犬肾细胞

大家好，我初次接触TEM准备看细胞的精细结构，完全没有经验，想做一个关于在细胞膜上看到5nm量子点，我看文献主要涉及到为了制备TEM样品，将裸露的的细胞固定在戊二醛（2.5％）溶液中。 然后将细胞样品用1％四氧化锇后固定。 用二甲胂酸盐缓冲液（0.1M）洗涤后，用一系列乙醇溶液（30,50,70,90和100％）使细胞脱水。 所有这些处理均在4℃下进行。 之后，将细胞用环氧丙烷处理，渗透并包埋在液体树脂中。 使用超薄切片机切割树脂块，并在网格上收集切片。 使用TEM和STEM模式在FEI Talos F200X高分辨率透射电子显微镜下进行成像。我目前能做到的就是用戊二醛溶液把细胞固定，其他试剂或者仪器暂时都没有，所以想联系老师是否可以帮忙测试。价格可以协商，手机号：15122625693

各位高手，我是tem的新手，我的细胞样品想攒到一起做，所以把不同时期的样品固定，我想求助各位高手，细胞样品戊二醛固定后能保存多久？保存条件是什么啊？谢谢

全光谱流式细胞仪原理，可以帮忙解答一下吗

胎盘亚全能干细胞定义： 　　亚全能干细胞自胚胎形成的第5到7天开始出现，能分化形成200 多种人体组织器官细胞，但不能形成一个完整的人体。胎盘亚全能干细胞是来源于新生儿胎盘组织的一族亚全能干细胞，其在发育阶段与胚胎干细胞接近，具备分化形成三个胚层的组织细胞的能力，但不会形成畸胎瘤。 　　胎盘亚全能干细胞的主要特性与功能： 　　胎盘亚全能干细胞是取自胎盘组织的一类亚全能干细胞，胎盘亚全能干细胞具有以下特性： 　　1. 具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为间充质干细胞，上皮干细胞、神经干细胞、肝干细胞，肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。可以用来修复受损或病变的组织器官，治疗心、脑血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病、骨组织病、角膜损伤、烧伤烫伤、肌病等多种疾病。 　　2.具有免疫调节作用，通过负性免疫调节功能，抑制机体亢进的免疫反应，使机体免疫功能恢复平衡，从而可以用来治疗造血干细胞移植之后的免疫排斥反应以及克隆氏病、红斑狼疮，硬皮病等自身免疫系统疾病。 　　3.胎盘亚全能干细胞定向培养的间充质干细胞是人体微环境的重要组成部分，移植间充质干细胞可以改变造血微环境，重建免疫系统，促进造血功能恢复，与造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等的治疗效果。 　　4.具有来源方便，细胞数量充足，易于分离、培养、扩增和纯化，传代扩增30多代后仍具有干细胞特性。 　　胎盘亚全能干细胞的用途： 　　胎盘作为理想的亚全能干细胞来源，在抗衰老及疾病治疗领域显示了其独特的功能，治疗疾病种类如下： 　　心脑血管系统疾病 　　糖尿病 　　肝肾损伤 　　脑及脊髓神经损伤 　　自身免疫性疾病 　　移植物抗宿主病 　　与造血干细胞共移植治疗血液病 　　缺血性血管病 　　肺及其它组织器官纤维化 　　抗衰老，恢复健康体态 　　胎盘亚全能干细胞的储存流程： 　　在新生儿娩出、胎盘剥离子宫排出后，由接生的医生尽快按照干细胞库胎盘标准采集规程进行胎盘的采集，然后放置在干细胞库特定的装置工具中，在限定时限内运送到干细胞库，由专业的技术人员进行亚全能干细胞的分离、提取、培养、检测等技术流程，直到根据最终检测结果来确认所获得的干细胞是否具有长期保存的价值。 　　保存和期限 　　目前国际上通用的干细胞保存技术是将获得的干细胞储存在-196℃深低温状态，医学研究与临床实践证明保存一百多年的细胞仍然具有活性。干细胞保存已有几十年的历史，胎盘干细胞库在与客户签订的合同期限内对干细胞库中所保管的胎盘亚全能干细胞活性负责。 　　安全性 　　胎盘的采集简便易行，不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。过去胎盘通常作为废物丢弃，而从胎盘中提取亚全能干细胞进行保存，是宝贵的生命资源再生。 　　而干细胞行业数据显示，胎盘亚全能干细胞基因稳定、不易突变，动物实验证明无致瘤性，使用安全可靠，对适应症范围疾病治疗效果好，优于传统医疗手段。 　　胎盘亚全能干细胞的优势 　　1.取材方便，原料来源充足，是生命资源的再生。 　　2.分化能力强可以定向诱导分化为间充质干细胞、血管干细胞、上皮干细胞、神经干细胞和肝干细胞等多种干细胞。 　　3.数量充足，使用方便，增殖能力强，培养后数目可达10亿，可以供多人多次使用。 　　4.在人群中使用不需要配型，不会产生免疫排斥反应，同时，血缘关系越亲近，生物利用度会越高，使用的效果越好。 　　5.治疗疾病范围广，抗衰老，恢复健康体态，心脑血管系统疾病，糖尿病，肝肾损伤，脑及脊髓神经损伤，自身免疫性疾病，移植物抗宿主病等多种疾病。

做cell biology实验，细胞铺板大概是最常见的一个实验了。但是有很多人不是很得要领，铺得不是均匀： 要么中间密周围稀，要么周围密中间秃顶。以下是我的一些技巧，希望可以帮助到大家。1. 一般96孔板我每孔是加100微升细胞悬液，从孔的左边靠近底部加入，加完半边板后，将未加的细胞悬液混一下再，继续加剩余的半边板子，都加完后盖上盖子，左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度（我一般轻巧敲三下），太强或次数太多会导致细胞集中成堆，将板顺时针旋转（逆时针效果不好），依次敲击剩余三个边，静置约5分钟，放入37度培养箱。 6孔板12孔板或24孔板，我均采用将第一个孔加入少量无血清培养基，晃动浸润整个孔底，然后用移液枪吸至第二孔，同样方法浸润孔底，其它孔一次类推，这样整个孔底都是湿润的，细胞悬液会平铺在整个孔底，加细胞悬液的时候可以避免加在中间中间细胞多，而加在周边晃匀后周边细胞多中间少的现象，细胞分散较均匀，注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下。这个方法就是有点慢，但操作熟练了也不慢。也可以采用轻拍的方式，但力度没有96孔板好掌握，效果没有96孔板好，所以我放弃改用浸润孔底的方法。2.细胞悬液加完后，将细胞培养板抬高，对着灯光，从底部往上看，看细胞有没有抱团。然后从底部敲击，使之分散。3. 如果实验室有平板振荡器的话，我建议用这个仪器稍振荡一下，效果不错，就是振幅小，频率高的那种。4. 细胞要尽量打散，大部分呈单个状态。离心后，要充分悬浮！还有转移到六孔板后，是要晃得！晃的时候最好不要让那个细胞液转圈，不然细胞就全被带到中间去了，就会不均匀！5. 一瓶细胞长满后，正常处理，在培养瓶里吹匀，然后铺6孔板，每孔2毫升，铺完之后不用观察直接用酒精棉擦拭，然后放到培养箱里，轻微的左三圈右三圈 前三圈 后三圈。基本上24小时之后观察 每孔的细胞都会很均匀。6.计算好所需要的全部液体量和细胞量，混匀后，加到六孔板里，六孔板按横8字型晃，显微镜下观察，如果不均匀，按上述方法再晃。如果细胞未计数直接种的话，在种六孔板的过程中，随时晃一下混匀用的瓶子，瓶子我通常是顺时针或逆时针转圈。7.放在水平板面上先上下移动，再左右移动，每个方向５到６次，但关键的是摇完后最好直接放入培养箱中，不要再做过多的运动，例如放到镜下去看，否则很容易就又聚到中间去了。

本人不是生物，医学出身，但现在博士期间的研究工作与生物医学相关，想学细胞培养技术，但课题组里没有师兄师姐可以请教，请问全国有没有哪个机构可以提供细胞培养的培训？ps：本人只了解过一些细胞培养的理论知识，从未进行过实际操作，希望培训能以实际操作为主。谢谢！

如果不小心，液氮罐可能会意外地掉进细胞中，对细胞造成严重损害。那么，当液氮罐掉进细胞时，我们该如何处理呢?　　1. 立即移除液氮罐　　当液氮罐掉进细胞中时，第一步是立即移除液氮罐。这可以通过使用钳子或其他合适的工具将液氮罐从细胞中取出。在这个过程中，需要注意不要进一步损伤细胞或污染实验环境。　　2. 冲洗细胞　　一旦液氮罐被移除，下一步是冲洗细胞。这可以通过将细胞置于含有适当缓冲剂的培养基中进行。缓冲剂可以帮助稀释液氮和减轻细胞受到的损害。同时，冲洗还有助于清除细胞表面的残留液氮。　　3. 检查细胞状态　　冲洗后，需要对细胞进行检查，以确定其状态。这可以通过使用显微镜观察细胞形态和结构来完成。如果细胞出现明显的损伤或死亡，那么可能需要重新开始实验或采取其他措施修复细胞。　　4. 细胞培养和恢复　　如果细胞没有受到严重损害，那么接下来的步骤是将细胞继续培养和恢复。这可以通过将细胞放入新的培养皿中，并提供适当的培养基和条件来完成。在此过程中，可以使用细胞培养技术和方法来促进细胞的生长和再生。　　5. 监测细胞恢复　　一旦细胞开始恢复，我们需要密切监测细胞的恢复情况。这可以通过定期观察细胞形态、增殖和功能来完成。如果发现细胞的恢复速度较慢或存在其他异常情况，可能需要调整培养条件或采取其他干预措施。　　总之，当液氮罐掉进细胞时，及时处理是至关重要的。通过立即移除液氮罐、冲洗细胞、检查细胞状态、细胞培养和恢复以及监测细胞恢复等步骤，我们可以最大程度地减少细胞受损并帮助其恢复。当然，在实验室操作中，预防措施也是非常重要的，包括正确使用液氮罐、操作时保持专注和谨慎等。只有这样，我们才能更好地保护细胞并确保实验的准确性和可靠性。　　预防措施　　在实验室工作中，事故的发生往往可以通过采取预防措施来避免。对于液氮罐掉进细胞的情况，以下是一些预防措施的建议：　　1. 储存和运输细胞时，确保液氮罐被正确放置并固定。使用适当的支架和保护装置可以降低液氮罐掉入细胞的风险。　　2. 在操作期间保持专注和谨慎。避免在操作液氮罐时分心或急躁，以免发生意外。　　3. 定期检查液氮罐的状态。确保液氮罐没有损坏或出现其他问题，以减少安全隐患。　　通过采取这些预防措施，可以降低液氮罐掉落细胞的风险，保护细胞和实验的安全。[url=http://www.mvecryoge.com/]金凤液氮罐[/url]　　应对不同情况　　[url=http://www.yedanguan365.com/]液氮罐[/url]掉进细胞的情况可能会有所不同，因此我们需要根据具体情况采取不同的应对策略。以下是一些常见的情况及相应的处理方法：　　1. 液氮罐只接触到细胞表面而未完全陷入细胞：在此情况下，可以尝试使用吸管或其他工具轻轻将液氮罐从细胞上移开，然后进行细胞冲洗和恢复。　　2. 液氮罐陷入细胞内部：在这种情况下，需要谨慎地将液氮罐从细胞中取出，以避免进一步损伤细胞。然后进行细胞冲洗和恢复。　　3. 细胞受到严重破坏或死亡：如果细胞受到严重损害或死亡，可能需要重新开始实验或采取其他措施来修复细胞。这可能包括使用新的细胞系或进行其他细胞培养操作。

如果要在液体环境下扫描细胞表面形貌，应该用哪种模式呢？对探针的参数又有哪些要求？我用的是NT-MDT的AFM和配套探针CSG10/NSG10，锥形针尖，刚度分别为0.2N/M和12N/M，细胞是贴壁的狗肾上皮细胞，但效果都不太好。接触模式下，探针把细胞推来推去，轻敲模式也差不多，感觉是不是探针没用对。如果给细胞加载的话，是不是球形探针比较好。

细胞在体外进行培养，失去了机体的调节和控制。因此，除满足营养的要求外，还必须使细胞生存环境尽量接近活体的环境。外环境的培养条件如温度、渗透压、酸碱度等均能影响细胞的生长。 一、温度 一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度是37~38℃。温度过高或过低都会影响到细胞的生长。细胞耐受低温的能力比抗热的能力强，在低温下，细胞的代谢活力及核分裂降低。温度不低于0℃时，虽影响细胞代谢，但并无伤害作用；把细胞置于25～35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度减缓；放在40℃数小时后，再置回37℃培养细胞仍能继续生长。但如果在40℃下暴露时间太长，对细胞生长不利，甚至变圆脱落于瓶壁。若温度过低，在降到冰点以下时，细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡。但若向培养液中加入甘油或二甲亚砜等保护剂，封入安瓿中后，置于液氮中，可起保护作用，此时细胞可耐受-70℃以下温度，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续生长增殖，细胞生物性状不受任何影响。此为保存细胞的主要手段。 高温对细胞培养不利。细胞在39～40℃培养1小时，能受到一定损伤，但仍有可能恢复，但不能忍受温度再升高2℃，持续数小时，即在41～42℃中培养1小时，细胞损伤严重，温度至43℃以上时细胞多数被杀死。高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏，核分裂的破坏，产生凝固酶使细胞发生凝固，另外使蛋白质变性。因此，体外培养细胞时一定要避免高温。 二、渗透压 细胞在高渗溶液或低渗溶液中，可以立即发生皱缩或肿胀、破裂。所以，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。哺乳动物和其他动物组织细胞体外培养的渗透压的维持主要与NaCl有关，但不能忽视其他电介质渗透压的关系。渗透压与单位体积溶媒内溶质的分子数和离子数成正比。为此，按一定比例控制培养液中离子平衡，维持正常渗透压是很重要的。这不仅是为了维持细胞张力，而且是为了调节细胞的代谢。因为细胞外离子输送和离子浓度改变着其他营养物质的输送(如氨基酸、蔗糖等)，直接影响细胞基本合成系统。 理想的渗透压因细胞的类型及种族而异，人血浆渗透压为290mmol/L，被视为是体外培养人类细胞的理想渗透压。哺乳类动物细胞的渗透压一般为290～300mmol/L。人胚肺成纤维细胞为250～325mmol/L，鼠则为310mmol/L左右。在实际应用中，260～320mmol/L的渗透压可适于大多数细胞。

液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、步骤：（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。（4）冷冻保存之细胞浓度：①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml②hybridoma:1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。③adherent tumor lines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。（6）冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4度时），复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。3、材料37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤：（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。（4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理：（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。3、步骤：（1）取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。5、范例：T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106存活率：225/243﹦92.6%

记者5月26日从南开大学获悉，该校物理科学学院田建国、刘智波研究组利用全内反射下石墨烯对介质折射率异常敏感的光学现象，实现了超灵敏单细胞实时流动传感。这一成果可以使癌细胞在形成之初即被精确“光测”出来，将为癌症预防提供一条新途径。 石墨烯是一种呈蜂巢状排列的单层碳原子结构，是目前已知的最薄、最坚硬的纳米材料。在全内反射这种特殊的结构下，对于介质折射率异常灵敏是石墨烯材料的重要特性之一。田建国、刘智波领导的研究组发现，折射率的灵敏度与石墨烯的层数有极大关系，并且层数有一个最优值。他们通过与南开大学化学学院陈永胜课题组合作，不断控制石墨烯的层数，最终制出厚度为8个纳米的石墨烯材料，其折射率的灵敏度和分辨率达到目前国际上最高水平。 在此基础上，课题组结合微流体技术和病变细胞的折射率差异，将这一超高的折射率灵敏度成功应用于单细胞传感。记者在实验室看到，实验人员将制备出的8纳米厚石墨烯均匀铺于一块三棱镜的一面，紧贴石墨烯上方建有一条细胞通道。实验时，一束光从棱镜一面射入，穿透石墨烯照射在细胞通道上，反射光从棱镜另一面射出。实验人员通过光电转化，即可得到一份波形图。如果细胞通道中存在癌细胞，则波形图上将会呈现出明显的波峰。即使数千个正常细胞中有一个发生了病变，这种“光测”方法都可以将其准确识别出来。 该课题组论文已在国际纳米科学技术领域权威刊物《Nano Letters》上发表，美国著名的纳米技术与纳米科学网进行了同步报道。

用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。 一、白细胞的分离 （一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。 本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 （二）聚合物加速沉淀法 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。

一、原理细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞 计数法等，这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞 如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377590583.jpg二、仪器、用品与试剂1. 仪器、用品：同常规细胞培养2. 试剂：BrdU(1.0 mg/ml)，甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液三、操作步骤1. 细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10 μg/ml。2. 44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1 μg。3. 48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。4. 常规染色体制片。5. 染色体玻片置56 ℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6 cm处紫外照射30分钟。6. 弃去2×SSC液，流水冲洗。7. Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。8. 镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。9. 计算：细胞 周期(Tc)=48/(小时)附：（1）BrdU配制: BrdU 10 mg十双蒸水10ml 4 ℃下避光保存。（2）2×SSC配制: NaCl 1.75克，柠檬酸三钠，2H2O 0.88克，加水至100 ml，4 ℃保存。

为规范和指导人源干细胞产品的非临床研究与评价，在国家药品监督管理局的部署下，药审中心组织制定了《人源干细胞产品非临床研究技术指导原则》（见附件）。根据《国家药监局综合司关于印发药品技术指导原则发布程序的通知》（药监综药管〔2020〕9号）要求，经国家药品监督管理局审查同意，现予发布，自发布之日起施行。特此通告。附件：人源干细胞产品非临床研究技术指导原则国家药监局药审中心2024年1月12日[img=image.png]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/a610bf49-b82c-4320-873c-6c1274fee8d6.jpg[/img][img=image.png]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/ccf3627b-39a8-486c-bf29-43f6161c0e82.jpg[/img][来源：仪器信息网] 未经授权不得转载[align=right][/align]

1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度http://www.39kf.com/Txt2Img/ju.png此法适用于动物内脏组织、植物肉质http://www.39kf.com/Txt2Img/named.png子等。　　2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机http://www.39kf.com/Txt2Img/iuy87612.png高，适用于量少和动物脏器组织。　　3、超声波处理法：用http://www.39kf.com/Txt2Img/2008-9-13.png定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法http://www.39kf.com/Txt2Img/kmmn675.png适用于微生物材料，用http://www.39kf.com/Txt2Img/datu.png肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。　　4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。　　5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果http://www.39kf.com/Txt2Img/877667jkdkk.png好。　　　　无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使http://www.39kf.com/Txt2Img/jsdh766289sdmkxu.png些条件都要适合于目的物质的提取。

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）最常见且严重的微血管病变之一，常伴有肾小球硬化和肾小管间质纤维化，最终可发展为终末期肾脏病（ESRD），严重危及生命。西医治疗DN主要以降糖、降压、调脂、抗感染为主，但这些手段仍难以阻止炎症反应与肾纤维化的发生，且存在一定的局限性及不良反应，因此，探寻行之有效的DN防治策略，提高治疗水平迫在眉睫［1-3］。中医药根据辨证分型对DN进行治疗已有上千年的历史，对其记载可追溯至《黄帝内经》之“消瘅”及“消渴病”继发的“虚劳、水肿、尿浊、关格、肾劳”等，可通过调节代谢、自噬、抗氧化、抗炎、抗纤维化等机制，对DN进行多靶点调控治疗。在改善DN客观指标、保护肾功能及远期疗效方面，中医药都显示出了独特的优势［4-5］。 黄芪六一汤始载于《太平惠民和剂局方》，由黄芪60 g、甘草10 g组成，具有大补肺气、滋益肾水、调和脾胃的功效［6］。课题组前期发现［7-11］，由黄芪六一汤提取、分离出来的黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖、甘草酸所组成的黄芪六一汤组分（简称“HQD”）具有防治DN、显著改善肾功能的作用。并鉴定出HQD中6个主要原型入血成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、甘草酸）。然而，HQD作为中药复杂化学成分的混合体，其在体内发挥抗DN药效的分子作用机制尚不完全明确，制约了其深层次开发利用。 网络药理学能高效整合中药、成分和靶点之间关系，构建中药-成分-靶点网络，诠释药物与疾病之间的复杂关系，为中药及其复方作用机制研究提供了行之有效的新方法［12-13］。故本实验首先采用网络药理学技术对HQD抗DN的机制进行探索，发现HQD发挥药理作用可能与细胞自噬缺陷有关。据报道［14-15］，自噬缺陷可导致肾小管上皮细胞的损伤，而激活自噬能够减轻这一损伤从而保护肾功能。根据药效学及网络药理学实验结果，推测HQD发挥抗糖尿病肾病的作用机制可能和肾小管上皮细胞自噬水平失调有关，为验证推测结果，本研究从细胞自噬角度出发，采用DN大鼠模型对筛选出的核心通路进行验证，以期为黄芪六一汤及中药复方的分子作用机制研究及深层次开发提供创新思路与借鉴。 1　材料 1.1　仪器 EnVision酶标仪（PerkinElmer）；H1-16KR台式高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；Rayto全自动生化分析仪（Chemray 800）；Tissuelyser-24L多样品组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；三诺血糖仪（长沙三诺生物传感技术有限公司）；Multiskan FC酶标仪（Thermo Scientific）；免染蛋白印迹系统（ChemiDooTM）、蛋白快速转印仪（Trans-Blot Turbo）、胶凝成像系统（GBOXChemiXL1.4）均购自美国Bio-rad公司；电泳仪（PowerPacBasic）、核酸蛋白紫外检测仪（Biomate 3S）、垂直电泳槽，均购自美国Thermo公司；纯水超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；透射电子显微镜（日本电子JEOL）生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；台式高速微量离心机（大龙兴创实验仪器北京股份）；超薄切片机（LEICA）；组织脱水机（LEICA）。 1.2　试药 黄芪（批号220604、211104、220901，四川盛世锦荣药业有限公司）、甘草（批号201024、200306、220805，四川盛世锦荣药业有限公司），黄芪、甘草经贵州中医药大学谢军丽讲师鉴定分别为豆科植物膜荚黄芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.干燥根和根茎。细胞凋亡检测试剂盒（货号E-CK-A322，Elabscience），DAPI（货号C1002，上海碧云天生物技术有限公司），抗荧光淬灭封片剂（货号0100-01，southernbiotech），苏木素（货号H9627，Sigma）；二甲苯（货号10023418）、包埋石蜡（货号69019361）、伊红Y（水溶性，货号71014544）、中性树胶（货号10004160）均购于中国医药集团有限公司；肌酐（Scr，货号C074-d）、尿素氮（BUN，货号C010-a）、总胆固醇（TC，货号C048-a）、三酰甘油（TG，货号C019-a）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C，货号C047-a）检测试剂盒均购于长春汇力生物科技有限公司；尿蛋白测试试剂盒（货号C035-2，南京建成生物工程研究所），RIPA裂解液、PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒、1xTBST 缓冲液、5x蛋白上样缓冲液、β-actin 兔多克隆抗体（货号AC230205001）均购于武汉塞维尔生物科技有限公司；mTOR（货号66888-1-lg）、Beclin 1（货号66665-1-lg）、p-mTOR（货号66882-1-lg）、HRP标记的羊抗鼠 IgG（货号SA00001-2）、HRP标记的羊抗兔 IgG（货号20000373）鼠单克隆抗体均购于武汉Proteintech有限公司；LC3α/β（货号R10241506）、PI3K（货号N09263380）、Akt（货号M04201652）兔多克隆抗体购于沈阳万类生物科技有限公司，链脲佐菌素（STZ，索莱宝生物有限公司，批号2230520002）。 根据本课题组前期确定的HQD制备工艺［10］，按照原处方黄芪与甘草6∶1比例，取符合药典标准的黄芪饮片12 kg和甘草饮片2 kg，制备得质量分数为72.04%的黄芪总皂苷干浸膏76.02 g（含黄芪甲苷2.69%）；质量分数为70.03 %的黄芪总黄酮干浸膏31.64 g（含毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.72%、毛蕊异黄酮1.52%、芒柄花苷0.94%、芒柄花素0.31%）；质量分数为67.12%的黄芪总多糖干浸膏185.04 g，质量分数为80.05%的甘草酸精制品22.01 g。将上述制备所得黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖干浸膏与甘草酸精制品全部混合均匀，即得本实验所需HQD样品。 1.3　实验动物 SPF级雄性SD大鼠35只，体质量（300.00±10.82）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（湘）2022-0011，饲养于通风良好，室温18～25 ℃，相对湿度50%～70%，按常规定期消毒的动物房。按每笼4只分装，由专人饲养管理，自由饮水及饲料，实验操作和处理严格遵循国际准则。 2　方法 2.1　HQD抗DN的药效实验 2.1.1 　DN模型大鼠的制备 大鼠适应性喂养1周后，选取8只作为对照组，对照组大鼠喂食普通饲料。其余大鼠高糖高脂饲料喂养2周，尾iv STZ（溶于pH 4.5，0.01 molL-1无菌柠檬酸钠缓冲液）33 mgkg-1，注射4周后测定空腹血糖（FBG）及24 h尿蛋白（24 h U-Alb）含量，以FBG≥11.1 mmolL-1［16-17］，肾组织出现病变为造模成功。其中，24只大鼠造模成功，3只血糖低于11.1 mmolL-1，无死亡大鼠。 2.1.2　分组及给药 将造模成功大鼠随机分为模型组，HQD高、低剂量给药组，每组8只。以黄芪六一汤临床生药用量（黄芪60 g、甘草10 g）的4倍、1倍剂量，换算本实验的HQD高剂量（0.66 gkg-1）与低剂量（0.17 gkg-1）。按照给药剂量，每日固定时间ig 1次，对照组与模型组ig等量的0.9%氯化钠溶液，连续给药8周。 2.1.3　各组大鼠相关生化指标检测 实验期间观察各组大鼠活动情况、精神状态、毛色、进食、饮水量及排泄量状况等。末次给药后，代谢笼收集24 h尿液并记录尿量（禁食不禁水），1 400 rmin-1离心5 min，收集上清。尾静脉采血测FBG，于腹主动脉取血，4 ℃下3 000 rmin-1离心15 min，收集上清。取血后断颈处死各组大鼠，取肾脏，除去被膜，部分肾组织用于病理学、细胞凋亡等检测，其余组织于-20 ℃保存备用。采用全自动生化分析仪，检测血清Scr、BUN、TG、TC、LDL-C水平。按照尿蛋白定量测试盒说明书操作测定尿总蛋白。 2.1.4　肾脏组织病理学观察 取上述部分肾脏置于4%多聚甲醛中固定，蒸馏水冲洗，将组织包裹在石蜡块中，组织脱水，浸蜡、包埋、切片、烤片、切片脱蜡，HE染色、Masson染色，封片，光镜下观察肾脏组织病理学改变。 2.1.5　TUNEL检测细胞凋亡情况 取肾组织石蜡切片进行脱蜡、水化，以蛋白酶K工作液在25℃下消化组织15 min，PBS漂洗，按照说明书对切片进行TUNEL染色，荧光显微镜下观察采集图像，计算细胞凋亡率。 2.1.6　数据统计分析 所有数据以±s表示，统计分析采用SPSS 27单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 2.2　网络药理学研究 2.2.1　活性成分靶点预测 以HQD中6个主要原型入血成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、甘草酸）为研究对象。采用PubChem数据库 （https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载活性成分的SDF格式，将其导入SwissTargetPrediction 数据库（http：//swisstargetprediction.ch/）进行活性成分的靶点预测。剔除重复靶点，获取与6个活性成分相关的靶点。通过UniProt数据库 （https：//www.uniprot.org/）将得到的活性成分靶点蛋白名称进行标准化。 2.2.2　DN的靶点预测 通过GeneCard（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（https：//www. disgenet.org/）和OMIM（https：//omim.org/）数据库以“Diabetic nephropathy”为关键词进行检索，剔除重复得到疾病靶点，并用Venny工具将6个活性成分的作用靶点与DN靶点进行交集比对，得到其共同作用的靶点作为6个活性成分治疗DN的潜在靶点。 2.2.3　蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 为了进一步明确HQD治疗DN预测靶点之间的直接或间接调控关系，将潜在靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/）中构建PPI网络，限定物种为“Homo sapiens”，为了具有高置信度，设置minimum required interaction score≥0.9，并隐藏游离蛋白，以TSV格式保存结果，将其导入可视化的Cytoscape 3.6.0软件进行拓扑分析，筛选得到核心靶点。 2.2.4　基因本体（GO）注释及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将交集靶点导入Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html），进行GO功能富集分析；将交集靶点导入KOBAS 3.0数据库（http：//kobas.cbi. pku.edu. cn/ kobas3/genelist/），进行KEGG通路富集分析。下载分析结果，将其分别按P值和“Count”（每条通路中含有的潜在基因靶点的数量）值的大小进行排序。 2.3　实验验证网络药理学预测结果 2.3.1　透射电镜观察肾小管上皮细胞中自噬体及自噬溶酶体的形成 取“2.1.3项”下对照组、模型组、HQD高剂量给药组大鼠部分肾组织约1 cm3，经3%戊二醛预固定24 h左右，1%四氧化锇再固定2 h；依次加入30%、50%、70%、80%、95%、100%的丙酮溶液进行逐级脱水，每次20 min；脱水后，采用丙酮和Epon812包埋剂对其进行渗透和包埋；采用超薄切片机制备60～90 nm的超薄切片；并以醋酸铀避光染色10～15 min，再用柠檬酸铅避二氧化碳染色1～10 min，超纯水清洗3次，滤纸吸干、室温干燥过夜后，采用JEM-1400FLASH透射电镜对各组肾组织中的肾小管上皮细胞外形及其中的自噬体及自噬溶酶体进行观察。 2.3.2 Western blotting检测肾脏组织中自噬相关蛋白及磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信号通路关键蛋白的表达 随机从对照组、模型组、HQD高剂量给药组选取3只大鼠的肾组织，加入含蛋白酶和磷酸化酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上匀浆，裂解1 h后，12 000 rmin-1离心10 min，收集上清液；BCA法测定总蛋白浓度。每孔以20 μg蛋白上样，100 V电泳，100 V湿转；5%的脱脂牛奶封闭2 h，加入Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，显色曝光。扫描胶片，分析胶片灰度值。考察HQD对肾组织中Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、PI3K、Akt、mTOR及p-mTOR蛋白表达的影响。 3　结果 3.1　HQD抗DN的药效实验 3.1.1　各组大鼠相关生化指标检测 结果见图1。对照组大鼠精神状态良好，饮食、饮水与大小便正常，皮毛有光泽，体质量逐渐增加。模型组大鼠呈明显的多饮、多尿、多食、体质量下降等糖尿病“三多一少”症状，后期出现不同程度的体毛暗淡、稀疏、精神萎靡，反应迟钝症状。与对照组比较，模型组大鼠FBG、Scr、BUN、TG、TC、LDL-C、24 h U-Alb显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，HQD高剂量组均能显著降低上述药效指标（P＜0.05、0.01）；低剂量组FBG、Scr、BUN、TG、24 h U-Alb显著降低（P＜0.05、0.01）。 3.1.2　肾脏组织病理学观察 HE染色结果显示，细胞核呈蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。对照组肾小球结构清晰，肾小球系膜区未见明显改变。模型组大鼠肾小球系膜基质增宽、增多，基底膜弥漫增厚，肾小囊腔狭窄，肾小球体积增大。HQD给药组大鼠肾小球系膜轻度增生，肾组织损伤情况较模型组明显减轻，见图2。 Masson染色结果显示，胶原纤维、黏液、软骨呈蓝色，肌肉、胞浆、纤维素、红细胞呈红色，胞核呈蓝黑色。主要用于区分肌纤维和胶原纤维。与模型组相比，HQD给药组大鼠的肾纤维化程度较轻，见图3。 3.1.3　TUNEL检测细胞凋亡情况 荧光显微镜下组织切片上凋亡的细胞呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。每个样品选取3个高倍视野（400倍），每个高倍视野计数各视野总细胞数，同时计数各视野的凋亡阳性细胞。结果见图4。与对照组比较，模型组细胞凋亡率明显上升（P＜0.01）；而HQD高、低剂量组细胞凋亡率显著下降（P＜0.05）。 3.2　网络药理学研究 3.2.1　潜在靶点 通过检索SwissTargetPrediction得到各个活性成分所对应的靶点基因共600个，去掉重复的244个，剩余356个靶点。通过GeneCard、DisGeNET和OMIM 数据库共获得1 480个与DN相关的靶点，通过制作韦恩图分析，得到114个药物-疾病共同靶点作为活性成分治疗DN的潜在靶点，见图5。 3.2.2　潜在靶点的PPI网络分析 为了获得有关潜在靶点交互作用的信息，将114个潜在靶点上传到STRING平台，进行PPI网络分析，结果见图6。并将结果的TSV文件导入Cytoscape 3.6.0 进行可视化和拓扑分析，PPI网络包括102个节点和451条边，选择“度”（degree）、“介数中心性”（betweenness centrality）和“接近中心性”（closeness centrality）高于中位数的靶点作为关键目标，首次筛选值为degree＞6，betweenness centrality＞0.003 836 8，closeness centrality＞0.413 800 8，筛选后，获得了一个包含41个节点和258条边的新网络；随后筛选值为degree＞10，betweenness centrality＞0.007 837 44，closeness centrality＞0.571 428 57，获得包含19个节点和107条边的中心网络；为了在PPI网络中找到最关键的目标，最后一次筛选值为degree＞11，betweenness cenTrality＞0.014 000 41，closeness centrality＞0.72，筛选获得STAT3、EGFR、VEGFA、JUN、TNF、AKT1、CASP3、mTOR及IL2作为PPI网络中的核心靶点，见图7。其中，mTOR是调节自噬的关键激酶，抑制mTOR可促进自噬。 3.2.3　GO分析和KEGG分析 将114个交集靶点导入Metascape平台进行GO富集分析，共获得 1 581条结果，包含1 388条生物过程（BP）结果，122条分子功能（MF）结果，71条细胞组成（CC）结果，分别选取显著丰富的前15个结果进行可视化处理，见图8。BP主要对激素的反应、MAPK级联调节、细胞对氮化合物的反应、细胞对有机氮化合物的反应和蛋白质磷酸化的正调控等；CC主要涉及膜筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）、细胞外基质（extracellular matrix）、膜面（side of membrane）和囊泡腔（vesicle lumen）等；MF主要涉及激酶结合（kinase binding）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）、激酶活性（kinase activity）、内肽酶活性（endopeptidase activity）和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）等。表明HQD治疗DN的机制涉及多种生物学过程，体现多重治疗作用。 使用KOBAS3.0共检索到235条富集通路，选取P＜0.001的结果，获得147条显著富集通路，并按“Count” 值由高到低排列，选取前20条通路作为核心通路进行展示，见图9。显示6个成分治疗DN的靶点主要涉及癌症通路、癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等信号通路，其中PI3K-Akt信号通路、MAPK通路均与自噬调控相关。与上述“3.2.2 ”项下PPI网络分析得出的“HQD核心作用靶点”进行联合分析后，选择对自噬经典通路PI3K/Akt/mTOR进行验证。 3.3　实验验证 3.3.1　透射电镜观察肾小管上皮细胞中自噬体及自噬溶酶体的形成 结果见图10。检测自噬的金标准是电镜下可观察到结构完整的自噬体及自噬溶媒体。采用透射电镜观察对照组、模型组、HQD高剂量组大鼠肾小管上皮细胞中自噬体及自噬溶酶体的数量。结果显示，对照组肾小管上皮细胞形态结构较正常；细胞核呈椭圆形或类圆形，核仁明显；线粒体呈圆形、椭圆形或长梭形，嵴排列较紧密，胞浆中可见大量溶酶体、自噬溶酶体和空泡。模型组肾小管上皮细胞形态结构出现明显异常。细胞核呈类圆形或椭圆形，核仁明显；线粒体发生肿胀，仅可见少量残留嵴结构，基质颗粒大量丢失；胞浆中自噬溶酶体数量较对照组明显降低。HQD高剂量组肾小管上皮细胞形态结构轻度异常。细胞核呈类椭圆形或类圆形，核仁明显；部分线粒体轻度肿胀，嵴溶解断裂，基质颗粒减少；胞浆中自噬溶酶体及自噬小体数量较模型组有所增加，溶酶体与自噬小体融合较好。 3.3.2　Western blotting检测肾脏组织中自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ及PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白的表达 结果见图11。与对照组比，模型组PI3K、Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平显著升高；Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比，HQD高剂量给药组PI3K、Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平显著降低；Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。 4　讨论 自噬是真核细胞的一种自我保护机制，也是细胞内蛋白质降解的主要途径之一。自噬活性正常时，细胞能够及时降解自噬小体内包裹的受损细胞器、侵入的病原体及衰老的蛋白质等，以维持细胞稳态、能量生成及细胞器的更新［19-20］。研究表明［21-23］，DN发生时，肾脏存在显著的自噬失调。自噬缺陷可导致肾小管上皮细胞的损伤，激活自噬能够减轻这一损伤从而保护肾功能。恢复自噬活性可能成为保护肾脏免受高糖损伤的一种新的治疗选择，有望成为防治DN的新靶点。 课题组前期已鉴定出HQD中6个主要原型入血成分（黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、甘草酸）。文献报道［24-28］，黄芪甲苷可通过激活AMPK/eNOS信号通路，改善大鼠糖尿病肾损伤；毛蕊异黄酮葡萄糖苷具有保护血管内皮细胞的作用，能延缓DN患者的血管病变；毛蕊异黄酮能通过调节NF-κB/p65/NLRP3/TXNIP炎症小体信号通路延缓DN的发展；芒柄花素可通过调节Sirt1/PGC-1α通路减轻DN大鼠的肾小管及线粒体损伤；芒柄花苷能通过降低氧化应激和炎症标志物减轻链脲佐菌素诱导的DN大鼠模型的肾损伤；甘草酸能通过调节SNARK/AMPK信号通路保护高糖诱导的肾小球足细胞损伤。然而， HQD在体内发挥抗DN药效作用的分子机制尚不完全明确，限制了其深层次研究。网络药理学能基于中药多靶点效应，从生物信息学上整体分析在HQD治疗DN上所涉及的靶点及信号通路。故本实验以HQD中6个主要原型入血成分为研究对象，采用网络药理学方法对HQD作用靶点及信号通路进行预测，并将114个潜在靶点进行了PPI分析，发现HQD可能主要作用于STAT3、EGFR、VEGFA、JUN、TNF、AKT1、CASP3、mTOR及IL2等核心靶点。其中，mTOR是调控自噬的重要因子。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白酶，是磷脂酰肌醇3激酶的相关激酶（PIKK），mTOR复合体是调节细胞自噬的关键分子之一，可作为多条信号通路的中间环节参与细胞自噬调节过程，并影响自噬标志性蛋白LC3的表达。mTOR可与其他调控蛋白相互作用至少形成两个不同的复合物，分别是mTOR复合物1（mTORC1）和复合物2（mTORC2）。虽然这两个复合物含有相同的催化亚基——TOR，但均可磷酸化不同的下游靶点，从而显示出不同的细胞功能。抑制mTOR可促进自噬，响胰岛素抵抗和炎性反应［29-30］。因此，调控mTOR不同的上游信号通路可能是治疗DN的一个新思路。 KEGG通路功能富集分析显示，HQD可能通过作用于癌症通路、癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、MAPK等信号通路发挥药理作用。其中PI3K/Akt/mTOR通路为自噬调控的经典通路，通路活化后可激活mTORC1抑制细胞自噬过程［31］。据报道［32］，Beclin-1、LC3蛋白参与自噬小体的形成与自噬溶酶体降解过程，是经典的自噬标志物。自噬小体的减少会导致Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平降低，而激活Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ表达可诱导细胞发生自噬。故本项目选择对经典自噬调控通路PI3K/Akt/mTOR进行验证，并进一步考察HQD对自噬标志蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的调节作用。Western blotting结果表明，HQD可以上调肾组织自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达，抑制PI3K/Akt通路活化，抑制mTOR的激活；透射电镜观察显示，HQD可以增加肾小管上皮细胞自噬体及自噬溶酶体数量。研究结

细胞自噬是机体一种重要的防御和保护机制。但是这种自噬“信号”如何传递给细胞从而使其“执行”自噬过程，则一直是科学界的难题。近期，我校生命科学学院林圣彩教授课题组成功找到高等动物细胞在生长因子缺失条件下，启动自噬的部分“密码”，从而在细胞自噬机制研究方面取得重大突破。　　4月27日，最新一期的美国《科学》杂志以研究文章的形式刊发了这项研究成果，并配发专门评述。这也是近三年来，我校生命科学学院第二篇发表在这一世界顶级学术刊物上的论文。2009年6月，该院韩家淮教授的一篇有关细胞选择死亡方式机制的研究文章曾“登上”该杂志。　　所谓自噬，是指细胞消化自身蛋白质或细胞内的结构（细胞器）的一种自食现象。通过这种现象，细胞可以降解、消除和消化受损、变性、衰老和失去功能的细胞器和变性蛋白质等生物大分子，为细胞的生存和修复提供必须的能量。　　科学家们认为，自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样，是一种十分重要的生物学现象。有关实验表明，包括肥胖症、糖尿病、神经退行性疾病、免疫失调及癌症在内的人类许多重大疾病的发生都与该过程的异常有关。为此，自噬也是当前生命科学中最热门的研究领域之一。　　据林圣彩介绍，对自噬进行分子机制的研究始于上世纪90年代的以单细胞生物酿酒酵母为模型的研究，目前，一系列构成单细胞生物自噬核心机器的基因已被发现并命名。　　然而，对自噬在多细胞生物特别是哺乳动物中的调控机制的研究，科学界至今仍在不断探索中。摆在科学家面前的一个根源性的问题是：在多细胞生物中，诱导自噬的各种信号是如何被传递到细胞内自噬“核心机器”从而启动自噬过程的？　　研究表明，与单细胞生物不同，在多细胞生物内，外界营养元素要依赖于生长因子的调控才能被转运到细胞内。一旦细胞外的生长因子匮乏，细胞便能启动自噬以维持能量平衡。那么，生长因子缺失这一信号又是如何“传达”的呢？　　这也成为长期致力于细胞信号转导研究的林圣彩教授课题组近年来的研究目标之一。经过多年研究，课题组终于成功“**”这一自噬启动“密码”——即通过一种名为GSK3的激酶活性增高后磷酸化并随之激活乙酰转移酶TIP60，进而导致自噬核心机器中的蛋白激酶ULK1的乙酰化水平增强而启动细胞自噬。简言之，这一发现揭示了多细胞生物在生长因子缺失条件下的细胞自噬过程的新的介导分子及其通路。　　林圣彩认为，弄清楚了细胞内到底有哪些蛋白分子“参与”了自噬和它们如何串联在一起，将有益于科学界从“源头”上认识相关疾病，并为这些疾病的诊断和治疗提供新的靶点。

白细胞与红细胞在此重新定向。白细胞（WBC）和红细胞（RBC）是血液中的重要组成部分，在生命体延续发展和生物治疗中具有不同的功能。红细胞，又称红血球，含有一种蛋白质称作血红蛋白。当血红蛋白从肺部吸收氧气时，血液呈红色。随着血液流经全身，血红蛋白向人体组织释放氧气。红细胞的生命周期为4个月，其形如圆盘，中间下凹，边缘较厚，呈圆饼状。白细胞，又称白血球，具有更加复杂的功能。白细胞构成了人体抵抗感染的一种防御机制。有多种不同类型的白细胞，其生命周期和功能各不相同。白细胞还能够产生一种特殊的蛋白质，称作抗体，能够识别并吞噬入侵人体的外来异物。 红细胞白细胞物理特征红细胞呈双凹圆盘状，无核。尺寸大约为6-8 μm。白细胞呈不规则性，但有一个核和外缓冲层。生命周期120天。几天，但在健康人体中可存活数天至数年不等。类型：血液中只有一种红细胞在血液中存在许多类型的白细胞，其功能各不相同：嗜中性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞（巨噬细胞）、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。循环系统：心血管系统。心血管和淋巴系统总计红细胞700:1白细胞男性每立方毫米460-6200万个；女性每立方毫米4200-5400万个。每立方毫米4000 – 11000个功能：向身体的不同部位提供氧气，并负责运送二氧化碳和其它废物。产生抗体，对感染形成免疫力，有些具有噬菌功能。血液中含量：

组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。　　　　实体组织材料的细胞分离方法　　　　对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。　　　　(一)机械分散法　　　　所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的实验室试剂软组织。　　　　(二)消化分离法　　　　组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。　　　　1、酶消化分离法　　　　酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：　　　　(1)胰蛋白酶分散技术　　　　胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用人血清 AB的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。　　　　①细胞类型胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效，但若与胶原酶合用,就能增加其对组织的分离作用。　　　　②酶的活力市售的胰蛋白酶,其活力都经过测定而有效，但配制时必须新鲜，需保存在低温冰箱中，消化时的pH和温度都要适宜，否则会影响活力，细胞的分散直接与酶的活力有关，最终使用活力为1:200或1:250，56℃pH8.0时活力最强。　　　　该酶为粉剂，保藏时要防潮，室内温度不宜过高，保存时间不能太长，若粉剂结团块,说明该部分受潮或失效。　　　　③酶的浓度胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。　　　　④温度一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为37℃，通常在37℃进行消化比室温作用快。　　　　⑤pHpH8~pH9是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时PH只能选用7.6～8.0之间，否则对细胞有损伤。　　　　⑥无机盐离子若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。　　　　⑦消化时间如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为20分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于4℃过夜也可。　　　　分离方法如下：　　　　①过夜冷消化将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。　　　　②多次提取消化法多次提取消化法有以下三种：　　　　热消化多次提取将剪碎的细胞块加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。　　　　冷消化多次提取方法同上，只是消化温度为4℃。　　　　先热消化后冷消化将组织块先用胰蛋白酶于37℃下消化20分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。　　　　(2)胶原酶(Collagenase)消化法　　　　胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。细胞培养此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。　　　　经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。　　　　鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间(小时)有差异，以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶(对细胞表面糖基有作用)，采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。　　　　除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年来，还有一种从灰霉菌中提取的Pronase新酶分散细胞更佳。　　　　2、非酶消化法(EDTA消化法)　　　　EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用(1:1或2:1)，不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。　　　　消化分离法的操作步骤：　　　　(1)剪切把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。　　　　(2)加液漂洗将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2-3次(采用倾斜，自然沉降法)。　　　　(3)消化加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次)，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。　　　　(4)弃去消化液采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。　　　　(5)漂洗将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。　　　　(6)机械分散采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。

我们公司明年准备进行全血质控的研发，我负责资料的收集！想问问大家一般全血质控物的生产一般都需要些什么仪器啊？生产过程中需要分离血细胞，出了离心机外还需要添购什么仪器呢？另外弱弱的请教个问题：有没有什么仪器能将不同体积大小的血细胞分别分离呢？例如我分离出红细胞，我想再分离出体积大小为某一范围的红细胞，有这样的仪器吗？这样可行吗？谢谢！谢谢大家！[em0706]

骨髓间充质干细胞总结 2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为详实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。一、骨髓间充质干细胞的分离 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。1. 直接培养法（全骨髓培养法） 1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法，得到了广泛的应用。culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：（1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞（2）原代培养24 h,48 h各换液一次（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来。（4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。（5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。（6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48 h~72 h后首次换液，一般7~10天可传代。天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6 w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48 h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。2. 密度梯度离心法 裴雪涛等用比重为1.073 g/ml的percoll分离（400 g×20 min）人骨髓MSCs，取界面处细胞层，离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种，72 h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每3 d换液一次。细胞长到80％汇合时1：1传代。菊花与刀利用PERCOLL密度1.073分离大鼠MSC 时，用2400 rpm×20 mins后可见中间有一层约1～2 mm厚的白色层，仔细用吸管吸取这一层再用PBS离心2遍即可加培养基和胎牛血清培养即rMSCs。周进明等利用密度为1.082的percoll分离小鼠MSCs，500g×30min离心后，取中间的单个核细胞层，PBS洗两次，接种于IMDM培养基，1 d后换液，去掉非贴壁细胞，以后每3-4天换液。jetter用过FICOLL,FERCOLL,上海二分厂的淋巴细胞分离液分离MSC细胞效果都不错，当然所获细胞群的纯度不一，Percoll最纯，而上海二分厂的淋巴细胞分离液所获细胞群的传代能力优秀（35 PASSAGE）。本版的部分园友认为MSC贴壁培养得到的细胞不均一，但是多能分化能力和增殖力好，percoll分离得到的细胞较为均一，多能分化性和增殖力不如贴壁培养的，尤其是增殖力相差很远，有人添加bFGF或/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力。二、骨髓间充质干细胞的培养 天之饺子认为，间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs获得或失去这些表面标记物的表达。三、骨髓间充质干细胞的特性 体外培养的MSC体积小，成梭形，核浆比大。不表达分化相关的细胞标志，如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶或Osteopontin；也不表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白，这群细胞特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95％和98％。MSC联系传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能，而且保持正常的核型核端粒酶活性，但不易自发分化，在体外特定的诱导条件下，MSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。四、其他相关内容 Jiang将从成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分离的间充质干细胞（CD45－TER119－）命名为多潜能成年祖细胞，他们证明，MAPC高表达端粒酶，而且随着细胞的扩增，端粒的长度不变，单个MAPC来源的细胞群不仅能在体外向3个胚层的细胞分化，而且能在体内能够向各种组织细胞分化，相比较而言，形态与MSC相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。参考文献 生理学报2003.55（2）：153－159 人骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑内的迁移及分化中华放射医学与防护杂志.2002,22(3).-167-169 培养小鼠骨髓间充质干细胞及其移植后在体内的定位分布Exp Biol Med Vol. 226:507 520, 2001 Mesenchymal Stem CellsNATURE |VOL 418 | 4 JULY 2002 Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow干细胞生物学 裴雪涛 主编

[color=#c00000][i]同济大学附属东方医院再生医学研究所何志颖研究员表示：项目研究从2018年开始，2021年4月Pre-IND，2024年1月18日IND获批！历时6年艰辛。[b]这是东方医院首个干细胞成药临床试验项目，希望能造福于心衰患者！[/b][/i][/color]据报道1月18日，天士力公告其一款创新干细胞药物获得国家药监局批准进入临床试验，主治慢性心力衰竭。公告称，公司收到国家药监局核准签发关于[b]人脐带间充质干细胞注射液（B2278注射液）[/b]项目的《药物临床试验批准通知书》，同意开展伴冠状动脉旁路移植术指征的慢性缺血性心肌病导致的慢性心力衰竭的临床试验。[b]人脐带间充质干细胞注射液[b]（B2278注射液）[/b]由上海市东方医院（同济大学附属东方医院）研发，2022年8月天士力与东方医院签署《技术转让（合作）合同》受让相关技术及成果，并在全球范围内，优先在中国开展药品注册申报及后续临床试验开发。[/b]临床前研究证明，B2278注射液可通过旁分泌作用调控心肌组织微环境，对于缺血性心肌病中的心肌细胞组织损伤有明显抑制作用，增加动物心功能，促进血管再生，减少心肌凋亡。心力衰竭是由于心脏结构和/或功能异常导致心室充盈和/或射血能力受损的一组临床综合征，是大部分心血管疾病发展的最终阶段，随着年龄增长，心衰患病率和发病率均明显增加。目前对于心力衰竭的治疗主要包括药物治疗、血运重建、细胞和基因治疗，其中冠状动脉旁路移植术（CABG）是常用的血运重建治疗方式，《2022年中国心血管外科手术和体外循环数据白皮书》显示，2022年CABG占心外科手术总量21.1%。上述治疗手段可以在一定程度上延缓心力衰竭的进展，但不能使死亡心肌再生。伴随CABG手术的心肌局部注射干细胞有望通过刺激心脏细胞的增殖和分化、抑制心肌细胞损伤及免疫调节等作用，修复心肌细胞使心肌收缩增强从而对心力衰竭发挥治疗作用。目前国际上获批的干细胞品种已达十余种，但是尚无治疗心衰的干细胞产品上市。[来源：仪器信息网] 未经授权不得转载[align=right][/align]

[b][b][font=&][size=18px]会议咨询：[font=inherit]顾成刚13621995193（微信同号）[/font][/size][/font][/b][font=&][size=18px][color=#404040]2022深圳细胞产业大会[/color][/size][size=18px][color=#404040]第九届（深圳）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛[/color][/size][size=18px][color=#404040]2022年8月深圳 11月 武汉[/color][/size][/font][font=&][size=18px]深圳会议时间：2022年8月21-22日[size=16px][/size][/size][/font][font=&][size=18px][size=16px]深圳会议地点：深圳湾万丽酒店（深圳市南山区科技南路18号）[/size][/size][/font][font=&][size=18px][size=16px][/size][/size][size=18px][color=#404040][/color][/size][size=18px][color=#404040]同期举办：[/color][/size][size=18px][color=#404040]细胞与基因治疗前沿技术应用峰会 外泌体技术转化与疾病研讨会[/color][/size][size=18px][color=#404040]单细胞多组学研究与临床应用峰会 3D细胞培养与类器官临床应用峰会[/color][/size][/font][color=#404040]细胞外囊泡前沿与转化峰会[/color][color=#404040][img]https://img-user-qn.hudongba.com/upload/_oss/userarticleimg/202207/28/31658988346866_article3_1579.png?image/auto-orient,1/quality,q_80[/img][/color][color=#404040]招展联系人：顾先生13621995193（微信Wechat）[/color][size=14px][color=#404040]大会概况：[/color][color=#404040]2022细胞产业大会 2022第九届（深圳）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛将于8月在深圳举办，本次峰会紧密围绕政策规范、监管、工艺与产业化进展、细胞与基因治疗、外泌体临床研究与疾病治疗、外泌体临床检验与肿瘤免疫治疗、细胞外囊泡领域的机制研究、体外诊断及疾病治疗、单细胞多组学、单细胞测序、3D细胞培养与类器官、溶瘤病毒药物的开发与产业转化、干细胞临床前研究与临床应用转化、干细胞存储与治疗、肿瘤免疫治疗、通用型CAR-T细胞治疗、基因治疗及溶瘤病毒、实体瘤治疗及药物开发、临床研究与治疗进展等话题，特邀来自国家药品审评监管机构、科研院所、医疗机构、创新药企、生物治疗、生物技术和服务企业、产业链上下游企业、产业园区、投资机构、行业协会等多位权威专家与产业先锋进行分享交流及产品展示。组委会竭诚搭建优质对话合作平台，诚邀您八月深圳相聚，共襄盛会！[/color][color=#404040]近年来，现代生命科学与生物技术取得了一系列重要进展和重大突破，尤其是以干细胞、免疫细胞为核心的细胞治疗技术更是迅猛发展，在多种难治性疾病的临床研究上获得了许多成绩，在未来展现出了巨大的应用前景细胞治疗受到前所未有的重视，国家和地方层面也密集出台相关政策，支持干细胞、免疫细胞研究的发展。[/color][color=#404040]2009年单细胞测序技术强势问世，发展至今，单细胞测序技术已经在肿瘤、临床诊断、免疫学、微生物学、神经科学等领域占有重要的应用地位，是目前研究和应用的点。研究范围也不再只是基因组、转录组学，而扩展到了表观基因组、空间转录组学、代谢组、免疫组、蛋白组谱系。这些“多组学”技术允许研究人员更仔细地观察细胞之间的异质性，更清楚地识别特定细胞及其功能。[/color][color=#404040]细胞与基因治疗改变了人类治疗遗传疾病和疑难杂症的方式，并正在撬动整个制药生态圈。在各种适应症需求的推动下，细胞与基因治疗快速发展，多种细胞免疫疗法、干细胞疗法、基于腺相关病毒及慢病毒载体的基因疗法相继问世，为复发难治性肿瘤及严重的基因遗传缺陷类疾病提供了重要的治疗选择。随着CAR-T免疫细胞疗法在国际以及国内获批上市，细胞和基因疗法进入了全新的赛道，整个行业进入了技术突破和产业化的快速演进。[/color][color=#404040]2022细胞产业大会 2022第九届（深圳）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛将于8月在深圳举办，本次峰会紧密围绕政策规范、监管、工艺与产业化进展、干细胞临床前研究与临床应用转化、干细胞存储与治疗、肿瘤免疫治疗、细胞与基因治疗、通用型CAR-T细胞治疗、单细胞多组学、单细胞测序、细胞外囊泡分离及检测、3D细胞培养与类器官、基因治疗及溶瘤病毒、实体瘤治疗及药物开发、临床研究与治疗进展等话题，特邀来自国家药品审评监管机构、科研院所、医疗机构、创新药企、生物治疗、生物技术和服务企业、产业链上下游企业、产业园区、投资机构、行业协会等多位权威专家与产业先锋进行分享交流及产品展示。组委会竭诚搭建优质对话合作平台，诚邀您八月深圳相聚，共襄盛会！[/color][color=#404040]专题会议[/color][color=#404040]1、干细胞临床研究与转化应用峰会[/color][color=#404040]干细胞临床前研究与转化应用[/color][color=#404040]干细胞临床前研究与临床应用转化[/color][color=#404040]干细胞治疗技术与临床研究[/color][color=#404040]干细胞与免疫细胞临床研究的制剂质量评价[/color][color=#404040]干细胞治疗质量控制管理的现状与未来[/color][color=#404040]干细胞与类器官研究[/color][color=#404040]干细胞外泌体的应用[/color][color=#404040]干细胞与再生医学[/color][color=#404040]间充质干细胞外囊泡治疗难治性疾病[/color][color=#404040]新型干细胞治疗新冠肺炎[/color][color=#404040]2、肿瘤免疫治疗产业转化领袖峰会[/color][color=#404040]细胞免疫治疗研发突破与商业化进程[/color][color=#404040]通用型CAR-T细胞免疫治疗[/color][color=#404040]细胞免疫治疗质量控制&产业化[/color][color=#404040]细胞治疗药物研发与商业化生产[/color][color=#404040]细胞治疗产品开发与工艺优化[/color][color=#404040]TIL细胞在实体瘤治疗中的技术挑战与发展趋势[/color][color=#404040]iPSC来源的CAR先天性免疫细胞及其在肿瘤免疫细胞治疗中的应用[/color][color=#404040]细胞外囊泡的多组学研究[/color][color=#404040]细胞外囊泡RNA组分解析及其应用[/color][color=#404040]外泌体技术的开发与临床转化[/color][color=#404040]3、单细胞多组学研究与临床应用峰会[/color][color=#404040]单细胞多组学研究与临床应用[/color][color=#404040]单细胞转录组技术致力于大脑发育及神经干细胞调控的研究[/color][color=#404040]单细胞多组学科学创新前沿及最新技术[/color][color=#404040]单细胞空间组学的开发与应用进展[/color][color=#404040]单细胞技术助力精准医学研究[/color][color=#404040]单细胞组学研究技术在肿瘤免疫与个性化治疗中的应用[/color][color=#404040]单细胞技术在肿瘤微环境及肿瘤细胞异质性探究中的应用[/color][color=#404040]单细胞测序结合多组学技术的应用[/color][color=#404040]4、细胞与基因治疗前沿技术应用峰会[/color][color=#404040]细胞及基因治疗的临床研究与产业转化[/color][color=#404040]细胞与基因治疗的国内外最新研究进展[/color][color=#404040]细胞与基因治疗CDMO[/color][color=#404040]基因治疗及溶瘤病毒产品的开发[/color][color=#404040]AAV基因治疗药物大规模生产工艺研究及成本控制[/color][color=#404040]基因治疗GMP病毒载体规模化生产[/color][color=#404040]基因工程化外泌体用于肿瘤靶向治疗的研究[/color][color=#404040]溶瘤病毒及RNA疗法[/color][color=#404040]5、3D细胞培养与类器官临床应用峰会[/color][color=#404040]3D细胞培养与类器官前沿进展[/color][color=#404040]3D类器官培养技术发展及其应用[/color][color=#404040]类器官基础研究与技术开发[/color][color=#404040]类器官临床医学研究与应用[/color][color=#404040]类器官药物筛选与生物制造[/color][color=#404040]类器官技术的科研应用和临床转化[/color][color=#404040]类器官在肿瘤精准医学研究中的应用[/color][color=#404040]类器官在伴随诊断和新药研发中的应用和进展[/color][color=#404040]微流控器官芯片在精准医疗及药物研发中的应用[/color][color=#404040]* 最终议程以现场为准，发言企业可自行命题[/color][color=#404040]更多嘉宾邀约中，欢迎各单位推荐自荐！[/color][color=#404040]* 最终以现场为准[/color][color=#404040]谁将参与[/color][color=#404040]全国各大医院的院长、医院管理者、肿瘤内科、肿瘤外科、生物治疗科、血液科、病理科、辅助生殖科、检验科等各科室主任医师、副主任医师、主治医生及从相关领域研究的专家、科研人员、医药企业等；[/color][color=#404040]科研院所、生物医药企业、技术服务代理商及投资机构、临床医生等；[/color][color=#404040]知名高校的教授、研究员、副研究员及生命科学专业、药学专业、医学专业、免疫学专业等；[/color][color=#404040]细胞及肿瘤抗体免疫治疗上游供应商、诊断试剂及设备服务商、技术与设备仪器提供商、IT大数据解决方案提供商等；[/color][color=#404040]基因治疗、基因编辑、基因测序、基因检测公司、生物技术公司研发人员等技术人员、研发总监等；[/color][color=#404040]精准医疗方面的机构、企业、细胞存储与治疗上、中、下游产业链的企业以及CRO、CMO等；[/color][color=#404040]CEO及药厂研发负责人：抗体免疫治疗药物研发、免疫细胞治疗及制品开发、溶瘤病毒、治疗性疫苗、小分子免疫治疗药物、细胞治疗与再生医学领域的专家、临床研究人员、从业医师、研究生以及细胞治疗与再生医学领域的医疗用品科研人员与厂商等；[/color][color=#404040]政府机构与代表、产业园区、招商局、投资孵化机构、咨询与培训机构、银行、律师、知识产权、证券公司等。[/color][/size][size=14px][color=#404040][img=2021.9嘉宾集竖版.jpg,1047,1177]https://img-user-qn.hudongba.com/upload/_oss/uePasteUpload/202206/2315/1655968748942_2757.jpg?image/auto-orient,1/quality,q_80[/img][/color][/size][size=14px][color=#404040]2021细胞产业大会 2021第六届（上海）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛伴随着为期两天的会议和三天的展览于4月25日在上海展览中心（上海市静安区延安中路1000号）落下帷幕！本次大会集聚60+行业大咖到场分享精彩演讲，现场参观参会人数高达1800多人，共有100多家优质展商和60多家行业媒体列席，呈现出一场学术与产业紧密交融的盛宴。细胞产业大会成熟的“会议+展览”的模式得到了参会嘉宾、参展企业及参会代表的一致好评！[/color][/size][size=14px][color=#404040][img=2021.4嘉宾集竖版.jpg,1047,1266]https://img-user-qn.hudongba.com/upload/_oss/uePasteUpload/202206/2315/1655968747557_2756.jpg?image/auto-orient,1/quality,q_80[/img][/color][/size][size=14px][color=#404040]2021细胞产业大会 2021第七届（深圳）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛/2021基因与精准诊疗（深圳）高峰论坛/2021肿瘤精准诊疗（深圳）论坛伴随着为期两天的会议和展览于10月27日在深圳会展中心落下帷幕！疫情特殊时期，本次大会采用了“线上（约12万人观看）+线下（600多人参加）”相结合的方式同步进行的，专家们以专业的视角分享行业动态，以战略的眼光探讨产业发展，共商细胞治疗、基因治疗及肿瘤精准诊疗的未来发展之路！[/color][color=#404040]活动预告[/color][color=#404040]2022细胞产业大会[/color][color=#404040]2022第九届（深圳）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛[/color][color=#404040]时间：2022年8月[/color][color=#404040]地点：深圳[/color][color=#404040]2022细胞产业大会[/color][color=#404040]2022第十届（武汉）细胞与肿瘤精准医疗高峰论坛[/color][color=#404040]时间：2022年11月[/color][color=#404040]地点：武汉[/color][color=#404040]展位及论坛赞助[/color][color=#404040]赞助商及演讲收费标准：[/color][color=#404040]套餐一：2个开放式展位+40分钟演讲+大会电子版会刊封三+资料入袋 RMB 100,000[/color][color=#404040]套餐二：1个开放式展位+30分钟演讲+大会电子版会刊彩页1P RMB 50,000[/color][color=#404040]套餐三：1个开放式展位+20分钟演讲+大会电子版会刊彩页1P RMB 40,000[/color][color=#404040]套餐四：20分钟演讲 RMB 20,000[/color][color=#404040]套餐六：1个开放式展位 RMB 22,800[/color][color=#404040]套餐七：光地展位每平方米 RMB 2,000[/color][color=#404040]听众参会代表收费标准：[/color][color=#404040]2022年8月1日前注册RMB 1,000/人，8月1日后注册RMB 1,200/人（深圳） [/color][color=#404040]2022年11月1日前注册RMB 1,000/人；11月1日后注册RMB 1,200/人（武汉） [/color][color=#404040]团体注册：3人以上可享受9折优惠（深圳、武汉两地均享此政策）[/color][color=#404040]费用包含：会议资料、大会入场资格、授权老师的PPT、午餐、茶歇等。[/color][color=#404040]上海顺展展览服务有限公司[/color][color=#404040]联系人：顾先生13621995193（微信Wechat）[/color][color=#404040]邮箱：[/color][/size][size=14px][color=#404040][email]2498299886@qq.com[/email][/color][/size][size=14px][color=#404040]地址：上海市松江区沪松公路1221号星晨大厦801室[/color][/size][size=14px][color=#404040][img]https://img-user-qn.hudongba.com/upload/_oss/userarticleimg/202207/28/11658988287538_article1_1574.png?image/auto-orient,1/quality,q_80[/img][/color][/size][/b]

http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/201203/2012030911450761.jpg细胞S-腺苷甲硫氨酸成像图，随着每个时间点蛋氨酸（右下）的增加，荧光强度也增高通过基因工程技术使得细胞表达一种经修饰（改造）过的RNA，又称Spinach，研究人员能对活细胞中的小分子代谢物进行成像，并观察它们随时间变化是如何改变的。每个细胞新陈代谢都会产生代谢产物。假如能得知产物生成效率的话，就能辨识如癌症状态下细胞代谢的异常或确定药物能否将细胞的代谢状况恢复到正常状态。康奈尔大学威尔医学院的研究人员说发表在3月9日的《科学》杂志上的相关论文详细描述了这种先进的技术方法，这一技术将有可能彻底颠覆以往对代谢组学的认识，提供数千种细胞内代谢产物的动态变化的化学指纹图谱。威尔康乃尔医学院药理学副教授Samie R. Jaffrey博士说：“动态观察到代谢产物的变化将为我们提供新的和强大的武器，方便我们了解代谢在疾病状态下是如何改变的，并帮助我们找到可以将它们恢复到正常水平的方法”。Jaffrey博士领导威尔康乃尔的其他三名研究人员共同完成了这项研究。他说：“细胞的代谢水平调控着细胞诸多功能，也正因为如此，代谢水平的变化可以是细胞内在特定的时间内发生什么变化的写照”。例如生物学家都知道，肿瘤细胞存在代谢异常，这些细胞对葡萄糖能源的利用存在异常并产生独特的代谢产物如乳酸，从而有不一样的新陈代谢过程。Jaffrey博士说：“能够看到这些代谢异常的话，就可以了解癌症的发生发展。但是到现在为止，测量活细胞中代谢产物一直非常困难。Jaffrey博士和他的团队展开的科学研究表明：可以用特定的RNA序列来检测细胞中代谢产物的水平。这些RNAs是基于能在细胞发出绿色光的Spinach RNA设计的。Jaffrey博士研究小组修改Spinach的RNAs，使得它们一旦遇到它们专属绑定的代谢物时就关闭，造成Spinach荧光开启。他们设计出了RNA序列以追踪细胞中五个不同代谢产物包括二磷酸腺苷、细胞能量分子ATP和参与调节基因活性的甲基化过程的SAM（S-腺苷蛋氨酸）水平的变化。他说：“在此之前，一直没有人能够实时观察到细胞中代谢产物水平是如何变化的”。Jaffrey博士说：“在活细胞中运用RNA传感器，研究人员能够测量单个细胞中的目标代谢产物水平随着时间的变化而发生的改变，你可以看到这些代谢物如何响应信号刺激或遗传变化进而发生动态变化的。你可以筛选出能使得这些基因异常发生正常化的药物，我们的一个主要目标是确定药物是否能使细胞的新陈代谢正常化。新技术克服了现行的用绿色荧光蛋白（GFP）标记活细胞以充当传感器的缺点。如果将绿色荧光蛋白和其他发光蛋白质融合到能结合某种代谢物产物的自然存在的蛋白质中的话，绿色荧光蛋白和其他发光蛋白质就可以用来充当代谢感应器。但在某些情况下，代谢产物与自然存在的蛋白质结合方式会扭转蛋白质结构，进而影响已经融入到这些蛋白质中的荧光蛋白。另外，对于大多数的代谢产物，并没有可用来融合绿色荧光蛋白以制造传感器的蛋白质。通过使用RNA作为代谢物传感器，这个问题引刃而解了。Jaffrey博士说：“关于RNA令人惊奇的是，你可以得到基本上你想要结合任何一种小分子代谢物的RNA序列。他们可以在几个星期就能生产出来”。然后，这些人造序列融合到Spinach中，并在细胞中以单链RNA的形式表达。Jaffrey博士说：“这种做法能让你得到任何你想研究的小分子代谢物，以及这些小分子代谢物在细胞内的情况”，他和他的同事们将这一技术的运用范围扩大到能检测活细胞内的蛋白质和其他分子。他补充说道：该技术可应用于多种疾病研究中。Jaffrey博士说：“我们非常有兴趣研究导致发育障碍如自闭症的大脑神经细胞内的代谢如何是变化的，有很多的机会能让这一新的工具发挥用处”。这篇研究论文的合著者包括威尔康乃尔医学院药理系Jeremy S. Paige博士、Thinh Nguyen Duc博士、Wenjiao Song博士。这项研究由美国国立卫生研究院的生物医学成像和生物研究所以及McKnight基金会资助。康奈尔科技企业和商业中心（CCTEC）已经代表康奈尔大学提出了这项技术的专利保护申请。Samie Jaffrey博士是Lucerna技术的创始人和科学顾问，并持有该公司股权。此外，Lucerna技术拥有上述描述技术的相关许可证。

细胞冻存是长期保存、运输和共享生物材料的重要手段，对于各种生物医学研究领域具有重要的作用。然而，不同的细胞冻存方法可能会影响细胞的质量和存活率。本文将探讨不同厂家提供的细胞冻存方法，并分析它们对细胞质量的影响。　　厂家差异及其对细胞质量的影响　　目前，市面上有许多细胞冻存试剂盒供应商，其中一些主要的厂家包括Thermo Fisher Scientific、Sigma-Aldrich、Qiagen和Promega等。这些厂家提供的细胞冻存试剂盒都有其独特的优点和缺点。　　以细胞存活率为例，Thermo Fisher Scientific公司提供的CryoStor冻存剂的细胞存活率达到了98.5%，而Sigma-Aldrich公司提供的CryoSure-DMSO冻存剂的细胞存活率仅为85%。这表明，不同厂家提供的细胞冻存试剂盒对细胞存活率的影响存在差异。　　此外，不同的冻存方法也可能影响细胞的质量。例如，在使用Thermo Fisher Scientific公司的CryoStor 冻存剂时，冷冻速率、先冷冻后复温的步骤和使用的液氮均对细胞的冻存质量产生影响。另外，Sigma-Aldrich公司的CryoSure-DMSO冻存剂需要在冷冻过程中将细胞悬浮于冻存剂中，并使用20%的DMSO作为保护剂，以确保细胞质量。　　因此，选择细胞冻存试剂盒时，需要注意不同厂家提供的细胞冻存试剂盒的差异，以及冷冻的方法是否适合特定类型的细胞。 关注：[url=http://www.yedanguan365.com/]液氮罐[/url] [url=http://www.mvecryoge.com/]金凤液氮罐[/url] [url=http://www.mvecryo.com/]mve液氮罐[/url]

在日前举行的第二次中国科协论坛“2009年中国干细胞研究高层战略研讨会”上，同济大学校长裴刚这样评价近10年来，国家对干细胞投入得到的回报，并没有白花钱。对于关注我国科研成果和科技进步的人来说，这句话对科研投入来说，应该是一个再好不过的答案。　　文章、实验室、重大项目、人才队伍，这些往往是衡量某项学科的科研水平在国际上所处位置的重要指标。从1999年12月，干细胞研究被评为世界十大科学研究之首，到今年，我国的干细胞研究已经走过了整整10年的历程。　　按照裴刚的统计，生命科学是国家重点支持的领域之一，支持的重大项目比例很高，在国际上发表文章的数量接近10%。我国干细胞领域实验室数量大约是50个，有超过一半的人员和经费用于干细胞研究，这50个实验室均在国际顶级杂志上发表过两篇以上的干细胞研究论文。裴刚说：“中国和美国的实验室数量跟中国和美国发表文章的数量比，还是好一些，我告诉大家我们没白花钱。”　　干细胞研究的重要性不言而喻。如果说21世纪是生物学的世纪，那么生物学中最前沿、最热门的一个研究领域应当是干细胞的研究。“干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞。”因为干细胞的这种特性，所以对很多疾病，如神经退行性疾病、各种血液干细胞疾病等都有很重要的治疗意义。然而，干细胞的来源却一直是难以解决的问题。　　在这个聚集了南开大学校长饶子和，北京大学生命科学学院教授、长江学者特聘教授邓宏魁，中国科学院动物研究所所长孟安明等20多位学者的研讨会上，加快建设大动物实验平台成为多位专家的共识。中国研究干细胞的动物模型，不能仅停留在小鼠等小动物上，今后要举全国之力试验大动物——猪、猴子干细胞。由于大动物在生物学的许多方面和人类更为相近，所以在临床应用上更加关键。从小动物模型到大动物模型，再到临床应用，这是一个发展的过程。中国科学院动物研究所研究员、国家杰出青年科学基金获得者周琪在讨论时说：“无论是技术研究还是产业化应用，建立大动物实验基地、建立中国特色的模式动物都是十分必要的，这是我们进行干细胞研究的基础。”　　抓住人才、机制创新，似乎每一个学科在谈到发展战略时，都要说这样的两点，干细胞领域亦不例外。对于国家实验室的模式，专家们也有着更高的期许：开放性的招聘，长期稳定的择优支持，国有评估，开放流动。如何把国家的需求、科研水平的提升、人才的培养和投入经费以及科研机制更好地融合，最终达到发展科技的目的，这并不是一件容易的事情，也是每个科研领域应该深入解决的问题。希望等到下一个十年，回顾干细胞领域的研究成果时，“我们没白花钱”这句话，能以更高的国际地位得到诠释。

[b]　　细胞储存液氮罐有哪些常见问题?[/b]　　1. 液氮泄漏：由于液氮的低温特性，液氮罐可能会发生泄漏。泄漏会导致液氮罐内的温度上升，从而影响细胞样品的保存质量。　　2. 结霜过多：在液氮罐内频繁开启和关闭时，可能会导致罐壁结霜过多，影响细胞样品的保存效果。　　3. 罐口密封不严：如果细胞储存液氮罐的罐口密封不严，空气和水分可能会进入罐内，影响细胞样品的保存质量。　　4. 细胞样品冻结：如果液氮罐内的温度过低或未能均匀冷却，细胞样品可能会被过度冻结，导致细胞死亡或质量下降。[b]　　如何解决细胞储存液氮罐常见问题?[/b]　　1. 液氮泄漏：定期检查液氮罐的密封性能，确保无泄漏现象发生。如果发现泄漏，需要及时修复或更换受损部件。　　2. 结霜过多：减少频繁开启和关闭液氮罐的次数，避免罐壁结霜过多。若结霜现象已经发生，可以使用专门工具清除结霜，保证罐壁干燥。　　3. 罐口密封不严：定期检查罐口密封圈的状态，确保其完好无损。如有损坏，及时更换密封圈，确保罐口密封性良好。　　4. 细胞样品冻结：在存放细胞样品前，先将液氮罐内的温度均匀冷却至适宜的范围。此外，可以根据细胞样品的特点，选择合适的冷冻液进行保存，以降低细胞冻结的风险。[url=http://www.mvecryoge.com/]金凤液氮罐[/url]　　[b]其他需要注意的事项[/b]　　1. 定期检查液氮罐的液位：液氮罐内的液位应保持在适当范围内，避免过高或过低。定期检查液位，并根据需要添加或排除液氮。　　2. 正确使用细胞冻存管：选择质量好的细胞冻存管，确保其密封性良好，以防止细胞样品受到空气和水分的污染。　　3. 定期清理液氮罐：定期清理液氮罐内的污垢和杂质，保持罐内干净整洁。清理时应注意安全，避免直接接触液氮和使用有害化学物质。　　4. 避免频繁开启和关闭液氮罐：频繁开启和关闭液氮罐会导致温度变化，影响细胞样品的保存效果。因此，在使用过程中应尽量减少开启和关闭液氮罐的次数。　　细胞储存液氮罐是保存细胞样品的重要设备，但在使用过程中常会遇到一些问题。通过定期检查液氮罐的密封性能、控制结霜、保证罐口密封性和正确保存细胞样品，可以有效解决液氮泄漏、结霜过多、罐口密封不严和细胞样品冻结等常见问题。此外，定期检查液位、正确使用细胞冻存管、定期清理液氮罐和避免频繁开启和关闭液氮罐也是需要注意的事项。只有正确使用和维护细胞储存液氮罐，才能保证细胞样品的长期保存质量和稳定性。

各国争相发展的重点项目　　iPS技术，即诱导性多能干细胞技术，是一种将成体成熟、分化的体细胞重编程获得类似胚胎干细胞的新兴技术。2007年11月美国和日本科学家分别独立宣布可将人类皮肤细胞转化为iPS细胞。这一发现被《自然》和《科学》杂志分别评为2007年第一和第二大科学进展。之后，iPS细胞研究迅猛发展，不同的国家和实验室纷纷报道了多种方法建立的iPS细胞系。就连世界第一只体细胞克隆动物多利羊的培育者伊恩·威尔莫特也宣布放弃人类胚胎干细胞克隆研究，转而进行 iPS 细胞研究，因为他认为这种细胞比胚胎干细胞更具潜在优势。　　我国连续多年将干细胞研究列入“863”、“973”、国家自然基金重点项目。国务院2006年发布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年）》中，干细胞作为五项生物技术之一成为未来15年我国前沿技术的重点研究领域。　　致瘤风险浮出水面　　Yamanaka研究组在《自然·生物技术》上发表的文章显示，用iPS细胞诱导的神经干细胞，即使不含c-Myc（曾被认为是导致肿瘤的主要原因），在植入NOD/SCID免疫缺陷小鼠后仍有很强的致瘤性，甚至高于胚胎干细胞。　　　他们共研究了36个iPS细胞克隆，在诱导方式上，有些诱导剂配方中含有c-Myc基因，有些没有，因此具有较好的代表性。同时他们选择了3株胚胎干细胞作为对照。在45周的观察中，移植胚胎干细胞来源神经干细胞的34只小鼠有4只长出肿瘤。在100只移植胚胎成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中34只发现肿瘤，概率和胚胎干细胞相当。在55只移植成人成纤维细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中46只发现肿瘤，概率远高于胚胎干细胞。在36只移植肝细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中10只发现肿瘤，概率高于胚胎干细胞。8只移植胃上皮细胞来源的iPS神经干细胞小鼠中未发现肿瘤。病理学检查证实肿瘤均为畸胎瘤，部分为恶性畸胎瘤。　　研究还发现，以前认为致瘤性很强的c-Myc在去掉后并没有减少iPS神经干细胞的致瘤性，相反以前认为没有致瘤性的Nanog基因却可以明显增强iPS神经干细胞的致瘤性。　　这次试验的另一个意外结果是并未发现在生成的肿瘤细胞中有c-Myc或其他基因的激活。以前的观点认为，转入的癌基因是iPS致瘤性的基础，只要在iPS细胞诱导成功后通过各种方法去除已完成使命的癌基因即可使iPS细胞免于致瘤性。这次试验的结果无疑给这些想法留下了阴影，而且使iPS致瘤的机制更加扑朔迷离。

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。二、细胞冻存操作步骤：(1)选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25%胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。(2)去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。(3)将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。(4)将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时(此步可省略)，再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。