼠，上海实验动物中心提供。1.2 药品和试剂[font='Times

前言 代谢产物的鉴定在药物代谢研究过程中意义重大，如何准确地鉴定代谢产物的结构一直是广大药物代谢研究工作者致力攻克的难题。代谢产物的鉴定之所以难主要有以下几点原因：1.代谢产物在生物样品(血浆、尿液、胆汁、粪便等)中浓度极低。2.代谢产物容易受生物样品中内源性物质的干扰。3.代谢产物的不稳定性。4.仪器的灵敏度不够，等等。目前鉴定代谢产物的方式多为通过HPLC与质谱检测器进行联用推测代谢产物的结构，但该方法存在缺陷，如对同分异构体束手无策等。本实验前期通过专业的分离技术，得到某代谢产物M1，为重要的Ⅱ相代谢产物，该代谢产物因为量少(6mg)无法完全通过核磁鉴定，本文通过核磁给出的结构信息结合酶水解巧妙地鉴定了该代谢产物的结构，涉及保密，只给出有差别的部分结构信息。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/12/201112280311_341823_2160661_3.jpg1.试剂 色谱甲醇(Fisher)，去离子水(Eyela Still Ace, SA-2100 E1, 日本）,三氟乙酸(TFA,Dima)，β葡萄糖苷酶(Sigma)。2.液相色谱条件 Shimadzu HPLC system, 由LC-10ATVP 泵, SPD-10AVP 紫外检测器, 以及CTO-10ASVP 柱温箱组成, 工作站为浙江大学N3000工作站。 色谱柱：Ultimate XB-C18柱(5μm, 4.6x250mm) 流动相：A通道：甲醇，B通道：水(0.05% TFA) 流 速：A通道0.500mL/min；B通道0.500mL/min 柱 温：30℃ 检测波长：275nm 进样量：20μL3.样品准备 对照品溶液的配置：取各纯品0.5mg，加入1mL50%甲醇水溶液，涡旋1mL，微孔滤膜过滤。水解过程：取代谢产物M1 0.5mg，溶于1mL水中，加入适量葡萄糖水解酶，37℃孵育2h，加入2mL的乙酸乙酯萃取，萃取2次，合并萃取液，45℃减压浓缩至干，用1mL50%甲醇水溶液溶解，进样分析。 4.结果与讨论http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/12/201112280325_341830_2160661_3.jpg图1.代谢产物M1水解前的分析图谱(tR=8.951min)http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/12/201112280315_341825_2160661_3.jpg图2.代谢产物M1水解后的分析图谱(tR=8.958min为剩余的未水解的M1，tR=14.720min为水解产物)http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/12/201112280325_341831_2160661_3.jpg图3.已知化合物C1的分析图谱http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/12/201112280325_341832_2160661_3.jpg图4.已知化合物C2的分析图谱http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/12/201112280326_341833_2160661_3.jpg图5.水解产物与C1和C2合并进样分析图谱1.代谢产物M1只有6mg，理论上核磁是可以鉴定的，但基于一些原因，核磁谱图结果不理想，只能通过别的方法鉴定。但是从图1来看，代谢产物M1的纯度是很高的，如果用面积归一化法来计算的话，其含量至少在95%以上，但作者在此给大家透露点信息，代谢产物不同于植物中的化学成分，即使在色谱图上显示单一的色谱峰，但绝对纯度不一定很高，往往有未知的内源性成分如影子一样伴随着它，作者推测这可能是核磁图谱测试不理想的原因之一。2.机缘巧合的是，代谢产物M1两种水解产物均作为已知化合物被作者分离得到，并准确鉴定，因此剩余的实验就显得顺理成章。3.化合物C1和C2在结构上很相似，仅仅是葡萄糖醛酸基的位置不同，因此其表现在色谱行为上的差别也很小，如图5所示，二者没有达到基线分离。4.从各分析图谱可以看出，相同化合物的保留时间重现性非常高，且峰形之正太有目共睹，体现了Ultimate XB-C18柱的优越性能，保证了代谢产物结果鉴定的准确性。具体参数如：理论塔板数、分离度、对称因子等在此不一一列举。5.在整个分析过程中系统压力为19.4MPa左右，波动不超过0.2，换算为PSI也仅为2800左右，在流动相比例为50%的情况下，如此低的压力给测试者营造了“轻松的”实验氛围，避免了系统压力高产生的漏液报警的烦恼。6.一句话小结：本实验运用酶水解结合HPLC分析，成功鉴定了代谢产物M1的结构。

人体及大鼠对淫羊藿苷片的代谢分析 淫羊藿苷为中药淫羊藿的提取物，淫羊藿苷现代药理实验研究表明：淫羊藿能增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢 ,具有抗衰老、抗肿瘤等功效。 本试验旨在探讨淫羊藿苷在人体内的代谢情况，为药学研究的重要组成部分，希望能够阐明其在体内的作用机制，为临床合理用药提供科学依据，并为系统的药代动力学研究提供参考。材料与方法：淫羊藿干片（自制）、乙腈（色谱纯）、去离子水（自制）、三氟乙酸、旋转蒸发仪、沃特斯液相配DAD检测器。色谱条件：色谱柱：菲罗门色谱柱（4.6mm×250mm, 5μm）流动相：A：水（0.05%TFA）B：乙腈-水（50:50，V/V 0.05%TFA）http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/11/201411280947_524999_2165260_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/11/201411280947_525000_2165260_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/11/201411280947_525001_2165260_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/11/201411280947_525002_2165260_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/11/201411280947_525003_2165260_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/11/201411280947_525004_2165260_3.jpg结果与讨论：1、大鼠及人体对于淫羊藿干片的代谢产物基本一致，只是各产物含量方面有所差异。2、本次试验的分析方法适用于淫羊藿苷片代谢产物的分析研究，准确，操作简便。3、三氟乙酸的运用可有效改善峰型，在考察中由于乙酸和磷酸盐缓冲液。

前言 药物代谢(drug metabolism)是研究药物在生物体内的吸收、分布、生物转化和排泄等过程的特点和规律的一门科学，即药物分子被机体吸收后，在机体作用下发生的化学结构转化。也是药物研发产业链中的重要环节，贯穿药物研究过程的始终。排泄是药物代谢研究过程中的一个重要环节，本实验涉及的是某黄酮成分在大鼠体内排泄的研究。1.Chemical and reagents 甲醇(色谱纯，天津大茂)，水(哇哈哈纯净水，杭州)，三氟乙酸(TFA, Dikma, USA)，其它试剂均为分析纯。2.animals Wista大鼠(220-250g，SPF级，由本校动物实验中心提供)3.HPLC analysis of two important metabolites Waters 高效液相色谱系统，由Waters Model 600 controller液相色谱，Millennium 32 工作站，Model Delta 600 泵，以及Waters 996 DAD检测器组成。 色谱柱：Ultimate XB-C18柱(5μm, 4.6x250mm) 流动相：A通道：甲醇，B通道：水(0.05%TFA) 梯度洗脱，具体流程未透露 流 速：1mL/min 柱 温：30℃ 检测波长：190-400nm扫描 进样量：20μL3.Sample preparation 大鼠灌胃给予该成分，剂量为30mg/200g，15min后用20%的乌拉坦溶液腹腔注射麻醉，行胆汁插管手术，缝合伤口，用规格为15mL的离心管收集12h内的胆汁，收集的胆汁过ODS，水洗脱，之后用甲醇洗脱，甲醇洗脱部分定溶到某体积，取一定体积过0.45μm微孔滤膜，HPLC分析，相同条件下与尿液中的代谢产物进行对照，确定该成分经大鼠灌胃后胆汁中排泄的代谢产物。4.Results and discussionhttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110042336_321120_2160661_3.jpgFig. 1. The HPLC chromatogram of blank bile.http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110042337_321121_2160661_3.jpgFig. 2. The HPLC chromatogram of bile sample(12h).http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110042338_321122_2160661_3.jpgFig. 3. The HPLC chromatogram of urine sample.讨论1. 首先要说明的是此部分实验是之前实验的续集，所以之前的实验请参考我以前发的体验贴，图3给出的是尿液中代谢产物的色谱图，从图中我们可以很明确地看到8个代谢产物的色谱峰，这8个色谱峰已经通过各种柱色谱手段分离得到，且结构已经用1D NMR和2D NMR以及MS等谱学手段进行了鉴定。讨论2. 图1和图2 分别为胆汁空白和样品色谱图，从该结果可知，有5种主要的代谢产物（M1 M2 M5 M6和M7）以及少量的M8经胆汁排泄，主要是通过保留时间，和紫外吸收进行了指认。讨论3. 此外我们还发现，尿液中大量存在的代谢产物M3不经胆汁排泄。讨论4. 通过对该成分在大鼠尿液中的代谢和胆汁排泄研究，我们可以得出这样的结果，尿液的内源性成分多为极性较大成分，多集中在保留时间靠前的范围，而胆汁中的内源性物质极性较小，如图2中50min左右的成分。讨论5.该实验尚未发表，因此代谢产物的结构不便透露，待发表之后，具体的结果会和广大息友进行交流。讨论6.最后也是最重要的，Ultimate XB C18柱对该类代谢产物表现了良好的保留能力和分离性能，代谢产物因为其结构中会结合亲水基团，如硫酸基，葡萄糖醛酸基等使其极性增加，易于从体内排出，因此这些成分往往表现了比较差的色谱行为，如强酸性导致的拖尾现象，因此需要在流动相中加入酸或者其它试剂进行调节，本实验流动相均为甲醇：水（含0.05%TFA），在此条件下，这些代谢产物在Ultimate XB C18柱上表现了良好的色谱行为。

[align=center]一种简便测定小鼠耗氧量的实验方法[/align][align=center]西安国联质量检测技术股份有限公司[/align][align=center]安评中心：苏敏[/align][b] 1引言[/b]小鼠在密闭的缺氧瓶内不断消耗氧气，而产生CO[sub]2[/sub]，CO[sub]2[/sub]被缺氧瓶中的钠石灰所吸收，瓶内氧分压逐渐降低而产生负压，缺氧瓶与水减压计接通，由于负压吸引将水柱内侧液面上升。及时由滴定管中滴入一定水，使水减压计恢复至原先的压力水平,保持小鼠处于常压状态下,记录所滴入装置中的水容积，以此表示在一定时间内，小鼠吸取的O[sub]2[/sub]的容积。黄芪是经典的补气药,具有利尿,强壮,降压,提高机体免疫功能等作用。本实验通过黄芪降低耗氧量的实验研究，介绍了小鼠整体耗氧量的测定的装置。[b]2材料与方法[/b]2.1材料动物：小鼠，体重18～22g，雌雄均有。器材：小鼠氧耗量装置（125ml缺氧瓶，200ml具塞广口瓶和微量滴定管,水减压计），秒表。药品及试剂：黄芪水煎液（2g/ml），普萘洛尔，钠石灰，凡士林。2.2方法2.2.1分组及给药选取体重18～22g健康小鼠48只，雌雄兼用，分别称重，编号，按体重和性别均分为4组: 生理盐水组,黄芪水煎液组,普萘洛尔组。生理盐水组小鼠每只腹腔注射等容量的生理盐水，黄芪水煎液组每只腹腔注射黄芪水煎液3g/kg，每只皮下注射ISP20mg/kg 普萘洛尔组，每只皮下注射普萘洛尔30 mg/kg。2.2.2测定方法 在室温25℃条件下，将微量滴定管及通气管插入200ml具塞广口瓶内；125ml缺氧瓶内，插上水减压计；用导管将缺氧瓶与广口瓶相接，如图1所示。20～45分钟后，测定小鼠5分钟内的耗氧量。将小鼠放入缺氧瓶内，盖好盖子，关闭与大[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]通的地方（空气入口处和滴定管活塞，水减压计开口处），通入空气，此时水减压计的压力即为常压状态下的压强。立即停止通气，此时开始记录时间，当小鼠呼出的CO[sub]2[/sub]，被钠石灰吸收时，装置内的气体容积减少，水减压计压力降低，及时从滴定管加水至装置中,使水减压计恢复至常压状态下压强。由滴定管放入装置中的水容积，即代表5分钟内该小鼠吸取O[sub]2[/sub]的容积，可以毫升表示，从而判断药物有无降低机体的氧耗量作用。 [align=center][img=,690,512]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807011428075958_3362_2904018_3.png!w690x512.jpg[/img] [/align][align=center]图1 氧耗量测定装置[/align][align=center]1.缺氧瓶2.水减压计3.滴定管4.广口瓶[/align][b]3结果[/b]普萘洛尔和黄芪水煎液组耗氧率显著降低，黄芪组的耗氧量降低幅度稍弱于普萘洛尔组。[b] 表1 黄芪水煎液对小鼠整体耗氧量的影响（[/b][img=,14,18]file:///C:\Users\ADMINI~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wpsF5F9.tmp.png[/img][b]±ѕ ， n=10）[/b][table][tr][td][align=center][b]组别[/b][/align][/td][td][align=center][b]剂量(mg/kg)[/b][/align][/td][td][align=center][b]5分钟累积耗氧量（ml/只）[/b][/align][/td][/tr][tr][td][align=center]生理盐水[/align][/td][td][align=center]10[/align][/td][td][align=center]5.43±0.33[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]普萘洛尔组[/align][/td][td][align=center]30[/align][/td][td][align=center]3.2±0.55[sup]**[/sup][/align][/td][/tr][tr][td][align=center]黄芪水煎液[/align][/td][td][align=center]3000[/align][/td][td][align=center]4.25±0.42[sup]**[/sup][/align][/td][/tr][/table]与生理盐水组比较：[sup]*[/sup][i]P[/i]0.05，[sup]**[/sup][i]P[/i]0.01[b]4讨论[/b]本文介绍一种在缺氧实验及抗心肌缺氧药物筛选中简易的方法，所用装置使用方便，耗资少。测定装置各接口处应密封无漏气，可涂少许凡士林于口密封。实验测氧耗量时，计时应准确。动物体重、室温、玻瓶容积等因素对实验结果有一定影响，实验中应加以控制。当小鼠耗氧量较多时，由于水比重小，水很容易通过虹吸现象进入缺氧瓶内，影响实验的进行。因此，连接缺氧瓶与广口瓶的导管不应离液面太近。应及时补充滴入水。由于钠石灰吸收CO[sub]2[/sub]会饱和，每测定1只小鼠要换钠石灰，否则影响实验结果准确性。小鼠整体氧耗量测定还可用小鼠放在密封小瓶内，通过连接测氧仪测定氧耗量。各组实验在一个时间段内进行。也可以用测氧仪来测耗氧量。[align=left][b]参考文献[/b]陈奇．中药药理研究方法学．北京：人民卫生出版社，2006：782．[/align]

LC-MS对盐酸芬戈莫德在大鼠体内的代谢分析 芬戈莫德最初是由冬虫夏草(子囊菌亚门赤僵菌)培养液中提取的抗生素成分经化学修饰后合成的免疫抑制剂。芬戈莫德是鞘氨醇的结构类似物，研究显示，该药具有与其他药物完全不同的免疫抑制机制，在体内磷酸化后与位于淋巴细胞上的鞘氨醇-1-磷酸受体(S1PR)结合，通过改变淋巴细胞的趋化，促使淋巴细胞在淋巴组织内滞留，从而减少自身反应性淋巴细胞再次进入循环的几率，进而防止这些细胞浸润中枢神经系统(CNS)。进而达到免疫抑制效果。而且该过程是可逆的，停药后淋巴细胞水平即可以恢复正常。临床研究表明，口服制剂芬戈莫德针对复发-缓解型多发性硬化症疗效确切，优于目前的常用MS治疗药物干扰素β-1a注射剂(Avonex，已用于多发性硬化症的临床治疗药物)。芬戈莫德可靶向作用于对中枢神经系统(CNS)有潜在自身攻击性的淋巴细胞，促进神经保护与修复过程，降低MS的复发率，延缓损伤的进展过程，减少颅内核磁共振成像(MRI)病灶的数量，减轻病灶的严重程度。 药物及实验动物： 盐酸芬戈莫德为本所研制，实验用大鼠为Wistar雄性大鼠，6-8周龄，体重范围约200-250g/只，本所实验中心提供；大鼠代谢笼为苏州动物实验仪器厂产品。 色谱条件色谱柱：Acquity BEH C18 (100mm×2.1mm,1.7μm)流动相：A：水（0.05%TFA）B：乙腈（0.05%TFA）http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/11/201411281531_525077_2217446_3.jpg 质谱条件 Waters LCT Premier XETM型飞行时间质谱仪，W-负离子模式；毛细管电压2200 V；锥孔电压35 V；离子源温度120℃；脱溶剂气温度350℃；脱溶剂气流量10L /h；锥孔气流量700 L /h；质量扫描范围m /z 50 ~ 1200；扫描时间0.2s。 给药方案与样品的收集： 血浆样品的收集健康雄性wistar大鼠3只，体重180-220g，1只为空白对照组，2只为给药组（取血时间30min和120min），给药前禁食12h，期间自由饮水。灌胃给药剂量为35 mg/kg，给药体积为1.5mL/只，给药30min和120min后，分别于颈动脉取全血，置于涂有肝素的离心试管中，3500prm离心10min，分离血浆，于-20℃冰箱中保存，直至分析。 血浆样品的预处理 取0.5ml血浆，置于离心管中，加入5倍的乙腈，3500prm离心10min，除去蛋白，取上清液，在40℃，旋转蒸干，用50%甲醇溶解，涡旋，11000prm离心10min，取2μL进行分析。 结果分析 对大鼠灌胃盐酸芬戈莫德溶液后收集的血浆样品用乙腈沉淀蛋白前处理方法处理之后，进行TOF-MS/MS分析，将所得HR-MS，MS2等数据与空白血浆和对照品比较后，在血浆样品中共推测出7个代谢产物。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/11/201411281532_525078_2217446_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/11/201411281532_525079_2217446_3.jpg结果与讨论：1、经过对于给药后大鼠血浆样品分析，初步推测盐酸芬戈莫德在大鼠体内的代谢产物有7种，其结构进一步鉴定中。2、流动相的选择方面进行了优化。流动相的选择主要从溶剂种类和梯度洗脱设置两方面进行优化。分析方法中采用了乙腈作为有机相，原因是乙腈比甲醇具有更大的洗脱强度，从而可以减少色谱峰的展宽，得到较好的峰型，此外，使用乙腈洗脱，其粘度较低，可以减小系统压力。在水相中加入TFA，可以进一步改善化合物的峰型，减少拖尾，此外，TFA的存在还可以提高样品在离子源中的离子化效率，因此，使用乙腈-0.05%TFA水溶液为流动相梯度洗脱，可以使样品分析在 9min之内完成。3、 生物样品中含有许多内源性物质，血浆中含量较高的内源性物质主要是蛋白类成分。蛋白质在测定过程中会形成泡沫，浑浊或沉淀，有时还会与加入的试剂发生反应，从而干扰测定。蛋白还会污染仪器。如果直接进样用液相色谱分析含蛋白的体液样品，蛋白质会逐渐变性沉结在色谱柱上，导致柱效降低，柱压上升，甚至堵塞色谱柱；含有蛋白的样品如果进入离子源，会造成离子源的严重污染和损坏，降低检测的灵敏度，所以血浆样品需进行合理的前处理。常用的生物样品前处理方法有蛋白沉淀法、固相萃取法和液液萃取法。由于待测的代谢产物的极性都比较大，采用液液萃取法(溶剂用乙酸乙酯)对化合物的提取效率差，因此不宜使用。主要比较了蛋白沉淀法和固相萃取法，两种方法均能有效提取待测化合物，经过实验发现，蛋白沉淀法比较好，并且考虑到血浆样品量较少，因此选择蛋白沉淀法。

键和金刚烷基团的ADME色谱柱对于极性化合物能得到良好的保留与分离，对于代谢产物的分析具有优势。如LC Café espresso No.2016005所述，从疏水性及表面极性参数可以对其具有特长的溶出行为进行说明。本次实验以极性化合物别嘌呤醇与黄嘌呤氧化酶反应生成的代谢物别嘌呤二醇，嘌呤体代谢产生的次黄嘌呤、黄嘌呤以及尿酸作为样品（参照图1），分别使用CAPCELL PAK ADME、CAPCELL PAK C18 AQ、CAPCELL PAKC18 MGII以及3种他社杂化型ODS色谱柱（粒径均为5 μm）进行分析，对各色谱柱的溶出行为进行了比较。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/07/201607210842_601338_2222981_3.jpg分析所得色谱图见图2。分析所用HPLC条件如下：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/07/201607210842_601339_2222981_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/07/201607210842_601340_2222981_3.jpg如图2，各化合物的保留随着各色谱图右侧所示色谱柱表面极性的增加而增强。其中，只有键和金刚烷基团的CAPCELL PAK ADME色谱柱实现了尿酸（峰1）与次黄嘌呤（峰2）间的分离；键和C18基团的色谱柱均无法得到良好分离。进一步，在本次进行比较的色谱柱中，CAPCELL PAK ADME所得理论塔板数（别嘌呤醇：峰5）是最高的，彰显了其对极性化合物优异的分析能力。