特异性靶基因

近日，北京大学神经科学研究所的科学家们在Science Advances 杂志发表了题为Development of a CRISPR-SaCas9 system for projection-and function-specific gene editing in the rat brain的研究论文。该研究基于CRISPR-SaCas9技术，结合腺相关病毒和细胞标记技术，以功能特异性模式实现基因编辑，在实验大鼠的脑中实现了特定记忆的精准删除。在研究中，研究人员对基因编辑靶点和潜在的脱靶位点进行扩增建库并使用基因测序仪MGISEQ-200对扩增产物进行深度测序。测序数据分析结果显示：潜在脱靶位点相对于基因编辑靶点在indel发生率方面至少低两个数量级（图1），同时在单细胞水平上对基因编辑后靶点区域的indel信息进行了验证（图2）。与以往的相关研究报道一致，SaCas9对DNA错配有较高的抗性，在体内能够保证高的靶点特异性。图1 基因编辑靶点和潜在脱靶位点序列及indel发生率图2 基因编辑靶点序列及基因编辑后测序结果展示作为一款小型化的桌面型基因测序仪，MGISEQ-200小巧、灵活，应用广泛，支持基于杂交捕获或多重PCR扩增的靶向测序、小型基因组测序、低深度全基因组测序等多种应用。目前，通过MGISEQ-200获得测序数据并由此展开深入探讨的相关研究已陆续见刊。其中，基于MGISEQ-200深度测序的新冠病毒转录组结构研究于4月份登上了Cell杂志，为全球科学家的后续研究提供参考和依据。小贴士MGISEQ-200已发表文章（精选）[1] 一例基孔肯雅病毒和寨卡病毒混合感染病例的发现.华南预防医学.DOI: 10.13217/j.scjpm.2019.0481[2] Devolopment of a CRISPR-SaCas9 system for projection and function-specific geneediting in the rat brain. Science Advances.DOI: 10.1126/sciadv.aay6687[3] Thearchitecture of SARS-CoV-2 transcriptome. Cell.DOI: 10.1016/j.cell.2020.04.011

双特异性T细胞衔接器（bispecific T-cell engager，BiTE）是一种能够同时结合肿瘤相关抗原（tumor associate antigen， TAA）和 CD3 复合物的抗体类抗肿瘤药物。传统的技术是通过靶向TAA 来实现肿瘤内T细胞上CD3信号通路的再激活，从而达到杀伤肿瘤细胞的效果【1-3】。自上世纪90年代起，针对双特异性抗体疗法的设计和改进已经有了近30年的研究。然而，目前为止只有安进公司（Amgen）的Blinatumomab (针对CD19 的 BiTE) 被FDA 批准用于治疗复发或难治性急性淋巴细胞白血病 (acute lymphoblastic leukemia, ALL)【4,5】。以细胞因子风暴（cytokine storm）为主的副作用限制了其他针对实体瘤的BiTE所进行的临床测试。仅在2021年，安进公司就暂停了4种 BiTE的一期临床试验, 所涉及的抗原包括FLT3, BCMA, CD33和EGFRVIII。除了严重的副作用之外，半衰期短，TAA特异性低以及抑制性肿瘤微环境都是限制BiTE在体内发挥抗肿瘤效应的重要因素。因此，提升双特异性抗体的有效性并降低其副作用能够极大的促进该疗法在临床的广泛应用。图1 正在以单药形式进行临床测试的双特异性抗体2021年11月1日，美国德克萨斯大学西南医学中心傅阳心团队在Nature Biomedical Engineering杂志上发表了题为Rejuvenation of tumour-specific T cells through bispecific antibodies targeting PD-L1 on dendritic cells的文章。该研究构建了靶向免疫检验点PD-L1 和CD3ε的双特异性抗体 （PD-L1xCD3）。在多种小鼠肿瘤模型上，PD-L1xCD3比传统的TAA靶向性双特异性抗体（ErbxCD3）展现出了更强的抗肿瘤效果。利用多种条件性敲除小鼠表明，PD-L1xCD3在体内主要结合树突状细胞（dendriticcells， DCs）表达的PD-L1而并非肿瘤细胞或巨噬细胞表达的PD-L1，进而重新激活了肿瘤内部的抗原特异性CD8 T 细胞免疫反应来达到治疗肿瘤的效果。进一步的机制研究表明，PD-L1xCD3与DC上PD-L1的结合，促进了共刺激分子B7和CD28之间的相互作用，从而避免T细胞发生激活诱导的细胞死亡（activation-induced cell death），进而实现肿瘤内T 细胞长效激活的效果。研究团队首先在体外验证了制备的PD-L1xCD3能够同时结合PD-L1和CD3ε，并能够以PD-L1依赖的方式刺激T细胞活化并分泌IFNγ，杀伤肿瘤细胞。体内实验进一步表明PD-L1xCD3能够在MC38模型上产生良好的抗肿瘤效果并优于anti-PD-L1和anti-CD3的联合治疗，从而表明PD-L1xCD3具有其独特的作用机制。通过细胞过继转移和删除实验表明，PD-L1xCD3能够诱导抗原特异性CD8 T细胞反应并产生免疫记忆，而这一现象依赖于肿瘤内预存的CD8 T 细胞。为了研究PD-L1xCD3是否比传统的TAAxCD3具有更强的抗肿瘤效果，作者们制备了靶向TAA的ErbxCD3双特异性抗体，并通过体外实验证明其具有与PDL1xCD3相似的亲和力，激活T细胞能力和肿瘤细胞杀伤能力。然而体内实验却表明，在相同剂量下PD-L1xCD3比ErbxCD3展现出了更强的抗肿瘤效果，并且这一现象在TC1，B16F10，TuBo等多种模型上均得到了验证，提示靶向免疫检验点PD-L1的双特异性抗体比靶向TAA具有更好的激活T细胞能力。为了进一步探究产生这种区别的本质原因，作者们首先通过在不同的细胞上敲除了PD-L1来探寻哪种细胞表达的PD-L1对于PD-L1xCD3在体内的抗肿瘤效果是必须的。出乎意料的是，尽管肿瘤细胞本身是最主要的PD-L1阳性的细胞，但敲除肿瘤细胞上的PD-L1并没有影响PD-L1xCD3的治疗效果。与之相反，敲除宿主细胞上的PD-L1却彻底废除了PD-L1xCD3的治疗效果。通过条件性PD-L1敲除小鼠实验表明，树突状细胞而并非巨噬细胞表达的PD-L1起到了至关重要的作用。作者进一步利用Batf3敲除小鼠确认树突状细胞亚群（cDC1）对于PD-L1xCD3的治疗效果是不可或缺的。前期研究表明，anti-PD-(L)1 治疗能够通过增强B7-1(CD80) 与CD28的相互作用来达到激活T 细胞的效果6, 7。由此，研究人员提出了PD-L1xCD3治疗是通过增强共刺激信号来发挥作用的假设。结果也表明，用抗体阻断CD80/86后，PD-L1xCD3的治疗效果消失同时抗原特异性T细胞反应也大大减弱。通过体外共培养实验证明，PD-L1xCD3能够通过增强共刺激信号的方式促进IL-2的分泌，避免T细胞因过度激活导致的凋亡，从而实现肿瘤内T细胞的长效激活。传统BiTE的设计理念是通过单链抗体（ScFv）衔接T细胞与肿瘤细胞，促使T细胞活化并直接进行肿瘤细胞杀伤。然而，在肿瘤微环境里T细胞的数量和质量都非常有限。而肿瘤细胞不仅数量“占优”并且能够通过激活抑制性信号通路（如PD-L1/PD-1）来逃逸杀伤。与此同时，由于肿瘤细胞本身并不表达共刺激分子，其激活T细胞的效果非常有限。面对数倍于己的“敌军”，T细胞在反复杀伤的过程中很容易产生耗竭而败下阵来。与之相反，作为新型双特异性抗体，PD-L1xCD3能够将T细胞与树突状细胞衔接在一起，从而为其激活提供充足的条件（共刺激分子）。通过与树突状细胞的相互作用，T细胞不仅得到了有效的激活并且能够通过IL-2实现自我扩增。最终实现T细胞的持续性激活并获得持久的抗肿瘤免疫反应。图二：PD-L1xCD3的作用机理综上所述，该研究为新一代双特异性抗体设计提供了思路。证明了PD-L1xCD3 具有优于传统BiTE的如下特点：1）靶向肿瘤组织降低毒性；2）阻断PD-L1/PD-1相互作用，解除T细胞抑制；3）靶向DC细胞为T细胞激活提供共刺激信号，从而促进IL-2介导的T细胞存活。据悉，该论文已被选为Nature Biomedical Engineering 杂志11月份的封面故事。该研究的通讯作者是美国德克萨斯大学西南医学中心的乔健博士和傅阳心教授。刘龙超博士为论文的第一作者。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41551-021-00800-2

肝癌的发病率和死亡率在癌症中位居前列，全世界每年新增病例超过90万，死亡病例超80万。在所有肝癌病例中，肝细胞癌 (HCC)占比约90%，对肝细胞癌高危人群进行有效、高灵敏度的筛查显得尤为重要。目前对肝癌高危人群早筛的方法是肝脏超声检查和血清甲胎蛋白（AFP）监测，其筛查灵敏度从47%-84%不等，特异性在67%-90%之间。因此，当前急需开发灵敏、高效的非侵入性肝细胞癌筛查方法。　　近期，来自美国约翰霍普金斯大学的研究团队在《Cancer Discovery》上发表题为“Detecting liver cancer using cell-free DNA fragmentomes”的文章。该研究开发出一种基于血液的全基因组cfDNA片段化检测方法（DELFI），为HCC检测提供了一种高性能、具有成本效益的新选择。　　研究人员检测了501名训练队列个体的血浆样本，对cfDNA片段进行低覆盖率基因组测序，分析HCC患者中cfDNA的分子来源，并确定了与片段化变化相关的基因组和染色质特征。通过机器学习方法构建DELFI模型。结果显示，在平均风险人群中，DELFI模型对HCC检测的敏感性为88%，特异性为98%；在高危人群中，DELFI模型对HCC检测的敏感性为85%，特异性为80%。此外，研究人员将来自223名香港患者的全基因组序列数据作为验证队列进行检测。在验证队列中，DELFI模型可将AUC为0.97的HCC患者与高危个体区分开来，有效证明了模型的可靠性。　　该研究开发的全基因组cfDNA片段化特征检测方法对HCC具有高灵敏度和特异性，弥补了血清甲胎蛋白监测敏感性低、准确率差的不足，有望为肝癌高危人群提供可靠且具有成本效益的筛查方式。　　注：此研究成果摘自《Cancer Discovery》杂志，文章内容并不代表本网站的观点和立场，仅供参考。

近年来，抗体药物的接连上市和重磅销售引发国内外抗体类生物治疗药物的研发热潮。抗体药物已经成为治疗肿瘤的明星产品。抗体类生物治疗药物的活性测定在质量控制中至关重要。活性测定是对药物的有效成分和含量以及药物效价的测定，是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。相关的生物技术在药物研发质控中的应用对新型抗体药物的发展带来一系列突破。为帮助从事相关研究的用户梳理生物制药质量控制研究技术及方法，仪器信息网特别策划了“抗体药研发的生物活性鉴定及功能分析”相关专题（点击查看）并邀请赛默飞蛋白和细胞分析技术应用高级经理冯彦斌先生分享对于抗体药的看法。他在文中主要分析了国内抗体药物的市场潜力、研发进展以及抗体药研发相关生物活性鉴定和功能分析的先进技术。赛默飞蛋白和细胞分析技术应用高级经理 冯彦斌仪器信息网：您如何看待近年来的抗体药市场发展变化与前景？ 冯彦斌：众所周知，近年来中国抗体药物市场规模增长异常迅猛，尽管目前中国总的抗体药物上市批准数量低于欧美，但增速方面已经接近欧美市场的两倍，蕴藏着巨大的潜力和空间。据统计，2018年我国抗体药物产业总体市场规模约183亿美元，预计2020-2025年平均年增长率为~15%，到2025年，我国抗体药的市场规模将超508亿美元。其主要的驱动因素有：1）肿瘤的发病和死亡率上升； 2）我国创新药优化的审评审批流程；3） 带量采购等政策驱动创新需求； 4）抗体药物逐渐被纳入医保目录。自2020年以来，国家药品监督管理局（NMPA）累计受理了超过200款国产抗体新药的临床试验申请。目前抗体药物研究最热门的靶点包括PD-1/PD-L1、TNF-α、VEGF、HER-2、CD20、EGFR 等。抗体药物最重要的应用领域为自身免疫类疾病和癌症（约65%的市场占比）。随着疾病机制的深入研究，抗体药物在哮喘、抗感染、血液病和心血管病领域的药物不断增加，并迅速拓展到其它相关领域。作为未来生物药的主力军，抗体药物创新研发则显得尤为重要。随着单抗生物类似药进入收获期，双特异性抗体、抗体偶联药物（ADC）、纳米抗体等药物市场也异军突起。创新型抗体加快了开发步伐，多种类型的抗体药物有望得到广泛的临床应用。从抗体创新药品种数量和国内产品临床申报数量上看，排名靠前的为恒瑞医药、复星医药、海正药业，而信达生物和康宁杰瑞产品数量超过了10个。创新类抗体药物基于其高特异性、低毒性、低转化周期等特征，将被更广泛地应用于各类疾病的治疗。未来几年，生物药仍是医疗领域的蓝海，也是人类健康的福音，未来发展前景良好。仪器信息网：近年来抗体制药的发展迅速，对于创新研发技术有何促进？ 冯彦斌：越来越多的研究表明，抗体药物由于靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，近年来已成为生物药行业中发展最快的分支。截至今日，美国FDA陆续批准了多个个治疗性抗体药物，其中传统单克隆抗体和人源化单抗已成主流，双特异性抗体开始初具规模。但在抗体功能优化、新抗体研发，特别是抗体规模化生产，以及抗体药物如何创新等问题仍是我们面临的巨大挑战。随着分子生物学、结构生物学、生物信息学等技术的发展，人们对抗体结构中各功能区的认识进一步加深，现在已经能够通过修改各功能区的序列、结构来赋予抗体新的特性和功能，这是抗体药物创新的基础。近年来抗体偶联药物（ADC）的发展主要依赖于以下研究领域的进展：①靶抗原及其特异性抗体的临床有效性及安全性得到验证，如靶向Her2 抗原的Herceptin 等；②高效的细胞毒性药物，如：美登素（maytansinoid，DM）、单甲基奥利他汀E（auristatin，MMAE）等；③新的连接臂和交联方法的发展，连接臂是决定抗体偶联药物ADC 药物活性的主要因素之一，它们应该在血液循环中相对稳定，到达靶细胞时通过内化进入细胞内，在溶酶体的低pH 条件下或蛋白酶作用下释放小分子药物。交联方法也从利用赖氨酸的随机连接向利用半胱氨酸的定点交联发展。新型药物拓宽了药物的治疗窗，因此备受关注，成为当前抗体药物发展的热点。持续上升的关注热点和研发投入的加大，使得创新技术也不断涌现。双特异性抗体药物由于其更好的特异性和低毒性，也越来越多地被投入研发管线；新靶点的筛选也一直是抗体药发现的努力方向，但其有效性和安全性需要获得更多的临床数据来验证，同时也有学者提出反向筛选靶向抗原的策略，以期通过反向药理学发现更多的候选靶分子。随着研究的持续深入，更多企业也加强了抗体工程下游技术的优化与整合。如在优化细胞培养条件、改造细胞系、抗体药物的质量控制、细胞培养工艺流程的改进等方面进行了诸多改良和优化。另外，未来基因工程抗体的发展方向将主要集中在通过合理改造抗体序列结构来提高基因工程抗体的药学特性，例如增加抗体药物的稳定性和均一性；通过双特异、多特异抗体以及抗体偶联物技术，赋予基因工程抗体药物新的药效功能；通过Fc 片段改造和糖基化改造，调节原有的效应功能和生物分布特性；通过创造新形式的抗体样分子骨架来发展具有更适宜的生物分布与代谢特性、抗原结合特性、药动学特性的新的“抗体”药物。 仪器信息网：请谈一下相应生物活性鉴定和功能分析的重要性和重要环节是什么？又发挥着怎样的作用？冯彦斌：随着生物制药领域的一大热点，治疗性抗体在治疗肿瘤、自身免疫性疾病、炎症、感染性疾病及其他疾病中取得了重大进展，作为抗体药研发的重点和难点，除了抗体的获取即表达和纯化之外，建立高效、稳定、可信的抗体质量控制分析方法，以及其标准化和先进性是衡量抗体药物相关企业研发能力的重要标准之一。特别是目前研究较为热门的肿瘤特异性抗体功能分析，之前也有提及双特异性抗体甚至多特异性抗体，其最突出的优势就是靶向性强、特异性高和毒副作用低等，所以在其特异性功能分析方向我们也提供足以应对的核心武器。因此，需要关注治疗性抗体的功能研究，通过对特异性抗原结合、抗体介导的细胞毒性作用（ADCC）、补体介导的细胞毒性作用（CDC）、抗体介导的细胞吞噬作用（ADCP）等实验方法进行分析。如在杂交瘤体系构建过程中对于杂交瘤细胞培养、融合、筛选，就可以使用我们的EVOS智能活细胞成像系统对其进行包括增殖及细胞状态的长期成像监测。EVOS M7000 3D数字共聚焦活细胞成像分析系统（点击查看详细参数）对于药理药效、药代及药物安全性评价方面，高内涵筛选分析平台和Varioskan LUX多功能酶标仪，凭借其高效的全自动高通量多靶标筛选功能，以及其后续通过强大多参数数据分析软件多抗体药功能验证进行多维度评价和分析。CellInsight CX7 LZR 激光共聚焦高内涵筛选分析系统（点击查看详细参数）Varioskan LUX多功能酶标仪（点击查看详细参数）Attune NxT流式细胞仪则发挥着更为广泛的作用，通过结合特异性流式抗体对不同种类和亚群的免疫细胞进行鉴定和分析，从而评估机体的免疫功能状态；也可以对细胞的状态和功能进行监测，以实时评估细胞的功能状态和对肿瘤细胞的杀伤作用。Attune NxT流式细胞仪（点击查看详细参数）

p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 1、双特性抗体简介 /strong /span br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 双特异性抗体（BsAb）又称双功能抗体，可同时识别和结合两种不同的抗原和表位，并阻断两种不同的信号通路以发挥其作用。根据不同结构可将双特异性抗体结构主要有2大类：含Fc片段的双特异性抗体（IgG-like双特异性抗体）与不含Fc片段的双特异性抗体（non-IgG-like双特异性抗体）。 /p p style=" text-indent: 2em " strong IgG-like双特异性抗体 /strong ：IgG样BsAb有Fc部分，具有Fc介导的效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（CDC）和抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用（ADCP）。分子量相对较大，其Fc部分有助于抗体后期的纯化并提高其溶解性、稳定性。IgG样BsAb相对分子量较大，且Fc部分与受体FcRn结合，增加了抗体血清半衰期。此类抗体结构主要包括Triomabs/quadroma、DVD-Ig（dual variable domain Ig）、CrossMAb、Two-in-one IgG、scFv2-Fc。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/cd9bb872-271d-45cb-afbc-35f7cba5588c.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 双特异性抗体（BsAb）又称双功能抗体，可同时识别和结合两种不同的抗原和表位，并阻断两种不同的信号通路以发挥其作用。根据不同结构可将双特异性抗体结构主要有2大类：含Fc片段的双特异性抗体（IgG-like双特异性抗体）与不含Fc片段的双特异性抗体（non-IgG-like双特异性抗体）。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong non-IgG-like双特异性抗体： /strong 非IgG样BsAb缺乏Fc片段，仅通过抗原结合力发挥治疗作用，具有较低的免疫原性、易于生产、分子量小等特点。因相对分子量较小，其在肿瘤组织的渗透性较高，因此具有更强的治疗效果。这些BsAb有诸多形式，主要包括TandAb（tandem diabody）、scFv-HSA-scFv、BiTE（bi-specific T-cell engager）、DART（dual affinity retargeting）、Nanobody。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/9acc75b7-4909-447c-adaf-5781ed723f89.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" / /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 2、双特异性抗体的临床优势 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " BsAb与普通抗体相比增加了一个特异性抗原结合位点，在治疗方面表现出了以下优势： /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong √ 介导免疫细胞对肿瘤的杀伤 /strong ：双特异性抗体的一个重要作用机制是介导免疫细胞杀伤，双特异性抗体有两条抗原结合臂，其中一条与靶抗原结合，另一条与效应细胞上的标记抗原结合，后者可以激活效应细胞，使其靶向杀伤肿瘤细胞。目前已经批准上市的2个双特异性抗体产品都属于这个类别，Trion Pharma公司开发的catumaxomab能够靶向肿瘤表面抗原EpCAM和T细胞表面受体CD3，而Micromet公司和Amgen公司开发的Blinatumomab可以同时结合CD19和CD3。两者都是通过激活并召集杀伤性T细胞，从而达到治疗肿瘤的目的； /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/f2b9023b-cc8d-488f-92f5-4a2013fa0fd8.jpg" title=" 3.jpg" alt=" 3.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong √& nbsp 双靶点信号阻断，发挥独特的或重叠的功能，有效防止耐药： /strong 同时结合双靶点，阻断双信号通路是双特异性抗体的另一个重要作用机制。受体络氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTKs）是最大的一类酶联受体，在细胞增殖过程中发挥重要的调节作用，如Her家族等。RTKs在肿瘤细胞表面异常高表达，导致肿瘤细胞恶性增生，因此也是肿瘤治疗的重要靶点。针对RTKs的单靶点单克隆抗体已在肿瘤治疗中得到广泛应用，但是，肿瘤细胞可以通过转换信号通路或通过HER家族成员自身或不同成员之间的同源或异源二聚体激活细胞内信号进行免疫逃逸。因此采用双特异性抗体药物同时阻断两个或多个RTKs或其配体，可以减少肿瘤细胞逃逸，提高治疗效果； /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong √& nbsp 具备更强特异性、靶向性和降低脱靶毒性： /strong 利用双特异性抗体两个抗原结合臂可以结合不同抗原的特点，两个抗原结合臂分别结合癌细胞表面2种抗原，可以有效增强抗体对癌细胞的结合特异性和靶向性，降低脱靶等副作用； br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong √& nbsp 有效降低治疗成本： /strong 以BiTE为例，与传统抗体相比在组织渗透率、杀伤肿瘤细胞效率、脱靶率和临床适应症等指标方面都具有较强的竞争力，临床优势显著。特别在使用剂量方面，由于其治疗效果可以达到普通抗体的100-1000倍，使用剂量最低可将为原来的1/2000，显著降低药物治疗成本。相对于组合疗法，双特异性抗体的成本也远远低于两个单药联合治疗。 br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 双特异性抗体的制备主要有双杂交瘤细胞法，化学偶联，重组基因制备等方法。重组DNA技术是目前制备BsAb使用最多的技术。 /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 3、双特异性抗体的制备方法 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 双特异性抗体的制备主要有双杂交瘤细胞法，化学偶联，重组基因制备等方法。重组DNA技术是目前制备BsAb使用最多的技术。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong √& nbsp 化学偶联法： /strong 该方法最早出现于上世纪80年代，其原理是通过化学偶联剂（如邻苯二马来酰亚胺、N-琥珀酰-3-（2-吡啶二硫基）丙酸盐、二硫代酰基苯甲酸等）将两个完整IgG或两个F(ab)2抗体片段偶联成一种BsAb，这种方法快速简便，但是容易破坏抗原结合部位从而影响抗体活性，同时交联剂本身的安全性和致癌性不确定； /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong √& nbsp 双杂交瘤融合法： /strong 通过细胞融合的方法将2株不同的杂交瘤细胞融合成双杂交瘤细胞株，然后通过常规的杂交瘤筛选法克隆靶细胞。由于双杂交瘤的遗传背景来源于亲代的两种杂交瘤细胞，它必然要产生2种重链和2种轻链分子，而这些轻重链的随机组合配对方式才能产生所需的BsAb.利用双杂交瘤方法制备双特异性抗体随机性较大，效率低，但是BsAb生物活性较好，抗体结构比较稳定。利用Konck-in-hole技术可以有效解决异源抗体抗体重链正确配对的难题。制备方法是将一个抗体的重链CH3区366位体积较小的苏氨酸突变为体积较大的络氨酸，形成突出的“杵”型结构；将另一个抗体重链CH3区407位较大的络氨酸残基突变成较小的苏氨酸，形成凹陷的“臼”型结构；利用“杵臼”结构的空间位阻效应实现两种不同抗体重链间的正确装配。化学偶联法和双杂交瘤融合法生产出的双特异性抗体为鼠源性，具有较强的免疫原性，且产量低纯度差，在临床应用上有很大的制约； br/ /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/1c866bc3-af96-4ab1-919d-6adc354c4247.jpg" title=" 4.jpg" alt=" 4.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong √& nbsp 基因工程： /strong 利用基因工程技术制备双特异性抗体是目前最常用的制备方法，其制备原理为利用基因工程技术对传统抗体进行基因工程方面的改造，从而形成多种形式的双特性抗体。 br/ /p p style=" text-align: justify " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 4、双特性抗体在肿瘤治疗中的研发现状 /strong /span /p p style=" text-align: justify " strong Catumaxomab /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " Catumaxomab（Removab，Trion）于2009年正式获得EMA批准在欧洲上市，用于治疗恶性腹水（腹腔转移癌晚期患者常见的一种并发症），成为全球第一个上市的双特异性抗体。在II / III期研究中，腹膜内catumaxomab改善了无穿刺存活率和下次腹腔穿刺的中位时间，减少了腹水的体征和症状，并显示出改善OS的趋势。 最常见的不良反应是发热，恶心，呕吐和腹痛。目前正在进行的临床试验包括卵巢癌、胃癌和上皮癌。Catumaxomab是一个分子量在150kDa三功能的抗体，由一个靶向肿瘤EpCAM的小鼠IgG2a和一个靶向CD3ε的大鼠IgG2b构成，同时还能通过Fcγ受体激活单核细胞、巨噬细胞、星状细胞以及NK细胞。由于小鼠和大鼠的轻重链之间很少发生错配，通过quadroma（hybrid-hybridoma）的方式，将分别表达小鼠和大鼠抗体的杂交瘤进行二次融合，从而得到同事分泌Triomab双特异性抗体以及小鼠和大鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株。然后在通过亲和力纯化的方式、分别去除小鼠和大鼠单克隆抗体。虽然Catumaxomab是第一个批准上市的双特异性抗体，但同时也具有非常明显的局限性，主要体现在Triomab抗体复杂的生产工艺以及异源抗体比较容易产生的免疫原性问题。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/e30a7448-be1a-4ee1-a003-2d0a8e910074.jpg" title=" 5.jpg" alt=" 5.jpg" / /p p strong Blinatumomab（博纳吐单抗） /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " Blinatumomab于2014年12月4日获得美国FDA批准，用于治疗费氏染色体阴性的前体B细胞急性淋巴细胞白血病。Blinatumomab由Micromet公司（后被Amgen公司收购）开发，是利用DNA重组技术制备的一种双特异性的单链抗体BiTE，通过一条多肽链把靶向肿瘤细胞和T细胞表面抗原的两种单克隆抗体的可变区连接起来，Blinatumomab选择性地靶向B细胞表面抗原CD19，同时特异性地结合T细胞表面抗原CD3从而激活T细胞。因为主要由两条单链抗体连接而成，BiTE的分子量较小（55-60kDa），容易渗透肿瘤组织。同时BiTE缺乏Fc段因而免疫源性较低。临床试验已经证明Blinatumomab即便在很低的使用剂量下，依然可以有效召集T细胞并清除肿瘤，显着改善复发或难治性B细胞前体ALL患者的中位OS。 其常见的不良反应包括发热，头痛，发热性中性粒细胞减少和外周性水肿。但是由于没有Fc片段，BiTE抗体分子的体内半衰期很短，试剂使用的时候需要额外配备连续输液装置。2017年Blinatumomab全球销售达1.75亿美元（2014年300万美元、2015年0.77亿美元、2016年1.15亿美元）。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/25849992-832f-4ea8-8403-4b0326c9455a.jpg" title=" 6.jpg" alt=" 6.jpg" / /p p strong 其他在研双特异性抗体 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 目前有多个双特异性抗体正在开展用于治疗肿瘤的临床试验，其结构中多包含CD3抗原结合位点（用于募集T细胞到肿瘤细胞附近），另一个结合位点包括CD19,CD20,CD33,CD123,HER2,CEA，神经节苷脂GD2，PSMA，gpA33等等。另外，还有一些双特异性抗体为：HER2 + HER3, IL1α+IL1β,IL13+IL17, IL17A/IL17F和CD30+CD16A。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/65a7606a-7037-4841-bb6c-51b9ddccfe40.jpg" title=" 7.jpg" alt=" 7.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 部分终止临床的双特异性抗体： /strong 在进入临床用于治疗肿瘤的双特异性抗体中，共有8个临床试验被终止。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/214002fa-5ac5-4e25-a649-06403b0bcffd.jpg" title=" 8.jpg" alt=" 8.jpg" / /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 5、国内双特异性抗体研发企业 /strong /span /p p style=" text-indent: 2em " span style=" text-align: justify " 据不完全统计，国内目前从事双特异性抗体研发的企业共有19家，其中上市公司3家，分别为珠海丽珠、江苏恒瑞、浙江海正药业，非上市公司16家，分别为武汉友芝友（石药占股40%）、武汉中美华世通、苏州康宁 /span span style=" text-align: justify " 杰瑞、苏州信达、苏州天演药业、苏州博生吉（安科生物占股20%）、上海君实生物、上海复宏汉霖（复星医药子公司）、上海岸迈生物、上海健能隆（合肥亿帆子公司）、上海宜明昂科、北京康众生物、北京天广实、深圳本康生物、中山康方生物、杭州特瑞思。 /span br/ /p p style=" text-align: justify " strong 武汉友芝友： /strong 友芝友是一家专门从事生物医药自主创新研发的高科技企业。从团队上讲，友芝友是一个由院士领衔，制药巨头研发高管参与的国际化背景团队。CDE的数据显示，友芝友自主开发的“注射用重组抗HER2和CD3人源化双特异性抗体”(M802)和“注射用重组抗EpCAM和CD3人鼠嵌合双特异性抗体”（M701），分别于2017年9月29日和2018年3月6日获得临床批件。 /p p style=" text-align: justify " strong 武汉中美华世通： /strong 中美华世通成立于2009年，由“国家千人计划”专家张发明博士回国创立。其子公司杭州翰思生物致力于肿瘤免疫领域生物大分子的研发及产业化，自主研发的PD-1目前已在进入国内二期临床。临床前品种围绕PD-1布局多个双特异性抗体，包括PD-1/CD47,PD-1/IL-10,PD-1/VEGF,CD47/VEGF等等，其中PD-1/CD47（HX009）目前已完成中试，正在猴子体内进行长毒试验，预计明年中获得临床批件。 br/ /p p strong style=" text-align: justify " 苏州康宁杰瑞： /strong span style=" text-align: justify " CRIB（Charge Repulsion Improved Bispecific）是康宁杰瑞自主研发的双特异性抗体平台，基于完整的抗体框架结构，通过有针对性的调整不同Fc链之间的电荷网络分布，大大增加异二聚体形成的几率的同时，阻碍同二聚体的形成，从而达到构建双特异性抗体分子的目的。目前康宁杰瑞的研发的“注射用重 /span span style=" text-align: justify " 组人源化抗HER2双特异性抗体”已于2018年4月10号获得临床批件，另外还有多个双特异抗体处于临床前研究。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 苏州信达生物： /strong span style=" text-align: justify " 信达生物制药致力于做国内最好、国际一流的高端生物制药公司。在双特异性抗体领域，信达生物与岸迈生物、礼来达成合作协 /span span style=" text-align: justify " 议，获得岸迈生物的FIT-Ig平台技术的全球权益，开发包括IBI302在内的双靶点单克隆抗体注射液。IBI302可用于治疗多种眼底黄斑疾病和实体瘤，通过同时阻断疾病发生和发展过程中的两个靶点，达到标本兼治的效果，显著优于现有治疗水平。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 苏州天演药业： /strong span style=" text-align: justify " 天演药业成立于2012年，致力于开发新一代治疗性和诊断用抗体技术的生物制药公司。公司的药物筛选平台“动态高精度抗体技术”突破了生物抗体药物研发面临的两大瓶颈：如何扩展治疗性抗体的靶向空间和如何提高抗体药物开发的成药性。目前，天演药业已经建立了高质量的、多样性达千亿的可开发性抗体库，能精准地设计 /span span style=" text-align: justify " 、构建及筛选治疗性抗体，并能生成针对不同靶点的单特异性与双特异性抗体，包括传统上难以生成抗体的复杂靶点的但特异性及双特异型抗体产品线。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 苏州博生吉： /strong span style=" text-align: justify " 博生吉医药以肿瘤细胞免疫治疗技术与产品为主要发展目标、以临床技术服务为主要业务的高科技企业。博生吉以细胞疗法为主，但在双特 /span span style=" text-align: justify " 异性抗体方面也崭露头角，公司研发的针对多发性骨髓瘤的CD3/CD138 BiTE在细胞水平上展现了骨髓瘤细胞的杀伤作用。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 上海君实生物： /strong span style=" text-align: justify " 君实生物是一家以开发治疗性抗体为主的研发型高科技公司，专注于创新单克隆抗体药物和其他治疗性蛋白药物的研发与产业化，已搭 /span span style=" text-align: justify " 建国内一流创新人源化抗体药物产品研究开发技术平台。该平台涵盖分子抗体药物筛选、高产稳定CHO细胞株的构建及治疗性抗体分析检测在内的多个核心技术。公司旗下目前在研的双特异型抗体候选药物主要有两款：创新性人源化JS005双特异抗体注射液、创新型人源化JS003双特异抗体注射剂。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 上海复宏汉霖： /strong span style=" text-align: justify " 复宏汉霖由复星医药与美国科学家团队于2009年12月合资组建，公司主要致力于应用前沿技术进行单克隆抗体生物类似 /span span style=" text-align: justify " 药、生物改良药以及创新单抗的研发及产业化。目前，复宏汉霖有14个单抗药物处于在研阶段，其中双特异性抗体药物两个（HLX31、HLX32）。 /span br/ /p p strong 上海岸迈生物： /strong 岸迈生物成立于2016年，主要关注肿瘤领域的双特异性抗体研发。岸迈生物的核心技术是双特异性抗体研发平台FIT-lg，FIT-Ig是一项新型的构建双特异性抗体的技术平台，保留了单克隆抗体的主要基本结构元素及生物学特性，同时可以结合及抑制两种不同的致病因子(靶源)，并且该项技术已经通过了对产品的可药性和产业化规模生产的验证。目前公司正全力将现有产品向临床推进，预计第一个产品将于2018年进入临床试验阶段。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/34f5b2cf-de66-47c6-b113-b1ea83dfd5f5.jpg" title=" 11.jpg" alt=" 11.jpg" / /p p style=" text-align: justify " strong 上海健能隆： /strong 健能隆医药建立了免疫抗体技术平台ITabTM（Immunotherapy Antibodies），启动了一系列双特异性抗体药物的开发，用于多种实体瘤和血液肿瘤的免疫治疗。利用该技术凭条设计合成的双特异性抗体分子具有独特的结构特征，可在真核细胞中表达，易于大规模生产。 /p p strong style=" text-align: justify " 上海宜明昂科： /strong span style=" text-align: justify " 宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司创立于2015年6月， 致力于肿瘤的免疫治疗产品的开发研究，在研产品包括针对免疫调节靶 /span span style=" text-align: justify " 点的单克隆抗体、经过武装的靶点特异性NK细胞以及双特性性抗体。公司针对CD47靶点的单抗已于2018年9月1日获得NMPA临床试验研究受理。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 北京康众生物： /strong span style=" text-align: justify " 康众生物的肿瘤T细胞生物治疗技术平台，基于其独创的羊驼纳米抗体快速分离技术，用于重点研发纳米抗体双特异性抗体（nano /span span style=" text-align: justify " BiTE）。BiTE(Bispecific T-cell engager)技术是采用DNA重组技术将识别T细胞的CD3抗体与其它抗体的重链和轻链可变区通过连接肽连接形成单一的双特异性抗体，这种抗体能够介导T细胞和靶细胞之间形成溶细胞行免疫连接，有效杀伤肿瘤细胞。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 北京天广实： /strong span style=" text-align: justify " 是一家处于临床阶段的生物制药公司，具备国内领先的单抗药物研发和产业化技术能力并形成了完善的技术体系。根据CDE的数据显示，公司的“注射用重组人源化双功能单克隆抗体MBS301（HER2-D2/D4） /span span style=" text-align: justify " ”已于2018年8月27日获得临床批件。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 深圳本康生物： /strong span style=" text-align: justify " 成立于2015年，主要从事生物制药和细胞治疗创新工具和技术解决方案的开发。公司技术团队中不乏出自安进、拜耳这些巨头公司的研发人才，依托公司在蛋白质工程领域多年的研究经验，公司储备了大量有望改造和提升细胞治疗技术的工具，涵盖双特异性抗体药物开发、细胞培养方案及基于磁珠的细胞分离技术以及细胞检测等诸多方面。目前一共有5个双特异性抗体药物，其中有三个正在展开临床试验，除了一项是在美国申报以外，其他两项试验尚未公布申报地点。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 中山康方生物： /strong span style=" text-align: justify " AK-104是中山康方生物医药开发的一种双特异性抗体，同时靶向于CTLA-4和PD-1。CTLA-4和PD-1是在肿瘤浸润淋巴T细胞上共表达的免疫检查点蛋白，康方研发的AK104能同时阻断这两个通路。AK-104目前已在澳大利亚启动了临床一期试验，用于治疗晚期实体瘤。中山康方生物医药已于2017年11月向CFDA药品审评中心递交了该药的新药临床试验(IND)申请。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 杭州特瑞思： /strong span style=" text-align: justify " 特瑞思是由国家“千人计划”专家吴幼玲博士领导的海外归国精英联合浙江民营企业家创立的，是一家集研发、中试放大和商业化生产、销售为一体的创新生物制药企业。公司拥有丰富的产品管线，其中2个双特异性抗体处于临床前研究，分别是TRS008（治疗非小细胞肺癌、尿路上皮癌）、TRS009（治疗肺癌、黑色素瘤、膀胱癌，消化道肿瘤）。TRS008是特瑞思于2018年4月与上海岸迈生物合作引进的品种，浙江特瑞思该药的中国市场开发权益,岸迈生物将保留该项目除中国以外的全球商业权益。 /span br/ /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 6、结语 /strong /span /p p style=" text-align: justify " 双特异性抗体是抗体药物领域最新的一个概念，被视为治疗肿瘤的第二代抗体疗法。国内虽然有多家企业布局双特抗体领域，但多处于临床前研发状态，进入临床阶段仅有武汉友芝友、苏州康宁杰瑞、北京天广实等几家企业。作为一种前瞻技术，其在产业化面临诸多挑战，如解决错配和纯化，改善下游工艺不稳定，保证双抗的稳定性和平衡两个抗体的表达量等。随着技术的进步，相信未来可以利用更多更好的策略来优化各种双特异性抗体，使其具有更强大的疗效和更低的副作用，为肿瘤患者带去福音。 /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 7、参考文献 /strong /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " 曾静，双特异性抗体在肿瘤免疫治疗中的研究进展 /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " 袁庆云，双特异性抗体药物在抗肿瘤治疗中的应用 /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " 闫莉萍，双特异性抗体药物非临床研究的考虑要点 /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " 郭婷婷，双特异性抗体药物的研究进展 /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " 吴丹青，双特异性抗体技术及其临床应用进展 /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " 黎晓维，双特异性抗体的结构设计及其装配工艺研究进展 /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " 房世娣，双特异性抗体的结构及应用研究进展 /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " Recent advances of bispecific antibodies in solid tumors /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " Bispecific antibody based therapeutics：Strengths and challenges /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " Bispecific antibodies：design, therapy, perspectives /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " Bispecific antibodies for cancer therapy：A review /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " Bispecific antibodies and their applications /span /p

抗原特异性对T细胞功能至关重要，但由于技术局限，其在T细胞高通量多组学分析中常常被忽略。美国德克萨斯大学奥斯汀分校的研究团队揭示了一种用于抗原特异性CD8+T细胞的高通量、高维度单细胞分析方法。该研究成果于近日发表在《Nature Immunology》上，题为：High-throughput and high-dimensional single-cell analysis of antigen-specific CD8+ T cells。　　研究人员提出了一种对T细胞抗原受体（TCR）高通量、高维度的测序方法（TetTCR-SeqHD）,该方法可同时分析数万个单细胞的同源抗原特异性、TCR序列、靶向基因表达和表面蛋白表达。研究人员使用已知抗原特异性、TCR序列的人类多克隆CD8+T细胞，验证该方法对抗原特异性的检测准确度超过98%。研究还评估了抗原特异性的CD8+T细胞、带有病原体靶点表型特征的CD8+T细胞的基因表达水平和表型差异。　　总之，TetTCR-SeqHD是一种分析人类和小鼠T细胞反应的有效方法,极大地提升了人们对多种疾病环境中 T 细胞免疫反应的认识。 　　论文链接：　　https://www.nature.com/articles/s41590-021-01073-2　　注：此研究成果摘自《Nature Immunology》期刊，文章内容不代表本网站观点和立场，仅供参考。

2022年1月7日，Science Immunology在线发表了中国科学院生物物理研究所研究员彭华与美国德克萨斯大学西南医学中心教授傅阳心合作完成的研究论文A tumor-specific pro-IL-12 activates preexisting cytotoxic T cells to control established tumors。该研究开发了新一代高效、低毒的肿瘤特异性白介素12前体药物，并探究了该药物分子的抗肿瘤机制。　　白细胞介素12（IL-12）是由P35和P40亚基组成的异源二聚体，是诱导细胞免疫的主要细胞因子之一。在肿瘤微环境中，IL-12刺激活化的T细胞和自然杀伤细胞（NK）释放毒杀性的酶类或分泌效应细胞因子如IFNγ，这些效应分子对于肿瘤的清除至关重要。伴随IL-12强大的抗肿瘤活性，20世纪90年代掀起了IL-12临床研究的热潮。由于IL-12在体内的半衰期短，为了达到足够的血药浓度，IL-12在临床治疗时多采用静脉多次给药，导致IL-12在到达肿瘤部位前会刺激活化血循环中的免疫细胞，同时会产生与剂量相关的细胞因子风暴或肝脏或其他器官组织损伤等严重的副作用。这些因素限制了IL-12的临床应用及推广。为了解决这些问题，科研人员设计了一种可在肿瘤微环境中特异性释放活性的IL-12前体药物（pro-IL-12），该设计策略同样可以应用于其他细胞因子药物的修饰或改造。　　为了延长IL-12的半衰期，研究人员构建了重组IL-12-Fc融合蛋白。在此基础上，研究进一步设计了pro-IL-12：用IL-12天然细胞受体的胞外结合域封闭IL-12的活性，受体与IL-12之间是由可切割的基质金属蛋白酶底物多肽连接。该药物在外周保持无活性状态，当药物到达肿瘤，肿瘤中特异性高表达的基质金属蛋白酶（MMP14）切割pro-IL-12释放IL-12的生物活性，发挥抗肿瘤效果。在多种小鼠以及人源化小鼠肿瘤模型中均验证了pro-IL-12在降低毒性的同时提高了抗肿瘤效果。　　进一步机制研究发现，pro-IL-12可直接作用于肿瘤中的杀伤性T细胞（CTL），促进其分泌IFNγ发挥抗肿瘤作用。临床中，由原癌基因驱动的肿瘤往往对免疫治疗没有响应，靶向药物治疗虽有效但后期易复发。研究观察到pro-IL-12可以与TKI靶向治疗产生协同作用，提高了肿瘤的治愈率。如何克服免疫检查点阻断药物（ICB）的耐药性是临床免疫治疗面临的挑战。研究提出并证明了通过pro-IL-12提供T细胞活化的第三信号，在解除T细胞免疫抑制的同时增强其活性，最终克服anti-PDL1耐药性。　　研究工作得到国家科技重大专项的支持。　　论文链接

肥大细胞白血病（Mast cell leukemia，MCL）又称为组织嗜碱细胞白血病，约占恶性肥大细胞肿瘤的 15％。但因其罕见，在体内恶性增殖的晚期表现及症状，又与急性白血病相似，所以很容易与急性嗜碱性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病嗜碱性粒细胞急变或伴骨髓嗜碱粒细胞增多的 AML 混淆。那么，面对 MCL 有什么相应的诊断策略吗？有哪些特异性表现可以作为诊断的突破口吗？以下临床病例可为您详细解答：////病史介绍：患者男性，59 岁。反复腹泻、乏力、皮疹、消瘦 1 年；面色黝黑，贫血貌，睑结膜苍白，浅表淋巴结不大，B 超示脾脏肿大，肋下7 cm 可触及，肝脏肿大，肋下 2 cm 可触及。血常规 ：白细胞计数 18.2×109/L，红细胞计数 1.64×1012/L，血红蛋白 60 g/L，血小板计数 142×109/L。外周血白细胞分类：中性分叶核粒细胞 22%，淋巴细胞 30%，单核细胞 3%，嗜酸性粒细胞 2%，分类不明细胞 42%，原始细胞 1%，有核红细胞 2 个/100 个白细胞。初步检查及诊断：骨髓细胞形态学检查：骨髓增生极度活跃，粒、红二系增生受抑，巨系增生活跃。血小板散在或小簇可见。髓片中分类不明细胞约占 79%，散在或成堆分布。此类细胞胞体大小不一，呈圆形、椭圆形或梭形，胞核圆或不规则，可见单个核、双核、分叶核，部分胞核中可见核仁，胞质中充满深紫色大小不一的颗粒。细胞化学染色结果：POX（-）100%；PAS（-）10%，（+）14%，（+++）76%；NAS-DCE（+）100%；甲苯胺蓝染色（+）100%；图 1 骨髓染色基因检测：骨髓 KIT 基因 F522C 突变。骨髓活检：骨髓象提示造血组织增生明显活跃，未见幼稚细胞、淋巴细胞、浆细胞增多和聚集。可见一类细胞弥漫单一性分布，胞体小，胞质少，胞核呈圆形的细胞异常增生。巨核细胞数量大致正常，胞体中等，核有分叶，散在分布。骨髓间质骨小梁规则，未见明显纤维化。该细胞免疫组化结果：CD34（-），CD117（+），髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）显示粒系细胞阳性。综上分析考虑肥大细胞（mast cell，MC），提示 MCL 可能。流式检测方案及检测结果：以所有 WBC 设门，异常细胞比例约占 61.1%，该群细胞 CD45 强表达、SS 中等、FS 较大，强表达：CD9，CD33，CD117；表达：CD2，CD13，CD203c；不表达：CD3，CD4，CD5，CD7，CD19，CD56，CD11b，CD15，CD14，CD64，CD123，CD25，CD34，CD38，HLA-DR，CD138，MPO，CD79a，cyCD3图 2 流式细胞学检查结果（以上数据来自 Navios 流式细胞仪采集，Kaluza 软件分析）病例分析与诊断策略：参考*****的诊断标准，临床诊断为 MC。总结与思考：急性肥大细胞白血病很少见，容易与急性嗜碱性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病嗜碱性粒细胞急变或伴骨髓嗜碱粒细胞增多的AML混淆。在免疫表型上、形态学以及免疫组化的染色结果*******扫描下方二维码或点击「阅读原文」，即可查看完整诊断策略及病例思考。作者简介：吴婧硕士，主管技师，就职于上海交通大学附属瑞金医院血液研究所主要从事白血病和淋巴瘤免疫分型工作。////点击「阅读原文」，查看更多精彩病例、课程。注册学员即可学习更多临床病例、大咖课程！注册用户中，也将随机选取 30 位，送上「鼠」于你的精美公仔！责任编辑：杭璐阅读原文

基因疗法能从根本上补充或修复缺陷基因，恢复健康基因的正常生物学功能，具有不可比拟的治疗优势。腺病毒或腺相关病毒（AAV）已经成为预防感染、严重疾病和死亡的理想基因治疗和疫苗载体。载体进入体内诱导免疫反应并建立免疫记忆需要一种具有传染性的活性病毒疫苗。传统的定量检测方法中，无论是灵敏度较高的qPCR检测，还是传统免疫学原理Elisa检测等，仅可以定量病毒载体的总浓度。因受到病毒载体碎片干扰，而无法精确测定病毒疫苗载体的效价浓度，进而影响基因药物或疫苗的生产质量控制以及精准给药。因此，迫切需要一种可准确测定病毒载体的浓度和存活力的新技术。近日，华中科技大学刘钢教授团队在 Materials Today Bio 期刊发表了题为：Versatile nanorobot hand biosensor for specific capture and ultrasensitive quantification of viral nanoparticles的研究论文。针对上述问题，华中科技大学刘钢教授和黄丽萍博士团队与华中农业大学金梅林教授、张强副教授团队合作，研发了一种具有纳米级多功能机器人手结构的纳米等离子体（Nano RHB）生物传感器，用于快速、无损和特异性地捕获和定量检测腺病毒颗粒。该传感器可应用于实时监测基因治疗和病毒疫苗载体数量和质量，评估病毒载体的感染活力。在该研究中，研究人员首先开发了一种基于非常光透射（EOT）效应的无标记NanoSPR生物传感器。该生物传感器可以被非偏振光激发，并且不需要复杂的光学设备。然后通过在纳米杯阵列芯片上直接实施金种子生长法，设计了一种具有纳米机器人手的新型多功能NanoSPR生物传感器。由于其特殊的纳米杯结构作为种子模板，通过聚多巴胺分子在芯片表面生成了不同形状的分枝状金纳米结构。这些分支金纳米结构的功能类似于智能机器人手，从而增强SPR共振效应以提高芯片的灵敏度，同时增加表面积以提高芯片修饰效率。将这些超灵敏生物传感器集成到标准96孔板或32孔板中，可以直接监测动态结合曲线，并使用微量样品定量检测腺病毒载体或疫苗。研究结果表明，基于该新型传感器，将重组人CAR、FX蛋白或抗腺病毒六邻体蛋白抗体固定在NanoRHB的表面，这些配体可以分别结合腺病毒的纤维蛋白（病毒衣壳上突出的刺突）和六邻体蛋白（主要的衣壳蛋白），通过腺病毒特异性结合的CAR/FX蛋白相互作用可快速检测腺病毒的生存活力和浓度，在5分钟内同时高通量检测多达96个样品，比传统病毒滴度检测方法和PCR方法更高效快捷。此外，研究人员还使用冻干技术将CAR标记的金颗粒整合到单克隆抗体修饰的Nano RHB平台上，检测灵敏度可以进一步提高5倍。研究结果显示，金颗粒偶联的Nano RHB的独特SPR效应可实现一步式夹心法进行高灵敏度和快速的腺病毒载体颗粒评估，而不需要洗涤步骤和复杂的样品预处理。该种超灵敏金纳米分支结构修饰的生物芯片，不仅可以快速有效地评估腺病毒载体的活力，还可以通过一步夹心法提高检测灵敏度至100 copies/mL。研究人员进一步将采用NanoRHB平台检测26个细胞上清液样品，结果显示与传统qPCR和病毒滴度检测分析的结果非常一致。Nano RHB传感器分析显著缩短了总检测时间，从几天和几小时缩短到几分钟，并通过直接结合病毒表面蛋白来同时快速检测病毒生存力和浓度，从而提高了检测能力。该新型检测平台也展示出对不同类型的病毒载体和假病毒的高特异性。研究结果显示Nano RHB平台是一种有前途的高通量生物检测工具，用于高效和超灵敏地评估疫苗和基因递送载体，用于大规模腺病毒载体疫苗的快速质量控制，亦可用于其他基于病毒载体和基因载体的检测分析。研究团队已实现上述技术的转化，基于NanoSPR技术开发的一种腺相关病毒（AAV-2）定量检测试剂盒，能准确、快速、简便、高通量的检测细胞上清中AAV-2病毒含量。AAV-2病毒定量检测试剂盒的原理是AAV-2病毒上的衣壳蛋白和生物芯片表面AAV-2单抗结合后与芯片纳米孔产生等离子共振效应，引起特定波长处吸光度的改变。该波长处的吸光度的高低与样本中的AAV-2病毒含量成正比。故可利用已知浓度的病毒样品在NanoSPR芯片的特定波长处的吸光度变化，建立吸光度变化值与浓度值的标准曲线，从而计算出待测样本中的AAV-2病毒含量。AAV作为基因治疗的明星载体，是目前基因治疗中最常用的载体，准确的滴度检测是AAV基因治疗药物质控的重要组成部分，也是开展临床研究的前提条件。AAV-2病毒定量检测试剂盒可搭配量准多功能分子检测仪（WeSPR 100或WeSPR HT96）使用，一步加样，15min即可出结果，能准确、快速、简便、高通量的检测细胞上清中AAV-2病毒含量。大大简化了AAV开发者的工作流程。在基因治疗、抗病毒疫苗开发等领域有着非常广泛的应用前景。基因治疗或疫苗开发过程中，对AAV衣壳浓度进行完整、精确的测定，是前期研发，中期筛选中获得可靠数据，后期治疗中能够安全有效给药的必要条件。同时，测定AAV分离纯化过程中不同阶段的病毒浓度、优化克隆、提高产量也十分重要。论文链接：https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2022.100444

荷兰乌得勒支大学，荷兰鹿特丹伊拉斯谟癌症研究院，荷兰癌症研究院等科学家团队在《Genome Medicine》（2021年影响因子11.117）杂志上发表文章“Optimizing Nanopore sequencing-based detection of structural variants enables individualized circulating tumor DNA-based disease monitoring in cancer patients”，提供了一种即时的、高灵敏的个体化疾病监测解决方案，基于癌症基因组三代测序技术实现潜在SV标志物筛选，随后通过naica® 微滴芯片数字PCR系统绝对定量检测转移性前列腺癌患者血浆中ctDNA（循环肿瘤DNA）的SV标志物，并实现持续监测。通过实时监控SV的变化，来评价肿瘤治疗的动态反应。通过四个病例的特异性SV的数字PCR监测，表明SV动态变化与已有的肿瘤治疗反应标志物如PSA具相关性并能更早发现复发。应用亮点1.naica® 微滴芯片数字PCR系统能够用于血浆ctDNA中的特异性SV生物标志物的检测。2. naica® 微滴芯片数字PCR系统三色荧光通道同时检测SV结构变异，上游野生型和下游野生型三个靶标位点。3.naica® 微滴芯片数字PCR绝对定量患者SV标志物，适用于肿瘤治疗反应监测，更早提示复发。三通道数字PCR绝对定量检测血浆cfDNA中肿瘤特异性SV实验设计A、血浆cfDNA中肿瘤特异性SV的数字PCR绝对定量检测路线。B、三通道数字PCR的引物和探针设计检测。野生型上游和野生型下游等位基因与变异等位基因。设计了三个标记不同荧光染料的探针，特异性检测变异等位基因或野生型上游和下游等位基因。循环肿瘤DNA循环肿瘤DNA（ctDNA）：肿瘤细胞释放入血的游离DNA（cfDNA），大小约为160-180 bp。与正常的游离DNA（cfDNA）相比，ctDNA的不同之处在于携带肿瘤特异性的遗传学改变（SNV,CNV,Indel,SV），约占0.1-1%，ctDNA已被证明与肿瘤负荷呈正线性相关性。有多例病例报道，ctDNA在临床症状出现前几个月发现癌症复发，通过ctDNA的液体活检，有望监控肿瘤负荷，确定疗效和耐药性，检测微小残留病，并了解肿瘤异质性和克隆进化。结果与结论利用naica® 微滴芯片数字PCR系统进行4例前列腺癌患者两个时间点，即基线期和进展期时，血浆cfDNA中两个肿瘤特异性结构变异位点SV-A和SV-B的检测，VAF变异等位基因频率如图C，每mL血浆中变异等位基因拷贝数如图D。C、显示四例前列腺癌患者血浆ctDNA中SV-A和SV-B的VAF变异等位基因频率。D、显示四例前列腺癌患者每毫升血浆中SV-A和SV-B变异等位基因拷贝数。监测4名前列腺癌患者的血浆ctDNA中特异性SV变异水平，每个患者有两个SV，并与PSA和ALP等临床生物标志物进行比较。患者Pros1和Pros5的SV-A和SV-B的VAF监测结果显示与肿瘤负荷相关，患者Pros1和Pros4比PSA更早地提示疾病的进展。下图为患者Pros1血浆ctDNA中的SV持续监测结果。E、患者Pros1两种SV的VAF、治疗、实验室指标（前列腺特异性膜抗原（PSA）、碱性磷酸酶（ALP））和临床疾病进展（PD）。* Cabazitaxel：卡巴他赛，是一种紫杉烷类化疗药物，主要用于治疗激素难治性转移性前列腺癌。展望作者在文中表明：临床医生非常清楚癌症治疗方案动态监测的重要性，但缺乏即时监测肿瘤治疗反应的有效工具，因此尽管医生能够及时发现了病情变化并做出反应，但却为时已晚。本文提出了一种克服这些限制因素的新方法，并为即时个性化疾病监测提供解决方案。每个患者持续监测了两个SV，结果表明使用SV量化ctDNA以监测治疗反应具备潜在临床效用。这种方法可以提高疾病监测的敏感性，使其满足更智能治疗方法的要求。更多详情查看原文：DOI:10.1186/s13073-021-00899-7法国Stilla Technologies公司naica® 微滴芯片数字PCR系统，六色荧光通道，少量样本中获得更多生物信息，了解详情请点击：https://mp.weixin.qq.com/s/rVt1F50ILi3wFY9FdndyBwGenome Medicine影响因子：影响因子查询网址：https://www.iikx.com/sci/biology/18358.html

简单的血液测试可检测肺癌，敏感性和特异性均较高&mdash &mdash 大型临床验证研究结果已刊发在《临床肿瘤学杂志》上 鉴于高清影像诊断肺癌的效果迫切需要改善，GENSIGNIA 计划推出微创诊断性测试 　　2014年1月14日，总部位于伦敦的私营分子诊断公司 GENSIGNIA Ltd (在加州圣迭戈设有实验室)携手意大利米兰国家癌症研究中心 Istituto Nazionale dei Tumori (INT)(国立肿瘤研究所)的 IRCCS 基金会 (Fondazione IRCCS) 宣布，微 RNA 特征分类器 (MSC) 的肺癌测定法(简称 MSC 肺癌测定法)取得了积极的临床验证结果，该结果已经发表在《临床肿瘤学杂志》(Journal of Clinical Oncology) 上。该结果首次证明，血液检测可以显著降低高清影像诊断中较高的假阳性率，尤其是目前推荐用于扫描重度吸烟者是否患有癌症的低剂量电脑断层扫描(LDCT 或螺旋 CT)方法。上述测定法灵敏度较高，在确诊时间上较 LDCT 最多早两年。INT 癌症基因组学博士、教授、主任 Gabriella Sozzi 将于1月8日在圣迭戈 AACR-IASLC 肺癌分子起源 (AACR-IASLC Molecular Origins of Lung Cancer) 大会的全体会议上公布该研究结果的细节。GENSIGNIA 打算2014年首先在美国推出肺癌诊断性测试。 　　在对比 LDCT 和观察疗法的随机肺癌筛查试验(意大利多中心肺癌检测 [MILD] 试验 INT)中，该机构提前收集了939名重度吸烟者的血液样本，这些样本用于验证24微 RNA 表达特征测定方法 -- MSC 肺癌测定法的诊断性能，并证明该方法的临床效用。来自 MILD 试验的重度吸烟者并未罹患癌症(n=870)，也并未确诊罹患肺癌(n=69)，在此次相关性研究进行了检查。MSC 肺癌测定法证明，确定肺癌存在的总敏感度为87%。在所有受试者中，MSC 肺癌测定法在肺癌确诊率和致死率上的阴性预测值 (NPV) 分别为99%和99.86%，表明该测试在准确识别无肺癌受试者方面具有高特异性。正因如此，MSC 肺癌测定法将 LDCT 确定未罹患肺癌的重度吸烟者存在疑似肺部肿瘤的假阳性率降低了五倍。 　　意大利米兰 Istituto Nazionale dei Tumori 胸外科主管、外科手术主任 Ugo Pastorino 博士表示：&ldquo MSC 肺癌测定法结合 LDCT 扫描结果将假阳性率降低了五倍，这具有重要的临床意义，因为这降低了重复 LDCT 扫描或其他不必要的侵入性诊断复查的假阳性率和潜在的副作用。&rdquo 　　该肺癌相关性研究开创了此类研究的先河，利用提前从大型随机肺癌筛查试验中收集的血液样本对生物标志物进行临床验证。除了显著降低假阳性率之外，MSC 肺癌测定法的表现与肺癌阶段和距离利用 LDCT 检测癌症的时间(至多两年)无关。这表明 MSC 肺癌测定法可以提高诊断和早期检测的潜在效用。 　　INT 癌症基因组学博士、教授、主任 Gabriella Sozzi 表示：&ldquo 我们已经开发出一种微创分子诊断测定法，量化了可在血液中自由循环并可显示肺癌存在的特效微 RNA 的表达。总的来说，我们的研究结果支持使用这种测定法作为改善提早发现肺癌的工具。&rdquo 　　全球大概有11亿烟民，美国则拥有大约1900万重度吸烟者，他们每天至少吸一包烟。LDCT 被推荐用于筛查高危人群中的肺癌患者，主要是重度吸烟者。具有里程碑意义的由 NCI 资助的全国肺癌筛查试验 (National Lung Screening Trial， NLST) 2011年6月发布在《新英格兰医学杂志》(New England Journal of Medicine) 上，该试验结果显示，与每年进行一次胸部 X 光检查相比，LDCT 筛查将有大于或等于30年烟龄(pack-year=表示20支烟/天/年)以及戒烟后时间小于等于15年的高危人群的死亡率相对降低20%，在 NLST 中，24.2%的被筛查受试者被视为肺癌阳性，大多数阳性受试者接受了额外的测试。当发现阳性筛查结果时，96.4%的 LDCT 结果被视为&ldquo 假&rdquo 阳性。因此，考虑到筛查大量高危人群的成本、LDCT 筛查相关的潜在危害以及 LDCT 出现的较高的假阳性率，这些因素突显出需要利用其它生物标记来提高诊断效率。 　　GENSIGNIA 创始人兼执行主席 Gabriele Cerrone 表示：&ldquo 利用螺旋 CT 扫描筛查重度吸烟者可以挽救许多人的生命，但是由于假阳性率很高，这种方法的成本效益受到了质疑。MSC 肺癌测定法结合螺旋 CT 扫描显著降低了假阳性率，这避免了为确定诊断而进行的更多检查和扫描，大大节省了全球医疗体系的开支。&rdquo 　　肺癌简介 　　国际世界癌症研究基金会 (World Cancer Research Fund International) 指出，肺癌是全球最常见的癌症，据估计本世纪将有多达十亿人因吸烟而死。在美国，肺癌是第二大癌症，但是美国癌症协会表示，迄今为止肺癌在癌症死因中居于首位。美国死于肺癌的人数多于死于结肠癌、乳腺癌和前列腺癌的总人数。肺癌的症状通常不会显现，除非已经进入不可治愈的晚期。即使真的出现了肺癌的症状，患者往往误以为是其他病症，例如感染或吸烟导致的慢性病，这常常会延误诊断。因此，80%以上的肺癌患者在确诊后两年内死亡。 　　微 RNA 和 MSC 肺癌测定法简介 　　微 RNA (miRNA) 是小的非编码核糖核酸 (RNA)，可以调节基因活性，在癌症中有异常表达。他们是肿瘤细胞及其微环境向血液循环主动释放的特定组织和疾病分子，包于外来体内或与核糖核蛋白复合物有关，以防止其降解。凭借尺寸小、稳定性强等优点，微 RNA 可以在生物体液中被测定，例如血浆和血清，可用作循环生物标记。Sozzi 和 Pastorino 博士报告了两个独立的 LDCT 筛查研究中的受试者的基于血浆的微 RNA 特征的开发和验证过程。这证明，24个循环的微 RNA 的实时 RT-PCR 的定量测定在肺癌上具有诊断和预后意义(Boeri 等，2011年)。这种生物标记测定旨在为早期发现肺癌创造可能，从而在 LDCT 或胸部 X 光检查做出假阳性诊断后避免不必要的检验的费用和并发症。

近日，中国科学院大连化学物理研究所生物技术研究部生物分离分析新材料与新技术研究组（1809组）叶明亮研究员团队和空军军医大学聂勇战教授团队等合作，开发了一种位点特异性糖型的高稳健蛋白质组分析系统，对278例临床样本进行N-糖基化蛋白质组的规模化分析，筛选并验证了可诊断胃癌尤其是早期胃癌的新型蛋白质糖基化类生物标志物，为 N-糖基化蛋白质组的规模化分析提供了一种分析工具。目前在临床上使用的肿瘤标志物基本上都是糖蛋白质。蛋白质糖基化的异常与疾病的发生发展密切相关，但是还没有在特定蛋白质、特定位点上的特定糖型（即位点特异性糖型）的疾病标志物。在本工作中，研究人员开发了一个高稳健的位点特异性糖型蛋白质组学分析系统。该系统采用自动化方法富集生物样本中的N-完整糖肽，然后采用微流LC-MS/MS系统检测N-完整糖肽，并利用团队开发的Glyco-Decipher软件鉴定和定量位点特异性糖型。科研人员使用该系统分析了200多个样品，发现其富集特异性保持在88.1%到91.7%之间，展现了稳定的糖肽富集性能。在10个批内/批间的质量控制样本中，N-完整糖肽、糖基化位点和糖蛋白的鉴定数目的相对标准偏差均低于7%，并且定量N-完整糖肽的Pearson相关系数平均值为0.909。经过长时间分析超过200份大队列样本后发现，每个质量控制样本依然能稳定地鉴定到平均1900条完整的N-完整糖肽。因此，该系统具有高灵敏、高稳健的N-完整糖肽鉴定性能，为 N-糖基化位点特异性糖型的规模化分析提供了一个有力的分析工具。由于早期胃癌无明显症状且存在较长的潜伏期，导致诊断迟、转移快和治疗效率低等问题。临床上现有的胃癌血清标志物有CEA、CA125、CA72-4和CA19-9等，由于它们对胃癌诊断的特异性和敏感度较差，难以用于胃癌的早期诊断。研究人员将该系统应用于探究胃癌患者血清中蛋白质N-糖基化的变化，筛选用于胃癌诊断的新型位点特异性糖型生物标志物。团队首先采用发现蛋白质组学策略，对含140例受试者的发现队列和70例受试者的验证队列分别进行N-糖基化蛋白质组的全面分析，共鉴定到来自971种糖蛋白上的21711种位点特异性糖型。通过差异分析和构建机器学习随机森林模型，筛选到四个位点特异性糖型作为候选生物标志物；它们对胃癌患者均展现了优异的诊断性能，尤其是联合诊断早期胃癌的AUC值大于0.91，而传统胃癌血清标志物CEA的诊断AUC值则小于 0.67。随后，团队利用该系统并采用靶向糖基化蛋白质组学分析策略，在含有另外78例受试者的靶向验证队列中，验证了这四个位点特异性糖型对胃癌和早期胃癌优异的诊断性能。特别是发现带有 SLe 抗原的四天线糖链结构位点特异性糖型对胃癌的诊断性能远优于同位点上的其他糖型，说明位点特异性糖型是一类很有潜力的疾病标志物。叶明亮团队长期致力于位点特异性糖型分析方法的发展，在糖肽的分离和富集方面发展了O-GlcNAc糖肽的可逆酶促化学标记策略（Angew. Chem. Int. Ed.，2022）、自动化的N-完整糖肽富集方法（Anal. Chem.，2021）、O-糖肽二次酶切策略（Anal. Chem.，2023）、同时富集和鉴定N-和O-完整糖肽的分析方法（Anal. Chem.，2023）；在糖肽的谱图解析软件方面，分别发展了O-糖肽的检索策略O-search（Anal. Chem.，2019；Anal. Chem.，2023；Bioinformatics，2022）和N-糖肽质谱谱图的解析软件Glyco-Decipher（Nat. Commun.，2022）。目前，Glyco-Decipher软件可以从github.com上下载，由于其解析灵敏度高、界面友好，已经被很多课题组和生物公司采用。相关成果以“Robust Glycoproteomics Platform Reveals a Tetra-Antennary Site-Specific Glycan Capping with Sialyl-Lewis Antigen for Early Detection of Gastric Cancer”为题，发表在《先进科学》（Advanced Science）上。该工作的共同第一作者是1809组博士研究生刘璐瑶、刘蕾和助理研究员王龑。该工作的糖肽富集、微流LC-MS/MS系统方面工作得到大连化物所二十八室梁鑫淼研究员、郭志谋研究员和西北大学边阳阳教授的支持。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、大连化物所创新基金等项目资助。（文/图 刘璐瑶、刘蕾）文章链接：https://doi.org/10.1002/advs.202306955

本期“月旭科技-专家讲座”的嘉宾是曹文明博士，主要研究领域：油脂化学、食品质量与安全领域。本周六上午，曹文明博士将与大家分享讨论“食品酸价的特异性检测方法—铜皂络合比色技术”的相关内容。我们的讲座分为两大部分，zui后有互动答疑环节，来跟大家交流相关主题的内容，解决大家的实际问题，敬请关注！主讲人简介讲座主题《食品酸价的铜皂络合比色技术的概述》主讲人：曹文明内容摘要一） 酸价的释义与现行的检测技术标准二） 现行酸价检测国家标准主要存在的问题三） 酸价的特异性检测方法——铜皂络合比色技术及其zui新研究进展四） 铜皂络合比色技术70年的发展历史《铜皂络合比色法测定食品酸价专用检测试剂盒简介》主讲人：薛斌内容摘要一）试剂盒的组成和分类二）试剂盒的主要特点三）试剂盒的使用方法四）试剂盒使用时的注意事项本次网络报告的简介酸价是食用动植物油脂、油脂制品和含油食品重要的食品安全指标。长期以来，由于对酸价定义及作用的理解偏差，以及传统的酸碱中和滴定的酸价检测技术存在的油脂样品称样量过大和非特异性导致的复杂基质食品酸价测定值偏高问题，人们在酸价的检测与应用中，产生一些疑惑。本次报告旨在系统解读酸价的定义、意义、检测方法，以及若干主要问题，并提供了解决方案：一种酸价的特异性检测方法——铜皂络合比色技术。阐述了铜皂络合比色技术在大幅度减少酸价检测的油脂称样量、酸价的特异性测定等方面的理论、技术方案和适用范围，同时综述了铜皂络合比色法70年的发展历程中，对FFA含量检测、脂肪酶活性评价、食品品质评价等方面的应用。

大家好，本周分享一篇发表在Nature Methods上的文章PROBER identifies proteins associated with programmable sequence-specific DNA in living cells，本文的通讯作者是来自斯坦福大学的Paul A. Khavari教授，他们组主要致力于干细胞分化与癌症的基因组调控方面的研究。在本文中，作者团队开发了一种通过游离基因招募的近端生物素化技术（PROBER），用于在活细胞中研究与特殊DNA序列相互作用的蛋白。时空和细胞类型特异性基因表达模式由称为顺式调控元件（CREs）的DNA序列控制，它可以通过招募一些蛋白因子来激活或抑制转录复合物的形成。目前已经确定了数千个富含转录因子结合基序的CRE，但其中仅有少数进行了生化表征，因此开发新的工具来定义这些相互作用蛋白是非常必要的。目前，用于识别与感兴趣DNA序列相关蛋白的方法，如CAPTURE、Chap等大多需要交联，这可能会导致偏差的引入。因此，在本文中，作者开发了一种通过近端生物素化定量检测活细胞中短DNA序列（≤80bp）相关蛋白复合物的方法——PROBER。在设计上，PROBER主要需要三种质粒。其中pBait包含目的DNA序列作为“诱饵”，克隆在酿酒酵母GAL4 结合上游激活序列 (UAS) 16的三个串联重复之间；pSprayer质粒表达融合Cal4的枯草芽孢杆菌BASU生物素连接酶（HA tag）；pDriver表达SV40大T抗原用于通过它们的 SV40 复制起点对所有质粒进行高拷贝游离扩增。在生物素存在时，结合在UAS序列上的生物素连接酶可以生物素化结合在目标DNA序列上的蛋白复合物，裂解细胞后采用链霉亲和素捕获生物素化的蛋白质，并使用WB或质谱进行检测。为验证方法的可行性，作者检测了YY1（Yin Yang1），发现与乱序的对照组相比，实验组可以有效地富集到YY1，并且同时富集到了与YY1相互作用的 INO80 复合物中的NFRKB 和 RUVBL1 亚基。接下来，作者也将PROBER与DNA pull down法进行了对比，GO 分析表明，通过 DNA pull down鉴定到的大多数蛋白与 RNA 结合有关，而 PROBER 鉴定到的蛋白质与转录控制有关。最后，作者将PROBER技术应用于了hTERT启动子突变体相互作用蛋白的鉴定。hTERT被发现在多种癌症中会产生单个位点突变（C250T、C228A 和 A161C），作者克隆了这些突变并使用PROBER进行富集，发现了一些由于癌症相关突变而增加的启动子调节因子。总的来说，本文开发了一种近端生物素化方法PROBER，用于活细胞中与短DNA序列相关蛋白的检测。

大家好，本周为大家分享一篇预发表的文章，Top-down Proteomics of Myosin Light Chain Isoforms Define Chamber-Specific Expression in the Human Heart ，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授。　　肌球蛋白作为肌节的“分子马达”，产生心肌收缩所必需的收缩力。肌球蛋白轻链1和2 (MLC-1和-2)在调节六聚体肌蛋白分子结构中起着重要的功能作用。轻链中存在“心房”和“心室”亚型，在心脏中呈现出腔限表达。然而，近年来MLC亚型在人心脏的腔室特异性表达受到了质疑。在本文中，作者使用自上而下蛋白质组学质谱分析了成人非衰竭供体心脏的四个心脏腔室中MLC-1和-2心房和心室亚型的表达。　　MLC-1v和MLC-2a是在所有供体心脏中呈现出腔限表达模式的MLC异构体。重要的是，作者的结果明确地表明，MLC-1v，而不是MLC-2v，在成年人心脏中是心室特异性的。图1展示了LV(left ventricle)、RV(right ventricle)、LA(left atrium)和RA(right atrium)中MLC异构体的检测和定量。作者发现MLC-1v存在心室特异性表达，而MLC-2v没有特异性，并在心房组织中发现了与MLC-2v和pMLC-2v分子质量相匹配的峰。此外，在所有(n=17)无心脏疾病的捐赠者的每颗心脏的心房组织中都能检测到MLC-2v。MLC-2v占总MLC-2含量的百分比采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行定量分析，认为MLC-2v占总MLC-2含量的百分比具有统计学意义，心室和心房间差异显著，LA和RA间横向差异显著。　　图1. MLCs Top-down MS分析　　接下来作者使用串联质谱(MS/MS)鉴定了MLC-2v蛋白质序列。位于心房组织MLC-2v上的去酰胺化翻译后修饰(PTM)被定位到氨基酸N13。去酰胺化位点与调控磷酸化位点Ser14相邻。磷酸化位点附近的脱酰胺基团所带来的额外负电荷模拟了MLC-2a在Ser22/23位点的双磷酸化模式(图2C)。心房特异性的MLC-2v去酰胺化可能与心房内心力的产生有关。磷酸化诱导了MLC-2的构象变化，而第二负电荷的加入可能有助于提高钙敏感性并诱导蛋白质进一步的构象变化。　　图2. Top-down MS/MS 鉴定　　总的来说，自上而下蛋白质组学对整个人类心脏的MLC亚型表达进行了无偏差分析，揭示了之前意想不到的亚型表达模式和PTMs。　　撰稿：张颖　　编辑：李惠琳　　文章引用：Bayne EF, Rossler KJ, Gregorich ZR, Aballo TJ, Roberts DS, Chapman EA, Guo W, Ralphe JC, Kamp TJ, Ge Y. Top-down Proteomics of Myosin Light Chain Isoforms Define Chamber-Specific Expression in the Human Heart. bioRxiv [Preprint]. 2023 Feb 26:2023.01.26.525767. doi: 10.1101/2023.01.26.525767.　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　1. Bayne EF, Rossler KJ, Gregorich ZR, Aballo TJ, Roberts DS, Chapman EA, Guo W, Ralphe JC, Kamp TJ, Ge Y. Top-down Proteomics of Myosin Light Chain Isoforms Define Chamber-Specific Expression in the Human Heart. bioRxiv [Preprint]. 2023 Feb 26:2023.01.26.525767. doi: 10.1101/2023.01.26.525767.

药食同源尴尬 　　阿胶是一种滋补品，又称驴皮胶，在我国有2500多年的历史。作为上品，自古以来，都是用于药用，1990年版、1995年版、2000年版《中华人民共和国药典》(下称《药典》)均有相关质量规定：以驴皮熬制的胶为阿胶正品。 　　但2002年2月28日，阿胶的这一定位开始改变。当日，卫生部发布了《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》，通知中规定，阿胶被列为既是食品又是药品的物品名单。由此，在国家药监局进行注册的药品使用的阿胶类药品有10种，而大大小小的阿胶类食品和保健品，也应运而生。 　　“阿胶作为药品使用，在《药典》中是有相关标准规定的，但是作为食品以及保健品，目前还没有国家标准，现行的食品类的标准都是企业各自制定的标准，食品里面含有多少阿胶，也是由企业自己说了算。”一家阿胶企业的技术人员对记者表示。 　　“保健品的监管过去是由卫生行政部门进行监管，在三定方案之后，各地都在进行人员的调整，目前还没有调整完毕，实质性的工作都还没有展开，而且保健品监管的规范性文件的条例还需要进一步完善，由于人员还没有到位，目前只是进行一些调研类工作。央视报道的事件，是涉及到生产环节存在的问题。”一名山东当地药监局工作人员表示。 　　药食同源造成阿胶的定位出现尴尬。根据2005年7月1日卫生部呈报的“关于将阿胶从药食两用物品名单中撤出有关问题的报告”，“阿胶作为药食两用物品，可以按照用途申请药品批准文号，依据药品有关法律法规管理及药品生产企业良好操作规范要求生产 也可以申请保健食品批准文号，依据《保健食品管理办法》和保健食品生产企业GMP要求生产 还可以申请作为普通食品生产，依据普通食品相关法律法规管理和《食品企业通用卫生规范》要求生产的规定执行”。 　　而制定食品标准的相关部门工作人员表示，属于保健品的阿胶由药监部门制定，普通食品的监管由质检部门负责。 　　由于保健品监管的部门交接问题，阿胶的监管目前处于灰色地带，而作为食品阿胶的标准，则由企业自行制定，这给阿胶造假提供了自由空间。 　　如何检测真假 　　《药典》规定以驴皮熬制的胶为阿胶正品，牛皮熬制的胶为黄明胶。但是如何鉴别正品阿胶，消费者并不一定知情。 　　“目前国家检测标准是针对阿胶成分的氨基酸含量进行检测，驴皮制成阿胶的氨基酸含量比较高，而其他皮类次之，动物皮的下脚料或皮革下脚料中可以检测出金属铬，具有毒性。但氨基酸的检测对于阿胶来讲并不具备特异性，目前我们已研制出新的检测方法，可以使用DNA检测手段，可以区别驴、马、牛等不同的皮，不同类动物的DNA不同，但是目前还没有申报国家标准。”一家阿胶研究所的人表示。

环凯于2016年底正式推出基于lamp(环介导恒温扩增技术)荧光检测技术的微生物快速试剂盒，可用于食源性致病菌：沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，志贺氏菌，单核增生李斯特菌，副溶血性弧菌，大肠杆菌o157：h7，阪崎肠杆菌，产气荚膜梭菌等 水源性微生物：铜绿假单胞菌，粪肠球菌，产气荚膜梭菌的快速检测。 　　环凯lamp荧光检测试剂盒基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,lamp)荧光法检测，利 用两对特殊引物和具有链置换活性的bst dna聚合酶，使模板两端引物结合处循环出现环状单链结构， 引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应，实现在恒温条件下(60-65℃)进行连续快速扩增。反应体系中加入了显色指示剂，阴阳性结果显色差异显著，扩增结束后可以通过观察荧光显色剂的颜色变化判读结果，无需开盖避免了扩增产物交叉感染性的可能性。　　lamp技术是一种新型的恒温核酸扩增技术，该技术无需常规pcr中变性、退火、延伸等步骤不同温度设计要求，只需提供一个适宜的恒定温度即可。 因此，与常规pcr相比，lamp技术更适合现场高通量快速检测。　　采用环凯lamp试剂盒，可在快速增菌的基础上，40-60分钟即可完成检测，判读结果。而且特异性强，灵敏度高，比传统pcr灵敏度高10-100倍。是食品快速检测的福音。　　环凯lamp试剂盒的6大优势：　　1、快速判读：40-60分钟内完成检测，肉眼观察颜色变化即可判读结果。　　2、特异性强：针对靶基因的6个区段设计引物，保证扩增特异性。　　3、灵敏度高：比传统pcr灵敏度高10-100倍， 可检测5-20个拷贝。　　4、操作简单：几步加样后，60 -65℃温度范围内恒温条件下即可完成扩增。　　5、使用便捷：一管式冻干，免去繁琐的配置溶液步骤。　　6、仪器简单：扩增条件简单，能提供恒温的装置即可进行快速检测。 　　环凯lamp试剂盒产品列表： 　　需要了解更多关于lamp试剂盒的技术细节，可关注环凯公司微信公众号(扫以下二维码关注)，在“环凯服务--技术支持栏目”咨询。或者拨打环凯技术支持电话：020-32078333-8877咨询。 关注健康 为食品药品安全保驾护航 微生物控制整体解决方案的提供者　　扫描或长按二维码关注环凯公众号

单细胞分析技术对生物医学研究意义重大,目前在单细胞组学中,基因组学和转录组学技术相对成熟,单细胞转录组学和蛋白组学分析技术近年来获得越来越多的关注和投入。与其他组学相比，单细胞脂质组学分析刚刚起步，面临诸多技术难点。近期，威斯康星大学麦迪逊分校的李灵军教授团队报道了离子淌度（IMS）与双极性离子化质谱成像相结合的单细胞脂质组学方法，实现了单细胞脂质组高通量、原位和双极性成像，揭示了小鼠小脑皮质细胞层特异性脂质分布。该项工作以“Single-cell lipidomics enabled by dual-polarity ionization and ion mobility-mass spectrometry imaging”为题发表在Nature Communications（https://www.nature.com/articles/s41467-023-40512-6），文章第一作者为张华博士。该研究实施了捕集离子淌度分离（TIMS）与双极性电离（dual-polarity ionization）以及质谱成像（MSI）相结合，以实现单细胞（SC）脂质组的高通量原位分析。使用来自单培养和共培养的人胰腺癌 (PANC-1) 和活化的胰腺星状细胞 (PSC) 以及神经母细胞瘤细胞 (SK-N-SH) 的 SC 样本的 MSI 分析来评估该方法的性能 使用 MALDI 捕集离子淌度飞行时间质谱(MALDI-timsTOF-MS) 平台进行分析。研究结果表明, 高分辨率 MALDI-MSI 可为单细胞分析提供良好的重现性和质量准确度。整体来说,该研究建立了单细胞脂质组学分析的新技术,为揭示细胞间及细胞内脂质异质性研究提供了重要工具。更多关于李灵军教授研究团队的最新研究进展欢迎登陆课题组网站：https://www.lilabs.org/

近日，大连化物所仪器分析化学研究室质谱与快速检测研究中心（102组）李海洋研究员团队与大连医科大学附属第二医院冷松教授团队合作，基于我所自主研发的高分辨离子迁移谱技术，发展了一种面向床旁诊断的呼出气氨实时监测仪和新方法，实现了对周期性呼吸过程中呼出气氨的高灵敏和高特异性的实时监测。该方法可以有效减轻呼出气中高湿度、复杂背景，以及小分子氨的高吸附性残留对检测结果的干扰，为人体重要生物代谢标志物氨的检测提供了一种无创、实时、精准的新仪器和新方法。呼出气氨与体内氨基酸合成—代谢、尿素—氮动态平衡、血液酸碱平衡缓冲对等多种重要生理过程密切相关。呼出气中氨浓度为肝肾功能、雷氏综合征、尿素循环障碍、有机酸中毒和幽门螺杆菌感染等疾病的诊断提供了重要参考。因此，呼出气氨的快速、非侵入、准确定量监测具有重要的临床意义。在前期相关研究的基础上，本工作通过在漂气中加入改性剂丙酮来调控离子—分子反应，显著地提升了氨和试剂分子的峰—峰分离度，在上千种呼出气组分中实现痕量氨气的高特异性检测；发展了在线稀释和吹扫采样技术，解决了氨分子的吸附残留难题，实现了100%RH下呼出气氨的高灵敏检测；在宽的浓度范围（100至2400ppb）可以实现呼出气氨的准确定量检测，单次分析时间仅40ms。与目前血氨浓度检测方法相比，呼出气氨离子迁移谱检测仪具有无创检测、实时性强、选择性好、灵敏度高等优点，特别适用于透析疗效的实时监测和肝性脑病的早期识别，展示出床旁诊断的重要应用价值。目前，该仪器已在大连医科大学附属第二医院健康管理医学中心开展健康检测和评估。相关研究以“Breath-by-breath measurement of exhaled ammonia by acetone-modifier positive photoionization ion mobility spectrometry via online dilution and purging sampling”为题，发表在《药物分析学报》（The Journal of Pharmaceutical Analysis）上。该工作的第一作者是大连化物所与大连医科大学联合培养硕士研究生王露和102组蒋丹丹副研究员。该工作得到了国家自然科学基金、中科院科研仪器设备研制项目、大连化物所创新基金等项目的资助。

p style=" text-indent: 2em " 3月21日，国家食品药品监督管理总局（CFDA）发布了《结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂注册技术审查指导原则》（2018年第57号），旨在加强医疗器械产品注册工作的监督和指导，进一步提高注册审查质量。 /p p style=" text-indent: 2em " 附件： a href=" http://img1.17img.cn/17img/files/201803/ueattachment/a12b34e3-7d21-4a6a-8a02-03a277136204.doc" 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂注册技术审查指导原则.doc /a /p

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Ion Mobility-Mass Spectrometry and Collision-Induced Unfolding of Designed Bispecific Antibody Therapeutics1，文章的通讯作者是密歇根大学的Brandon副教授。　　双特异性抗体(bispecific antibodies, bsAbs)是一类重要的新兴疗法，能够同时靶向两种不同的抗原，已被开发作为对某些单克隆抗体疗效有限疾病的治疗手段。尽管bsAbs具有独特的优势，但它的结构较为复杂，需要特殊的制备工艺，“knobs-into-holes”(KiH)是其中一种可以用于制备bsAbs的技术，这种技术通过将knob链CH3结构域表面的特定氨基酸突变为较大氨基酸，将hole链上的突变为较小氨基酸，从而实现“knobs-into-holes”的配对形式，提高不同轻重链在配对时的正确配对率，产生正确的bsAbs。然而，由于抗体治疗药物分子量较大，通常比传统的小分子药物表现出更大的结构复杂性和异质性，对KiH bsAb 高级结构的完整表征对定义bsAb的结构功能关系，以及确保最终治疗的稳定性、有效性和安全性都至关重要。目前已开发的分析方法有很多，但是普遍存在样品消耗量大、数据采集和解析时间较长等缺点。近年来，非变性离子迁移质谱(ion mobility-mass spectrometry, IM-MS)和碰撞诱导去折叠(collision-induced unfolding，CIU)逐渐被证实是用于分析单克隆抗体高级结构的有效方法，能够从存在结构异质性和杂质的几微克样品中表征单抗治疗药物的高级结构。IM可以根据气相蛋白离子的电荷和旋转平均碰撞截面(collision cross sections，CCSs)在毫秒时间尺度上对蛋白进行分离。当与质谱耦合时，可以很容易地将质荷比相同但CCS不同的离子区分开来，而CIU可以使IM-MS同步提供蛋白质结构和构象稳定性信息。CIU根据二硫键、糖基化水平、结构域交换特性等信息来区分差异。　　在这篇文章中，作者描述了定量CIU在bsAbs中的首次应用，扩展了非变性IM-MS和CIU的能力，用于稳定表征KiH bsAb及其亲本knob和hole同型二聚体单抗的高级结构。　　图1 Native、未修饰的knob(蓝色)和hole(橙色)同型二聚体，以及KiH bsAb异型二聚体(绿色)的CIU实验。(A)24+电荷态(左)及其相应重复RMSD基线(右)的平均CIU指纹图谱(n=3)。所有的指纹图谱都显示了白色虚线框所示的三个主要特征。在(B) 5 V、(C) 65 V、(D) 110 V时的标准化TWCCSN2分布。在较低的激活电位下，所有抗体均具有相似的CCS，在较高的加速电位下则存在显著差异。(E)两两的RMSD分析显示，与重复的RMSD基线(虚线)相比，抗体之间的整体高级结构差异。(F)CIU50分析说明了KiH bsAb模型的稳定性如何保持在knob和hole的同型二聚体之间。　　如图1所示，bsAb的稳定性似乎与本文研究的KiH模型的两个亲本同型二聚体单克隆抗体相关。在电压为65V时，KiH bsAb的TWCCSN2分布与亲本knob同型二聚体单抗的分布相似 而在110V时，则与亲本hole同型二聚体单抗的分布相似。并且KiH bsAb的稳定性介于两种亲本同型二聚体单抗的稳定性之间。与指纹图谱中记录的第一次CIU转换相对应的是CIU50-1值，第二次的则是CIU50-2值，从3组样本的数据分析推测，CIU50-1和CIU50-2很可能代表了KiH bsAb和mAb结构中不同结构域的局部稳定性。　　图2 knob和hole的半体CIU数据。(A)16+电荷态的平均CIU指纹图谱(n=3).(B)两两RMSD分析显示，半体之间的高级结构存在显著差异。(C)CIU50分析显示，蛋白质稳定性存在显著差异。　　为了更好地展示KiH bsAb不同结构域的CIU特征，作者记录了同型二聚体单抗IM-MS光谱中16+电荷态的knob和hole半体的CIU数据。从图2A的指纹图谱可以看出，每种结构都包含4种主要的CIU特征，但是图2B的RMSD分析显示两种半体的高级结构之间存在显著差异。CIU50分析进一步表明，在观察到的两次展开过渡中，knob半体明显比hole半体更稳定。作者推测造成这种CIU主要差距的原因可能是Fab结构域的差异。　　图3 Fab和Fc片段的CIU数据。(A)13+电荷态的平均CIU指纹图谱(n=3).(B)两两RMSD分析显示，knob和hole的Fab片段之间存在显著差异。(C)CIU50分析显示，不同片段之间稳定性存在显著差异。　　为了进一步将CIU特征联系到KiH bsAb的结构域当中，作者对木瓜蛋白酶消化后产生的Fab和Fc片段进行了CIU分析。从图3A可以看出，knob和hole的Fab片段都具有3种CIU特征，但是嵌合的Fc片段则具有4种CIU特征。尽管knob和hole的Fab片段具有相似的CIU指纹图谱，但是RMSD分析显示它们之间的高级结构仍然存在较大差异，并且knob的Fab片段稳定性明显高于hole的。至于Fc片段的稳定性则远高于两种Fab片段，可能的原因是重链CH3结构域的强非共价作用以及knobs-into-holes配对的影响。　　图4 去糖基化后的knob、hole同型二聚体和KiH bsAb异型二聚体24+离子(n=3)。(A)比较对照组和去糖基化抗体的RMSD分析显示，高级结构有显著差异。CIU50-1(B)和CIU50-2(C)分析显示抗体去糖基化后表现出显著的不稳定性。(D)对照组和去糖基化抗体之间的CIU50值差异图。　　先前的研究已经证明，CIU对不同水平的单抗糖基化很敏感，其中去糖基化会导致单抗高级结构的不稳定。作者利用高分辨率非变性轨道阱质谱分辨添加PNGaseF前后同型二聚体mAb和KiH bsAb糖型的变化。实验结果显示，KiH bsAb表现出高度糖异质性，包含至少12种不同的糖型。这很可能归因于组装的KiH bsAb中每个独立的knob和hole重链上存在独特的糖基化，进一步增加了其复杂性。　　总而言之，这篇文章展示了IM-MS结合CIU用于建立KiH bsAb及其亲本同型二聚体之间高级结构联系的能力。单独的CCS不足以解决此研究中抗体之间细微的高级结构差异。相比之下，CIU指纹图谱则可以分辨和区分每一个等截面的抗体。这一解释bsAb CIU细节的能力，加上对KiH bsAb稳定性的更深入理解，有可能提供支持KiH bsAb发现和发展的关键信息。　　撰稿：梁梓欣　　编辑：李惠琳　　文章引用：Ion Mobility-Mass Spectrometry and Collision-Induced Unfolding of Designed Bispecific Antibody Therapeutics　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　Villafuerte-Vega, R. C., Li, H. W., Slaney, T. R., Chennamsetty, N., Chen, G., Tao, L., & Ruotolo, B. T. (2023). Ion Mobility-Mass Spectrometry and Collision-Induced Unfolding of Designed Bispecific Antibody Therapeutics. Analytical Chemistry.

结核病问题的解决仍是一个长期的世界性的难题。从20世纪90年代初世界卫生组织宣布全球进入结核病公共卫生紧急状态起,在相当长的一个时期内公众普遍乐观地认为,通过推行直接面视下短程化疗(DOTS)措施就可以有效解决结核病的问题。但是随着全球范围结核病防治工作的普遍开展和实践,到2011年前后,全球逐渐形成解决结核病问题需要将公共卫生管理和技术工具开发相结合的共识。结核病的有效防治需要在诊断、预防、治疗等3个方面(新诊断技术、新疫苗和新药物)下力气。在传染病相关的行政管理中,中国的模式和行政效率在世界上都是领先有效的。在行政手段有效保障的基础上,进一步提高控制能力的任务就需要客观具体的技术产品来实现了。随着我们对结核病、耐药结核病、耐多药结核病、广泛耐药结核病研究的日益深入,对其认识也是逐步提高的。在应用已有手段解决普遍性问题的同时,针对新发现的尚缺乏有效诊治手段的结核病类型,我们就需要研究更多新技术并开发更多的新产品,从技术能力上切实解决这些问题。免疫学诊断方法免疫分子用于结核病诊断新进展：在活动性结核病患者体内结核分枝杆菌特异性单阳性TNF-α+和双阳性IFN-γ+/TNF-a+CD4+T细胞的比例显著高于潜伏性感染者和未感染者。此外，表达IL-17的CD4+T细胞（主要为单阳性IL-17+和双阳性IL-2+/IL-17+表型）的频率在活动性结核病患者中高于其他两种组。分枝杆菌特异性CD4+T细胞的数量和功能特征在结核病感染和未感染结核的儿童之间以及潜伏和活动性结核病之间存在显着差异【1】。细胞因子和可溶性粘附分子谱和生物标志物用于治疗监测再治疗涂阳肺结核患者。复治期间，IFN-γ、IL-2、IL-7和可溶性CD54水平以及IL-2/IL-10和IFN-γ/IL-10比率呈上升趋势，可作为复治是否有效的血清指标【1】。IP-10和RANTES的组合可能被用作诊断和治疗监测肺结核中的生物标志物。肺结核患者血浆IP-10和RANTES水平显着高于健康对照组，IP-10和RANTES的组合在训练组中的AUC为1.0时表现**。响应治疗时，IP-10和RANTES均显着水平在6个月内减少【2】。γ-干扰素释放试验（IGRAs）用于结核病诊断新进展：IGRAs的原理是当机体内被结核菌抗原致敏的效应T细胞，在体外受到相同抗原的刺激（在APC细胞辅助下）后，会分泌大量的γ干扰素。通过IFN-γ的检测来判断结核感染的情况。IGRAs试验灵敏度高，特异性高，快速简便，是一种值得推广的检测方法，为潜伏性感染和活动性结核的辅助诊断，阴性结果对排除结核感染有一定的帮助。IGRAs试验用于筛查潜伏性感染时不受卡介苗接种的影响，但不适用于流行病学筛查。但是IGRAs预测哪些患者将来进展为活动性结核病的方面的应用较少。最近的一个大样本研究评估IGRAs和TSTs显示在低发病率国家，IGRAs和TST的阴性预测值＞99%，但阳性预测值仅为3%-4%【3】。下一代IGRAs发展前瞻需考虑以下几个方面：增加预测潜伏性感染到活动性结核的能力；能够检测结核分枝杆菌感染的临床阶段；监测潜伏感染或结核病的治疗效果；增加新抗原（如Rv3873、Rv3879和Rv3615）及增加更多细胞因子（IP-10，MCP-2，MIG等）来提高IGRA的敏感性。此外，随着结核分枝杆菌的菌量增加，结核特异性的CD8+ T细胞更容易检测到。CD8反应可以初步区别活动性与潜伏感染，与治疗效果相关【4】。双因子检测DeFine.TB 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒结核分枝杆菌特异性细胞因子（IFN-γ和IL-2）检测试剂是 “十三五” 国家科技重大专项传染病防治专项成果转化产品。在检测时，将人外周血单个核细胞从全血样本中分离出来 ，消除血液本底干扰因素，通过计数单个核细胞数量，排除人群中免疫细胞数量的个体差异影响。将定量的单个核细胞与融合蛋白ESAT-6-CFP-10-Rv1985c在细胞培养板上共培养，结核特异性 T 细胞由于记忆反应而分泌γ-干扰素及白细胞介素-2因子，再利用双抗体夹心酶联免疫法，检测培养上清中的γ-干扰素、白细胞介素-2的浓度，来判断其是否存在结核分枝杆菌特异性的细胞免疫反应。用于结核病的辅助诊断，能够及时发现活动性结核患者，同时对于潜伏感染患者能够进行及时、准确的排筛。01 新的检测靶标IL-2特异性高达94.3%研究结果发现IFN-γ的ROC 曲线下面积为0.859，而IL-2 的ROC 曲线面积0.865（详见Fig. 2 ） ，IFN-γ的总体敏感性和特异性分别为83.8% 和81.5%，IL-2的特异性为94.3%，灵敏度为72.6%（详见Table2）。02 新的检测靶标IL-2提高结核病的检出率双因子检测的敏感性为87.9%，单因子检测敏感性为83.8%，敏感性的增加主要是由于引入新的检测靶标IL-2，表明约16%的活动性结核患者中IFN-γ结果为阴性，而这些患者中有1/4的IL-2 结果为阳性。当IFN-γ和IL-2 串联组合时，特异性进一步提高到96.0%，可与分子诊断的培养阳性检测结果相媲美，甚至可以对培养阴性的患者产生可靠的结果。03 并联检测敏感性高达87.9%，串联检测特异性高达96.0%进一步分析IFN-γ和IL-2联合应用对活动性结核病的诊断价值。对IFN-γ和IL-2 进行并联检测时，敏感性升至最高的87.9%，特异性达到79.8%，阳性预测值达93.9%；当IFN-γ和IL-2 进行串联检测时，718 例非结核患者中有689 例检测结果为阴性，特异性为96.0%，敏感性为68.5%，阳性预测值为98.4%。值得注意的是，串联检测在结核病确诊患者的敏感性（72.1%），高于临床诊断敏感性（65.8%），提示IFN-γ和IL-2串联检测的准确度与结核病的严重程度相关。04 双因子联合检测灵活性高，满足不同的检测场景研究团队根据活动性结核病不同流行模型，分别阐述了IFN-γ和IL-2联合检测在不同模型中诊断价值，并提出了适用于综合性医院和专科医院各自的诊断算法。在综合性医院中，约有10%的结核疑似患者最终确诊为活动性结核，与常规涂片镜检相比，使用具有更高敏感性的双因子并联检测可帮助临床医生发现更多活动性结核病患者（如图B）；在结核病专科医院，结核病疑似患者中活动性结核病的比例达到50%，使用具有高特异性的双因子串联检测可为活动性结核病患者特别是菌阴结核患者提供诊断依据（如图A）。在检测时，将人外周血单个核细胞从全血样本中分离出来 ，消除血液本底干扰因素，通过计数单个核细胞数量，排除人群中免疫细胞数量的个体差异影响。将定量的单个核细胞与融合蛋白ESAT-6-CFP-10-Rv1985c在细胞培养板上共培养，结核特异性 T 细胞由于记忆反应而分泌γ-干扰素及白细胞介素-2因子，再利用双抗体夹心酶联免疫法，检测培养上清中的γ-干扰素、白细胞介素-2的浓度，来判断其是否存在结核分枝杆菌特异性的细胞免疫反应。用于结核病的辅助诊断，能够及时发现活动性结核患者，同时对于潜伏感染患者能够进行及时、准确的排筛。

近年来,蛋白质组学技术在肽和蛋白质类新型治疗药物的蓬勃发展以及临床新型大分子生物标志物的深入发掘中被日益广泛应用。应用方式的迭代对生物大分子的分析技术提出了更高的要求。基于蛋白质特征肽段检测的自下而上的蛋白质组学技术(bottom up proteomics)是现有研究中具有较高灵敏度与分辨率的蛋白质定性定量方法。开发多肽的生物分析方法是极具挑战的,除了所需的低检出限外,多肽的非特异性吸附性质,使其极易在接触到的材料表面发生吸附,进而导致分析全流程中待测物的丢失或干扰,给定性和定量分析引入巨大风险。例如在蛋白组学研究的质谱数据库搜索中,即使系统中微量肽段的损失或残留亦可能导致假阳性或假阴性结果。而在高灵敏度的多肽定量方法的开发中,肽段的非特异吸附对定量分析的线性、准确度和精密度均有负面影响。低浓度肽段溶液的吸附性质会更加明显,表现形式为标准曲线的非线性,最终导致定量限的不必要升高以及方法的重复性差。已有一些研究在分子水平上解释这种吸附行为,然而目前对其潜在的机制和相互作用仍然知之甚少。Eeltink等基于分子动力学模拟,提出了一种三相分子机制解释肽段从溶液吸附到强相互作用不带电固定相上的原理。Kristensen等研究了样品容器对阳离子多肽吸附的影响,当1 μmoL/L肽溶液在硼硅酸盐或聚丙烯瓶中存储1 h后,肽段的回收率仅有10%~20%。也有研究通过在溶剂中添加有机试剂、酸/碱性溶液、表面活性剂、吸附竞争剂或调整流动相组成等方法减少这类吸附。这些研究论文大多对一组特定的多肽和/或表面材料进行研究,但均未给出可用来预测多肽吸附特性的规律,也未给出通用的解决吸附的方法。本研究选择牛血清白蛋白(BSA)作为模型蛋白质,以其酶解后的肽段作为包含亲水性和疏水性多肽的“典型”多肽组样本。首先通过超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-HRMS)的测定,分析常见多肽理化参数与上述多肽组的非特异吸附程度的关联性。然后基于超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-QQQ-MS/MS)建立对强吸附肽段吸附程度的评估方法,从样品制备至分析测定建立全过程试验设计,考察不同材质的制备、储存耗材对肽段吸附的影响,以及考察不同色谱条件对肽段残留的影响,最终提出多肽全流程分析中减少非特异性吸附的通用型策略。01样品制备方法取10 mg BSA溶于10 mL水中,制得1 mg/mL蛋白储备液,进一步以水稀释为100 μg/mL的工作液。取200 μL上述工作液于蛋白质低吸附离心管中 加入65 μL 500 mmol/L碳酸氢铵和60 μL 50 mmol/L二硫苏糖醇,于60 ℃水浴加热60 min对蛋白质进行还原 放冷至室温后加入120 μL 50 mmol/L碘代乙酰胺,于暗处反应30 min进行烷基化 加入100 μg/mL的胰蛋白酶5 μL,于37 ℃水浴中酶解8 h,加入甲酸20 μL终止反应,12000 g离心15 min后,取200 μL上清置于蛋白质低吸附的进样瓶中作为混合肽段溶液待测。02超高效液相色谱-高分辨质谱方法参数色谱条件:色谱柱采用Waters Acquity Premier Peptide CSH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) 柱温为40 ℃ 流速为0.25 mL/min 流动相A、B两相分别为0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液。洗脱梯度为0~1 min, 1%B 1~13 min, 1%B~40%B 13~13.1 min, 40%B~90%B 13.1~16 min, 90%B 16~16.1 min, 90%B~1%B 16.1~20 min, 1%B。进样器温度10 ℃ 进样量5 μL。质谱条件:毛细管电压3 kV,锥孔电压30 V,离子源温度120 ℃,脱溶剂气温度450 ℃,锥孔气流速25 L/h,脱溶剂气流速800 L/h。电喷雾电离(ESI)源、正离子模式下测定,MSE模式采集,扫描范围m/z 50~2000 数据采集时使用亮氨酸脑啡肽校正液进行实时质量校正,以保证采集质量数的准确性与重复性。采集后的数据使用Unifi软件处理。03相对残留量的测定和肽段分级策略将上述混合肽段溶液经上述条件采集、Unifi软件分析后,可得BSA酶解后肽段组的实际肽段组成和每个肽段的响应值Area(供试品溶液)。在进样上述供试品溶液后连续进样3针空白溶剂,以3针空白溶剂中检测到的对应肽段响应之和Area(Blank 1+Blank 2+Blank 3)计为该肽段的残留总量,该肽段的相对残留量为肽段的残留总量与肽段响应值的比值。基于肽段的响应与相对残留量,可将BSA酶解后的肽段组分为如下四类:Class Ⅰ,响应高且无残留的肽段 Class Ⅱ,响应高但有残留的肽段 Class Ⅲ、Class Ⅳ分别为响应低,无吸附和有吸附的肽段。响应的高低以是否大于中位数计,有无残留以Area(Blank 1+Blank 2+Blank 3)是否有检出判断。04超高效液相色谱-三重四极杆质谱方法参数色谱条件:色谱柱采用Waters ACQUITY UPLC BEH C8(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) 柱温30 ℃ 流速0.4 mL/min 流动相A、B两相分别为0.2%甲酸水溶液和0.2%甲酸乙腈溶液。洗脱梯度为0~2 min, 2%B 2~5 min, 2%B~60%B 5~5.1 min, 60%B~90%B 5.1~8 min, 90%B 8~8.1 min, 90%B~2%B 8.1~11 min, 2%B。进样器温度10 ℃ 进样量5 μL。洗针液为90%乙腈水溶液(含0.2%甲酸)。质谱条件:离子化电压5500 V 气帘气压力0.14 MPa 离子源温度500 ℃ 喷雾气、辅助加热气压力0.38 MPa。ESI源正离子模式下测定,多反应监测(MRM)模式采集,12条Class Ⅱ类肽段的离子对、碰撞能量(CE)、去簇电压(DP)值经Skyline软件协助优化后结果如原文表1所示。文章信息色谱, 2022, 40(7): 616-624 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2021.12012张莹1,2, 杨静1,2, 马跃新1,2, 曹玲2*, 黄青2*1.南京中医药大学药学院, 江苏 南京 2100232.江苏省食品药品监督检验研究院, 国家药品监督管理局化学药杂质谱研究重点实验室, 江苏 南京 210019

仪器信息网讯 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)暴发,对人民群众的生命安全和身心健康造成了严重损伤。SARS-CoV-2核酸检测作为COVID-19诊断的主要指标受多种因素影响致其假阴性率较高。为提高诊断效率国家卫生健康委员会早在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(第七版)》中就提出将SARS-CoV-2特异性抗体列为疑似病例确诊的病原学证据之一。近日，路明克斯（Luminex）公司宣布推出全新Guava® SARS-CoV-2多抗原抗体检测试剂盒，用于流式细胞仪，助力全面免疫分析。血清学检测有助于疾病的防治和疫苗研发核酸检测方法作为新冠病毒肺炎确诊的关键技术，在疫情期间发挥着巨大作用，然而，核酸检测多采用咽拭子，新冠病毒感染人体后，上呼吸道(咽部)的病毒含量低，在感染过程中，随着人体机能的增强，病毒载量会有一个相对降低的过程，再加上采样不规范、运输和存储等过程中可能导致病毒RNA的降解，都导致了核酸检测可能出现“假阴性”结果。相反，血清学检测方式中使用的样本是血清，血清中一般不含有冠状病毒或含病毒量较低，可以大大降低医护人员的职业暴露风险；同时血清学检测方法不仅可以用于感染的诊断，也可以检测感染者体内特异性抗体的变化情况、人群的易感状况等，有助于疾病的防治和疫苗研发。血清学检测有利于研究人员通过测量血液（血清或血浆）中 SARS-CoV-2 抗体的存在来确定受试者是否已感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2），也就是导致 COVID-19 的病毒。抗SARS-CoV-2 抗体检测依赖于免疫反应，并可能受多种因素影响，包括病毒暴露量、症状发作后评估阶段、年龄、性别和健康状况。因此，血清学检测的灵敏度和特异性对于准确可靠检测抗SARS-CoV-2 抗体来说非常重要。科普：实验室检测新冠病毒判断人体内是否感染了新冠病毒，有两种常用的实验室检测方法，一种是核酸检测，一种是血清学抗体检测。1、核酸检测核酸检测主要是检测鼻咽拭子、咽拭子、痰液等标本中是否有新冠病毒核酸，检测结果阳性代表感染了新冠病毒。通过核酸检测筛查新冠病毒感染者，是实现“早发现”和“早诊断”最重要的手段和措施，有助于后续尽早给予治疗和干预，减少重症和死亡。人群核酸检测能协助判定疫情规模和流行阶段，同时可用于判断传染性的大小和作为解除隔离的依据。2、血清学抗体检测血清学抗体检测主要检测血清中针对新冠病毒的特异性抗体，即人体在感染新冠病毒后产生的具有免疫功能的蛋白质。在感染的不同时期，出现的抗体类型不同，所以血清学抗体检测主要用于判断既往感染、恢复期诊断、流行病学回顾性调查以及疫苗效果评估等。抗体检测阳性提示被检查者处在恢复期，或者曾经感染过，或者接种过疫苗，需要结合核酸检测结果作出综合分析。助力免疫反应全面评估，路明克斯全新试剂盒该试剂盒是一种新型的、基于微球的免疫分析试剂盒，用于流式细胞仪，可同时分析血清和血浆样本中针对三种SARS-CoV-2抗原（核衣壳蛋白（N）、刺突蛋白受体结合域（RBD）以及刺突蛋白S1亚基（S1））的IgG、IgM和IgA抗体表达。通过对荧光强度和数据结果简单直观地解读，可轻松分析体内相关抗体的水平，为免疫反应提供更全面的评估。Guava® SARS-CoV-2抗体检测试剂盒针对Guava® Muse® 细胞分析仪和Guava® easyCyte™ 系统上进行了系统性的优化，亦可兼容任何配置有488nm或532nm激光器的流式细胞仪。Guava easyCyte流式细胞仪（点击查看）Guava Muse细胞分析仪（点击查看）据悉，针对血清样本中SARS-CoV-2抗体同型特异性分析，其工作流程十分简易：仅需三步即可完成从样本到数据的过程：从抗体孵育，上机检测到数据输出，整体流程不超过75分钟。将50μL人血浆和血清样品以1：400稀释、孵育，然后在Guava® Muse® 细胞分析仪上进行分析。结果如图所示，在样本中清晰地检测到SARS-CoV-2特异性的IgG、IgM和 IgA抗体。综上，该试剂盒主要具有：同时进行分析三种SARS-CoV-2特异性抗原；更加完整的抗体图谱；更加全面的免疫反应评估；简单、快速获取结果；检测通量灵活等特点。

美国加州大学欧文分校（UCI）研究人员开发出一种DNA酶，可区分一个细胞内的两条RNA链，并切割与疾病相关的链，同时保持健康链的完整性。这项突破性的“基因沉默”技术可能会彻底改变用于治疗癌症、传染病和神经疾病的DNA酶的发展。相关研究论文刊登于最新一期《自然通讯》杂志。一个信使核糖核酸（mRNA）的发夹环，绿色为核碱基，蓝色为磷酸核糖骨架。（图片来源：物理学家组织网）DNA酶是切割其他分子的核酸酶。利用酶让“基因沉默”技术已经存在20多年，美国食品药品监督管理局批准了一些药物，但没有一种药物能够区分RNA链中的单点突变，而UCI团队研制出的Dz 46酶可识别和切割特定的基因突变。Dz 46酶外表看起来像希腊字母Ω，通过加速化学反应起到催化剂的作用，其左右两侧的“臂”与RNA的靶区结合，组成的环与镁结合，并在一个非常特定的位置折叠和切割RNA，但其发挥作用非常依赖镁。为此，研究团队使用化学方法重新设计了这种DNA酶，降低了其对镁的依赖性。得到的Dz 46酶专门靶向KRAS基因内的等位基因特异性RNA突变，KRAS基因是细胞生长和分裂的主要调节因子，出现于25%的人类癌症中。研究人员表示，他们的研究结果表明，化学进化可以为开发多种疾病的新疗法铺平道路。他们计划进一步调整Dz 46酶，然后开展临床前试验。

01研究背景SLC9C1是精子中特异的溶质载体，属于阳离子/质子逆向转运蛋白SLC9超家族，其表达与精子数量和活力直接相关。SLC9C1包含运输结构域(TD)，电压感应结构域 (VSD)和环核苷酸结合结构域 (CNBD)。VSD感知的膜电压如何激活转运体中的离子交换机制一直不清楚。来自海德堡大学的Cristina Paulino课题组在Nature上发表了题为“Structures of a sperm-specific solute carrier gated by voltage and cAMP”的文章，解析海胆SLC9C1的结构，并揭示了三个功能域是如何耦合。文中使用NanoTemper Panta分析配体对SLC9C1的构象的影响。02案例解读https://doi.org/10.1038/s41586-023-06629-wSpSLC9C1以同二聚体的形式组装，通过结构解析，作者明确识别SpSLC9C1不同的结构域：TD、VSD和CTD（包括CNBS和CH1-9）。图1：SpSLC9C1在序列水平上的结构域排列环核苷酸可以使得SLC9C1在静息电位激活，cAMP的激活效果比cGMP高。作者又解析了SLC9C1在cAMP与cGMP存在的情况下的结构（图2A）。发现结合cAMP的SLC9C1结构有很高的构象异质性，特别是CTD。分析发现cAMP破坏了β-CTD之间的二聚体相互作用，导致CTD偏离对称轴。为了进一步表征cGMP和cAMP结合对SpSLC9C1的影响，作者分析分离的CTD (S946-E1193， CNBD和β-CTD) 在加入cAMP和cGMP后Tm的变化。从结构信息来看，cGMP的加入未引起SLC9C1构象上明显改变，对应的ΔTm变化可能很小。因此，需要一种高精度和重复性的方法进行检测。nanoDSF技术检测Tm精度为±0.1℃，避免重复性差造成的假阴性问题。实验时，无需加入染料，也不存在染料分子造成的不兼容或者对蛋白的其他影响。nanoDSF检测显示，环核苷酸诱导CTD的热稳定性增加，其中cAMP产生6°C的位移，而cGMP仅观察到2°C，结果证实了cAMP对SpSLC9C1有较高的增强作用。图2：A.加入cGMP和cAMP后SpSLC9C1 -CTD结构；B.Panta nanoDSF模块检测SpSLC9C1 -CTD(蓝色)以及加入cGMP(紫色)和cAMP(橙色)后Tm综上，cAMP结合在CNBD结构域后也可以破坏β-CTD的相互作用，使其可以在更接近静息电位下被激活，进而进行钠/氢交换，揭示了SLC9C1电压调节与cAMP调节的钠/氢交换机制。03产品技术优势Panta nanoDSF模块具有极高数据重复性和准确性，确保您获得准确的Tm值。实验时无需加入染料，操作简单的同时，保证了实验结果。此外，Panta整合了DLS、SLS、背反射和nanoDSF四大检测模块，只需一份样品，便可以获得多种稳定性参数。PR Panta蛋白稳定性分析仪

使用序列特异性的CAS内切酶进行精确性敲除，敲入，替换等已成为一种常用的分子生物学手段。但是，为了识别所需的基因修饰，排除脱靶克隆，仍然需要筛选几百个单克隆细胞系。而大量克隆的维护和筛选是一个费力、耗时、容易出错的过程。欧洲分子生物学实验室（EMBL）研究人员Moritz Kueblbeck, Andrea Callegari等分享了一种快速验证基因编辑效果的实验方案。该方案使用naica® 微滴芯片数字PCR系统（Crystal Digital PCR™ ）实现了一次三色分析就可完成目标拷贝数的评估和脱靶事件的检测。且基于数字PCR (dPCR)的高敏感性，无需大量的样品，因此，在早期就可以完成筛选试验。Crystal Digital PCR™ 一次实验3个小时内就可完成，对于编辑错误的克隆当天就可终止培养。那么这个实验具体是怎么设计的？就让我们一起来看看吧。应用亮点：▶ naica® 微滴芯片数字PCR系统一次三色分析同时完成目标拷贝数的评估和脱靶事件的检测，是非常强大的绝对定量工具。▶ naica® 微滴芯片数字PCR系统对长插入片段(如mEGFP)拷贝数提供稳健的检测方法。▶ naica® 微滴芯片数字PCR系统只需少量生物样本，可以在早期完成检测，快速完成CRISPR筛选，节省时间。Single-step 3-color Crystal Digital PCR™ 实验设计：该实验共设计了三个探针：1.“total tag”（HEX基团标记）检测mEGFP转基因；2.“on-target tag”（FAM基团标记）检测内源NUP93编辑位点的最后一个外显子与整合的mEGFP转基因(标签)的5' 序列之间的连接；3.reference(CY5基团标记)作为内参，对“total tag”和“on-target tag”进行归一化。“total tag”归一化获得整合的mEGFP拷贝数和“on-target tag”获得靶标上整合的mEGFP拷贝数。实验使用U-2 OS细胞作为基因编辑对象，其具有3个NUP93等位基因。结果分析：如图B所示，对多个U-2 OS细胞系的基因编辑效果进行分析，naica® 微滴芯片式数字PCR系统结果显示克隆35，52和247的U-2 OS细胞mEGFP总拷贝数和靶标拷贝数都为3，这表明这三个细胞系的所有3个NUP93等位基因都成功编辑，没有脱靶，这个结果与检测金标准的Southern blot的结果一致（图C），而克隆5虽然mEGFP总拷贝数和靶标拷贝数一致，但与NUP93位点的预期数量不匹配。这表明其可能发生基因组的重排，而Southern blot结果也验证了这一现象，其出现了一个小于正常NUP93的拷贝条带。对于克隆25和246，虽然其靶标拷贝数符合预期，但是其总拷贝数大于3，这表明其可能存在脱靶整合或者不完全HDR（homology-directed repair）现象，而Southern blot结果显示其存在一个过大的整合条带，表示其可能存在基因重排。上述这些结果表明基于naica® 微滴芯片式数字PCR系统（3-color Crystal Digital PCR™ ）的基因编辑脱靶检测的三色数字PCR检测方法，是一种快速简便的一步检测方法，其结果与耗时更长的Southern blot技术完全一致，可以用来快速评估基因编辑效果，筛选适合的基因编辑细胞株系。

在药物设计领域，K-Ras蛋白是一个传奇。作为人类癌症中最常见的突变癌基因，30多年来它一直位列在所有研究人员的&ldquo 靶点&rdquo 清单上。尽管如此的高调，由于许多的制药、生物技术公司和高校实验室都未能设计出一种能够成功靶向这一突变基因的药物，在科学界里K-Ras被视作是&ldquo 无药可及&rdquo 的靶点。 现在，来自加州大学旧金山分校霍华德休斯医学研究所（HHMI）的研究人员，鉴别并利用了K-Ras一个新发现的&ldquo 阿喀琉斯之踵&rdquo （Achilles heel）。这一薄弱点就是HHMI研究人员Kevan M. Shokat和同事们在K-Ras上新发现的一个 &ldquo 口袋&rdquo （结合位点）。Shokat和他的研究小组设计出了一种化合物，证实它可以进入到这一口袋里，抑制突变K-Ras的正常活性，但不会影响正常的蛋白。 Shokat 说：&ldquo 人们将K-Ras视作是癌症中最重要的癌基因，并广泛认为它&lsquo 无药可及&rsquo 。我们报告称发现了K-Ras上一个药物可及的新口袋。我们相信这对于患者将具有真正的转化意义。&rdquo 在发表于11月20日《自然》（Nature）杂志上的一篇研究论文中，Shokat研究小组描述了一种新型的化合物，其能够进入到K-Ras上一个从前未知的口袋中，干扰该酶的功能。Ras蛋白是一种在细胞内负责传送信号的小GTPase。由于它们在细胞生长和存活中发挥核心作用，对于细胞至关重要。 Ras这一名称也用于指代编码这些蛋白质的基因家族。其中的一个基因K-Ras大约30年前被发现，在30%的人类肿瘤，包括90%的胰腺癌、40%的结肠癌和20%的非小细胞肺癌中存在突变。携带Ras突变的癌症具有侵袭性，对标准治疗反应不佳。 尽管靶向突变Ras基因的研究工作一直遭受挫折，美国国家癌症研究所（NCI）近日强调将继续重视这一难对付的药物靶点，并宣布了一项1000万美元的RAS计划。这项计划将汇集研究人员共同开发阻断Ras的新思路，以激励研发出新药或新疗法让癌症患者受益。 Shokat的HHMI研究小组在大约6年前开始启动对Ras的研究工作。利用他们的化学专业知识，Shokat和两个研究小组成员：博士后研究人员Ulf Peters以及博士生Jonathan Ostrem拟定了一些早期的想法：研发一类新的Ras突变体抑制药物。&ldquo 其中一些早期的策略行不通，&rdquo 他说。 &ldquo 我们不得不开发出一种新的筛选方法，其最终推动研发出了这一新抑制剂。&rdquo Shokat说当确定了他们的攻击范围时他们做了一些不一样的事情。他们将焦点缩小，专注于其他科学家们没有采用的策略。他们还选择了研究一种叫做G12C的K-Ras突变体，这种K-Ras突变体广泛存在于大约7%的肺癌患者中。 这一突变使得K-Ras蛋白中第12位的甘氨酸被半胱氨酸所替代。重要的是，这一半胱氨酸处在对Ras正常功能至关重要的一个位置。偏离从前的研究工作，Shokat和同事们没有试图靶向天冬氨酸和缬氨酸突变的Ras版本&mdash &mdash 这些突变相对常见，因此过去许多的科学家们都将焦点放在这些突变上。反之，他们挑选出了G12C突变体，因为这些Ras突变体影响了大批的肺癌和结直肠癌患者。 Shokat说，这一半胱氨酸所赋予的一些化学特性，为他的研究小组提供了一个独特的药物设计把柄。在20种天然氨基酸中半胱氨酸具有一种独特的能力：可以形成共价键。通常两个半胱氨酸之间形成共价键起稳定蛋白质结构的作用，但如果存在游离半胱氨酸，就如同G12C K-Ras，一种特别设计的药物就可以与这一半胱氨酸形成共价键。 Shokat说：&ldquo 其他人一直认为他们必须去追逐所有的Ras突变体。我们寻找的是别人没有做过的，我们挑选出这一特殊突变是因为它的一些化学特性。&rdquo 在三年的时间里，该研究小组对500多个化合物进行了初步筛查，看看他们能否鉴别出一个可以与K-Ras G12C共价结合和&ldquo 连接&rdquo 的化合物。他们的研究导致鉴别出了一种有效的K-Ras抑制剂。为了获得这一化合物与K-Ras互作机制的更好图像，科学家们解析了这一化合物与K-Ras结合的晶体结构。 当他们检测数据时，Shokat和研究小组发现在靠近这一半胱氨酸残基的K-Ras蛋白表面上有一个之前从未描述过的口袋。Shokat说：&ldquo 这个口袋是新发现的，此前从未有人找到它。&rdquo 通过进一步的调查，他们发现化合物是通过改变Ras与底物GTP的自然亲和力从而对其形成干扰的。&ldquo 其中最重要的一个方面就是这一小分子只抑制突变K-Ras，而不影响正常蛋白，&rdquo Shokat说。 接下来的工作包括：继续优化这一化合物，进一步测试了解这一化合物在多大程度上能够杀死具有G12C突变的细胞。Shokat说他和同事们成立了一家叫做Araxes Pharma, LLC的公司，与强生的下属部门Janssen Biotech建立了合作关系，以开发出有潜力应用于临床的化合物。 人透明质酸结合蛋白(HABP)ELISA试剂盒 Human Hya]uronate binding protein,HABP ELISA试剂盒 人Ⅰ型胶原N末端肽(NTX)ELISA试剂盒 Human cross linked N-telopeptide of type Ⅰ collagen,NTX ELISA试剂盒 人幽门螺旋杆菌IgM(Hp-IgM)ELISA试剂盒 Human Helicobacter pylori IgM,Hp-IgM ELISA试剂盒 人细胞毒素相关蛋白A(CagA)ELISA试剂盒 Human Cytotoxin-associated protein,CagA ELISA试剂盒 人胃抑素(GIP)ELISA试剂盒 Human gastric inhibitory polypeptide,GIP ELISA试剂盒 人胃泌素释放多肽(GRP)ELISA试剂盒 Human gastrin-reliasing peptide,GRP ELISA试剂盒 人胃泌素释放肽前体(ProGRP)ELISA试剂盒 Human pro-gastrin-releasing peptide, ProGRP ELISA试剂盒 人胶原蛋白Ⅱ(HCBⅡ)ELISA试剂盒 Human Collagen-like Bioprotein Ⅱ,HCBⅡ ELISA试剂盒 人促胰液素/胰泌素(Secretin)ELISA试剂盒 Human Secretin ELISA试剂盒 人多肽YY(Peptide-YY)ELISA试剂盒 Human Peptide YY ELISA试剂盒 人促胃液素受体(GsaR)ELISA试剂盒 Human gastrin receptor,GsaR ELISA试剂盒 人胆囊收缩素/缩胆囊素八肽(CCK-8)ELISA试剂盒 Human cholecystokinin octapeptide,CCK-8 ELISA试剂盒 人胰蛋白酶原激活肽(TAP)ELISA Human trypsinogen activation peptide,TAP ELISA试剂盒 人&alpha 1酸性糖蛋白(&alpha 1-AGP)ELISA试剂盒 Human &alpha 1-Acid glycoprotein,&alpha 1-AGP ELISA试剂盒 人内皮型一氧化氮合成酶3(eNOS-3)ELISA试剂盒 Human &alpha 1-Acid glycoprotein,&alpha 1-AGP ELISA试剂盒 人丙二醛(MDA)ELISA试剂盒 Human malondialchehyche,MDA ELISA试剂盒 人胰淀素(Amylin)ELISA试剂盒 Human Amylin ELISA试剂盒 人血管活性肠肽(VIP)ELISA试剂盒 Human Motilin,MTL ELISA试剂盒 人胆囊收缩素/肠促胰酶肽(CCK)ELISA试剂盒 Human cholecystokinin,CCK ELISA试剂盒 人Ⅲ型前胶原肽(PⅢNP)ELISA试剂盒 Human N-terminal procollagen Ⅲ propeptide,PⅢNP ELISA试剂盒 人Ⅱ型胶原(Col Ⅱ)ELISA试剂盒 Human Collagen Type Ⅱ,Col Ⅱ ELISA试剂盒 人Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)ELISA试剂盒 Human Collagen Type Ⅰ,Col Ⅰ ELISA试剂盒 人Ⅰ型前胶原羧基端肽(PⅠCP)ELISA试剂盒 Human procollagen Ⅲ N-terminal peptide,PⅢNT ELISA试剂盒 人透明质酸(HA)ELISA试剂盒 Human Hyaluronic acid,HA ELISA试剂盒 人Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)ELISA试剂盒 Human Collagen Type Ⅳ,Col Ⅳ ELISA试剂盒 人Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)ELISA试剂盒 Human Collagen Type Ⅲ,Col Ⅲ ELISA试剂盒 人层连蛋白/板层素(LN)ELISA试剂盒 Human Laminin,LN ELISA试剂盒 人纤连蛋白(FN)ELISA试剂盒 Human Fibronectin,FN ELISA试剂盒 人纤连蛋白(FN)ELISA试剂盒 Human Fibronectin,FN ELISA试剂盒 人NOGO-A抗体(Nogo-A Ab)ELISA试剂盒 Human anti-Nogo-A antibody,NOGO-A Ab ELISA试剂盒 人抗组织转谷氨酰胺酶抗体IgA(tTG-IgA)ELISA试剂盒 Human Anti-tissue tranGSlutaminase IgA,tTG-IgA ELISA试剂盒 人抗存活素抗体/生存蛋白(Surv)ELISA试剂盒 Human anti-Survivin antibody,Surv ELISA试剂盒 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子抗体(GM-CSF Ab)ELISA试剂盒 Human anti-Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor antibody,GM-CSF Ab ELISA试剂盒 人抗肌联蛋白抗体(TTN)ELISA试剂盒 Human Anti-titin Antibody,TTN ELISA试剂盒 人抗突触前膜抗体(PsmAb)ELISA试剂盒 Human anti-presynaptic membrane antibody,PsmAb ELISA试剂盒 人血管紧张素Ⅱ受体2抗体(AT2R-Ab)ELISA试剂盒 Human Angiotensin Ⅱ Receptor 2 antibody,AT2R-Ab ELISA试剂盒 人血管紧张素Ⅱ受体1抗体(ATⅡR1)ELISA试剂盒 Human angiotension Ⅱ receptor 1 Antibody,ATⅡR1 Ab ELISA试剂盒 人血管紧张素Ⅰ受体抗体(ANG-ⅠR)ELISA试剂盒 Human angiotension I receptor Antibody,ANG-ⅠR antibody ELISA试剂盒 人卵清蛋白特异性IgG(OVA sIgG)ELISA试剂盒 Human ovalbumin specific IgG,OVA sIgG ELISA试剂盒 人抗钙调素特异抗体(CAM-ab)ELISA试剂盒 Human anti-calmodulin specific antibody,CaM-ab ELISA试剂盒 人甲状腺非肽激素抗体(THAA)ELISA试剂盒 Human thyroid hormone autoantibodies,THAA ELISA试剂盒 人抗类固醇生成细胞抗体(SCA)ELISA试剂盒 Human steroid producing cell autoantibody,SCA ELISA试剂盒 人粒细胞特异性抗核抗体(GS-ANA)ELISA试剂盒 Human granulocyte specific antinuclear antibody,GS-ANA ELISA试剂盒 人抗信号识别颗粒抗体(SRP)ELISA试剂盒 Human signal recognization particle antibody,SRP ELISA试剂盒 人封闭抗体(BA)ELISA试剂盒 Human Blocking antibody,BA ELISA试剂盒 人抗细胞膜DNA抗体(cmDNA)ELISA试剂盒 Human anti-cell membrane DNA antibody,cmDNA ELISA试剂盒 人抗钙蛋白酶抑素抗体(ACAST-DⅣ)ELISA it Human autoantibodies against the C-terminal domain Ⅳ,ACAST-DⅣ ELISA试剂盒 人卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)ELISA试剂盒 Human ovalbumin specific IgE,OVA sIgE ELISA试剂盒 人抗核仁纤维蛋白抗体(AFA/snoRNP/U3RNP)ELISA试剂盒 Human anti-fibrillarin antibody,AFA/snoRNP/U3RNP ELISA试剂盒 人系统性红斑狼疮(SLE)ELISA试剂盒 Human systemic lupus erythematosus,SLE ELISA试剂盒 人抗神经节苷脂抗体(GM1)ELISA试剂盒 Human anti-ganglioside antibody,GM1 ELISA试剂盒 人抗髓鞘相关糖蛋白抗体(MAG Ab)ELISA试剂盒 Human anti-myelin associated glycoprotein antibody,MAG Ab ELISA试剂盒 人抗中性粒细胞颗粒抗体(ANGA)ELISA试剂盒 Human anti-neutrophil granules antibody,ANGA ELISA试剂盒 人抗中性粒细胞抗体(ANA)ELISA试剂盒 Human anti-neutrophil antibody,ANA ELISA试剂盒 人抗载脂蛋白抗体A1(Apo A1)ELISA试剂盒 Human anti-apolipoprotein A1 antibody,Apo A1 ELISA试剂盒 人抗胰岛素受体抗体(AIRA)ELISA试剂盒 Human anti-insulin receptor antibody,AIRA ELISA试剂盒 人抗胃壁细胞抗体(AGPA/PCA)ELISA试剂盒 Human anti-gastric parietal cell antibody,AGPA/PCA ELISA试剂盒 人抗网硬蛋白抗体(ARA)ELISA试剂盒 Human anti-gastric parietal cell antibody,AGPA/PCA ELISA试剂盒 人抗网硬蛋白抗体(ARA)ELISA试剂盒 Human anti-Reticulin antibody,ARA ELISA试剂盒 人抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体(MCV)ELISA试剂盒 Human anti-mutated citrullinated vimentin antibody,MCV ELISA试剂盒 人抗髓磷脂抗体IgA(AMA IgA)ELISA试剂盒 Human anti-myelin antibody IgA,AMA IgA ELISA试剂盒 人抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体(MCV)ELISA试剂盒 Human anti-myelin antibody IgA,AMA IgA ELISA试剂盒 人抗髓磷脂抗体IgA(AMA IgA)ELISA试剂盒 Human anti-myelin antibody IgA,AMA IgA ELISA试剂盒 人抗腮腺管抗体(anti-parotid duct Ab)ELISA试剂盒 Human anti-parotid duct antibody ELISA试剂盒 人抗软骨抗体(anti-cartilage-Ab)ELISA试剂盒 Human anti-cartilage-antibody ELISA试剂盒 人抗人绒毛膜促性腺激素抗体(AhCGAb)ELISA试剂盒 Human anti-chorionic gonadotropin-antibody,AhCGAb ELISA试剂盒 人抗染色体抗体(anti-chromosome Ab)ELISA试剂盒 Human anti-chorionic gonadotropin-antibody,AhCGAb ELISA试剂盒 人抗脑组织抗体(ABAb)ELISA试剂盒 Human anti-brain tissue antibody,ABAb ELISA试剂盒 人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)ELISA试剂盒 Human anti-gliadin antibody,AGA ELISA试剂盒 人抗磷脂酰丝氨酸抗体(APSA)ELISA试剂盒 Human Anti-phosphatidyl serine antibody,APSA ELISA试剂盒 人抗磷壁酸抗体(TA)ELISA试剂盒 Human anti-teichoic acid antibody,TA ELISA试剂盒 人抗淋巴细胞毒抗体(ALA/LCA)ELISA试剂盒 Human anti-lymphocytotoxic antibody,ALA/LCA ELISA试剂盒 人抗巨噬细胞抗体(anti-macrophage Ab)ELISA试剂盒 Human anti-macrophage antibody ELISA试剂盒 人抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)ELISA试剂盒 Human anti-Thyroid-Peroxidase antibody,TPO-Ab ELISA试剂盒 人抗红细胞抗体(RBC)ELISA试剂盒 Human anti-red cell antibody ELISA试剂盒 人28S抗核糖体抗体(28S rRNP)ELISA试剂盒 Human 28S ribosome RNP antibody,28S rRNP ELISA试剂盒 人抗核仁抗体(ANA)ELISA试剂盒 Human anti-nucleolus antibody,ANA ELISA试剂盒 人抗核膜糖蛋白210抗体(gp210)ELISA试剂盒 Human Anti-glucoprotein 210,GP210 ELISA试剂盒 人抗肝细胞胞质1型抗体(LC1)ELISA试剂盒 Human anti-liver cytosolantibody type 1,LC1 ELISA试剂盒 人抗肺泡基底膜抗体(ABM-Ab)ELISA试剂盒 Human alveoli basement membrane zone antibody,ABM-Ab ELISA试剂盒 人抗胸腺细胞球蛋白(ATG)ELISA试剂盒 Human anti-thymocyte globulin,ATG ELISA试剂盒 人抗表皮细胞基底膜抗体(EBMZ)ELISA试剂盒 Human epidermal basement membrane zone,EBMZ ELISA试剂盒 人抗中性粒/中心体抗体(ACA)ELISA试剂盒 Human anti-centrol and centrosome antibody,ACA ELISA试剂盒

肿瘤免疫治疗的策略之一就是使免疫系统特异性靶向肿瘤细胞而不是正常细胞。而突变相关的新抗原（neoantigen）正是这样的靶标，肿瘤细胞中体细胞突变产生的序列改变的肽段被细胞处理，被主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）呈递至细胞表面，进而被T细胞识别，对肿瘤细胞进行杀伤。由于新抗原只在肿瘤细胞中存在，其成为肿瘤免疫治疗的热门靶标之一【1】。但是大部分肿瘤只有有限的肿瘤突变荷载并不能够产生新抗原相关的反应，同时只有5%的新抗原能被MHC分子提呈，而能激活有效的杀伤性T细胞的新抗原更少【2】。同时，肿瘤细胞中大部分的促癌因子和蛋白都是胞内蛋白，这也限制它们作为新抗原被人白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA, 人MHC分子）呈递作为肿瘤治疗的靶标【1】。神经母细胞瘤（Neuroblastoma）是儿童中常见的一种恶性肿瘤，其具有很少的肿瘤突变，相反其是由于转录调控网络表观遗传学上的失调而引起的【3】。在实体瘤，尤其是肿瘤突变荷载少的实体瘤中发现特异性以及免疫原性都较好的肿瘤免疫治疗新靶标，一直以来是肿瘤免疫治疗存在的挑战。2021年11月3日，来自美国宾夕法尼亚儿童医学院的John M. Maris团队在Nature上发表题为Cross-HLA targeting of intracellular oncoproteins with peptide-centric CARs的文章。团队分析神经母细胞瘤的免疫肽组，在HLA-A*24:02上发现来自神经母细胞瘤主要促癌转录因子PHOX2B的未突变肽段QYNPIRTTF具有很好的肿瘤特异性，以该肽为中心设计的CARs能识别多种不同HLA呈递的QYNPIRTTF，且在体外和小鼠模型中具有不错的效果。高度多态性的人白细胞抗原（HLA-A,-B,-C）基因编码的MHCI分子能够将来自于细胞内蛋白质组的一段8-14个氨基酸长度肽段提呈至细胞表面，这些肽段为免疫肽组（immunopeptidome），随后T细胞识别监视这些肽-MHC复合体（pMHC），发现来自于外来病原的抗原。研究团队假设肿瘤细胞的免疫肽组中存着在一部分来自于肿瘤发生必须的促癌因子的特异性的肽，针对这些肽便可设计出以肽为中心的嵌合抗原受体（peptide-centric CARs, PC-CARs）来特异性靶向肿瘤细胞。首先，研究团队对8个神经母细胞瘤细胞来源的异种移植物和病人来源的异种移植物（cell-derived xenografts (CDX), patient-derived xenografts PDX）进行免疫肽组的检测，通过MHC的捕获，肽段洗脱以及后续LC-MS/MS质谱等一共发现了7608个肽段。筛选这些肽段和HLA的结合力，筛选到2286个强亲和力的肽段。随后分析肿瘤组织和正常组织的RNA-Seq数据，研究团队筛选到61个肽段，其来源的母基因在肿瘤组织中高表达。最后研究团队分析正常组织中MHC肽组，进一步把可能在正常组织中提呈的肽段筛选掉。最后得到13个肽段，其来自于9个特异在神经母细胞瘤中表达的基因。同时研究团队在原代神经母细胞瘤中也进行同样的免疫肽组筛选，发现56个肽段。CDX和PDX筛选的13个肽有7个在原代肿瘤细胞中也被筛选到。随后，根据pMHC结合力，HLA等位基因频率，母基因表达情况以及神经母细胞瘤生物学信息对这些肽进行排序，6条分别来自来自CHRNA3, GFRA2, HMX1, IGFBPL1, PHOX2B 和TH的肽段被选择继续研究。分析不同发育时期的转录组学数据，研究团队发现PHOX2B只在胎儿发育过程中表达而在出生前的正常组织中PHOX2B完全被沉默。PHOX2B也是神经母细胞瘤发生的主要调控因子，PHOX2B的表达也是神经母细胞瘤诊断检测的手段之一。这表明，PHOX2B是神经母细胞瘤高度特异性的肿瘤抗原且是免疫治疗的理想靶标。由于自身抗原的免疫原性较弱，研究团队决定设计基于scFv-CARs而不是TCRs来靶向PHOX2B。随后研究团队筛选sc-Fvs库，寻找能结合PHOX2B肽的特异性克隆，并通过sCRAP算法预测排除其抗原交叉反应。研究团队筛选到10LH克隆并进一步研究，scFv 10LH和PHOX2B具有很强的亲和力，KD为13 nM，kd是 7.6 × 10-4 s-1。据此，研究团队设计出识别在HLA-A*24:02上提呈的PHOX2B 9氨基酸肽QYNPIRTTF的PC-CARs。发现PHOX2B 9氨基酸肽QYNPIRTTF也可被其他类型的HLA-A提呈，而10LH PC-CARs能打破传统的HLA限制和不同种类pMHC识别结合。随后在体外细胞模型以及体内PDX模型中证明了PHOX2B特异性的PC-CAR T细胞的跨HLA肿瘤杀伤能力。图1 肿瘤抗原的发现以及PC-CARs设计工作流程本文利用多种技术手段从非突变的促癌蛋白中发现神经母细胞瘤的肿瘤特异性抗原，并靶向这些肿瘤自身肽段设计出了PC-CARs，具有较好的肿瘤杀伤能力以及跨HLA的反应活性。该方法将非免疫原性的胞内促癌蛋白纳入到选择中，极大扩大了肿瘤免疫治疗的候选靶标，有助于神经母细胞瘤以及其他肿瘤的免疫疗法的发展。同时打破传统的HLA限制，也会扩大肿瘤免疫治疗的受益人群。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04061-6

p 　　近日，中国科学院深圳先进技术研究院博士周文华等在CRISPR等温扩增基因检测技术领域取得新进展。相关工作“A CRISPR-Cas9-triggered strand displacement amplification method for ultrasensitive DNA detection”(《一种应用于核酸超敏检测的CRISPR-Cas9链取代扩增技术》)发表于国际刊物《自然-通讯》(Nat. Commun. 2018, 9, 5012)。论文共同第一作者是周文华和研究助理胡丽，通讯作者是研究员喻学锋。 /p p 　　核酸分子检测已被广泛应用于精准医疗、食品安全检疫、公共安全监控等多个领域。尽管基于PCR(聚合酶链式反应)的核酸检测技术被广泛用于专业检测机构，但由于该技术操作复杂、仪器昂贵、以及涉及多重变温过程，并不适用于基层检测和家庭检测。为了克服PCR技术的缺点，一类不依赖变温的检测技术，即等温扩增检测技术得到广泛关注。然而，当前等温扩增技术在灵敏度、特异性和抗干扰度方面仍各自有着其内在缺陷，且成熟的等温扩增技术核心专利大多掌握在国外公司手中。因此，迫切需要开发出一种性能更优异，且具有完全自主知识产权的新的核酸等温扩增检测技术，以满足我国在核酸检测领域日益增长的需求。 /p p style=" text-indent: 2em " CRISPR/Cas9作为一种源自原核生物获得性免疫系统的基因定点编辑技术，自发现以来已吸引了大量科研关注和投资兴趣。然而，由于人体的复杂性和伦理方面的争议，基于CRISPR技术的临床基因治疗仍面临着诸多困难和挑战。另一方面，由于该技术操作简便、灵敏度高、抗干扰性强等优势，目前已开始在体外核酸分子的检测领域得到应用。但目前以CRISPR技术为基础的核酸检测手段仍依赖传统的PCR技术或等温扩增技术对靶分子进行扩增，其创新性和适用范围仍有待提高。 /p p 　　针对这些现状，喻学锋课题组创新性地提出利用CRISPR系统效应蛋白Cas9在与靶核酸分子结合过程中独特的构象变化，作为链取代等温扩增反应的开关，高效启动针对靶核酸分子的指数倍扩增(简称CRISDA技术)。相比于传统PCR和其他等温扩增技术，CRISDA技术有着诸多独特优势。第一，该技术灵敏度高。基于CRISPR技术良好的抗干扰性，该技术可在复杂背景条件下，对aM(10-18M)浓度的靶核酸分子进行高效扩增检测。第二，CRISDA技术特异性强。通过在机理上的特殊优化，该技术很好地规避了在传统CRISPR基因编辑技术中普遍存在的脱靶效应，可实现对极低浓度的靶核酸分子进行单核苷酸多态性(SNP)检测。第三，CRISDA技术普适性极强。在针对不同靶位点的检测反应中，所需的扩增引物设计简单、无需优化，可迅速实现对新位点的检测反应体系开发。除此之外，该技术检测过程完全等温，并且在从室温到42oC的范围内均保持良好的扩增检测效果，可充分满足在实际检测中对新靶点的检测需求。目前，课题组已利用该技术成功检测出人基因组中乳腺癌相关的单核苷酸位点突变，并在野生型大豆中成功检测出万分之三的转基因大豆。 /p p 　　同时，由于CRISDA技术所具有的独特优势和超越传统PCR技术的应用前景，以该技术为背景的“基于CRISPR-Cas系统的核酸高敏快速等温检测技术”项目在中科院首届“率先杯”未来技术创新大赛中，从数百个项目中脱颖而出，获得最终优胜奖，并已吸引了多家投资机构前来洽谈产业化事宜。目前，课题组正将该技术应用于突发或新型传染病的检测，如新型流感、非洲猪瘟等，并正积极开发相关检测试剂盒。 /p p 　　该研究工作得到国家自然科学基金、深圳市科技计划国际合作研究、中科院前沿科学研究重点计划、深圳科技研究计划、英国利华休姆信托基金和香港研究资助局面上项目等的资助。 /p p 　　 a href=" https://www.nature.com/articles/s41467-018-07324-5" target=" _self" strong 论文链接 /strong /a /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/0d23d2ca-6349-469c-8baf-47725333d3c4.jpg" title=" 111.png" alt=" 111.png" style=" text-align: center " / /p p style=" text-align: center " 图1: 传统PCR技术与CRISDA检测技术对比。 /p p style=" text-align: center " 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/d9f7eaaa-745e-48b5-b10a-1fee29f62f2d.jpg" title=" 222.png" alt=" 222.png" style=" text-align: center " / /p p style=" text-indent: 2em " 图2: 利用CRISDA技术对aM量级的靶分子进行特异性扩增检测。(a)扩增体系设计 和(b)利用CRISDA技术对合成的DNA片段进行特异性扩增检测。(c)利用CRISDA技术对来自人基因组的DNA片段进行特异性扩增检测。(d)利用CRISDA技术对人基因组的特定区域进行特异性扩增检测。 br/ /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/0f10d157-8779-46d8-8160-16cfad36b63c.jpg" title=" 333.png" alt=" 333.png" style=" text-align: center " / /p p 　　图3: 利用CRISDA技术对aM量级的靶分子进行SNP扩增检测。(a)不同细胞株基因组中rs3803662位点的测序验证 (b)利用CRISDA技术对该SNP位点进行高灵敏度扩增检测。 /p